WO2007066650A1

WO2007066650A1 - 軟骨組織再生用培養基材および培養方法

Info

Publication number: WO2007066650A1
Application number: PCT/JP2006/324241
Authority: WO
Inventors: Tokifumi Majima; Norimasa Iwasaki; Kazuo Harada; Sachiko Nonaka; Yasuhiko Kasahara
Original assignee: Chemical Biology Institute
Priority date: 2005-12-06
Filing date: 2006-12-05
Publication date: 2007-06-14

Abstract

　軟骨組織を再生させるために使用する軟骨細胞培養基材、および培養方法を提供することを目的とする。この課題は繊維内部がキトサンまたはその塩よりなり、繊維表面がキトサンとヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、およびデルマタン硫酸よりなる群から選択される酸性生体高分子との複合体で被覆されているキトサン／酸性生体高分子ハイブリッド繊維よりなる織物または編物を含む軟骨組織再生用培養基材であって、織物または編物の糸と糸の間隙は２５０～５００μｍであり、基材内部の空隙率が６５～９４％である培養基材により解決できる。

Description

明細書

軟骨組織再生用培養基材および培養方法

技術分野

[0001] 本発明は、変形性関節症などの疾患や事故などの原因により損傷した軟骨組織を再生させるために用いられる移植用軟骨組織の培養のための培養基材、および該基材を用いる軟骨細胞培養方法に関するものである。

背景技術

[0002] 高齢化社会を迎え、関節疾患患者は人口の 1 %にも達しようとして!/、る。これらの疾患者の大部分は軟骨組織が損傷を受け、壊死することによって起こる変形性関節症や慢性リウマチによるものと言われている。軟骨は自己再生能がきわめて低いことから、外科的治療が必要な場合には人工関節置換術が施されている。しかし、この方法では装着物力の金属イオンの溶出による炎症や骨接合部との緩み、耐久性等に大きな課題があり、医療用具としての寿命は 10年程度とされていることから、人工関節置換術は根治的な治療法にはなって!/、な、。

[0003] そこで、近年、自己再生能の低、組織を対象に、正常部位の自己組織を一度体外に取り出し、培養して増殖'分化させた後、再び体内に移植して目的組織の再生を図ろうとする再生医療の研究が盛んに行われて、る。細胞はある物質の表面に接着することによって増殖'分ィ匕が起こることから、再生医療の発展には培養細胞が接着するための足場となる良好な人工基材の開発が、不可欠とされている。

[0004] 一般に、組織再生用の基材に求められる条件として、（1)炎症反応が見られず、生体親和性に優れていること、（2)生体吸収性であること、（3)細胞の接着性がよいこと、（4)細胞の活性を維持できること、（5)細胞の増殖 ·分ィ匕による組織再生が可能な 3 次元構造を有することが挙げられる。さらに、股関節部位の軟骨には 20Mpa程度までの圧縮応力がかかることから、上記 5つの条件以外に（6)体内で組織が再生されるまでの形状の安定性が確保されること、および (7)機械的強度を有することの 2つの条件も同時に満たす基材の開発が必要と考えられる。

[0005] これまでに軟骨細胞培養基材として、ポリグリコール酸やポリ乳酸等の生体吸収性の合成高分子を用、たファイバーやスポンジが検討されてきた (特公平 6— 6155号、特表平 8— 511679号、 Ito, K.等， Mat. Res. Soc. Proc, 252, 359—365 (1992), Fr eed, L. E.等， J. Biol. Mater. Res., 27, 11-23 (1993)等）。これらの合成高分子材料は体内での加水分解物が生体内の代謝中間体と同一であるため毒性がなぐ高重合体が得られるため機械的強度を有し、成形が容易であるなどの長所がある。しかし、これらの合成高分子は細胞の接着性に欠けるため、材料表面に生体の細胞接着性因子である RGD (アルギニン一グリシンーァスパラギン酸のトリペプチド）や、ゼラチン、コラーゲン等の生体高分子を固定ィ匕する方法によって細胞の接着性を向上させることが検討されてきた（Yamaoka, T.等， J. Biol. MacromoL, 25, 265-271 (1999) 等)。しかし、このような化学的固定方法は操作が煩雑であり、また、固定化処理に使用した薬品の残存等も懸念される。

