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WO2006019179A1 - 希土類蛍光錯体を用いた標識方法と分析検出法 - Google Patents

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WO2006019179A1
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Kazuko Matsumoto
Yoshinori Yamaguchi
Kimikazu Hashino
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Japan Science And Technology Agency
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    • Y10T436/10Composition for standardization, calibration, simulation, stabilization, preparation or preservation; processes of use in preparation for chemical testing

Definitions

  • the present invention firstly provides a labeling method for labeling a sample used in an electrophoresis method with a rare earth fluorescent complex DTBTA-Eu 3+ as a labeling agent.
  • the electrophoresis method is capillary electrophoresis, capillary one-zone electrophoresis, capillary isoelectric focusing, capillary isokinetic electrophoresis, capillary SDS electrophoresis, micellar conductive electrophoresis
  • a labeling method characterized by electrophoresis, capillary gel electrophoresis, or SDS capillary gel electrophoresis.

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Abstract

電気泳動法で用いられる試料に希士類蛍光錯体DTBTA-Eu3+を標識剤として標識することで、電場の強弱に寄らず安定した蛍光強度を示す、比較的簡便な標識方法が提供され、さらに生体物質の高感度な分析をも可能とする。

Description

明 細 書 希土類蛍光錯体を用いた標識方法と分析検出法 技術分野
本願発明は、 希土類蛍光錯体を用いた標識方法と分析検出法に関する ものである。 背景技術
従来より、 生物の機能を細胞レベルで明らかにするために、 生体内の タンパク質、 ペプチド、 核酸、 アミノ酸、 糖質、 神経伝達関連物質など の解析、 分析が行われている。 その手段として、 質量分析計を組み合わ せた高速液体クロマトグラフィー等が行われてきたが、 その理論段数は キヤピラリー電気泳動に及ばない。 そのことは、 例えばオリゴヌクレオ チドの分離分析において、 キヤピラリー電気泳動では 1, 000, 000、 高速 液体クロマトグラフィーでは 30, 000程度であることが報告されている (例えば、 非特許文献 1参照)。 さらに加えて、 分析に必要なサンプルの 絶対量が高速液体クロマトグラフィーと比較して微量である (高速液体 クロマトグラフィーでは数 m 1、 キヤピラリー電気泳動法では p 1 レべ ルである) ので分離分析にはキヤピラリー電気泳動法が利用される。 ま た、 キヤピラリー電気泳動はヒューマンゲノムプロジェク卜で使用され ているように、 その高分解能には定評があり、 最近ではタンパク質、 ァ ミノ酸などの分析にも多く利用される。
しかし、 多くの場合、 検出はサンプルの吸光度を測定しているため、 検出限界がおおむね悪く、 試料の種類により検出限界が異なる欠点があ る。 それらの欠点を解消するために、 蛍光物質をアミノ酸に標識して測 定している例がある(例えば、 非特許文献 2参照)が、 その標識方法は複 雑であり、 また、 検出に高出力のレーザーを利用しているので、 実際の 測定には使用が困難である。 その他のアミノ酸の測定は、 例えば、 紫外 部の吸収を強くするために誘導化したアミノ酸、 具体的には誘導化試薬 としてフエ二ルイソチオシァネートを用いたフエ二ルチオヒダント ン一アミノ酸及ぴ、 ダンシルクロリ ドを利用したダンシル一アミノ酸の 吸収を利用して測定するものが広く利用されている(例えば、 非特許文 献 3参照)。 しかし、 その検出限界は mM程度である。
