WO2006126267A1 - 遺伝子類導入方法 - Google Patents
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Definitions
- the present invention relates to a method for efficiently introducing genes into a target cell and a kit for introducing genes in vitro and in vivo.
- Non-Patent Document 2 Gao X and Huang L., A novel conjugated liposome reag ent for efficient transfection of mammalian cells.Biochem. Biophys.Res. Commun 179 280-285, 1991
- Non-Patent Document 3 Tachibana K, Uchida T, Ogawa K. Yamashita N. Tamura
- the pressure after filling is preferably 1 atm (gauge pressure) or more, particularly 1 to 1.5 atm.
- a filling means it is easy to inject from a rubber stopper or the like with a syringe or the like, but an injection cylinder may be used.
- the complex (A) and the gas-containing fine particles (B) are added or administered to the target cell-containing composition or the living body.
- the target cell-containing composition includes a target cell culture solution.
- examples of the living body include mammals including humans, birds, fishes, reptiles, insects, plants and the like.
- the target cell is the cell or cell to which the gene is to be introduced.
- the gas-containing microparticle (B) When the gas-containing microparticle (B) is irradiated with a low-frequency ultrasonic wave including a resonance frequency of 0.5 to 2 MHz, the microparticle collapses and a cavity is generated due to a gas microbubble. As a result, the complex (A) present in the vicinity thereof or the complex (A) in the gas-containing fine particles is efficiently introduced into the target cells. The reason why this complex (A) is efficiently introduced into the target cell is not clear, but it is thought to be because it is positively charged and easily comes into contact with the cell surface.
- DOPE dioleoylphosphatidylethanolamine
- Plasmid DNA encoding luciferase was mixed with protamine to produce a DNA-protamine complex, which was made compact. At this time, the charge of the entire complex was set to be positive (+0.5 to +20 mV at zeta potential). For comparison, the charge of the whole complex was set to be negative (7 mV at zeta potential).
- DPPC Cholesterol (1: 1 (m / m)) lipid dissolved in organic solvent of black mouth form: isopropyl ether (1: lv / v) and aqueous solution (or aqueous solution containing drugs) such as physiological saline.