[0006] 一方、天然高分子を用いた軟骨細胞培養用基材としては、コラーゲンのゲルゃスポンジ状基材（特開平 6-22744号公報、特表平 9-510639号公報、特開 2001-224678 号公報、 Fujisato, T.等， Biomaterials, 17,155-162 (1996)等）、キチンやキトサンのスポンジ状基材が検討されてきた（Park, Y. J.等， Biomaterials, 21, 153-159 (2000)等 )。これらの基材は細胞接着性には優れるが、形状安定性および機械的強度に問題がある。また、コラーゲンは原材料費が高価であるとともに、抗原性や BSE等の感染も懸念される。

[0007] 酸性高分子としてアルギン酸を主原料に塩基性高分子としてキトサンを用いた基材

(特許第 3616344号)やキトサンとヒアルロン酸等の酸性生体高分子力もなるハイブリツド繊維を用いた培養基材 (WO 2004Z003130)に関する報告がある。しかし、この培養基材は繊維の製造方法等の詳細な記載はあるが、基材の具体的な構造につ!、ては明記されて!、な!/、。

[0008] これまでに基材の構造に関しては、軟骨細胞の増殖および組織再生の足場として用いられる天然高分子多孔質構造体の細孔は 20〜： L00 μ mが好ま、との報告（特開 2003— 10309)や、細孔の大きさが 100〜200 /ζ πιの難水溶性ヒアルロン酸ゲルが細胞を保持するのに好ましいとの報告がある（特開 2003— 10308)。し力し、細胞を保持することのみを考えた場合にはこの程度の小孔が好ましいと考えられるが、軟骨細胞が増殖 ·分ィ匕し、組織を形成する際にはこのような小孔では細胞外マトリツタスを産生するための空間が確保できず、良好な軟骨組織の形成には不適当なことが予想される。

[0009] 一方、軟骨細胞の培養方法に関してもこれまでにいくつかの検討が行われている。

軟骨組織は歩行などの日常的な動作により 5〜： LOMPa程度の静水圧を受けているとされている。また、軟骨細胞は強力な血管新生阻害作用をもち、軟骨組織への血管の進入を抑制していることから、軟骨組織は酸素分圧が低いと考えられている。そこで、これらの生体条件を模擬した培養方式として静水圧を負荷する方式 (Parkkinen , J.等， Arch. Biochem. Biophys., 300, 458—465 (1993)、 Mizuno, S.等， Material Scie nce & Engineering C, c6, 301-306 (1998)等）や、低酸素下で培養する方式（Domm, C.等， Osteoarthritis Cartilage, 10, 13-22 (2002)等）などが研究され、報告されている。また、培地を撹拌する方式についても報告（Freed, L. E.等， J. Cell Biochem., 51 , 257-264 (1993))がある力これらの培養方式と基材形状との関係については明らかとなつていない。

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0010] 本発明は、培養基材を用いた生体外での培養によって軟骨組織の主要構成成分であるタイプ IIコラーゲンが基材内部まで形成され、且つ、基材の占める割合が非常に低、軟骨組織を得ることが可能であって、軟骨組織の形成とともに機械的強度も増加し、生体内への移植後も良好な軟骨組織の再生が起こる培養基材を提供することを目的とする。

課題を解決するための手段

[0011] 本発明は、繊維内部がキトサンまたはその塩よりなり、繊維表面がキトサンとヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、およびデルマタン硫酸よりなる群カゝら選択される酸性生体高分子との複合体で被覆されているキトサン Ζ酸性生体高分子ハイブリッド繊維よりなる織物または編物を含む軟骨組織再生用培養基材であって、構造物内部の空隙率が 65〜94%であり、織物または編物の糸と糸の間隙は 250〜500 μ mである培養基材を要旨とする。 [0012] 培養基材に占める空隙率が低い場合、即ち、培養基材に占める基材の割合が高い場合には、培養中に軟骨組織が形成されるための空間が確保できない。また、移植後生体内で基材が分解されるのに時間がかかり、基材部分における組織形成能が低くなる恐れがある。軟骨組織には血管が発達して、な、ために代謝も遅、ことから、良好な軟骨組織の再生には基材の分解速度も考慮した適正な 3次元の構造が非常に重要と考えられる。さらに、培養基材に占める空隙率が高すぎる場合、即ち、培養組織に占める基材の割合が低ヽ場合には、培養時に播種した軟骨細胞が付着し増殖、分ィ匕するための足場となる基材が少なすぎるため、細胞密度が低下してしまい、組織の形成が起こり難くなる。

[0013] 織物または編物の糸と糸の間隙が小さすぎると、基材内部までの十分な培地移動が起こりづらいために、基材内部まで軟骨組織を形成させることが困難となる。また、織物または編物の糸と糸の間隙が大きすぎると、培養中に基材の変形などが起こり、形態の維持が困難となる。

