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WO2006038520A1 - ヒドロキシイミノ酸からのアミノ酸誘導体製造方法 - Google Patents

ヒドロキシイミノ酸からのアミノ酸誘導体製造方法 Download PDF

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WO2006038520A1
WO2006038520A1 PCT/JP2005/017962 JP2005017962W WO2006038520A1 WO 2006038520 A1 WO2006038520 A1 WO 2006038520A1 JP 2005017962 W JP2005017962 W JP 2005017962W WO 2006038520 A1 WO2006038520 A1 WO 2006038520A1
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WO
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group
general formula
amino acid
reaction
carbon atoms
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PCT/JP2005/017962
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French (fr)
Inventor
Masakazu Sugiyama
Kunihiko Watanabe
Tadashi Takemoto
Kenichi Mori
Original Assignee
Ajinomoto Co., Inc.
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Publication date
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Definitions

  • the present invention relates to a method for producing an amino acid derivative having hydroxyimino acid strength, and more particularly to a method for producing an amino acid derivative from hydroxyimino acid by enzymatic reduction.
  • Amino acids are extremely important industrial components as pharmaceuticals, foods, reagents, chemical synthesis intermediates and the like.
  • the enzymatic method is a method in which a precursor having a structure close to the target amino acid is used as a raw material, and is converted into amino acids at once by an enzyme reaction in one to several steps. Enzymatic methods can generally yield highly pure amino acids with few by-products.
  • the enzymatic method is an extremely efficient production method when the precursor material as a substrate is available at a low cost.
  • a chemical synthesis method for the production of monatin for example, a ketone derivative is synthesized from an indoleacetic acid derivative and an acid halide of aspartic acid as raw materials, and a cyanohydrin derivative is further obtained.
  • a method to hydrolyze under conditions for example, Patent Document 1.
  • indole-3-pyruvate IPA
  • 4- (indole-3-ylmethyl) 4-hydroxy-1-2-oxomethyl 4-(Indol-3-ylmethyl) -4-hydroxy — 2— oxoglutarate (also referred to as IHOG) and monatin in the presence of an enzyme
  • IHOG oxoglutarate
  • Patent Document 3 a method for producing the above IHOG in the presence of an enzyme is also known (for example, Patent Document 3).
  • Patent Document 5 describes a method for producing ⁇ -methylbenzylamine from acetophenone oxime.
  • Patent Document 5 describes a method for producing ⁇ -methylbenzylamine from acetophenone oxime.
  • the method of reducing amino acids in the presence of microorganisms or enzymes to produce amino acids is completely known.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Laid-Open No. 2003-171365
  • Patent Document 2 International Publication No. 2003-056026 Pamphlet
  • Patent Document 3 International Publication No. 2004Z018672 Pamphlet
  • Patent Document 4 Pamphlet of International Publication No. 2003-059865
  • Patent Document 5 Japanese Patent Laid-Open No. 4 23499
  • Non-Patent Document 1 Pharmacology, 13, 234 (1975)
  • Non-Patent Document 4 Gibbs et al., Tetrahedron Lett., 31, 555 (1990) Disclosure of the Invention
  • the method for producing an amino acid derivative by chemical synthesis is useful when it is an amino acid derivative that is difficult to isolate and extract, but on the other hand, the equipment cost tends to be high and an expensive catalyst must be used. In many cases, the industrial production level is disadvantageous in terms of cost. On the other hand, in the production of amino acid derivatives, methods using microorganisms or enzymes are often industrially useful. Under the circumstances as described above, an object of the present invention is to provide an industrially advantageous method for producing an amino acid derivative.
  • the present inventors have conducted extensive research on a new method for producing amino acid derivatives such as monatin. As a result, hydroxyimino acid was reduced using microorganisms and Z or enzymes to produce amino acids. A method for producing acid derivatives was found and the present invention was completed. That is, the present invention provides a method for producing the following amino acid derivative.
  • each R represents an optionally substituted alkyl having 2 to 6 carbon atoms.
  • a kill group an aryl group having 6 to 14 carbon atoms, a cycloalkyl group having 6 to 10 carbon atoms, an aralkyl group having 7 to 19 carbon atoms, an alkoxyalkyl group having 2 to 10 carbon atoms, or a heterocycle in these carbon skeletons.
  • R is an optionally substituted alkyl group having 2 to 6 carbon atoms, aryl group having 6 to 14 carbon atoms, cycloalkyl group having 6 to 10 carbon atoms, aralkyl group having 7 to 19 carbon atoms, carbon This represents an alkoxyalkyl group of 2 to 10 or a substituent selected from a group containing a hetero atom in the carbon skeleton.
  • X and X each independently represent a hydroxyl group or a carbonyl group.
  • 1 2 2 represents an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms or a hydrogen atom.
  • n is 0 or 1.
  • An amino acid derivative represented by the general formula (in) is produced by carrying out the reaction in the presence of a microorganism that catalyzes the reaction for producing the amino acid derivative represented by Production method.
  • a method for producing monatin which comprises producing monatin by carrying out the reaction in the presence of a microorganism and Z or an enzyme that catalyze the reaction for producing monatin shown in 1.
  • ⁇ 8-phenylalanine is produced by carrying out the reaction in the presence of a microorganism that catalyzes the reaction to produce 13 phenylalanine from BAE-oxime, and Z or an enzyme. —Method for producing phenylalanin.
  • a method for producing trybutophane characterized in that it produces tributophane by carrying out the reaction in the presence of microorganisms and soot or enzymes that catalyze the reaction to produce tryptophan from indole-3-pyruvate-oxime represented by .
  • Microbial power belongs to any genus selected from the group consisting of the genus Citrobacter, the genus Escherichia, and the genus Rhodococcus The method according to any one of [1] to [11] above, wherein the method is one or more bacteria.
  • the microbe is selected from a group power consisting of Citrobacter freundii, Escherichia intermedia, Escherichia coli, and Rhodococcus marinonascens.
  • the manufacturing method according to any one of [1] to [12] above.
  • amino acid derivatives include amino acids themselves and derivatives thereof.
  • the microorganism having the ability to catalyze this reaction used in the present invention is preferably a genus Citropacter, a genus Escherichia, a genus Corynebacterium, a Rhodococcus J3 ⁇ 4, Examples include bacteria belonging to any genus selected from the group of the genus Sanmonemon (Salmonella) and the genus Erwinia.
  • preferred microorganisms include Citrobacter freun dii, Citrobacter intermedius, Escherichia intermedia, Esch erichia coli, Corynebacterium equi (Corineno kuteryumu kui), Rhodococcus marinonascens (Rodokoku 7 s Marinoscenes), Salmone 11a sp. (Sanoremonera sp.), Erwinia amylovora , And Salmonella enteritidis (Salmonella enteritidis).
  • strains are exemplified as preferred microorganisms.
  • the names of the strains and their deposits are shown below.
  • the enzyme used in the present invention can be isolated and purified from the above microorganisms and the like.
  • “in the presence of microorganisms and Z or an enzyme” means that the reaction system for converting hydroxyimino acid represented by the general formula (I) into an amino acid derivative represented by the general formula (III) Or the presence of an enzyme.
  • the “microorganism and Z or enzyme” has the desired activity of the present invention, its origin and preparation method are not particularly limited.
  • a host microorganism transformed with a gene (including a recombinant gene) that encodes the enzyme that mediates the reaction, or an enzyme produced by the host microorganism can also be used. That is, as long as the hydroxyimino acid represented by the general formula (I) is converted into the amino acid derivative represented by the general formula ( ⁇ )! / Microorganisms and Z or enzymes may be present in the reaction system in an undue form. . Microorganisms and enzymes can be used either alone or in combination.
  • microorganism and Z or enzyme used in the production method of the present invention can take the following forms. Specific examples include a culture of the above microorganism, a microbial cell separated from the culture, a treated cell of the cell, and the like.
  • a microorganism culture is a product obtained by culturing a microorganism. More specifically, a microorganism cell, a medium used for culturing the microorganism, and a mixture of substances produced by the cultured microorganism. Etc. Alternatively, the microbial cells may be washed and used as washed cells.
