WO2007069368A1

WO2007069368A1 - Ｃ型肝炎ウイルス由来ペプチド

Info

Publication number: WO2007069368A1
Application number: PCT/JP2006/315874
Authority: WO
Inventors: Kyogo Itoh; Akira Yamada; Michio Sata; Shigeru Yutani
Original assignee: Kurume University
Priority date: 2005-12-13
Filing date: 2006-08-10
Publication date: 2007-06-21
Also published as: JP2009051733A

Abstract

　Ｃ型肝炎ウイルスに対する抗体により認識されるペプチドであって，配列番号１－１４のいずれかのアミノ酸配列を有するペプチドが開示される。また，上述の本発明のペプチドを有効成分として含有する，ＨＣＶ関連疾患を有する患者を治療するための医薬組成物，ならびに上述の本発明のペプチドを含有する，ＨＣＶ関連疾患を診断するかまたはＨＣＶ関連疾患の進行を予測するための組成物も提供される。本発明は、ＨＣＶ２ａに感染した患者の治療、診断および疾患の進行の予測に有用である。

Description

明細書

c型肝炎ウィルス由来ペプチド

技術分野

[0001] 本発明は C型肝炎ウィルス (HCV)関連疾患の治療および HCV関連疾患の診断または進行予測に有用な組成物に関する。

背景技術

[0002] 世界の人口の約 3%が C型肝炎ウィルス (HCV)に対してセロポジティブであると見積られている (World Health Organization. Hepatitis C: global prevalence. W kly. Epidemiol. Re 1997; 72(46):341- 344)。 HCV感染の急性期はしばしば無症状であるが，セロポジティブの個人の約 70%は慢性感染を発症し，感染した患者は進行性の肝臓病，例えば，慢性肝炎，肝硬変，および肝細胞癌に罹患しやすい（ Alter HJ, Seeff LB., Semin Liver Dis. 2000; 20(1):17— 35; Shimotohno, K., Semin. Cancer Biol. 2000;10:233-240)。 HCV感染の現在の治療法はリバビリンと組み合わせたインターフェロン（IFN)— αであり，最近では，ポリエチレングリコール修飾型の IFN— αが用いられている。しかし，持続性の応答は，治療した患者の約 5 0%にしか見られない（Manns MP, et al, Lancet. 2001; 358:958- 965)。さらに重要なことには，抗ウィルス療法は，感染者の大部分が居住するほとんどの発展途上国では利用できない。したがって，新たな治療法の開発が必要とされている。

[0003] HCV感染後の肝細胞傷害の病因メカニズムはまだよくわ力つていないが，多くの証拠から，ウィルス特異的細胞傷害性 Tリンパ球 (CTL)が HCV感染後の肝臓障害に重要な役割を果たしている力もしれないことが示されている（Chang KM, et al., Springer Semin Immunopathol. 1997; 19:57-68)。一方， CTLは，感染の間にウイルスの広がりを制限しウィルスを排除するのに有効であると考えられている（Kurokoh chi K, et al., J Virol. 1996; 70:232- 240)。したがって，ワクチンによる CTL誘導は， HCV感染に伴う疾患の管理の有望な戦略であろう。さらに，コストが低いことおよび保存が容易であることから， CTL誘導を指向したペプチドワクチンの開発が求められている。 [0004] HCVのゲノタイプとしては， laおよび lbが主であるため，これまでこれらのタイプに関して多くの研究が行われてきた。 HCVlaおよび lbに由来する!、くつかの HLA拘束性ェピトープが，ペプチドワクチンの候補として同定されている（Kurokohchi K, e t al., J Hepatol. 2001; 34(6):930— 935; Uno— Furuta S, et al., Vaccine. 2001 ； 19:2190-2196; Dikopoulos N, et al., Hepatology. 2004; 40(2):300- 309; Cu riel TJ, et al" J Immunol. 2004; 172(12):7425- 7431)。しかし， HCV2aは中国 , 日本およびイタリアにおいて支配的なゲノタイプであるにもかかわらず， HCV2aについてはほとんど知られていない（Zein NN, Clin Microbiol Rev. 2000; 13(2):22 3-235; Huy TT, Abe K., Pediatr Int. 2004; 46(2):223— 230)。

[0005] したがって，本発明の目的は， C型肝炎ウィルス (HCV) 2a感染に対する特異的免疫療法の基礎となる分子を提供することである。

[0006] 本明細書において引用される参考文献は以下のとおりである。これらの文献に記載される内容はすべて本明細書の一部としてここに引用する。これらの文献のいずれか力本明細書に対する先行技術であると認めるものではない。

特許文献 1： WO2005/028503

非特許文献 l : Kurokohchi K, et al., J Hepatol. 2001; 34(6):930- 935 非特許文献 2 : Uno- Furuta S, et al., Vaccine. 2001; 19:2190-2196

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0007] 本発明は， HCV2aに感染した患者に適用することができる， HCV関連疾患の治療法を提供することを目的とする。

課題を解決するための手段

[0008] 本発明者らは， C型肝炎ウィルス (HCV) 2a由来ェピトープペプチドがヒト白血球抗原 (HLA)— A24陽性の HCV2a感染者にぉ、て細胞傷害性 Tリンパ球を誘導しうることを見いだした。

[0009] 本発明は， C型肝炎ウィルスに対する抗体により認識されるペプチドであって，以下の!、ずれかのアミノ酸配列を有するペプチドを提供する：

E1 335-344 : AYAMRVPEVI (配列番号 1) E2 576-584: DFNASTDLL (配列番号 2)

E2 627-635 : NYTIFKIRM (配列番号 3)

E2 649-658 : NFTRGDRCNL (配列番号 4)

NS2 889-897 : VFDITKWLL (配列番号 5)

NS2 936-945 : KYVQMALLAL (配列番号 6)

NS3 1085-1094 VYHGAGNKTL (配列番号 7)

NS3 1104-1112 MYSSAEGDL (配列番号 8)