ぺプチドゃタンパク質の分析もキヤビラリ一電気泳動を利用して行 われている。 ペプチド分析ではほとんどの場合、 タンパク質を酵素によ り分解したものであり、 ペプチドの分離を向上するために、 多くの労力 を割いている。 また、 その検出に専ら吸収の方法が用いられている。 ま た、 タンパク質の分離分析は、 吸収の方法で検出しているが、 吸収で検 出する場合には例えば、 ポリマーを充填したキヤビラリーゲル電気泳動 を利用する場合には、 充填するゲルやポリマーの吸収により、 測定限界 が悪くなる場合がある。 また、 最近になって、 レーザ一励起による蛍光 を測定してタンパク質を分析した例などが見られる (例えば、 非特許文 献 4 参照)。 その際には、 分析対象物 となる タ ンパク質は 3- (2-furoyl) auinol ine-2-carboxaldehyde (FQ)により標識されている が、 標識剤の導入順序などの複雑な前処理が存在しするので、 簡便な分 離方法としては適していない。
以上のことを整理すると、 キヤビラリ一電気泳動は優れた分離能をも つことが示されているが、 その検出においては、 濃度にして p p m以下 例えば 1 0— 9 Mや p p bの超微量分析にまで到達したものは少ない。 そこで、 新しい生体関連物質に対しての標識剤の開発が期待される。 そ の一つとして、 希土類蛍光錯体を利用した標識剤は (1 ) 蛍光強度が強 い (2 ) 蛍光寿命が長い (3 ) 溶液中で安定であるなどの特徵を持った 優れた標識剤としての特徴を持つ。
. ところで、 蛍光を発する蛍光金属錯体を生体物質に標識して分析しよ うとする試みは 1975 年にユーロピウムキレートを抗体に標識したのが 初めてである(例えば、 非特許文献 5参照)。 その後、 生体物質の検出に 必要な条件、 蛍光寿命が長いこと、 強い蛍光性、 水溶液中で安定である こと等を満たすユーロピウム錯体の研究開発が行われることに伴い、
LKBシステムと呼ばれる標識の方法が(米) Wal lac社により開発された。 しかし、 この方法では、 タンパク質に標識はできるが、 標識されたヨウ 口ピウム自身は蛍光を持たず、 また、 溶液中からの未反応のヨウ口ピウ ムのお影響を強く受けることや、 標識の際の反応経路が多いこと、 固相 化できないなどの欠点があり、そのままでは利用できなかった。その後、 それら の欠点を克服するために、 蛍光性ユウ口 ピウム錯体 4, 7 - bis (chlorosul fophenyl) - 1, 10-phenanthrol ine-2, 9-dicarboxyl ic ac id (BCPM)が合成され、 CyberFluorシステムと呼ばれる方法が開発さ れた。
この方法を利用して時間分解ィムノアツセィを実行した例がある(例 えば、 非特許文献 6参照)が、 蛍光強度が LKB に比べて弱いという欠点 があり、 高感度測定は達成できなかった。 それらの欠点を補うために、 多くの金属錯体が合成された(例えば、 非特許文献 7 , 8参照)が、 蛍光 強度が弱い、 あるいは、 生体分子との結合が弱いなどの欠点が存在し、 高感度検出できる標識剤の合成ができなかった。
近年になって、 新たに合成された希土類蛍光錯体を利用して生化学物 質の高感度分析、 特に、 タンパク質をィムノアッセィにより分析する際 の標識剤が利用されてきた(例えば、 非特許文献 9, 1 0参照)。 具体的 には、 ハイブラリゼーシヨンアツセィゃ 2つの違った標識剤を利用して ィムノアツセィを行った例などがある。 詳しく述べると、 ハイブラリゼ ーションアツセィは核酸がその相補的配列と 2本鎖を作ることを利用 して DNAや RNAの検出定量に広く用いられている。 さらには、 この文献 では蛍光のエネルギー転移を利用することによって B/F分離を不要とし ている。 また、 タンパク質や抗原の分析では、 ヨウ口ピウムとサマリゥ ムの錯体を利用して、 ヒト血清中の α—フエトプロテイン (AFP) と力 リシォェンブリオニック抗原、 Care ioembryonic Ant igen (CEA) を同時 に高感度分析を行った例などがあり、 その有用性は実証されている。 こ れらの方法で、 希土類蛍光錯体を利用することによって、 従来の有機色 素より、 約 100倍程度の検出限界を得ている。