  • the treated bacterial cells include those obtained by crushing, lysing, and freeze-drying the bacterial cells, and further include crude purified enzymes recovered by treating the bacterial cells, and further purified purified enzymes.
  • the purified enzyme a partially purified enzyme obtained by various purification methods may be used, or a fixed enzyme obtained by immobilizing these by a covalent bond method, an adsorption method, a comprehensive method, or the like may be used. May be.
  • some microorganisms lyse during culture, and in this case, the culture supernatant can also be used as the above-mentioned “microorganism and Z or enzyme”.
  • the hydroxyimino acid represented by the general formula (I) is converted into an amino acid derivative represented by the general formula ( ⁇ ).
  • Recombinant strains expressing the enzyme may be used, or treated cells such as acetone-treated cells and freeze-dried cells may be used, and these may be used in a covalent bond method, adsorption method, inclusion method, etc.
  • a fixed bacterial cell or a treated product of the fixed bacterial cell fixed by the above method may be used.
  • R is an alkyl group having 2 to 6 carbon atoms
  • specific examples are ethyl group
  • n examples include pill group, isopropyl group, n-butyl group, isobutyl group, sec-butyl group, tert-butyl group, n-pentyl group, isopentyl group, neopentyl group, n-hexyl group, isohexyl group and the like.
  • R is an aryl group having 6 to 14 carbon atoms
  • a specific example is
  • tolyl group tolyl group, xylyl group, biphenyl group, naphthyl group, anthryl group, phenanthryl group and the like, and preferable examples include a phenyl group and a naphthyl group.
  • R is a cycloalkyl group having 6 to 10 carbon atoms
  • a specific example is
  • a xyl group, a cycloheptal group, a cyclooctal group, a cyclononal group, a cyclodeoxy group, and the like are included.
  • R is an aralkyl group having 7 to 19 carbon atoms
  • specific examples include benzyl group
  • Phenylalkyl groups such as benzhydryl group, phenethyl group, and trityl group, cinnamyl group, styryl group, and naphthylalkyl group.
  • Preferred examples include a phenylalkyl group and a naphthylalkyl group.
  • R is an alkoxyalkyl group having 2 to L carbon atoms: a specific example is carbon
  • R contains a hetero atom in the carbon skeleton is a heterocycle-containing carbon hydrogen group.
  • the heterocyclic ring-containing hydrocarbon group is a ring system hydrocarbon group containing a hetero atom in the ring of the cyclic compound.
  • the heterocycle-containing hydrocarbon group includes a heteroaryl group and is not limited to the presence or absence of aromaticity, and may be monocyclic or polycyclic.
  • Specific examples of the heterocyclic ring-containing hydrocarbon group include a furyl group, a chenyl group, a pyridyl group, a piperidyl group, a piperidino group, a morpholino group, an indolyl group, and an alkyl group substituted by these heterocyclic groups. Suitable examples include a pyridyl group and an indoyl group.
  • R further represents a halogen atom, a hydroxyl group, an alkyl group having up to 3 carbon atoms, a carbon number of up to 3
  • R represents an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms or a hydrogen atom, and alkyl having 1 to 3 carbon atoms.
  • Groups include ethyl, methyl, npropyl and isopropyl groups.
  • the compound represented by the general formula (I) can be obtained by various oximation reactions for converting a CO group corresponding to a hydroxyimino group into a CNOH group. More specifically, it can be obtained by the methods described in, for example, International Publication No. 2003Z056026 Pamphlet, International Publication No. 2004,018672 Pamphlet, International Publication No. 2003Z059865 Pamphlet and the like.
  • R represents a hydrogen atom, an alkyl group, an aryl group or an aralkyl group.
  • reaction is carried out by reacting the amine compound represented by the formula (1) or a salt thereof.
  • R is
  • R When it is an alkyl group, an aryl group or an aralkyl group, R has 13 carbon atoms.
  • R is selected from methyl and benzyl groups.
  • An oximation reaction can be performed.
  • hydroxylamine hydrochloride can be oximed by adding it to a solution containing a keto compound under mildly alkaline conditions and stirring for 0.5 to 60 hours at room temperature to 10 ° C. Can do.
  • the pH of the oximation reaction is preferably 6 to 10, more preferably pH 7 to 9.
  • the conditions of the reaction system using microorganisms and sputum or enzymes should be appropriately adjusted according to the specific types of microorganisms, enzymes and raw materials used.
  • the amount of microorganisms and sputum or enzyme used should be an amount that exhibits the desired effect (effective amount). This effective amount can be easily determined by a person skilled in the art through simple preliminary experiments. When used, about 0.01 to 100 units (U) is preferable, and when using washed cells, about 0.1 to 500 gZL is preferable.
  • the reaction temperature is usually within the range in which the enzyme used is active, that is, preferably at a temperature of 10 to 50 ° C, more preferably 20 to 40 ° C, more preferably 25 to 37 ° C. Is called.
  • the pH value of the enzyme reaction solution is usually adjusted in the range of 2 to 12, preferably 7 to 11, and more preferably 8 to 9.
  • NADH, NAD PH, pyridoxal-5'-phosphate (hereinafter also referred to as PLP), and MgCl force are selected in the reaction solution.
  • At least one of the compounds to be added can be added. By covering these additives, the amount of the amino acid derivative represented by the general formula ( ⁇ ) can be increased.
  • the combination of the above four types of additives may be appropriately adjusted according to the type of microorganism, etc., more preferably a form containing at least three types of NADH, NADPH and PLP, and more preferably The form which contains all four types of additives is mentioned.
  • the preferable compounding quantity of each additive in a reaction liquid is as follows.
  • NADH is preferably 0.01 to 200 mM, more preferably 0.1 to 50 mM.
  • NADPH is preferably 0.01 to 200 mM, more preferably 0.1 to 50 mM.
  • MgCl preferably 0
  • PLP Preferably it is 0.01-10 mM, More preferably, it is 0.1-lmM.
  • an amino acid derivative in which R is a group containing an aromatic ring or a heterocyclic ring is used.
  • the compound of general formula (I) is IHO G-oxime.
  • the compound represented by the general formula (I) is IP A-oxime (indole-13-pyruvate monooxime).
  • the compound represented by the general formula (I) is BAE-oxime (3-hydroxyimino-3-phenylpropionic acid methyl ester, 3-hydroxyimino-3-phenyl-propionic. acid methyl ester).
  • BAE is an abbreviation for benzoyl acetate ethyl ester.
  • monatin was quantified by high performance liquid chromatography using “Inertsil ODS-80A” (5 m, 6 ⁇ 150 mm) manufactured by GL Sciences.
  • the analysis conditions are as shown below.
  • (2S, 4S) -monatin and (2R, 4R) -monatin are 12.1 minutes
  • (2S, 4R) -monatin and (2R, 4S) -monatin are 9.7 minutes Separation and quantification are possible with the retention time of.
  • Mobile phase perchloric acid aqueous solution (pHl. 5) ZlO% (vZv) methanol;
  • monatin optical isomers are (2R, 4S), (2R, 4R), (2S, 4R), and (2S, 4S) in this order, 42 minutes, 57 minutes, 64 minutes, and 125 minutes. Separation can be done with retention time.
  • Ammonium salt 1 Og produced according to Production Example 1 was dissolved in 20 ml of water, and 100 ml of cation exchange resin DIAION PK228 (potassium type, After passing through a column packed with (Mitsubishi Chemical Co., Ltd.) and exchanging it with the desired ion, the eluent was concentrated to 20 g and 4 hydroxy-4- (3-indylmethyl) 2-hydroxyiminodaltaric acid 2 An aqueous potassium salt solution was obtained.
  • IHOG oxime 4-Hydroxy-1- (3-indolylmethyl) 2-hydroxyiminoglutaric acid
  • a test microorganism (bacteria or yeast) was inoculated on a bouillon plate medium (manufactured by Eiken-Igaku) and cultured at 30 ° C for 24 hours.