NS3 1447-1456 GYTGDFDSVI (配列番号 9)

NS3 1560-1569 EFWEAVFTGL (配列番号 10)

NS5 2445-2453 SYSWTGALI (配列番号 11)

E2 576-584: DFN(A/T)S(T/M)DLL (配列番号 12)

E2 627-635 : N(Y/F)(T/S)(I/T/V)FK(I/V)RM (配列番号 13)

NS3 1085-1094: VYHGAG(N/T)(K/R)T(L/I) (配列番号 14)

[0010] 特に好ましくは，本発明のペプチドは以下のいずれかの配列を有する：

E2 576-584: DFNASTDLL (配列番号 2)

E2 627-635 : NYTIFKIRM (配列番号 3)

NS3 1085-1094: VYHGAGNKTL (配列番号 7)

[0011] 好ましくは，本発明のペプチドは， HLA—A24拘束性細胞傷害性 T細胞を誘導することがでさる。

[0012] 別の観点においては，本発明は，上述の本発明のペプチドを有効成分として含有する， HCV関連疾患を有する患者を治療するための医薬組成物を提供する。本発明はまた，上述の本発明のペプチドを含有する， HCV関連疾患を診断する力または HCV関連疾患の進行を予測するための組成物を提供する。

[0013] 別の観点においては，本発明は，上述の本発明のペプチドを投与することにより， HCV関連疾患を有する患者を治療する方法を提供する。本発明はまた，上述の本発明のペプチドを用いて HCV関連疾患を診断する方法および HCV関連疾患の進行を予測する方法を提供する。

[0014] 本明細書において用いる場合，「HCV関連疾患」とは， C型肝炎ウィルスの感染によって引き起こされる疾患を意味し，例えば，急性および慢性の肝炎，肝硬変，および肝細胞癌が含まれる。 HCV関連疾患の進行は，典型的には，慢性肝炎から肝硬変への進行，さらに肝硬変力肝癌への進行である。

図面の簡単な説明

[0015] [図 1]図 1は， HCV2a感染者の PBMCからの HCV2aペプチド特異的 CTLの細胞傷害活性を示す。

[図 2]図 2は， HCV非感染の健康なドナーの PBMCからの HCV2aペプチド特異的 C TLの細胞傷害活性を示す。

[図 3]図 3は， HCV非感染の健康なドナーの PBMCからの HCV2aペプチド特異的 C TLの細胞傷害活性を示す。

[図 4]図 4は， HCV非感染の健康なドナーの PBMCからの HCV2aペプチド特異的 C TLの細胞傷害活性を示す。

[図 5]図 5は， HCV非感染の健康なドナーの PBMCからの HCV2aペプチド特異的 C TLの細胞傷害活性を示す。

[図 6]図 6は，安定にトランスフエタトされた C1RA2402細胞における HCV2amRNA の発現を示す。

[図 7]図 7は， HCV2a感染者および HCV非感染の健康なドナーにおける HCV2a 62 7-635ペプチドに反応性の IgGを示す。

発明を実施するための最良の形態

[0016] 本発明は， HCV2aに感染した患者の治療に用いることができる免疫原性 HCV由来ペプチドを提供する。本発明の C型肝炎ウィルス由来ペプチド (HCVペプチド）は , C型肝炎ウィルスタイプ 2a由来の蛋白質の部分アミノ酸配列を含み，かつ，患者の HLAと適合する HLA結合モチーフを配列中に含む。このペプチドは， C型肝炎ウイルス感染者の血中抗体により認識されることができる。好ましくは，本発明に係る C型肝炎ウィルス由来ペプチドは， CTLを誘導することができ，このようにして誘導された CTLは， HCV感染細胞を標的にしてこの細胞を攻撃する。

[0017] 下記の実施例に示されるように，本発明においては， HCV2a感染者の末梢血単核細胞（PBMC)を HLA— A24結合モチーフを有する HCV2a由来ペプチドで刺激して，ペプチド特異的かつ HLA—A24拘束性の細胞傷害活性を調べた。また， HC V2aペプチドに対するィムノグロブリン G (IgG)の血漿レベルを蛍光的に測定した。その結果， 11種類のペプチドが， HLA— A24陽性 HCV2a感染者の PBMCからべプチド特異的 CTLを有効に誘導することが見いだされた。このうち， 3つのペプチド（ E2蛋白質からの HCV2a 576-584および HCV2a 627-635および NS3蛋白質からの HCV2a 1085-1094)が，特に高い頻度で CTLを誘導した。それぞれのペプチドに反応性のペプチド特異的 CD8+T細胞により， HLA— A24拘束性の細胞傷害活性が示された。また， HCV2a 1085-1094反応性 T細胞は HCV2aNS3— 5遺伝子をトランスフヱクシヨンした標的細胞に対して細胞傷害活性を有していた。さらに， HCV2a 感染者の血漿中で有意なレベルの HCV2a 627-635ペプチド特異的 IgGが検出された。これらの結果は，これらの 3つのペプチドを用いて， HLA— A24陽性 HCV2a感染者のペプチドに基づく免疫療法が可能であることを示す。中でも， HCV2a 576-58 4ペプチドは非常に免疫原性が高いことがわ力つた。

[0018] 本発明においては，配列番号 1— 11に示されるアミノ酸配列において， 1個， 2個または 3個のアミノ酸残基が保存的に置換されていてもよい。保存的置換とは，あるアミノ酸が同様の特性を有する別のアミノ酸で置換され，そのためペプチド化学分野の当業者によってポリペプチドの 2次構造およびハイド口パシー特性が実質的に変化しな!、ことが予期されるような置換を、う。互いに保存的置換であるアミノ酸の群としては一般に以下のものが知られている：（1)グリシン，ァスパラギン，グノレタミン，システイン，セリン，トレオニンおよびチロシン；（2)ァラニン，パリン，ロイシン，イソロイシン，プロリン，フエ-ルァラニン，メチォニンおよびトリプトファン；（3)グリシン，了ラニン, セリン，トレオニンおよびメチォニン；（4)ロイシン，イソロイシンおよびパリン；（5)グルタミンおよびァスパラギン；（6)グルタミン酸およびァスパラギン酸；（7)アルギニン，リジンおよびヒスチジン；（8)フエ-ルァラニン，トリプトファンおよびチロシン。

