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WO2006121055A1 - γ-グルタミルアミド化合物の製造方法 - Google Patents

γ-グルタミルアミド化合物の製造方法 Download PDF

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Publication number
WO2006121055A1
WO2006121055A1 PCT/JP2006/309342 JP2006309342W WO2006121055A1 WO 2006121055 A1 WO2006121055 A1 WO 2006121055A1 JP 2006309342 W JP2006309342 W JP 2006309342W WO 2006121055 A1 WO2006121055 A1 WO 2006121055A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
synthetase
daltamylcystine
cells
protein
polynucleotide
Prior art date
Application number
PCT/JP2006/309342
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Koichiro Miyake
Shin-Ichi Hashimoto
Original Assignee
Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. filed Critical Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.
Priority to JP2007528292A priority Critical patent/JPWO2006121055A1/ja
Priority to US11/913,472 priority patent/US20090068713A1/en
Publication of WO2006121055A1 publication Critical patent/WO2006121055A1/ja

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/02—Amides, e.g. chloramphenicol or polyamides; Imides or polyimides; Urethanes, i.e. compounds comprising N-C=O structural element or polyurethanes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/93—Ligases (6)

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a ⁇ -daltamamylamide compound using ⁇ -daltammilcystine synthetase, a cultured product of cells having the enzyme, or a treated product of the culture as an enzyme source.
  • y-Gnoretaminocysteine synthetase ( ⁇ -glutamylcysteine synthetase) is known as a synthase of ⁇ -gnoretamyl peptide (see Non-Patent Document 1).
  • ⁇ -Glutamylcystine synthetase has a relatively wide substrate specificity and is known to have an activity to produce various ⁇ -Daltamyl amino acids from L-glutamic acid and various amino acids (see Patent Document 1). ).
  • ⁇ -daltamylcystine synthetase is also known to have an activity to produce y-daltamyl-4-hydroxyl-lide from 4-hydroxyaurine and L-glutamic acid. (See Patent Document 2).
  • ⁇ -glutamylcystine synthetase has an activity to produce a y-dartamamidamide compound from a glutamyl donor such as L-glutamic acid and an amine compound such as ethylamine. ,,,.
  • Theanine a kind of y-daltamamidhi compound, is known as the main ingredient of gyokuro umami, and is an important substance as a flavoring substance for foods such as tea.
  • theanine has been suggested to have various physiological effects such as relaxation effect, sleep disorder improvement, blood pressure suppression, cooling improvement, epilepsy prevention, and concentration enhancement, and it is a promising health food material. Is being viewed.
  • Non-Patent Document 1 Biotechnology Research Report, Kumagai et al., Vol.14, No.4, 8-17 (1985)
  • Patent Document 1 JP-A-57-132896
  • Patent Document 2 JP-A-57-99197
  • Patent Document 3 Japanese Patent Laid-Open No. 11-225789
  • Patent Document 4 JP-A-8-89266
  • Patent Document 5 International Publication No. 01/73038 Pamphlet
  • An object of the present invention is to provide a simple and efficient production method of a dartamylamide compound, preferably theanine.
  • the present invention relates to the following (1) to (10).
  • R 1 and R 2 are the same or different and represent a hydrogen atom, a substituted or unsubstituted lower group, A force represented by alkyl, substituted or unsubstituted lower alkyl, or substituted or unsubstituted lower alkyl, R 1 and R 2 cannot be hydrogen atoms at the same time).
  • a method for producing a ⁇ -daltamamiramide compound characterized by comprising:
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 one or more amino acid residues are deleted, replaced, or attached, and ⁇ -daltamylcystine synthetase activity is exhibited.
  • a protein comprising an amino acid sequence having 80% or more homology with the amino acid represented by SEQ ID NO: 1.
  • the cells having ⁇ -glutamylcystine synthetase are cells into which a polynucleotide encoding ⁇ -glutamylcysteine synthetase has been introduced. Manufacturing method.
  • a polynucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 [2] A polynucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 2
  • a ⁇ -daltamamidhi compound preferably theanine
  • a ⁇ -daltamamidhi compound can be produced easily and efficiently.
  • FIG. 1 is a diagram showing the structure of a ⁇ -glutamylcystine synthetase gene expression plasmid pGSKl derived from Escherichia coli W3110 strain.
  • esh I ⁇ -glutamylcystine synthetase gene derived from Escherichia coli W3110 strain
  • Pkc Ratatosoperon promoter region
  • TIEE Escherichia coli's lipoprotein terminator sequence
  • the ⁇ -daltamamidhi compound produced by the method of the present invention includes a compound represented by formula (I) (wherein R 1 and R 2 are the same or different and each represents a hydrogen atom, a substituted or unsubstituted lower alkyl group). Represents a substituted or unsubstituted lower alkenyl, or a substituted or unsubstituted lower alkynyl, but R 1 and R 2 do not simultaneously become hydrogen atoms). it can.
  • examples of lower alkyl include linear, branched, cyclic, or combinational alkyl having 1 to 10 carbon atoms, and more specifically, Examples of the chain and branched alkyl include methyl, ethyl, ⁇ _propyl, isopropinole, ⁇ -butyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl, n-pentyl, and neopentene. Examples include cyclic propyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cyclohexyl, and the like.
  • cyclic alkyl examples include cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cyclohexyl, and cyclohexyl.
  • alkyl which is a combination force of linear or branched and cyclic, such as cyclopropylmethyl, cyclopentylmethyl, cyclooctylethyl, and the like, including butyl, cyclooctyl, cyclodecyl, noradamantyl, and adamantyl.
  • Examples of the lower alcohol include a straight chain or branched chain alcohol having 2 to 10 carbon atoms, and more specifically, a bulle, a aryl, a 1-probe, 1-Butyl, 3-Butul, 2-Pental, 4-Pentel, 2-Hexal, 5-Hexal, 1-Heptenyl, 4-Heptul, 6-Heptul, 2-D Sell, 1-Ottur, 9-Decele, 1-None, 6-None and so on.
  • Examples of the lower alkynyl include straight chain or branched chain alkyl having 2 to 10 carbon atoms, and more specifically, ethur, propiel, buthl, pentyl, hexul, Examples include heptul, octyl, knurl, and deciel.
  • Substituents in the substituted lower alkyl, substituted lower alkyl and substituted lower alkyl are the same or different and have 1 to 3 substitutions, preferably 1 to 3 substitutions, more preferably 1 substitution. Examples thereof include halogen, nitro, hydroxy and the like.
  • R 1 is a hydrogen atom, R 2 acetyl, ethyl, propyl, cyclopropyl or A compound which is butyl, more preferably the following formula (II)
  • the -glutamylcystine synthetase used in the present invention may be of any origin as long as it is a ⁇ -glutamylcystine synthetase, but preferably the enzyme derived from enterobacteria, yeasts or filamentous fungi can be mentioned. .
  • a protein having an amino acid sequence registered in swiss-prot accession number P46309 from Arabidopsis thaliana (hereinafter, the number after the organism name also represents swiss-prot accession number, and the access ion number Q7WES2 from Bordetella bronchiseptica, Q7W3F2 from Bordetella parapertussis, 023736 from Brassica iuncea, P57485, P58994 and Q89AD8 from Buchnera aDhidicola, Q20117 from Caenorhabditis elegans, Q9HF78 from Candida albicans, Q97IV1 from C lostridium acetobutylicum, Q9W3K5 from Clostridium perfringens, Q9W3K5 from Escherichia coli, Q8X900, ecococcus 183 Q82ZG8, Leptospira interrogans Q8F4D5, Listeria innocua 0926X7
  • the enzyme derived from a microorganism in the enzyme more preferably the enzyme derived from an enteric bacterium, yeast, or filamentous fungus, Particularly preferred is the enzyme derived from Escherichia coli, most preferably a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the ⁇ -daltamylcystine synthetase used in the present invention has an amino acid sequence ability in which one or more amino acid residues are deleted, substituted or appended in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and Examples thereof include proteins having ⁇ -daltamylcystine synthetase activity.
  • a protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acid residues are deleted, substituted or added and having ⁇ -daltamylcystine synthetase activity is a molecular loning, A Laboratory Manual. , Third Edition, old Spring Harbor Laboratory Press (1989) (hereinafter abbreviated as Molecular ⁇ Cloning 3rd Edition), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997) Protocols' In'Molecular ⁇ ⁇ ⁇ abbreviated as Biology), Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982), Proc. Natl. Acad. Sci.
  • the number of amino acid residues to be deleted, substituted or added is not particularly limited, but is a number that can be deleted, substituted or added by a known method such as the above-mentioned site-specific mutation method, The number is 1 to several tens, preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and further preferably 1 to 5.
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 one or more amino acids are deleted, substituted, or added.
  • One or more amino acid residues are deleted, substituted, or added at any position in the same sequence. It may be added.
  • amino acid residues that can be substituted include the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and the above.
  • amino acid sequences of the ⁇ -daltamylcystine synthetases derived from various organisms described above are compared using known alignment software, the amino acids that can be stored in all amino acid sequences are listed. be able to.
  • known alignment software include alignment analysis software included in gene analysis software Genetyx (Software Development Co., Ltd.). Default values can be used as analysis parameters of the analysis software.
  • amino acid positions at which amino acid residues can be deleted or attached include the N-terminal side and C-terminal side of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • Amino acids that are substituted or added, which may be deleted, substituted or attached at the same time, may be natural or non-natural.
  • Natural amino acids include L-alanine, L-asparagine, L-aspartic acid, L-glutamine, L-glutamic acid, glycine, L-histidine, L-isoleucine, L-leucine, L-lysine, L-methionine, L-phenylalanine, L-proline, Examples include L-serine, L-threonine, L-tryptophan, L-tyrosine, L-parin, and L-cysteine.
  • amino acids that can be substituted with each other are shown below. Amino acids contained in the same group can be substituted for each other.
  • Group A Leucine, Isoleucine, Norleucine, Norin, Norpaline, Alanine, 2-Aminobutanoic acid, Methionine, 0-Methylserine, t-Butylglycine, t-Butylalanine, Cyclohexinolealanine
  • Group B aspartic acid, glutamic acid, isoaspartic acid, isoglutamic acid, 2-amino adipic acid, 2-aminosuberic acid
  • Group D lysine, arginine, ornithine, 2,4-dianaminobutanoic acid, 2,3-dianaminopropionic acid
  • Group E proline, 3-hydroxyproline, 4-hydroxyproline
  • Group F serine, threonine, homoserine
  • the protein used in the present invention is an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • a protein comprising an amino acid sequence having homology of 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, more preferably 97% or more, particularly preferably 98% or more, and most preferably 99% or more
  • a protein having ⁇ -daltamylcystine synthetase activity is an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • a protein having ⁇ -daltamylcystine synthetase activity that also has an amino acid sequence ability in which one or more amino acid residues are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • a DNA recombination method was used to confirm the activity! /
  • a transformant expressing the sputum protein was prepared, and the protein was produced using the transformant.
  • An example is a method in which protein, L-glutamic acid, and L-cysteine are present in an aqueous medium, and whether or not ⁇ -daltamylcystine is produced and accumulates in the aqueous medium is analyzed by HPLC or the like.
  • any cells such as microorganisms and animal and plant cells can be used as long as they have ⁇ -daltamylcystine synthetase.
  • ⁇ -daltamylcystine synthetase is used. Examples thereof include the cells having a polynucleotide to be encoded.
  • Examples of the cells include cells of various organisms having the above-mentioned 2 ⁇ -daltamylcystine synthetase, preferably microorganisms of the cells, and more preferably enteric cells of the microorganisms. Examples include fungi, yeasts and filamentous fungi, and more preferably Escherichia coli.
  • the cells used in the present invention are preferably cells with enhanced ⁇ -daltamylcystine synthetase activity.
  • the above-mentioned cells having ⁇ -glutamylcystine synthetase are used as mutants, for example, ⁇ -methy 'N'-nitro-N-nitrosoguanidine (NTG ), Etc., by treating the cells by a known method and selecting a cell line that exhibits an increase in ⁇ -daltammilcystine synthetase activity compared to the pre-mutation cell, Examples include recombinant strains obtained by introducing a polynucleotide encoding ⁇ -daltamylcystine synthetase into cells by a recombinant method.
  • the cell used in the present invention is preferably a cell having ⁇ -daltamylcystine synthetase and capable of producing a dartamyl donor, such as L-glutamic acid, more preferably ⁇ .
  • a dartamyl donor such as L-glutamic acid
  • -Cells that have dartamyl cystine synthetase and are enhanced in their ability to produce dartamyl donors, such as d-glutamic acid.
  • the cells include microorganisms that have artificially enhanced the ability to produce L-glutamic acid by known methods, preferably prokaryotes, and more preferably Escherichia coli.
  • the polynucleotide in the present invention is DNA or RNA, preferably DNA, and may be double-stranded or single-stranded. If double-stranded, it may be double-stranded DNA, double-stranded RNA, or a DNA: RNA hybrid. In the case of a single strand, it may be a sense strand (ie, a coding strand) or an antisense strand (ie, a non-coding strand).
  • the polynucleotide encoding ⁇ -glutamylcystine synthetase used in the present invention may be any polynucleotide as long as it is a polynucleotide encoding y-daltamylcystine synthetase.
  • Polynucleotides encoding ⁇ -glutamylcystine synthetase derived from cells having dartamylcystine synthetase can be mentioned.
  • GenBank accession derived from ArabidoDsis thaliana number A polynucleotide having a base sequence registered in Z29490 (hereinafter, 3 ⁇ 4 ⁇ after the organism name represents a GenBank accession number, meaning a polynucleotide having a base sequence registered in the accession number), Bordetella BX640450 derived from bronchiseDtica, BX640435 derived from Bordetella parapertussis, Y10 848 derived from Brassica iuncea, BA000003 derived from Buchnera aphidicola, AE014115 and AE014017, Z54218 derived from Caenorha bditis elegans, Clostridium from Candida albican77 BA000016 from perfringens, AF244351 from Drosophila me lanogaster, AE005497, AE016765 and X0 3954 from Escherichia coli, AE016956 from Enter
  • the polynucleotide encoding the grayed Honoré Tamil cis Tin synthetase and more preferably the polynucleotide derived from the above microorganism, further enterobacteria good Mashiku during microorganism, yeasts, Or the polynucleotide derived from a filamentous fungus, particularly preferably the polynucleotide derived from a microorganism belonging to the genus Escherichia in the enteric bacterium.
  • the polynucleotide derived from Escherichia coli most preferably a polynucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • the polynucleotide encoding ⁇ -daltamylcystine synthetase used in the present invention includes a polynucleotide having a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 and stringent conditions. Polynucleotides that encode proteins that hybridize below and have ⁇ -glutamylcystine synthetase activity can be mentioned.
  • hybridize means that a polynucleotide hybridizes to a polynucleotide having a specific base sequence or a part of the polynucleotide. Therefore, the polynucleotide having the specific base sequence or a part thereof is a polynucleotide that can be used as a probe for Northern or Southern blot analysis, or can be used as an oligonucleotide primer for PCR analysis.
  • the polynucleotide used as a probe include polynucleotides of at least 100 bases, preferably 200 bases or more, more preferably 500 bases or more.
  • Polynucleotides used as primers include at least 10 bases, Preferred examples include polynucleotides having 15 or more bases.
  • the above stringent conditions include a polynucleotide, preferably a DNA-immobilized filter and a probe, preferably a probe DNA, 50% formamide, 5 X SSC (750 mM sodium chloride, 75 mM quench. Sodium chloride), 50 mM sodium phosphate (pH 7.6), 5 X Denhardt's solution, 10% dextran sulfate, and 20 g / 1 denatured salmon sperm DNA at 42 ° C After incubation, conditions such as washing the filter in 0.2 X SSC solution at about 65 ° C are preferred, but lower, stringent conditions are preferred. It can also be used.
  • 5 X SSC 750 mM sodium chloride, 75 mM quench. Sodium chloride
  • 50 mM sodium phosphate pH 7.6
  • 5 X Denhardt's solution 10% dextran sulfate
  • 20 g / 1 denatured salmon sperm DNA 20 g / 1 denatured salmon sperm
  • Stringent conditions can be changed by adjusting the concentration of formamide (the lower the concentration of formamide, the lower the stringent), and changing the salt concentration and temperature conditions.
  • Low stringent conditions include, for example, 6 X SSCE (20 X SSCE is 3 mol / 1 sodium chloride, 0.2 mol / l sodium dihydrogen phosphate, 0.02 mol / l EDTA, pH 7.4), Incubate at 37 ° C in a solution containing 0.5% SDS, 30% formamide, 100 ⁇ g / 1 denatured salmon sperm DNA, then 1 X SSC, 0.1% SDS at 50 ° C The conditions for washing with the solution can be raised. Further, as a lower stringent condition, under the above-mentioned low stringent condition, washing is performed after carrying out a noblation and hybridization using a solution having a high salt concentration (for example, 5 X SSC). Conditions can be raised.
  • the various conditions described above can also be set by adding or changing a blocking reagent used for suppressing the background of the hybridization experiment.
  • the addition of the blocking reagent described above may be accompanied by changes in hybridization conditions in order to adapt the conditions.
  • the polynucleotide that can be hybridized under the above-mentioned stringent conditions includes, for example, the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 when calculated based on the above-mentioned parameters using the above-mentioned BLAST, FASTA, etc. And polynucleotides having a homology of at least 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 97% or more, still more preferably 98% or more, particularly preferably 99% or more.
  • the polynucleotide that hybridizes with the polynucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 under stringent conditions is a polynucleotide encoding a protein having ⁇ -daltamylcystine synthetase activity. For example, as described above, it can be confirmed by producing a protein encoded by the polynucleotide using a gene recombination method and measuring the activity of the protein.