  • Glycerol 0.5 gZdl, fumaric acid 0.5 g / dl, yeast extract 0.3 gZdl, peptone 0.2 gZdl, ammonium sulfate 0.5 g / dl, K HPO 0.3 g / dl
  • Reaction solution l 100 mM Tris—HCl (pH 8.0), 50 mM IHOG—oxime ⁇ 2 ammonium salt, ImM MgCl, lmM pyridoxallo-5-phosphate (PLP), 20 mM NAD
  • Reaction solution 2 100 mM Glycine-NaOH (pH 9.0), 50 mM IHOG—Oximium ⁇ 2 strength Lithium salt, ImM MgCl, lmM Pyridoxal 5, —Phosphate (PLP), 25 mM NA DH, 25 mM NADPH, 1% ( ⁇ ) toluene
  • Reaction solution 3 100 mM Glycine-NaOH (pH 9.0), 50 mM IHOG—Oxime 2 power Lithium salt, 1% ( ⁇ ) Toluene
  • Citrobacter freunan [FO 13546 11. 30 6. 47 tzschencnia intermedia AJ 2607 11. 65 6. 79 cscnenc / a coli ATCC 13070 1. 01 0. 54
  • reaction liquids (reaction liquids 4 to 9) having the compositions shown in Table 3 were prepared, and the IHOG-oxime reduction reaction was carried out in the same manner as in the method shown in Example 1 to quantify the produced monatin.
  • Citrobacter freundii IFO on bouillon plate medium (Eiken Chemical)
  • Reaction solution 10 100 mM Glycine-NaOH (pH 9.0), 50 mM IPA-oxime, lm M MgCl, lmM pyridoxarloo 5, phosphoric acid (PLP), 25 mM NADH, 25 mM
  • Citrobacter freunan IFO 13546, Escherichia intermedia AJ2oO / Test strains Solution 11 was inoculated and allowed to react at 30 ° C for 24 hours.
  • Reaction solution l l 100 mM Glycine-NaOH (pH 9.0), 50 mM BAE-oxime, lm M MgCl, lmM pyridoxarloo 5, phosphoric acid (PLP), 25 mM NADH, 25 mM
  • Escherichia intermedia AJ 2607 was cultured in the same manner as in Example 4 to obtain wet cells.
  • the following reaction solution 1 is used so that the obtained bacterial mass is about 1% (WZV) by the wet bacterial mass.
  • Reaction solution 12 100 mM Glycine—NaOH (pH 9.0), 50 mM 15 N-labeled IPA—oxime, ImM MgCl 2, lmM pyridoxal-5, -phosphate (PLP), 25 mM NAD
  • N-labeled IPA-oxime was prepared as follows. Under an argon stream, 1.413 g (6.95 mmol) of indolepyruvic acid and 0.913 ml of 8NNaOH were dissolved in 60 ml of water at 25 ° C and dissolved. 15 NH OH hydrochloride 0.5 g (7.09 mmol) and 8N
  • the present invention is useful in the production of various amino acid derivatives.

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Description

明 細 書
ヒドロキシィミノ酸からのアミノ酸誘導体製造方法
技術分野
[0001] 本発明はヒドロキシィミノ酸力もアミノ酸誘導体を製造する方法に関し、詳しくは、ヒ ドロキシィミノ酸から酵素的還元によりアミノ酸誘導体を製造する方法に関する。 背景技術
[0002] アミノ酸は医薬品、食品、試薬類、化学合成中間体等として、産業上極めて重要な 成分である。アミノ酸の製造方法としては、抽出法、発酵法、酵素法、化学合成法の 4つに大別される。このうち酵素法は、 目的とするアミノ酸に構造の近い前駆体を原 料として 1〜数段階の酵素反応で一気にアミノ酸に転換させる方法である。酵素法は 、一般的に副生物が少なぐ高純度のアミノ酸を得ることができる。また、酵素法は、 基質となる前駆物質が安価に入手できる場合には極めて効率的な製造法である。
[0003] アミノ酸誘導体の 1種であるモナティン（Monatin)は、南アフリカの灌木の根から単 離'抽出された天然の甘味アミノ酸である。モナティンは、ショ糖の数十倍から数千倍 に相当する強 、甘味を有し、甘味剤として利用が期待されて 、る。
[0004] モナティンの製造方法に関しィ匕学合成法としては、例えば、インドール酢酸誘導体 とァスパラギン酸の酸ハロゲンィ匕物を原材料としてケトン誘導体を合成し、さらにシァ ノヒドリン誘導体を得て、これを塩基性条件下で加水分解する方法がある（例えば特 許文献 1)。また酵素法としては、例えば、インドールー 3 ピルビン酸 (IPA)から中 間体として 4— (インドール一 3—ィルメチル） 4 ヒドロキシ一 2—ォキソグルタル酸 (4— (Indol- 3 -ylmethyl)—4— hydroxy— 2— oxoglutarate ;IHOGともいう） を生成し、さらに酵素存在下でモナティンを生成する方法がある（例えば特許文献 2) 。さらに、上記 IHOGを酵素の存在下で生成する方法も知られている（例えば特許文 献 3)。
[0005] IHOGからモナティンを生成する他の方法として、例えば、 IHOGから中間体として IHOG -ォキシム（IHOG - oximeまたは 4 -ヒドロキシ 4— (3—インドリルメチル） 2—ヒドロキシィミノダルタル酸）を生成し、さらにロジウムなどの還元触媒の存在下 でモナティンに変換する方法がある（例えば特許文献 4)。しかし、 IHOGより安定性 の高い IHOG—ォキシムから、微生物または酵素の存在下でモナティンを生成する 方法につ ヽては知られて ヽな 、。
[0006] 才キシム (ヒドロキシィミン)を微生物または酵素を用いて還元すること (酵素的還元) については、特許文献 5、非特許文献 1〜4などに記載がある。例えば、特許文献 5 には、ァセトフエノンォキシムから α メチルベンジルァミンを製造する方法が記載さ れている。しかし、ヒドロキシィミノ酸を微生物または酵素の存在下で還元し、アミノ酸 を生成する方法にっ ヽては全く知られて ヽな 、。
[0007] 特許文献 1 :特開 2003— 171365号公報
特許文献 2：国際公開第 2003Ζ056026号パンフレット
特許文献 3：国際公開第 2004Z018672号パンフレット
特許文献 4 :国際公開第 2003Ζ059865号パンフレット
特許文献 5：特開平 4 23499号公報
非特許文献 1 : Pharmacology, 13, 234 (1975)
j¾2 : Clement et al. , Arch, der Parmazie, 321, 955 (1988) 非特許文献 3 : Clement et al. , JBC, 272, 19615 (1997)