[0019] さらに，本発明のペプチドは，所望の作用効果を奏する程度に上記のアミノ酸配列を有していればよく，付カ卩的な配列がさらに含まれていてもよい。当業者であれば，抗原ペプチドとして所望の作用効果を奏するためには，その N末端側および C末端側にそれぞれどの程度の配列の付加が許容されるかを当然に理解することができる。したがって，例えば，本発明にかかるペプチドの N末端側および/または C末端側に，免疫感作を促進するのに有用なアミノ酸配列や，製剤化を容易にするアミノ酸配列や，融合蛋白質としてペプチドを発現させるのに便利なアミノ酸配列や，ペプチドの製造および精製に便利なアミノ酸配列などが付加されていてもよい。また，本発明にかかるペプチドは，抗体との結合の特異性が失われない限り，化学的に修飾されてヽてもよく，ポリマーや糖鎖が付加されてヽてもよヽ。

[0020] 本発明に係る HCVペプチドは，通常の化学的合成法，タンパク分子の酵素的分解法，目的のアミノ酸配列をコードする塩基配列を発現するように形質転換した宿主を用いる遺伝子組換え技術などにより製造することができる。

[0021] 目的とするペプチドをィ匕学的合成法で製造する場合には，通常のペプチド化学において公知の慣用されている手法によって製造することができ，例えば，ペプチド合成機を使用して，固相合成法により合成することができる。このようにして得られた粗ペプチドは，タンパク質ィ匕学において通常使用されている精製方法，例えば，塩析法，限外ろ過法，逆相クロマトグラフィー法，イオン交換クロマトグラフィー法，ァフィ- ティークロマトグラフィー法などによって精製することができる。

[0022] 一方，所望のペプチドを遺伝子組換え技術で生産する場合には，例えば，合成またはクローユングした目的のアミノ酸配列をコードする DNA断片を適当な発現べクタ一に組込み，この発現ベクターを用いて微生物や動物細胞を形質転換して，得られた形質転換体を培養することによって，所望のペプチドを得ることができる。使用できる発現ベクターとしては，当該技術分野において公知であるプラスミド，ウィルスべクターなどを用いることができる。

[0023] このペプチド生産技術における発現ベクターを用いた宿主細胞の形質転換方法としては，それ自体公知の方法，例えば，塩化カルシウム法，リン酸カルシウム共沈殿法， DEAEデキストラン法，リポフエクチン法，エレクト口ポレーシヨン法などが使用でき，使用する宿主細胞に基づいて適宜選択するのがよい。得られたペプチドの精製は，培養した培地から回収した細胞抽出液もしくは培養上清から上記精製法により行うことができる。

[0024] 本発明のペプチドは， HCV関連疾患を有する患者を治療するための医薬組成物 ,すなわちペプチドワクチンとして有用である。 C型肝炎ウィルス由来ペプチドからなるワクチンは，上記のようにして製造したペプチドを，医薬的に許容される補助剤および Ζまたは担体と適宜混合することにより調製する。補助剤としては，免疫応答を強化し得るアジュバント，例えばフロイントの不完全アジュバント，水酸化アルミニウムゲルなどを使用することができる。また，担体としては，例えば，リン酸緩衝生理食塩水（

PBS) ,蒸留水などの希釈剤，生理食塩水などを使用することができる。

[0025] ペプチドワクチンは，その使用形態に応じて，例えば，経口または静脈投与や皮下投与など経皮経路で投与することができる。その剤形としては，例えば，錠剤，顆粒剤，ソフトカプセル剤，ハードカプセル剤，液剤，油剤，乳化剤などが挙げられる。か力る医薬組成物の投与量は，投与する患者の症状などにより，適宜変動し得るが，一般的には，成人に対して 1日当たり，ペプチド量として 0. l— 10mgが好ましく，投与間隔としては数日ないし数ケ月に 1回投与することが好ましい。また，ペプチドワクチンとインターフェロンやリバビリンなどの抗ウィルス剤を併用してもよい。

[0026] 好ましい態様においては，投与される C型肝炎ウィルス由来ペプチドは，患者の血液中に存在する抗 HCV抗体のペプチド反応性もしくは CTLの存在に基づ、て選択される。更に好ましくは抗 HCV抗体のペプチド反応性と CTLの両方の存在に基づいて選択される。ここで，「抗 HCV抗体のペプチド反応性」とは，投与すべきペプチドのいずれかが，患者の血液中に存在する抗 HCV抗体により認識されることをいう。それぞれの患者における抗 HCV抗体のペプチド反応性を検査して，各人に適するぺプチドのみを投与する，いわゆるテーラーメイド型の投与により，より高い治療効果を期待することができる。癌ペプチドワクチン臨床試験における経験により，テーラーメイド型投与により二次免疫の賦活が速やかに誘導されるため，より安全により良い臨床効果が発現することが立証されている（Mine et al.， Clin. Can. Res. 929-937, 2004)。

[0027] HCV関連疾患の治療効果の確認は， HCV関連疾患に罹患している被験者の血中抗体価，すなわちペプチドに対する反応性を有する抗体の血中濃度を， ELISA 等の慣用の方法によりモニターすることによって行うことができる。また， HCV RNA の量を RT— PCR等の慣用の方法により測定することにより，ウィルス量をモニターすることがでさる。

