WO2006112025A1 - 新規なβ－ガラクトシド－α２，３－シアル酸転移酵素、それをコードする遺伝子およびその製造方法 - Google Patents
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Classifications
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12Y204/99—Glycosyltransferases (2.4) transferring other glycosyl groups (2.4.99)
- C12Y204/99004—Beta-galactoside alpha-2,3-sialyltransferase (2.4.99.4)
Definitions
- sialic acid is a sugar that is extremely important from the viewpoint of sugar chain function because it is often present at a non-reducing end. It is one of the most highly demanding glycosyltransferases that increase their properties!
- Patent Document 4 International Publication No. WO03Z027297A Pamphlet
- Position 3 of the toose residue, position 3 of galactose present in oligosaccharides such as ratatoses or ⁇ acetylyllactosamine, or complex sugars such as galactose, mannose, ⁇ -acetylyldarcosamine, ⁇ -acetylacetylgalatosamine Means a protein that has the activity of transferring to the 3rd position of a monosaccharide having a hydroxyl group at the 3rd carbon.
- “one galactoside 1 ⁇ 2,3 sialyltransferase activity” means the activity described above for one galactosid ⁇ 2,3 sialyltransferase.
- the j8-galatatoside-a 2,3-sialyltransferase of the present invention may be a protein comprising the amino acid sequence of amino acids 22-409 of SEQ ID NO: 2.
- the ⁇ -galactoside ⁇ 2,3 sialyltransferase of the present invention may be a protein encoded by a nucleic acid comprising the base sequence of bases 64-1230 of SEQ ID NO: 1.
- Expression vectors used in prokaryotic host cells generally contain one or more phenotypically selectable marker genes.
- a phenotypically selectable marker gene is, for example, a gene that confers antibiotic resistance or confers autotrophic requirements.
- Examples of expression vectors suitable for prokaryotic host cells include commercially available plasmids such as pBR322 (ATCC37017) or those derived therefrom. Since pBR322 contains genes for ampicillin and tetracycline resistance, it is easy to identify transformed cells. DNA sequence of nucleic acid encoding appropriate promoter and j8-galactoside ⁇ 2,3 sialyltransferase. This DNA is inserted into this pBR322 vector.
- Other commercially available vectors include, for example, ⁇ 223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden) and pGEMl (Promega Biotech., Madison, Wisconsin, USA).
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Abstract
本発明は、新規なβ－ガラクトシド－α２，３－シアル酸転移酵素および当該シアル酸転移酵素をコードする核酸を提供する。本発明はまた、当該シアル酸転移酵素を生産する微生物を提供すると共に、そのような微生物を用いた当該シアル酸転移酵素の製造方法を提供する。本発明はさらに、当該シアル酸転移酵素をコードする核酸を含むベクター、および当該ベクターで形質転換した宿主細胞を提供すると共に、組換えβ－ガラクトシド－α２，３－シアル酸転移酵素を製造する方法を提供する。
Description
明 細 書
新規な 0—ガラタトシドー x 2， 3_シアル酸転移酵素、それをコードする 遺伝子およびその製造方法
技術分野
[0001] 本発明は、新規な β -ガラタトシド- a 2, 3-シアル酸転移酵素、当該酵素をコード する遺伝子、当該酵素を生産する微生物および当該酵素の製造方法に関する。 背景技術
[0002] 糖転移酵素は、生体内において糖タンパク質や糖脂質等の糖鎖の生合成に関与 する酵素である。そしてその反応生成物である糖タンパク質や糖脂質等の糖鎖 (以 下、複合糖質糖鎖）は、生体内において非常に重要な機能を有している。例えば、糖 鎖は、主に哺乳類細胞において、分化や発生における細胞間および細胞 細胞外 マトリックス間のシグナル伝達や複合糖質のタグとして機能する重要な分子であること などが明らかにされている。
[0003] 上記のとおり、糖鎖は非常に重要な機能を有しているが、これを応用した具体例と して、エリスロポエチンが挙げられる。エリスロポエチンは本来糖タンパク質であるが、 糖鎖の数を増カロさせ、その寿命を向上させた組換えエリスロポエチンタンパク質が作 製され、現在市販されている。
[0004] 今後もこのように糖鎖を応用した医薬品、機能性食品等の開発が想定される。その ため、糖鎖を合成 ·生産する手段としての糖転移酵素の重要性が増大して ヽる。
[0005] これまでに約 150種類以上の糖転移酵素遺伝子がヒト、マウス、ラット及び酵母等 の真核生物力 単離されており、さらに CHO細胞や大腸菌等を宿主細胞とする生産 系で糖転移酵素活性を有するタンパク質が発現されている。一方、原核生物である 細菌からも、いくつかの糖転移酵素遺伝子が単離されており、さらに大腸菌を用いる 組換え生産系で糖転移酵素活性を有するタンパク質が発現され、それらの基質特性 や酵素化学的な諸性質が明らかにされている。
[0006] 糖鎖を構成する糖の中でも、非還元末端に存在することの多!、シアル酸は、糖鎖 機能という観点力も極めて重要な糖であり、従って、シアル酸転移酵素は、現在重要
性が増して!/ヽる糖転移酵素の中で最も需要が高!ヽ酵素の一つである。
[0007] a 2, 3—シアル酸転移酵素およびその遺伝子に関しては、動物、特に哺乳類由来 のものが多く報告されている（例えば、 Harduin- Lepers, A. et al., Biochem J., 15;352 Pt 1:37-48 (2000) ; Young- Choon Lee et al., J. Biol. Chem., 23;274(17):11958-67 (1999) ; Lee, Y- C. et al., J. Biochem., 216, 377-385 (1993) ; Chang, M-し et al., Glycobiology, 5, 319—325 (1995) ; Gillespie, W. et al" J. Biol. Chem., 267,
21004-21010 (1992)を参照)。しかし、これらの動物由来の酵素は精製が困難で大量 に得られな 、ため非常に高価であり、さらに酵素としての安定性が悪 、と 、う問題を 有している。
[0008] これに対し、微生物由来の a 2, 3—シアル酸転移酵素およびその遺伝子としては 、ナイセリア属、キャンピロパクター属、へモフイラス属およびパスッレラ属に属する微 生物から取得されたものが報告されている（例えば、 WO97Z047749、 WO 99/0 49051、 WO01/077314, WO03/027297を参照）。し力し、ビブリ才科に属す る微生物力 取得されたという報告はなぐまた、ビブリオ科に属する微生物に《2, 3 -シアル酸転移酵素活性を有するタンパク質が存在すると!/ヽぅ報告もな!/ヽ。
特許文献 1：国際公開第 WO97Z047749A号パンフレット
特許文献 2：国際公開第 WO99Z049051A号パンフレット
特許文献 3：国際公開第 WO01Z077314A号パンフレット
特許文献 4 :国際公開第 WO03Z027297A号パンフレット
非特許文献 1 : Harduin- Lepers, A. et al., Biochem. J., 15;352 Pt 1:37-48 (2000) 非特許文献 2 : Young- Choon Lee et al., J. Biol. Chem., 23;274(17):11958-67 (1999) 非特許文献 3 : Lee, Y- C. et al" J. Biochem., 216, 377-385 (1993)
非特許文献 4 : Chang, M-し et al., Glycobiology, 5, 319-325 (1995)
非特許文献 5 : Gillespie, W. et al" J. Biol. Chem., 267, 21004-21010 (1992) 発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0009] 本発明の課題は、ビブリオ科の微生物に由来する新規な β -ガラタトシド- a 2, 3- シアル酸転移酵素、およびそれをコードする遺伝子を提供することである。また、本
発明の課題は、本発明の j8—ガラクトシドーひ 2, 3—シアル酸転移酵素をコードす る遺伝子を利用して遺伝子組換え技術により本酵素を高生産する方法を提供するこ とである。
課題を解決するための手段
[0010] 本発明者らは鋭意研究に努めた結果、ビブリオ科に属する微生物がシアル酸を糖 鎖中のガラクトース残基もしくは N ァセチルガラタトサミン残基に a 2, 3結合で転移 させる新規な酵素を生産することを見出し、本発明を完成させた。本発明は、新規な β ガラクトシドー α 2, 3 シアル酸転移酵素およびそれをコードする核酸、ならび に、当該シアル酸転移酵素を製造する方法を提供する。