非特許文献 4 : Gibbs et al. , Tetrahedron Lett. , 31 , 555 (1990) 発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0008] 化学合成によるアミノ酸誘導体の製造方法は、単離 ·抽出が困難なアミノ酸誘導体 である場合などに有用であるが、反面、設備費が高くなりやすいことや高価な触媒を 用いなければならないなど、工業的生産レベルではコスト面で不利な場合も多い。こ れに対して、アミノ酸誘導体の製造にあっては微生物または酵素を用いた方法はェ 業的に有用な場合が多い。上記のような状況の下、本発明は、工業的に有利なアミ ノ酸誘導体の製造方法を提供することを課題とする。
課題を解決するための手段
[0009] 本発明者らは、モナティン等のアミノ酸誘導体の新たな製法にっ ヽて鋭意研究を 進めたところ、ヒドロキシィミノ酸を微生物および Zまたは酵素を用いて還元し、ァミノ 酸誘導体を生成する方法を見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は、下 記アミノ酸誘導体の製造方法を提供するものである。
〔1〕下記一般式 (I)
[化 1]
0H
Figure imgf000005_0001
(一般式 (I)において、 Rはそれぞれ置換基を有していてもよい炭素数 2〜6のアル
1
キル基、炭素数 6〜14のァリール基、炭素数 6〜 10のシクロアルキル基、炭素数 7へ 19のァラルキル基、炭素数 2〜10のアルコキシアルキル基、またはこれらの炭素骨 格中にヘテロ原子を含む基、および下記一般式 (II)
[化 2]
Figure imgf000005_0002
で示される置換基 R
3から選択される置換基を表す。ここに、 R
4はそれぞれ置換基を 有していてもよい炭素数 2〜6のアルキル基、炭素数 6〜 14のァリール基、炭素数 6 〜 10のシクロアルキル基、炭素数 7〜 19のァラルキル基、炭素数 2〜 10のアルコキ シアルキル基、またはこれらの炭素骨格中にヘテロ原子を含む基力 選択される置 換基を表す。 Xおよび Xは相互に独立して水酸基またはカルボ二ル基を表す。 Rは
1 2 2 炭素数 1〜3のアルキル基または水素原子を表す。 nは 0または 1である。 ) で示されるヒドロキシィミノ酸から、
下記一般式 (III)
Figure imgf000006_0001
(一般式 (III)において、 Rおよび nは、一般式 (I)における R、 nと同義である。）
1 1
で示されるアミノ酸誘導体を生成する反応を触媒する微生物および Zまたは酵素の 存在下で、当該反応を実施することにより、前記一般式 (in)のアミノ酸誘導体を生成 することを特徴とするアミノ酸誘導体の製造方法。
〔2〕前記 nが 0であり、生成するアミノ酸誘導体が α アミノ酸誘導体である上記〔1〕 に記載の製造方法。
〔3〕生成するアミノ酸誘導体が、 oc L アミノ酸である上記〔1〕または〔2〕に記載の 製造方法。
〔4〕生成するアミノ酸誘導体が、 oc D アミノ酸である上記〔1〕または〔2〕に記載の 製造方法。
〔5〕前記 ηが 1であり、生成するアミノ酸誘導体が j8—アミノ酸誘導体である上記〔1〕 に記載の製造方法。
〔6〕前記ァリール基力 置換基を有して 、てもよ 、フエニル基またはナフチル基であ る、上記〔1〕から〔5〕の 、ずれか一項に記載の製造方法。
〔7〕前記ァラルキル基力 置換基を有して!/、てもよ 、フエ-ルアルキル基またはナフ チルアルキル基である、上記〔1〕から〔5〕の 、ずれか一項に記載の製造方法。 〔8〕前記炭素骨格にヘテロ原子を含む基が、置換基を有して!/ヽてもよ ヽピリジル基ま たはインドイル基である、上記〔1〕から〔5〕の 、ずれか一項に記載の製造方法。 〔9〕下記一般式 (IV)
[化 4]
Figure imgf000006_0002
で示される IHOG—ォキシムから、 下記一般式 (V)
[化 5]
Figure imgf000007_0001
H
で示されるモナティンを生成する反応を触媒する微生物および Zまたは酵素の存 在下で、当該反応を実施することによりモナティンを生成することを特徴とする、モナ ティンの製造方法。
〔10〕下記一般式 (VI)
[化 6]
Figure imgf000007_0002
で示される BAE—ォキシムから 13 フエ二ルァラニンを生成する反応を触媒する微 生物および Zまたは酵素の存在下で、当該反応を実施することにより j8—フエニルァ ラニンを生成することを特徴とする、 β—フエ二ルァラニンの製造方法。
〔11〕下記一般式 (VII)
[化 7]
Figure imgf000007_0003
で示されるインドールー 3—ピルビン酸ーォキシムからトリプトファンを生成する反応を 触媒する微生物および Ζまたは酵素の存在下で、当該反応を実施することによりトリ ブトファンを生成することを特徴とする、トリブトファンの製造方法。
〔12〕微生物力 シトロパクター（Citrobacter)属、ェシエリヒア（Escherichia)属、お よびロドコッカス（Rhodococcus)属からなる群より選ばれるいずれかの属に属ずる 細菌の 1種または 2種以上であることを特徴とする、上記〔1〕から〔11〕の 、ずれか一 項に記載の製造方法。
〔13〕微生物が、 Citrobacter freundii (シトロパクター フルーンジ）、 Escherichi a intermedia (ェシエリヒア インターメディア)、 Escherichia coli (ェシエリヒア コ リ)、および Rhodococcus marinonascens (ロドコッカス マリノナシーンズ)からな る群力も選ばれることを特徴とする、上記〔1〕から〔12〕のいずれか一項に記載の製 造方法。
〔14〕一般式 (I)で示される化合物から一般式 (III)で示される化合物を生成する反 応を行う反応液中に、 NADH、 NADPH、ピリドキサール 5，一リン酸、および Mg C1力 なる群力 選ばれる化合物のうち、少なくとも一つを添加することを特徴とする
2
上記〔 1〕から〔 13〕の 、ずれか一項に記載の製造方法。
発明の効果
[0011] 本発明によれば、簡便で、コスト的にも有利なアミノ酸の製造方法が提供される。
発明を実施するための最良の形態
[0012] 本発明のアミノ酸誘導体の製造方法は、所定の微生物および Zまたは酵素の触媒 作用により上記一般式 (I)のヒドロキシィミノ酸を上記一般式 (ΠΙ)の化合物に変換す る。本明細書においてアミノ酸誘導体には、アミノ酸そのものおよびその誘導体を含 む。
[0013] 本発明で用いられるこの反応を触媒する能力を有する微生物としては、好ましくは 、シトロパクター（Citrobacter)属、ェシエリヒア（Escherichia)属、コリネバタテリゥム (Corynebacterium)属、ロドコッカス (Rhodococcus) J¾、サノレモネフ (Salmonella )属、およびァーウイ-ァ（Erwinia)属カ なる群より選ばれるいずれかの属に属する 細菌などが挙げられる。より具体的には好ましい微生物として、 Citrobacter freun dii (シトロノくクタ一 フノレーンジ)、 Citrobacter intermedius (シトロノくクタ一 イン ターメディアス）、 Escherichia intermedia (ェシエリヒア インターメディア）、 Esch erichia coli (ェシエリヒア コリ)、 Corynebacterium equi (コリネノ クテリゥム ェ クイ)、 Rhodococcus marinonascens (ロドコッ 7ス マリノナシーンズ)、 Salmone 11a sp. (サノレモネラ エスピー.）、 Erwinia amylovora (ァーウイ-ァ アミ口ボラ） 、および Salmonella enteritidis (サルモネラ ェンテリチヂス）などが挙げられる。
[0014] さらに具体的には、好ましい微生物として次の菌株が例示される。下記に菌株名お よびその寄託先等につ!、て示す。
[0015] (l) Citrobacter freundii IFO 13546
(i)受託番号： IFO 13546
(iii)寄託先 (住所）：独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部 生物遺伝資源部門（〒292— 0818 日本国千葉県木更津巿かずさ鎌足 2— 5— 8) [0016] (2) Escherichia intermedia AJ 2607
(i)受託番号： FERM BP- 10401 (FERM P— 20215より移管）
(ii)原寄託日： 2004年 9月 8日