[0014] 本発明はまた、上記培養基材を用いた生体外での軟骨細胞の培養方法にも関する。

本発明はさらに上記培養方法で得られた移植用軟骨組織にも関する。発明の効果

[0015] 本発明の培養基材を用いた生体外での培養によって軟骨組織の主要構成成分であるタイプ IIコラーゲンが基材内部まで形成され、且つ、基材の占める割合が非常に低い軟骨組織を得ることが可能であって、軟骨組織の形成とともに機械的強度も増加し、生体内への移植後も良好な軟骨組織の再生が起こる培養基材が得られる。図面の簡単な説明

[0016] [図 1]本発明の培養基材の構造の例を示す模式図である。

[図 2]異なる間隙の織物力もなる培養基材を用いて培養した場合の生成したタンパク質量の比較を示すグラフである。各値は平均値と標準誤差で示した (n= 5)。

[図 3]異なる間隙の織物力もなる培養基材を用いて培養した場合の生成した酸性ムコ多糖量の比較を示すグラフである。各値は平均値と標準誤差で示した (n= 5)。

[図 4]異なる構造の織物力もなる培養基材を用いて培養した場合の生成したタンパク質量の経時変化を示すグラフである。各値は平均値と標準誤差で示した (n= 5)。圆 5]異なる構造の織物力もなる培養基材を用いて培養した場合の生成した酸性ムコ多糖量の経時変化を示すグラフである。各値は平均値と標準誤差で示した (n= 5)。圆 6]回転培養を行った培養組織の湿重量の経時変化を示すグラフである。培養開始 1週間後から回転培養した。重量には基材を含む。各値は平均値と標準誤差で示した (n= 5)。

圆 7]回転培養を行った培養組織のタンパク質量の経時変化を示すグラフである。培養開始 1週間後から回転培養した。各値は平均値と標準誤差で示した (n= 3)。

[図 8]回転培養を行った培養組織の DNA量の経時変化を示すグラフである。培養開始 1週間後から回転培養した。各値は平均値と標準誤差で示した (n= 3)。

圆 9]回転培養を行った際のタイプ IIコラーゲンの染色像を示す写真のコピーである圆 10]回転培養と低酸素条件下での培養を組み合わせた際の湿重量の変化を示すグラフである。培養開始 1週間後から回転培養、 2週間後から低酸素下で培養した。各値は平均値と標準誤差で示した (n= 3)。

圆 11]回転培養と低酸素条件下での培養を組み合わせた際のタンパク質量の変化を示すグラフである。培養開始 1週間後から回転培養、 2週間後から低酸素下で培養した。各値は平均値と標準誤差で示した (n= 3)。

圆 12]回転培養と低酸素条件下での培養を組み合わせた際の DNAの変化を示すグラフである。培養開始 1週間後から回転培養、 2週間後から低酸素下で培養した。各値は平均値と標準誤差で示した (n= 3)。

圆 13]回転培養と低酸素条件下での培養を組み合わせて行った際のタイプ IIコラーゲン染色像を示す写真のコピーである。

圆 14]回転培養と低酸素条件下での培養を組み合わせて行った際の培養組織の硬度変化を示すグラフである。

圆 15]培養基材 [2]および [3]を用いて回転培養を行った際の湿重量の変化を示すグラフである。 1週間の静置培養後、回転培養を行った。

圆 16]培養基材 [2]および [3]を用いて回転培養を行った際のタンパク質量の変化を示すグラフである。 1週間の静置培養後、回転培養を行った。

[図 17]培養基材 [2]および [3]を用いて回転培養を行った際の DNA量の変化を示すグラフである。 1週間の静置培養後、回転培養を行った。

[図 18]培養基材 [3]を用いて回転培養を行った際のタイプ IIコラーゲン染色像を示す写真のコピーである。

[図 19]培養基材 [2]を用いて骨髄幹細胞力も軟骨細胞への分ィ匕誘導を行った際のタイプ IIコラーゲン染色像を示す写真のコピーである。

発明を実施するための最良の形態

[0017] 繊維内部がキトサンまたはその塩よりなり、繊維表面がキトサンとヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、およびよりなる群から選択される酸性生体高分子との複合体で被覆されているキトサン Z酸性生体高分子ハイブリッド繊維は、 WO 2004/003130^- 公報に記載の方法により製造できる。