このような高感度を提供する標識剤を利用して、 生体分子を従来の 離技術、 高速液体クロマトグラフィーを利用して分離した例が報告され ている(例えば、 非特許文献 1 1参照)。 また、 アミノ酸に標識すること によって、 高速液体クロマトグラフィーを用いて分離しようと試みた例 もあるが、 その分離は完全でない。 そこで、 高速液体クロマトグラフィ 一より大きい理論段数を持つキヤビラリ一電気泳動法を利用した分離 分析が期待されるが、 これまでは、 サンプルの分離後に金属錯体を導入 し、 蛍光を検出する方法であった(例えば、 非特許文献 1 2参照)。 この 方法では、 検出部の構造が複雑になり、 また、 配位子と結合する金属を 完全に制御することが難しいので、定量分析には向いていない。つまり、 金属の状態は、 多くの場合、 高電圧下での分析では、 錯体を構成してい る希土類金属が不安定になり、 蛍光を発しない場合や蛍光強度が弱くな つていた。
さらに、 金属錯体を構成する金属イオンが、 キヤビラリ一の内壁に強 く吸着することによって、 分離能が損なわれてしまう現象があり、 上記 文献では、金属を分離の後に導入することにより、蛍光を検出している。 このことによる欠点は、 まずテルビウムなどの水和金属イオンの弱い蛍 光を避けることが難しいこと、 反応を完全に制御できないにとから、 定 量分析に向かないと言う欠点がある。 以上のことから、 標識剤としては 高感度であるにもかかわらず、 電気泳動の方法と組み合わせることによ る高感度分析が提供されていないのが現状であった。
ま た 、 発 明 者 ら は、 ユ ウ 口 ピ ウ ム (Eu) と 4, 4 ' -ヒ ' ス ( 1" , 1" , 1" , 2" , 2" , 3" , 3" -へフ。タフル才ロ- 4" , 6" -へキサンシ 'オン- 6" -ィル) - クロロスルホ - 0 -テルフエ::ル (BHHCT)とからなる希土類金属錯体などを用いた分析 方法を提案している.(例えば、 特許文献 1参照)。 しかしながら、 ここ で提案されている希土類蛍光錯体は、 金属が配位子から抜けやすく蛍光 が減少するなど十分ではなく、 より最良のものが求められてもいる。 非特許文献 1 : J. Chormatography,第 558号 1991年 p280
非特許文献 2 : Science, 242巻 pp562 - pp564
非特許文献 3 : J. Chormatography, 545巻 pp350 (1991年)
非特許文献 4 : Journal of Chromatography A,第 894巻 pp291-296 (2000年)
非特許文献 5 : Tutorials of Cytology, pp313 (1976年)
非特許文献 6 : Analytical Chemistry, 60巻 ppl069 - 1074 (1988年) 非特許文献 7 : Journal of the American Chemical Society, 1 1 5 巻 PP11032 - 11040 (1993年)
非特許文献 8 -.Journal I匪漏 logical Method, 179巻 pp233 - 240(1995 年)
非特許文献 9 :蛋白質核酸酵素, 48 巻第 1 1号 ppl550 - 1558 (2003 年)
非特許文献 1 0 : マテリアルインテグレシヨ ン, 17 巻第 3号 PP45 - pp49 (2003年)
非特許文献 1 1 : Chromatography Journal of Separation Sciences, 23 巻第 2号 pp73 - 78 (2002年)
非特許文献 1 2 : HRC-Journal of high Resolution Chromatography, 第 20巻 pp638— 642 (1997年)
特許文献 1 :特開 2001- 356128号公報 発明の開示
本願発明は、 以上の通りの背景から、 電場の強弱に寄らず安定した蛍 光強度を示し、 電気泳動法で用いられる分析対象物の生体物質 (試料) を比較的簡便に標識できる標識方法と、 生体物質 (試料) の高感度な分 析を可能とする分析検出法を提供することを課題としている。
本願発明は、 前記の課題を解決するものとして、 第 1には、 電気泳動 法で用いられる試料に希土類蛍光錯体 DTBTA- Eu3+を標識剤として標識す る標識方法を提供する。 そして、 第 2には、 上記の標識方法において、 電気泳動法がキヤビラ リー電気泳動、 キヤビラリ一ゾーン電気泳動、 キヤピラリー等電点電 $ 泳動、 キヤピラリー等速電気泳動、 キヤピラリー SDS電気泳動、 ミセル 導電電気泳動、 キヤビラリーゲル電気泳動、 または SDSキヤピラリーゲ ル電気泳動であることを特徴とする標識方法を提供する。