[0011] 以下、本発明を詳細に説明する。
[0012] β ガラクトシドー 2. 3 シアル酸転移酵素
本発明は、新規な β—ガラタトシド— oc 2, 3 シアル酸転移酵素を提供する。本明 細書において、「 —ガラクトシド 《2, 3 シアル酸転移酵素」とは、シチジン 1リン 酸 (CMP)—シアル酸力ゝらシアル酸を、複合糖質糖鎖もしくは遊離の糖鎖中のガラク トース残基の 3位、ラタトースもしくは Ν ァセチルラクトサミンなどのオリゴ糖に存在す るガラクトースの 3位、またはガラクトース、マンノース、 Ν—ァセチルダルコサミン、 Ν —ァセチルガラタトサミンなどの複合糖質を構成しうる単糖であって 3位の炭素に水 酸基を有する単糖の 3位、に転移させる活性を有するタンパク質を意味する。本明細 書において、「 一ガラクトシド一 《 2, 3 シアル酸転移酵素活性」とは、 一ガラク トシドー《2, 3 シアル酸転移酵素について上述した活性を意味する。また、ここで いうシアル酸とは、シアル酸ファミリーに属するノィラミン酸誘導体を示す。具体的に は、 Ν ァセチルノイラミン酸（Neu5Ac)、 Ν—グリコリルノィラミン酸（Neu5Gc)、 5 デァミノ 5—ヒドロキシノイラミン酸 (KDN)、ジシアル酸などを示す。
[0013] 本発明の β ガラクトシドー α 2, 3 シアル酸転移酵素は、配列番号 2のアミノ酸 配列を含んでなるタンパク質である。また、本発明の j8—ガラタトシド— a 2, 3—シァ ル酸転移酵素は、配列番号 1の塩基配列を含んでなる核酸によってコードされるタン ノ ク質である。
[0014] 本発明の配列番号 2のアミノ酸配列を含んでなる、 13 ガラクトシドー α 2, 3 シァ
ル酸転移酵素において、配列番号 2のアミノ酸 1— 21はシグナル配列である。したが つて、本発明の j8—ガラタトシドー a 2, 3—シアル酸転移酵素は、配列番号 2のアミ ノ酸 22— 409のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質であってもよい。また、本発明の β ガラクトシドー α 2, 3 シアル酸転移酵素は、配列番号 1の塩基 64— 1230の 塩基配列を含んでなる核酸によってコードされるタンパク質であってもよい。
[0015] 本発明はまた、上記の本発明の β ガラクトシドー a 2, 3 シアル酸転移酵素の 変異体であって、 ガラクトシドー α 2, 3—シアル酸転移酵素活性を有する変異 タンパク質をも包含する。このような変異タンパク質もまた、本発明の β—ガラタトシド - α 2, 3 シアル酸転移酵素に含まれる。
[0016] 本発明の変異体タンパク質は、配列番号 2もしくは配列番号 2のアミノ酸 22— 409、 のアミノ酸配列において、 1または複数のアミノ酸の欠失、置換、挿入および/または 付加を含むアミノ酸配列を含んでなるタンパク質であって、 j8—ガラクトシドー α 2, 3 —シアル酸転移酵素活性を有するタンパク質であってもよい。置換は、保存的置換 であってもよぐこれは、特定のアミノ酸残基を類似の物理化学的特徴を有する残基 で置き換えることである。保存的置換の非限定的な例には、 Ile、 Val、 Leuまたは Ala 相互の置換のような脂肪族基含有アミノ酸残基の間の置換、 Lysおよび Arg、 Gluお よび Asp、 Ginおよび Asn相互の置換のような極性残基の間での置換などが含まれ る。
[0017] アミノ酸の欠失、置換、挿入および Zまたは付カ卩による変異体は、野生型タンパク 質をコードする DNAに、例えば周知技術である部位特異的変異誘発 (例えば、 Nucleic Acid Research, Vol.10, No. 20, p.6487- 6500, 1982参照、引用によりその全 体を本明細書に援用する）を施すことにより作成することができる。本明細書におい て、「1または複数のアミノ酸」とは、部位特異的変異誘発法により欠失、置換、挿入 および Zまたは付加できる程度のアミノ酸を意味する。
[0018] 部位特異的変異誘発法は、例えば、所望の変異である特定の不一致の他は、変異 を受けるべき一本鎖ファージ DNAに相補的な合成オリゴヌクレオチドプライマーを用 いて次のように行うことができる。即ち、プライマーとして上記合成オリゴヌクレオチド を用いてファージに相補的な鎖を合成させ、得られた二重鎖 DNAで宿主細胞を形
質転換する。形質転換された細菌の培養物を寒天にプレーティングし、ファージを含 有する単一細胞力もプラークを形成させる。そうすると、理論的には 50%の新コ口- 一が一本鎖として変異を有するファージを含有し、残りの 50%が元の配列を有する。 上記所望の変異を有する DNAと完全に一致するものとはハイブリダィズする力 元 の鎖を有するものとはハイブリダィズしな 、温度にぉ 、て、得られたプラークをキナー ゼ処理により標識した合成プローブとハイブリダィズさせる。次に該プローブとハイブ リダィズするプラークを拾 ヽ、培養して DNAを回収する。
[0019] なお、酵素などの生物活性ペプチドのアミノ酸配列にその活性を保持しつつ 1また は複数のアミノ酸の欠失、置換、挿入および Zまたは付加を施す方法としては、上記 の部位特異的変異誘発の他にも、遺伝子を変異源で処理する方法、および遺伝子 を選択的に開裂し、次に選択されたヌクレオチドを除去、置換、挿入または付加し、 次 ヽで連結する方法もある。
[0020] 本発明の変異体タンパク質はまた、配列番号 1もしくは配列番号 1の塩基 64— 123 0の塩基配列の相補鎖にストリンジヱントな条件または高度にストリンジヱントな条件 下でノ、イブリダィズする塩基配列を含む核酸によってコードされるタンパク質であって 、 j8—ガラクトシドー α 2, 3—シアル酸転移酵素活性を有するタンパク質であっても よい。
ここで、ストリンジェントなハイブリダィゼーシヨンの条件としては、 0. 5Μ リン酸ナトリ ゥム ρΗ7. 2、 ImM EDTA、 7%SDS、 1%BSA中で 55°Cでハイブリダィゼーシ ヨンさせた後、 40mM リン酸ナトリウムバッファー ρΗ7. 2、 ImM EDTA、 5%SD S、 0. 5%BSA中で 55。C、 15分を 2回、 40mM リン酸ナトリウムノ ッファー pH7. 2、 ImM EDTA、 1%SDS中で 55°C、 15分を 2回、洗浄操作を行うという条件、あ るいは Molecular Cloning: A Laboratory Manual,第 2版、第 1卷、 1.101- 104頁、 Cold
Spring Harbor Laboratory Press (1989) (引用によりその全体を本明細書に援用する )等に記載されているように、 30% 脱イオン化ホルムアミド、 0. 6M NaCl、 40mM リン酸ナトリウム ρΗ7. 4、 2. 5mM EDTA、 1%SDS中で 42°Cで、ハイブリダィ ゼーシヨンさせた後、 2XSSC、 0. 1%SDS、中で室温で 10分を 2回、さらに同じバッ ファー中で 55°Cで 1時間洗浄操作を行うという条件が挙げられるが、これらに限定さ
れるものではない。また、高度にストリンジェントな条件におけるハイブリダィゼーショ ンとして、例えば、 Molecular Cloning (同上）等に記載されている、 0. 5M リン酸ナト リウム pH7. 2、 ImM EDTA、 7%SDS、 1%BSA中で 65°Cでハイブリダィゼー シヨンさせた後、 40mM リン酸ナトリウムバッファー pH7. 2、 ImM EDTA、 5%S DS、 0. 5%BSA中で 65。C、 40mM リン酸ナトリウムノ ッファー pH7. 2、 ImM EDTA、 1%SDS中で 65°C、洗浄操作を行うという条件が挙げられる。
[0021] 本発明の変異体タンパク質はさらに、配列番号 2もしくは配列番号 2のアミノ酸 22— 409のアミノ酸配列と少なくとも 80%以上、好ましくは 85%以上、 90%以上、 95%以 上、 98%以上または 99%以上、より好ましくは 99. 5%以上のアミノ酸相同性を有す るアミノ酸配列を含んでなるタンパク質であって、 j8—ガラクトシドー α 2, 3—シアル 酸転移酵素活性を有するタンパク質であってもよい。ここで、アミノ酸配列の相同性 %は、視覚的検査および数学的計算によって決定可能である。例えば、 2つのアミノ 酸配列の相同性％は、遺伝情報処理ソフトウェア GENETYX Ver. 7 (ゼネティック ス製）などのプログラム、または、 FASTAアルゴリズムや BLASTアルゴリズムなどを 用いて、配列情報を比較することによって決定することができる。
[0022] シアル酸転移酵素活性は、公知の手法、例えば、 J. Biochem., 120, 104-110
(1996) (引用によりその全体を本明細書に援用する）に記載されている方法で測定し てもよい。例えば、糖供与体基質として CMP— NeuAc (N—ァセチルノイラミン酸）を 、そして糖受容体基質としてラタトースを用いて酵素反応を行い、反応生成物である シァリルラタトースの量を評価することで酵素活性を評価することができる。
[0023] 糖受容体基質に転移したシアル酸の結合様式の決定方法としては、限定するわけ ではないが、ピリジルァミノ化糖鎖を用いる手法、反応生成物の核磁気共鳴分光法（ NMR)による分析など、当業者に公知の手法のいずれかを用いて行うことができる。 ピリジルァミノ化糖鎖を用いる手法は、ピリジルァミノ化糖鎖を糖受容体基質として酵 素反応を行うことを含む。具体的には、ピリジルァミノ化ラタトース (Gal |8 1— 4Glc— PA、タカラバィォ製)を糖受容体基質、 CMP— NeuAcを糖供与体基質として用い て酵素反応を行 ヽ、反応生成物を高速液体クロマトグラフィー (HPLC)分析にかけ、 反応生成物の保持時間からシアル酸が転移された位置を特定する。
[0024] 本発明の一態様において本発明の酵素は、ビブリオ科に属する微生物由来、好ま しくはフォトパクテリゥム属に属する微生物由来、さらに好ましくは、フォトバクテリウム' フォスフォレゥム種に属する微生物由来の酵素である。
[0025] 本発明の β ガラクトシドー a 2, 3 シアル酸転移酵素の酵素学的性質および理 化学的性質は、上記に定義した |8—ガラクトシドー《2, 3 シアル酸転移酵素活性 を有することを特徴とするほ力、限定するわけではないが、至適 ρΗが ρΗ5〜7の範 囲であり、至適温度が 20〜35°Cであり、分子量が SDS— PAGE分析で 42, 000士 3, OOODa程度である。
[0026] 特に、本発明の配列番号 2のアミノ酸配列を含む β ガラクトシドー α 2, 3 シァ ル酸転移酵素、すなわち、フォトバタテリゥム 'フォスフォレゥム JT—ISH— 467株（寄 託番号 ΝΙΤΕ ΑΒΡ - 88)由来の酵素は、上述の作用および基質特異性、 20-35 °Cの至適温度、 pH5. 0〜7. 0の至適 pH、約 39, OOODaの分子量（SDS— PAGE 電気泳動法による）、という酵素学的性質および理ィ匕学的性質を有する。
[0027] R ガラクトシ a 2. 3 シアル酸転移酵素 コードする核酸
本発明は、 |8—ガラクトシドーひ 2, 3—シアル酸転移酵素をコードする核酸を提供 する。
[0028] 本発明の核酸は、配列番号 2または配列番号 2のアミノ酸 22— 409のアミノ酸配列 を含んでなるタンパク質をコードする核酸である。本発明の核酸はまた、配列番号 1も しくは配列番号 1の塩基 64— 1230の塩基配列を含んでなる核酸である。