(iii)寄託先 (住所）：独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター (〒 305— 8566 日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6)
[0017] (3) Escherichia coli ATCC 13070
(i)受託番号: ATCC 13070
(iii)寄託先（住所）：アメリカン'タイプ'カルチャ^ ~ ·コレクション（American Type Culture Collection, P. O. Box 1549 Manassas, VA 20110, USA) [0018] (4) Escherichia coli ATCC 12814
(i)受託番号: ATCC 12814
(iii)寄託先（住所）：アメリカン'タイプ'カルチヤ一'コレクションに. O. Box 1549 Manassas, VA 20110, USA)
[0019」 (5) Rhodococcus marinonascens AJl 10354
(i)受託番号： FERM BP- 10400 (FERM P— 20213より移管）
(ii)原寄託日： 2004年 9月 8日
(iii)寄託先 (住所）：独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター (〒 305— 8566 日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6)
[0020] 本発明で用いられる酵素は、上記微生物などから単離 ·精製することができる。また 、「微生物および Zまたは酵素の存在下で」とは、一般式 (I)で示されるヒドロキシイミ ノ酸を一般式 (III)で示されるアミノ酸誘導体に変換する反応系に微生物および Zま たは酵素を存在させることを意味する。「微生物および Zまたは酵素」は、本発明の 所望の活性を有する限り、その由来及び調製方法等に特に制限はない。微生物とし ては、前述した本発明の反応を媒介する微生物に加え、反応を媒介する酵素をコー ドする遺伝子 (組み換え遺伝子を含む）により形質転換された宿主微生物、あるいは 該宿主微生物が生産する酵素を使用することもできる。すなわち、一般式 (I)で示さ れるヒドロキシィミノ酸を一般式 (ΠΙ)で示されるアミノ酸誘導体に変換する限り!/ヽかな る形態で微生物および Zまたは酵素を反応系に存在させてもよい。また、微生物お よび酵素は 、ずれか一方を単独で用いてもょ 、し、双方が混在してもよ ヽ。
[0021] 本発明の製法で用いられる「微生物および Zまたは酵素」としては次のような形態 をとり得る。具体的形態としては、上記微生物の培養物、当該培養物から分離された 微生物菌体、菌体処理物などが含まれる。微生物の培養物とは、微生物を培養して 得られる物のことであり、より具体的には、微生物菌体、その微生物の培養に用いた 培地および培養された微生物により生成された物質の混合物などのことを 、う。また 、微生物菌体は洗浄し、洗浄菌体として用いてもよい。また、菌体処理物には、菌体 を破砕、溶菌、凍結乾燥したものなどが含まれ、さらに菌体などを処理して回収され る粗精製酵素、さらに精製した精製酵素なども含まれる。精製処理された酵素として は、各種精製法によって得られる部分精製酵素等を使用してもよいし、これらを共有 結合法、吸着法、包括法等によって固定ィ匕した固定ィ匕酵素を使用してもよい。また、 使用する微生物によっては、培養中に一部、溶菌するものもあるので、この場合には 培養液上清も上述の「微生物および Zまたは酵素」として利用できる。
[0022] また、本発明の製法で用いられる「微生物および Zまたは酵素」としては、上記一般 式 (I)で示されるヒドロキシィミノ酸を一般式 (ΠΙ)で示されるアミノ酸誘導体に変換す る酵素を発現した遺伝子組換え株を用いてもよいし、アセトン処理菌体、凍結乾燥菌 体等の菌体処理物を使用してもよいし、これらを共有結合法、吸着法、包括法等によ つて固定ィ匕した固定ィ匕菌体、固定ィ匕菌体処理物を使用してもよい。
[0023] 本発明の製造方法では、一般式 (I)で示されるヒドロキシィミノ酸を出発物質とする 反応を行う。一般式 (I)おける R
1はより具体的には下記のものが例示される。
[0024] Rが炭素数が 2〜6のアルキル基である場合とは、具体例を示すと、ェチル基、 nプ 口ピル基、イソプロピル基、 nブチル基、イソブチル基、 secブチル基、 tertブチル基、 n ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、 nへキシル基、イソへキシル基などが 含まれる。
[0025] また、 Rが炭素数 6〜 14のァリール基である場合とは、具体例を示すと、フ ニル
1
基、トリル基、キシリル基、ビフヱ-リル基、ナフチル基、アントリル基、フヱナントリル基 などが含まれ、好適なものとしてはフエ-ル基、ナフチル基などが挙げられる。
[0026] Rが炭素数 6〜 10のシクロアルキル基である場合とは、具体例を示すと、シクロへ
1
キシル基、シクロヘプタ-ル基、シクロォクタ-ル基、シクロノナ-ル基、シクロデ力- ル基などが含まれる。
[0027] Rが炭素数が 7〜 19のァラルキル基である場合とは、具体例を示すと、ベンジル基
1
、ベンズヒドリル基、フエネチル基、トリチル基などのフエ-ルアルキル基、シンナミル 基、スチリル基、並びにナフチルアルキル基などが含まれ、好適なものとしてはフエ- ルアルキル基、ナフチルアルキル基などが挙げられる。
[0028] Rが炭素数 2〜： L 1のアルコキシアルキル基である場合とは、具体例を示すと、炭素
1
数 1〜10のアルキル基に、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、 ブトキシ基、ペンチルォキシ基、フエノキシ基、ヘプトキシ基、オタトキシ基、ノナノキシ 基、デカノキシ基、およびゥンデコキシ基力 選ばれる基が置換されたものを含む。
[0029] Rが炭素骨格中にヘテロ原子を含む基の一形態には、複素環含有炭素水素基が
1
含まれる。複素環含有炭化水素基とは、環式化合物の環にヘテロ原子を含む環系 炭化水素基である。複素環含有炭化水素基としてはへテロァリール基などが含まれ 、芳香族性の有無には限定されず、また単環式であっても多環式であってもよい。複 素環含有炭化水素基として具体的には、フリル基、チェニル基、ピリジル基、ピベリジ ル基、ピペリジノ基、モルホリノ基、インドリル基、さらには、これらの複素環基により置 換されたアルキル基等が含まれ、好適なものとしてはピリジル基、インドイル基などが 挙げられる。
[0030] 上記 Rは、さらに、ハロゲン原子、水酸基、炭素数 3までのアルキル基、炭素数 3ま
1
でのアルコキシル基、およびアミノ基力 選ばれる少なくとも一種の置換基などにより 置換されていてもよい。 [0031] Rは、炭素数 1〜3のアルキル基または水素原子を表し、炭素数 1〜3のアルキル
2
基にはェチル基、メチル基、 nプロピル基、イソプロピル基が含まれる。
[0032] Rのアルキル基、ァリール基、シクロアルキル基、ァラルキル基、アルコキシアルキ
4
ル基、これらの炭素骨格中にヘテロ原子を含む基、およびさらにこれらが有していて もよい置換基は上記 Rの場合と同様である。
1
[0033] 一般式 (I)で示される化合物は、ヒドロキシィミノ基に対応する CO基を CNOH基に 変換する各種のォキシム化反応等によって得られる。より具体的には、例えば、国際 公開第 2003Z056026号パンフレツ卜、国際公開第 2004,018672号パンフレツ卜 、国際公開第 2003Z059865号パンフレットなどに記載の方法によって得ることが できる。
[0034] ォキシム化 (ヒドロキシィミノ化）の方法としては、中性又はアルカリ性条件下におい て、対応するケト体に対して、下記一般式 (VIII)
[0035] [化 8]
H2N-OR5 - - - (VIII)
[0036] (上記一般式 (VIII)にお 、て、 Rは水素原子、アルキル基、ァリール基又はァラルキ
5
ル基を表す。 )
に表されるァミン化合物又はその塩とを反応せしめることによって行う。ここに、 Rが
5 アルキル基、ァリール基又はァラルキル基である場合、 Rは炭素原子を 1 3有する
5
アルキル基、ァリール基またはァラルキル基が好ましぐ結晶化の観点力 より好まし くは、 Rはメチル、ベンジル基から選択される。
5
[0037] より簡便には、一般式 (VIII)にお 、て Rが水素原子であるヒドロキシァミンを用いて
5
ォキシム化反応を行うことができる。一例を挙げると、ヒドロキシルァミン塩酸塩を中性 力も弱アルカリ条件下でケト体を含む溶液に添加し、室温から 10°C程度の条件で 0.5 〜60時間攪拌することにより、ォキシム化することができる。ォキシム化反応の pHは 好ましくは 6〜10、より好ましくは pH7〜9で行うことができる。ケト体のォキシム化反応 の条件には特段の制限は無ぐ当該業者であれば簡単な予備検討によって、ォキシ ム化反応条件を決定することができる。