また、 本願発明は、 第 3には、 上記の標識方法において、 電気泳動法 がスラブゲル電気泳動法、 ディスクゲル電気泳動法、 膜電気泳動法、 濾 紙電気泳動法、 SDS- PAGE法、 nat ive- PAGE法、 ァガロースゲル法、 等電 点電気泳動 (焦点電気泳動) 法、 または免疫電気泳動法であることを特 徴とする標識方法を、 第 4には、 ブロッテイング操作が併用されること を特徴とする標識方法を提供する。
さらに、 本願発明は、 第 5には、 試料が蛋白質、 核酸、 糖質、 または 脂質であることを特徴とする標識方法を、 第 6には、 上記第 2の標識方 法において、 試料がアミノ酸であることを特徴とする標識方法をも提供 する。
そして、 本願発明は、 第 7には、 希土類蛍光錯体 DTBTA-Eu3+を標識し た試料の電気泳動法による分析検出法を提供する。
また、 本願発明は、 第 8には、 上記の分析検出法において、 電気泳動 法がキヤピラリー電気泳動、 キヤビラリ一ゾーン電気泳動、 キヤビラリ 一等電点電気泳動、 キヤビラリ一等速電気泳動、 キヤピラリー SDS電気 泳動、 ミセル導電電気泳動、 キヤビラリーゲル電気泳動、 または SDSキ ャビラリ一ゲル電気泳動であることを特徴とする標識方法を提供する。 さらに、 本願発明は、 第 9には、 上記の分析検出法において、 電気泳 動法がスラブゲル電気泳動法、ディスクゲル電気泳動法、膜電気泳動法、 濾紙電気泳動法、 SDS-PAGE法、 nat ive-PAGE法、 ァガロースゲル法、 等 電点電気泳動 (焦点電気泳動) 法、 または免疫電気泳動法であることを 特徴とする標識方法を、 第 1 0には、 ブロッテイング操作が併用される ことを特徴とする分析検出法を提供する。
また、 本願発明は、 第 1 1には、 試料が蛋白質、 核酸、 糖質、 または 脂質であることを特徵とする分析検出法を、 第 1 2には、 上記第 8の分 析検出法において、 試料がアミノ酸であることを特徴とする分析検出お をも提供する。
そして、 本願発明は、 第 1 3には、 上記第 8の分析検出法において、 電気泳動法による検出方法が時間分解の検出方法であることを特徴と する分析検出法を提供する。 図面の簡単な説明
図 1は、 実施例 1における標識蛋白質の泳動像の観察結果である。 図 2は、 実施例 1において、 泳動像からバンドの移動度を計測し、 分- 子量の対数に対してプロットしたグラフである。
図 3は、 実施例 2 におけるキヤピラリーゲル電気泳動による DTBTA-Eu3+標識蛋白質の分析結果である。
図 4は、 実施例 2 におけるキヤピラリーゲル電気泳動による DTBTA- Eu3+標識蛋白質の分析結果において、 ピークの位置について、 そ のキヤピラリー電気泳動での移動時間と、 それぞれの分子量との相関関 係をプロッ卜したグラフである。
図 5は、 実施例 3 におけるキヤビラリーゲル電気泳動による DTBTA- Eu3+標識されたストレブトアビジンの高感度検出結果である。
図 6は、 実施例 3 におけるキヤビラリーゲル電気泳動による DTBTA- Eu3+標識されたストレブトアビジンの高感度検出結果において、 ピークの強度について、 その濃度との相関関係をプロットしたグラフで ある o
図 7は、 実施例 4におけるキヤビラリ一ゲル電気泳動 DTBTA-Eu3+標識 された蛋白質のより高い電場中での分離分析結果である。
図 8は、 実施例 5における I g G蛋白の SDSキヤピラリーゲル電気泳 動での分離分析結果である。
図 9は、 実施例 5における I g G蛋白の SDSキヤビラリーゲル電気泳 動での分離分析結果について、 実施例 2で得られた検量線を用いて回帰 したグラフである。
図 1 0は、 実施例 6におけるパルスフィールド時間分解キヤピラリー Ϊ 気泳動による DTBTA-Eu3+で標識した実施例 2における蛋白質の分析結果 である。
図 1 1は、実施例 7における I g G蛋白の nat iveキヤビラリーゲル電気 泳動での分離分析結果である。 (a) が DTBTA- Ειι3+標識した抗体のみの nat ive キヤビラリーゲル電気泳動の結果でピーク 1がそのピークであ る。 (b)は抗原抗体複合体をキヤビラリ一ゲル電気泳動で分離分析した 結果であり、 ピーク 1が DTBTA-Eu3+標識した抗体のピークで、 ピーク 2 は DTBTA- Eu3+標識した抗体と子牛胎児血清中の未標識抗原との抗原抗体 複合体のピークである。
図 1 2は、 実施例 7で得られた子牛胎児血清中の抗原の濃度と nat ive キヤピラリ一ゲル電気泳動で得られた抗原抗体によるピークの強度と の相関から得られた検量線を用いて作成した回帰直線のグラフである。 発明を実施するための最良の形態
本願発明は前記のとおりの特徴をもつものであるが、 以下に、 発明を 実施するための最良の形態を説明する。
本願発明は、 電気泳動法で用いられる試料に希土類蛍光錯体 DTBTA-Eu3+を標識剤として標識する標識方法を提供するものである。
