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WO2006001380A1 - 物質の製造法 - Google Patents

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WO2006001380A1
WO2006001380A1 PCT/JP2005/011637 JP2005011637W WO2006001380A1 WO 2006001380 A1 WO2006001380 A1 WO 2006001380A1 JP 2005011637 W JP2005011637 W JP 2005011637W WO 2006001380 A1 WO2006001380 A1 WO 2006001380A1
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acid
gene
glutamine
microorganism
protein
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Application number
PCT/JP2005/011637
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English (en)
French (fr)
Inventor
Shin-Ichi Hashimoto
Kazuhiko Tabata
Original Assignee
Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.
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Publication date
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Priority to CN2005800205138A priority patent/CN101065477B/zh
Priority to EP05765117A priority patent/EP1783203B1/en
Priority to JP2006528631A priority patent/JP4898441B2/ja
Priority to DE602005019063T priority patent/DE602005019063D1/de
Priority to AT05765117T priority patent/ATE455845T1/de
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/14—Glutamic acid; Glutamine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/22—Tryptophan; Tyrosine; Phenylalanine; 3,4-Dihydroxyphenylalanine
    • C12P13/227—Tryptophan

Definitions

  • the present invention relates to a microorganism belonging to the genus Escherichia having the ability to generate and accumulate a substance synthesized using nitrogen supplied from L-gnoretamine or L_glutamine, and L using the microorganism. —Gnoretamine or a method for producing the substance.
  • L-gnoretamine itself is a substrate for protein synthesis, and in the biosynthesis of purine and pyrimidine nucleic acids and amino acids such as L-arginine, L-histidine, L-tryptophan, and L-asparagin. Nitrogen supply substrate.
  • GS glutamine synthetase
  • GlnE protein glutamine synthetase zeadenylyltransferase
  • GlnB protein PII regulatory protein for glutamine synthetase 0 or less
  • the GlnB protein When the GlnB protein is uridylylated, the GlnE protein promotes GS deadenylation, and conversely, the GlnB protein is uridylated, and in other cases, the GS adenylylation by the GlnE protein. Promote.
  • the GlnB protein uridilyl and uridilyl are determined by the protein encoded by the glnD gene. Since L-glutamine promotes deuridylation, GS is adeurilylated, reducing its activity, and regulating L-glutamine synthesis.
  • 2-year-old xognoretaric acid promotes uridylation of GlnB protein, and thus L-glutamine synthesis is promoted by the reverse scheme (Non-patent Documents 1 and 2).
  • Patent Document 1 describes that Escherichia coli that produces and accumulates L_glutamine by modifying the GS adenylation site so that it is not adenylylated and enhancing gene expression has been obtained. The production is only 1.3g / L.
  • glutamine-producing bacteria Corynedal Tamcumum flavum, which lacks the glnE gene (Patent Document 2), Corynedal Tamcumum flavum (Patent Document 2), which has a modified g!
  • E. coli and E. coli with enhanced expression of E gene and £ ⁇ gene Patent Document 6
  • Known force GlnE protein and GlnB protein have reduced or lost activity
  • L glutamine or L glutamine Known is a microorganism belonging to the genus Escherichia that has the ability to generate and accumulate a substance that is biosynthesized using nitrogen supplied from the plant, and a method for producing the substance using this microorganism. Tele, nare.
  • Non-Patent Document 2 FEMS Microb. Lett., 201, 91-98 (2001)
  • Patent Document 1 Japanese Patent Laid-Open No. 2003-164297
  • Patent Document 2 JP 2002-300887
  • Patent Document 3 JP-A 57-5693
  • Patent Document 4 US Pat. No. 5,939,295
  • Patent Document 5 JP-A-2001-86998
  • Patent Document 6 Japanese Patent Laid-Open No. 2002-355087
  • An object of the present invention is to provide a microorganism belonging to the genus Escherichia having the ability to generate and accumulate a substance biosynthesized using nitrogen supplied from L-glutamine or L-gnoretamine, and the microorganism Means for solving the problem of providing L-gnoretamine or a method for producing the substance
  • the present invention relates to the following (1) to (: 10).
  • GlnE protein glutamine synthetase adenylyltransferase
  • GlnB protein glutamine synthetase regulatory protein ⁇
  • amino acid is an amino acid selected from the group consisting of L arginine, L tryptophan, L histidine, and L glutamic acid.
  • Nucleic acid is adenosine, inosine, guanosine, xanthosine, cytidine, uridine, thymidine, 5'-adenylic acid, 5'-inosinic acid, 5'-guanylic acid, 5, -cytidylic acid, 5 'xanthylic acid, 5'
  • the microorganism according to any one of the above (1) to (3) is cultured in a medium, and a substance biosynthesized using nitrogen supplied from L dartamine or L-gnoretamine is produced in the medium. Accumulating and collecting L-glutamine or the substance from the medium Rutamine or a method for producing the substance.
  • amino acid is an amino acid selected from the group consisting of L-arginine, L-tryptophan, L-histidine, and L-glutamic acid.
  • Nucleic acid is adenosine, inosine, guanosine, xanthosine, cytidine, uridine, thymidine, 5'-adenylic acid, 5'-inosinic acid, 5'-guanylic acid, 5'-cytidylic acid, 5'-xanthylic acid, The production method of (8) above, which is a nucleic acid selected from the group consisting of 5'-uridylic acid and 5'-thymidylic acid.
  • a microorganism belonging to the genus Escherichia having the ability to generate and accumulate a substance that is biosynthesized using nitrogen supplied from L_glutamine or L-gnoretamine, and the microorganism L-gnoretamine or a method for producing the material is provided.