  • the ⁇ -daltamylcystine synthetase used in the present invention is obtained by culturing the above three cells in a medium, generating and accumulating ⁇ -daltamylcystine synthetase in the culture, and according to a known protein purification method. It can be obtained by separating and purifying ⁇ -Daltamilcystine synthetase from the culture, preferably ⁇ -Daltamylcystine synthase.
  • a recombinant cell having an enhanced ⁇ -daltamylcystine synthetase activity obtained by introducing a polynucleotide encoding ⁇ -daltamilcystine synthetase into the cell by a gene recombination method is used.
  • One method is to obtain from a culture of replacement cells.
  • the nucleotide sequence of the polynucleotide encoding the ⁇ -daltamylcystine synthetase of the above 4 with respect to various gene sequence databases is 85% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, More preferably 97% or more, particularly preferably 98% or more, most preferably 99% or more of the homologous sequence is searched, and the chromosomal DNA of the organism having the base sequence based on the base sequence obtained by the search
  • the cDNA library has the same strength.
  • the polynucleotide tide encoding ⁇ -daltamylcystine synthetase can also be obtained by the method described above.
  • the obtained polynucleotide is cut as it is or with an appropriate restriction enzyme, and is incorporated into a vector by a conventional method.
  • a commonly used base sequence analysis method For example, by analysis using a base sequence analyzer such as the dideoxy method [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74, 5463 (1977)] or 373 ⁇ ⁇ DNA sequencer (manufactured by Perkin'Elma Corp.)
  • the nucleotide sequence of the polynucleotide can be determined.
  • the target polynucleotide can be prepared by chemical synthesis using a 8905 DNA synthesizer manufactured by Perceptive Biosystems.
  • Examples of the polynucleotide obtained as described above include a polynucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • Examples of host cells include microorganisms belonging to the genus Escherichia.
  • Examples of microorganisms belonging to the genus Escherichia include Escherichia coli XL1-Blue, Escherichia coli XL2-—Blue Escherichia coli DH1, Escherichia coli MC1000, Escherichia coli A TCC 12435, Escherichia coli W1485, Escherichia coli. JM109, Escherichia coli HB 101, Escherichia coli No.
  • Escherichia coli W3110 Escherichia coli NY49, Escherichia coli MP347, Escherichia coli NM522, Escherichia coli BL21, Escherichia coli ME8415, etc. Can do.
  • any method can be used as long as it is a method for introducing DNA into the host cell.
  • a method using calcium ion [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110 (1972)], protoplast method (JP-A-63-248394), electrovolution method [Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)] and the like.
  • Escherichia coli BL21 / pGSKl which is a microorganism having a recombinant DNA containing a polynucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 can be mentioned. .
  • Recombinant DNA is prepared by inserting the DNA fragment downstream of the promoter of an appropriate expression vector.
  • a transformant producing ⁇ -daltamylcystine synthetase By introducing the recombinant DNA into a host cell suitable for the expression vector, a transformant producing ⁇ -daltamylcystine synthetase can be obtained.
  • Any host cell can be used as long as it can express the target polynucleotide, such as bacteria, yeast, animal cells, insect cells, and plant cells.
  • the expression vector is capable of autonomous replication in the above host cell or can be integrated into a chromosome, and contains a promoter at a position where DNA encoding ⁇ -glutamylcystine synthetase can be transcribed. Is used.
  • the recombinant DNA having a DNA encoding ⁇ -daltamylcystine synthetase can replicate autonomously in the prokaryote, and at the same time, a promoter, a ribosome binding sequence, gamma - Group Tamil cis Tin synthetase te peptidase encoding DN a, it is configured from transcription termination sequences recombinant DNA good or,. Contains the genes that control the promoter!
  • Expression vectors include pBTrp2, pBTacl, pBTac2 (all manufactured by Boehringer Mannheim), pHelixl (manufactured by Roche's Diagnostats), pKK233-2 (manufactured by Amersham 'Fanore Macia' Biotech), pSE280 (Invitrogen), pGEMEX-EX (Promega), pQE-8 (Qiagen), pET-3 (Novagen), pKYPIO (JP 58-110600), p KYP200 [Agric. Biol Chem., 48, 669 (1984)], pLSAl [Agric. Biol.
  • the promoter may be anything as long as it functions in a host cell such as Escherichia coli! For example, promoter (p),
  • promoters derived from SPOl promoter examples include promoters derived from SPOl promoter, SP02 promoter, and penP promoter. Also, a promoter with two Ps in series, ⁇ promoter,
  • the xylA promoter for expression in microorganisms belonging to the genus Bacillus [Appl.
  • a plasmid in which the distance between the Shine-Dalgarno sequence, which is a ribosome binding sequence, and the initiation codon is adjusted to an appropriate distance (eg, 6 to 18 bases).
  • a transcription termination sequence is not necessarily required, but a transcription termination sequence should be placed immediately below the structural gene. Is preferred.
  • Prokaryotes include Escherichia, Serratia, Bacillus, Brevibacterium, Corvnebacterium, Microbacterium, Pseudomonas, and Agronocterum (Agrobacterium), Alicyclonocinoles (Alicvclobacillus), Anabena (Anabena), Anacvstis, Arthrobacter, Azotobacter, Chromatium, Enorebini (Erwinia), Metvlobacterium, Phormidium, Rhodobact ⁇ 1, Rhodopseudomonas, Rhodospirillum, The genus Scenedesmus, the genus Streptomvces, the genus Svnechoccus, the Microorganisms belonging to the genus Zvmomonas, such as Escherichia coli XL and Blue Escherichia coli 'XL2—Blue Escher
  • Rhodobacter capsulat Rhodobacter capsulat
  • Rhodobacter 'spheroides Rhodes 1 ⁇ Monas buchsti y (Rnodopseudomonas blastica), Roton Eudomonas marina (RhodoDseudomonas marina), Rhodoseudomonas palustns, Mouth tospirium ryum (Rhodospirillum rubrum), Rothos spirum (Rhodospirillum rubrum) Salinarum (Eh odospirillum salinarum, Streptomvces ambof aciens), Sterrorism.
  • More preferred prokaryotes include microorganisms belonging to the genus Escherichia or Corynebataterium, and more preferred are Escherichia coli and Corynebacterium dartamicam.
  • examples of the microorganism include microorganisms with enhanced productivity of dartamyl donor, and more preferably microorganisms with enhanced productivity of L-glutamic acid. I can give you.
  • a microorganism artificially imparted with an ability to produce L-glutamic acid by a known method preferably a prokaryote, more preferably a microorganism belonging to the genus Escherichia or Corynebaterum, more preferably May include Escherichia coli and Corynebaterum glutamicum.
  • L-glutamic acid biosynthetic pathway power A method for weakening or blocking at least one of the metabolic pathways branching to metabolites other than L-glutamic acid, and
  • any method can be used as long as it is a method for introducing DNA into the above host cell.
  • a method using calcium ion [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69 , 2110 (1972)]
  • protoplast method Japanese Patent Laid-Open No. 63-248394
  • electrovolution method [Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)] and the like.
  • yeast strain for example, YEpl3 (ATCC37115), YEp24 (ATCC37051), YCp50 (ATCC37419), pHS19, pHS15, etc. can be used as an expression vector.
  • Any promoter can be used as long as it functions in yeast strains.
  • PH05 promoter PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter motor, gal i promoter, gal 10 promoter, heat shock poly
  • promoters include peptide promoters, MF al promoters, and CUP 1 promoters.
  • Host cells include the genus Saccharomvces, Schizosaccharomvces fe, Kluweromvces, Tricho sporon, the genus Schwanniomvces, Examples include yeast strains belonging to the genus Pichia or Canidaida (£ fe), such as Saccharomvces cerevisiae and Schi zosaccharomyces nombe. , Kunoreberoma TT 'Fuku Ice (Kluyveromyces lactis), bird Examples include Trichosporon pullulans, Schwannimvces alluvius, Pichia pastoris, Candida utilis and ida utilis.
  • any method for introducing recombinant DNA any method can be used as long as it introduces DNA into yeast.
  • the Elect Mouth Position Method [Methods EnzymoL, 194, 182 (1990)]
  • Examples include the plast method [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81, 4889 (1984)], the lithium acetate method [J. BacterioL, 153, 163 (1983)], and the like.
  • examples of expression vectors include pcDNAU pcD M8 (sold by Funakoshi), pAGE107 (JP-A-3-22979), pAS3-3 (JP-A-2-227075), pCDM8 [Nature , 329, 840 (1987)], pcDNAI / Amp (Invitrogen), pREP4 (Invitrogen), pAGE103 [J. Biochem, 101, 1307 (1987)], pAGE210, pAMo, pAMoA, etc. Can do.
  • Any promoter can be used as long as it functions in animal cells.
  • a promoter of the cytomegalovirus (CMV) IE (immediate early) gene an early promoter of SV40, or a metamouth.
  • CMV cytomegalovirus
  • Examples include thionein promoter, retrowinore promoter, heat shock promoter, SRa promoter and the like.
  • an enhancer of the IE gene of human CMV may be used together with a promoter.
  • Host cells include mouse 'myeloma cells, rat' myeloma cells, mouse 'hybridoma cells, human cells such as Namalwa cells or Namalva KJM-1 cells, human fetal kidney cells, human leukemia cells, Examples include African green monkey kidney cells, CHO cells that are Chinese hamster cells, and HBT5637 (Japanese Patent Laid-Open No. 63-299). As mouse myeloma cells, SP2 / 0, NSO, etc.
  • Rat 'myeloma cells as YB2 / 0 etc., human fetal kidney cells as HEK293 (ATCC CRL-1573), human leukemia cells as BALL-1, etc., Africa Examples of green monkey kidney cells include COS-l and COS-7.
  • any method for introducing recombinant DNA any method can be used as long as it is a method for introducing DNA into animal cells.
  • the electopore position method [Cytotechnology, 3, 133 (1990)]
  • the calcium phosphate method Japanese Patent Laid-Open No. 2-227075
  • the lipofusion method [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84, 7413 (1987)]
  • insect cells are used as hosts, for example, Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, WH Freeman and company, New York (1992), 7 Lund-Froto Cornolez 'In'Molecular'Neurology, Molecular Proteins can be produced by the methods described in Biology, A Laboratory Manual, Bio / Technology, 6, 47 (1988).
  • gene transfer vectors used in the method include pVL1392, pVLl
  • baculovirus for example, use of the autographa californica nu clear polyhedrosis virus; an autographa californica nu clear polyhedrosis virus; That's it.
  • Insect cells include Spodoptera frueiperda ovary cells
  • Spodoptera frugibelda ovary cells are S19, S11 (Baculovirus' Expression 'Vector Zura' Laboratory 'Mual), etc.) Trichopulsia' second ovary cells High 5 Examples of cultured cells derived from silkworm ovary such as 4 (manufactured by Invitrogen) include Bombix mori N4.
  • Examples of a method for co-introducing the above recombinant gene transfer vector and the above baculovirus into insect cells for preparing a recombinant virus include, for example, the calcium phosphate method (JP-A-2-227075), the lipofusion method [Proc. Natl. Acad Sci., USA, 84, 7413 (1987)].
  • expression vectors include Ti plasmids and tobacco mosaic virus vectors. Any promoter can be used as long as it functions in plant cells. Examples thereof include the cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S promoter, the rice actin 1 promoter, and the like.
  • CaMV cauliflower mosaic virus
  • host cells include tobacco, potato, tomato, carrot, soybean, rape, alfalfa, rice, wheat, barley, and other plant cells.
  • any method can be used as long as it is a method for introducing DNA into plant cells.
  • a method using Agrobacterium Japanese Patent Laid-Open No. 59-140885, specially disclosed. Examples include Kaisho 60-70080, WO94 / 00977), electo-poration method (Japanese Patent Publication 60-251887), a method using a particle gun (patent 2606856, Japanese Patent 2517813), and the like.
  • the above 3 cells or the transformants obtained in (1) and (2) above are cultured in a medium, and ⁇ -daltamylcystine synthetase is produced and accumulated in the culture, and the protein is obtained from the culture. By collecting, ⁇ -daltamylcystine synthetase can be produced.
  • the method of culturing cells and transformants having the above-mentioned ⁇ -daltamylcystine synthetase in a medium can be performed according to a usual method used for culturing cells.
  • a medium for culturing cells such as prokaryotes such as Escherichia coli or eukaryotes such as yeast, and transformants obtained using these as hosts, carbon sources and nitrogen sources that can be assimilated by the cells are used.
  • a natural medium or a synthetic medium may be used.
  • the carbon source may be glucose, fructose, sucrose, molasses containing these, carbohydrates such as starch or starch hydrolyzate, acetic acid, propionic acid, etc. as long as the organism can assimilate.
  • Organic acids, alcohols such as ethanol, propanol and the like can be used.
  • Nitrogen sources include ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, ammonium salts of organic acids such as ammonium salts, and other nitrogen-containing elements.
  • inorganic salt monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride salt, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, calcium carbonate, etc. may be used. it can.
  • the culture is usually carried out under aerobic conditions such as shaking culture or deep aeration stirring culture.
  • the culture temperature is 15-40 ° C.
  • the culture time is usually 5-7 days.
  • the pH is maintained at 3.0 to 9.0.
  • the pH is adjusted using an inorganic or organic acid, an alkaline solution, urea, calcium carbonate, ammonia or the like.
  • an antibiotic such as ampicillin or tetracycline should be added to the medium.
  • an inducer may be added to the medium as necessary.
  • an inducer such as isopropyl 1 ⁇ -D-thiogalatatopyranoside
  • indoleacrylic acid or the like may be added to the medium.
  • RPMI1640 medium J. Am. Med. Assoc., 199, 519 (1967)
  • Eagle's MEM medium Science, 122, 501 (1952)]
  • DMEM medium DMEM medium [Virology, 8, 396 (1959)]
  • 199 medium Proc. Soc. Biol. Med., 73, 1 (1950)] or these
  • a medium in which fetal calf serum or the like is added to the medium can be used.
  • Cultivation is usually carried out for 1 to 7 days under conditions such as pH 6 to 8, 25 to 40 ° C, and the presence of 5% CO.
  • antibiotics such as kanamycin, penicillin, streptomycin and the like may be added to the medium as needed during culture.
  • the culture media for transformants obtained using insect cells as hosts are the commonly used TNM-FH medium (Pharmingen), Sf-900 II SFM medium (Life Technologies). ), ExCell400, ExCell405 [Both made by JRH Biosciences], Grace ' s Insect Medium [Nature, 195, 788 (1962)] can be used.
  • Cultivation is usually carried out under conditions of pH 6-7, 25-30 ° C, etc. for 1-5 days.
  • antibiotics such as gentamicin may be added to the medium as needed during the culture.
  • Transformants obtained using plant cells as hosts are cultured as cells or differentiated into plant cells and organs. can do.
  • a medium for culturing the transformant commonly used Murashige 'and' Stag (MS) medium, White medium, or a plant hormone such as auxin or cytokinin is added to these mediums. It is possible to use the prepared medium.
  • Cultivation is usually carried out under conditions of pH 5-9, 20-40 ° C for 3-60 days.
  • antibiotics such as kanamycin and hygromycin may be added to the medium as needed during the culture.
  • y-Daltamylcystine synthetase can be produced intracellularly, secreted extracellularly, or produced on the outer membrane.
  • the structure of the cell used and the protein produced. The method can be applied by changing.
  • a ⁇ -daltamylcystine synthetase is produced by adding a signal peptide in front of the amino acid sequence containing the active site of ⁇ -glutamylcystine synthetase. It can be actively secreted extracellularly.
  • the production amount can be increased using a gene amplification system using a dihydrofolate reductase gene or the like.
  • the gene or animal plant cell is further subdivided to regenerate the gene. It is possible to construct an animal individual (transgenic non-human animal) or a plant individual (transgenic plant) into which gamma is introduced, and to produce ⁇ -daltamylcystine synthetase using these individuals. .
  • the protein is bred or cultivated according to a usual method, the protein is produced and accumulated, and the protein is obtained from the animal individual or plant individual. By collecting the protein, the protein can be produced.
  • a transgenic non-human animal introduced with a polynucleotide encoding ⁇ -daltamylcystine synthetase is bred, and ⁇ -daltamylcystine synthetase is produced and accumulated in the animal
  • the protein can be produced by collecting the protein from the animal. Examples of the place of production and accumulation in the animal include milk of the animal (Japanese Patent Laid-Open No. 63-309192), eggs and the like. Any promoter can be used as long as it functions in animals. 1S For example, mammary cell-specific promoters ⁇ -casein promoter, ⁇ -casein promoter, j8 lactoglobulin promoter, whey An acidic protein promoter or the like is preferably used.
  • a method for producing ⁇ -daltamylcystine synthetase using an individual plant for example, a known method using a transgenic plant into which a polynucleotide encoding ⁇ -daltamylcystine synthetase has been introduced [tissue culture, 20 (1994), tissue culture, 21 (1995), Tr ends BiotechnoL, 15, 45 (1997)], producing and accumulating the protein in the plant, and collecting the protein from the plant Thus, a method for producing the protein can be mentioned.
  • the cells were collected by centrifugation after culturing and suspended in an aqueous buffer, followed by an ultrasonic crusher and a French press. Then, crush the cells with a Manton Gaurin homogenizer, dynomill, etc. to obtain a cell-free extract.
  • an ordinary enzyme isolation and purification method that is, a solvent extraction method, a salting-out method using ammonium sulfate, a desalting method, a precipitation using an organic solvent, etc.