- black mouth form: isopropyl ether: Aqueous solution 1: 1: lv / v
- the mixture was mixed to obtain an emulsion.
- ribosomes were prepared by the reverse phase evaporation method (REV method). Pass through 400, 200, and lOOnm polycarbonate membranes with an etastruder to adjust the particle size.
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Abstract
標的細胞への遺伝子の効率的な導入法を提供する。
標的細胞含有組成物又は生体に（Ａ）遺伝子類とカチオン性物質とからなる正に荷電した複合体及び（Ｂ）ガス含有微小粒子を添加又は投与後、低周波超音波を照射することを特徴とする標的細胞への遺伝子類導入方法。
Description
明 細 書
遺伝子類導入方法
技術分野
[0001] 本発明は、インビトロ及びインビボにおいて、標的細胞に効率良く遺伝子類を導入 する方法及び遺伝子類導入用キットに関する。
背景技術
[0002] 標的細胞に遺伝子類を導入する方法としては、遺伝子類を第 4級アンモ-ゥム塩 含有リボソームに封入させて投与する方法 (非特許文献 1)、遺伝子類とともにプロタ ミン等を投与する方法 (非特許文献 2)等が知られている。しかし、これらの手段では、 標的細胞への遺伝子類の導入効率は未だ満足できるものではな力つた。
[0003] 一方、アルブミンでできた薄!、殻の中にオタタフツ化プロパンガス等を封入したマイ クロバブルと遺伝子類とを同時に投与し、超音波を照射すると、内封されたガスのキ ャビテーシヨンにより、標的細胞に対して遺伝子類を導入できることが知られている（ 非特許文献 3)。
非特干文献 1： Feigner P. L. Canonic liposome— mediated transfection with lipofection reagent, Meth. Mol. Biol 91— 98, 1991
非特許文献 2 : Gao X and Huang L. , A novel cationic liposome reag ent for efficient transfection of mammalian cells. Biochem. Biophys . Res. Commun 179 280- 285, 1991
非特許文献 3 :Tachibana K, Uchida T, Ogawa K. Yamashita N. Tamura
K. , Induction of cell― membrane porosity by ultrasound. Lancet 353, 1409, 1999
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0004] しかし、前記マイクロバブルを使用した手段によってもその遺伝子導入効率は低ぐ さらに導入効率の高い方法が望まれていた。
課題を解決するための手段
[0005] そこで本発明者は、遺伝子類とマイクロバブルをそのまま使用するのでなぐ予め 遺伝子類とカチオン性物質とを複合化させ、その表面荷電を正にした複合体とし、こ れとマイクロバブルとを組み合せ、超音波照射すれば、標的細胞への遺伝子類の導 入効率が 10倍から 10000倍に飛躍的に向上することを見出し、本発明を完成した。
[0006] すなわち、本発明は、標的細胞含有組成物又は生体に、（A)遺伝子類とカチオン 性物質とからなる正に荷電した複合体及び (B)ガス含有微小粒子を添加又は投与 後、低周波超音波を照射することを特徴とする標的細胞への遺伝子類導入方法を提 供するものである。
また本発明は、（A)遺伝子類とカチオン性物質とからなる正に荷電した複合体及び (B)ガス含有微小粒子を含有する標的細胞への遺伝子類導入用キットを提供するも のである。
発明の効果
[0007] 本発明方法によれば、インビトロ及びインビボの 、ずれにお 、ても、標的細胞に、 目的とする遺伝子類を極めて効率良く導入できる。従って、本発明を用いれば、従来 導入効率が低いことが原因で不可能だった形質転換細胞の生成率が向上する。ま た、遺伝子治療の有効率も飛躍的に向上する。
発明を実施するための最良の形態
[0008] 本発明は、（A)遺伝子類とカチオン性物質とからなる正に荷電した複合体を用いる ことを特徴とする。ここで、遺伝子類としては、 DNA、 RNA、アンチセンス DNA、 SIR NA、デコイ、治療用オリゴヌクレオチド等が挙げられる。また、カチオン性物質として は、プロタミン、ポリ— L—リジン、ポリ— L—アルギニン、オル-チン等のカチオン性 ペプチド；ポリエチレンィミン、カチォニックデンドリマー、キトサン等のカチオン性ポリ マー等が挙げられる。これら遺伝子類とカチオン性物質とからなる複合体は、例えば これらを精製水中で混合することにより製造することができる。溶媒によっては凝集が おこるので事前の検討が必要である。このとき、得られる複合体全体の荷電を正にな るよう〖こすることが必要である。当該荷電は、ゼータ電位で + 5〜 + 20mVとなるよう に調整するのが好ましい。ゼータ電位は、通常のゼータ電位測定装置で測定できる