  • Microorganisms belonging to the genus Escherichia with reduced or lost activity of GlnE protein and GlnB protein are introduced with the glffE gene or glnE gene deletion mutation of existing microorganisms belonging to the genus Escherichia [JHMiller, Experiments in Molecular Genetics, Col d Spring Harbor Lab. (1972)], a method of accumulating in one microorganism belonging to the genus Escherichia, and selecting a strain whose GlnE protein or GlnB protein activity has decreased or lost after mutation treatment such as UV irradiation Method or chromosome D of microorganisms belonging to the genus Escherichia
  • the glnE gene and the glnB gene each comprise a sequence obtained by adding a base sequence including a region that regulates the expression of the gene such as a promoter sequence to the base sequence encoding the GlnE protein or GlnB protein.
  • the microorganism belonging to the microorganism is a microorganism in which the activity of the GlnE protein and the GlnB protein is reduced by introducing the mutation described above, compared to the strain (parent strain) before the mutation introduction, preferably 80% or less, preferably Refers to a microorganism that has been reduced to 50% or less, more preferably 30% or less, even more preferably 20%, particularly preferably 10% or less, and most preferably 5% or less.
  • the activity of GlnE protein and GlnB protein can be measured by a known method.
  • Examples of a method for introducing a deletion, substitution or addition of a base into a chromosomal DNA gene of a microorganism include a method using homologous recombination.
  • a method using homologous recombination a mutant gene into which a base deletion, substitution or addition has been introduced is introduced into which a base deletion or the like is introduced, or a gene which cannot replicate autonomously in a host cell.
  • a method using a plasmid for homologous recombination that can be prepared by ligation with a plasmid DNA having a drug resistance gene can be mentioned, and a preferred method using homologous recombination is using a homologous recombination system of lambda phage. And a method of introducing a base deletion, substitution or addition [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 6641-6645 (2000)].
  • a transformant in which the plasmid for homologous recombination is incorporated into chromosomal DNA by homologous recombination using drug resistance as an indicator select.
  • the obtained transformed strain is cultured in a medium not containing the drug for several hours to 1 day, and then applied to the drug-containing agar medium and the drug-free agar medium, and the latter is not grown on the former medium.
  • a strain that can grow in the medium a strain that has undergone the second homologous recombination on chromosome DNA can be obtained.
  • a linear DNA containing a gene to which a base deletion, substitution or addition is to be introduced is incorporated into a cell, and homologous recombination is performed between the chromosomal DNA and the introduced linear DNA. It is a way to wake up.
  • This method comprises a microorganism belonging to the genus Escherichia having the ability to take up linear DNA, preferably Escherichia coli, more preferably a phage-derived set.
  • Recombinant protein group (Red recombination system) can be expressed and used for rusieria
  • Escherichia coli expressing ⁇ Red recombination system has pKD46 [available from Escherichia coligenetic stock center (Yale University, USA)] which is a plasmid DNA containing Red recombination system gene. You can raise S. E. coli JM101 strain.
  • any drug resistance gene can be used as long as it is a drug resistance gene that imparts drug resistance to a drug to which a host microorganism is sensitive.
  • examples of drug resistance genes include kanamycin resistance gene, chloramphenicol resistance gene, gentamicin resistance gene, spectinomycin resistance gene, tetracycline resistance gene and ampicillin resistance gene. Etc.
  • a gene that can be used for negative selection refers to the gene in a host microorganism. When expressed, it refers to a gene that is lethal to the microorganism under certain culture conditions. Examples of the gene include a ⁇ gene derived from a microorganism belonging to the genus Bacillus [
  • DNA having homology with DNA existing outside both ends of the region on the chromosomal DNA to which substitution or deletion is to be introduced, present at both ends of the above linear DNA is linear DNA. It is arranged in the same direction as that on the chromosomal DNA, and the length is preferably about 10 to 100 bp, more preferably about 20 to 50 bp, and further preferably about 30 to 40 bp.
  • the nucleotide sequence recognized by the yeast-derived Flp recombinase is not particularly limited as long as it is recognized by the protein and catalyzes homologous recombination, but is preferably a DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 9.
  • the DNA having the homology is a DNA having the homology that the homologous recombination occurs in the target region on the chromosomal DNA.
  • Examples thereof include DNA having a homology of 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, and still more preferably 100%.
  • the linear DNA fragment can be prepared by PCR.
  • the desired linear DNA can be obtained by restriction enzyme treatment. More specific methods for introducing base deletion, substitution or addition into the chromosomal DNA of a microorganism using homologous recombination include the following methods 1 to 4.
  • Method 1 Introduce the linear DNA (a) or (d) above into the host microorganism, and select a transformant in which the linear DNA is inserted into the chromosomal DNA by homologous recombination using drug resistance as an index. Method.
  • Method 2 By introducing the linear DNA of (b) above into the transformed strain obtained by Method 1 above and deleting the drug gene inserted into the chromosomal DNA by the method, A method of substituting or deleting a region of.
  • the linear DNA of (c) above is introduced into a host microorganism, and a transformant in which the linear DNA is inserted into chromosomal DNA by homologous recombination is selected using drug resistance as an index.
  • DNA that has homology to DNA located outside both ends of the target region for substitution or deletion on the chromosomal DNA is synthesized by ligating DNA in the same direction as that on the chromosomal DNA. Introduce into the transformant obtained in 1],
  • the linear DNA of (d) above is introduced into a host microorganism, and a transformant in which the linear DNA is inserted into chromosomal DNA by homologous recombination is selected using drug resistance as an index.
  • any method can be used as long as it introduces DNA into the microorganism, for example, a method using calcium ion [Proc. Natl. Acad. Sci "USA, 69, 2110 (1972)], protoplast method (Japanese Patent Laid-Open No. 63-248394), electoral position method [Nucleic Acids Res., 16. 6127 (1988)] Etc.
  • a drug is obtained by using a linear DNA in which an arbitrary gene to be inserted on a chromosomal DNA is inserted near the center of the DNA. At the same time that the resistance gene is deleted, any gene can be inserted into the chromosomal DNA.