  • Anion exchange chromatography using resin such as dimethylaminoethyl (DEAE) -Sepharose, DIAION ⁇ -75 (Mitsubishi Kasei), resin such as S-Sepharose FF (Pharmacia) Cation exchange chromatography, hydrophobic chromatography using resins such as butyl sepharose and phenyl sepharose, gel filtration using molecular sieves, affinity chromatography, chromatofocusing, isoelectric focusing
  • a purified sample can be obtained by using an electrophoresis method such as electrophoresis alone or in combination.
  • the cells are similarly collected, crushed, and centrifuged to obtain a conventional method from a precipitate fraction obtained by centrifugation. After recovering the protein, the insoluble material of the protein is dissolved with a protein denaturant.
  • the solubilized solution is diluted with a solution containing no protein denaturant or diluted so that the concentration of the protein denaturant does not denature the protein, or dialyzed to form the protein into a normal three-dimensional structure.
  • a purified sample can be obtained by the same isolation and purification method as described above.
  • the protein or a derivative such as a sugar adduct can be recovered in the culture supernatant.
  • a soluble fraction is obtained by treating the culture by a technique such as centrifugation as described above, and a purified sample is obtained from the soluble fraction by using the same isolation and purification method as described above. Obtainable.
  • Examples of the ⁇ -glutamylcystine synthetase thus obtained include a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • ⁇ -daltamylcystine synthetase can be produced as a fusion protein with other proteins, and purified using affinity chromatography using a substance having an affinity for the fused protein.
  • the method of Law et al. [Proc. Natl. Acad. Sci., USA,
  • ⁇ -glutamylcystine synthetase can be produced as a fusion protein with a Flag peptide and purified by affinity chromatography using an anti-Flag antibody [Proc. Natl. Acad. Sci., USA , 86, 8227 (1989), Genes Develop., 4, 1288 (1990)]. Alternatively, it can be purified by affinity chromatography using an antibody against ⁇ -daltamylcystine synthetase.
  • the chemical synthesis method such as Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method), tBoc method (tbutyloxycarbol method), etc.
  • Fmoc method fluorenylmethyloxycarbonyl method
  • tBoc method tbutyloxycarbol method
  • -Daltamylcystine synthetase can be produced.
  • chemical synthesis using peptide synthesizers such as Advanced ChemTech Sento, Nokin ⁇ Kin, Elma 1 ⁇ , Pharmacia, Protein Technology Instrument, Synthece U-Vega, PerSeptive, Shimadzu, etc. You can also
  • the cell culture having 7-daltamylcystine synthetase used in the present invention is obtained by transforming the above-mentioned 3 cells or the transformant obtained in 5 (1) and (2) above by the method of 5 (3). It can be obtained from Koji by culturing and producing and accumulating ⁇ -daltamylcystine synthetase in the culture.
  • the treated product of the cell culture having ⁇ -daltamylcystine synthetase used in the present invention is obtained by centrifuging the culture concentrate, the culture dry product, or the culture.
  • Cells dried products of the cells, freeze-dried products of the cells, surfactant-treated products of the cells, solvent-treated products of the cells, enzyme-treated products of the cells, fixation of the cells Viable cells such as chemicals
  • a crude enzyme extract such as an ultrasonically treated product of the bacterial cell, a mechanically ground product of the bacterial cell, a protein fraction of the bacterial cell, or an enzyme preparation obtained by extraction from the bacterial cell
  • each can be used as an enzyme source in the production method of the present invention, that is, as long as it has ⁇ -daltamyl cystine synthetase activity, it can be prepared by a known method.
  • y-Daltamylcystine synthetase as the enzyme source, from the Daltamyl donor and the amine compound (I) (wherein R 1 and R 2 are the same or different, hydrogen atom, substituted or unsubstituted R 1 and R 2 which represent a lower alkyl, a substituted or unsubstituted lower alkyl, or a substituted or unsubstituted lower alkyl cannot be a hydrogen atom at the same time.
  • a Tamilamide compound a ⁇ -Daltamylamide compound can be produced.
  • ⁇ -glutamylcystine synthetase, glutamyl donor, ammine compound, and cocoon are present in an aqueous medium, and ⁇ -glutamylamide compound is produced and accumulated in the medium, A method for collecting a ⁇ -daltamamylamide compound from a medium can be mentioned.
  • the dartamyl donor used as a substrate is not particularly limited as long as it is a compound that becomes a substrate of y-daltamylcystine synthetase and reacts with an amine compound to give a ⁇ -dartamylamide compound.
  • Can include, for example, L-glutamic acid, D-glutamic acid, 2-oxodaltaric acid, and salts thereof, and preferably L-glutamic acid and salts thereof.
  • the amine compound represented by formula (III) is preferably methylamine.
  • Ethylamine, professional Pyramine, cyclopropylamine, butylamine and the like can be mentioned, and ethylamine can be mentioned more preferably.
  • ⁇ -Daltamylcystine synthetase is usually added in an amount of 0.01 to 100 mg, preferably 0.1 to 10 mg per lg of glutamyl donor used as a substrate.
  • the dartamyl donor and amine compound used as a substrate are usually in the aqueous medium so that the concentration is 0.1 to 500 g / L, preferably 0.2 to 200 g / L. Added.
  • ATP used as an energy source is usually 0.5 mmol to 10 mol /
  • the aqueous medium used in the production method of the present invention may be an aqueous medium of any component and composition as long as it does not inhibit the formation reaction of ⁇ -daltamamiramide compound.
  • ⁇ -daltamamiramide compound for example, water, phosphate , Carbonates, acetates, borates, citrates, tris buffers, alcohols such as methanol and ethanol, esters such as ethyl acetate, ketones such as acetone, amides such as acetate amide, etc. Can do.
  • the formation reaction of y-dartamamidamide compound is carried out in an aqueous medium usually at pH 5 to ll, preferably pH 6 to 10, 20 to 50 ° C, preferably 25 to 45 ° C. It is performed for 150 hours, preferably 6 to 120 hours.
  • the ⁇ -daltamamiramide compound produced by the above method includes a compound represented by the formula (I) (wherein R 1 and R 2 are as defined above), preferably in the formula (I), R A compound in which 1 is a hydrogen atom and R 2 force methyl, ethyl, propyl, cyclopropyl or butyl, more preferably, theanine represented by the formula (II) can be mentioned.
  • Examples of the culture of cells having y-daltamylcystine synthetase used in the above production method or the treated product of the culture include cultures that can be prepared by the above method 6. Can do.
  • the type of substrate, the concentration of the substrate used, and the ⁇ -dartamylamide compound produced are the same as in the enzymatic production method described in 7 (1) above.
  • a cell culture solution used as an enzyme source may be used as the aqueous medium. it can.
  • a compound that cells can metabolize to produce koji such as sugars such as glucose, alcohols such as ethanol, acetic acid, etc.
  • Organic acids and the like can be added to the aqueous medium.
  • a surfactant or an organic solvent may be added to the aqueous medium.
  • Surfactants include nonionic surfactants such as polyoxyethylene 'octadecylamine (for example, Naimine S-215, manufactured by NOF Corporation), cetyltrimethylammonium bromide and alkyldimethyl.benzylammonide.
  • -Cationic surfactants such as um chloride (for example, cationic F2-40 ⁇ , manufactured by Nippon Oil & Fats), ion-based surfactants such as lauroyl sarcosinate, alkyldimethylamine (for example, tertiary amine FB, Nippon Oil & Fats Co., Ltd.) Any one can be used as long as it promotes the production of galactose-containing complex carbohydrates, such as tertiary amines (manufactured) and the like.
  • the surfactant is usually used at a concentration of 0.1 to 50 g / 1.
  • the organic solvent include xylene, toluene, aliphatic alcohol, acetone, ethyl acetate and the like, and are usually used at a concentration of 0.1 to 50 ml / 1.
  • the amount of the enzyme source Depending on the specific activity of the enzyme source, etc., for example, it is usually 5 to 1000 mg, preferably 10 to 400 mg per mg of the substrate dartamyl donor.
  • the formation reaction of ⁇ -daltamamidamide compound is usually carried out in an aqueous medium under the conditions of ⁇ 5 to 11, preferably ⁇ 6 to 10, usually 20 to 50 ° C, preferably 25 to 45 ° C. It is performed for 150 hours, preferably 6 to 120 hours.
  • ⁇ -Daltamilamide compound produced and accumulated in an aqueous medium can be collected by an ordinary method using an activated carbon ion exchange resin or the like, or extraction with an organic solvent, crystallization, thin-layer chromatography, high-speed It can be performed by liquid chromatography or the like.
  • Escherichia coli has the ability to produce dartathione, and a gene encoding ⁇ -daltamylcystine synthetase has been identified as an enzyme involved in biosynthesis of daltathione [Nucleic Acids Res., 14, 4393- 400 (1986)].
  • the chromosomal DNA of Escherichia coli W3110 was isolated and purified by a method using saturated phenol described in Current 'Protocols'in' Molecular Biology.
  • DNA having the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 3 to 6 (hereinafter referred to as primer A, primer B, primer C, primer D) was synthesized.
  • Primer A is obtained by adding a base sequence containing a Hindlll recognition sequence to the 5 ′ side of the region containing the start codon of the known ⁇ -daltamylcystine synthetase gene of Escherichia coli.
  • Primer B is obtained by adding a base sequence containing an ElHI recognition sequence to the 5 ′ side of a base sequence complementary to the sequence containing the termination codon of the ⁇ -glutamylcystine synthetase gene.
  • Primer C is obtained by adding a base sequence containing an E ⁇ RI recognition sequence to the 5 ′ side of the base sequence of the k £ promoter region of expression vector pUC19.
  • Primer D is A nucleotide sequence containing a Hindlll recognition sequence is added to the 5 ′ side of a sequence complementary to the sequence of the promoter region of the current vector pUC19.
  • PCR For PCR, 0.1 ⁇ g of chromosomal DNA or lOOng of pUC19, 0.5 ⁇ mol / L of each primer, 2.5 units of DNA polymerase (Stratagene), 4 L of EfiiDNA polymerase X 10 buffer ( Prepare 40 L of reaction solution containing 200 ⁇ mol / L dNTPs (dATP, dGTP, dCTP and TTP), 94 ° C for 1 minute, 55 ° C for 2 minutes, 72 ° C The process for 3 minutes was repeated 30 times.
  • dNTPs dATP, dGTP, dCTP and TTP
  • 0.2 ⁇ g expression vector pTrS33 (Patent No. 2928287) was digested with restriction enzymes Mindlll and E ⁇ RI, treated with Alkaline phosphatase, and DNA fragments were separated by agarose gel electrophoresis. To recover a 3.16 kb DNA fragment. Obtained above! ⁇ A 0.3 kb fragment containing the promoter region and a 3.16 kb vector fragment were ligated by reaction at 16 ° C for 16 hours using a ligation kit (Takara Shuzo).
  • E. coH DH5 a tt (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) was transformed by a method using calcium ions [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110 (1972)].
  • the transformant was applied to an LB agar medium containing 50 ⁇ g / mL ampicillin and cultured at 30 ° C.
  • a plasmid was extracted from the grown colonies of the transformant according to a known method, and it was confirmed that an expression vector into which the k £ promoter was inserted was obtained.
  • the expression vector was named pTrS33L.
  • pTrS33L was cleaved with restriction enzymes Hindlll and Hunri HI, treated with Alkaline phosphatase, and the polynucleotide fragments were separated by agarose gel electrophoresis. A 2.5 kb polynucleotide fragment was recovered by the same method as described above.
  • Ligation kit containing 1.6 kb fragment and 2.5 kb vector fragment
  • TAKARA BIO INC. (TAKARA BIO INC.) was used and reacted at 16 ° C. for 16 hours for ligation.
  • E. coH DH5 strain manufactured by Toyobo Co., Ltd.
  • E. coH DH5 strain was transformed by a method using calcium ions [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110 (1972)].
  • the transformant was applied to an LB agar medium containing 50 ⁇ g / mL ampicillin and cultured at 30 ° C.
  • a plasmid is extracted from the grown colonies of the transformant according to a known method, and the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is encoded downstream of the k £ promoter and has the base sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • plasmid DNA linked with a polynucleotide encoding dartamylcystine synthetase was obtained, and the plasmid DNA was named pGSKl.
  • Figure 1 shows the structure of pGSKl.
  • E. coli DH5a carrying the plasmid was named E. coH DH5 ⁇ / pGSKl.
  • Recombinant E. coH DH5 ⁇ / pGSKl prepared in Example 1 is used in 40 ml of LB medium Lecttripton (manufactured by Difco) 10 g / l containing 100 mg / L ampicillin, yeast extract (manufactured by Difco) 5 g / 1 and NaCl were inoculated into 5 g rivers, respectively, and cultured in a 300 ml Erlenmeyer flask at 30 ° C and shaking. culture After completion, the cells recovered by centrifuging the culture are suspended in 100 mmol / L Tris-HCl (pH 8.0), and the cell concentration is adjusted so that OD660 is 70 as measured by a spectrophotometer. A cell-containing solution was obtained.
  • the bacterial cells-containing solution was supplemented with xylene at 10 ml / L and vortexed for 15 minutes to obtain treated bacterial cells. Each substance was added to 100 1 treated cells to the concentration shown in Table 1, and the reaction solution made up to a total volume of 200 1 was reacted at 37 ° C for 60 minutes.
  • the recombinant plasmid pGSKl into which the polynucleotide encoding ⁇ -daltamylcystine synthetase was inserted, was introduced into E. ⁇ HBL21 strain (Takara Shuzo Co., Ltd.) according to a conventional method, and E. coli BL21 / pGSKl strain was obtained. .
  • E. coH BL21 / pGSKl strain was applied to an LB agar medium containing 100 mg / L ampicillin and cultured at 30 ° C. for 1 hour.
  • 2L volume containing 300ml of precultured medium [corn steep liquor 6%, sodium glutamate 1.15%, lactic acid 0.2%, casamino acid 200mg / L, vitamin B1 5mg / L (pH7.2)] was inoculated into an Erlenmeyer flask and cultured at 28 ° C and 220 rpm for 20 hours.
  • a ⁇ -dartamylamide compound preferably theanine, can be produced easily and efficiently.
  • SEQ ID NO: 3 Description of artificial sequence: synthetic DNA

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Abstract

　本発明によれば、γ-グルタミルシステインシンセターゼ(γ-glutamylcysteine synthetase)、好ましくは微生物由来のγ-グルタミルシステインシンセターゼまたは該酵素を有する細胞の培養物もしくは該培養物の処理物を酵素源に用いて、グルタミル供与体とアミン化合物とからγ-グルタミルアミド化合物を生成することを特徴とするγ-グルタミルアミド化合物の製造方法が提供される。

Description

明 細 書
7 -グルタミルアミド化合物の製造方法
技術分野
[0001] 本発明は、 γ -ダルタミルシスティンシンセターゼまたは該酵素を有する細胞の培 養物もしくは該培養物の処理物を酵素源に用いた γ -ダルタミルアミド化合物の製造 方法に関する。
背景技術
[0002] y -グノレタミノレシスティンシンセターゼ（ γ -glutamylcysteine synthetase)は γ -グノレ タミルペプチドの合成酵素として知られて ヽる（非特許文献 1参照)。 γ -グルタミルシ スティンシンセターゼは基質特異性が比較的広く、 L-グルタミン酸と各種アミノ酸とか ら、種々の γ -ダルタミルアミノ酸を生成する活性を有することが知られて ヽる（特許文 献 1参照)。
[0003] また、 γ -ダルタミルシスティンシンセターゼは、アミノ酸以外にも 4-ヒドロキシァユリ ンと L-グルタミン酸とから y -ダルタミル- 4-ヒドロキシァ -リドを生成する活性を有する ことも知られて!/ヽる (特許文献 2参照)。
しかしながら、 γ -グルタミルシスティンシンセターゼが L-グルタミン酸のようなグルタ ミル供与体とェチルァミンのようなアミンィ匕合物とから y -ダルタミルアミドィ匕合物を生 成する活性を有することは知られて 、な 、。
[0004] y -ダルタミルアミドィ匕合物の 1種であるテアニンは、玉露の旨味の主要成分として 知られており、茶をはじめとする食品の香味物質として重要な物質である。また、テア ニンは、リラックス効果、睡眠障害改善、血圧抑制、冷え性改善、てんかん予防、集 中力向上などの種々の生理的効果を有することが示唆されており、健康食品素材と しても有望視されている。
[0005] テアニンの酵素的製造法としてはダルタミナーゼを用いる方法 (特許文献 3参照）、 y -グルタミルトランスぺプチダーゼ（ γ -glutamyltranspeptidase)を用いる方法（特許 文献 4参照）シユードモナス (Pseudomonas)属細菌由来の ipuC( y -グルタミルアミドシ ンセターゼ： Ύ - glutamylamide synthetase)を用いる方法（特許文献 5参照）などが知 られている。クルタミナーゼを用いる方法は唯一、実用化されている方法であるが、 該方法は本来の酵素反応の逆反応を利用するために高アルカリ条件で高いェチル
N
CCCCCIII'.