[0009] また、当該複合体の粒子径は、 100〜300nm程度にするの力 遺伝子導入効率 の点で好まし 、。この粒子径はレーザー光散乱微粒子測定装置によって測定できる
[0010] ここで用いる遺伝子類とカチオン性物質とは、重量比で 1： 100-100 : 1,より好ま しくは 1： 10〜： LO : 1の割合で混合するのが好ましい。
[0011] 一方、（B)ガス含有微小粒子としては、従来力もマイクロバブルとして利用されてい るもの、例えばアルブミン小包中にガスを封入したものの他、ガス封入リボソームを用 いることができる。ここで、公知のマイクロバブルとしては、 Alubunex (Molecular B losystems)、 Levovist ( chermgノ、 Sonavist (Schhering) ^ Echovist (schheri ng)、 Sonazoid (Nycomed)、 Optison(Nycomed— Amersham)、 Definity (Du Pont Pharmaceutical)、 SonoVue (Bracco)等; ^挙げられる。
[0012] ガス封入リボソームとしては、内容積の 20〜80%リボソーム懸濁液を含有する密封 容器の空隙部にフッ化ガス又は窒素ガスを充填し、超音波処理することにより得られ るガス封入リボソームが挙げられる。
[0013] ここでリボソームの膜構成成分として用いられる脂質類としては、リン脂質、グリセ口 糖脂質及びスフインゴ糖脂質の他、これらの脂質に、 1級ァミノ基、 2級ァミノ基、 3級 アミノ基又は第 4級アンモ-ゥム基が導入されたカチオン性脂質、これらの脂質にポリ アルキレングリコールが導入された脂質、さらに各種細胞、組織等に対するリガンドが 結合した脂質類が挙げられる。
[0014] リン脂質としては、例えばホスファチジルコリン（大豆ホスファチジルコリン、卵黄ホス ファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジル コリン等）、ホスファチジルエタノールァミン（ジステアロイルホスファチジルエタノール アミン等）、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロール、ホ スファチジルイノシトール、リゾホスファチジルコリン、スフインゴミエリン、卵黄レシチン 、大豆レシチン、水素添加リン脂質等の天然又は合成のリン脂質等が挙げられる。
[0015] グリセ口糖脂質としては、例えばスルホキシリボシルグリセリド、ジグリコシルジグリセ リド、ジガラタトシルジグリセリド、ガラクトシルジグリセリド、グリコシルジグリセリド等が 挙げられる。スフインゴ糖脂質としては、例えばガラクトシルセレブ口シド、ラタトシルセ
レブ口シド、ガンダリオシド等が挙げられる。
[0016] カチオン性脂質としては、上記リン脂質、グリセ口糖脂質又はスフインゴ糖脂質に、 アミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、トリアルキルアンモ-ゥム基、モノア シルォキシアルキル ジアルキルアンモ-ゥム基、ジァシルォキシアルキル モノア ルキルアンモ-ゥム基等の第 4級アンモ-ゥム基が導入された脂質が挙げられる。ま た、ポリアルキレングリコール修飾脂質としては、上記リン脂質、グリセ口糖脂質、スフ インゴ糖脂質に、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール等が修飾した脂質
、例えばジ— C ァシル—グリセロール—ホスファチジルエタノールァミン— N— P
12-24
EG等が挙げられる。
[0017] また必要に応じて膜安定化剤としてコレステロール類、抗酸化剤としてトコフェロー ル類、ステアリルァミン、ジセチルホスフェート、ガレダリオシドを用いてもよい。
[0018] また、標的細胞、標的糸且織、標的病巣に対するリガンドとしては、トランスフェリン、 葉酸、ヒアルロン酸、ガラクトース、マンノースなどの癌細胞に対するリガンド等が挙げ られる。また、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体もリガンドとして使用できる。
[0019] また、予め作成されるリボソームの内部には、水相であればよいが、遺伝子類等を 含有してちょい。
[0020] リボソームの製造には、公知のリボソームの調製法を適用することができ、例えばバ ンガム（Bangham)らのリボソーム調製法 [ジャーナル ·ォブ ·モレキュラ^ ~ ·バイオ口 ジー (J. Mol. Biol. ) , 13, 238 (1965) ]、エタノール注入法 [ジャーナル'ォブ 'セ ル 'バイオロジー (J. Cell. Biol. ) , 66, 621 (1975) ]、フレンチプレス法 [フエブス' レター（FEBS Lett. ) , 99, 210 (1979) ]、凍結融解法 [アーカイブス'ォブ 'バイ オケミストリ^ ~ ·アンド'バイオフィジックス（Arch. Biochem. Biophys. ) , 212, 186 (1981) ]、逆相蒸発法 [プロシーデイング ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー 'ォブ 'サ イエンシズ.ユ^ ~ .エス.エー（proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 75, 4194 (1978) ] 等が挙げられる。例えば、脂質類等を有機溶媒に溶解し、これに水性溶液を加え、 次いで、超音波処理してリボソーム懸濁液を得る。次いで必要によりこれをェクストル ーダー及び Z又はメンブランフィルターを用いて、整粒する。このとき、粒子径は、 1 /z m以下、さらに 100〜800nm、特に 100〜600nmに整粒するの力 ^好まし!/、。