[0029] 本発明の核酸は、上記の核酸の変異体であって、 β ガラクトシドー α 2, 3 シァ ル酸転移酵素活性を有するタンパク質をコードする核酸であってもよ 、。そのような 核酸もまた、本発明の β ガラクトシドー oc 2, 3 シアル酸転移酵素をコードする核 酸に含まれる。
[0030] そのような核酸の変異体は、配列番号 2もしくは配列番号 2のアミノ酸 22— 409のァ ミノ酸配列において、 1または複数のアミノ酸の欠失、置換、挿入および Ζまたは付 加を含むアミノ酸配列を含んでなるタンパク質であって、 j8—ガラクトシドー α 2, 3— シアル酸転移酵素活性を有するタンパク質、をコードする核酸である。
[0031] そのような核酸の変異体はまた、配列番号 1もしくは配列番号 1の塩基 64— 1230
の塩基配列の相補鎖にストリンジヱントな条件、または高度にストリンジヱントな条件 下でハイブリダィズする塩基配列を含む核酸であって、該核酸は j8—ガラクトシドー a 2, 3—シアル酸転移酵素活性を有するタンパク質をコードする、前記核酸である。 ここで、ストリンジヱントな条件または高度にストリンジヱントな条件とは、上記で定義し たとおりである。
[0032] そのような核酸の変異体はさらに、配列番号 2もしくは配列番号 2のアミノ酸 22— 40 9のアミノ酸配列と少なくとも 80%以上、好ましくは 85%以上、 90%以上、 95%以上 、 98%以上または 99%以上、より好ましくは 99. 5%以上の相同性を有するアミノ酸 配列を含んでなるタンパク質であって、 j8—ガラクトシド α 2, 3 シアル酸転移酵 素活性を有するタンパク質、をコードする核酸である。ここで、アミノ酸配列または核 酸塩基配列の相同性は、上記に示した方法で決定することができる。
[0033] β ガラクトシ 2. 3 シアル酸転移酵素 発現する微牛物
本発明者らは、ビブリオ科に属する微生物が新規な )8—ガラクトシドー《2, 3—シ アル酸転移酵素を発現することを見いだした。よって本発明は、 β—ガラタトシドー (X 2, 3 シアル酸転移酵素を発現する微生物を提供する。本発明の微生物は、ビブリ ォ科に属し、 ガラクトシドー《2, 3 シアル酸転移酵素生産能を有する微生物 であり、好ましくはフォトバタテリゥム属（Photobacterium sp.)に属するもの、さらに好ま しくは、フォトバタテリゥム 'フォスフォレゥム（Photobacterium phosphoreum)に属する ものである。 j8—ガラクトシドー α 2, 3 シアル酸転移酵素生産能を有するフォトバタ テリゥム 'フォスフォレゥムの例としては、 JT— ISH— 467株（寄託番号 ΝΙΤΕ ΑΒΡ — 88)、が挙げられる。なお、上記のフォトバタテリゥム.フォスフォレゥムは海洋性細 菌であり、海水中または海産の魚介類力も分離される。たとえば、本発明のフォトパク テリゥム ·フォスフォレゥム JT—ISH— 467株は石川県産のイカから分離されたもので ある。
[0034] 本発明の微生物は、例えば以下に説明するようなスクリーニング法を用いて分離す ることができる。海水、海砂、海泥あるいは海産魚介類を微生物源とする。海水、海 砂、海泥はそのままもしくは滅菌海水で希釈し、接種源とする。海産魚介類は表面の 粘液等をループで擦り採って接種源としたり、内臓器を滅菌海水中で磨砕した液を
接種源とする。これらをマリンブロスァガー 2216培地（ベタトン'ディッキンソン製）や 塩ィ匕ナトリウム添加-ユートリエントァガー培地 (ベタトン'ディッキンソン製)などの平 板培地上に塗布し、様々な温度条件下で生育する海洋性微生物を取得する。常法 に従い、得られた微生物を純粋培養した後、マリンブロス 2216培地 (ベタトン'ディッ キンソン製)や塩ィ匕ナトリウム添加-ユートリエントブロス培地（ベタトン'ディッキンソン 製)などの液体培地を用い、それぞれの微生物を培養する。微生物が十分生育した 後に、培養液力も菌体を遠心分離によって集める。集めた菌体に界面活性剤である 0. 2%トリトン X— 100 (関東化学製）を含む 20mMカコジレート緩衝液 (pH6. 0)を 添加し、菌体を懸濁する。この菌体懸濁液を氷冷下、超音波処理し細胞を破砕する 。この細胞破砕液を酵素溶液として、常法にしたがってシアル酸転移活性を測定し、 シアル酸転移活性を有する菌株を得ることができる。
[0035] 本発明のフォトバタテリゥム 'フォスフォレゥム JT—ISH— 467も上記のスクリーニン グ法を用いることで得られた。得られたフォトバタテリゥム'フォスフォレゥム JT—ISH 467株の菌学的性質および生理学生化学的性質、ならびに 16S rRNA遺伝子 の塩基配列解析による種の同定にっ 、ては、実施例 1に詳述する。
[0036] フォトバタテリゥムフォスフォレゥム（Photobacterium phosphoreum)JT— ISH— 467 株は 2005年 3月 14日付で、独立行政法人 製品評価技術基盤機構特許微生物寄 託センター (NPMD : National Institute of Technology and Evaluation, Patent Microorganisms Depositary)に NITE ABP— 88として寄託されている。
[0037] β ガラクトシド ' α 2. 3—シアル酸転移酵素を 1¾告する方法
( 1) β ガラクトシド ' α 2. 3 シアル酸転移酵素を発頊,する微牛.物を焙着するこ Wこよる当該酵素の 1¾告方法
本発明の一態様において、本発明の j8—ガラクトシドーひ 2, 3 シアル酸転移酵 素はビブリオ科に属する微生物由来であり、 j8—ガラクトシドー《2, 3—シアル酸転 移酵素生産能を有する微生物を培地に培養し、 |8—ガラクトシドー《2, 3—シアル 酸転移酵素を生産させ、これを採取することよって得られる。
[0038] ここで用いる微生物としては、ビブリオ科に属し、 β—ガラタトシド一 a 2, 3 シアル 酸転移酵素生産能を有する微生物であれば、いずれの菌株でも用いることができる
。ビブリオ科の微生物の中でもフォトバタテリゥム属に属するものが好ましぐそしてフ オトバタテリゥム 'フォスフォレゥムに属するものがさらに好ましい。本発明の方法にお いて用いる微生物の例としては、フォトバタテリゥム 'フォスフォレゥム JT—ISH— 467 株（寄託番号 NITE ABP— 88)が挙げられる。
[0039] 上記微生物の培養に用いる培地としては、それらの微生物が利用し得る炭素源、 窒素源、無機物等を含むものを用いる。炭素源としては、ペプトン、トリプトン、カゼィ ン分解物、肉エキス、ブドウ糖等が挙げられ、好ましくはペプトンを用いる。窒素源と しては、酵母エキスを用いるのが好ましい。塩類としては、塩ィ匕ナトリウム、クェン酸鉄 、塩化マグネシウム、硫酸ナトリウム、塩ィ匕カルシウム、塩ィ匕カリウム、炭酸ナトリウム、 重炭酸ナトリウム、臭化カリウム、塩化ストロンチウム、ほう酸ナトリウム、ケィ酸ナトリウ ム、フッ化ナトリウム、硝酸アンモ-ゥム、リン酸水素ニナトリウム等を適宜組み合わせ て用いるのが好ましい。
[0040] また、上記成分を含んだマリンブロス 2216培地 (ベタトン'ディッキンソン製)を用い てもよい。さらには、上記塩類を適度に含む人工海水を用い、これにペプトン、酵母 エキス等を添加した培地を用いてもょ ヽ。培養条件は培地の組成によって多少異な る力 培養温度は 10〜28°C、好ましくは 20〜25°C、培養時間は 8〜48時間、好ま しくは 16〜24時間である。
[0041] 目的とする酵素は菌体内に存在するため、公知の菌体破砕法、例えば超音波破砕 法、フレンチプレス破砕法、ガラスビーズ破砕法、ダイノミル破砕法などのいずれかの 方法を行えばよぐその菌体破砕物から目的とする酵素を分離精製する。本発明の 方法における好ましい菌体破砕法は超音波破砕法である。例えば、菌体破砕物から 遠心分離により固形物を除去した後に、得られた菌体破砕液上清を市販の陰イオン 交換カラム、陽イオン交換カラム、ゲル濾過カラム、ハイドロキシアパタイトカラム、 CD P へキサノールアミンァガロースカラム、 CMP へキサノールアミンァガロースカラ ム、疎水性カラム等のカラムクロマトグラフィー及びネイティブ一 PAGE等を適宜組み 合わせて電気泳動的に単一バンドになるまで精製することができる。
[0042] なお、 /3—ガラタトシドー a 2, 3 シアル酸転移酵素は完全に精製してもよいが、 部分精製品でも十分な活性を有するため、本発明の β ガラクトシドー 2, 3 シァ
ル酸転移酵素は精製品であってもよぐまたは部分精製品であってもよい。
[0043] (2)組椽ぇ β ガラクトシドー a 2. 3 シアル酸転移酵素を製诰する方法
本発明は、 j8—ガラクトシドーひ 2, 3—シアル酸転移酵素をコードする核酸を含む 発現ベクター、および当該発現ベクターを含有する宿主細胞を提供する。そして、本 発明は、当該発現ベクターを含有する宿主細胞を、組換えタンパク質の発現に適す る条件下で培養して、発現された組換えタンパク質を回収することにより組換え |8— ガラクトシドー《2, 3 シアル酸転移酵素タンパク質を製造する方法も提供する。
[0044] 本発明の組換え β—ガラタトシドー a 2, 3 シアル酸転移酵素タンパク質を製造 するためには、使用する宿主に応じて選ばれた発現ベクターに、哺乳動物、微生物 、ウィルス、または昆虫遺伝子等力 誘導された、適当な転写または翻訳調節ヌクレ ォチド配列に機能可能に連結した j8—ガラクトシドー α 2, 3 シアル酸転移酵素を コードする核酸配列を挿入する。調節配列の例として、転写プロモーター、オペレー ター、又はェンハンサー、 mRNAリボソーム結合部位、ならびに、転写及び翻訳の開 始及び終結を制御する適切な配列が挙げられる。
[0045] 本発明のベクターに挿入される β—ガラタトシドー a 2, 3 シアル酸転移酵素をコ ードする核酸配列は、配列番号 1の塩基 1 63に相当するリーダー配列を含んでい ても、含んでいなくてもよぐまた、他の生物源由来のリーダー配列に置き換えてもよ い。リーダー配列を置き換えることによって、発現したタンパク質を宿主細胞の外に分 泌させるように発現システムを設計することも可能である。
[0046] また、本発明の組換え /3 ガラクトシドー a 2, 3 シアル酸転移酵素タンパク質は 、当該酵素をコードする核酸に続いて、 Hisタグ、 FLAG™タグ、ダルタチオン— S— トランスフェラーゼなどをコードする核酸を連結した核酸をベクターに挿入することに より、融合タンパク質として発現することも可能である。本発明の酵素をこのような融合 タンパク質として発現させることにより、当該酵素の精製および検出を容易にすること ができる。
[0047] β ガラクトシドー a 2, 3 シアル酸転移酵素タンパク質の発現に適する宿主細 胞には、原核細胞、酵母または高等真核細胞が含まれる。細菌、真菌、酵母、および 哺乳動物細胞宿主で用いる適切なクローユングおよび発現ベクターは、例えば、
Pouwelsら、 Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, (1985) (引 用によりその全体を本明細書に援用する）に記載されている。
[0048] 原核生物には、グラム陰性またはグラム陽性菌、例えば、大腸菌または枯草菌が含 まれる。大腸菌のような原核細胞を宿主として使用する場合、 β ガラクトシドー《2 , 3—シアル酸転移酵素タンパク質は、原核細胞内での組換えポリペプチドの発現を 容易にするために Ν末端メチォニン残基を含むようにしてもよ 、。この Ν末端メチォ二 ンは、発現後に組換え j8—ガラクトシドー α 2, 3 シアル酸転移酵素タンパク質から 切り離すことちでさる。