[0038] 本発明の製造方法にお!、ては、上記一般式 (I)で示される化合物が変換されて上 記一般式 (ΠΙ)で示される化合物を得る。 R等および nの定義は一般式 (ΠΙ)につい
1
ても上記一般式 (I)と同様である。
[0039] 一般式 (I)において、 n力^である場合には一般式 (ΠΙ)の化合物として α アミノ酸 誘導体が得られる。また、 ηが 1である場合には、 β アミノ酸誘導体が得られる。ま た、一般式 (I)の化合物について L体または D体を選択すること等の手法により、一般 式 (ΠΙ)の化合物にっ 、ても L体または D体を生成し得る。また L体および D体の混合 物として得られる場合には、混合物カゝらいずれか一方を単離 '精製してもよい。
[0040] 微生物および Ζまたは酵素を用いる反応系の条件は、用いる微生物、酵素および 原材料の具体的な種類などによって適宜調整してょ 、。微生物および Ζまたは酵素 の使用量は、目的とする効果を発揮する量 (有効量)であればよぐこの有効量は当 業者であれば簡単な予備実験により容易に求められるが、例えば酵素を用いる場合 には、 0. 01から 100ユニット (U)程度、洗浄菌体を用いる場合は 0. l〜500gZL程 度が好適である。反応温度については、通常、利用する酵素が活性を有する範囲内 、即ち好ましくは 10〜50°Cで行われる力 より好ましくは 20〜40°C、更に好ましくは 25〜37°Cの範囲で行われる。酵素反応液の pH値については、通常、 2〜12、好ま しくは 7〜11、より好ましくは 8〜9の範囲で調節される。
[0041] また、本発明の製造方法の好ま ヽー実施形態として、反応液中に NADH、 NAD PH、ピリドキサール— 5'—リン酸 (以下、 PLPとも記す）、 MgCl力もなる群から選ば
2
れる化合物のうち、少なくとも一つを添加することができる。これらの添加物をカ卩えるこ とにより、一般式 (ΠΙ)で示されるアミノ酸誘導体の生成量を増加させることができる。
[0042] 上記 4種の添加物の組み合わせは微生物等の種類により適宜調整してよぐより好 ましくは少なくとも NADH、 NADPHおよび PLPの 3種を含む形態が挙げられ、さら に好ましくは上記の 4種の添加物をすベて含む形態が挙げられる。また、反応液中に おける各添加物の好ましい配合量は次の通りである。 NADHについては、好ましく は 0.01〜200mM、より好ましくは 0.1〜50mMである。 NADPHについては、好ましく は 0.01〜200mM、より好ましくは 0.1〜50mMである。 MgClについては、好ましくは 0
2
.01〜10mM、より好ましくは 0.1〜lmMである。 PLPについては、好ましくは 0.01〜10 mM、より好ましくは 0.1〜lmMである。 [0043] 本発明の製造方法は、 Rが芳香環または複素環を含む基であるアミノ酸誘導体の
1
製造に好適であり、より好ましくはモナティン、トリブトファン、フエ-ルァラニンなどの 製造に適用される。モナティンの製造の場合、一般式 (I)で示される化合物は、 IHO G—ォキシムである。トリブトファンの製造の場合、一般式 (I)で示される化合物は、 IP A—ォキシム (インドール一 3—ピルビン酸一ォキシム）である。また、フエニルァラ- ンの製造の場合、一般式 (I)で示される化合物は、 BAE—ォキシム（3—ヒドロキシィ ミノ— 3—フエ-ルプロピオン酸メチルエステル、 3 - hydroxyimino— 3— phenyl - propionic acid methyl ester)である。なお、 BAEは、ベンゾイノレアセタートェチ ノレエステノレ（benzoyl acetate ethyl ester)の略称である。
実施例
[0044] 以下、本発明の実施例について説明するが、本発明は下記実施例に限定されるも のではない。
本実施例において、モナティンの定量は、ジーエルサイエンス社製「Inertsil ODS— 80A」（5 m、 6 X 150mm)を利用した高速液体クロマトグラフィーにより 行った。分析条件は、以下に示す通りである。
[0045] 移動相： 12% (v/v)ァセトニトリル Z0. 05% (ν/ν)トリフルォロ酢酸水溶液； ： 1. 5ml/ mm；
カラム温度： 30°C ;および
検出： UV210nm
[0046] 本分析条件により、 (2S, 4S)—モナティンおよび（2R, 4R)—モナティンは 12. 1 分に、（2S, 4R)—モナティンおよび（2R, 4S)—モナティンは 9. 7分のリテンション タイムにて分別定量ができる。
[0047] また、必要に応じて、ダイセルィ匕学工業製光学分割カラム「CROWNPAK CR(
+ )」（4. 6 X 150mm)を利用した高速液体クロマトグラフィーによる分析も行った。 分析条件は以下に示す通りである。
[0048] 移動相：過塩素酸水溶液 (pHl. 5)ZlO% (vZv)メタノール；
流速： 0. 5mレ min;
カラム温度： 30°C ;および 検出： UV210nm
[0049] 本条件によりモナティン光学異性体は（2R, 4S)、 (2R, 4R)、 (2S, 4R)、および（ 2S, 4S)の順に 42分、 57分、 64分、および 125分のリテンションタイムにて分別定 量ができる。
[0050] 製造例 1 IHOG—ォキシム 2アンモ-ゥム塩（4 ヒドロキシ— 4— (3—インドリルメ チル） 2—ヒドロキシイミノグルタル酸 2アンモ-ゥム塩）の製造
1. 6wt0 /。水酸化ナトリウム水溶液 917gに、インドール— 3 ピルビン酸 73. 8g (35 2ミリモル)を加えて溶解した。反応溶液を 35°Cとし、 30%水酸ィ匕ナトリウム水溶液を 用いて pH値を 11. 1に保ちながら、 50%ピルビン酸水溶液 310. 2g (1761ミリモル） を 2時間かけて滴下した。更に 4. 5時間反応させて、 4ーヒドロキシー4一（3 インド リルメチル） 2 ケトグルタル酸を含有する反応溶液を得た。これに、 30%水酸ィ匕 ナトリウム水溶液にて pH値を 7に保ちながら、 40%ヒドロキシルァミン塩酸塩水溶液 3 67. 2g (2114ミリモル)を加え、 5°Cにて 17. 5時間攪拌した。濃塩酸を用いて反応 液の pH値を 2にし、有機物を酢酸ェチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し 、濃縮して残渣を得た。残渣に 28%アンモニア水 60mlと 2 プロパノール 1350ml から再結晶を行い、 4 ヒドロキシ一 4— (3—インドリルメチル） 2 ヒドロキシィミノ グルタル酸の 2アンモ-ゥム塩 43. 4g ( 142ミリモル：収率 40% 対インドール— 3— ピルビン酸)を結晶として得た。
[0051] 製造例 2 IHOG—ォキシム 2カリウム塩（4 ヒドロキシ— 4— (3—インドリルメチル )一 2—ヒドロキシィミノダルタル酸 2カリウム塩)の製造
製造例 1に従って製造した 4 ヒドロキシ— 4— (3—インドリルメチル） 2 ヒドロキ シイミノグルタル酸 2アンモ-ゥム塩 1 Ogを水 20mlに溶解し、 100mlの陽イオン交換 榭脂 DIAION PK228 (カリウム型、三菱ィ匕学製)を充填したカラムに通液して所 望のイオンに交換した後、溶離液を 20gまで濃縮し 4 ヒドロキシ— 4— (3—インドリ ルメチル） 2—ヒドロキシィミノダルタル酸 2カリウム塩水溶液を得た。
[0052] 製造例 3 インドールピルビン酸ォキシムの製造
インドールピルビン酸 4. 06g (0. 02モル）及び 85%水酸ィ匕カリウム 1. 32g (0. 02 モノレ）を水 50ml【こ溶解し、これ【こ塩酸ヒドノレキシノレアミン 1. 53g (0, 022モノレ）をカロ えた。さらに 85%水酸ィ匕カリウム 1. 45g (0. 022モル)を加え、室温下に 1夜攪拌し た。反応液に塩酸を加え pH2に調整し、析出した結晶を濾取した。得られた湿結晶 を乾燥しインドールピルビン酸ォキシム 3. 34gを得た。インドールピルビン酸に対す る収率は 76. 5%であり、 ESI— MS : 219. 1 [M+H]+のシグナルが得られた。
[0053] 製造例 4 ベンゾィル酢酸ェチルエステルオキシムの製造