ァミン濃度で反応する必要があること、ダルタミナーゼの加水分解反応によって基質 のグルタミンがグルタミン酸に変換されるため収率が悪いなどの問題があり、より効率 の良 、製造方法が望まれて 、る。
非特許文献 1 :生命工学研究レポート、熊谷ら、 Vol.14, No.4、 8-17 (1985) 特許文献 1：特開昭 57-132896号公報
特許文献 2：特開昭 57-99197号公報
特許文献 3：特開平 11-225789号公報
特許文献 4：特開平 8-89266号公報
特許文献 5：国際公開第 01/73038号パンフレット
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0006] 本発明の目的は、ダルタミルアミド化合物、好ましくはテアニンの簡便で効率のよ!、 製造方法を提供することにある。
課題を解決するための手段
[0007] 本発明は、以下の（1)〜（10)に関する。
( 1) y -ダルタミルシスティンシンセターゼ (E.C.6.3.2.2)または該酵素を有する細胞の 培養物もしくは該培養物の処理物を酵素源に用いて、ダルタミル供与体とアミンィ匕合 物とから下式 (I)
[0008] [化 1]
H
2
N :1 R2 (丄）
[0009] (式中、 R1および R2は同一または異なって、水素原子、置換若しくは非置換の低級 アルキル、置換若しくは非置換の低級ァルケ-ル、または置換若しくは非置換の低 級アルキ-ルを表す力 R1および R2は同時に水素原子にはならない）で表される γ - ダルタミルアミド化合物を生成することを特徴とする γ -ダルタミルアミド化合物の製造 方法。
(2) γ -ダルタミルシスティンシンセターゼが微生物由来の酵素である、上記（1)の製 造方法。
(3)微生物が腸内細菌、酵母または糸状菌のいずれかである、上記（2)の製造方法
(4)微生物がエシ リヒア (Escherichia)属に属する微生物である、上記（2)の製造方 法。
(5) y -ダルタミルシスティンシンセターゼが以下の [1]〜 [3]のいずれかに記載の蛋 白質である、上記（1)の製造方法。
[1]配列番号 1で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
[2]配列番号 1で表されるアミノ酸配列において、 1個以上のアミノ酸残基が欠失、置 換または付カ卩したアミノ酸配列カゝらなり、かつ γ -ダルタミルシスティンシンセターゼ活 性を有する蛋白質
[3]配列番号 1で表されるアミノ酸と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列からな る蛋白質
(6)細胞が微生物である、上記（1)の製造方法。
(7)微生物が腸内細菌、酵母または糸状菌のいずれかである、上記 (6)の製造方法
(8)微生物がエシ リヒア (Escherichia)属に属する微生物である、上記（6)の製造方 法。
(9) γ -グルタミルシスティンシンセターゼを有する細胞が γ -グルタミルシスティンシ ンセターゼをコードするポリヌクレオチドを導入された細胞である、上記（1)および (6 )〜（8)の!、ずれか 1つの製造方法。
(10) γ -グルタミルシスティンシンセターゼをコードするポリヌクレオチドが以下の [1] 〜 [3]の 、ずれかに記載のポリヌクレオチドである、上記（9)の製造方法。 [ 1]上記（5)の [ 1]〜 [3]の 、ずれかに記載の蛋白質をコードするポリヌクレオチド
[2]配列番号 2で表される塩基配列を有するポリヌクレオチド
[3]配列番号 2で表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドと ストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、かつ γ -グルタミルシスティンシンセター ゼ活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチド
発明の効果
[0010] 本発明により、 γ—ダルタミルアミドィ匕合物、好ましくはテアニンを簡便かつ効率よく 製造することができる。
図面の簡単な説明
[0011] [図 1]図 1はェシエリヒア'コリ W3110株由来の γ -グルタミルシスティンシンセターゼ 遺伝子発現プラスミド pGSKlの構造を示す図である。
符号の説明
[0012] esh I：ェシエリヒア'コリ W3110株由来の γ -グルタミルシスティンシンセターゼ遺伝子 Pkc：ラタトースォペロンプロモーター領域
TIEE：ェシエリヒア 'コリ由来リポプロテインのターミネータ一配列
Αβ：アンピシリン耐性遺伝子
発明を実施するための最良の形態
[0013] 1. 本発明の方法で製造される γ -ダルタミルアミド化合物
本発明の方法で製造される γ -ダルタミルアミドィ匕合物としては、式 (I) (式中、 R1お よび R2は同一または異なって、水素原子、置換若しくは非置換の低級アルキル、置 換若しくは非置換の低級ァルケ-ル、または置換若しくは非置換の低級アルキニル を表すが、 R1および R2は同時に水素原子にはならない)で表される γ -ダルタミルアミ ド化合物をあげることができる。
[0014] 式 (I)の定義において、低級アルキルとしては、例えば炭素原子数 1から 10の直鎖 、分枝鎖状、環状またはこれらの組み合わせ力 なるアルキルがあげられ、より具体 的には直鎖、分枝鎖状のアルキルとしては、例えばメチル、ェチル、 η_プロピル、イソ プロピノレ、 η-ブチル、イソブチル、 sec-ブチル、 tert-ブチル、 n-ペンチル、ネオペン チル、 n-へキシル、 n-ヘプチル、 n-ォクチル、 n-ノ -ル、 n-デシルなどがあげられ、 環状のアルキルとしては、例えばシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シク 口へキシル、シクロへプチル、シクロォクチル、シクロデシル、ノルァダマンチル、ァダ マンチルなどがあげられ、直鎖または分枝状と環状との組み合わせ力 なるアルキル としては、例えばシクロプロピルメチル、シクロペンチルメチル、シクロォクチルェチル などがあげられる。
[0015] 低級ァルケ-ルとしては、例えば炭素原子数 2から 10の直鎖または分枝鎖状のァ ルケ-ルがあげられ、より具体的にはビュル、ァリル、 1-プロべ-ル、 1-ブテュル、 3- ブテュル、 2-ペンテ-ル、 4-ペンテ-ル、 2-へキセ -ル、 5-へキセ -ル、 1-ヘプテニ ル、 4-ヘプテュル、 6-ヘプテュル、 2-デセ -ル、 1-オタテュル、 9-デセ -ル、 1-ノネ -ル、 6-ノネ-ルなどがあげられる。
[0016] 低級アルキニルとしては、例えば炭素原子数 2から 10の直鎖または分枝鎖状のァ ルケ-ルがあげられ、より具体的にはェチュル、プロピエル、ブチュル、ペンチ-ル、 へキシュル、ヘプチュル、ォクチ-ル、ノ- -ル、デシ-ルなどがあげられる。
置換低級アルキル、置換低級ァルケ-ルおよび置換低級アルキ-ルにおける置換 基としては、同一または異なって置換数 1〜置換可能な数の、好ましくは置換数 1〜 3、より好ましくは置換数 1の、例えばハロゲン、ニトロ、ヒドロキシなどがあげられる。
[0017] 本発明の方法で製造される、より好まし!/、 γ -ダルタミルアミドィ匕合物としては、 R1が 水素原子であり、 R2カ チル、ェチル、プロピル、シクロプロピルまたはブチルである 化合物、さらに好ましくは下式 (II)
[0018] [化 2]
COOH
H2NCH
CH2
CH2
CO
NHC2HR (I I) で表されるテアニンをあげることができる。
2. 本発明で用いられる γ -ダルタミルシスティンシンセターゼ
本発明で用いられる -グルタミルシスティンシンセターゼは、 γ -グルタミルシステ インシンセターゼであれば、その由来は問わないが、好ましくは腸内細菌、酵母また は糸状菌由来の該酵素をあげることができる。具体的には、 Arabidopsis thaliana由 の swiss-prot accession number P46309に登録されているアミノ酸配列を有する蛋白 質（以下、同様に生物名の後の番号は swiss- prot accession numberを表し、該 access ion numberに登録されているアミノ酸配列を有する蛋白質であることを意味する）、 Bo rdetella bronchiseptica由来の Q7WES2、 Bordetella parapertussis由来の Q7W3F2、 B rassica iuncea由 の 023736、 Buchnera aDhidicola由夹の P57485、 P58994および Q 89AD8、 Caenorhabditis elegans由来の Q20117、 Candida albicans由 ¾の Q9HF78、 C lostridium acetobutylicum由來の Q97IV1、 Clostridium perfringens由夹の、 Drosophil a melanogaster由夹の Q9W3K5、 Escherichia coli由 ¾の Q8X900、 P06980、 1501198 Aおよび CAA27583、 Enterococcus faecalis由来の Q82ZG8、 Leptospira interrogans 由来の Q8F4D5、 Listeria innocua由来の 0926X7、 Listeria monocytogenes 来の Q8 Y3R3、 Lvcopersicon esculentum由来の 022493、 edicaeo truncatula由 ¾の Q9ZNX 6、 Neurospora crassa由夹の Q8X0X0、 Onchocerca ^Ιχϋΐ 由来の Q9NFN6、 Pasteu rella multocida由来の Q9CM00、 Photorhabdus luminescens fe来の Q7N7A4、 Pseudo monas aeruginosa由来の Q9HTY6、 Pseudomonas putida由来の Q88R90、 Pseudomon as syringae由来の Q88AR1および P61379、 Salmonella typhi由来の Q8Z4D6、 Salmone 11a tvohimurium由来の 068838、 Schizosaccharomyces pombe由来の Q09768、 Shewan ella oneidensis由来の Q8EBF9、 Streptococcus agalactiae由来の Q8E399、 Streptococ cus agalactiae由来の Q8DXM9、 Streptococcus mutans由来の Q8DW15、 Vibrio chole rae由来の Q9KUG5、 Vibrio Darahaemolvticus由来の Q87LS2、 Vibrio vulnificus由來 の Q8DC38、 Vibrio ilnita由来の Q7MHS5、 Wigglesworthia glossinidia由来の Q8D 2V5、 Saccharomvces cerevisiae由来の P32477、 Yersinia pestis由来の Q8ZBU2、 Horn o sapiens由来の P48507および P48506、 Mus musculus由来の P97494、並びに Rattus norvegicus由来の P48508および P19468など をあげることができる。
[0020] また、本発明で用いられる γ -ダルタミルシスティンシンセターゼとして、より好ましく は上記酵素中の微生物由来の該酵素、さらに好ましくは腸内細菌、酵母、または糸 状菌由来の該酵素、特に好ましくはエシ リヒア 'コリ由来の該酵素、最も好ましくは 配列番号 1で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をあげることができる。
また、本発明で用いられる γ -ダルタミルシスティンシンセターゼとしては、配列番号 1で表されるアミノ酸配列において、 1個以上のアミノ酸残基が欠失、置換または付カロ したアミノ酸配列力もなり、かつ γ -ダルタミルシスティンシンセターゼ活性を有する蛋 白質をあげることができる。
[0021] 上記において、 1個以上のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されたアミノ酸配 列からなり、かつ γ -ダルタミルシスティンシンセターゼ活性を有する蛋白質は、 Mole cularし loning, A Laboratory Manual, Third Edition, し old Spring Harbor Laboratory Press (1989) (以下、モレキュラ^ ~ ·クロー-ング第 3版と略す）、 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987- 1997) (以下、カレント'プロトコールズ' イン'モレキュラ^ ~ ·バイオロジーと略す）、 Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982)、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409(1982)、 Gene, 34, 315 (1985)、 Nucleic Acids R esearch, 13, 4431 (1985)、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)等に記載の部 位特異的変異導入法を用いて、例えば配列番号 1で表されるアミノ酸配列力 なる 蛋白質をコードする DNAに部位特異的変異を導入することにより、取得することがで きる。
[0022] 欠失、置換または付加されるアミノ酸残基の数は特に限定されな 、が、上記の部位 特異的変異法等の周知の方法により欠失、置換または付加できる程度の数であり、 1 個から数十個、好ましくは 1〜20個、より好ましくは 1〜10個、さらに好ましくは 1〜5 個である。
配列番号 1で表されるアミノ酸配列において 1個以上のアミノ酸が欠失、置換または 付加されたとは、同一配列中の任意の位置において、 1個または複数個のアミノ酸残 基が欠失、置換または付加されていてもよい。
[0023] 置換が可能なアミノ酸残基としては、例えば配列番号 1で表されるアミノ酸配列と上 記した各種生物由来の γ -ダルタミルシスティンシンセターゼのアミノ酸配列とを公知 のァライメントソフトウェアを用 、て比較したときに、すべてのアミノ酸配列にお ヽて保 存されて ヽな 、アミノ酸をあげることができる。公知のァライメントソフトウェアとしては、 例えば遺伝子解析ソフトウェア Genetyx (ソフトウェア開発株式会社）に含まれるァライ メント解析ソフトをあげることができる。該解析ソフトの解析パラメータとしては、デフォ ルト値を用いることができる。
[0024] また、アミノ酸残基の欠失または付カ卩が可能なアミノ酸の位置としては、例えば配列 番号 1で表されるアミノ酸配列の N末端側および C末端側をあげることができる。 欠失、置換または付カ卩は同時に生じてもよぐ置換または付加されるアミノ酸は天然 型と非天然型とを問わない。天然型アミノ酸としては、 Lーァラニン、 Lーァスパラギン 、 L ァスパラギン酸、 L グルタミン、 L グルタミン酸、グリシン、 L ヒスチジン、 L —イソロイシン、 L ロイシン、 L リジン、 L—メチォニン、 L フエ二ルァラニン、 L— プロリン、 L セリン、 L—スレオニン、 L トリプトファン、 L チロシン、 L—パリン、 L システィンなどがあげられる。
[0025] 以下に、相互に置換可能なアミノ酸の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸は相互 に置換可能である。
A群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、ノ リン、ノルパリン、ァラニン、 2-アミノブ タン酸、メチォニン、 0-メチルセリン、 t-ブチルグリシン、 t-ブチルァラニン、シクロへ キシノレァラニン
B群：ァスパラギン酸、グルタミン酸、イソァスパラギン酸、イソグルタミン酸、 2-ァミノ アジピン酸、 2-アミノスべリン酸
C群：ァスパラギン、グルタミン
D群：リジン、アルギニン、オル二チン、 2,4-ジァミノブタン酸、 2,3-ジァミノプロピオ ン酸
E群：プロリン、 3-ヒドロキシプロリン、 4-ヒドロキシプロリン
F群：セリン、スレオニン、ホモセリン
G群：フエ-ルァラニン、チロシン
また、本発明で用いられる蛋白質としては、配列番号 1で表されるアミノ酸配列との 相同性が 80%以上、好ましくは 90%以上、より好ましくは 95%以上、さらに好ましく は 97%以上、特に好ましくは 98%以上、最も好ましくは 99%以上の相同性を有する アミノ酸配列からなる蛋白質であり、かつ γ -ダルタミルシスティンシンセターゼ活性を 有する蛋白質をあげることができる。
[0026] アミノ酸配列や塩基配列の相同性は、 Karlin and Altschulによるアルゴリズム BLAS T[Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)]や FASTA[Methods EnzymoL, 183, 63 (1990)]を用いて決定することができる。このアルゴリズム BLASTに基づいて、 BLAST Nや BLASTXとよばれるプログラムが開発されている [J. Mol. Biol, 215, 403(1990)]。 BLASTに基づ 、て BLASTNによって塩基配列を解析する場合には、パラメータは例 えば Score = 100、 wordlength= 12とする。また、 BLASTに基づいて BLASTXによって アミノ酸配列を解析する場合には、パラメータは例えば score=50、 wordlength=3と する。 BLASTと Gapped BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフオル トパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（http：〃 WW w. ncbi.nlm.nih.gov.)。
[0027] 配列番号 1で表されるアミノ酸配列において 1個以上のアミノ酸残基が欠失、置換 または付加されたアミノ酸配列力もなる蛋白質力 γ -ダルタミルシスティンシンセタ ーゼ活性を有する蛋白質であることを確認する手段としては、例えば DNA組換え法 を用 ヽて活性を確認した!/ヽ蛋白質を発現する形質転換体を作製し、該形質転換体 を用いて該蛋白質を製造した後、該蛋白質、 L-グルタミン酸、および L-システィンを 水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中に γ -ダルタミルシスティンが生成、蓄積す る力否かを HPLC等により分析する方法をあげることができる。
3.本発明で用いられる細胞
本発明で用いられる細胞としては、 γ -ダルタミルシスティンシンセターゼを有する 細胞であれば、微生物および動植物細胞等のいずれの細胞も用いることができ、好 ましくは γ -ダルタミルシスティンシンセターゼをコードするポリヌクレオチドを有する該 細胞などをあげることができる。
[0028] 該細胞としては、上記 2の γ -ダルタミルシスティンシンセターゼを有する各種生物 の細胞、好ましくは該細胞のうちの微生物、より好ましくは該微生物のうちの腸内細 菌、酵母および糸状菌、さらに好ましくはェシエリヒア'コリをあげることができる。 また、本発明で用いられる細胞としては、好ましくは γ -ダルタミルシスティンシンセ ターゼ活性が増強された細胞をあげることができる。
[0029] γ -ダルタミルシスティンシンセターゼ活性が増強された細胞としては、上記 2の γ - グルタミルシスティンシンセターゼを有する細胞を変異剤、例えば Ν- methy卜 N'-nitro -N-nitrosoguanidine (NTG)等を用いて、公知の方法により細胞を処理し、変異前の 細胞に比べて γ -ダルタミルシスティンシンセターゼ活性が上昇して ヽる細胞株を選 択することにより得られる変異株、遺伝子組換え法により γ -ダルタミルシスティンシン セターゼをコードするポリヌクレオチドを細胞に導入して得られる組換え株などをあげ ることがでさる。