[0049] 原核宿主細胞内で用いる発現ベクターは、一般に 1または 2以上の表現型選択可 能マーカー遺伝子を含む。表現型選択可能マーカー遺伝子は、例えば、抗生物質 耐性を付与するか、または独立栄養要求性を付与する遺伝子である。原核宿主細胞 に適する発現ベクターの例には、 pBR322 (ATCC37017)のような巿販のプラスミド またはそれらカゝら誘導されるものが含まれる。 pBR322は、アンピシリンおよびテトラ サイクリン耐性のための遺伝子を含有するので、形質転換細胞を同定するのが容易 である。適切なプロモーターならびに j8—ガラクトシドー α 2, 3 シアル酸転移酵素 をコードする核酸の DNA配列力 この pBR322ベクター内に挿入される。他の巿販 のベクターには、例えば、 ρΚΚ223 - 3 (Pharmacia Fine Chemicals,スウェーデン、ゥ プサラ）および pGEMl (Promega Biotech.、米国、ウィスコンシン州、マディソン）など が含まれる。
[0050] 原核宿主細胞用の発現ベクターにおいて通常用いられるプロモーター配列には、 t acプロモーター、 βーラクタマーゼ（ベ-シリナーゼ）プロモーター、ラタトースプロモ 一ター（Changら、 Nature 275:615, 1978;及び Goeddelら、 Nature 281 :544, 1979、引 用によりその全体を本明細書に援用する。 )などが含まれる。
[0051] また、組換え /3 ガラクトシドー a 2, 3 シアル酸転移酵素タンパク質を酵母宿主 内で発現させてもよい。好ましくは、サッカロミセス属（Saccharomyces、例えば、 S.cerevisiae )を用いるが、ピキア属（Pichia)またはクルイべ口ミセス属（
Kluyveromyces)のような他の酵母の属を用いてもよい。酵母ベクターは、 2 酵母プ ラスミドからの複製起点の配列、自立複製配列 (ARS)、プロモーター領域、ポリアデ
二ルイヒのための配列、転写終結のための配列、および選択可能なマーカー遺伝子 を含有することが多い。酵母 α因子リーダー配列を用いて、糸且換え j8—ガラクトシド - α 2, 3 シアル酸転移酵素タンパク質の分泌を行わせることもできる。酵母宿主か らの組換えポリペプチドの分泌を促進するのに適する他のリーダー配列も知られて 、 る。酵母を形質転換する方法は、例えば、 Hinnenら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75: 1929-1933, 1978 (引用によりその全体を本明細書に援用する）に記載されている。
[0052] 哺乳動物または昆虫宿主細胞培養系を用いて、組換え β ガラクトシドー α 2, 3— シアル酸転移酵素タンパク質を発現することもできる。哺乳動物起源の株化細胞系も 用いることができる。哺乳動物宿主細胞発現ベクターのための転写および翻訳制御 配列は、ウィルスゲノム力も得ることができる。通常用いられるプロモーター配列およ びェンハンサー配列は、ポリオ一マウィルス、アデノウイルス 2など力も誘導される。 S V40ウィルスゲノム、例えば、 SV40起点、初期および後期プロモーター、ェンハンサ 一、スプライス部位、およびポリアデニルイ匕部位力 誘導される DNA配列を用いて、 哺乳動物宿主細胞内での構造遺伝子配列の発現のための他の遺伝子要素を与え てもよい。哺乳動物宿主細胞内で用いるためのベクターは、例えば、 Okayamaおよび Berg (Mol. Cell. Biol, 3: 280, 1983、引用によりその全体を本明細書に援用する。 ) の方法で構築することができる。
[0053] 本発明の /3 ガラクトシドー a 2, 3 シアル酸転移酵素タンパク質を産生する 1つ の方法は、 j8—ガラクトシドー α 2, 3—シアル酸転移酵素タンパク質をコードする核 酸配列を含む発現ベクターで形質転換した宿主細胞を、当該タンパク質が発現する 条件下で培養することを含む。次いで、用いた発現系に応じて )8—ガラクトシドー ex 2, 3 シアル酸転移酵素タンパク質を培養培地または細胞抽出液から回収する。
[0054] 組換え β ガラクトシドー oc 2, 3 シアル酸転移酵素タンパク質を精製する操作は 、用いた宿主の型および本発明のタンパク質を培養培地中に分泌させるかどうかと ヽ つた要因に従って適宜選択される。例えば、糸且換え j8—ガラクトシドー α 2, 3 シァ ル酸転移酵素タンパク質を精製する操作には、陰イオン交換カラム、陽イオン交換力 ラム、ゲル濾過カラム、ハイドロキシアパタイトカラム、 CDP へキサノールアミンァガ ロースカラム、 CMP へキサノールアミンァガロースカラム、疎水性カラム等のカラム
クロマトグラフィー及びネイティブ PAGE等、またはそれらの組み合わせが含まれる 。また、組換え |8—ガラクトシドー《2, 3 シアル酸転移酵素に精製を容易にするタ グなどを融合させて発現させた場合には、ァフィユティークロマトグラフィーによる精 製方法を利用してもよい。例えば、ヒスチジンタグ、 FLAG™タグ、またはダルタチォ ン— S トランスフェラーゼ (GST)などを融合させた場合には、それぞれ、 Ni-NT A (二トリ口トリ酢酸)カラム、抗 FLAG抗体を連結したカラム、またはダルタチオンを連 結したカラム、などを用いてァフィユティークロマトグラフィーにより精製することができ る。
[0055] 組換え /3 ガラクトシドー a 2, 3 シアル酸転移酵素は電気泳動的に単一バンド になるまで精製してもよいが、部分精製品でも十分な活性を有するため、本発明の β ガラクトシドー 2, 3 シアル酸転移酵素は精製品であってもよぐまたは部分精製 品であってもよい。
[0056] 碰
本発明は、本発明の β—ガラタトシド— (X 2, 3 シアル酸転移酵素タンパク質に対 する抗体を提供する。本発明の抗体は、本発明の β ガラクトシドー (X 2, 3 シアル 酸転移酵素タンパク質、またはそのフラグメント、に対して作製してもよい。ここで、本 発明の j8—ガラクトシドー α 2, 3 シアル酸転移酵素のフラグメントは、当該酵素の ミノ酸酉己歹 IJ中、少なくとち 6 ミノ酸、少なくとち 10 ミノ酸、少なくとち 20 ミノ酸、ま たは少なくとも 30アミノ酸を含む配列を有するフラグメントである。
[0057] 抗体は、本発明の j8—ガラクトシドー a 2, 3 シアル酸転移酵素またはそのフラグ メントを、当該技術分野において抗体作製のために用いられる動物、例えば、限定さ れるわけではないが、マウス、ラット、ゥサギ、モルモット、ャギなどに免疫して作製し てもよい。抗体はポリクローナル抗体であっても、またはモノクローナル抗体であって もよい。抗体は、当業者に周知の抗体作製方法に基づいて作製することができる。
[0058] 本発明の抗体は、本発明の β—ガラタトシドー a 2, 3 シアル酸転移酵素タンパク 質をァフィユティー精製により回収するのに用いることができる。本発明の抗体は、本 発明の j8—ガラタトシド— a 2, 3 シアル酸転移酵素タンパク質を、ウェスタンブロッ ティングや ELISAなどのアツセィにおいて検出するのに用いることもできる。
発明の効果
[0059] 本発明は、新規な β ガラクトシドー a 2, 3 シアル酸転移酵素およびそれをコー ドする核酸を提供することにより、生体内において重要な機能を有することが明らか にされてきて!/ヽる糖鎖の合成 ·生産手段を提供すると ヽぅ観点にお ヽて貢献する。特 に、シアル酸は、生体内の複合糖質糖鎖において非還元末端に存在することが多く 、糖鎖機能という観点から極めて重要な糖であるため、シアル酸転移酵素は糖転移 酵素の中でも最も需要が高い酵素の一つであり、本発明の新規なシアル酸転移酵 素の提供は、そのような高い需要に応えるものである。
図面の簡単な説明
[0060] [図 1-1]図 1—1は、組換え |8—ガラクトシドー《2, 3 シアル酸転移酵素の酵素活 性の確認実験における、標品（失活させた粗酵素液、ピリジルァミノ化ラタトースおよ びピリジルアミノィ匕ひ 2, 3 シァリルラタトースの混合物）の HPLC分析結果を示す 図である。
[図 1-2]図 1—2は、組換え |8—ガラクトシドー《2, 3—シアル酸転移酵素の酵素活 性の確認実験の HPLC分析結果を示す図である。
[図 1-3]図 1—3は、組換え |8—ガラクトシドー《2, 3 シアル酸転移酵素の酵素活 性の確認実験における、対照実験 (糖供与体である CMP シアル酸を含まな 、反 応液を使用した反応）の HPLC分析結果を示す図である。
[図 2]図 2は、フォトバクテリウム'フォスフォレゥム JT— ISH— 467株由来 α 2, 3 シ アル酸転移酵素（配列番号 2)、フォトバタテリゥム 'ダムセラの a 2, 6 シアル酸転移 酵素（JC5898)、へモフィルス'デュクレイ（Haemophilus ducreyi) 35000HP株の仮 定上のタンパク質 HD0053 (AAP95068)ならびにパスッレラ.ムルトシダ亜種ム ルトシダ Pm70株の仮定上のタンパク質 PM0188 (AAK02272)とのアラインメント を示す図である。 JT-ISH 467由来 α 2, 3 シアル酸転移酵素につ 、ての下線 は精製タンパクカゝら決定されたアミノ酸配列を示す。 以下、実施例により本発明をさ らに具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの実施例に限定されるもの ではない。
実施例
[0061] 実施例 1 : β -ガラクトシド α 2. 3 シアル酸転移酵素を発現する微生物のスク リーユングと菌株の同定
海水、海砂、海泥あるいは海産魚介類を接種源とした。この接種源をマリンブロスァ ガー 2216培地（ベタトン'ディッキンソン製)からなる平板培地上に塗布し、 15°C、 25 °Cもしくは 30°Cで生育する微生物を取得した。常法に従い、得られた微生物を純粋 培養した後、マリンブロス 2216培地 (ベタトン'ディッキンソン製)からなる液体培地を 用いてそれぞれの微生物を培養した。微生物が十分成育した後に、培養液から菌体 を遠心分離によって集めた。集めた菌体に、 0. 2%トリトン X— 100 (関東ィ匕学製)を 含む 20mMカコジレート緩衝液 (pH6. 0)を添カ卩し、菌体を懸濁した。この菌体懸濁 液を氷冷下、超音波処理し細胞を破砕した。この細胞破砕液を酵素溶液としてシァ ル酸転移活性を測定し、シアル酸転移活性を有する菌¾[丁— ISH— 467株を得た 。なお、本菌株は、スルメイ力の表皮から得られた。
[0062] シアル酸転移活性は、 J. Biochem., 120, 104-110 (1996) (引用によりその全体を本 明細書に援用する）に記載されている方法で測定した。具体的には、糖供与体基質 CMP— NeuAc (70nmol、 14Cで NeuAcをラベルした CMP— NeuAc 25000cpm を含む、 356cpmZnmol。 NeuAcは N ァセチルノイラミン酸を表す）、糖受容体 基質としてラタトース（1. 25 iu mol)、NaClを0. 5M濃度になるように添カ卩し、及び上 記に記した方法で調製した酵素を含む反応溶液 (30 μ 1)を用いて酵素反応を行つ た。酵素反応は 25°Cで 10分間から 30分間行った。反応終了後、反応溶液に 1. 97 mlの 5mMリン酸緩衝液（pH6. 8)を加え、この溶液を Dowexl X 8 (PO 3-フォーム
4
、 0. 2 X 2cm、 BIO— RAD製）カラムに供した。このカラムの溶出液（0〜2ml)に含 まれる反応生成物、すなわち、シァリルラタトースに含まれる放射活性を測定すること で、酵素活性を算出した。
[0063] 得られ^ JT ISH— 467株の性質は以下の通りであった：
(菌学的件皙）
(1)細胞の形態は桿菌で、大きさは 0. 7〜0. 8 /z m X l. 5〜2. 0 m。