[0028] 本発明のペプチドはまた， HCV関連疾患を有する患者を診断し，あるいは疾患の進行を予測するための組成物としても有用である。本発明のペプチドを用いて，当該技術分野においてよく知られる抗原抗体反応を用いて，被験者の血液中の抗体価を測定することができる。例えば，典型的な ELISA法を用いる場合には，以下のようにして測定を行うことができる。抗原であるペプチドを 96ゥエルなどの慣用の ELISAプレートに結合させ，非特異的吸着を防止するためにプレートを適宜ブロッキングする。次に被験者の血液力も調製した血清を適宜希釈してプレートの各ゥエルにカ卩えて，所定時間反応する。プレートを洗浄して未結合成分を除去した後，ヒト抗体と結合しうる抗体 (例えばゥサギ抗ヒト抗体)を加える。 IgGを検出することが望まれる場合には， γ鎖特異的抗ヒ HgGを用いることができる。所定時間反応した後，プレートを洗浄し ,検出可能なように標識した抗体 (例えば抗ゥサギ IgG)を加える。標識は，酵素，蛍光色素，化学発光物質，ピオチン，放射線ィ匕合物等を用いて，当業者によく知られる方法により行うことができる。プレートを所定時間反応した後，適当な基質を加えて基質の減少もしくは生成物の増加を測定するか，または蛍光，発光，放射活性を測定することにより，標識を検出する。このようにして，被験者の血清における特定のぺプチドに対する抗体の量を測定することができる。さらに，抗体の量をモニターすることにより， HCV関連疾患の進行の予測を行うことができる。

[0029] このような抗原抗体反応により抗体を検出する方法のうち，感度の高い方法の 1つとして xMAP技術がある。これは， Luminex社が開発した蛍光マイクロビーズアレイシステムによるフローメトリー測定法であり，ペプチドを結合させたマイクロビーズと血清とを接触させ，次に，蛍光標識二次抗体を結合させて，フローメトリーにより蛍光強度を測定する。

[0030] また，病院の検査室などで抗体価を測定する場合には，免疫クロマト法を用いることができる。この方法は，試験紙上に抗原 (または抗体)を線状に分布させた部分を作っておき，検体中の抗体と着色粒子で標識された抗原との複合体が試験紙上を移動する際に，抗原 (または抗体）に集中的に捕捉されることで現れる色付きのラインの有無によって定性分析を行う方法である。この方法を用いれば，簡便な設備で短時間（20〜30分以内）に結果を得ることができる。

[0031] 本明細書において明示的に引用される全ての特許および参考文献の内容は全て本明細書の一部としてここに引用する。また，本出願が有する優先権主張の基礎となる出願である日本特許出願 2005-359511号の明細書および図面に記載の内容は全て本明細書の一部としてここに引用する。

実施例

[0032] 以下に本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。ただし，これらの実施例は本発明をより具体的に説明するために例示的に示したものであり，本発明は実施例により限定されるものではない。

[0033]

碰

HLA— A24陽性の， HCV2a感染による慢性肝炎患者 20名および HCV非感染の健康なドナー 15名を被験者とした。 CTL誘導実験には， 10名の HLA— A24陽性患者および 5名の HLA— A24陽性の HCV非感染の健康なドナーの PBMCを用いた。 HCV2a患者は，抗 HCV抗体 (Abs)についてセロポジティブであった。 HCV非感染の健康なドナーは肝臓の機能障害の症状を有して、な力つた。末梢血単核細胞（PBMC)を得るためには， 20mlの末梢血を採取し，フイコールーコンレー密度勾配遠心分離により PBMCを調製した。

[0034] ペプチド

以下の実施例で用、た HCV2a由来ペプチドを表 1に示す。これらのペプチドは， HCV—ゲノタイプ 2aの蛋白質に由来する， HLA—A24結合モチーフを有する 11 種類の 9量体または 10量体の合成ペプチドである。陰性対照としては， HLA-A24 結合モチーフを有するインフルエンザウイルス (Flu)由来ペプチド（RFYIQMCYE L (配列番号 15) ) , EBV由来ペプチド（TYGPVFMCL (配列番号 16) ) ,およびヒト免疫不全ウィルス (HIV)由来ペプチド (RYLRQQLLGI (配列番号 17) )を用いた。すべてのペプチドは， BIOSYNTHESIS (Lewisville, TX)または SynPep (Dublin,

CA)から購入し， 90%以上の純度であった。ペプチドは， lOmgZmlの濃度でジメチルスルホキシド（DMSO)に溶解して 20°Cで保存した。 [0035] [表 1]

ffi枨s sffilsAolue

[0036] 細朐株

CIR- A2402は HLA- A*2402を発現する CIRリンパ腫のサブラインである（Dr. M. Takiguchi, Kumamoto University, Japan)。この細胞は， 10%FCS (牛胎児血清）および 500 /z g/mlのハイグロマイシン B (Gibco BRL, New York, NY, USA)を補充した RPMI— 1640培地で維持した。

[0037] RNA合成

HCV2aサブゲノム JFH— 1の NS 3— NS 5の保存配列を含むプラスミド pSGR— JF HIは Kato ら（Gastroenterology. 2003; 125(6):1808- 1817)に記載されている。プラスミドを Xbal消化により直線化し，さらにマングビーン'ヌクレアーゼ（New England

Biolabs, Beverly, MA)で処理して 4ヌクレオチドを除去して， HCV cDNAの 3，平滑末端を得た。消化したプラスミド DNAを精製し，これをテンプレートとして， ME GAscript (登録商標） T7キット（Ambion, Austin, TX)を用いるインビトロ RNA合成を行った。合成した HCVサブゲノム RNAを DNaseI (RQl TM RNase- free DNase , Promega, Madison, WI)で処理し，次に酸フエノール抽出を行って，残留するテンプレート DNAを除去した。

[0038] RNAトランスフエクシヨン

トリプシン処理した C1R-A2402細胞を PBSで洗浄し，氷冷 Cytomixバッファ（van den Hoff MJ, et al, Nucleic Acids Res. 1992; 20(11):2902)に 0. 5— lxlO⁷ Zmlの濃度で再懸濁した。合成したレブリコン RNA (5 μ g)を 400 μ 1の細胞懸濁液と混合し，エレクト口ポレーシヨンキュベット（Bio- Rad, Hercules, CA)に移し， Gene