[0030] また、本発明で用いられる細胞としては、好ましくは γ -ダルタミルシスティンシンセ ターゼを有し、かつダルタミル供与体、例えば L-グルタミン酸を生産する能力を有す る細胞、さらに好ましくは γ -ダルタミルシスティンシンセターゼを有し、かつダルタミ ル供与体、例えばし-グルタミン酸を生産する能力が強化された細胞をあげることがで きる。該細胞としては、例えば公知の方法により L-グルタミン酸を生産する能力を人 為的に強化した微生物、好ましくは原核生物、より好ましくはェシエリヒア'コリなどを あげることができる。
4.本発明で用いられる γ -グルタミルシスティンシンセターゼをコードするポリヌクレ ォチド
本発明におけるポリヌクレオチドは、 DNAまたは RNA、好ましくは DNAであり、二 本鎖であっても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖 DNA、二本鎖 R NAまたは DNA:RNAのハイブリッドでもよい。一本鎖の場合は、センス鎖（すなわち 、コード鎖)であっても、アンチセンス鎖 (すなわち、非コード鎖)であってもよい。
[0031] 本発明で用いられる γ -グルタミルシスティンシンセターゼをコードするポリヌクレオ チドとしては、 y -ダルタミルシスティンシンセターゼコードするポリヌクレオチドであれ ばその由来は問わないが、好ましくは上記 2の γ -ダルタミルシスティンシンセターゼ を有する細胞由来の Ί -グルタミルシスティンシンセターゼをコードするポリヌクレオ チドをあげることができ、具体的には、 ArabidoDsis thaliana由来の GenBank accession number Z29490に登録されている塩基配列を有するポリヌクレオチド（以下、生物名 の後の ¾~ は GenBank accession numberを表し、該 accession numberに登録されて いる塩基配列を有するポリヌクレオチドを意味する）、 Bordetella bronchiseDtica由来 の BX640450、 Bordetella parapertussis由來の BX640435、 Brassica iuncea由来の Y10 848、 Buchnera aphidicola由来の BA000003、 AE014115および AE014017、 Caenorha bditis elegans由来の Z54218、 Candida albicans由来の AFl 76677、 Clostridium acetob utylicum由来の AE007664、 Clostridium perfringens由来の BA000016、 Drosophila me lanogaster由来の AF244351、 Escherichia coli由来の AE005497、 AE016765および X0 3954、 Enterococcus faecalis由来の AE016956、 Leptospira interrogans由来の AE011 382、 Listeria innocua由 の AL596174、 Listeria monocytogenes由 ¾の AT 591984、 L vcopersicon esculentum由来の AFO 17983、 Medicaeo truncatula由夹の AF041340、 N eurospora cmssa由来の AL670009、 Onchocerca volvulus由来の AF042168、 Pasteure Ha multocida由 の AR006146、 Photorhabdus luminescens由来の BX571863、 Pseudo monas aeruginosa S¾(OAE004933, Pseudomonas Dutida由 ¾の AE016774、 Pseudo monas sxiiflgas由来の AE016857および AY374326、 Salmonella typhi由 ¾の AL62727 6、 Salmonella tvphimurium由来の AF055352、 Schizosaccharomvces pombe由来の X8 5017、 Shewanella oneidensis由来の AE015792、 Streptococcus agalactiae由来の AL了 6 6854、 Streptococcus agalactiae由来の AE014274、 Streptococcus mutans由来の AEO 14876、 Vibrio cholerae由来の AE004141、 Vibrio parahaemolvticus 来の BA000031 、 Vibrio vulnificus由 ¾の AEO 16802、 Vibrio vulnificus由来の BA000037、 Wiggleswort hia glossinidia由来の BA000021、 Saccharomvces cerevisiae由来の D90220、 Yersinia pestis由来の AT414156、 Homo sapiens由来の L35546および 1490856、 Mus musculus 由来の U85414、 Rattus norvegicus由夹の S65555および T05181な ' あげるこ がで きる。
また、本発明で用いられる Ί -グノレタミルシスティンシンセターゼをコードするポリヌ クレオチドとしては、より好ましくは上記の微生物由来の該ポリヌクレオチド、さらに好 ましくは該微生物中の腸内細菌、酵母、または糸状菌由来の該ポリヌクレオチド、特 に好ましくは該腸内細菌中のェシエリヒア属に属する微生物由来の該ポリヌクレオチ ド、特に好ましくはェシエリヒア'コリ由来の該ポリヌクレオチド、最も好ましくは配列番 号 2で表される塩基配列を有するポリヌクレオチドをあげることができる。
[0033] また、本発明で用いられる γ -ダルタミルシスティンシンセターゼをコードするポリヌ クレオチドとしては、配列番号 2で表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するポ リヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、かつ γ -グルタミルシステ インシンセターゼ活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドをあげることがで きる。
[0034] ここで 、う「ハイブリダィズする」とは、特定の塩基配列を有するポリヌクレオチドまた は該ポリヌクレオチドの一部にポリヌクレオチドがハイブリダィズすることである。したが つて、該特定の塩基配列を有するポリヌクレオチドまたはその一部は、ノーザンまた はサザンブロット解析のプローブとして用いることができ、また PCR解析のオリゴヌク レオチドプライマ一として使用できるポリヌクレオチドである。プローブとして用いられ るポリヌクレオチドとしては、少なくとも 100塩基以上、好ましくは 200塩基以上、より 好ましくは 500塩基以上のポリヌクレオチドをあげることができ、プライマーとして用い られるポリヌクレオチドとしては、少なくとも 10塩基以上、好ましくは 15塩基以上のポリ ヌクレオチドをあげることができる。
[0035] ポリヌクレオチドのハイブリダィゼーシヨン実験の方法はよく知られており、例えば当 業者であれば本願明細書に従 、、ハイブリダィゼーシヨンの条件を決定することがで きる。該ハイブリダィゼーシヨンの条件は、モレキュラー 'クローユング第 2版、第 3版（ 2001年)、 Methods for General and Molecular Bacteriolgy, ASM Press (1994)、 Imm unology methods manual, Academic press(Molecular)【し己載の他、多数の他の標準 的な教科書に従っておこなうことができる。
[0036] 上記のストリンジェントな条件とは、ポリヌクレオチド、好ましくは DN Aを固定化した フィルターとプローブ、好ましくはプローブ DNAとを 50%ホルムアミド、 5 X SSC (750m Mの塩化ナトリウム、 75mMのクェン酸ナトリウム）、 50mMのリン酸ナトリウム（pH7.6)、 5 Xデンハルト溶液、 10%の硫酸デキストラン、および 20 g/1の変性させたサケ精子 D NAを含む溶液中で 42°Cでー晚、インキュベートした後、例えば約 65°Cの 0.2 X SSC 溶液中で該フィルターを洗浄する条件が好まし 、が、より低 、ストリンジェント条件を 用いることもできる。ストリンジェンな条件の変更は、ホルムアミドの濃度調整 (ホルム アミドの濃度を下げるほど低ストリンジヱントになる）、塩濃度および温度条件の変更 により可能である。低ストリンジェント条件としては、例ぇば6 X SSCE (20 X SSCEは、 3 mol/1の塩化ナトリウム、 0.2mol/lのリン酸二水素ナトリウム、 0.02mol/lの EDTA、 pH7.4 )、 0.5%の SDS、 30%のホルムアミド、 100 μ g/1の変性させたサケ精子 DNAを含む溶 液中で、 37°Cでー晚インキュベートした後、 50°Cの 1 X SSC、 0.1%SDS溶液を用いて 洗浄する条件をあげることができる。また、さらに低いストリンジェントな条件としては、 上記した低ストリンジェント条件にぉ 、て、高塩濃度 (例えば 5 X SSC)の溶液を用いて ノ、イブリダィゼーシヨンを行った後、洗浄する条件をあげることができる。
[0037] 上記した様々な条件は、ノ、イブリダィゼーシヨン実験のバックグラウンドを抑えるた めに用いるブロッキング試薬を添加、または変更することにより設定することもできる。 上記したブロッキング試薬の添カ卩は、条件を適合させるために、ハイブリダィゼーショ ン条件の変更を伴ってもょ 、。
上記したストリンジヱントな条件下でノヽイブリダィズ可能なポリヌクレオチドとしては、 例えば上記した BLASTや FASTA等を用いて上記したパラメータ等に基づ 、て計算し たときに、配列番号 2で表される塩基配列と少なくとも 90%以上、好ましくは 95%以 上、より好ましくは 97%以上、さらに好ましくは 98%以上、特に好ましくは 99%以上 の相同性を有するポリヌクレオチドをあげることができる。
[0038] 配列番号 2で表される塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下 でハイブリダィズするポリヌクレオチドが、 γ -ダルタミルシスティンシンセターゼ活性 を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドであることは、例えば上記したように、遺 伝子組換え法を用いて該ポリヌクレオチドにコードされる蛋白質を製造し、該蛋白質 の活性を測定することにより確認することができる。
5.本発明で用いる γ -ダルタミルシスティンシンセターゼの調製法
本発明で用いる γ -ダルタミルシスティンシンセターゼは、上記 3の細胞を培地に培 養し、培養物中に γ -ダルタミルシスティンシンセターゼを生成、蓄積させ、公知の蛋 白質の精製方法に従い、該培養物中から γ -ダルタミルシスティンシンセターゼを分 離、精製することにより取得することができ、好ましくは γ -ダルタミルシスティンシンセ ターゼを有する細胞として、 γ -ダルタミルシスティンシンセターゼをコードするポリヌ クレオチドを遺伝子組換え法により細胞に導入して得られる γ -ダルタミルシスティン シンセターゼ活性が増強された組換え細胞を用い、該組換え細胞の培養物から取得 する方法をあげることがでさる。
( 1) y -ダルタミルシスティンシンセターゼをコードするポリヌクレオチドの調製法 本発明に用いられる y -グルタミルシスティンシンセターゼをコードするポリヌクレオ チドは、例えば上記 4の γ -グルタミルシスティンシンセターゼをコードするポリヌクレ ォチドの塩基配列に基づき設計することができるプローブ DNAを用いた、各生物の 染色体 DNAライブラリーに対するサザンハイブリダィゼーシヨン、または該塩基配列 に基づき設計することができるプライマー DNAを用いた、上記 2の各生物などの染 色体 DNAを铸型とした PCR[PCR Protocols, Academic Press (1990)]により取得する ことができる。
[0039] また、各種の遺伝子配列データベースに対して上記 4の γ -ダルタミルシスティンシ ンセターゼをコードするポリヌクレオチドの塩基配列と 85%以上、好ましくは 90%以 上、より好ましくは 95%以上、さらに好ましくは 97%以上、特に好ましくは 98%以上、 最も好ましくは 99%以上の相同性を有する配列を検索し、該検索によって得られた 塩基配列に基づき、該塩基配列を有する生物の染色体 DNA、 cDNAライブラリ一等 力 上記した方法により γ -ダルタミルシスティンシンセターゼをコードするポリヌクレ 才チドを取得することもできる。
[0040] 取得したポリヌクレオチドをそのまま、あるいは適当な制限酵素などで切断し、常法 によりベクターに組み込み、得られた組換え体 DNAを宿主細胞に導入した後、通常 用いられる塩基配列解析方法、例えばジデォキシ法 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 7 4, 5463 (1977)]あるいは 373Α· DNAシークェンサ一（パーキン 'エルマ一社製）等の 塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該ポリヌクレオチドの塩基配列を決 定することができる。
[0041] 塩基配列を決定した結果、取得されたポリヌクレオチドが部分長であった場合は、 該部分長ポリヌクレオチドをプローブに用いた、染色体 DNAライブラリーに対するサ ザンノ、イブリダィゼーシヨン法等により、全長ポリヌクレオチドを取得することができる。 更に、決定されたポリヌクレオチドの塩基配列に基づいて、パーセプティブ 'バイオ システムズ社製 8905型 DNA合成装置等を用いて化学合成することにより目的とする ポリヌクレオチドを調製することもできる。
[0042] 上記のようにして取得されるポリヌクレオチドとして、例えば、配列番号 2で表される 塩基配列を有するポリヌクレオチドをあげることができる。
γ -グルタミルシスティンシンセターゼをコードするポリヌクレオチドを組み込むベタ ターとしては、 pBluescriptll KS(+) (ストラタジーン社製）、 pDIRECT[Nucleic Acids Res ., 18, 6069 (1990)]、 pCR- Script Amp SK(+) (ストラタジーン社製）、 pT7Blue (ノバジェ ン社製）、 pCR II (インビトロジェン社製）および pCR- TRAP (ジーンハンター社製）など をあげることができる。
[0043] 宿主細胞としては、ェシエリヒア属に属する微生物などをあげることができる。ェシェ リヒア属に属する微生物としては、例えば、ェシエリヒア'コリ XL1-Blue、ェシエリヒア' コリ XL2— Blueゝェシエリヒア'コリ DH1、ェシエリヒア'コリ MC1000、ェシエリヒア'コリ A TCC 12435、ェシエリヒア'コリ W1485、ェシエリヒア'コリ JM109、ェシエリヒア'コリ HB 101、ェシエリヒア'コリ No.49、ェシエリヒア'コリ W3110、ェシエリヒア'コリ NY49、ェシ エリヒア'コリ MP347、ェシエリヒア'コリ NM522、ェシエリヒア'コリ BL21、ェシエリヒア' コリ ME8415等をあげることができる。
[0044] 組換え体 DNAの導入方法としては、上記宿主細胞へ DNAを導入する方法であれ ばいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法 [Proc. Natl. Ac ad. Sci., USA, 69, 2110 (1972)]、プロトプラスト法（特開昭 63- 248394)、エレクトロボレ ーシヨン法 [Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)]等をあげることができる。
上記方法によって得られる形質転換体としては、例えば配列番号 2で表される塩基 配列を有するポリヌクレオチドを含有する組換え体 DNAを保有する微生物であるェ シエリヒア'コリ BL21/pGSKlをあげることができる。
(2) γ -ダルタミルシスティンシンセターゼを有する形質転換体の調製法
上記（1)の方法で得られる y -ダルタミルシスティンシンセターゼをコードするポリヌ クレオチドをもとにして、必要に応じて、 γ -ダルタミルシスティンシンセターゼをコード する部分を含む適当な長さの DNA断片を調製する。また、 γ -ダルタミルシスティン シンセターゼをコードする部分の塩基配列を、宿主細胞での発現に最適なコドンとな るように、塩基を置換することにより、生産率が向上した形質転換体を取得することが できる。
[0045] 該 DNA断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、 組換え体 DNAを作製する。
該組換え体 DNAを、該発現べクタ一に適合した宿主細胞に導入することにより、 γ -ダルタミルシスティンシンセターゼを生産する形質転換体を得ることができる。
宿主細胞としては、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞等、植物細胞等、 目的とする ポリヌクレオチドを発現できるものであればいずれも用いることができる。
[0046] 発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中へ の組込が可能で、 γ -グルタミルシスティンシンセターゼをコードする DNAを転写で きる位置にプロモーターを含有して 、るものが用いられる。
細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合は、 γ -ダルタミルシスティンシンセ ターゼをコードする DNAを有する組換え体 DNAは、原核生物中で自立複製可能で あると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、 γ -グルタミルシスティンシンセタ ーゼをコードする DNA、転写終結配列より構成された組換え体 DNAであることが好 ま 、。プロモーターを制御する遺伝子が含まれて!/、てもよ!/、。
[0047] 発現ベクターとしては、 pBTrp2、 pBTacl、 pBTac2 (いずれもベーリンガーマンハイ ム社製）、 pHelixl (ロシュ'ダイァグノステイタス社製）、 pKK233-2 (アマシャム'ファノレ マシア'バイオテク社製）、 pSE280 (インビトロジェン社製）、 pGEMEX-Ι (プロメガ社製 )、 pQE-8 (キアゲン社製）、 pET-3 (ノバジェン社製）、 pKYPIO (特開昭 58- 110600)、 p KYP200[Agric. Biol. Chem., 48, 669 (1984)]、 pLSAl[Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1 989)]、 pGELl[Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82, 4306 (1985)]、 pBluescriptll SK(+)、 p Bluescript II KS (-) (ストラタジーン社製）、 pTrS30 [ェシエリヒア'コリ JM109/pTrS30(F ERM BP- 5407)より調製]、 pTrS32 [ェシエリヒア'コリ JM109/pTrS32(FERM BP- 5408) より調製]、 pPAC31 (W098/12343), pUC19 [Gene, 33, 103 (1985)]、 pSTV28(宝酒造 社製)、 pUC118 (宝酒造社製）、 pPAl (特開昭 63-233798)等を例示することができる [0048] プロモーターとしては、エシ リヒア 'コリ等の宿主細胞中で機能するものであれば 、かなるものでもよ!ヽ。例えば、 プロモーター（p )、 プロモーター（p ；)、 pプ
trp iac L 口モーター、 pプロモーター、 p プロモーター等の、ェシエリヒア.コリゃファージ等に
R SE
由来するプロモーター、 SPOlプロモーター、 SP02プロモーター、 penPプロモータ 一等をあげることができる。また P を 2つ直列させたプロモーター、 ^プロモーター、
trp
lacT7プロモーター、 let Iプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター 等ち用いることがでさる。
[0049] さらにバチルス属に属する微生物中で発現させるための xylAプロモーター [Appl.