[0064] (2)運動性
(3)グラム染色性
(4)胞子の有無
(生理学生化学的性質）
(1)生育温度 4°Cでは +、 25°Cでは +、 30°Cでは
(2)集落の色調 特徴的集落色素を産生せず
(3) OZFテスト +Z—
(4)カタラーゼテスト
(5)ォキシダーゼテスト +
(6)グルコースからの酸産生
(7)グノレコースからのガス産生
(8)発光性 +
(9)硝酸塩還元 +
(10)インドール産生 +
(11)ブドウ糖酸性ィ匕
( 12)アルギニンジヒドロラーゼ +
(13)ゥレアーゼ
(14)エスクリン加水分解
(15)ゼラチン加水分解性
(16) β -ガラタトシダーゼ +
(17)ブドウ糖資化性
( 18) L ァラビノース資化性
(19) D マンノース資化性
(20) D マンニトール資化性
(21) Ν ァセチルー D—ダルコサミン資化性
(22)マルトース資化性
(23)ダルコン酸カリウム資化性
(24) η—力プリン酸資化性
(25)アジピン酸資化性
(26) dl リンゴ酸資化性
(27)クェン酸ナトリウム資化性 ―
(28)酢酸フエ二ル資化性
(29)チトクロームォキシダーゼ +
(30)菌体内 DNA の GC含量（モル％) 39. 7%
(16S rRNA遣伝子の塩某配列解析および DNA— DNAノ、イブリダィゼーシヨン による種の同定）
JT— ISH— 467株から、常法により抽出したゲノム DNAを铸型として、 PCRにより 1
6S rRNA遺伝子の全塩基配列を増幅し、塩基配列を決定した。塩基配列を配列 番号 3に示した。この塩基配列はフォトバタテリゥム 'フォスフォレゥム（Photobacterium phosphoreum)基準株である ATCC11040株の 16S rRNA遺伝子の塩基配列に 対し、相同率 100%の高い相同性を示した。この結果から、 JT—ISH— 467株はフォ トバクテリゥム属に属することが明ら力となった。しかしながら、 16S rRNA遺伝子は 細菌の全ゲノムの一部でしかないので、 16S rRNA遺伝子の塩基配列による同定 解析は種レベルの極めて近縁な生物間の距離に対しては誤差が非常に大きいとさ れている。そこで、属内における菌株の類縁関係の定量的な評価に一般的に用いら れて 、る DNA— DNAノヽイブリダィゼーシヨン試験法を用い、種の決定を行った。 JT
— ISH— 467株およびフォトバクテリウム'フォスフォレゥム基準株である NCIMB128
2株 (ATCC11040株と同一株）の全 DNAを抽出し、供試した。その結果、 84. 7% の高い相同値（DNA- DNA relatedness)が得られた。一般に、同一種間の DNA—D
NA相同値は 60%以上を示すことから、 JT—ISH—467株はフォトバタテリゥム ·フォ スフォレゥム（Photobacterium phosphoreum)と同定された。なお、 DNA— DNAハイ ブリダィゼーシヨン試験は「微生物の分類.同定実験法」（鈴木健一郎'平石 明.横 田 明 編、シュプリンガー'フエアラーク東京株式会社、 2001年 9月、参照によりそ の全体を本明細書に援用する）に従い、マイクロプレートを用いたフォトピオチン標識 法によって行った。
実施例 2： フォトパクテリゥムフォスフォレゥム（Photobacterium phosphoreum) TT— ISH— 467からの β—ガラクトシド— α 2. 3 シアル酸転移酵素の抽出および精製 マリンァガー 2216平板培地上で継代培養したフォトバクテリゥムフォスフォレゥム J
T—ISH— 467株のコロニーから菌体をループで採取し、マリンブロス 2216液体培 地 10mlに接種し、 25°C、毎分 180回転で 8時間振とう培養した。
[0066] 本培養は、以下の手順で実施した。 20gZLの Bacto Peptoneおよび 4 gZLの Bacto Yeast Extractをカ卩えたマリンブロス 2216培地を 1000ml容のコブ付フラ スコに 300ml張り込み、オートクレーブ（121°C、 15分間）で滅菌した。これを 36本（ 合計 10. 8L)用意した。各々のフラスコに前培養液 10mlを接種し、 25°C、毎分 180 回転で 24時間振とう培養した。培養液を遠心分離し、菌体を回収した。湿重量で約 6 0gを得た。
[0067] この菌体を、 990mlの 0. 2%トリトン X— 100および 3M塩化ナトリウムを含む 20m Mカコジレート緩衝液 (pH6. 0)に懸濁し、氷冷下で超音波破砕した。菌体破砕液を 4°C、 100, 000 8で1時間、遠心分離を行い、上清を得た。得られた上清を、透析 膜チューブに入れ、 0. 2%トリトン X— 100を含む 20mMカコジレート緩衝液（pH6. 0)中で 4°C、塩ィ匕ナトリウムが 20mM程度になるまで透析した。透析後、溶液中に沈 澱が生じたため、 4°Cで、 100, 000 X gで 1時間遠心分離を行い、沈殿を取り除いた
[0068] この粗酵素液を、 0. 2%トリトン X— 100なる界面活性剤を含む 20mMカコジレート 緩衝液（ρΗ6. 0)で平衡化した HiPrep 16/10 DEAE FF (アマシャムバイオサ ィエンス製）という陰イオン交換カラムに吸着させ、 0. 2%トリトン X— 100を含む 20m Mカコジレート緩衝液 (pH6. 0)から 1M塩ィ匕ナトリウムを含む同緩衝液へ直線濃度 勾配法で溶出させた。その結果、塩ィ匕ナトリウム濃度が 0. 25M付近で溶出された酵 素活性を有する画分を回収した。
[0069] 回収した画分を 20mMリン酸緩衝液 (pH6. 0)で希釈し、予め 0. 2%トリトン X— 1 00を含む 20mMリン酸緩衝液 (pH6. 0)で平衡化したハイドロキシアパタイト（Bio— Rad製）に吸着させ、 0. 2%トリトン X— 100を含む 20mMリン酸緩衝液（pH6. 0)か ら 0. 2%トリトン X— 100を含む 500mMリン酸緩衝液 (pH6. 0)へ直線濃度勾配法 で溶出させ。その結果、リン酸緩衝液濃度が 125mM付近に溶出された酵素活性を 有する画分を回収した。
[0070] この画分を MonoQ 5/50 GL (アマシャムバイオサイエンス製）陰イオン交換力
ラムに吸着させ、 0. 2%トリトン X— 100を含む 20mM カコジレート緩衝液（pH6. 0 )から 1M 塩ィ匕ナトリウムを含む同緩衝液へ直線濃度勾配法で溶出させた。その結 果、塩ィ匕ナトリウム濃度が 300mM付近で溶出される酵素活性を有する画分を回収し た。
[0071] この画分を、 0. 2%トリトン X—100を含む 20mM カコジレート緩衝液（pH7. 0)で 10倍希釈し、 MonoQ 5/50 GL (フアルマシア製）陰イオン交換カラムに吸着さ せた。 0. 2%トリトン X— 100を含む 20mMカコジレート緩衝液（pH7. 0)から 1M 塩ィ匕ナトリウムを含む同緩衝液へ、直線濃度勾配法で溶出させた。塩ィ匕ナトリウム濃 度が 300mM付近で溶出される酵素活性を有する画分を回収した。
[0072] この画分を 0. 2%トリトン X— 100および 0. 2M塩化ナトリウムを含む 20mMカコジ レー卜緩衝液（ρΗ7. 0)で 2倍希釈し、 HiLoad 16/60 Superdex 200 prep grade (アマシャムバイオサイエンス製）ゲルろ過カラムで分画した。 0. 2%トリトン X— 100および 0. 2M塩化ナトリウムを含む 20mM カコジレート緩衝液（pH7. 0)で溶 出させた。
[0073] 活性のあった画分を SDS—ポリアクリルアミドゲル電気泳動（アクリルアミドゲルの 濃度は 12. 5%)した結果、 目的酵素は単一のバンドを示し、約 39, 000の分子量を 示した。この画分の比活性は、菌体破砕時の比活性に比べて約 350倍に上昇した。
[0074] 酵素活性は、実施例 1に記載したのと同様に J. Biochem. 120, 104-110(1996)に記 載されている方法で測定した。また、タンパク質の定量は Coomassie Protein As say Reagent (PIERCE製）を用いて、添付されたマニュアルにしたがってタンパク 質の定量を行った。酵素 1単位（1U)は、 1分間に 1マイクロモルのシアル酸を転移す る酵素量とした。
[0075] 実施例 3 : ピリジルァミノ化糖鎖を用いたシアル酸結合様式の決定
実施例 2で得られた酵素を用い、ピリジルァミノ化糖鎖を糖受容体基質として酵素 反応を行った。ピリジルァミノ化糖鎖としては、ピリジルァミノ化ラタトース (Gal |8 1—4 Glc— PA、タカラバィォ製)を用い分析した。糖受容体基質が 2. 0 /z M、 CMP-Ne uAcが 5. 及び酵素が 20mUZmlとなるように、それぞれを 20mM 力コジレ ート緩衝液 (PH6. 0) 25 1中に溶解し、 25°C下で 3時間反応させた。反応終了後、
100°Cで 2分間反応溶液を処理することにより酵素を失活させた。その後、 HPLCで 反応生成物の分析を行った。
[0076] HPLCシステムとして Shimadzu LCI OA (島津製作所製）を用い、分析カラムに は Takara PALPAK Type R (タカラバイオ製）を用いた。 0. 15% N ブタノー ルを含む lOOmM 酢酸—トリェチルァミン (pH5. 0)で平衡化したカラムに溶出液 A ( lOOmM 酢酸—トリェチルァミン、 pH5. 0)で希釈した反応液を注入した。ピリジ ルァミノ化糖鎖の溶出には溶出液 A ( lOOmM 酢酸—トリェチルァミン、 pH5. 0)及 び溶出液 B (0. 5%、 n—ブタノールを含む lOOmM 酢酸 トリェチルァミン、 pH5. 0)を用い、 30〜： L00%溶出液 Bの直線濃度勾配法 (0〜35分)及び 100%溶出液 B (35〜50分）により、順次ピリジルァミノ化糖鎖を溶出した。なお、分析は以下の条件 で行った（流速： lmlZmin、カラム温度： 40°C、検出：蛍光（Ex : 320nm、 Em : 400 nm) )。
[0077] その結果、本酵素を用いることにより、ピリジルァミノ化ラタトースカもピリジルァミノ 化 a 2, 3 シァリルラタトースが合成されることが明ら力となった。
[0078] 実施例 4 : TT— ISH— 467菌株が牛.産する βガラクトシド— 2. 3 シアル酸転 移酵素 用いた単糖'二糖街へのシアル酸の転移 (シアル酴含有糖鎖の観告）
JT— ISH— 467菌株カも調整した菌体破砕液を、イオン交換クロマトグラフィー、ハ イドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィーを用いて部分精製 した α 2, 3 シアル酸転移酵素を用いて、各種の単糖 '二糖類へのシアル酸の転移 を確認するために、以下の実験を行った。
[0079] 各糠の糖 容体 を用いたシアル酸転移反
反応溶液 24 1中に、糖供与体基質 CMP— "C NeuAc (400nmol ( 15600cp m)、反応溶液中での最終濃度：16. 6mM)、各種糖受容体基質（10 ;ζ ΐηΟ1、反応 溶液中での最終濃度： 200mM)、シアル酸転移酵素（0. 13mU)、 NaCl (反応溶液 中での最終濃度： 500mM)からなる反応溶液を調製して、 25°Cで 4時間、酵素反応 を行った。なお、糖受容体基質として用いた単糖'二糖類は、メチル— oc— D—ガラ タトビラノシド（Gal— a— OMe)、メチルー β—D ガラクトピラノシド（Gal— β— ΟΜ
e)、 N ァセチルガラタトサミン（GalNAc)、ラタト一ス（Gal— β 1,4— Glc)、 Ν ァセチ ルラクトサミン（Gal— β 1,4— GlcNAc)、メチル一 13—D—ガラタトピラノシル一 β 1, 3 —Ν ァセチルダルコサミニド（Gal— β 1,3 -GlcNAc- β— OMe)の 6種類を用いた