Pulser II装置（Bio- Rad)を用いて 300V, 950 Fでパルスを印カロした。次に，トランスフエクシヨンした細胞を 10%FCSを含む RPMI1640培地に移し，培養フラスコで培養した。トランスフエクシヨンの 18— 24時間後に， G418 (0. 5mg/ml) (Nacalai

Tesque, Kyoto, Japan)を培地に加えた。 G418を補充した培地を週に 2回交換した。トランスフエクシヨンの 3週間後，細胞を選択培地で 1細胞 Z200 1の濃度に希釈した。 96ゥエルプレートにゥエルあたり 100 1の細胞を播種し，さらに 2— 3週間培養した。 G418耐性コロニーを回収し， 10cm培養皿で 80— 90%コンフルェントとなるまで増殖させて，核酸および蛋白質分析に用いた。

[0039] HCV2a感染者の PBMCにおける HCV2a由来ペプチドを用いる CTLのインビトロ醒ペプチド特異的 CTLの検出は先の報告にしたがって行った（Maeda Y, et al, B r. J. Cancer. 2002; 87: 796- 804)。簡単には， HLA—A24陽性の HCV2a感染者の PBMC (1X10⁵細胞 Zゥエル）を 10 /z gZmlの各ペプチドとともに U底 96ゥェルマイクロ培養プレート（Nunc, Denmark)中で 200 μ 1の容量の培養液でインキュペートした。培地は， 45%RPMI— 1640, 45%AIM— V培地（GibcoBRL, NY, USA) , 10%FCS, lOOU/mlのインターロイキン一 2 (IL— 2) ,および 40 /z gZml のゲンタマイシン力もなる。 3— 4日ごとに培養液の半分を除去し， 20 gZmlの対応するペプチドを含む新たな培地で置き換えた。第 15日に，ゥエル中の培養細胞の半分を 4つのゥエルに等分した。 2つのゥエルは対応するペプチドでパルスした C1R- A2402細胞でさらに刺激し，他方の 2つのゥエルは対照 HIVペプチドでパルスした C1 R-A2402細胞で刺激した。 16— 18時間インキュベートした後，上清中の IFN— γのレベルを ELISAにより測定した。対照 HIVペプチドに応答した IFN— γ産生をバックグラウンドとして差し引いた。 HCV2aペプチドで刺激した PBMCは，放射線照射した HLA—A24陽性バフィ一コート細胞をフィーダ一細胞としてさらに約 2— 3週間培養して，細胞傷害活性分析に十分な数の細胞を得た。

[0040] 細朐傷害活件のアツセィ

合計 10³個の⁵¹ Cr—標識標的細胞を異なるエフェクター Z標的 (EZT)比で， U底 96ゥエルプレートのゥエルで 6時間培養し，上清への⁵¹ Cr放出を調べた。非特異的溶解を排除するために， 40倍過剰の未標識 K562細胞の存在下で細胞傷害性活性を調べた。抗体ブロッキング実験においては，アツセィの最初に，抗 HLAクラス I (W 6/32 :マウス IgG2a)または抗 HLA— DR (L243：マウス IgG2a)単クローン抗体のいずれかを 20 gZmlの濃度でゥエルに加えた。いくつかの実験では， CD8単離キット（DYNAL, Oslo, Norway)を用いて CD8+細胞を精製した。

[0041] 血液単力らの榭状細朐 (DC)の作成

PBMCを培養プレートに， 10%FCS, PRMI1640培地中 4xl0⁶細胞 Zmlで播種し， 37°Cで 60— 90分間インキュベートして，細胞を培養プレートに付着させた。付着した単球に富んだ集団を以下の培地で 7日間培養した。培地は， 45%RPMI— 164 0, 45%AIM— V培地， 10%FCS, 100U/mlのインターロイキン一 2 (IL— 2) , 10 ng/mlの GM— CSF (Cosmo Bio, Tokyo, Japan) , lOng/mlの IL— 4 (Cosmo Bio) ,および 40 gZmlのゲンタマイシン力もなる。この培養期間中には培地の追加または除去を行わなかった。第 5日に， lOngZmlの TNF— a (Sigma, MI, USA) を培養液に加えて， DCを成熟させた。第 7日に細胞を回収して DCとして用いた。

[0042] HCV非感染の健康なドナー由来 PBMCから HCV2aペプチドでパルスした DCを用いた CTLの誘導

第 0日に， DCを PBSで洗浄し， 1. Omlの培養液に再懸濁し， 3 gZmlの j8 2—ミクログロブリン（Sigma)および 10 μ gZmlのペプチドとともに 37°Cで 2時間インキュペートした。放射線照射 (40Gy)の後， DCを 1 : 20の比率の非付着性 PBMCとともにさらにインキュベートした。第 7, 14および 21日に， PBMC培養物をペプチドでパルスし放射線照射した DCで 1 : 40の比率で再刺激した。第 28日に細胞傷害活性ァッセィを行った。

[0043] ペプチド：の沏 I定

ペプチド特異的 IgGの血漿レベルは，先に報告されているように（Komatsu N, et al, Scand J Clin Lab Invest. 2004; 64(6):535- 545) ,蛍光計で測定した。簡単には，製造元の方法を若干改変して，各ペプチド（0. 1M MESバッファ中 100 /z g , pH4. 5)をカラーコード化ビーズ（Luminex Corp. , Austin, TX)に結合させた。希釈した血漿サンプル（1 : 100, 1 : 200,および 1 : 400)を 96ゥエルのフィルタープレート（NUNC, NY, USA)中で，ペプチドを結合したカラーコード化ビーズとともに，プレート振盪器（300rpm)で室温で 2時間インキュベートした。インキュベート後，プレートを真空マ-ホルド装置で洗浄し，ピオチンィ匕ャギ抗ヒト IgGとともに室温で 1時間インキュベートした。次にプレートを洗浄し，ストレプトアビジン PEをゥエルに加え， 30分間インキュベートした。結合したビーズを 3回洗浄し， 100 1の 5%Tween— P BSを各ゥエルに加えた。 50 μ 1のサンプルを Luminex (登録商標）システムに供した