  • the above methods 2 to 4 are methods that do not leave a foreign gene such as a drug resistance gene and a gene that can be used for negative selection on the chromosomal DNA of the finally obtained transformant. Therefore, by repeating the operation of the method using the same drug resistance gene and a gene that can be used for negative selection, it is easy to delete bases in two or more regions at different positions on the chromosomal DNA. Microorganisms having substitutions or additions can be produced.
  • Microbial power with decreased or lost activity of GlnE protein and GlnB protein obtained by the above method ability to generate and accumulate substances biosynthesized using nitrogen supplied from L-gnoretamine or L-glutamine
  • the presence of the microorganism can be easily confirmed by culturing the microorganism in a medium, and producing or accumulating L-glutamine or the substance in the medium by a known method, for example, analysis using HPLC or bioassay.
  • Microorganisms belonging to the genus Escherichia that lose the activity of GlnE protein and GlnB protein that can be prepared by the above method and produce and accumulate glutamine include Escherichia coli lacking the glnE gene and the GlnB gene. 'Kori JGLBE1 can be raised.
  • Microorganisms belonging to the genus Escherichia in which the activity of the GlnE protein and GlnB protein is reduced or lost are biosynthesized using nitrogen supplied by L-glutamine, which not only has the ability to produce and accumulate L-gnoretamine. It also has the ability to generate and accumulate materials.
  • Examples of biosynthesized substances using nitrogen supplied from L_glutamine include amino acids and nucleic acids.
  • amino acids L-arginine, L-histidine, L- Nucleic acids such as tryptophan and L-gnoretamic acid are preferably adenosine, inosine, guanosine, xanthosine, cytidine, uridine, thymidine, 5'_dururic acid, 5 'inosinic acid, 5'-guanylic acid, 5'-cytidylic acid 5'-xanthylic acid 5'-uridylic acid and 5'-thymidylic acid.
  • Microorganisms belonging to the genus Escherichia that have the ability to produce and accumulate substances that are biosynthesized using nitrogen supplied from L-glutamine, with the activity of GlnE and GlnB proteins decreased or lost.
  • Escherichia coli JGLBE1 as well as microorganisms obtained by the above method,
  • a microorganism obtained by using a method such as a method of selecting a cell line having a higher resistance to an analog of the substance than a wild type strain alone or in combination can be mentioned.
  • L_glutamine power A known microorganism belonging to the genus Escherichia having the ability to produce a biosynthetic substance using supplied nitrogen is L-arginine-producing bacterium Escherichia coli (Japanese Patent Laid-Open No. 57-5693). Etc.), such as L-tryptophan producing bacterium Escherichia coli (US Pat. No.
  • L histidine producing bacterium Escherichia coli JP 2001-86998
  • L glutamic acid producing bacterium Escherichia coli specialty
  • 5'-inosinic acid producing bacteria such as Escherichia coli (JP 2002-355087), 5'-guanylic acid producing bacteria Escherichia coli (JP 2002-355087), etc.
  • a microorganism belonging to the genus Escherichia that can be prepared by the above method 1 is cultured in a medium, and L-glutamine or a substance that is biosynthesized using nitrogen supplied from L-glutamine is generated and accumulated in the medium.
  • L-glutamine or the substance can be produced by collecting L-gnoretamine or the substance from the medium.
  • Examples of the substance biosynthesized using nitrogen supplied from L-glutamine include the substance 1 described above.
  • the medium used in the production method of the present invention uses the growth of microorganisms of the present invention such as carbon source, nitrogen source, inorganic salts, vitamins, and nitrogen supplied from L-glutamine or L-gnoretamine. As long as the nutrients necessary for biosynthesis of the biosynthesized substance are included, the synthetic medium and the natural medium can be misaligned.
  • any carbon source that can be assimilated by the microorganism to be used can be used.
  • Sugar such as fructose, alcohols such as ethanol and glycerol, organic acids such as acetic acid, etc. Can give.
  • nitrogen source examples include ammonia, ammonium salts such as ammonium sulfate, nitrogen compounds such as amamine, natural nitrogen sources such as peptone and soybean hydrolysate.
  • inorganic salts include potassium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride salt, ferrous sulfate, Examples include potassium carbonate.
  • vitamins examples include piotin and thiamine.
  • a substance required for growth by the microorganism of the present invention for example, a required amino acid in the case of an amino acid-requiring microorganism
  • a required amino acid in the case of an amino acid-requiring microorganism
  • the culture is preferably performed under aerobic conditions such as shaking culture and aeration-agitation culture.
  • the culture temperature is 20-50 ° C, preferably 20-42 ° C, more preferably 28-38 ° C.
  • the culture pH is 5-9, preferably 6-7.5.
  • the culture time is 5 hours to 5 days, preferably 16 hours to 3 days.
  • Substances biosynthesized using nitrogen supplied from L-gnoretamine or L-glutamine accumulated in the medium can be collected by ordinary purification methods.
  • L-gnoretamine can be collected by culturing and removing solids from the cells by centrifugation or the like, followed by ion exchange, concentration, and crystal fractionation.
  • the plasmids pKD46, pKD3, and pCP20 shown below are obtained by obtaining a Escherichia coli strain carrying the plasmid from the Escherichia coli Collogenetic Stock Center (Yale University, USA) and extracting it from the strain by a known method. It was.
  • Escherichia The base sequences of the gln £ and glnn genes of the K12 strain have already been clarified [Science, 5331. 1453-1474 (1997)] 0 Based on the reported base sequences' Using a Biosystems 8905 DNA synthesizer, the DNA consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 1 and 2 as the primer DNA for gene deletion, the SEQ ID NOs: 3 and 4 as the primer DNA for the glnE gene deletion DNA comprising the nucleotide sequence represented was synthesized. Synthesized primer DNA is above the target gene for each deletion. The design was based on the base sequence consisting of 36 bp located downstream and downstream.
  • PCR was performed using the above synthetic DNA as a primer set and pKD3DNA as a saddle type.