[0080] 酵素反応終了後、反応溶液に 1. 98mlの 5mMリン酸バッファー（pH6. 8)を添カロ して酵素反応を停止した。その後、 5mMリン酸バッファー (pH6. 8)で希釈した酵素 反応溶液（2ml)を、 AGl - X 2Resin(PO 3-フォーム、 0. 2 X 2cm)カラムに供した
4
。このカラムは、 AGl - X 2Resin (OH -form, BIO— RAD社製）を 1Mリン酸バッ ファー (pH6. 8)に懸濁し、 30分後レジンを蒸留水で洗浄した後、蒸留水に懸濁して 作成した。このカラムの溶出液 (0〜2ml)の放射活性を測定した。このカラムの溶出 液には、反応で生じた14 C— NeuAc (N ァセチルノイラミン酸）が結合した反応生成 物及び未反応の糖受容体基質が含まれるが、未反応の CMP— 14C NeuAcはカラ ムに保持されたままである。従って、酵素反応の結果生じた各種シアル酸含有糖鎖 由来の14 Cの放射活性は、全て反応生成物由来であり、この画分の放射活性カも酵 素活性を算出することができる。
[0081] 上記の方法を用いて、それぞれの糖受容体基質に転移された NeuAcの放射活性 を測定して転移されたシアル酸を算出した。
(腿
今回糖受容体基質として用いた 6種類の単糖、ニ糖 、ずれにもシアル酸が転移し て!、ることが明らかとなつた (表 1参照)。今回糖受容体基質として用いた糖類の中で は、 N ァセチルラクトサミンに最も多くのシアル酸が転移していることが明ら力となつ た。
[0082] [表 1]
表 1 ： J1 SH-467由来 α2，3-シアル酸転移酵素による
種々の糖受容体基質へのシァル酸転移酵素活性
( 1 )ゲノム DN Αの精製 ゲノムライブラリ一の作成
JT— ISH— 467の菌体ペレット約 0. 5gから、 Qiagen Genomic -tip 100/G ( Qiagen社製)を用いて、キット添付の説明書きに従って、約 100 gのゲノム DNAを 調製した。 l 2 iu gのDNAに対して、 0.：!〜 0. 2ユニットの四塩基認識の制限酵素 Sau3AIを反応させ、部分分解を行った。反応バッファ一は酵素に添付のものを用い 、反応条件は 37°C、 30分とした。反応終了後、反応液に最終濃度 25mMの EDTA pH8. 0を加え、フエノール'クロ口ホルム処理を行った。ゲノム DNAをエタノール沈 殿で回収し、 TE 400 μ 1に溶解した。遠心チューブ（日立製作所製 40ΡΑ)に、ダラ ジェント作製装置を用いて、 40%シユークロースバッファー（20mM Tris pH8. 0 ， 5mM EDTA pH8. 0， 1M NaCl)と 10%シユークロースバッファーから、 40— 10%のグラジェントを作製し、そこへ上記の部分分解 DN A溶液を重層した。超遠心 機（日立製作所製 SCP70H、ローター： SRP28SA)を用いて、 26, 000rpm、 20°C 、 15時間遠心した。遠心後チューブの底部に 25Gの針で穴を空け、底部の液から 1 mlずつ回収した。回収したゲノム DNAを含むサンプルの一部を、サブマリン電気泳 動糟を用い、 0. 5-0. 6%ァガロースゲル ZTAEバッファ一中で、 26V、 20時間電 気泳動を行い、 9 16kbのサィズのDNAを含む画分を把握した。マーカーとして; L
ZHindlllを用いた。 9— 16kbのサイズの DNA断片を含む画分に TEを 2. 5ml加え シユークロース濃度を下げた後，エタノール沈殿、リンスを行い、少量の TEに溶解し た。
[0084] JT—ISH— 467のゲノムライブラリー作成のためのベクターとして、 DASH II (S tratagene製）を用いた。 DASH IlZBamHIベクターとゲノム DNA断片のライゲ ーシヨン反応は Stratagene製のライゲーシヨンキットを用いて、 12°Cでー晚行った。 反応後、反応液を GigaPack III Gold Packaging extractと反応させ、ゲノム D NAが組み込まれた λベクターをファージ粒子に取り込ませた。ファージ液は 500 μ 1 の SMバッファーと 20 μ 1のクロ口ホルム中で 4°C保管した。大腸菌 XL1— Blue MR A (P2) (Stratagene製）を LBMM (LB + 0. 2%マルトース + 10mM MgSO )中
4 で A = 0. 5になるまで培養し、この培養液 200 μ 1に、適量のファージ溶液をカロえ、
600
37°Cで 15分間培養した。ここへ 48°Cで保温した NZYトップァガロースを 4mlカロえ、 混合し、 NZYァガープレート（直径 9cmのプラスチックシャーレ）にプレーティングし た。プレートを 37°Cで一晩培養し、プラーク数を数え、 titerを計算したところ、ライブ ラリーサイズは約 30万 pfu (plaque forming unit)と算出された。
(2)プライマー設 t ^プローブ作成
Precise 494 cLし Protein sequencing System (Applied Biosystems製)を用 ヽ飞、 JT — ISH— 467株由来の |8—ガラクトシド一 《 2, 3—シアル酸転移酵素のァミノ末端（ Ν末端)アミノ酸配列、および内部アミノ酸配列を決定した。
[0085] Ν末端アミノ酸配列の決定は、次のようにして行った。当該シアル酸転移酵素を 5Ζ
20%グラジェントゲル（ΑΤΤΟ製）にて SDS—ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行つ た。泳動後、当該酵素を PVDF膜に吸着させ、アミノ酸配列分析装置により、アミノ末 端側 10個のアミノ酸の配列を決定した。その結果、当該酵素の Ν末端アミノ酸配列 は XNSDSKHNNS (配列番号 4)であった。
[0086] また、内部アミノ酸配列の決定は、次のようにして行った。当該シアル酸転移酵素を 5Ζ20%グラジェントゲル (ΑΤΤΟ社）にて SDS—ポリアクリルアミドゲル電気泳動を 行った。ゲルを染色した後、 目的のバンドを切り出し、リジルエンドべプチダーゼを含 むトリスバッファー（ρΗ8. 5)を加え、 35°C、 20時間の処理を行った。その後、溶液の
全量を逆相 HPLC (カラム： Symmetry C18 3. 5 m)に供して、断片ペプチドを 分離した。アミノ酸配列分析装置により、当該酵素の内部アミノ酸配列は、 SLDSMI LTNEIK (配列番号 5)、 FYNFTGFNPE (配列番号 6)および GHPSATYNQQII DAHNMIEIY (配列番号 7)を有することが明ら力となった。
[0087] 上記のように決定されたフォトバタテリゥム 'フォスフォレゥム JT—ISH— 467由来 a 2， 3—シアル酸転移酵素の部分アミノ酸配列、即ち Ν末アミノ酸配列: XNSDSKH NNS (配列番号 4)と、三箇所の内部アミノ酸配列のうち、二箇所の内部アミノ酸配列 ： FYNFTGFNPE (配列番号 6)および GHPSATYNQQIIDAHNMIEIY (配列番 号 7)を基に以下の degenerateプライマーを設計、合成した。即ち、 N末のアミノ酸 配列： XNSDSKHNNS (配列番号 4)から、下記の表 2に示す 3本のプライマー（Iは イノシン）を合成した。
[0088] [表 2] 表 2
名称 配列 5' -3' (ni 度 長さ
467N- V AAY S I GAY S I AAR CAY AAY AA (配列番号 8 ) 256 Z3mer
467N-RVZ GAY WS I AAR CAY AAY AAY WS (配列番号 9 ) 512 20mer
467N-RV3 AAY WSN GAY WS I AAR CAY AAY AA (配列番号 1 0 ) 1024 Z3mer 表中、 Yはチミンまたはシトシン； Wはチミンまたはアデニン； Sはシトシンまたはグァニン； Rはアデニンまたはグァニン； Nはアデニン、 グァニン、 シ卜シンまたはチミン；
Iはイノシン；をそれぞれ表す。
[0089] また、内部アミノ酸配列： GHPSATYNQQIIDAHNMIEIY (配列番号 7)力も下 ei の表 3に示す 4本のプライマーを合成した。
[0090] [表 3] 表 3
名称 配列 5'—3' mi x度 長さ
467 i nl RV ATH ATH GAY GCN CAY AAY ATG (配列番号 Ί 1 ) 288 21mer
467 i n1FW CAT RTT RTG NGC RTC DAT DAT (配列番号 1 2 ) 288 21mer
467 i nl RV2 TAY AAY CAR CAR ATH ATH GAY GC (配列番号 1 3 ) 288 23mer
467 i n1FW2 GCR TCD ATD ATY TGY TGfi TTR TA (配列番号 1 4 ) 288 23tner 表中、 Hはチミン、 シトシンまたはアデニン； Yはチミンまたはシトシン；
Rはアデニンまたはグァニン； Dはアデニン、 グァニンまたはチミン；
Nはアデニン、 グァニン、 シトシンまたはテミン；をそれぞれ表す。
[0091] さらに、内部アミノ酸配列： FYNFTGFNPE (配列番号 6)力 下記の表 4に示す 2本 のプライマーを合成した。
[0092] [表 4] 表 4
名称 配列 5 ' - 3' m i x度 長さ
467 i n2RV TAY AAY TTY ACN GGN TTY AAY CC (配列番号 1 5 ) 512 23mer
467 i n2FW GGR TTR AAN CCN GTR AAR TTR TA (配列番号 1 6 ) 512 23mer 表中、 Yはチミンまたはシトシン； Rはアデニンまたはグァニン；
Nはアデニン、 グァニン、 シ卜シンまたはチミン；をそれぞ す。 これらのプライマーを用いて、上記（1)で抽出'精製し^ JT— ISH— 467のゲノム D NAを铸型に PCRを行 、、ライブラリーをスクリーニングするためのプローブとなる JT —ISH—467由来 α 2, 3—シアル酸転移酵素遺伝子の部分長 DNAを増幅した。 プライマー組み合わせは、 Ν末配列由来の 3本のプライマーのそれぞれと、 467inl FW (配列番号 12)、 467inlFW2 (配列番号 14)もしくは 467in2FW (配列番号 16) の 9つの組み合わせ、 467inlRV (配列番号 11)もしくは 467inlRV2 (配列番号 13 )と 467in2FW (配列番号 16)の 2つの組み合わせ、さらに 467in2RV (配列番号 15 )と 467inlFW (配列番号 12)もしくは 467inlFW2 (配列番号 14)の 2つの組み合 わせの、総計 13組み合わせである。 PCR反応は以下のように行った。 の反応 液中【こ、ゲノム DNA 250ng、 10( Ex taqノ ッファー 5 μ 1、 2. 5mM 各 dNTPs
4 μ \,プライマーをそれぞれの配列について 5pmole, Ex taq (タカラバイオ製） 0 . 5 1、をそれぞれ含み、プログラムテンプコントロールシステム PC— 700 (ASTEK 社)を用いて、 96°C 3分を 1回、 96°C 1分、 50°C 1分、 72°C 2分を 40 回、 72 °C 6分を 1回行った。その結果、 9つのプライマー組み合わせ (467N— RV (配列番 号 8)と 467inlFW (配列番号 12)、 467N— RV (配列番号 8)と 467in2FW (配列番 号 16)、 467inlRV (配列番号 11)と 467in2FW (配列番号 16)、 467in2RV (配列 番号 15)と 467inlFW (配列番号 12)の組み合わせ以外の 9つ）において、 PCR産 物が増幅された。これらの PCR産物のうち、特異的かつ高い増幅効率の得られた組 み合わせ（467N— RV3 (配列番号 10)と 467inlFW (配列番号 12) )由来の PCR 産物をベクター pCR2. lTOPO (Invitrogen製）にクローユングした。ライゲーシヨン