[0044] 統計学

統計学的解析はスチューデント t検定により行った。 P値が 0. 05より低いものを統計学的に有意とした。 [0045]

T細朐ェピトープペプチドの決定

HCV2aに由来する HLA - A24 -結合推定ペプチドを BIMASソフトウェア（Bioin formatics and Molecular Analysis Section, NIH)により分析した。ペプチド結合スコアは， HLAクラス I分子力ゝらの解離の予測半減期に基づいて計算した (Bioinforma tics and Molecular Analysis Section, Computational Bioscience and Engineen ng Laboratory, Division of Computer Research & Technology, NIH)。

[0046] これらのペプチドが， 10名の HLA—A24陽性 HCV2a感染者の PBMCから CTL を誘導する能力を調べた。患者および HCV非感染の健康なドナーからの PBMCを各ペプチドで 2週間インビトロ刺激した後に，対応するペプチドに対する反応性につ Vヽて試験した。 CTLの誘導が認められた 11種類のペプチドおよびそのペプチド M HC解離の半減期の BIMAS結合スコアを表 1に， CTL誘導の結果を表 2にそれぞれ示す。表 2の値は，対応するペプチドで予めパルスした C1R— A2402細胞に応答してエフェクター PBMCから産生された IFN— yを示す。対照 HIVペプチドで予めパルスした C1R—A2402細胞に対する IFN— y応答をバックグラウンドとして差し引いた。有意な値（両側スチューデント t検定により P< 0. 05)を下線で示す。 N. D. ,測定せず。

[0047] [表 2]

表 2 HLA— A24陽性の HCV2a感染患者（Pt)および健康なドナ一（HD)の PBMCからのペプチド反応性 CTLの誘導

IFN-γ産生（pg/ml)

[0048] 11種類すベてのペプチドは，少なくとも 1名の患者力もペプチド特異的 CTLを誘導することができた。 7種類の HCV2a由来ペプチド（HCV2a 576-584, HCV2a 627-6 35, HCV2a 649-658, HCV2a 889-897, HCV2a 1085-1094, HCV2a 1447-1456 ,および HCV2a 2445-2453)は，患者の 1Z3以上からペプチド特異的 CTLを誘導した。 HCV2a 627-635ペプチドが最も効率よくペプチド特異的 CTLを誘導し，このペプチドは 10名の HLA—A24陽性患者のうち 7名力ペプチド特異的 CTLを生成した。さらに，これらの 11種類のペプチドは， HCV非感染の健康なドナーの PBMC からもペプチド特異的 CTLを誘導することができた。

[0049] 患者の PBMC力誘導された HCV2aペプチド特異的 CTLの細朐傷害活性

HVC2a感染者の PBMCからのペプチド誘導性 CTLの細胞傷害活性を調べた。対応する HCV2aペプチド，または陰性対照として HIVペプチドでパルスした C1R-A 2402細胞に対する細胞傷害活性を，標準的な 6時間⁵¹ Cr—放出アツセィにより調べた。

3つのペプチド（HCV2a 576-584, HCV2a 627-635,および HCV2a 1085-1094)により誘導された CTLは，ペプチド特異的細胞傷害活性を示した。患者 1, 2, 4および 8についての代表的な結果を図 1に示す。値は， 3回の測定の平均であり，統計学的分析はスチューデント t検定により行った（* P< 0. 05)。これらのペプチド特異的 C TLは，対応するペプチドを負荷した C1R-A2402細胞に対して，対照 HIVペプチドを負荷した C1R-A2402細胞に対するものと比較して有意に高いレベルの細胞傷害活性を示した。

[0050] 上述の結果は， 3つの HCV2a由来ペプチド（HCV2a 576-584, HCV2a 627-635 ,および HCV2a 1085-1094)が，対応するペプチドおよび HVC2aを発現する標的細胞に対して細胞傷害性を有する CTLを誘導しうることを示す。これらの 3つのぺプチドのうち，特に HCV2a 627-635ペプチドは試験した患者の半分以上からペプチド特異的 CTLを誘導することができた。

[0051] なお，上述のペプチドは，いくつかの HCV2a株から選択したものである。 3つのべプチド（HCV2a 576-584, HCV2a 627- 635,および HCV2a 1085- 1094)について， 8種類の HCV2a株の配列の比較を表 3に示す。これらの 3つのペプチドのアミノ酸配列は，それぞれ， 6, 5,および 7種類の HCV2a株で保存されていた。

[表 3] 表 3 種々の HCV2a 株における HCV2a由来ェピトープの変異

ペプチド

株 E2 576-584 E2 627-635 NS3 1085-1094

DFNASTDLL NYTIFKIRM VYHGAGNKTL

~~ HC-J6

PH77CV-J6S T R -

PJ6CF

JCH-1 T — S T

MD2A-1 V——V "―

NDM228

JFH-1 — F

G2AK3

[0053] HCV非感染の健康なドナーの PBMC力 ^誘導されたペプチド特異的 CTLの細朐傷害活件

HCV2aペプチドをパルスした DCを用いて HLA—A24陽性の HCV非感染の健康なドナーの PBMC力ペプチド特異的 CTLを誘導した。代表的な結果を図 2— 5に示す。

[0054] HCV非感染の健康なドナーの PBMCをインビトロで HCV2aペプチドを負荷した D Cで刺激し，その細胞傷害活性を 6時間⁵¹ Cr—放出アツセィにより調べた。標的としては，対応する HCV2aペプチドまたは対照 HIVペプチドでパルスした C 1R-A2402細胞を用いた。 HCV2a 576-584, HCV2a 627- 635,または HCV2a 1085- 1094ぺプチドでパルスした DCのインビトロ刺激により， HCV非感染の健康なドナーの PBMCからペプチド特異的 CTLを誘導することができた（図 2)。示される値は 3回の測定の平均であり，統計学的解析はスチューデント t検定により行った（* P< 0. 05)。