ここで、 希土類蛍光錯体を構成する配位子である DTBTA は、 2, V , V , ,2, , , - { [ (4, 6-dic loro-l, 3, 5-triaz in-2-yl) amino-bi phenyl-4-yl] -2, 2 ' , 6, ,2, , -terpyridine-6, 6 ' , -diyl) bis (methy leneni tri lo) tetraacet ic acid と して表され、 希土類蛍光錯体 DTBTA- Eu3+は下記式で表される。
Figure imgf000011_0001
この希土類蛍光錯体 DTBTA-Eu3+は、 例えば、 本発明者らによって提案 された方法 (国際公開番号: W02003/076938) によって製造される。
電気泳動法としては、 例えば Ι ΟΟ ΠΙ以下のキヤピラリー内で行うキ ャピラリー電気泳動法であることが好ましい。 キヤピラリーを用いる場 合、 非常に高い電場 (1 0 0〜5 0 0 V c m—1) を印加しても流れる電 流は小さく、 電気泳動を行う場合で大きな問題となっていたジュール熱 の発生を最小限に抑えることが可能である。 また、 キヤピラリーは内容 積に対して表面積の比率が大きいため、 発生するジュール熱を効率良く 拡散することも可能であり、 短い分析時間で高い分離効率が得られるも のである。 また、 キヤピラリー電気泳動法以外では、 中空キヤビラリ一 を用いたキヤピラリーゾーン電気泳動、 キヤピラリー等電点電気泳動、 キヤピラリー等速電気泳動、 キヤピラリー SDS電気泳動、 ミセル導電電 気泳動、 キヤビラリ一ゲル電気泳動、 または SDSキヤビラリーゲル電気 泳動等の電気泳動法であってもよい。
本願発明の標識方法においては、 スラブゲル電気泳動法、 ディスクゲ ル電気泳動法、膜電気泳動法、濾紙電気泳動法、 SDS-PAGE法、 nat ive-PAGE 法、 ァガロースゲル法、 等電点電気泳動 (焦点電気泳動) 法、 または免 疫電気泳動法が挙げられ、 膜電気泳動法としてはセルロースァセテ一ト 膜電気泳動法等も考慮される。 また、 ブロッテイング操作を併用しても よい。 これらのうち、 特にキヤピラリー電気泳動は、 スラブゲル電気泳動法 と比較して、 迅速な分析、 ジュール熱の分散等の点で優れているので ί ましい。
本願発明の標識方法においては、 電気泳動法で用いられる試料を希土 類蛍光錯体で標識するには、 電気泳動試料を含む可能性のある被検試料 と、希土類蛍光錯体とを、接触させることにより実施することができる。 例えば、 希土類蛍光錯体 DTBTA- Eu3+と試料をそれぞれ ρΗ 9 . 0〜9 . 5 の炭酸緩衝溶液に溶解し、 両者を混合して反応させることで電気泳動試 料を標識することができる。
試料としては、 蛋白質、 核酸、 糖質、 脂質、 アミノ酸であることが好 ましい。 アミノ酸の場合には、 電気泳動法がキヤピラリー電気泳動、 キ ャピラリーゾーン電気泳動、 キヤピラリー等電点電気泳動、 キヤビラリ 一等速電気泳動、 キヤピラリー SDS電気泳動、 ミセル導電電気泳動、 キ ャビラリ一ゲル電気泳動、 または SDSキヤビラリ一ゲル電気泳動である ことがこの好ましい。
また、 本願発明では、 標識剤に適する分離分析のための電気泳動条件 を提供することにより、 上記のとおりの希土類蛍光錯体 DTBTA-Eu3+を標 識した試料の高感度な分析を可能とする分析検出法を提供するもので ある
このような電気泳動法としては、 上記のとおり、 例えば l OO z m以下 のキヤピラリー内で行うキヤピラリー電気泳動法であることが好まし い。 キヤピラリーを用いる場合、 非常に高い電場 (1 0 0〜5 0 0 V c m-1) を印加しても流れる電流は小さく、 電気泳動を行う場合で大きな 問題となっていたジュール熱の発生を最小限に抑えることが可能であ る。
また、 キヤピラリーは内容積に対して表面積の比率が大きいため、 発生 するジュール熱を効率良く拡散することも可能であり、 短い分析時間で 高い分離効率が得られるものである。 また、 キヤピラリー電気泳動法以 外では、 中空キヤピラリーを用いたキヤピラリーゾーン電気泳動、 キヤ ピラリー等電点電気泳動、 キヤピラリー等速電気泳動、 キヤピラリー SD S電気泳動、 ミセル導電電気泳動、 キヤピラリーゲル電気泳動、 また t SDSキヤビラリ一ゲル電気泳動等の電気泳動法であってもよい。
さらに、 本願発明では、 電気泳動法として、 例えばスラブゲル電気泳 動法、 ディスクゲル電気泳動法、 膜電気泳動法、 濾紙電気泳動法、 SDS- PAGE法、 nat ive-PAGE法、 ァガロースゲル法、 等電点電気泳動 (焦 点電気泳動) 法、 または免疫電気泳動法が挙げられ、 膜電気泳動法とし てはセルロースアセテート膜電気泳動法等も考慮される。 また、 ブロッ ティング操作を併用してもよい。