  • PCR is 10 ng of plasmid DNA, each primer is 0.5 ⁇ mol / L, EfiiDNA polymerase (Stratagene) 2.5 units, Pfu DNA polymerase X 10 buffer (Stratagene) 4 ⁇ L, deoxyNTP 200 ⁇ mol each 40 ⁇ L of the reaction solution containing / L was used, and the process consisting of 94 ° C for 1 minute, 55 ° C for 2 minutes, and 72 ° C for 3 minutes was repeated 30 times.
  • the resulting upper layer was mixed with 2 volumes of cold ethanol and allowed to stand at ⁇ 80 ° C. for 30 minutes. After centrifuging the solution to precipitate DNA,
  • Escherichia coli JM101 strain lacking £ lnE gene on chromosomal DNA After transformation of Escherichia coli JM101 strain with pKD46, maintain pKD46 on LB agar medium containing 100 mg / l ampicillin Escherichia coli JM101 strain (hereinafter referred to as Escherichia coli JM101 / pKD46) was selected.
  • the obtained chloramphenicol resistant strain was replicated on an LB agar medium containing 25 mg / L chloramphenicol, and single colony separation was carried out in a state kept at 42 ° C. Each obtained colony was replicated on an LB agar medium containing 25 mg / L chloramphenicol and an LB agar medium containing 100 mg / L ampicillin, and colonies showing chloramphenicol resistance and ampicillin sensitivity were selected.
  • this pKD46-eliminated strain was transformed with pCP20, applied to an LB agar medium containing 100 mg / L ampicillin, and cultured at 30 ° C.
  • the grown ampicillin-resistant strain was replicated on a LB agar medium with no drug added, and single colonies were isolated while being kept at 42 ° C. Each colony obtained was replicated on LB agar medium containing no drug, LB agar medium containing 25 mg / L chloramphenicol, and LB agar medium containing 100 mg / L ampicillin, and chloramphenicol sensitive and ampicillin sensitive The colonies showing were selected. Chromosomal DNA was prepared from each of the strains obtained here by a conventional method (Biotechnical Experiments, Japan Biotechnology Society, pages 97-98, Baifukan, 1992). Colony PCR was performed using a primer DNA consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 5 and 6 designed based on the internal sequence of the gkiE gene.
  • Colony PCR is performed by touching the colony with a 200 ⁇ 1 pipette tip, 0.5 ⁇ mol / L of each primer, E £ iDNA polymerase 2.5 units, Pfo DNA polymerase X 10 buffer 4 ⁇ m
  • the strain that did not show gene amplification was confirmed to be a glnE gene-deficient strain and named Escherichia coli JGLE1.
  • Escherichia coli JM101 / pKD46 was transformed with the chloramphenicol resistance gene fragment for glnE gene deletion, and Escherichia coli lacking the ginn gene was obtained. ⁇ Named Kori JGLB 1.
  • Escherichia coli JGLE1 After transforming the Escherichia coli JGLE1 strain obtained in (2) above with pKD46, the strain is applied to an LB agar medium containing 100 mg / L ampicillin and cultured at 30 ° C to preserve pKD46. Acquired 'Kori JGLE1 strain (hereinafter referred to as Escherichia coli JGLEl / pKD46). Using the same procedure as in (2) above, Escherichia coli JGLE1 / DKD46 was transformed using the chloramphenicol resistance gene fragment for glnB gene deletion by the electroless method, and the gene on the chromosomal DNA was deleted. A strain recombined was obtained.
  • Colony PCR was performed under the conditions of (2) above using a primer DNA consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 7 and 8, designed based on the internal sequence of the £ klS gene. Confirm that the strain in which gene amplification was not observed by the PCR was a glnE gene-deficient strain. It was named Sielihia'coli JGLBE1.
  • Escherichia coli JM101, Escherichia coli JGLB1, Escherichia coli JGLE1 and Escherichia coli JGLBE1 obtained in Example 1 were each added to 8 ml of LB medium (lOg / 1 bactotryptone (Difco), 5 g / l yeast extract ( Inoculated into a test tube containing 5 g / l sodium chloride], and cultured at 28 ° C for 17 hours.
  • LB medium lOg / 1 bactotryptone (Difco)
  • 5 g / l yeast extract Inoculated into a test tube containing 5 g / l sodium chloride
  • Each of these cultures was used as a production medium [16 g / L dipotassium hydrogen phosphate, 14 g / L potassium dihydrogen phosphate, 5 g / L ammonium sulfate, 1 g / L citrate (anhydrous), 5 g / L casamino acid (Difco). 10g / L glucose, 10mg / L vitamin B, 25mg / L magnesium sulfate heptahydrate, 50mg / L ferrous sulfate heptahydrate, pH7.2
  • the Escherichia coli JGLBE1 obtained in Example 1 was inoculated into a 300 ml Erlenmeyer flask containing 50 ml of LB medium and cultured at 28 ° C. for 17 hours.
  • Nesym 7 hydrate, 0.2 g / L iron sulfate 7 hydrate, adjusted with 10 mol / L sodium hydroxide to ⁇ 7.2, glucose, vitamin B, magnesium sulfate 7 hydrate, iron sulfate 7 Hydrate is separate
  • 1% was inoculated into a 2L jar mentor containing “added after cooking.”
  • Culture medium pH during culture was maintained at pH 7.0 with 18% ammonium hydroxide, culture temperature was 30 ° C, stirring speed was 900 ⁇ m, and culture was performed while aerated with sterile air through a sterile filter. .
  • a sterilized 60% gno-lecose solution was fed at a rate of 10 to 13 ml per hour.
  • a substance that is biosynthesized using nitrogen supplied from L-glutamine or L-gnoretamine can be efficiently produced.