ベンゾィル酢酸ェチルエステル 3. 84g (0. 02モル）を MeOH50mlに溶解し、これ 【こ塩酸ヒドロキシノレアミン 1. 53g (0. 022モノレ）をカロえた。トリエチノレアミン 2. 23g (0 . 022モル)を加え、室温下に 1夜攪拌した。反応液を減圧下に濃縮し、残渣に水を 加え析出した結晶を濾取した。乾燥しベンゾィル酢酸ェチルエステルオキシム 3. 27 gを得た。ベンゾィル酢酸ェチルエステルに対する収率は 78. 9%であり、 ESI-MS : 208. 2[M+H]+のシグナルが得られた。
[0054] (分析条件）
ガードカラム： Shodex IC YK— G (昭和電工製）
カラム ： Shodex IC YK—421 (昭和電工製）
検出 ：電気伝導度検出器
溶離液 ：4mM燐酸 + 5mM18— Crown— 6
Figure imgf000016_0001
分析温度 ：40°C
[0055] 実施例 1 IHOG—ォキシム還元活性菌の採取
4 ヒドロキシ一 4— (3—インドリルメチル） 2 ヒドロキシイミノグルタル酸（IHOG ォキシム： IHOG oxime)を基質としてモナティンを生成する IHOG ォキシム 還元活性菌株の採取を実施した。
[0056] ブイヨン平板培地 (栄研ィ匕学製）に供試微生物 (細菌または酵母)を接種し、 30°C で 24時間培養した。得られた培養物をグリセロール 0. 5gZdl、フマル酸 0. 5g/dl 、酵母エキス 0. 3gZdl、ペプトン 0. 2gZdl、硫安 0. 5g/dl, K HPO 0. 3g/dl
2 4
、 KH PO 0. lg/dl、 MgSO - 7H O 0. 05g/dl、 IHOG—ォキシム · 2アンモ-
2 4 4 2
ゥム塩 0. 2gZdl、寒天末 2gZdl(pH6. 5)を含むプレートに接種し、 30°Cで 24時 間培養した。得られた菌体を湿菌体重量で約 1% (WZV)となるように、以下の 2種類 の反応液にそれぞれ接種し、 30°Cで 24時間反応させた。
[0057] 反応液 l : 100mM Tris— HCl (pH 8. 0)、50mM IHOG—ォキシム · 2アンモ- ゥム塩、 ImM MgCl、 lmM ピリドキサールー5，ーリン酸（PLP)、20mM NAD
2
H、 20mM NADPH, l% (v/v) トルエン
[0058] TLCを用いて生成モナティンの定性分析を行った。反応液 1 μ 1を TLCプレートシリ 力ゲル 60F254 (Merck製）にスポットし、 n—ブタノール：酢酸：水 =4： 1： 2に混合し た溶液を用いて展開後、ニンヒドリン発色を行った。モナティンはおおよそ Rf=0. 39 の位置にピンク色のスポットとして検出できる。
[0059] モナティンの生成が認められた反応液を HPLC分析に供して、生成モナティンを定 量分析した。その結果、表 1に示す菌株においてモナティンの生成が認められ、即ち IHOG—ォキシム力 微生物変換にてモナティンを生成せしめることが出来た。
[0060] [表 1]
I H O G ォキシムからの生成モナティン
反応溶液 1
生成モナティン
菌 株
(mM)
itrobacter freundu IFO 1 3546 3. 2 c scnenchia intermeaia AJ 2607 3. 2 cscnenchia coli ATCC 1 3070 2. 1
Hhoaococcus marinonascens AJ 1 1 0354 1 . 2 cscnenchia coli ATCC 1 281 4 0. 8
[0061] 実施例 2 IHOG—ォキシム · 2カリウム塩を基質としたモナティンの生成
表 2に示す菌株を用いて、 IHOG -ォキシム · 2力リゥム塩を基質とした変換反応を 実施した。菌体の調製方法は実施例 1記載の方法と同様に行い、反応液は以下に 示す反応液 2および反応液 3を用いた。 30°Cで 24時間反応させた後に HPLCにて 生成モナティン量を定量した。その結果、表 2に示す通り、 IHOG—ォキシム · 2力リウ ム塩からもモナティンが生成した。また、反応液 3と 4の比較から、反応液中に NADH 、 NADPH、 MgCl、ピリドキサール一 5，一リン酸（PLP)などを添カ卩することにより生
2
成モナティン量が増加した。
[0062] 反応液 2 : 100mM Glycine -NaOH (pH 9. 0) , 50mM IHOG—ォキシム · 2力 リウム塩、 ImM MgCl、 lmM ピリドキサール 5，—リン酸（PLP)、 25mM NA DH、 25mM NADPH、 1%(νΖν)トルエン
[0063] 反応液 3:100mM Glycine -NaOH(pH 9.0), 50mM IHOG—ォキシム ·2力 リウム塩、 1%(νΖν)トルエン
[0064] [表 2]
表 2 I HOG—ォキシム 2カリウム塩を基質とした生成モナティン量 （mM) 菌 株 反応液 2 反応液 3
Citrobacter freunan 【FO 13546 11. 30 6. 47 tzschencnia intermedia AJ 2607 11. 65 6. 79 cscnenc /a coli ATCC 13070 1. 01 0. 54
[0065] 実施例 3 PLP、Mgα、NAD(P)Hの添加効果
2
Citrobacter freunan IFO Id 546、 Escherichia intermedia AJ2607によ る IHOG—ォキシム還元反応における PLP、 MgCl、 NAD (P)Hの添カ卩効果を検討
2
した。
[0066] 表 3に示す組成の反応液 (反応液 4〜9)をそれぞれ調製し、実施例 1に示す方法と 同様に IHOG—ォキシム還元反応を実施し、生成したモナティンを定量した。
その結果（表 4)、それぞれの菌株において、 PLP、 MgCl、あるいは NAD(P)Hを
2
添加することにより生成モナティン量が増加した。
[0067] さらに、反応液 4を用いて生成したモナティンについて、光学分割カラム「CROWN PAK CR( + )」を用いて光学異性体を同定したところ、これらのモナティンは（2S, 4S)体であることが明ら力となった。
[0068] [表 3]
表 3 反応溶液組成 （単位： mM)
Figure imgf000018_0001
[0069] [表 4] 表 4 生成モナティン量 （mM)
Figure imgf000019_0001
[0070] 実施例 4 IPA—ォキシム（インドール— 3—ピルビン酸—ォキシム）からのトリプトファ ン (Trp)の生成
ブイヨン平板培地（栄研化学）に Citrobacter freundii IFO
13546、 Escherichia intermedia AJ 2607を接種し、 30。Cで 24時間培養し た。これをグリセロール 0. 5gZdl、フマル酸 0. 5gZdl、酵母エキス 0. 3g/dl,ぺプ トン 0. 2gZdl、硫安 0. 5gZdl、 K 2 HPO 4 0. 3g/dl, KH 2 PO 40. lg/dl, MgSO
•7H O 0. 05gZdl、 IHOG—ォキシム · 2アンモ-ゥム塩 0. 2gZdl、寒天末 2g
4 2
/dl (pH6. 5)を含むプレートに接種し、 30°Cで 24時間培養した。得られた菌体を 湿菌体重量で約 1% (WZV)となるように、以下の反応液 10に接種し、 30°Cで 24時 間反応させた。
[0071] 反応液 10 : 100mM Glycine -NaOH (pH 9. 0) , 50mM IPA—ォキシム、 lm M MgCl、 lmM ピリドキサールー5，ーリン酸（PLP)、 25mM NADH、 25mM
2
NADPH、 1% (νΖν)トルエン
[0072] TLCを用いて生成トリブトファンの定性分析を行った。反応液 1 μ 1を TLCプレート シリカゲル 60F254 (Merck製）にスポットし、 n—ブタノール：酢酸：水 =4 : 1： 2に混 合した溶液を用いて展開後、ニンヒドリン発色を行った。トリブトファンはおおよそ Rf= 0. 52の位置に紫色のスポットとして検出できる。
[0073] トリブトファンの生成が認められた反応液を HPLC分析に供して、生成トリブトファン を定量分析した。その結果、トリブトファンの生成が認められ、即ち IPA—ォキシムか ら微生物変換にてトリブトファンを生成せしめることが出来た。
[0074] (分析条件）
カラム ：Inertsil ODS— 80A (ジーエルサイエンス製）
検出 ： UV210nm 溶離液 ：12% (vZv)ァセトニトリル Z0. 05% トリフルォロ酢酸水溶液 流速 ： 1. 5mレ mm
分析温度： 30°C
[0075] [表 5]
表 5 生成 T r p量
Figure imgf000020_0001
[0076] 実施例 5 BAE—ォキシムからの β—フエ-ルァラニン（ j8—Phe)の生成