これらのうち、 特にキヤピラリー電気泳動は、 スラブゲル電気泳動法 と比較して、 迅速な分析、 ジュール熱の分散等の点で優れているので好 ましい。
試料としては、 蛋白質、 核酸、 糖質、 脂質、 アミノ酸であることが好 ましい。 アミノ酸の場合には、 電気泳動法がキヤピラリー電気泳動、 キ ャピラリーゾーン電気泳動、 キヤビラリ一等電点電気泳動、 キヤビラリ 一等速電気泳動、 キヤピラリー SDS電気泳動、 ミセル導電電気泳動、 キ ャビラリ一ゲル電気泳動、 または SDSキヤビラリ一ゲル電気泳動である ことがこの好ましい。
本願発明の分析検出法は、 電場中、 例えば数 k Vの電圧下で用いて、 その蛍光が失われず、安定な金属錯体 DTBTAをタンパク質に標識してキ ャピラリー電気泳動を行うことによって、分離分析が可能となる。また、 この錯体は上記のように通常の平板ゲル電気泳動でも使用可能である。 キヤビラリ一の内壁は通常マイナスに電荷を帯びているが、 これを内 壁処理することによって、 電荷をなくし、 錯体を構成している金属が内 壁と相互作用するのが緩和される。
従来の吸収や蛍光による検出法は、 特に内部充填するポリマー、 緩衝 液による吸収やパックグランド蛍光のため、 特に高感度分析を行うとい う点ではその検出限界が mM程度までしか上がらなかった。 そこで、 さ らに、 標識剤の優れた特徵を生かすために、 キヤピラリー電気泳動にお いては、 時間分解の方法を用いることで、 標識剤からのシグナルをより 効率よく測定することができるものである。 このことにより、 例えば 充填されているゲル、 ポリマーなどの分子篩い物質からのパックグラウ ンドシグナルを軽減し、 また、 緩衝液や狭雑物からの蛍光を避けての測 定が可能とされる。 すなわち、 ポリマーや緩衝液からの蛍光の寿命が 1 0ナノ秒以下なので、 それらを除去して測定することで検出感度を上げ ることができるものである。 ここで、 分子篩い物質とは、 キヤビラリ一 内部に充填するゲル、 ポリマーなどのサンプルの泳動に篩い効果を出す ための充填剤を示すものである。
本願発明の分析検出法によれば、 金属錯体が従来持つ高い量子効率を 生かし、 検出限界を約 1 0 0倍程度まで可能な高感度分析となる。 これ は金属錯体のストークスシフトが大きいことによる起因も併せた効果 である。
そこで以下に実施例を示し、 さらに詳しく説明する。 もちろん以下の 例によって発明が限定されることはない。 実施例
ぐ実施例 1 >
<DTBTA- Eu3+標識蛋白質の調製 >
本願発明に用いた蛋白質は、 2 mg/il となるよう 100 mM 炭酸緩衝液 (pH 9, 1) に溶解した。 DTBTA- Eu3+は、 1 mg/ml となるよう 100 mM 炭酸 緩衝液 (pH 9, 1) に溶解し、 上記蛋白質溶液と体積比で 1 : 1となるよ う混合し、 室温で 3時間反応させた。 反応後、 SepliadexTM G-25 カラム を用いたゲルろ過で未反応の DTBTA-Eu3+を除去し、 標識蛋白質画分を調 製した。
くスラブゲルによる DTBTA- Eu3+標識蛋白質の分析 >
Laemml iの系で DTBTA- Eu3+標識蛋白質の SDS-PAGEを行なった。分離ゲ ルは、 12〜17. 5 %のグラジェントゲルを用いた。 泳動後、 ゲルに UV ト ランスイルミネーターによって UV光を照射し標識蛋白質の泳動像を観 察したところ、 Eu3+錯体特有の赤色の蛍光を有するパンドを確認した。 この結果を図 1に示す。
この泳動像からパンドの移動度を計測し、 分子量の対数に対してプロ ットしたところ、 良好な直線関係が得られた。 この結果を図 2に示す。 <実施例 2 >
くキヤピラリーゲル電気泳動による DTBTA- Eu3+標識蛋白質の分析 > 実施例 1で調製した DTBTA- Eu3+標識蛋白質のサンプルを印加電圧 4000V (電場強度 100V/cm) で SDSキヤビラリ一ゲル電気泳動を行った。 分離には、 交換が可能な 5 % (W/W) のヒドロキシェチルセルロース緩 衝溶液を利用した。 5 % (W/ ) のヒドロキシェチルセルロース緩衝溶 液は市販のヒドロキシェチルセルロースを緩衝溶液、 この場合には通常、 蛋白質の分離分析で利用される Tris/Glyc ine/SDS, pH8. 3 を利用して重 量%で 5 %になるように作成したものである。検出には時間分解キヤピ ラリー電気泳動システムを利用し、 350ηπι励起で 610ηπι検出で、 遅延蛍 光検出が 100 z secで行った。 この結果を図 3に示す。