[0021] 得られたリボソーム懸濁液は密封容器に注入する。このとき、容器の空隙率は内容 積の 20〜800/0、さらに 30〜800/0、特に 50〜800/0にするの力好まし!/、。 200/0未満 では、得られるリボソームのガス導入率が低すぎる。一方、 80%を超えると経済的で ない。
[0022] この空隙部にフッ化物ガス又は窒素ガスを充填する。フッ化物ガスとしては、硫ィ匕 へキサフルオライド、パーフルォロ炭化水素ガス、例えば、 CF、 C F、 C F、 C F
4 2 6 3 8 4 10
、C F 、C F 等が挙げられ、 C F、C F 、C F が特に好ましい。また、窒素ガス
5 12 6 14 3 8 4 10 5 12
も使用できる。充填した後の圧力は 1気圧 (ゲージ圧)以上、特に 1〜1. 5気圧が好ま しい。充填手段としては、ゴム栓等から注射器等により、注入するのが簡便であるが、 注入用シリンダーを用いてもょ ヽ。
[0023] 次 、で超音波処理する。超音波処理は、例えば、 20〜50kHzの超音波を 1〜5分 照射すればよい。当該超音波処理により、リボソーム内部の水溶液とフッ化物ガス又 は窒素ガスとが置換し、ガス封入リボソームが得られる。得られたガス封入リボソーム の粒子径は、原料リボソームのそれとほぼ同じである。従って、リボソーム調整時に整 粒しておけば、粒子径が一定範囲、例えば 1 μ m以下、さらに 50〜800nm、特に 10 0〜600nmのガス封入リボソームが簡便に得られる。
[0024] なお、フッ化物ガス又は窒素ガスを充填したリボソーム懸濁液含有密封容器を調製 しておき、これを病院等に供給すれば、現場で超音波処理するだけで容易にガス封 入リボソームを得ることができる。
[0025] 力べして得られたガス封入リボソームは、粒子径が小さぐその粒度分布も一定にす ることができるので、微小血管、深部組織等への移行が可能である。
[0026] また、本発明においては、前記複合体 (A)は、ガス含有微小粒子 (B)に内封され ていてもよい。内封手段としては、ガス含有微小粒子の調製段階で行う方法、及びガ ス含有微小粒子を調製後に前記複合体 (A)を添加し、混合する方法が挙げられる。
[0027] 本発明にお 、ては、標的細胞含有組成物又は生体に、前記複合体 (A)及びガス 含有微小粒子 (B)を添加又は投与する。ここで、標的細胞含有組成物としては、標 的細胞培養液が挙げられる。一方、生体としては、ヒトを含む哺乳類、鳥類、魚類、ハ 虫類、昆虫、植物等が挙げられる。標的細胞は遺伝子を導入しょうとする細胞又は細
胞を含む組織である。
[0028] ここでインビトロの場合には、標的細胞培養液に、前記複合体 (A)及びガス含有微 小粒子 (B)を添加後、低周波超音波を照射すればよい。一方、インビボの場合には 、生体に前記複合体及びガス含有微小粒子を投与した後、診断用超音波（2〜6M Hz)を照射し、標的細胞への移行を確認した後、低周波超音波を照射すればよい。 このときの投与法は、局所投与でもよぐ静脈内投与でもよい。
[0029] ガス含有微小粒子 (B)は、 0. 5〜2MHzの共振周波数を含む低周波超音波を照 射すると、微小粒子の崩壊とガスの微小気泡によるキヤビテーシヨンを生じる。この結 果、その近傍に存在する前記複合体 (A)、又はガス含有微粒子中の前記複合体 (A )は、標的細胞に対して、効率良く導入される。この複合体 (A)が、標的細胞に効率 良く導入される理由は、明らかではないが、正荷電であるため細胞表面に接触しや す 、状態になって 、るためと考えられる。
実施例
[0030] 次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明は何らこれらに限定され るものではない。
以下、実施例で用いる略語は次のとおりである。
DPPC：ジパルミトイルホスファチジルコリン
DOPE：ジォレオイルホスファチジルエタノールァミン
DOTAP : 1, 2 ジォレオイル 3 トリメチルアンモ -ゥム一プロパン
[0031] 実施例 1
(1)ルシフェラーゼをコードしたプラスミド DNAとプロタミンを混合し、 DNA—プロタミ ン複合体を作製し、コンパクトなサイズにした。このとき、複合体全体の荷電を正 (ゼ ータ電位で +0. 5から + 20mV)となるようにした。比較のために複合体全体の荷電 を負（ゼータ電位で 7mV)となるようにした。
[0032] (2) DPPCリボソーム
DPPC：コレステロール（1 : 1 (m/m) )の脂質をクロ口ホルム：イソプロピルエーテル (1： lv/v)の有機溶媒に溶解し、生理食塩水などの水溶液 (または薬物を含む水溶 液）を有機溶媒の 1Z2容量を加えて（このとき、クロ口ホルム:イソプロピルエーテル：