即ち、 1つの製造方法では、 1)キトサンを酸の水溶液に溶解しキトサンの塩の水溶液を調製し； 2)キトサンの塩の水溶液を、アルカリ土類金属の塩を凝固剤として用いて湿式紡糸して繊維を形成させ; 3)その繊維を生体吸収性の酸性生体高分子の溶液に浸漬して、繊維表面でキトサンと酸性生体高分子を反応させてキトサン Z酸性生体高分子ハイブリッド繊維を形成させ; 4)場合によりハイブリッド繊維を延伸し; 5) ノ、イブリツド繊維を塩基、 2塩基酸以上の無機酸もしくはその塩、または 3塩基酸以上の有機酸もしくはその塩の水溶液で処理する。

[0018] 他の製造方法では、 1)キトサンを酸の水溶液に溶解しキトサンの塩の水溶液を調製し； 2)キトサンの塩の水溶液を、塩基、 2塩基酸以上の無機酸もしくはその塩、または 3塩基酸以上の有機酸もしくはその塩を凝固剤として用いて湿式紡糸して繊維を形成させ; 3)その繊維を生体吸収性の酸性生体高分子の溶液に浸漬して、繊維表面でキトサンと酸性生体高分子を反応させてキトサン Z酸性生体高分子ハイブリッド繊維を形成させ; 4)場合によりハイブリッド繊維を延伸する。

[0019] このハイブリッド繊維は、（1)炎症反応が見られず、生体親和性に優れていること、 ( 2)生体吸収性であること、（3)細胞の接着性がよいこと、（4)細胞の活性を維持できること等の特徴を有する。 [0020] このようにして製造した繊維を用いて、公知の方法により、織物、編物、糸、綿状物を製造する。ここで「糸」とは上のように製造した繊維を撚糸して得られるものを言い、「綿状物」とは上のように製造した直径 10〜50 mの繊維を塊状にしたものを言う。織物または編物の場合、糸と糸の間の間隙を 250〜500 mとすることが好ましい。

[0021] 本発明の培養基材のー態様によれば、上記織物または編物を、 2枚以上重ね合わせ、上記の糸を用いて固定して形態を保つ。その場合、培養基材における基材全体の空隙率が 60%を超えるようにすることが好ま U、。

[0022] 本発明の培養基材の他の態様によれば、織物または編物の間に、上記綿状物が挟まれており、各織物または編物間を上記の糸で固定されて形態を保つ。

[0023] 本発明の培養基材のさらなる態様によれば、帯状の織物または編物を丸めて円筒形にし、上記の糸で固定し、またはキトサン溶液を塗布し、乾燥させて固定して形態を保ち、円筒内部に上記綿状物が充填される。

[0024] V、ずれの場合も培養基材の空隙率が 60〜96%、好ましくは 65〜94%、特に好ましくは 80〜94%となることが必要である。培養基材の「空隙率」とは（1—繊維の体積 Z基材の体積) xlOOをいう。空隙率の測定は次のようにして行う。基材の重量を測定し、繊維の密度 1. 013gZcm³から基材中の繊維の体積を算出する。また基材の体積を測定し、これらの値をもとに、上式より空隙率を算出する。

[0025] 上記の培養基材を用いる動物細胞の培養は通常の動物細胞培養法 (例えば、 Kla gsourn, M., Large ¾caie Preparation of Chondrocytes , Methods in iinzymoi., 58:5 60(1979)を参照）に準じて行う。先ず、予め、該培養基材をオートクレープで加熱滅菌するか、ガス殺菌等を行い形状 '特性が壊れないように殺菌処理を施し、殺菌した培地に添加する。次に、動物細胞を培養基材上にできるだけ 3次元的に均一に播ぃて培養する。培養に使用する細胞としてはゥサギ、ゥシ、ゥマ、ィヌ、ネコ、ヒト等の哺乳動物由来の細胞であり、軟骨細胞または軟骨細胞になりうる幹細胞であれば、いずれの細胞でも培養可能である。好ましい細胞は、ヒト由来のものであり、特に好まし V、のは移植しょうとする患者由来の軟骨細胞または幹細胞である。

[0026] 培地としては、通常の動物細胞培養法で用いられるもの、例えばヒト血清を含む D MEM (Dulbecco' s Modified Eagle' s Medium)などが使用出来る。培地にはいずれかの成長因子、例えば TGF |8 (トランスフォーミング成長因子 j8 )、 FGF (線維芽細胞増殖因子）， ChM- 1 (コンドロモジエリン一 1)などを添カ卩してもよ!、。