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Abstract

　本発明によれば、グルタミンシンテターゼアデニリルトランスフェラーゼ(GlnE蛋白質)およびグルタミンシンテターゼ調節蛋白質PIIの活性が低下または喪失し、かつＬ－グルタミンまたはＬ－グルタミンから供給される窒素を利用して生合成される物質を生成、蓄積する能力を有するエシェリヒア属に属する微生物、および該微生物を用いたＬ－グルタミンまたはＬ－グルタミンから供給される窒素を利用して生合成される物質の製造法が提供される。

Description

明 細 書
物質の製造法
技術分野
[0001] 本発明は、 L—グノレタミンまたは L_グルタミンから供給される窒素を利用して生合 成される物質を生成、蓄積する能力を有するェシエリヒア属に属する微生物、および 該微生物を用いた L—グノレタミンまたは該物質の製造法に関する。
背景技術
[0002] ェシエリヒア属に属する微生物などにおいて、 Lーグノレタミンは自身が蛋白質合成 の基質であるとともに、プリンやピリミジンの核酸および L アルギニン、 L ヒスチジ ン、 L トリプトファンおよび L ァスパラギンなどのアミノ酸の生合成において、窒素 の供給基質となっている。
一方、 L—グルタミンの生合成は 遺伝子にコードされるグルタミンシンテターゼ（ GS)によって行われるが、 GS活性は非常に厳密かつ複雑な制御を受けることが知ら れている。すなわち GSはアデユリルイ匕されることで活性を負に調節されている。この アデ二リル化および脱アデ二リル化は g ^遺伝子にコードされるグルタミンシンテター ゼァデニリルトランスフェラーゼ（以下、 GlnE蛋白質と称す）によって触媒され、どちら の方向を触媒するかはさらに £ 遺伝子にコードされるグノレタミンシンテターゼ調節 蛋白質 PII (PII regulatory protein for glutamine synthetase0以下、 GlnB蛋白質と称 す）によって決定される。 GlnB蛋白質がゥリジリルイ匕されている場合は GlnE蛋白質に よる GSの脱アデ二リル化を促進し、逆に GlnB蛋白質がゥリジリル化されてレ、なレ、場合 は GlnE蛋白質による GSのアデ二リル化を促進する。 GlnB蛋白質のゥリジリル、脱ゥリ ジリルイ匕は glnD遺伝子にコードされる蛋白質によって決定される。 L グルタミンは脱 ゥリジリル化を促進するため、 GSはアデユリルイ匕されて活性が低下し、 L グルタミン の合成が低下する調節が働く。一方、 2—才キソグノレタル酸は GlnB蛋白質のゥリジリ ル化を促進するため、上記と逆のスキームにより L グルタミン合成が促進される（非 特許文献 1および 2)。
[0003] 上記した複雑な調節機構を解除することにより L グルタミンを発酵生産する試み がなされている。特許文献 1には、 GSのアデ二リル化部位をアデ二リル化されないよう に改変し、かつ 遺伝子の発現を強化することで L_グルタミンを生成、蓄積する ェシエリヒア'コリが取得されたとの記載はある力 その生産量は 1.3g/Lにすぎない。 また、グルタミン生産菌としては、 glnE遺伝子が欠損したコリネダルタミクム'フラバム (特許文献 2)、 g! 遺伝子を改変しかつ l遺伝子の発現を強化したコリネダルタミ クム'フラバム (特許文献 2)、 L—アルギニン生産菌としては、 areA遺伝子を導入した ェシエリヒア'コリ (特許文献 3)など、 L—トリブトファン生産菌としては、トリブトファンォ ペロン、 遺伝子および^遺伝子を導入したェシエリヒア 'コリ（特許文献 4)など 、 L-ヒスチジン生産菌としては、ァミノキノリン耐性を付与したェシエリヒア 'コリ（特許 文献 5)など、核酸生産菌としては、 5 ' イノシン酸を生産する ΜΐΔ、 deoD、 DurR、 ad d, gsk, edd, xapA. および の各遺伝子が欠損し、脱感作型 lE遺伝子の発 現を強化したェシエリヒア 'コリ (特許文献 6)など、 5 '—グァ二ル酸を生産する ΜΐΔ、 d eoD、。urR、 add, gsk、 edd、 xapA, ushAおよび aohの各遺伝子を欠損し、脱感作 ¾¾ur
E遺伝子および £ Δβ遺伝子の発現を強化したェシエリヒア 'コリ (特許文献 6)などが 知られている力 GlnE蛋白質および GlnB蛋白質の活性が低下もしくは喪失した微生 物であり、かつ L グルタミンまたは L グルタミンから供給される窒素を利用して生 合成される物質を生成、蓄積する能力を有するェシエリヒア属に属する微生物、およ び該微生物を用レ、たし -グノレタミンまたは該物質の製造法は知られてレ、なレ、。
非特霄午文！ 丄： E.coli and Salmonella, Second E ition(1996)
非特許文献 2 : FEMS Microb. Lett., 201, 91-98(2001)
特許文献 1：特開 2003-164297号
特許文献 2：特開 2002-300887号
特許文献 3：特開昭 57-5693号
特許文献 4：米国特許第 5,939,295号
特許文献 5：特開 2001-86998号
特許文献 6：特開 2002-355087号
発明の開示
発明が解決しょうとする課題 [0004] 本発明の目的は、 L—グルタミンまたは L—グノレタミンから供給される窒素を利用し て生合成される物質を生成、蓄積する能力を有するェシエリヒア属に属する微生物、 および該微生物を用いた L—グノレタミンまたは該物質の製造法を提供することにある 課題を解決するための手段
[0005] 本発明は、以下の（1)〜（： 10)に関する。
(1) グルタミンシンテターゼアデ二リルトランスフェラーゼ（以下、 GlnE蛋白質と称す )およびグルタミンシンテターゼ調節蛋白質 ΡΠ (ΡΠ regulatory protein for glutamine s ynthetase0以下、 GlnB蛋白質と称す）の活性が低下または喪失し、かつ L グノレタミ ンまたは L グルタミンから供給される窒素を利用して生合成される物質を生成、蓄 積する能力を有するェシエリヒア属に属する微生物。