図 3におけるそれぞれのパンドの帰属は l :Lysozyme, 8nM, MW=14, 300 2 :b -Lactoglobul in, 6. 6nM, MW = 18, 300 3 : Tlyps inogen, 5. 4nM, MW = 24, 000 4 :Albumin, egg, 2. 8nM, MW = 45, 000 5 :BSA (Bovine Serum Albumin) , 2nM, MW = 66, 000である。
ピークの位置について、 その移動度を計算し、 それぞれの分子量との 相関を調べたところ、 良好な直線関係が得られた。 この結果を図 4に示 す。
<実施例 3 >
<キヤビラリ一ゲル電気泳動による DTBTA- Eu3+標識されたストレプトァ ビジンの高感度検出 >
DTBTA-Eu3+標識ストレブトアビジン (S - Avid in)のサンプルを印加電圧 4000V (電場強度 100V/cm) で SDSキヤビラリーゲル電気泳動を行った。 分離には、 交換が可能な 1 % (W/W) のヒドロキシェチルセルロース緩 衝溶液を利用した。 5 % (W/W) のヒドロキシェチルセルロース緩衝溶 液は市販のヒドロキシェチルセルロースを緩衝溶液、 この場合には通常、 蛋白質の分離分析で利用される Tris/Glycine/SDS,pH8.3 を利用して】 量%で 5 %になるように作成したものである。検出には時間分解キヤピ ラリ一電気泳動システムを利用し、 350nm励起で 610nm検出で、 遅延蛍 光検出が 100 xsecで行った。 この結果を図 5に示す。
ピークの強度について、 その濃度との相関関係は良好な直線が得られ た。 この結果を図 6に示す。 また、検出限界は 5 X 1 0— "M (S/N比 =3.9) であった。
<実施例 4>
<キヤビラリーゲル電気泳動 DTBTA-Eu3+標識された蛋白質の高い電場で の分離分析 >
実施例 1で調製した DTBTA- Eu3+標識蛋白質のサンプルを印加電圧 10000V (電場強度 250V/cm)で SDSキヤビラリ一ゲル電気泳動を行つた。 分子篩いの濃度、 検出条件は実施例 2と同じである。 この結果を図 7に 示す。
図 7におけるそれぞれのパンドの帰属は l:Lysozyme, MW=14, 300 2:b -Lactoglobulin, MW = 18, 300 3:Tlypsinogen, MW = 24, 000 4:Albumin, egg, MW = 45, 000 5:BSA (Bovine Serum Albumin), MW = 66, 000であ る。
<実施例 5>
<IgG蛋白の SDSキヤビラリ一ゲル電気泳動 >
DTBTA-Eu3+標識された IgGを還元剤で処理し、 実施例 2と同じ条件で 分離分析したところ、 長鎖と軽鎖のパンドが確認できた。 この結果を図 8に示す。
これを実施例 2で得られた検量線を用いて回帰したところ、 それらの 分子量は長鎖がおよそ 44000、 軽鎖がおよそ 30000であった。 この鍩果 を図 9に示す。
図 9におけるそれぞれのパンドの帰属は 1:軽鎖 2:長鎖である。
ぐ実施例 6 > ぐパルスフィールド時間分解キヤピラリ一電気泳動 >
実施例 1で調製した DTBTA- Eu3+標識蛋白質のサンプルを矩形波によ f 分離分析を行った。 泳動方向に対して順方向に 6600V、 逆方向に 3300V の電圧を 12. 5Hzで印加し、 キヤピラリーゲル電気泳動で分離分析を行 つた。 分離には、 交換が可能な 6 % (W/W) のヒドロキシェチルセル口 ース緩衝溶液を利用し、 検出には時間分解キヤピラリ一電気泳動システ ムを利用し、 350ηπι励起で 610ηπι検出で、遅延蛍光検出が 100 x secで行 つた。 6 % (W/W) のヒドロキシェチルセルロース緩衝溶液は市販のヒ ドロキシェチルセルロースを緩衝溶液、 この場合には通常、 蛋白質の分 離分析で利用される Tris/Glycine/SDS, pH8. 3 を利用して重量%で 6 % になるように作成したものである。 この結果を図 1 0 ( a ) ( b ) に示 す。 (a ) はパルスフィールド時間分解キヤピラリー電気泳動での結果 を表し、 (b ) は対照実験として行った直流波 (3300VDC) による結果を 表している。
図 1 0 ( a ) ( b ) におけるそれぞれのピークで BSAのピークである ピーク 1がパルスフィールド時間分解キヤピラリ一電気泳動ではよく 分離が行われていることが分かった。
以上の結果から分子量の大きい蛋白質分子を分離する際には矩形波 による分離分析、 つまりパルスフィールド時間分解キャビラリ一電気泳 動を行うことでより分離が進むことが分かる。
ぐ実施例 7 >
くィムノアツセィと nat ive時間分解キヤピラリー電気泳動 >