[0027] 播種した細胞が培養基材上で良好に増殖、分化するためには細胞付着 ·吸着性の高、培養基材は極めて重要である。

[0028] 生体内の軟骨組織には血管が発達して、な、ことから低酸素条件となって、ること

、また、体重による圧負荷を受けていることから、これらの生体条件に近い条件での培養も有効と考えられる。このため軟骨細胞の培養では、 1〜15%の低酸素条件下で行うことや、 0. l〜20MPa (周期負荷の場合には 0. 01〜2Hz)の圧をかけて培養を行うこと、およびこれらの条件を組み合わせて培養することも可能である。圧を負荷する方法については、具体的にはポンプやピストン状のものを用いて培地に空気圧や水圧を加える方法等がある。

[0029] さらに、培養容器を回転させる培養方式または培地を振とうしながら培養する方法を行うことにより、生体外での培養によって基材内部まで軟骨組織の主要構成成分であるタイプ IIコラーゲンカゝら成る移植用軟骨組織が得られる。

[0030] 軟骨細胞の培養では、少なくとも細胞外マトリックスが形成されるまで行う。通常、培養 2〜4週間程度で軟骨細胞が本発明の培養基材の上に良好に接着、増殖し、コラゲン様の細胞外マトリックスが形成される。

[0031] このようにして製造される、本発明の、キトサンと酸性生体高分子とのハイブッリド繊維よりなる培養基材、及び培養基材に付着した軟骨組織を含むものは、軟骨損傷の修復のための移植用基材として好適に用いることができる。

以下に実施例によって本発明をさらに説明するが、本発明が実施例に限定されるものではな!/、ことは勿論である。

実施例

[0032] ¾細

キトサンヒアルロン酸のハイブリッド繊維の製诰

3. 5 (重量/容量)％のキトサン (君津化学工業社製、 B、分子量:約 600, 000)を 2 %酢酸水溶液に溶解した溶液をカラム (ガラス製、内径 45mm、長さ 410mm)に詰め、濾布で加圧 (0. 6kgfZcm2)濾過した。この濾液を紡糸用カラム (ガラス製、内径 4 5mm,長さ 410mm)に詰め、これを紡糸液として簡易紡糸装置を用い、以下のような方法によって繊維を作製した。 50ホール（小孔： θ. 1mm)のノズルから、 0. 8kgf Zcm2の加圧下で飽和塩ィ匕カルシウム溶液中（第 1凝固浴:水 Zメタノール = 1/1 ( 容量）、浴長 100cm、容量約 2L)に上記紡糸液を押出し、次に水 Zメタノール = 1Z 1 (容量）に浸漬 (第 2凝固浴:浴長 50cm、容量約 1L)し、さらに 0. 05%ヒアルロン酸溶液 (水 Zメタノール = 1Z1 (容量)）を上流側から滴下した中を通過させた。その後、ローラー (第丄ローラー:速度 ₄. 4mZ分、第 2ローラー: 4. 5mZ分、延伸倍率 1. 0 2)にかけ、最後に卷取りローラーで巻き取った後、 0. 2% (重量 Z容量)の水酸化ナトリウム溶液 (水 Zメタノール = 1Z9 (容量)）に約 15時間浸漬後、水洗し、さらにメタノールに約 30分浸漬後取り出しローラーから糸状にほどき、 80°C程度の温風で乾燥させ、しなやかなキトサン一ヒアルロン酸ノヽイブリツド繊維を得た。

[0033] 実飾 12

ノ、イブリツド繊維からの谘着某材「ίΊの作製

実施例 1で製造したハイブリッド繊維を撚糸した後、市販の加工機器を用いて約 40 0 mの糸と糸との間隙を有する織物状構造物を作製した。この織物状構造物を 4枚重ねて縫合し、培養基材 [1]を作製した（図 1)。この培養基材の空隙率は 66. 0%でめつに。

[0034] 実飾 13

ノ、イブリツド繊維からの谘着某材「2Ίの作製

実施例 1で製造したハイブリッド繊維は 50本の束であることからこれをほぐして塊状にし、綿状物を作製した。また、ハイブリッド繊維を撚糸した後、約 400 mの糸と糸との間隙を有する織物を作製し、 2枚の織物で前記綿状物を挟み込むように成形し、培養基材 [2]を作製した (図 1)。この培養基材の空隙率は 85. 0%であった。