(2) ェシエリヒア属に属する微生物が野生型の GlnE蛋白質をコードする遺伝子（以 下、 gkiE遺伝子と称す）、および野生型の GlnB蛋白質をコードする遺伝子（以下、 gin β遺伝子と称す）の塩基配列中に塩基の欠失、置換または付加がある該遺伝子を有 する微生物である、上記（1)の微生物。
(3) ェシエリヒア属に属する微生物がェシエリヒア'コリである、上記（1)または（2)の 微生物。
(4) L_グルタミンから供給される窒素を利用して生合成される物質がアミノ酸また は核酸である、上記（1)〜（3)のレ、ずれか 1つの微生物。
(5) アミノ酸が L アルギニン、 L トリプトファン、 L ヒスチジンおよび L グルタミ ン酸からなる群よりえらばれるアミノ酸である、上記（4)の微生物。
(6) 核酸がアデノシン、イノシン、グアノシン、キサントシン、シチジン、ゥリジン、チミ ジン、 5'—アデニル酸、 5'—イノシン酸、 5 '—グァニル酸、 5，ーシチジル酸、 5 ' キサンチル酸、 5'ーゥリジル酸および 5 '—チミジル酸からなる群よりえらばれる核酸 である、上記（4)の微生物。
(7) 上記（1)〜（3)のいずれか 1つの微生物を培地に培養し、該培地中に L ダル タミンまたは Lーグノレタミンから供給される窒素を利用して生合成される物質を生成、 蓄積させ、該培地から L グルタミンまたは該物質を採取することを特徴とする Lーグ ルタミンまたは該物質の製造法。
(8) L_グルタミンから供給される窒素を利用して生合成される物質がアミノ酸また は核酸である、上記（7)の製造法。
(9) アミノ酸が L—アルギニン、 L—トリプトファン、 L—ヒスチジン、 L—グルタミン酸 力もなる群よりえらばれるアミノ酸である、上記（8)の製造法。
(10) 核酸がアデノシン、イノシン、グアノシン、キサントシン、シチジン、ゥリジン、チ ミジン、 5 '—アデニル酸、 5 '—イノシン酸、 5'—グァニル酸、 5'—シチジル酸、 5' - キサンチル酸、 5'ーゥリジル酸および 5 '—チミジル酸からなる群よりえらばれる核酸 である、上記（8)の製造法。
発明の効果
[0006] 本発明により、 L_グルタミンまたは L—グノレタミンから供給される窒素を利用して生 合成される物質を生成、蓄積する能力を有するェシエリヒア属に属する微生物、およ び該微生物を用いた L—グノレタミンまたは該物質を製造する方法が提供される。 発明を実施するための最良の形態
[0007] 1. GlnE蛋白質および GlnB蛋白質の活性が低下または喪失したェシエリヒア属に属 する微生物とその調製
GlnE蛋白質および GlnB蛋白質の活性が低下または喪失したェシエリヒア属に属す る微生物は、既存のェシエリヒア属に属する微生物が有する glnE遺伝子または glnE 遺伝子欠損変異を Plff 質導入 [J.H.Miller, Experiments in Molecular Genetics, Col d Spring Harbor Lab.(1972)]によって 1種のェシエリヒア属に属する微生物に集積す る方法、 UV照射などの変異処理後、 GlnE蛋白質または GlnB蛋白質の活性が低下ま たは喪失した菌株を選択する方法、またはェシエリヒア属に属する微生物の染色体 D
NA上の 遺伝子および glnn遺伝子の塩基配列に、塩基の欠失、置換または付加 を導入する方法などにより取得することができる。ここで、 glnE遣伝子および glnB遣伝 子は、それぞれ GlnE蛋白質または GlnB蛋白質をコードする塩基配列にプロモーター 配列などの該遺伝子の発現を調節する領域を含む塩基配列が付加した配列よりなる 本発明において GlnE蛋白質および GlnB蛋白質の活性が低下したェシエリヒア属に 属する微生物とは、上記変異を導入することにより、該変異導入前の株 (親株）に比 ベ、 GlnE蛋白質および GlnB蛋白質の活性が低下している微生物であり、好ましくは 8 0%以下、好ましくは 50%以下、より好ましくは 30%以下、さらに好ましくは 20%、特 に好ましくは 10%以下、最も好ましくは 5%以下に低下した微生物をいう。 GlnE蛋白 質および GlnB蛋白質の活性は、公知の方法により測定することができる。
[0008] 微生物の染色体 DNAの遺伝子に塩基の欠失、置換または付加を導入する方法と しては、相同組換えを利用した方法をあげることができる。一般的な相同組換えを利 用した方法としては、塩基の欠失、置換または付加が導入された変異遺伝子を、塩 基の欠失等を導入したレ、宿主細胞内では自立複製できなレ、薬剤耐性遺伝子を有す るプラスミド DNAと連結して作製できる相同組換え用プラスミドを用いる方法をあげる ことができ、好ましい相同組換えを利用した方法としてはラムダファージの相同組換 え系を利用して、塩基の欠失、置換または付加を導入する方法 [Proc. Natl. Acad. S ci. USA, 97, 6641-6645(2000)]をあげることができる。
[0009] 該相同組換え用プラスミドを常法により宿主細胞に導入した後、薬剤耐性を指標に して相同組換えによって染色体 DNA上に該相同組換え用プラスミドが組込まれた形 質転換株を選択する。得られた形質転換株を該薬剤を含有しない培地で数時間〜 1 日間培養した後、該薬剤含有寒天培地、および該薬剤非含有寒天培地に塗布し、 前者の培地で生育せず、後者の培地で生育できる株を選択することで、染色体 DN A上において 2回目の相同組換えが生じた株を取得することができる。染色体 DNA 上の欠失等を導入した遺伝子が存在する領域の塩基配列を決定することで、染色体 DNA上の目的遺伝子に塩基の欠失、置換または付加が導入されたことを確認する こと力 Sできる。また、複数の遺伝子に効率よく塩基の欠失、置換または付加を導入す る相同組換えを利用した方法としては、直鎖 DNAを用いた方法をあげることができる