反応はベクターキット添付の説明書きに従った。大腸菌 TB Iにエレクト口ポレーシヨン 法を用いて DNAを導入し、常法（Sambrook et al. 1989, Molecular Cloning, A laboratory manual, 2nd edition (引用によりその全体を本明細書に援用する））に従い プラスミド DNAを抽出した。このクローンに関して、 M l 3プライマー（タカラノィォ製） を用いて、 ABI PRISM蛍光シークェンサ一（Model 310 Genetic Analyzer, Perkin Elmer製)で、 PCR産物の塩基配列をその両端カゝら決定した。
決定された DNA塩基配列（929bp：配列番号 17)に関して、 National Center for
Biotechnology Information (NCBI)の GeneBankデータベースに対して、 BLASTプ ログラムによる相同性検索を行った。その結果、有意な相同性を示す DNA配列は検 出されなかった。これは本発明によって明らかにされた、フォトバタテリゥム'フォスフォ レゥム JT—ISH—467株由来 a 2, 3—シアル酸転移酵素遺伝子の DNA塩基配列 が新規な配列であることを意味する。次に、この塩基配列をアミノ酸に翻訳して、再度 BLASTサーチをかけたところ、フォトバクテリウム*ダムセラ（Photobacterium damselae)の α 2, 6—シアル酸転移酵素 (JC5898)と 30%の相同性、ノ スッレラ 'ム ルトシダ亜種ムルトシダ株 (Pasteurella multocida subsp. multocida) Pm70株の仮定 上のタンパク質 PM0188 (AAK02272)と 26%の相同性、へモフィルス 'デュクレ ィ（Haemophilus ducreyi) 35000HP株の仮定上のタンパク質 HD0053 (AAP950 68)と 21 %の相同性が検出された。さらに、翻訳されたアミノ酸配列は、上記の精製 酵素から直接決定された内部アミノ酸配列： FYNFTGFNPE (配列番号 6)と SLDS MILTNAIK (配列番号 5)の全体を含み、 N末アミノ酸配列： XNSDSKHNNS (配 列番号 4)と、内部アミノ酸配列： GHPSATYNQQIIDAHNMIEIY (配列番号 7)の 一部を含んでいた。以上の結果から、クローユングされた DNAは、フォトバタテリゥム 'フォスフォレゥム JT—ISH—467株由来 ex 2, 3—シアル酸転移酵素遺伝子の一部 であり、かつ本発明のフォトバクテリウム'フォスフォレゥム JT—ISH— 467株由来 α 2 , 3—シアル酸転移酵素のアミノ酸配列は、既報配列と 30%程度し力 4目同性を示さ ない新規なアミノ酸配列であることが明らかとなった。
(3)スクリーニングと遣伝子クローニング
上記（2)でクローン化されたフォトバタテリゥム 'フォスフォレゥム JT—ISH— 467株
由来ひ 2, 3—シアル酸転移酵素遺伝子の一部力もなる DNA断片を、 pCR2. 1 T OPOベクター力 制限酵素 EcoRIで切り出し、これをプローブとして、上記（1)作製 したフォトバクテリウム'フォスフォレゥム JT— ISH— 467株由来ゲノム DNAライブラリ 一をスクリーニングした。直径 9cmの丸形シャーレに λ DASH Il/BamHI ベクタ 一キット（Stratagene製）の説明書きに従って、約 300— 500pfuのファージを宿主 菌 XLl—blue MRA(P2)とともにプレーティングした。プラークを Hybond—N + ナイロンメンブレンフィルター (Amersham製）に接触させ、メンブレン添付の説明書 きに従ってアルカリ処理を行い DNAを変性させ、メンブレン上に固定させた。プロ一 ブは rediprime 1丄 DNA labelling system (Amersham製)を用いて Pラベ ルした。ハイブリダィゼーシヨンは 0. 5M リン酸ナトリウムバッファー pH7. 2、 7% SDS、 ImM EDTA中で 65(Cでー晚、洗浄の条件は 40mM リン酸ナトリウムバッ ファー pH7. 2、 ImM EDTA, 5%SDS中で 65。C、 15分を二回、 40mM リン酸 ナトリウムバッファー pH 7. 2、 1% SDS、 ImM EDTA中で 65(C、 15分を二回 行った。 1次スクリーニングで約 5, OOOpfuのファージから 24個のポジティブクローン が得られた。うち 18個のクローンに関して、プラークの精製を兼ねた 2次スクリーニン グを行った。その結果、 6種類の選抜'精製プラークを得ることが出来た。
これらのプラークを回収し、それぞれ大腸菌 XLl—blue MRA(P2)とともに、一 枚数万 pfuとなるように NZYプレートにプレーティングし、ー晚 37°Cで保温した。プラ ークがー面に出ている 6枚のプレートに SMバッファーを 4mlづっ注ぎ、 4°Cでー晚静 置した。パスツールピペットで、ファージプレートライセートを回収し、 QIAGEN La mbda Mini Kit (キアゲン製）で、 λ DNAを抽出、精製した。これら 6種類の λ DN Α、および（1)で精製し^ JT— ISH— 467株の全ゲノム DNAを制限酵素 EcoRI、 Hi ndmで消化し、 0. 7%ァガロースゲル電気泳動で分画後、 0. 4M NaOHを用いた アルカリブロッテイングにより、ゲルを Hybond—N +ナイロンメンブレンフィルター（A mersham製）に転写した。このフィルターに関して、上記の 929bpのプローブ（配列 番号 17)を用いて、上述のようにサザンノヽイブリダィゼーシヨンを行った。その結果、 EcoRI消化では、 9kbまたはそれ以上のバンドが検出された。一方、 Hindlll消化の 場合、全ての DNA、ゲノム DNAともに 4. 6kbのバンドが検出された。そこで、 D
NAを再度 Hindlllで消化し、ァガロースゲル電気泳動を行い、 4. 6kb Hindlll断 片を回収し、プラスミドベクター pBluescript SK (—）の Hindlll部位に、常法に従 いクローニングした。
[0096] 次に、フォトバタテリゥム 'フォスフォレゥム JT—ISH— 467株由来 α 2, 3—シアル 酸転移酵素遺伝子の全塩基配列を決定するため、同遺伝子の部分 DNA配列（上 述、 929bp：配列番号 17)を基に以下の表 5に示すプライマーを合成した。
[0097] [表 5] 表 5
名称 配列 5' -3' 長さ
467-23ST i nRVl TGTTGATAGAGCAACATTACC (配列番号 1 8) 21mer
467-23ST i nRV2 TGGTAATACCTTATGGGCAG (配列番号 1 9 ) 20mer
467-Z3ST i nRV3 GMCAGCAACGGCAGAGC (配列番号 2 0 ) 18iner
467-23ST i nRV4 CTAATTCAATTCAAGGATTGG (配列番号 2 1 ) 21mer
467-23ST i nFWl TGGTAATGTTGCTCTATCAAC (配列番号 2 2 ) 21mer
467-23ST i nFW2 ACTGCCCATAAGGTATTACC (配列番号 2 3 ) 20mer
467-23ST i nFW3 GCTCTGCCGTTGCTGTTC (配列番号 2 4 ) lSmer
[0098] これらのプライマーを用いて、 ABI PRISM蛍光シークェンサ一（Model 310
Genetic Analyzer， Perkin Elmer製）で、 4. 6kb Hindlll断片の内部塩基配列を解 析し、フォトバタテリゥム 'フォスフォレゥム JT—ISH— 467株由来 α 2, 3—シアル酸 転移酵素遺伝子の内部、およびその近傍の塩基配列を解析した。その結果、配列表 の配列番号 1の配列を得た。この配列は、フォトバタテリゥム 'フォスフォレゥム JT— IS H— 467株由来ひ 2, 3—シアル酸転移酵素遺伝子のオープンリーディングフレーム (ORF)の全塩基配列である。最初の ATGの上流には同じ読み枠で、翻訳終止コド ンが現れるのでこれ力 本遺伝子の翻訳開始コドンであると考えられる。
[0099] フォトバタテリゥム 'フォスフォレゥム JT—ISH— 467株由来 α 2, 3—シアル酸転移 酵素遺伝子の ORFは、 1230塩基からなり、 409個アミノ酸をコードしていた。このァ ミノ酸配列を配列表の配列番号 2に示す。このアミノ酸配列は、精製酵素から決定さ れた 4箇所のアミノ酸配列全てを完全に含む。 Ν末のアミノ酸配列の一文字目が解読 されていな力 た力 遺伝子力 演繹されるこの部分のアミノ酸は Cys (システィン）で
あった。また成熟タンパクの N末端は、配列表の配列番号 2の配列のうちの第 22番 目の Cysであることから、初めの 21アミノ酸力もなる配列は、フォトバタテリゥム 'フォス フォレゥムにおいてはプロセッシングを受け、除去されると考えられた。遺伝情報処理 ソフトウェア GENETYX Ver. 7 (ゼネテイツタス製）を用いて、本発明のフォトバクテ リウム 'フォスフォレゥム JT— ISH— 467株由来 α 2, 3—シアル酸転移酵素タンパク 質全長、およびその遺伝子全長と、それらのホモローグの全長同士の相同性を解析 したところ、アミノ酸配列では、フォトバクテリウム'ダムセラの α 2, 6—シアル酸転移 酵素 (JC5898)と 32%の相同性、パスッレラ.ムルトシダ亜種ムルトシダ株 Pm70の 仮定上のタンパク質 PM0188 (AAK02272)と 28%の相同性を有し、そして、遺伝 子 DNA配列ではそれぞれと、 53%、 51%の相同性を有していた。
(4) ベクターの
クローン化した遺伝子が、シアル酸転移活性を有するか否かを調べるため、同遺伝 子を発現ベクターに組み込み、大腸菌内でタンパク質を生産させ、この発現タンパク 質の活性を測定した。
[0100] フォトバクテリウム'フォスフォレゥム JT— ISH— 467株由来 α 2, 3—シアル酸転移 酵素のアミノ酸配列について、遺伝情報処理ソフトウェア GENETYX Ver. 7で、シ グナルペプチドの予測を行うと、 N末の 24アミノ酸力 シグナルペプチドであると予測 された。そこで、この部分のアミノ酸が除かれたタイプのタンパク質をコードする遺伝 子を、 PCRによりクローンィ匕するため、下記の表 6に示したプライマーを設計、合成し た。
[0101] [表 6] 表 6
名称 83列5' -3' 長さ
467-Z3ST-N2-Nco GGGCTGTACC ATG 3ACTCTAAGCACAATAACTCAG (配列番号 2 5 ) 35mer 467- 23ST-C0- Bm CTTAGAATGG ATCC： TTACTGCAAATCACTTATCAAC (配列番号 2 6 ) 36tner
[0102] クロー-ング用にプラィマーに予め組み込んだ制限酵素NcoI (467— 23ST—N2 — Nco)、 BamHI (467— 23ST— CO— Bm)部位を下線で示した。翻訳開始コドン