[0035] 実施例 4

ノ、イブリツド繊維からの焙着某材「3Ίの作製

実施例 1で製造したハイブリッド繊維から微細な綿状構造物を作製した。また、撚糸した実施例 1で製造したノヽイブリツド繊維力も約 400 μ mの糸と糸との間隙を有する織物状構造物を作製し、筒状に成形加工した後、この内部に前記綿状構造物を詰めて培養基材 [3]を作製した（図 1)。この培養基材の空隙率は 92. 6%であった。

[0036] 実施例 5

焙着某材を用いた軟骨細胞の焙着 (1)

実施例 2に記載の培養基材 [1]を用いて軟骨細胞の培養試験を実施した。 Kawasa kiら、および Yasuiらの方法（Kawasaki, K.等， J.Cell Physiol, 179, 142-148(1999), Ya sui, N.等， Exp.Cell Biol., 50, 92-100(1982))に準じて軟骨細胞の採取および培養を行った。すなわち、日本白色家兎 (8週齢、体重 1. 8〜2. Okg)の膝関節部位カも軟骨組織片を採取し、 0. 25%トリプシン溶液を添加して 37°Cで 25分間処理した後、 0 . 25%コラーゲナーゼ (タイプ II)溶液を添加し、 37°Cで 4時間程度処理を行い、細胞を単離した。この細胞浮遊液を 50 L採取しトリパンブルー 50 Lをカ卩え、よく撹拌した後、 20 Lを血球計算盤に乗せて細胞数をカウントし、全細胞数を算出した。予めオートクレーブで滅菌処理を行った培養基材をマルチウヱルプレート（12ゥエル、 Falcon社製）に入れ、基材上に各基材当たり 3 X 10⁵個となるように軟骨細胞浮遊液 80 Lを添カ卩した。 5%CO存在下、 37°Cの培養器で 1時間インキュベートした後

2

、 DMEM培地 2mLを少量ずつ添カ卩し、さらに 0. 1%ァスコルビン酸ホスフェート 20 μ Lをカ卩えて、上記条件下で 8週間培養を行った。比較対照として、織物状構造物の糸と糸との間隙が約 200 mの培養基材についても同様に培養試験を実施した。なお、タンパク量は Lowry法に、また、酸性ムコ多糖量はジメチルメチレンブルーを用いた Farndaleらの方法（Farndale, R.W.,等 Biochimi ca et Biophysica Acta, 883, 173-177 (1986))に準じて測定した。

[0037] 図 2には 21日間培養した際のタンパク質量の変化を示した力実施例 2に記載の糸と糸との間隙が 400 mの培養基材を用いた場合、比較対照とした間隙 200 m の培養基材 (空隙率 59. 3%)と比較してタンパク質量の増加が良好であった。また、図 3には酸性ムコ多糖量の変化を示した力間隙 400 mの培養基材では培養に伴つて顕著に増加した。これに対し間隙が 200 mの培養基材では酸性ムコ多糖の産生はほとんど見られな力つた。

[0038] 実施例 6 焙着某材を用いた軟骨細胞の焙着 (2)

実施例 3の培養基材 [2]を用いて実施例 5と同様な方法により軟骨細胞の培養試験を実施した。比較対照には実施例 2に記載の培養基材 [1]を使用した。図 4にはタンパク量の変化を、図 5には酸性ムコ多糖量の変化を示した力実施例 2に記載した糸と糸との間隙が 400 /z mの織物状構造物の内部に綿状繊維を含む構造の培養基材を用いた場合、糸と糸との間隙 400 mの織物状構造物を重ね合わせた構造の培養基材と比較して、どちらの値とも良好に増加し、特に酸性ムコ多糖の増加が顕著であった。

[0039] 実施例 7

谘着某材用いた軟骨細qの谘着 (3)

培養基材 [1]および [2]を用いて、回転培養 (容器ごと回転させて培地に流れをつくる）方式での軟骨細胞の培養試験を実施した。

実施例 5に記載した方法と同様にして軟骨細胞を採集し、マルチウエルプレートに入れた培養基材に播種した。 5%CO存在下、 37°Cの培養器で 1時間インキュベー

2

トした後、 DMEM培地 2mLを少量ずつ添カ卩し、さらに 0. 1%ァスコルビン酸ホスフエート 20 Lを加えて上記条件下で 1週間静置培養を行った。この培養基材を専用の培養容器に入れ、市販の装置 (Synthecon社製)を用いて 5%CO存在下、 37°Cで 7