[0010] 具体的には、塩基の欠失、置換または付加を導入したい遺伝子を含有する直鎖 D NAを細胞内に取り込ませ、染色体 DNAと導入した直鎖 DNAとの間で相同組換え が起こさせる方法である。本方法は、直鎖 DNAを取り込む能力を有するェシエリヒア 属に属する微生物、好ましくはェシエリヒア'コリ、より好ましくはえファージ由来の組 換えタンパク質群 (Red組換え系）を発現してレ、るシヱリヒア 'コリに用いることができる
[0011] λ Red組換え系を発現しているェシエリヒア'コリとしては、 Red組換え系遺伝子 を有するプラスミド DNAである pKD46 [ェシエリヒア'コリジェネティックストックセンタ 一（米国エール大学）より入手可能]を保有するェシエリヒア'コリ JM101株等をあげる こと力 Sできる。
相同組換えに用いられる DNAとしては、
(a)塩基の欠失、置換または付カ卩の導入対象である染色体 DNA上の領域の両端の 外側に存在する DNAと相同性を有する DNAを、薬剤耐性遺伝子の両端に有する 直鎖 DNA、
(b)塩基の欠失、置換または付カ卩の導入対象である染色体 DNA上の領域の両端の 外側に存在する DNAと相同性を有する DNAが連結した直鎖 DNA、
(c)薬剤耐性遺伝子およびネガティブセレクションに用いることができる遺伝子からな る DNAの両端に、塩基の欠失、置換または付加の導入対象である染色体 DNA上 の領域の両端の外側に存在する DNAと相同性を有する DNAを有する直鎖 DNA、 および
(d)上記（a)の直鎖 DNAにおいて、薬剤耐性遺伝子と染色体 DNA上の領域の両 端の外側に存在する DNAと相同性を有する DNAの間に、さらに酵母由来の Flp rec ombinase [Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 82, 5875 (1985)〕が認識する塩基配列を有 する DNA、
をあげることができる。
[0012] 薬剤耐性遺伝子としては、宿主微生物が感受性を示す薬剤に対し、薬剤耐性を付 与する薬剤耐性遺伝子であれば、レ、ずれの薬剤耐性遺伝子も使用することができる 。宿主微生物にェシエリヒア 'コリを用いた場合は、薬剤耐性遺伝子としては、例えば 、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフエ二コール耐性遺伝子、ゲンタマイシン耐性遺 伝子、スぺクチノマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子およびアンピシリ ン耐性遺伝子等をあげることができる。
[0013] ネガティブセレクションに用いることができる遺伝子とは、宿主微生物で該遺伝子を 発現させたとき、一定培養条件下においては、該微生物に致死的である遺伝子のこ とをいい、該遺伝子としては例えば、バチルス属に属する微生物由来の^遺伝子 [
Appl. Environ. Microbiol., 59, 1361-1366 (1993) ]、およびェシエリヒア属に属する微 生物由来の 遺伝子 [Genomics, 72, 99-104(2001)]等をあげることができる。
[0014] 上記の直鎖 DNAの両末端に存在する、置換または欠失の導入対象である染色体 DNA上の領域の両端の外側に存在する DNAと相同性を有する DNAは、直鎖 DN Aにおいて、染色体 DNA上の方向と同じ方向に配置され、その長さは 10bp〜100bp 程度が好ましぐ 20bp〜50bp程度がより好ましぐ 30〜40bp程度がさらに好ましい。 酵母由来の Flp recombinaseが認識する塩基配列とは、該蛋白質が認識し、相同組 換えを触媒する塩基配列であれば、特に限定されないが、好ましくは配列番号 9で表 される塩基配列を有する DNA、および該 DNAにおいて 1個〜数個の塩基が欠失、 置換または付加された塩基配列を有し、かつ酵母由来の Flp recombinaseが認識し、 相同組換えを触媒する塩基配列を有する DNAをあげることができる。
[0015] 上記の相同性を有する DNAとは、上記直鎖 DNAが、染色体 DNA上の目的とす る領域において、相同組換えが起こる程度の相同性を有する DNAであり、具体的な 相同性としては、 80%以上、好ましくは 90%以上、より好ましくは 95%以上、さらに 好ましくは 100%の相同性を有する DNAをあげることができる。
上記塩基配列の相同性は、 Karlin and Altschulによるアルゴリズム BLAST[Pro. Natl . Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)]や FASTA[Methods Enzymol., 183, 63 (1990)]を用 いて決定することができる。このアルゴリズム BLASTに基づいて、 BLASTNや BLASTX とよばれるプログラムが開発されている [J. Mol. Biol., 215, 403(1990)]。 BLASTに基 づいて BLASTNによって塩基配列を解析する場合には、パラメータは例えば Score = 100、 wordlength= 12とする。 BLASTと Gapped BLASTプログラムを用いる場合には、 各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法 は公矢口で ¾>る (http://www.ncbi.nlm.nih.gov·)。
[0016] 上記直鎖 DNA断片は、 PCRにより作製すること力できる。また上記直鎖 DNAを含 む DNAをプラスミド上にて構築した後、制限酵素処理にて目的の直鎖 DNAを得る ことちでさる。 相同組換えを利用した微生物の染色体 DNAに塩基の欠失、置換または付加を導 入する、より具体的な方法としては、以下の方法 1〜4をあげることができる。
方法 1：上記（a)または（d)の直鎖 DNAを宿主微生物に導入し、薬剤耐性を指標に 該直鎖 DNAが染色体 DNA上に相同組換えにより挿入された形質転換株を選択す る方法。