水溶液 = 1:1: lv/v)混和しェマルジヨンとした。これを用いて逆相蒸発法 (REV法 )でリボソームを調製した。エタストルーダーで 400nm、 200nm、 lOOnmのポリカー ボネート膜を通過させて粒径を揃える。
[0033] (3)DOTAPリボソーム
DOTAP:DOPE=l:lw/wをクロ口ホルムに溶解し、梨型フラスコ中に入れ、口 一タリーエバポレートで回転しながら有機溶媒をエバポレートして脂質の薄い膜を壁 に作製した (lipid filmの作製)。生理食塩水などの溶媒で水和（hydration)して、リ ポソームを作製した。超音波処理によってサイズを小さくする。または、エタストルーダ 一で 400nm、 200nm、 lOOnmのポリカーボネート膜を通過させて粒径を揃える。
[0034] (4)市販の力チォニックリボソーム力 なる遺伝子導入用の試薬として、以下の試薬 を用いた。
Lipofectin™ (DOTMA： DOPE =1:1 w/w)
LipofectACE™ (DDAB： DOPE =1:1.25 w/w)
[0035] (5)パーフルォロプロパンガス封入
バイアル瓶（5mLゝ 10mL、 20mLなど）に容量の 30% (1.5mLゝ 3mL、 6mL)に 相当するリボソーム水溶液 (脂質濃度は 5mgZmL)を入れ、パーフルォロプロパン ガスを空気と置換するように入れた。ゴム栓をしてシールしゴム栓を通じて注射器でさ らにパーフルォロプロパンを加えた。パーフルォロプロパンは全量で内容積の 1.5 倍で 1.5気圧程度の加圧状態にした。バス型超音波装置 (42kHz)に水を張り静置 し、 1分間照射処理した。
[0036] (6)48穴のプレートに八5?じー1細胞（4 104細胞7 611)培養し、 DNA—プロタミ ン複合体（1 g DNA、 lipid:DNA=12:lw/w)とガス封入 PEG—リボソームを 添加し、 1MHzの超音波を 3秒間パルス照射し、直ちに培養液を 3〜4回繰り返し洗 浄し、培養液を加えて 2日間培養した。その後、ルシフェラーゼ活性を常法により測 定した。得られた結果を表 1に示す。
[0037] [表 1]
パ一フルォロプ DNA/プロタミン複
口パンガス封入 合体の荷電状態
リボソーム 超音波処理の有無 発現量 （RLU/mg protein)
DPPC LP 正荷電 0.6 X 103
DPPC LP 正何電 + S0NIC 6.3 X 103
DPPC LP 負荷電 0.1 X 103
DOTAP LP 正荷電 4.9 X 106
DOTAP LP 正荷電 + S0NIC 205 X 106
DOTAP LP 負荷電 0.1 X 106
Li ofectin™ 正荷電 0.1 X 106
Lipofectin™ 正荷電 + SONIC 129 X 106
LipofectACETN 正荷電 0.3 X 106
Lipo feet ACE™ 正荷電 + S0NIC 135 X 106
結果から、パーフルォロプロパンガス封入カチォニックリボソームと正荷電状態の D NAZプロタミン複合体に対して低周波超音波を照射した場合に、高い発現量が得 られた。
Claims
請求の範囲
[I] 標的細胞含有組成物又は生体に、（A)遺伝子類とカチオン性物質とからなる正に 荷電した複合体及び (B)ガス含有微小粒子を添加又は投与後、低周波超音波を照 射することを特徴とする標的細胞への遺伝子類導入方法。
[2] 標的細胞含有組成物が、標的細胞培養液である請求項 1記載の遺伝子類導入方 法。
[3] カチオン性物質が、カチオン性ペプチド又はカチオン性ポリマーである請求項 1又 は 2記載の遺伝子類導入方法。
[4] ガス含有微小粒子が、高分子物質又はリボソームにガスが封入された小包体であ る請求項 1〜3のいずれか 1項記載の遺伝子類導入方法。
[5] (A)遺伝子類とカチオン性物質とからなる正に荷電した複合体が、 (B)ガス含有微 粒子に内封されている請求項 1〜4のいずれ力 1項記載の遺伝子類導入方法。
[6] (A)遺伝子類とカチオン性物質とからなる正に荷電した複合体及び (B)ガス含有 微小粒子を含有する標的細胞への遺伝子類導入用キット。
[7] 標的細胞含有組成物に、 (A)遺伝子類とカチオン性物質とからなる正に荷電した 複合体及び (B)ガス含有微小粒子を添加後、低周波超音波を照射することにより使 用されるものである請求項 6記載のキット。
[8] 生体に、（A)遺伝子類とカチオン性物質とからなる正に荷電した複合体及び (B)ガ ス含有微小粒子を投与し、次いで標的細胞に低周波超音波を照射することにより使 用されるものである請求項 6記載のキット。
[9] 標的細胞含有組成物が、標的細胞培養液である請求項 6又は 8記載のキット。
[10] カチオン性物質が、カチオン性ペプチド又はカチオン性ポリマーである請求項 6〜
9の!、ずれ力 1項記載のキット。
[II] ガス含有微小粒子が、高分子物質又はリボソームにガスが封入された小包体であ る請求項 6〜9の!、ずれ力 1項記載のキット。
[12] (A)遺伝子類とカチオン性物質とからなる正に荷電した複合体が、 (B)ガス含有微 粒子に内封されて 、る請求項 6〜： L 1の 、ずれか 1項記載のキット。
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