2

週間、回転培養を行った (合計 8週間）。なお、 DNA量は発色試薬である Hoechst33 258を用いて測定した。

[0040] 図 6には培養組織の湿重量、タンパク量および DNA量の変化を示した。培養基材

[1]および [2]のどちらを用いた場合でも全ての値が培養に伴って良好に増加した 1S 両基材の差は見られな力つた。一方、図 9には 5週間および 8週間培養した軟骨組織のタイプ IIコラーゲンの抗体染色像を示したが、培養基材 [2]を用いた場合には、基材内部までタイプ Πコラーゲンが十分形成されていた。これに対し、培養基材 [1] では内部でのタイプ IIコラーゲンの産生が不十分であった。

[0041] 静置培養を行った場合には、正常軟骨組織には含まれていないタイプ Iコラーゲンの産生が若干見られたが、回転培養を行うことによって、どちらの基材を使用した場合でもタイプ Iコラーゲンの産生は全く見られな力つた。 [0042] なお、生分解性の合成繊維であるポリダラクチン繊維を用いて培養基材 [1]と同様の基材を作成し、比較対象として同様の培養試験を行ったところ、 3週間の培養でポリグラクチン繊維は溶解し、基材形状の維持は困難であった。

[0043] 実施例 8

焙着某材を用いた軟骨細胞の焙着 (4)

培養基材 [ 1 ]および [ 2]を用いて、回転培養と低酸素条件を併用した培養方式での軟骨細胞の培養試験を実施した。

実施例 7に記載した方法と同様にして 1週間の静置培養を行った後、専用の培養容器に入れ、 5%CO存在下、 37°C、通常の酸素濃度下（20%O )で回転培養を 1

2 2

週間行った。次いで、酸素濃度を 5%に設定した培養器中（5%CO、 37°C)で 6週

2

間、回転培養を行った (合計 8週間)。なお、培養組織の硬度は万能試験機 (AGS— H、島津製作所製)を用いて測定した圧縮強度曲線力算出したヤング率で表記した。

[0044] 図 8には培養組織の湿重量、タンパク量および DNA量の変化を示した。実施例 5と同様、両基材とも培養に伴って全ての値が通常の 20%O下での回転培養（図 5)に

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比べて顕著に増加したが、基材構造による差は見られな力つた。一方、図 13にはタイブ IIコラーゲンの抗体染色像を示したが、培養基材 [1]を用いた場合には 5週間の培養では基材中央部分におけるタイプ IIコラーゲンの産生が不十分であつたのに対し、培養基材 [2]を用いた場合には、 5週間の培養で基材内部まで良好にタイプ IIコラーゲンが産生されていた。また、図 14には培養基材 [2]を用いて培養した組織の硬度変化を示したが、培養 5週目以降に急激な硬度の上昇が見られた。これは、タイプ IIコラーゲンの産生によって正常軟骨組織と同様の硬い軟骨組織が形成されたことによるものと考えられる。これらのことから、培養基材 [2]を用い、回転培養と低酸素条件を組み合わせることによって、通常の 20%O下より短期間の 5週間の培養によ

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つても軟骨組織が十分形成され、且つ、基材内部まで十分、タイプ IIコラーゲンで占められた良好な移植用軟骨組織を得ることができる。

[0045] 実施例 9

焙着某材を用いた軟骨細胞の焙着 (5) 実施例 4に記載の培養基材 [3]を用いて、回転培養方式での軟骨細胞の培養試験を実施した。実施例 7に記載した方法と同様にして 1週間の静置培養を行った後、専用の培養容器に入れ、 5%COおよび 20%O下、 37°Cで 7週間、回転培養を行

2 2

つた (合計 8週間)。

[0046] 図 11には培養組織の湿重量、タンパク量および DNA量の変化を示した。培養基材 [2]および [3]の両基材とも培養に伴って全ての値が増加したが、基材構造による明確な差は見られな力つた。一方、図 18には培養基材 [3]を用いた場合のタイプ IIコラーゲンの抗体染色像を示したが、 5週間の培養ではやや空隙が見られるものの、 8 週間培養を行うことによって内部まで良好にタイプ IIコラーゲンが産生しているのを確認した。また、培養基材 [2]を用いて培養した場合には、基材を取り囲むように組織が形成されるため、内部のみを取り出して移植することは困難であるが、培養基材 [3 ]を用いて培養を行った場合には、表面の織物状構造物を取り除いて、内部のタイプ Πコラーゲンで満たされた綿状構造物部分のみを移植することも可能であった。