Microbiol. Biotechnol., 35, 594-599 (1991)]やコリネバタテリゥム（^^QOie ^li l) 属に属する微生物中で発現させるための P54-6プロモーター [Appl. Microbiol. Biote chnol, 53, 674-679 (2000)]なども用いることができる。
リボソーム結合配列であるシャイン一ダルガノ（Shine-Dalgarno)配列と開始コドンと の間を適当な距離 (例えば 6〜18塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ま 、。
[0050] γ -グルタミルシスティンシンセターゼをコードする DNAを発現ベクターに結合させ た組換え体 DNAにおいては、転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝 子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
このような糸且換え体 DNAとしては、例えば pGSKlをあげることができる。 原核生物としては、ェシエリヒア属、セラチア（Serratia)属、バチルス属、ブレビバタ テリゥム（Brevibacterium)属、コリネパクテリゥム（Corvnebacterium)属、ミクロバタテリ ゥム属 (Microbacterium)、シユードモナス (Pseudomonas)属、ァグロノくクテリゥム (Agr obacterium)属、アリシクロノくチノレス属 (Alicvclobacillus)、アナべナ (Anabena)属、ァ ナシスティス (Anacvstis)属、ァスロバクタ一 (Arthrobacter)属、ァゾトパクター (Azoto bacter)属、クロマチゥム（Chromatium)属、エノレビニァ（Erwinia)属、メチロバクテリウ ム (Methvlobacterium)属、フォノレミディゥム (Phormidium)属、口ドノくクタ一 (Rhodobact §1)属、ロドシユードモナス（Rhodopseudomonas)属、ロドスピリゥム（Rhodospirillum)属 、セネデスムス (Scenedesmus)属、ストレプトマイセス（Streptomvces)属、シネコッカス (Svnechoccus)属、ザィモモナス (Zvmomonas)属等に属する微生物、例えば、エシ リヒア.コリ XLト Blueゝェシエリヒア'コリ XL2— Blueゝェシエリヒア'コリ DH1、ェシエリヒ ァ 'コリ DH5 a、ェシエリヒア'コリ MC1000、ェシエリヒア'コリ KY3276、ェシエリヒア'コ リ W1485、ェシエリヒア'コリ JM109、ェシエリヒア'コリ HB101、ェシエリヒア'コリ No.49 、ェシエリヒア'コリ W3110、ェシエリヒア'コリ NY49、ェシエリヒア'コリ MP347、ェシェ リヒア.コリ NM522、ェシエリヒア'コリ BL21、バチルス ·サチリス（Bacillus subtilis) AT CC33712,バチルス ·メガテリゥム（Batillus megaterium)、ブレビパクテリゥム ·ァンモ ニァゲネス (Brevibacterium ammoniagenes)、ブレビノ クテリゥム 'イマリオフイノレム ( evibacterium immariophilum) ATCC14068、ブレビバタテリゥム 'サッカロリティカム（ evibacterium saccharolvticum) ATCC14066、ブレビパクテリゥム ·フラバム（Brevibact erium flavum) ATCC14067,ブレビパクテリゥム ·ラクトフアーメンタム（Brevibacterium lactofermentum) ATCC13869、コリネパクテリゥム ·グルタミカム（Corvnebacterium elu tamicum) ATCC13032、コリネバタテリゥム 'グルタミカム ATCC14297、コリネバタテリ ゥム ·ァセトァシドフィルム（Corvnebacterium acetoacidophilum) ATCC13870.ミクロノく クテリゥム ·アンモニアフィルム（Microbacterium ammoniaphilum) ATCC15354、セラ チア ·フィカリア (Serratia ficaria)、セラチア ·フォンチコラ (Serratia fonticola)、セラチ ァ ·リケファシエンス (Serratia liauefaciens)、セラチア ·マノレセッセンス (Serratia marce scens)、シユードモナス'エスピー（Pseudomonas sp.) D-0110、ァグロバタテリゥム 'ラ ジォノ クタ一 (Aerobacterium radiobacter)、ァグロノくクテリゥム .リゾジーンズ (Agroba cterium rhizogenes)、 "7グロノ グァリゥム 'ノレビ、 (Aerobacterium rubi)、 ,ナベナ.ンリ ンドリカ (Anabaena cvlindrica)、アナべナ ·ドリ才ノレム (Anabaena doliolum)、アナべナ •フロスアクア (Anabaena flos- aauae)、アースロバクタ一'オーレッセンス (Arthrobacte r aurescens)、アースロノくクタ一 ·シトレウス (Arthrobacter citreus)、アースロノくクタ一 .グロプフォルミス (Arthrobacter globformis)、アースロバクタ一 ·ヒドロカーボグルタミ カス (Arthrobacter hvdrocarboglutamicus)、 7 ~~スロノくクタ1 ~~ · ソレンス Arthrobacte r mvsorens)、アースロノくクタ一 ·ニコチアナ (Arthrobacter nicotianae)、アースロノくク ター ·パラフイネウス (Arthrobacter paraffineus)、アースロバクタ一 ·プロトフオルミエ（ Arthrobacter protophormiae)、アースロノくクタ一 ·ロセオノ ラフイナス (Arthrobacter r oseoparaffinus)、 7 ~~スロノくクタ1 ~~ 'スノレフレ! /ス (Arthrobacter sulfureus、 7 ~~スロ パクター 'ウレァファシエンス（Arthrobacter ureafaciens)、クロマチゥム 'ブデリ hro matium buderi)、クロマチゥム .テピダム (Chromatium tepidum)、クロマチゥム .ビノサ ム (Chromatium vinosum)、クロマチゥム ·ヮ ~~ ン (Chromatium warmingn)、クロマ チウム ·フルビアタティレ (Chromatium fluviatile)、ェルビ-ァ ·ウレドバラ (Erwinia ure dovora)、エノレビ-ァ '力ロトノ ラ (Erwinia carotovora)、エノレビ-ァ ·ァナス (Erwinia an anas)、エノレビニァ ·ヘリコラ (Erwinia herbicola)、エノレビニァ ·ノ ンクタタ (Erwinia punc tata)、エノレビニァ ·テレウス（Erwinia terreus)、メチロバクテリウム ·口デシァナム（Met hvlobacterium rhodesianum)、メチロノ クテリゥム ·ェクソトノレクェンス (Methvlobacteriu m extorauens)、フオルミディウム'エスピー（Phormidium sp.) ATCC29409、口ドノくクタ 一 ·力プスラタス (Rhodobacter capsulatus)、ロドパクター 'スフエロイデス (Rhodobacte r sphaeroides)、ロドシュ1 ~~トモナス ·ブフスチ y (Rnodopseudomonas blastica)、ロトン ユードモナス ·マリナ（RhodoDseudomonas marina)、ロドシユードモナス'パルストリス（ Rnodopseudomonas palustns)、口トスピリゥム ·リブフム (Rhodospirillum rubrum)、ロト スピリウム ·サレキシゲンス (Rhodospirillum salexieens)、ロドスピリゥム 'サリナラム (Eh odospirillum salinarum 、ストレプトマ でス · ンホノアンエンス (Streptomvces ambof aciens)、ストレフ。トマィセス ·才ーレ才ファシエンス (Streptomvces aureofaciens ) 、スト レプトマイセス ·ァゥレウス (Streptomvces aureus)、ストレプトマイセス ·フンジシディ力 ス (Streptomvces iuneicidicus)、ストレプトマイセス ·グリセォクロモゲナス (Streptomvc es griseochromogenes)、ストレプトマイセス ·グリセウス (Streptomvces gnseus 、ストレ プトマイセス .リビダンス (Streptomvces lividans.ストレプトマイセス 'オリボグリセウス treptomvces olivogriseus)、ストレフ。トマィセス ·フメウス (atreptomvces rameus)、ストレ プトマイセス ·タナシェンシス (Streptomvces tanashiensis)、ストレプトマイセス ·ビナセ ウス (Streptomvces vinaceus)、ザ モモナス ·モビリス (Zvmomonas mobins 等をめげ ることがでさる。
より好ましい原核生物としてはェシエリヒア属またはコリネバタテリゥム属に属する微 生物をあげることができ、さらに好ましくはェシエリヒア'コリおよびコリネバクテリウム- ダルタミカムをあげることができる。
また、より好まし 、微生物としてはダルタミル供与体の生産性が強化された微生物 をあげることができ、さらに好ましくは L-グルタミン酸の生産性が強化された微生物を あげることができる。
[0052] 具体的には、公知の方法により L-グルタミン酸を生産する能力を人為的に付与した 微生物、好ましくは原核生物、より好ましくはェシエリヒア属、またはコリネバタテリゥム 属に属する微生物、さらに好ましくはェシエリヒア 'コリおよびコリネバタテリゥム ·グルタ ミカムなどをあげることができる。
当該公知の方法としては、
(a) L-グルタミン酸の生合成を制御する機構の少なくとも 1つを緩和または解除する 方法、
(b) L-グルタミン酸の生合成に関与する酵素の少なくとも 1つを発現強化する方法、
(c) L-グルタミン酸の生合成に関与する酵素遺伝子の少なくとも 1つのコピー数を増 加させる方法、
(d) L-グルタミン酸の生合成経路力 L-グルタミン酸以外の代謝産物へ分岐する代 謝経路の少なくとも 1つを弱化または遮断する方法、および
(e)野生型株に比べ、 L-グルタミン酸のアナログに対する耐性度が高い細胞株を選 択する方法、
などをあげることができ、上記公知の方法は単独または組み合わせて用いることがで きる。
[0053] 上記（a)の具体的な方法は、 Agric. Biol. Chem., 43, 105-111(1979)、 J. BacterioL,
110. 761- 763(1972)および Appl. Microbiol. BiotechnoL, 39, 318- 323(1993)などに 記載されている。上記（b)の具体的な方法は、 Agric. Biol. Chem., 43, 105-111(1979 )および J. BacterioL, 110, 761-763(1972)などに記載されている。上記（c)の具体的 な方法は、 Appl. Microbiol. BiotechnoL, 39, 318- 323(1993)および Agric. Biol. Chem ., 39, 371-377(1987)などに記載されている。上記（d)の具体的な方法は、 Appl. Envi ron. MicribioL, 38, 181- 190(1979)および Agric. Biol. Chem., 42, 1773- 1778(1978)な どに記載されている。上記（e)の具体的な方法は、 Agric. Biol. Chem., 36, 1675-168 4(1972)、 Agric. Biol. Chem., 41, 109—116(1977)、 Agric. Biol. Chem., 37, 2013-2023 (1973)および Agric. Biol. Chem., 51, 2089- 2094(1987)などに記載されている。上記 文献等を参考に L-グルタミン酸を生産する能力を有する微生物を調製することがで きる。
[0054] さらに上記 (a)〜（e)の 、ずれかまたは組み合わせた方法による L-グルタミン酸を 生産する能力を有する微生物の調製方法については、 Biotechnology 2nd ed., Vol.6 , Products of Primary Metabolism (VCH Verlags ges ells chaft mbH, Weinheim, 1996) section 14a, 14bや Advances in Biochemical Engineering/ Biotechnology, 79, 1-35 (2003)、アミノ酸発酵、学会出版センター、相田 浩ら（1986)に記載されており、上 記文献等を参照することにより L-グルタミン酸を生産する能力を有する微生物を調製 することができる。
[0055] L-グルタミン酸を生産する能力を有する微生物は、数多く報告されており、例えば F ERM BP- 5807および ATCC13032などをあげることができる。
組換え体 DNAの導入方法としては、上記宿主細胞へ DNAを導入する方法であれ ばいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法 [Proc. Natl. Ac ad. Sci., USA, 69, 2110 (1972)]、プロトプラスト法（特開昭 63- 248394)、エレクトロボレ ーシヨン法 [Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)]等をあげることができる。
[0056] 酵母菌株を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、 YEpl3 ( ATCC37115)、 YEp24 (ATCC37051)、 YCp50 (ATCC37419)、 pHS19、 pHS15等を用 いることがでさる。
プロモーターとしては、酵母菌株中で機能するものであればいずれのものを用いて もよぐ例えば、 PH05プロモーター、 PGKプロモーター、 GAPプロモーター、 ADHプ 口モーター、 gal iプロモーター、 gal 10プロモーター、ヒートショックポリペプチドプロモ 一ター、 MF a lプロモーター、 CUP 1プロモーター等のプロモーターをあげることが できる。
[0057] 宿主細胞としては、サッカロマイセス (Saccharomvces)属、シゾサッカロマイセス (Sch izosaccharomvces) fe、クルィベロマイセス (Kluweromvces) 、トリコス ロン (Tricho sporon)属、シヮニォマイミセス（Schwanniomvces)属、ピチア (Pichia)属、またはキヤ ンデイダ (£ fe)属等に属する酵母菌株をあげることができ、具体的には、サッカロ マイセス ·セレビシェ (Saccharomvces cerevisiae)、シゾサッカロマイセス ·ボンべ (Schi zosaccharomyces nombe)、クノレイベロマ TTス 'フクアイス（Kluyveromyces lactis)、トリ コスポロン ·プルランス (Trichosporon pullulans)、シヮニォマイセス ·ァノレビウス (Schw anniomvces alluvius)、ピチア ·ノストリス (Pichia pastoris)、キャンディダ ·ウテイリス andida utilis)等をあげることができる。
[0058] 組換え体 DNAの導入方法としては、酵母に DNAを導入する方法であればいずれ も用いることができ、例えば、エレクト口ポレーシヨン法 [Methods EnzymoL, 194, 182 ( 1990)]、スフエロプラスト法 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81, 4889 (1984)]、酢酸リチ ゥム法 [J. BacterioL, 153, 163 (1983)]等をあげることができる。
動物細胞を宿主として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、 pcDNAU pcD M8 (フナコシ社より巿販）、 pAGE107 (特開平 3- 22979)、 pAS3- 3 (特開平 2- 227075)、 pCDM8[Nature, 329, 840 (1987)]、 pcDNAI/Amp (インビトロジェン社製）、 pREP4 (ィ ンビトロジェン社製）、 pAGE103[J. Biochem, 101, 1307 (1987)]、 pAGE210、 pAMo、 p AMoA等を用いることができる。
[0059] プロモーターとしては、動物細胞中で機能するものであればいずれも用いることが でき、例えば、サイトメガロウィルス（CMV)の IE (immediate early)遺伝子のプロモータ 一、 SV40の初期プロモーターあるいはメタ口チォネインのプロモーター、レトロウイノレ スのプロモーター、ヒートショックプロモーター、 SR aプロモーター等をあげることがで きる。また、ヒト CMVの IE遺伝子のェンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
[0060] 宿主細胞としては、マウス'ミエローマ細胞、ラット 'ミエローマ細胞、マウス'ハイブリ ドーマ細胞、ヒトの細胞であるナマルバ（Namalwa)細胞またはナマルバ KJM-1細胞 、ヒト胎児腎臓細胞、ヒト白血病細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞、チャイニーズ 'ハム スターの細胞である CHO細胞、 HBT5637 (特開昭 63-299)等をあげることができる。 マウス ·ミエローマ細胞としては、 SP2/0、 NSO等、ラット 'ミエローマ細胞としては YB2 /0等、ヒト胎児腎臓細胞としては HEK293(ATCC CRL-1573)、ヒト白血病細胞として は BALL-1等、アフリカミドリザル腎臓細胞としては COS-l、 COS-7等をあげることが できる。
[0061] 組換え体 DNAの導入方法としては、動物細胞に DNAを導入する方法であればい ずれも用いることができ、例えば、エレクト口ポレーシヨン法 [Cytotechnology, 3, 133 ( 1990)]、リン酸カルシウム法（特開平 2-227075)、リポフエクシヨン法 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84, 7413 (1987)]、 Virology, 52, 456 (1973)に記載の方法等をあげること ができる。
[0062] 昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えば Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W. H. Freeman and company, New York (1992)、 7ルント-フ—ロト コーノレズ 'イン'モレキュラー'ノ ィォロジ一、 Molecular Biology, A Laboratory Manual 、 Bio/Technology, 6, 47 (1988)等に記載された方法によって、蛋白質を生産すること ができる。
[0063] 即ち、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウィルスを昆虫細胞に共導入して 昆虫細胞培養上清中に組換えウィルスを得た後、さらに組換えウィルスを昆虫細胞 に感染させ、蛋白質を生産させることができる。
該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、例えば、 pVL1392、 pVLl
393、 pBlueBacIII (V、ずれもインビトロジェン社製）等をあげることができる。
[0064] バキュロウィルスとしては、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウィルスであるアウトグ ラファ 'カリフオル-力'ヌクレア一'ポリへドロシス'ウィルス (Autographa californica nu clear polyhedrosis virus;等を用 ヽること »でさ 。
昆虫細胞としては、スポドプテラ ·フルギベルダ (Spodoptera frueiperda)の卵巣細胞
、トリコプルシア，二 (TrichoDlusia ni)の卵巢細朐、カイコ卵巣由来の培養細胞等を用 いることがでさる。
[0065] スポドプテラ ·フルギベルダの卵巣細胞としては S19、 S1 1 (バキュロウィルス'イクスプ レツシヨン'ベクターズァ 'ラボラトリー 'マ-ユアル)等、トリコプルシア '二の卵巣細胞 としては High 5、 ΒΤΙ-ΤΝ-5Β1-4 (インビトロジェン社製)等、カイコ卵巣由来の培養細 胞としてはボンビクス'モリ (Bombvx mori) N4等をあげることができる。