S100蛋白質を抗原として利用してィムアツセィを行い、時間分解キヤ ビラリーゲル電気泳動で子胎児血清中での分析した。 S100 抗体を DTBTA-Eu3+で標識し、 子牛胎児血清中 S100蛋白質 (抗原) を定量した。
S100 抗体を DTBTA- Eu3+で標識方法は実施例 1で示した方法と同様であ る。 分離分析には SDS、 還元剤を使用せず、 抗原抗体をそのまま分離分 析する nat iveキヤビラリ一電気泳動により分析を行った。 分離には、 交換が可能な 5 % (W/W) のヒドロキシェチルセルロース緩衝溶液を利 用し、検出には時間分解キヤビラリ一電気泳動システムを利用し、 350ηηι 励起で 610nm検出で、 遅延蛍光検出が 100 ^ secで行った。 キヤピラ i 一の長さはこの実験の場合 33cmで、 印加電圧は 3300V ( lOOVZcii) であ つた。 その他の緩衝液などは実施例 2と同じである。 抗原抗体反応は子 牛胎児血清中に添加した S 100蛋白質 (抗原) に対して標識した S 100抗 体を混ぜ、 1時間反応させた。 この結果を図 1 1 ( a ) ( b )、 図 1 2に 示す。
図 1 1 (a) が DTBTA-Eu3+標識した抗体のみの nat iveキヤピラリーゲ ル電気泳動の結果でピーク 1が標識した抗体のピークである。 (b)は子 牛胎児血清中で抗原抗体複合体を作成し、 それをキヤビラリ一ゲル電気 泳動で分離分析した結果であり、 ピーク 1が DTBTA-Eu3+標識した抗体の ピークで、 ピーク 2は DTBTA- Eu3+標識した抗体と子牛胎児血清中の未標 識抗原との抗原抗体複合体のピークである。 さらに、 子牛胎児血清中へ 添加する S100蛋白質の濃度を変えて測定した。 その結果の検量線が図 1 2である。 時間分解キヤピラリー電気泳動の方法を用いて nat ive の 方法で抗原を測定できることが分かった。 産業上の利用可能性
本願発明によれば、 電場の強弱に寄らず安定した蛍光強度を示し、 電 気泳動法で用いられる分析対象物の生体物質 (試料) を比較的簡便に標 識できる希土類蛍光金属錯体を標識剤とする標識方法が提供される,。 ま た、 この標識剤に適する分離分析のための泳動条件を提供することによ り、 生体物質 (試料) の高感度な分析を可能とする分析検出法が提供さ れる。

Claims

請求の範囲
1 . 電気泳動法で用いられる試料に希土類蛍光錯体 DTBTA-Eu3+を標識 剤として標識する標識方法。
2 . 電気泳動法が、 キヤピラリー電気泳動、 キヤビラリ一ゾーン電気 泳動、 キヤピラリー等電点電気泳動、 キヤビラリ一等速電気泳動、 キヤ ピラリー SDS電気泳動、 ミセル導電電気泳動、 キヤビラリ一ゲル電気泳 動、 または SDSキヤビラリ一ゲル電気泳動であることを特徵とする請求 項 1に記載の標識方法。
3 . 電気泳動法が、スラブゲル電気泳動法、ディスクゲル電気泳動法、 膜電気泳動法、 濾紙電気泳動法、 SDS- PAGE法、 nat ive-PAGE法、 ァガロ —スゲル法、 等電点電気泳動 (焦点電気泳動) 法、 または免疫電気泳動 法であることを特徴とする請求項 1に記載の標識方法。
4 . プロッティング操作が併用されることを特徵とする請求項 3に記 載の標識方法。
5 . 試料が、 蛋白質、 核酸、 糖質、 または脂質であることを特徴とす る請求項 1から 4のいずれかに記載の標識方法。
6 . 試料がアミノ酸であることを特徵とする請求項 2に記載の標識方 法。
7 . 希土類蛍光錯体 DTBTA-Eu3+を標識した試料の電気泳動法による分 析検出法。
8 . 電気泳動法が、 キヤピラリー電気泳動、 キヤビラリ一ゾーン電気 泳動、 キヤピラリー等電点電気泳動、 キヤビラリ一等速電気泳動、 キヤ ピラリー SDS電気泳動、 ミセル導電電気泳動、 キヤビラリーゲル電気泳 動、 または SDSキヤビラリ一ゲル電気泳動であることを特徴とする請求 項 7に記載の分析検出法。
9 . 電気泳動法が、スラブゲル電気泳動法、ディスクゲル電気泳動法、 膜電気泳動法、 濾紙電気泳動法、 SDS-PAGE法、 nat ive-PAGE法、 ァガロ ースゲル法、 等電点電気泳動 (焦点電気泳動) 法、 または免疫電気泳動 法であることを特徴とする請求項 7に記載の分析検出法。
1 0 . プロッティング操作が併用されることを特徴とする請求項 9 ί 記載の分析検出法。
1 1 . 試料が、 蛋白質、 核酸、 糖質、 または脂質であることを特徴と する請求項 7から 1 0のいずれかに記載の分析検出法。
1 2 . 試料がアミノ酸であることを特徴とする請求項 8に記載の分析 検出法。
1 3 . 電気泳動法による検出方法が時間分解の検出方法であることを 特徵とする請求項 8に記載の分析検出法。
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