[0047] 実施例 10

谘着某材用いた細胞の谘着

実施例 3に記載の基材 [2]を用いて、幹細胞の培養試験を実施した。 Wakitani等の方法（Wakitani, S.等， J. Bone Joint Surg. Am., 76, 579- 592(1994))に準じて、日本白色家兎 (8週齢)の顎骨より骨髄液を採取し、 10%の FBSおよび 1%の抗生物質 (ペニシリンとストレプトマイシンとファンギゾンの混液）を含む DMEM培地中で 14日間培養を行った。この後、培養容器底面の接着細胞 (骨髄間質細胞および骨髄間葉系細胞）のみを回収し、さらに培養を行った。

予めオートクレーブで滅菌処理を行った培養基材をマルチウエルプレート（24ゥェル）に入れ、基材当たり 2. 5xl0⁷個となるように増殖させた骨髄細胞を含む細胞浮遊液 25 1を播種した。 5%CO存在下、 37°Cの培養器で 1時間インキュベートした

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後、軟骨誘導用培地 lmlを少量ずつ添加し、上記条件下で 21日間培養を行った。なお軟骨誘導用培地には、抗性物質 (ペニシリンとストレプトマイシンとファンギゾンの混液） 1%、デキサメサゾン 0. l ^ M,ピルビン酸 100 μ g/mUァスコルビン酸— 2 —ホスフェート 50 μ g/m プロリン 40 μ gZmlおよび TGF— β 10ng/mlを含む DMEM— high glucose培地を使用した。

図 19には 21日間培養した際の組織のタイプ IIコラーゲンの抗体染色像を示したが、基材内部まで十分タイプ IIコラーゲンが形成されており、本基材により骨髄幹細胞力も軟骨細胞への分ィ匕が良好に起こっていることを確認した。

[0048] 比較例 2

ノ、イブリツド繊維からの焙着某材の作製

実施例 1で製造したハイブリッド繊維から微細な綿状構造物を作製した。また、撚糸した実施例 1で製造したノヽイブリツド繊維力も約 600 μ mの糸と糸との間隙を有する織物状構造物を作製し、筒状に成形加工した後、この内部に前記綿状構造物を詰めて培養基材 [4]を作製した。この培養基材の空隙率は 95. 8%であった。

[0049] 実施例 11

谘着某材用いた軟骨細胞の谘着

比較例 2の培養基材 [4]を用いて、回転培養方式での軟骨細胞の培養試験を実施した。比較対照には実施例 4に記載の培養基材 [3]を使用した。実施例 7に記載した方法と同様にして 1週間の静置培養を行った後、専用の培養容器に入れ、 5%CO

2 および 20%0下、 37°Cで 7週間、回転培養を行った (合計 8週間）。

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空隙率 92. 6%の実培養基材 [3]を用いて培養した場合には、タンパク量および D NA量は図 16および図 17とほぼ同様に両者とも良好に増加した力空隙率 95. 8% の培養基材 [4]を用いて培養した場合には、このような良好な増加は見られなカゝつた。また、タイプ IIコラーゲンの抗体染色を行った結果、タイプ IIコラーゲンの産生も図 1 8に比べて不十分であった。

産業上の利用可能性

[0050] 再生医療のための培養基材として利用できる。

Claims

請求の範囲

[1] 繊維内部がキトサンまたはその塩よりなり、繊維表面がキトサンとヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、およびデルマタン硫酸よりなる群から選択される酸性生体高分子との複合体で被覆されているキトサン Z酸性生体高分子ハイブリッド繊維よりなる織物または編物を含む軟骨組織再生用培養基材であって、織物または編物の糸と糸の間隙は 250〜500 μ mであり、基材内部の空隙率が 65〜94%である培養基材。

[2] 織物または編物を重ねてなる請求項 1に記載の軟骨組織再生用培養基材。

[3] 織物または編物の間に、請求項 1に記載のキトサン Z酸性生体高分子ハイブリッド繊維よりなる綿状物が挟まれて!/ヽる請求項 1に記載の軟骨組織再生用培養基材。

[4] 織物または編物で作った円筒中に、請求項 1に記載のキトサン Z酸性生体高分子ハイブリッド繊維よりなる綿状物が充填されて、る請求項 1に記載の軟骨組織再生用培養基材。

[5] 請求項 1〜4の!ヽずれかに記載の培養基材を用いて生体外で軟骨細胞を培養する方法。

[6] 培養容器を回転させながら培養を行う請求項 5に記載の培養方法。

[7] 培地を振とうしながら培養する請求項 5に記載の培養方法。

[8] 低酸素条件下で培養する請求項 5〜7の、ずれかに記載の培養方法。

[9] 請求項 5〜8の!ヽずれかに記載の培養方法で得られる移植用軟骨組織。