[0055] HCV2aペプチドで刺激した PBMCの CD8+細胞を精製し，種々の mAbの存在下で，対応する HCV2aペプチドでパルスした C1R-A2402細胞に対する細胞傷害活性について調べた。精製した CD8+T細胞は，ペプチド特異的細胞傷害活性を示し，細胞傷害活性は抗 HLAクラス I抗体をカロえることによりブロックされたが，抗 HLAクラス I I抗体ではブロックされなかった（図 3)。これらの結果は，ペプチド特異的 CD8+T細胞が HLAクラス I拘束性の様式で細胞傷害活性を示すことを表す。

[0056] さらに， HCV2aRNAで安定にトランスフエタトされた C1R-A2402細胞を榭立して， HCV2aペプチド特異的 CTLが HCV2aを発現する C1R-A2402細胞を殺すことができるか否かを調べた。健康なドナーからの HCV2a 1085-1094ペプチド特異的 CTL 力 HCV2aでトランスフエクシヨンした C1R-A2402細胞に及ぼす細胞傷害活性を 6時間⁵¹ Cr—放出アツセィにより測定した。 ⁵¹Cr—放出アツセィの結果から， 3名の健康なドナーから得た HCV2a 1085-1094ペプチド特異的 CTLが HCV2aでトランスフエタトした C1R-A2402細胞を有意に傷害したことが明ら力となった（図 4)。

[0057] HCV2a 1085-1094ペプチドで誘導した CTLの精製 CD8+細胞を，種々の mAbの存在下で， HCV2aでトランスフエタトした C1R-A2402細胞に対する細胞傷害活性について測定した。抗 HLAクラス I抗体を加えると細胞傷害活性はブロックされたが，抗 HLAクラス II抗体ではブロックされなかった（図 5)。したがって， HCV2a 1085-1094

、ても，ペプチド特異的 CD8+T細胞が HLAクラス I拘束性の様式で細胞傷害活性を示すことが確認された。

[0058] HCV2aでトランスフエクシヨンした C1R-A2402細胞およびその親細胞において， H CV2a mRNAが発現していることを確認するために， RT— PCRを行った。 5 μ gの総 RNAから cDNAを合成し， PCR増幅のテンプレートとして用いた。 HCV2aに特異的な 1組のオリゴヌクレオチドプライマー（フォワードプライマー，ヌクレオチド位置 5 050-5069： 5'- ACACATAGACGCCCACTTCC- 3' (配列番号 18)およびリバースプライマ一，ヌクレオチド位置 5214- 5233： 5し ACGGTACAGGAGAGGTGTGG- 3' (配列番号 19) )を PCR増幅において用いた。 PCRは， TaqDNAポリメラーゼ（Promega, WI, USA)を用いて 30サイクル（1分， 95°C, 1分 60°C,および 1分， 72°C)実施した。対照として j8ァクチンを用いた。 PCR生成物は 2%ァガロースゲルで分析した。その結果， RT—PCR分析により，安定にトランスフエタトされた C1R-A2402細胞における HCV2aサブゲノム RNAの存在が確認された（図 6)。

[0059] HCV2a^¾ 中 _ HCV2aぺプチ P _ J¾の I¾P

次に， 20名の HCV2a感染者および 15名の HCV非感染の健康なドナーの血漿において， 11種類のペプチドに反応性の IgGのレベルを測定した。これらの被験者には， HL A -A24陽性および— A24陰性の両方が含まれて!/、た。

[0060] 図 7Aは， HCV2a感染者および HCV非感染の健康なドナーの 1 : 100希釈血漿中の抗 HCV2a 627-635 IgGレべノレを示す。患者の抗 HCV2a 627-635 IgG (242. 5± 95. OFIU)は， HCV非感染の健康なドナー（64. 0± 52. OFIU)より有意に高かった（Pく 0. 0001)。他の 10種類のペプチドに対する IgGのレベルについては，患者と HCV非感染の健康なドナーとの間で有意な相違はな力つた。 (FIU： Fluoresc ence Intensity Unit,螢光強度単位）

[0061] HCV2a 627-635ペプチドに対する IgGの特異性を確認するために， 96ゥエルプレートで患者の 1： 100希釈血漿サンプルを免疫ペプチド（20 μ gZゥエル）で 37°Cで 2 時間吸収させた。吸収工程を 3回繰り返し，上清中の HCV2a 627-635ペプチドに反応性の IgGのレベルを Luminex (登録商標）システムにより測定した。陰性対照としては， HIV由来ペプチドおよび無関係な HCV2a 2850-2858ペプチドを用いた。結果を図 7Bに示す。値は 3回のアツセィの平均である。 *は統計学的に有意 (pく 0. 05) を示す。サンプルを HVC2aペプチドで被覆したプレートで培養すると抗 HCV2a 627 -635 IgGは吸収された力無関係な HIVペプチドまたは HCV2a 2850-2858ぺプチドで被覆したプレートでは吸収されな力つた。このことは， HCV2a感染者の血清中に HCV2a 627-635ペプチド特異的 IgGが存在することを立証する。

[0062] HLA— A24陽性の HCV非感染の健康なドナーの PBMCからペプチドパルス DC を用いて誘導された HCV2aペプチド特異的 CTLは， HLAクラス I拘束性にペプチド特異的細胞傷害活性を示した。さらに重要なことには， HCV非感染の健康なドナーの PBMCから誘導された HCV2a 1085-1094ペプチド特異的 CTLは， HCV2aでトランスフエタトした C1R-A2402細胞に対して細胞傷害活性を示した。この結果は， HCV 2a 1085-1094ペプチドが自然にプロセシングされ， HCV2a感染細胞上に提示されたことを示唆する。これらの結果を合わせると，本発明の HCV2aペプチドは免疫原性を有しており，したがって， HLA— A24陽性の HCV2a感染者の特異的免疫療法に有用であることが示唆される。