Citrobacter freunan IFO 13546、 Escherichia intermedia AJ2oO / 供試菌株とし、実施例 4と同様に培養して得られた菌体を湿菌体重量で約 1% (w/ V)となるように、以下の反応液 11に接種し、 30°Cで 24時間反応させた。
[0077] 反応液 l l : 100mM Glycine -NaOH (pH 9. 0) , 50mM BAE—ォキシム、 lm M MgCl、 lmM ピリドキサールー5，ーリン酸（PLP)、 25mM NADH、 25mM
2
NADPH, l % (v/v) トルエン
[0078] TLCを用いて生成物の定性分析を行った。反応液 1 μ 1を TLCプレートシリカゲル 60F254 (Merck製）にスポットし、 n—ブタノール：酢酸：水 =4 : 1： 2に混合した溶液 を用いて展開後、ニンヒドリン発色を行った。 β フエ-ルァラニンェチルエステルは おおよそ Rf=0. 72の位置に黄色のスポットとして、 13 フエ-ルァラニンはおおよそ Rf=0. 51の位置に茶色のスポットとして、それぞれ検出できる。その結果、これら反 応液においては β フエ-ルァラニンと同一の Rf付近にスポットの生成を認めた。
[0079] β フエ-ルァラニンスポットの生成が認められた反応液を HPLC分析に供して分 祈した。その結果、 β フエ-ルァラニンの生成が認められ、即ち ΒΑΕォキシムから 微生物変換にて β フエ-ルァラニンを生成せしめることが出来た。
[0080] (分析条件）
カラム ：Inertsil ODS— 80A (ジーエルサイエンス製）
検出 ： UV210nm
溶離液 ：12% (vZv)ァセトニトリル Z0. 05% トリフルォロ酢酸水溶液 流速 ： 1. 5mレ mm 分析温度： 30°C
[0081] [表 6]
表 6 生成 —フエ二ルァラニン量
Figure imgf000021_0001
[0082] 実施例 6 15Nラベル IPA—ォキシム（15N同位体でラベルしたインドールー 3—ピルビ ン酸ォキシム）からのトリプトファン (Trp)の生成
実施例 4と同様の方法により Escherichia intermedia AJ 2607を培養し、湿菌 体を得た。得られた菌体を湿菌体重量で約 1% (WZV)となるように、以下の反応液 1
2に接種し、 30°Cで 24時間反応させた。
[0083] 反応液 12 : 100mM Glycine— NaOH (pH9. 0)、 50mM 15Nラベル IPA—ォ キシム、 ImM MgCl 2、 lmM ピリドキサール— 5，—リン酸（PLP)、 25mM NAD
H、 25mM NADPH、 1% (νΖν)トルエン
[0084] 15Nラベル IPA—ォキシムは、以下のようにして調製した。アルゴン気流下、 25°Cで 水 60mlにインドールピルビン酸 1. 413g (6. 95ミリモル）及び 8NNaOH0. 913ml をカロえて溶解した。その溶解液に15 NH OH塩酸塩 0. 5g (7. 09ミリモル)及び 8N
2
NaOHO. 913mlを添カ卩し、 25°Cで一時間攪拌した。 1N塩酸 4. 9mlで反応液の p Hを 3に調整し 25°Cで一晩攪拌した。析出結晶を濾別し、湿結晶 2. 07gを 40°Cで 減圧乾燥することにより、15 Nラベル IPA—ォキシム 0. 81g (3. 58ミリモル エリア純 度 97. 5%)を得た。
[0085] 反応液を LC— MSで分析した結果、 15Nラベル区では + 206 (15N相当）のピークが 検出され、ォキシムが酵素的に還元されていることが示された。
産業上の利用可能性
[0086] 本発明は、各種アミノ酸誘導体の生産において有用である。

Claims

請求の範囲 [1] 下記一般式 (I)
[化 1]
Figure imgf000022_0001
(一般式 (I)において、 Rはそれぞれ置換基を有していてもよい炭素数 2〜6のアル
1
キル基、炭素数 6〜14のァリール基、炭素数 6〜 10のシクロアルキル基、炭素数 7へ 19のァラルキル基、炭素数 2〜10のアルコキシアルキル基、またはこれらの炭素骨 格中にヘテロ原子を含む基、および下記一般式 (II)
[化 2]
(1【)
Figure imgf000022_0002
で示される置換基 R
3から選択される置換基を表す。ここに、 R
4はそれぞれ置換基を 有していてもよい炭素数 2〜6のアルキル基、炭素数 6〜 14のァリール基、炭素数 6 〜 10のシクロアルキル基、炭素数 7〜 19のァラルキル基、炭素数 2〜 10のアルコキ シアルキル基、またはこれらの炭素骨格中にヘテロ原子を含む基力 選択される置 換基を表す。 X
1および X
2は相互に独立して水酸基またはカルボ二ル基を表す。 R
2は 炭素数 1〜3のアルキル基または水素原子を表す。 nは 0または 1である。 ) で示されるヒドロキシィミノ酸から、
下記一般式 (III)
[化 3]
Figure imgf000022_0003
(一般式 (III)において、 Rおよび nは、一般式 (I)における R、 nと同義である。）
1 1
で示されるアミノ酸誘導体を生成する反応を触媒する微生物および Zまたは酵素の 存在下で、当該反応を実施することにより、前記一般式 (in)のアミノ酸誘導体を生成 することを特徴とするアミノ酸誘導体の製造方法。
[2] 前記 nが 0であり、生成するアミノ酸誘導体が ex アミノ酸誘導体である請求項 1に 記載の製造方法。
[3] 生成するアミノ酸誘導体が、 α— L アミノ酸である請求項 1に記載の製造方法。
[4] 生成するアミノ酸誘導体が、 α D アミノ酸である請求項 1に記載の製造方法。
[5] 前記 ηが 1であり、生成するアミノ酸誘導体が β アミノ酸誘導体である請求項 1に 記載の製造方法。
[6] 前記ァリール基力 置換基を有して!/、てもよ 、フエ-ル基またはナフチル基である、 請求項 1に記載の製造方法。
[7] 前記ァラルキル基力 置換基を有して 、てもよ 、フエ-ルアルキル基またはナフチ ルアルキル基である、請求項 1に記載の製造方法。
[8] 前記炭素骨格にヘテロ原子を含む基が、置換基を有して!/、てもよ 、ピリジル基また はインドイル基である、請求項 1に記載の製造方法。
[9] 下記一般式 (IV)
[化 4]
Figure imgf000023_0001
で示される IHOG—ォキシムから、
下記一般式 (V)
[化 5]
Figure imgf000024_0001
で示されるモナティンを生成する反応を触媒する微生物および Zまたは酵素の存 在下で、当該反応を実施することによりモナティンを生成することを特徴とする、モナ ティンの製造方法。
[10] 下記一般式 (VI)
[化 6]
Figure imgf000024_0002
で示される BAE—ォキシムから 13 フエ二ルァラニンを生成する反応を触媒する微 生物および Zまたは酵素の存在下で、当該反応を実施することにより j8—フエニルァ ラニンを生成することを特徴とする、 β—フエ二ルァラニンの製造方法。
[11] 下記一般式 (VII)
[化 7]
Figure imgf000024_0003
で示されるインドールー 3—ピルビン酸ーォキシムからトリプトファンを生成する反応を 触媒する微生物および Zまたは酵素の存在下で、当該反応を実施することによりトリ ブトファンを生成することを特徴とする、トリブトファンの製造方法。
[12] 微生物が、シトロパクター（Citrobacter)属、ェシエリヒア（Escherichia)属、およ びロドコッカス（Rhodococcus)属からなる群より選ばれるいずれかの属に属ずる細 菌の 1種または 2種以上であることを特徴とする、請求項 1, 9, 10または 11に記載の 製造方法。
[13] 微生物が、 Citrobacter freundii (シトロパクター フルーンジ）、 Escherichia in termedia (ェシエリヒア インターメディア）、 Escherichia coli (ェシエリヒア コリ）、 および Rhodococcus marinonascens (ロドコッカス マリノナシーンズ）からなる群 力も選ばれることを特徴とする、請求項 1 , 9, 10または 11に記載の製造方法。
[14] 一般式 (I)で示される化合物から一般式 (ΠΙ)で示される化合物を生成する反応を 行う反応液中に、 NADH、 NADPH、ピリドキサール 5，一リン酸、および MgClか
2 らなる群力も選ばれる化合物のうち、少なくとも一つを添加することを特徴とする請求 項 1, 9, 10または 11に記載の製造方法。
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