組換えウィルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクター と上記バキュロウィルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法 (特開平 2 -227075)、リポフエクシヨン法 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84, 7413 (1987)]等をあげ ることがでさる。
[0066] 植物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、 Tiプラス ミド、タバコモザイクウィルスベクター等をあげることができる。 プロモーターとしては、植物細胞中で機能するものであればいずれのものを用いて もよぐ例えば、カリフラワーモザイクウィルス（CaMV)の 35Sプロモーター、ィネアクチ ン 1プロモーター等をあげることができる。
[0067] 宿主細胞としては、タバコ、ジャガイモ、トマト、ニンジン、ダイズ、アブラナ、アルファ ルファ、イネ、コムギ、ォォムギ等の植物細胞等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、植物細胞に DNAを導入する方法であれば ヽ ずれも用いることができ、例えば、ァグロパクテリゥム (Agrobacterium)を用いる方法 ( 特開昭 59-140885、特開昭 60-70080、 WO94/00977)、エレクト口ポレーシヨン法（特 開昭 60-251887)、パーティクルガン (遺伝子銃）を用いる方法 (特許第 2606856、特 許第 2517813)等をあげることができる。
(3) γ -ダルタミルシスティンシンセターゼの調製法
上記 3の細胞、または上記（1)および（2)で得られる形質転換体を培地に培養し、 培養物中に γ -ダルタミルシスティンシンセターゼを生成、蓄積させ、該培養物から 該蛋白質を採取することにより、 γ -ダルタミルシスティンシンセターゼを製造すること ができる。
[0068] 上記 γ -ダルタミルシスティンシンセターゼを有する細胞および形質転換体を培地 に培養する方法は、細胞の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。 エシ リヒア 'コリ等の原核生物あるいは酵母等の真核生物、およびそれらを宿主と して得られた形質転換体などの細胞を培養する培地としては、該細胞が資化し得る 炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、該細胞の培養を効率的に行える培地であれ ば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
[0069] 炭素源としては、該生物が資化し得るものであればよぐグルコース、フラクトース、 スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水 化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類 等を用いることができる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモ-ゥム、硫酸アンモ-ゥム、酢酸アンモ- ゥム、リン酸アンモ-ゥム等の無機酸もしくは有機酸のアンモ-ゥム塩、その他の含窒 素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカ一、カゼィ ン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体、およびその消化 物等を用いることができる。
[0070] 無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸 マグネシウム、塩ィ匕ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム 等を用いることができる。
培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。培養 温度は 15〜40°Cがよぐ培養時間は、通常 5時間〜 7日間である。培養中 pHは 3.0〜9 .0に保持する。 pHの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシ ゥム、アンモニア等を用いて行う。
[0071] また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に 添カロしてちょい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微 生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例 えば、 k£プロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するとき にはイソプロピル一 β —D—チォガラタトピラノシド等を、 imプロモーターを用いた発 現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地 に添カ卩してもよい。
[0072] 動物細胞、および動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地とし ては、一般に使用されている RPMI1640培地 [J. Am. Med. Assoc., 199, 519 (1967)]、 Eagleの MEM培地 [Science, 122, 501 (1952)]、 DMEM培地 [Virology, 8, 396 (1959)]、 199培地 [Proc. Soc. Biol. Med., 73, 1 (1950)]またはこれら培地に牛胎児血清等を添 カロした培地等を用いることができる。
[0073] 培養は、通常 pH6〜8、 25〜40°C、 5%CO存在下等の条件下で 1〜7日間行う。
2
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生 物質を培地に添加してもよい。
昆虫細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用さ れている TNM- FH培地 (ファーミンジェン社製)、 Sf-900 II SFM培地（ライフ'テクノロジ ーズ社製）、 ExCell400、 ExCell405 [いずれも JRHバイオサイエンシーズ社製]、 Grace' s Insect Medium[Nature, 195, 788 (1962)]等を用いることができる。
[0074] 培養は、通常 pH6〜7、 25〜30°C等の条件下で 1〜5日間行う。
また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい 植物細胞を宿主として得られた形質転換体は、細胞として、または植物の細胞や器 官に分化させて培養することができる。該形質転換体を培養する培地としては、一般 に使用されているムラシゲ'アンド'スターグ (MS)培地、ホワイト (White)培地、またはこ れら培地にオーキシン、サイトカイニン等、植物ホルモンを添カ卩した培地等を用いるこ とがでさる。
[0075] 培養は、通常 pH5〜9、 20〜40°Cの条件下で 3〜60日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ハイグロマイシン等の抗生物質を培地 に添カ卩してもよい。
y -ダルタミルシスティンシンセターゼの生産方法としては、細胞内に生産させる方 法、細胞外に分泌させる方法、あるいは細胞外膜上に生産させる方法があり、使用 する細胞や、生産させる蛋白質の構造を変えることにより、該方法を適用することが できる。
[0076] γ -ダルタミルシスティンシンセターゼが細胞内ある 、は細胞外膜上に生産される 場合、ポールソンらの方法 [J. Biol. Chem., 264, 17619 (1989)]、ロウらの方法 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 8227 (1989)、 Genes Develop., 4, 1288 (1990)]、または特 開平 5-336963、 WO94/23021等に記載の方法を準用することにより、該蛋白質を細 胞外に積極的に分泌させることができる。
[0077] すなわち、遺伝子組換えの手法を用いて、 γ -グルタミルシスティンシンセターゼの 活性部位を含むアミノ酸配列の手前にシグナルペプチドを付加した形で生産させる ことにより、 γ -ダルタミルシスティンシンセターゼを細胞外に積極的に分泌させること ができる。
また、特開平 2-227075に記載されている方法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝 子等を用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。
[0078] さらに、遺伝子導入した動物または植物の細胞を再分ィ匕させることにより、遺伝子 が導入された動物個体 (トランスジエニック非ヒト動物)または植物個体 (トランスジェ- ック植物）を造成し、これらの個体を用いて γ -ダルタミルシスティンシンセターゼを製 造することちでさる。
γ -ダルタミルシスティンシンセターゼを有する形質転換体が動物個体または植物 個体の場合は、通常の方法に従って、飼育または栽培し、該蛋白質を生成、蓄積さ せ、該動物個体または植物個体より該蛋白質を採取することにより、該蛋白質を製造 することができる。
[0079] 動物個体を用いて γ -ダルタミルシスティンシンセターゼを製造する方法としては、 例えば公知の方法 [Am. J. Clin. Nutr" 63, 639S (1996)、 Am. J. Clin. Nutr" 63, 627 S (1996)、 Bio/Technology, 9, 830 (1991)]に準じて遺伝子を導入して造成した動物 中に該蛋白質を生産する方法があげられる。
動物個体の場合は、例えば、 γ -ダルタミルシスティンシンセターゼをコードするポリ ヌクレオチドを導入したトランスジエニック非ヒト動物を飼育し、 γ -ダルタミルシスティ ンシンセターゼを該動物中に生成、蓄積させ、該動物中より該蛋白質を採取すること により、該蛋白質を製造することができる。該動物中の生成、蓄積場所としては、例え ば、該動物のミルク (特開昭 63-309192)、卵等をあげることができる。この際に用いら れるプロモーターとしては、動物で機能するものであればいずれも用いることができる 1S 例えば、乳腺細胞特異的なプロモーターである αカゼインプロモーター、 βカゼ インプロモーター、 j8ラクトグロブリンプロモーター、ホエー酸性プロテインプロモータ 一等が好適に用いられる。
[0080] 植物個体を用いて γ -ダルタミルシスティンシンセターゼを製造する方法としては、 例えば γ -ダルタミルシスティンシンセターゼをコードするポリヌクレオチドを導入した トランスジェニック植物を公知の方法 [組織培養， 20 (1994)、組織培養， 21 (1995)、 Tr ends BiotechnoL, 15, 45 (1997)]に準じて栽培し、該蛋白質を該植物中に生成.蓄積 させ、該植物中より該蛋白質を採取することにより、該蛋白質を生産する方法があげ られる。
[0081] γ -ダルタミルシスティンシンセターゼを生産する細胞または形質転換体を用いて 製造された γ -ダルタミルシスティンシンセターゼを単離、精製する方法としては、通 常の酵素の単離、精製法を用いることができる。
例えば、 γ -ダルタミルシスティンシンセターゼカ 細胞内に溶解状態で生産された 場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液にけん濁後、超 音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細 胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。
[0082] 該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常の酵素の単離精 製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジ ェチルアミノエチル（DEAE)—セファロース、 DIAION ΗΡΑ-75 (三菱化成社製)等レジ ンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、 S- Sepharose FF (Pharmacia社製)等の レジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フエ二ルセフ ァロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過 法、ァフィユティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動 等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることが できる。
[0083] また、該蛋白質が細胞内に不溶体を形成して生産された場合は、同様に細胞を回 収後破砕し、遠心分離を行うことにより得られた沈殿画分より、通常の方法により該蛋 白質を回収後、該蛋白質の不溶体を蛋白質変性剤で可溶ィ匕する。
該可溶化液を、蛋白質変性剤を含まな ヽあるいは蛋白質変性剤の濃度が蛋白質 が変性しない程度に希薄な溶液に希釈、あるいは透析し、該蛋白質を正常な立体構 造に構成させた後、上記と同様の単離精製法により精製標品を得ることができる。
[0084] γ -ダルタミルシスティンシンセターゼあるいはその糖修飾体等の誘導体が細胞外 に分泌された場合には、培養上清に該蛋白質あるいはその糖付加体等の誘導体を 回収することができる。
即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理することにより可溶性 画分を取得し、該可溶性画分から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精 製標品を得ることができる。
[0085] このようにして取得される γ -グルタミルシスティンシンセターゼとして、例えば、配 列番号 1で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をあげることができる。 また、 γ -ダルタミルシスティンシンセターゼを他の蛋白質との融合蛋白質として生 産し、融合した蛋白質に親和性をもつ物質を用いたァフィユティークロマトグラフィー を利用して精製することもできる。例えば、ロウらの方法 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA,
86, 8227 (1989)、 Genes Develop., 4, 1288 (1990)]、特開平 5- 336963、 WO94/2302 1に記載の方法に準じて、本発明のポリペプチドをプロテイン Aとの融合タンパク質と して生産し、ィムノグロブリン Gを用いるァフィユティークロマトグラフィーにより精製す ることがでさる。
[0086] また、 γ -グルタミルシスティンシンセターゼを Flagペプチドとの融合蛋白質として 生産し、抗 Flag抗体を用いるァフィユティークロマトグラフィーにより精製することがで きる [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 8227 (1989)、 Genes Develop., 4, 1288 (1990)] 。また、 γ -ダルタミルシスティンシンセターゼに対する抗体を用いたァフィ-ティーク 口マトグラフィ一で精製することもできる。
[0087] γ -グルタミルシスティンシンセターゼのアミノ酸情報を基に、 Fmoc法（フルォレニ ルメチルォキシカルボ-ル法）、 tBoc法（t ブチルォキシカルボ-ル法）等の化学 合成法により、 γ -ダルタミルシスティンシンセターゼを製造することができる。また、 A dvanced ChemTech千土、ノヽ ~~キン，エルマ1 ~~社、 Pharmacia社、 Protein Technology Ins trument社、 SyntheceU- Vega社、 PerSeptive社、島津製作所等のペプチド合成機を利 用して化学合成することもできる。
6.本発明で用いられる y -ダルタミルシスティンシンセターゼを有する細胞の培養物 および該培養物の処理物の調製法
本発明で用いられる 7 -ダルタミルシスティンシンセターゼを有する細胞の培養物 は、上記 3の細胞、または上記 5 (1)および（2)で得られる形質転換体を上記 5 (3)の 方法により培養し、培養物中に γ -ダルタミルシスティンシンセターゼを生成、蓄積さ せること〖こより取得することができる。
[0088] また、本発明で用いられる γ -ダルタミルシスティンシンセターゼを有する細胞の培 養物の処理物としては、培養物の濃縮物、培養物の乾燥物、培養物を遠心分離して 得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理 物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物、該菌体の固定化物などの生菌体 、該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕処理物、該菌体の蛋白質分画物、 あるいは該菌体より抽出して得られる酵素標品などの粗酵素抽出物をあげることがで き、それぞれ本発明の製造法の酵素源として使用できる限り、すなわち γ -ダルタミル システィンシンセターゼ活性を有する限り、公知の方法によって調製することができる
7.本発明の γ -ダルタミルアミドィ匕合物の製造法
(1)酵素的製造法
y -ダルタミルシスティンシンセターゼを酵素源に用いて、ダルタミル供与体とアミン 化合物とから式 (I) (式中、 R1および R2は同一または異なって、水素原子、置換若しく は非置換の低級アルキル、置換若しくは非置換の低級ァルケ-ル、または置換若し くは非置換の低級アルキ-ルを表す力 R1および R2は同時に水素原子にはならない )で表される γ -ダルタミルアミドィ匕合物を生成することにより、 γ -ダルタミルアミドィ匕 合物を製造することができる。
[0089] より具体的には、 γ -グルタミルシスティンシンセターゼ、グルタミル供与体、ァミン 化合物および ΑΤΡを水性媒体中に存在せしめ、該媒体中に γ -グルタミルアミド化 合物を生成、蓄積させ、該媒体から γ -ダルタミルアミドィ匕合物を採取する方法をあげ ることがでさる。
上記本発明の製造法において、基質に用いられるダルタミル供与体としては、 y - ダルタミルシスティンシンセターゼの基質となり、ァミン化合物と反応して γ -ダルタミ ルアミド化合物を与える化合物であれば特に制限はな 、が、例えば L-グルタミン酸、 D—グルタミン酸、 2—ォキソダルタル酸、およびそれらの塩などをあげることができ、 好ましくは L-グルタミン酸、およびその塩をあげることができる。
[0090] ァミン化合物としては、下式（III)
[0091] [化 3]
H NR1 R2 (T T T)
[0092] (式中、 R1および R2は前記と同義である）で表されるアミンィ匕合物をあげることができる 式 (III)で表されるアミンィ匕合物としては、好ましくはメチルァミン、ェチルァミン、プロ ピルァミン、シクロプロピルァミン、ブチルァミンなどをあげることができ、より好ましくは ェチルァミンをあげることができる。
[0093] 上記の製造法にお!、て、 γ -ダルタミルシスティンシンセターゼは、基質として用い るグルタミル供与体 lgあたり通常 0.01〜100mg、好ましくは 0.1mg〜10mg添カ卩する。 上記の製造法において、基質として用いるダルタミル供与体とアミンィ匕合物は、通 常 0.1〜500g/L、好ましくは 0.2〜200g/Lの濃度になるように水性媒体中に初発また は反応途中に添加する。
[0094] 上記の製造法において、エネルギー源として用いる ATPは、通常 0.5mmol〜10mol/
Lの濃度で用いる。
本発明の製造法で用いられる水性媒体としては、 γ -ダルタミルアミドィ匕合物の生成 反応を阻害しない限り、いかなる成分、組成の水性媒体であってもよぐ例えば、水、 りん酸塩、炭酸塩、酢酸塩、ほう酸塩、クェン酸塩、トリスなどの緩衝液、メタノール、 エタノールなどのアルコール類、酢酸ェチルなどのエステル類、アセトンなどのケトン 類、ァセトアミドなどのアミド類などをあげることができる。
[0095] y -ダルタミルアミドィ匕合物の生成反応は水性媒体中、通常 pH5〜ll、好ましくは p H6〜10、 20〜50°C、好ましくは 25〜45°Cの条件で 2〜150時間、好ましくは 6〜120時 間行う。
上記方法で製造される γ -ダルタミルアミド化合物としては、式 (I) (式中、 R1および R 2は前記と同義である）で表される化合物、好ましくは式 (I)において、 R1が水素原子 であり R2力メチル、ェチル、プロピル、シクロプロピルまたはブチルである化合物、より 好ましくは式 (II)で表されるテアニンをあげることができる。