[0063] これまでに，腫瘍反応性 CTLを誘導する能力があるとして同定されたいくつかの H LAクラス I 結合性腫瘍抗原由来ペプチドが IgG〖こよっても認識されること（Ohkouch i S, et al. Tissue Antigens.2002; 59: 259-272; Kawamoto N, et al., Tissue Antigens. 2003; 61:352-361) ,臨床試験においてペプチドワクチンはしばしばそのペプチドに反応性の IgGを誘導することが知られている（Noguchi M, et al., Pro state.2003; 57:80-92; Tanaka S, et al" J Immunother. 2003; 26:357 - 366)。さらに重要なことには，ワクチンペプチドに反応性の IgGの誘導は，進行した癌患者の生存期間延長と正に相関していた（Mine T, et al., Cancer Science 2003; 94 :548-556; Sato Y, et al., Cancer Science. 2002; 94: 802- 808)。したがって，本発明のペプチドは， HCV2a感染に対するペプチドワクチンとして有用であると期待される。

産業上の利用可能性

本発明のペプチドは HCV関連疾患の治療，および HCV関連疾患の診断または進行予測に有用である。

Claims

請求の範囲

[1] c型肝炎ウィルスに対する抗体により認識されるペプチドであって，以下の配列：

E1 335-344: AYAMRVPEVI (配列番号 1)

E2 576-584: DFNASTDLL (配列番号 2)

E2 627-635 : NYTIFKIRM (配列番号 3)

E2 649-658 : NFTRGDRCNL (配列番号 4)

NS2 889-897 : VFDITKWLL (配列番号 5)

NS2 936-945 : KYVQMALLAL (配列番号 6)

NS3 1085-1094: VYHGAGNKTL (配列番号 7)

NS3 1104-1112 : MYSSAEGDL (配列番号 8)

NS3 1447-1456 : GYTGDFDSVI (配列番号 9)

NS3 1560-1569 : EFWEAVFTGL (配列番号 10)

NS5 2445-2453 : SYSWTGALI (配列番号 11)

E2 576-584: DFN(A/T)S(T/M)DLL (配列番号 12)

E2 627-635 : N(Y/F)(T/S)(I/T/V)FK(I/V)RM (配列番号 13)

NS3 1085-1094: VYHGAG(N/T)(K/R)T(L/I) (配列番号 14)

のいずれかで表されるアミノ酸配列を有するペプチド。

[2] 配列番号 12— 14のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する，請求項 1記載のぺプチド。

[3] 配列番号 2, 3または 7で表されるアミノ酸配列を有する，請求項 2記載のペプチド。

[4] HLA—A24拘束性細胞傷害性 T細胞を誘導しうる，請求項 1—3のいずれかに記載のペプチド。

[5] 請求項 1 4のいずれかに記載のペプチドを有効成分として含有する， C型肝炎ウイルス関連疾患を治療するための医薬組成物。

[6] 請求項 1 4のいずれかに記載のペプチドを含有する， C型肝炎ウィルス関連疾患を診断する力または C型肝炎ウィルス関連疾患の進行を予測するための組成物。

[7] HCV関連疾患を有する患者を治療する方法であって、 C型肝炎ウィルスに対する抗体により認識されるペプチドを投与することを含み，前記ペプチドは、以下の配列： El 335-344: AYAMRVPEVI (配列番号 1)

E2 576-584: DFNASTDLL (配列番号 2)

E2 627-635 : NYTIFKIRM (配列番号 3)

E2 649-658 : NFTRGDRCNL (配列番号 4)

NS2 889-897 : VFDITKWLL (配列番号 5)

NS2 936-945 : KYVQMALLAL (配列番号 6)

NS3 1085-1094 VYHGAGNKTL (配列番号 7)

NS3 1104-1112 MYSSAEGDL (配列番号 8)

NS3 1447-1456 GYTGDFDSVI (配列番号 9)

NS3 1560-1569 EFWEAVFTGL (配列番号 10)

NS5 2445-2453 SYSWTGALI (配列番号 11)

E2 576-584: DFN(A/T)S(T/M)DLL (配列番号 12)

E2 627-635 : N(Y/F)(T/S)(I/T/V)FK(I/V)RM (配列番号 13)

NS3 1085-1094: VYHGAG(N/T)(K/R)T(L/I) (配列番号 14)

のいずれかで表されるアミノ酸配列を有することを特徴とする方法。

被験者において HCV関連疾患を診断する力または HCV関連疾患の進行を予測する方法であって、 C型肝炎ウィルスに対する抗体により認識されるペプチドを用いて、前記被験者の血液中の C型肝炎ウィルスに対する抗体価を測定することを含み，前記ペプチドは、以下の配列：

E1 335-344: AYAMRVPEVI (配列番号 1)

E2 576-584: DFNASTDLL (配列番号 2)

E2 627-635 : NYTIFKIRM (配列番号 3)

E2 649-658 : NFTRGDRCNL (配列番号 4)

NS2 889-897 : VFDITKWLL (配列番号 5)

NS2 936-945 : KYVQMALLAL (配列番号 6)

NS3 1085-1094 VYHGAGNKTL (配列番号 7)

NS3 1104-1112 MYSSAEGDL (配列番号 8)

NS3 1447-1456 GYTGDFDSVI (配列番号 9) NS3 1560-1569 : EFWEAVFTGL (配列番号 10)

NS5 2445-2453 : SYSWTGALI (配列番号 11)

E2 576-584: DFN(A/T)S(T/M)DLL (配列番号 12)

E2 627-635 : N(Y/F)(T/S)(I/T/V)FK(I/V)RM (配列番号 13)

NS3 1085-1094: VYHGAG(N/T)(K/R)T(L/I) (配列番号 14) のいずれかで表されるアミノ酸配列を有することを特徴とする方法。