ATG、翻訳終止コドン TAA (この相補配列）を四角で囲んだ。さらに、プライマー配 列のうち、制限酵素部位より 3 '側で、铸型 DNAとアニーリングする部分の配列を太 字で示した。 PCR時の铸型 DNAは、フォトバクテリウム'フォスフォレゥム JT— ISH— 467株由来ひ 2, 3—シアル酸転移酵素遺伝子全長を含む上記 Hindlll 4. 6kb断 片が組み込まれたプラスミドを用いた。 PCRの反応条件は以下のように設定した。 50 1の反応液中に、铸型 DNA 100ng、 10 X Ex taq buffer 5 μ Ι, 2. 5mM 各 dNTP 4 ΐ、プライマー 50pmole、Ex taq (タカラバイオ製） 0. 5 1をそれ ぞれ含み、プログラムテンプコントロールシステム PC— 700 (ASTEK製）を用いて、 96°C 3分を 1回、 96°C 1分、 50°C 1分、 72°C 2分を 15 回、 72°C 6分を 1回 行った。その結果、およそ 1. lkbの PCR産物が増幅された。この PCR産物を、制限 酵素 NcoI、 BamHI (ともにタカラバィォ製)で二重消化した後、ゲル精製した。大腸 菌発現用ベクターは pTrc99A (Pharmacia LKB製）を用いた。このベクターを同じ 制限酵素 Ncolと BamHIで二重消化しゲル精製したものを、制限酵素処理を行った PCR産物と Takara Ligation Kit (タカラバイオ製）を用いてライゲーシヨンし、大 腸菌 TBIに組み込んだ。常法に従いプラスミド DNAを抽出、制限酵素分析し、イン サートの組み込みを確認したクローンのうち、 2クローンの塩基配列を決定した結果、 ともにアミノ酸置換を伴う塩基の変異が見つかった。即ち、第一クローンでは、配列番 号 1の塩基配列の 476番目のチミン (T)がシトシン (C)に変異しており、これによりコ ドンが TTTから TCTに変わり、 159番目のフエ-ルァラニン（Phe)がセリン（Ser)に 置換されていた。第二クローンでは、配列番号 1の塩基配列の 78番目のチミン (T)が 欠失し、これにより、フレームシフトが起き、正しいタンパク質が翻訳されない。
) 現. 活件沏 I
上記 (4)で得られた 2クローンに関して、タンパク質発現誘導実験を行った。各クロ ーンが組み込まれた発現ベクター pTrc99Aをもつ大腸菌 TBIの単一コロニーを、抗 生物質アンピシリン (最終濃度 100(gZmL)を含む LB培地（5ml)に接種し、 A =
600
0. 5程度になるまで 30°Cで菌を前培養し、その後 IPTG (イソプロピル— β— D (―) —チォガラタトピラノシド、和光純薬工業製)を最終濃度で ImMとなるように加え、 30 °Cでさらに 4時間振とう培養した。培養液 2ml中の菌体を遠心分離によって集めた。
この菌体を、 200 1の。. 336%トリトン X— 100およひ Ό. 5M塩ィ匕ナトリウムを含む 2 OmM ビストリス緩衝液 (PH7. 0)に懸濁し、氷冷下で超音波破砕した。得られた破 砕液を粗酵素液とし、活性測定に供試した。反応は 2反復で行い、反応組成は実施 例 1と同様に行った。但し、反応時間は 15時間とした。その結果、下記の表 7に示す ように、第一クローンの粗酵素液中には糖供与体である CMP— NeuAc中の14 Cでラ ベルされた NeuAcを糖受容体基質であるラクトースに転移する因子、即ちシアル酸 転移酵素活性が存在することが示された。一方、第二クローンの粗酵素液中および 粗酵素液なしの反応液中にはシアル酸転移酵素活性が含まれて L、な力つた。以上 の結果から、第一クローンを導入した大腸菌にはシアル酸転移酵素が発現されてい ることが明らかとなった。
[0103] [表 7] 表 7 ： JI^ISH-467由来 β—ガラクトシド— α 2,3-シァル酸転移酵素遺伝子を組み換えた 菌破碎液中のシアル酸転移酵素活性
[0104] (6) - 2. 3シアル酴転移活件の確認
上記（5)の粗酵素液を用いて、第一クローンを導入した大腸菌で発現されたシアル 酸転移酵素が α— 2, 3シアル酸転移活性を有するかどうか調べた。実施例 3と同様 に、糖受容体としてピリジルァミノ化ラクトース（0&113 1—401(：—? 、タカラバィォ社 製 ΡΑ— Sugar Chain 026)を用い、酵素反応を行った。反応終了後、 95°Cで 5 分間、反応溶液を熱処理することにより酵素を失活させ、 HPLCで分析した。なお、 酵素反応は、ピリジルァミノ化ラタトースが 2. 0 M、 CMP—シアル酸が 5. 7 Μと なるように、それぞれを 20mM カコジレート緩衝液（ρΗ6. 0) 25 μ 1中に溶解し、 25 °C下で 6時間行った (反応 1)。一方、 CMP—シアル酸を含まない反応液を供試した 対照実験 (反応 2)を行った。また、標品の保持時間を明らかにするため、熱処理 (95
°C、 5分間）によって失活させた粗酵素液を加え、ピリジルァミノ化ラタトースおよびピ リジルアミノィ匕 α 2, 3 シァリルラタトース（Neu5Ac a 2— 3Gal j8 1— 4Glc— PA、 タカラバイオ製 PA— Sugar Chain 029)を添カ卩した試験を行った。
[0105] 標品の分析結果（図 1— 1)から、ピリジルァミノ化ラタトースの保持時間は 4. 1分、 ピリジルアミノィ匕 α 2, 3 シァリルラタトースの保持時間は 5. 4分であることが示され た。これにより反応 2 (図 1— 3)では検出されない保持時間 5. 3分のピーク（図 1— 2) 力 Sピリジルアミノィ匕 α 2, 3——ンァリルラタトースであることが明ら力となった。すなわち、 第一クローンを導入した大腸菌で発現されたシアル酸転移酵素が α— 2, 3シアル酸 転移活性を有することが証明された。
(7)各種シアル酸転移酵素タンパク質のアミノ酸配列のマルチアライメント分析 遺伝情報処理ソフトウェア GENETYX Ver. 7 (ゼネテイツタス社製）を用いて、マ ルチアライメント分析を行った。その結果、フォトバタテリゥム'フォスフォレゥム JT— IS H— 467株由来《2, 3 シアル酸転移酵素（配列番号 2)、フォトパクテリゥム 'ダム セラの α 2, 6 シアル酸転移酵素 (JC5898)、へモフィルス'デュクレイ（
Haemophilus ducreyi) 35000HP株の仮定上のタンパク質 HD0053 (AAP95068 )ならびにパスッレラ ·ムルトシダ亜種ムルトシダ株 Pm70の仮定上のタンパク質 PM0 188 (AAK02272)は図 2のようなアラインメントを示した。なお、 JT— ISH— 467株 由来 α 2, 3 シアル酸転移酵素についての下線は精製タンパク質力も決定された アミノ酸配列を示す。
産業上の利用可能性
[0106] 本発明は、新規な β ガラクトシドー a 2, 3 シアル酸転移酵素およびそれをコー ドする核酸を提供することにより、生体内において重要な機能を有することが明らか にされてきている糖鎖の合成 ·生産手段を提供する。特に、シアル酸は、生体内の複 合糖質糖鎖において非還元末端に存在することが多ぐ糖鎖機能という観点力ゝら極 めて重要な糖であるため、シアル酸転移酵素は糖転移酵素の中でも最も需要が高 ヽ 酵素の一つである。本発明の新規なシアル酸転移酵素は、糖鎖を応用した医薬品、 機能性食品等の開発に利用することが可能である。
Claims
[1] 配列番号 2または配列番号 2のアミノ酸残基 22— 409のアミノ酸配列を含んでなり、 そして、 β—ガラタトシドーひ 2, 3 シアル酸転移酵素活性を有する、単離されたタ ンパク質。
[2] 配列番号 2または配列番号 2のアミノ酸残基 22— 409のアミノ酸配列において、 1ま たはそれより多くのアミノ酸の欠失、置換、挿入および Ζまたは付加を含むアミノ酸配 列を含んでなり、そして、 j8—ガラクトシドーひ 2, 3—シアル酸転移酵素活性を有す る、単離されたタンパク質。
[3] 配列番号 2または配列番号 2のアミノ酸残基 22— 409のアミノ酸配列と少なくとも 80 %以上のアミノ酸相同性を有するアミノ酸配列を含んでなり、そして、 β ガラクトシド - α 2, 3 シアル酸転移酵素活性を有する、単離されたタンパク質。
[4] 配列番号 1または配列番号 1の塩基 64— 1230の塩基配列を含んでなる核酸によ つてコードされ、そして、 j8—ガラクトシドーひ 2, 3—シアル酸転移酵素活性を有する 、単離されたタンパク質。
[5] 配列番号 1または配列番号 1の塩基 64— 1230の塩基配列の相補鎖にストリンジ ントな条件下でハイブリダィズする塩基配列を含む核酸によってコードされ、そして、 β ガラクトシドー《2, 3 シアル酸転移酵素活性を有する、単離されたタンパク質
[6] ビブリオ科微生物由来である、請求項 1ないし 5のいずれか 1項に記載の単離され たタンパク質。
[7] 配列番号 2または配列番号 2のアミノ酸残基 22— 409のアミノ酸配列を含んでなる タンパク質をコードする、単離された核酸。
[8] 配列番号 2または配列番号 2のアミノ酸残基 22— 409のアミノ酸配列において、 1ま たはそれより多くのアミノ酸の欠失、置換、挿入および Ζまたは付加を含むアミノ酸配 列を含んでなるタンパク質であって、 j8—ガラクトシド α 2, 3 シアル酸転移酵素 活性を有するタンパク質をコードする、単離された核酸。
[9] 配列番号 2または配列番号 2のアミノ酸残基 22— 409のアミノ酸配列と少なくとも 80
%の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなるタンパク質であって、 13 ガラクトシド
- α 2, 3 シアル酸転移酵素活性を有するタンパク質をコードする、単離された核 酸。
[10] 配列番号 1または配列番号 1の塩基 64— 1230の塩基配列を含んでなる単離され た核酸。
[11] 配列番号 1または配列番号 1の塩基 64— 1230の塩基配列の相補鎖にストリンジ ントな条件下でハイブリダィズする塩基配列を含む単離された核酸であって、該核酸 は j8—ガラクトシドー α 2, 3—シアル酸転移酵素活性を有するタンパク質をコードす る、前記単離された核酸。
[12] 請求項 7な 、し 11の 、ずれか 1項に記載の核酸を含んでなる組換えベクター。
[13] 請求項 12に記載の組換えベクターで形質転換した宿主細胞。
[14] 請求項 1な!、し 6の 、ずれか 1項に記載のタンパク質を発現するビブリオ科の単離さ れた微生物。
[15] フォトバタテリゥム 'フォスフォレゥム JT— ISH— 467株（寄託番号 ΝΙΤΕ ΑΒΡ—
88)である、請求項 14に記載の微生物。
[16] β ガラクトシドー ex 2, 3 シアル酸転移酵素活性を有するタンパク質の製造方法 であって、以下の工程：
1) β ガラクトシドー《2, 3 シアル酸転移酵素を生産する微生物を培養し；
2)培養した微生物または培養上清から、 —ガラクトシド 《2, 3 シアル酸転移 酵素を単離する；
ことを含んでなる、前記製造方法。
[17] β—ガラタトシドー ex 2, 3 シアル酸転移酵素活性を有する組換えタンパク質の製 造方法であって、以下の工程：
1)請求項 7な 、し 11の 、ずれか 1項に記載の核酸を含んでなる組換えベクターで 宿主細胞を形質転換し；
2)形質転換した当該宿主細胞を培養し；そして、
3)培養した宿主細胞または培養上清から、 |8—ガラクトシドー《2, 3—シアル酸転 移酵素活性を有するタンパク質を単離する；
ことを含んでなる、前記製造方法。
請求項 1な!ヽし 6の ヽずれか 1項に記載のタンパク質に対する抗体。 ポリクローナル抗体である、請求項 18に記載の抗体。
モノクローナル抗体である、請求項 18に記載の抗体。
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