(2)細胞の培養物等を酵素源として用いる製造法
γ -ダルタミルシスティンシンセターゼを有する細胞の培養物または該培養物の処 理物を酵素源に用いて、ダルタミル供与体とアミンィ匕合物とから式 (I) (式中、 R1およ び R2は前記と同義である）で表される γ -ダルタミルアミドィ匕合物を生成することにより 、 γ -ダルタミルアミドィ匕合物を製造することができる。
[0096] より具体的には、 [1] γ -ダルタミルシスティンシンセターゼを有する細胞の培養物 または該培養物の処理物、およびァミン化合物を水性媒体中に存在せしめ、該媒体 中に γ -ダルタミルアミドィ匕合物を生成、蓄積させ、該媒体から γ -ダルタミルアミドィ匕 合物を採取する方法、および [2] γ -ダルタミルシスティンシンセターゼを有する細胞 の培養物または該培養物の処理物、ダルタミル供与体、およびァミン化合物を水性 媒体中に存在せしめ、該媒体中に γ -ダルタミルアミド化合物を生成、蓄積させ、該 媒体から γ -ダルタミルアミドィ匕合物を採取する方法をあげることができる。
[0097] 上記製造法で用いられる y -ダルタミルシスティンシンセターゼを有する細胞の培 養物または該培養物の処理物としては、上記 6の方法により調製することができる培 養物等をあげることができる。
上記製造法において、基質の種類とその使用濃度、および生産される γ -ダルタミ ルアミド化合物は、上記 7 (1)の酵素的製造法と同様である。
[0098] また、上記製造法において用いられる水性媒体としては、上記 7 (1)の酵素的製造 法に用いられる水性媒体に加え、酵素源として用いる細胞の培養液も水性媒体とし て用いることができる。
また上記製造法においては、必要に応じて、 ΑΤΡの供給源として、細胞が代謝して ΑΤΡを生産し得る化合物、例えばグルコースのような糖類、エタノールのようなアルコ ール類、酢酸のような有機酸類などを水性媒体中に加えることができる。
[0099] さらに必要に応じて、水性媒体中に界面活性剤あるいは有機溶媒を添加してもよ い。界面活性剤としては、ポリオキシエチレン'ォクタデシルァミン (例えばナイミーン S -215、 日本油脂社製)などの非イオン界面活性剤、セチルトリメチルアンモ -ゥム 'ブ ロマイドやアルキルジメチル.ベンジルアンモ -ゥムクロライド（例えばカチオン F2- 40 Ε、 日本油脂社製)などのカチオン系界面活性剤、ラウロイル'ザルコシネートなどの ァ-オン系界面活性剤、アルキルジメチルァミン (例えば三級アミン FB、 日本油脂社 製)などの三級アミン類など、ガラクトース含有複合糖質の生成を促進するものであれ ばいずれでもよぐ 1種または数種を混合して使用することもできる。界面活性剤は、 通常 0. 1〜50 g/1の濃度で用いられる。有機溶剤としては、キシレン、トルエン、脂肪 族アルコール、アセトン、酢酸ェチルなどが挙げられ、通常 0.1〜50 ml/1の濃度で用 いられる。
[0100] 培養物または該培養物の処理物を酵素源として用いる場合、該酵素源の量は、当 該酵素源の比活性等により異なが、例えば、基質であるダルタミル供与体 lmgあたり 通常 5〜1000mg、好ましくは 10〜400mg添カ卩する。
γ -ダルタミルアミドィ匕合物の生成反応は水性媒体中、通常 ρΗ5〜11、好ましくは ρ Η6〜10、通常 20〜50°C、好ましくは 25〜45°Cの条件で、通常 2〜150時間、好ましく は 6〜120時間行う。
[0101] 水性媒体中に生成、蓄積した γ -ダルタミルアミド化合物の採取は、活性炭ゃィォ ン交換樹脂などを用いる通常の方法あるいは、有機溶媒による抽出、結晶化、薄層 クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等により行うことができる。
以下に、実施例を示すが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
実施例 1
[0102] γ -グルタミルシスティンシンセターゼ発現株の造成
ェシエリヒア'コリはダルタチオンを生成する能力を有しており、ダルタチオン生合成 に関わる酵素として、 γ -ダルタミルシスティンシンセターゼをコードする遺伝子が同 定されている [Nucleic Acids Res., 14, 4393-400 (1986)]。
よって、以下の方法により γ -ダルタミルシスティンシンセターゼをコードするポリヌク レオチドをクローユングし、 γ -ダルタミルシスティンシンセターゼ発現株を造成した。
[0103] まず、カレント 'プロトコ一ルズ'イン'モレキュラ^ ~ ·バイオロジーに記載の飽和フエノ ールを用いる方法により、ェシエリヒア'コリ W3110株の染色体 DNAを単離精製した。 パーセプティブ ·バイオシステムズ (Perseptive Biosystems)社製 8905型 DNA合成 機を用いて、配列番号 3〜6で表される塩基配列を有する DNA (以下、プライマー A 、プライマー B、プライマー C、プライマー Dと呼ぶ）を合成した。プライマー Aは、公知 であるェシエリヒア'コリの γ -ダルタミルシスティンシンセターゼ遺伝子の開始コドンを 含む領域の 5'側に Hindlll認識配列を含む塩基配列を付加したものである。なお本遺 伝子の開始コドンは TTGで始まるため、翻訳効率の向上を期待して ATGに変更した 。プライマー Bは、 γ -グルタミルシスティンシンセターゼ遺伝子の終始コドンを含む 配列と相補的な塩基配列の 5'側に E lHI認識配列を含む塩基配列を付加したもの である。またプライマー Cは、発現ベクター pUC19の k£プロモーター領域の塩基配列 の 5'側に E^RI認識配列を含む塩基配列を付加したものである。プライマー Dは、発 現ベクター pUC19の プロモーター領域の配列と相補的な配列の 5'側に Hindlll認 識配列を含む塩基配列を付加したものである。
[0104] γ -グルタミルシスティンシンセターゼをコードするポリヌクレオチド断片の増幅には 上記のプライマー Αおよびプライマー Β、铸型としてェシエリヒア'コリ (E. coH)W3110 株の染色体 DNAを用い、 プロモーター領域の断片の増幅にはプライマー Cおよ びプライマー D、铸型として pUC19を用いた PCRを行った。
PCRは、铸型として 0.1 μ gの染色体 DNAまたは lOOngの pUC19、 0.5 μ mol/Lの各 プライマー、 2.5 unitsの DNAポリメラーゼ (ストラタジーン社製 )、 4 Lの EfiiDNAポ リメラーゼ用 X 10緩衝液 (ストラタジーン社製)、各 200 μ mol/Lの dNTP(dATP、 dGTP、 dCTPおよび TTP)を含む反応液 40 Lを調製し、 94°Cで 1分間、 55°Cで 2分間、 72°C で 3分間の工程を 30回繰り返すことにより行った。
[0105] 該反応液の 1/10量をァガロースゲル電気泳動し、プライマー Aおよびプライマー B を用いた PCRでは γ -グルタミルシスティンシンセターゼをコードするポリヌクレオチド 断片に相当する約 1.6kb、プライマー Cおよびプライマー Dを用いた反応では k£プロ モーター領域に相当する約 0.3kbのポリヌクレオチド断片がそれぞれ増幅していること を確認後、残りの反応液と等量の TE[10 mmol/L Tris- HCl(pH8.0)、 1 mmol/L EDTA] 飽和フエノール/クロ口ホルム（lvol/lvol)を添カ卩して混合した。該混合液を遠心分離 後、得られた上層に 2倍容量の冷エタノールをカ卩えて混合し、 -80°Cに 30分間放置し た。該溶液を遠心分離し、得られた DNAの沈殿を 20 Lの TEに溶解した。
[0106] 該溶液それぞれ 5 μ Lを用い、 y -ダルタミルシスティンシンセターゼをコードするポ リヌクレオチド断片を制限酵素 ttodlllおよび旦 iHIで、また!^プロモーター領域の D NAを制限酵素 Hindlllおよび で切断し、ァガロースゲル電気泳動により DNA 断片を分離した後、ジーンクリーン IIキット（GENECLEAN II kit, BIO 101社製）により 、 γ -グルタミルシスティンシンセターゼをコードするポリヌクレオチドを含む 1.6kbおよ び!^プロモーター領域を含む 0.3kbの DNA断片をそれぞれ回収した。
[0107] 0.2 μ gの発現ベクター pTrS33 (特許 2928287号）を制限酵素 Mindlllおよび E^RIで 切断後、 Alkaline phosphataseにて処理してァガロースゲル電気泳動により DNA断 片を分離し、上記と同様の方法により 3.16kbの DNA断片を回収した。 上記で得られた！^プロモーター領域を含む 0.3kb断片と 3.16kbのベクター断片とを ライゲーシヨンキット（宝酒造社製)を用いて、 16°Cで 16時間反応させ連結した。
[0108] 該反応液を用いて E. coH DH5 a tt (東洋紡社製)を、カルシウムイオンを用いる方 法〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110 (1972)]によって形質転換し、該形質転換 体を 50 μ g/mLのアンピシリンを含む LB寒天培地に塗布後、 30°Cでー晚培養した。 生育してきた形質転換体のコロニーより公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、k£ プロモーターが挿入された発現ベクターが取得されて 、ることを確認し、該発現べク ターを pTrS33Lと命名した。
[0109] pTrS33Lを制限酵素 Hindlllおよび旦里 HIで切断後、 Alkaline phosphataseにて処理 してァガロースゲル電気泳動によりポリヌクレオチド断片を分離し、上記と同様の方法 により 2.5kbのポリヌクレオチド断片を回収した。
上記で得られたを含む 1.6kb断片および 2.5kbのベクター断片をライゲーシヨンキット
(タカラバイオ社製)を用いて、 16°Cで 16時間反応させ連結した。
[0110] 該反応液を用いて E. coH DH5ひ株 (東洋紡社製)を、カルシウムイオンを用いる方 法〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110 (1972)]によって形質転換し、該形質転換 体を 50 μ g/mLのアンピシリンを含む LB寒天培地に塗布後、 30°Cでー晚培養した。 生育してきた形質転換体のコロニーより公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、 k£ プロモーター下流に配列番号 1で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする 配列番号 2で表される塩基配列を有する γ -ダルタミルシスティンシンセターゼをコ一 ドするポリヌクレオチドが連結したプラスミド DNAが取得されていることを配列決定およ び制限酵素消化により確認し、該プラスミド DNAを pGSKlと命名した。 pGSKlの構造 を図 1に示す。また、該プラスミドを保有する E. coliDH5 aを E. coH DH5 α /pGSKlと 命名した。
実施例 2
[0111] 培養物の処理物を酵素源に用いた γ -ダルタミルアミドィ匕合物の製造（1)
実施例 1で作製した組換え E. coH DH5 α /pGSKlを、 100mg/Lのアンピシリンを含 有する 40mlの LB培地レ クトトリプトン（Difco社製） 10g/l、イーストエキス（Difco社製） 5 g/l、 NaCl 5g川に各々植菌し、 300ml容三角フラスコで 30°C—晚振盪培養した。培養 終了後、培養物を遠心分離することにより回収した菌体を、 100mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)に懸濁し、分光光度計の測定で OD660が 70になるように菌体濃度を調整し、菌 体含有溶液とした。
[0112] 該菌体含有溶液にキシレンを 10ml/Lになるように添カ卩し、 15分間ボルテックスする ことにより処理菌体を取得した。 100 1の処理菌体に表 1に示す濃度になるよう各物 質を添カ卩し、総量 200 1にした反応液を 37°Cで 60分間反応した。
[0113] [表 1] 表 1
反応液組成
Tris 12.1 g/L
MgS04- 7H20 5 g/L
K2S04 3.5 g/L
NAD - 3H20 143 mg/L
FMN - Na - 2H20 65.6 mg/L
ATP 12.1 g/L
グルタミン酸ナトリウム 0または 2.5 g/L
ェチルァミン塩酸塩 0または 20 g/L
[0114] 反応終了後、以下の条件で反応液を HPLC分析することにより、反応液中に生成し たテアニンを検出、定量した。結果を表 2に示す。
HPLC分析条件：
移動相： 2g/Lのァセトニトリルを含む 3.5%水溶液に 1-ヘプタンスルホン酸ナトリウム（ リン酸で pH 2.0に調製）
カラム： NucreosiKGLサイエンス社製） 4.6 X 150mmを 2本連結カラム温度： 40°C 流速： 0.9ml/分
検出： 210nmの吸収
[0115] [表 2] 表 2
ェチルァミン添加量 L ^ミン酸添加量 テア^^生成量
( g/L) ( g/L) ( mg/L)
0 0 0
20 2.5 520
20 0 54
[0116] 上記にあるとおり、 γ -ダルタミルシスティンシンセターゼをコードするポリヌクレオチ ドを導入して得られた E. coli DH5 a /pGSKl株の培養物の処理物を酵素源に用いる ことにより、テアニンが製造できることがわ力つた。また、基質として L-グルタミン酸を 添加しなくてもテアニンの生成が確認されたことから、特にダルタミル供与体となる L- グルタミン酸等の生産能が強化されて 、な 、細胞であっても、基質としてアミンィ匕合 物を添加するのみで、テアニンのような γ -ダルタミルアミドィ匕合物を生成する能力が あることがわかった。
実施例 3
[0117] 培養物の処理物を酵素源に用いた γ -ダルタミルアミドィ匕合物の製造（2)
γ -ダルタミルシスティンシンセターゼをコードするポリヌクレオチドが挿入された組 換えプラスミド pGSKlを E. ^HBL21株 (宝酒造製)に常法に従って導入して取得し、 E. coli BL21/pGSKl株を取得した。
E. coH BL21/pGSKl株を 100mg/Lのアンピシリンを含む LB寒天培地に塗布し、 30 °Cで 1晚静置培養した。生育してきた菌を 300mlの前培養培地 [コーンスティープリカ 一 6%、グルタミン酸ナトリウム 1.15%、乳酸 0.2%、カザミノ酸 200mg/L、ビタミン B1 5 mg/L (pH7.2)]が入った 2L容の三角フラスコに植菌し、 28°C、 220rpmで 20時間培養 した。得られた培養物 2.25mlを 1Lのシード培地 [コーンスティープリカ一 2%、大豆べ プチド (SMS:不二精油製） 0.5%、リン酸水素 2カリウム 1.5%、塩化ナトリウム 0.1%、硫酸 アンモ-ゥム 0.6%、グリシン 0.1%、アルギニン塩酸塩 0.06%、硫酸第一鉄 4.95mg/L、 硫酸亜鉛 4.4mg/L、硫酸銅 1.97mg/L、塩化マンガン 360 /z g/L、ほう酸ナトリウム 44 0 μ g/L、モリブデン酸アンモ-ゥム 185 μ g/L、ビタミン Bl 5mg/L、ニコチン酸 5mg/L 、ロイシン 20mg/L、スレオニン 20mg/L、トリプトファン 20mg/L、 LG109 (旭電化工業 社製） 0.01%、グルコース 1%、硫酸マグネシウム 0.05%、アンピシリン 100mg/L (pH6.5 ；) ]が入った 2L-Jarに植菌し、通気 1L/分、攪拌速度 800rpm、 30°Cで 8時間培養した。
[0118] 得られた培養物 28mlを 1Lの生産培地 [コーンスティープリカ一 2.25%、大豆べプチ ド (SMS:不二精油製） 0.55%、リン酸水素 2カリウム 1.68%、塩化ナトリウム 0.115%、硫酸 アンモニゥム 0.68%、硫酸第一鉄 5.57mg/L、硫酸亜鉛 4.95mg/L、硫酸銅 2.21mg/ L、塩化マンガン 405 μ g/L、ほう酸ナトリウム 495 μ g/L、モリブデン酸アンモ-ゥム 2 08 μ g/L、ビタミン Bl 5.6mg/L、ニコチン酸 5.6mg/L、ロイシン 22mg/L、スレオ-ン 2 2mg/L、トリプトファン 22mg/L、 LG109 0.018%、グルコース 1.26%、硫酸マグネシウム 0.08%アンピシリン 100mg/L(pH6.5)]が入った 2L-Jarに植菌し、通気 1L/分、攪拌速 度 800rpm、 30°C、 28%アンモニア水で pH6.5にコントロールしながら培養した。培養中 、 340mlのフィード糖液 (グルコース 57.7%、塩化カルシウム 0.188g/L)を一定流速で 添加した。
[0119] 30時間後に培養を終了し、キシレンを 7.5ml/L添加して 10分間攪拌することにより培 養物の処理物を取得した。 700mlの該処理物に硫酸マグネシウム 3.5g、硫酸カリウム 2.45g、 ATP 350mg、 NAD 50mg、 FMN 22mg、グルコース 65g、ェチルァミン塩酸塩 28g、グルタミン酸ナトリウム 56gを添カ卩し、 34°C、通気 0.7ml/分、撹拌速度 950rpm、 水酸ィ匕ナトリウム溶液で PH7.2にコントロールしながら 18時間、反応を行った。反応生 成物を実施例 2と同様の分析条件で分析し、 2.1g/Lのテアニンが生成していることを 確認した。
産業上の利用可能性
[0120] γ ダルタミルアミド化合物、好ましくはテアニンを簡便かつ効率よく製造すること ができる。
配列表フリーテキスト
[0121] 配列番号 3 人工配列の説明：合成 DNA
配列番号 4 人工配列の説明：合成 DNA
配列番号 5—人工配列の説明：合成 DNA
配列番号 6—人工配列の説明：合成 DNA

Claims

請求の範囲 Η
[1] y - 2グ Νノレタミノレシスティンシンセターゼ（ γ -glutamylcysteine synthetase)または該酵素
CCCCNCIIIII
を有する細胞の培養物もしくは該培養物の処理物を酵素源に用いて、ダルタミル供 与体とアミンィ匕合物とから下式 (I)
[化 4]
OOH H
H2
H2
O
R1 R2 (I)
(式中、 R1および R2は同一または異なって、水素原子、置換若しくは非置換の低級ァ ルキル、置換若しくは非置換の低級アルケニル、または置換若しくは非置換の低級 アルキ-ルを表すが、 R1および R2は同時に水素原子にはならない）で表される γ -グ ルタミルアミド化合物を生成することを特徴とする γ -ダルタミルアミド化合物の製造方 法。
[2] γ -ダルタミルシスティンシンセターゼが微生物由来の酵素である、請求項 1記載の 製造方法。
[3] 微生物が腸内細菌、酵母または糸状菌のいずれかである、請求項 2記載の製造方 法。
[4] 微生物がェシエリヒア (Escherichia)属に属する微生物である、請求項 2記載の製造方 法。
[5] y -ダルタミルシスティンシンセターゼが以下の [1]〜 [3]の!、ずれかに記載の蛋白 質である、請求項 1記載の製造方法。
[1]配列番号 1で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
[2]配列番号 1で表されるアミノ酸配列において、 1個以上のアミノ酸残基が欠失、置 換または付カ卩したアミノ酸配列カゝらなり、かつ γ -ダルタミルシスティンシンセターゼ活 性を有する蛋白質
[3]配列番号 1で表されるアミノ酸と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列からな る蛋白質
[6] 細胞が微生物である、請求項 1記載の製造方法。
[7] 微生物が腸内細菌、酵母または糸状菌のいずれかである、請求項 6記載の製造方 法。
[8] 微生物がェシエリヒア (Escherichia)属に属する微生物である、請求項 6記載の製造方 法。
[9] γ -グルタミルシスティンシンセターゼを有する細胞が γ -グルタミルシスティンシンセ ターゼをコードするポリヌクレオチドを導入された細胞である、請求項 1および 6〜8の いずれか 1項に記載の製造方法。
[10] γ -グルタミルシスティンシンセターゼをコードするポリヌクレオチドが以下の [1]〜 [3] の!、ずれかに記載のポリヌクレオチドである、請求項 9記載の製造方法。
[ 1]請求項 5の [ 1]〜 [3]の 、ずれかに記載の蛋白質をコードするポリヌクレオチド [2]配列番号 2で表される塩基配列を有するポリヌクレオチド
[3]配列番号 2で表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドと ストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、かつ γ -グルタミルシスティンシンセター ゼ活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチド
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