方法 2：上記方法 1により取得された形質転換株に、上記 (b)の直鎖 DNAを導入し、 該方法により染色体 DNA上に挿入された薬剤遺伝子を削除することにより、微生物 の染色体 DNA上の領域を置換または欠失させる方法。
方法 3 :
[1]上記（c)の直鎖 DNAを宿主微生物に導入し、薬剤耐性を指標に該直鎖 DNA が染色体 DNA上に相同組換えにより挿入された形質転換株を選択する、
[2]染色体 DNA上の置換または欠失の対象領域の両端の外側に位置する DNAと 相同性を有する DNAを、染色体 DNA上における方向と同一の方向で連結した DN Aを合成し、上記 [1]で得られた形質転換株に導入する、
[3]ネガティブセレクションに用いることができる遺伝子が発現する条件下において、 上記 [2]の操作を行った形質転換株を培養し、該培養において生育可能な株を、薬 剤耐性遺伝子およびネガティブセレクションに用いることができる遺伝子が染色体 D NA上力 削除された株として選択する方法。
方法 4 :
[1]上記（d)の直鎖 DNAを宿主微生物に導入し、薬剤耐性を指標に該直鎖 DNA が染色体 DNA上に相同組換えにより挿入された形質転換株を選択する、
[2]上記 [1]で得られた形質転換株に Flp recombinase遺伝子発現プラスミドを導入 し、該遺伝子を発現させた後、上記 [1]で用いた薬剤に感受性である株を取得する 方法。
上記方法で用いられる、直鎖 DNAを宿主微生物に導入する方法としては、該微生 物へ DNAを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムィ オンを用いる方法 [Proc. Natl. Acad. Sci" USA, 69, 2110 (1972)]、プロトプラスト法（ 特開昭 63-248394)、エレクト口ポレーシヨン法 [Nucleic Acids Res., 16. 6127 (1988)] 等をあげることができる。
[0018] 方法 2または方法 3 [2]で用いられる直鎖 DNAにおいて、該 DNAの中央部付近に 、染色体 DNA上に挿入したい任意の遺伝子を組み込こんだ直鎖 DNAを用いること により、薬剤耐性遺伝子等を削除するのと同時に、任意の遺伝子を染色体 DNA上 に揷入することができる。
上記方法 2〜4は、最終的に得られる形質転換株の染色体 DNA上には薬剤耐性 遺伝子およびネガティブセレクションに用いることができる遺伝子等の外来遺伝子を 残さない方法である。よって、同一の薬剤耐性遺伝子およびネガティブセレクション に用いることができる遺伝子を用いて、該方法の操作を繰り返すことにより、容易に染 色体 DNA上の位置の異なる 2以上の領域に塩基の欠失、置換または付加を有する 微生物を製造することができる。
[0019] 上記方法により取得された GlnE蛋白質および GlnB蛋白質の活性が低下もしくは喪 失した微生物力 Lーグノレタミンまたは L グルタミンから供給される窒素を利用して 生合成される物質を生成、蓄積する能力を有することは、該微生物を培地に培養し、 該培地中に生成、蓄積する L グルタミンまたは該物質を公知の方法、例えば HPLC を用いた分析またはバイオアツセィ等により容易に確認することができる。
[0020] 上記方法により調製できる GlnE蛋白質および GlnB蛋白質の活性が喪失し、かっし —グルタミンを生成、蓄積するェシエリヒア属に属する微生物としては、 glnE遣伝子お よび GlnB遺伝子が欠損しているェシエリヒア'コリ JGLBE1をあげることができる。
上記した GlnE蛋白質および GlnB蛋白質の活性が低下または喪失したェシエリヒア 属に属する微生物は、 L—グノレタミンを生成、蓄積する能力を有するだけでなぐ L- グルタミン力 供給される窒素を利用して生合成される物質を生成、蓄積する能力も 有する。
[0021] L_グルタミンからから供給される窒素を利用して生合成される物質としてはァミノ 酸および核酸などをあげることができ、アミノ酸としては、好ましくは L—アルギニン、 L —ヒスチジン、 L—トリプトファンおよび L—グノレタミン酸など、核酸としては、好ましくは アデノシン、イノシン、グアノシン、キサントシン、シチジン、ゥリジン、チミジン、 5 ' _ァ デュル酸、 5' イノシン酸、 5 '—グァニル酸、 5 'ーシチジル酸、 5 'ーキサンチル酸 、 5 '—ゥリジル酸および 5 '—チミジル酸などをあげることができる。
[0022] GlnE蛋白質および GlnB蛋白質の活性が低下または喪失し、かつ L—グルタミンか ら供給される窒素を利用して生合成される物質を生成、蓄積する能力を有するェシ エリヒア属に属する微生物としては、ェシエリヒア'コリ JGLBE1をあげることができる他、 上記方法で得られる微生物に、さらに、
(a)該物質の生合成を制御する機構の少なくとも 1つを緩和または解除する方法、
(b)該物質の生合成に関与する酵素の少なくとも 1つを発現強化する方法、
(c)該物質の生合成に関与する酵素遺伝子の少なくとも 1つのコピー数を増加させる 方法、
(d)該物質の生合成経路から該アミノ酸以外の代謝産物へ分岐する代謝経路の少 なくとも 1つを弱化または遮断する方法、および
(e)野生型株に比べ、該物質のアナログに対する耐性度が高い細胞株を選択する方 法、などの方法を単独または組み合わせて用いて取得される微生物をあげることが できる。
[0023] 該物質がアミノ酸である場合、上記（a)については、例えば Agric. Biol. Chem., 43, 105— 111(1979)、 J. Bacteriol., 110, 761— 763(1972)および Appl. Microbiol. Biotechnol ·, 39, 318-323(1993)など、上記（b)については、例えば Agric. Biol. Chem., 43, 105- 111(1979)および J. Bacteriol., 110, 761- 763(1972)など、上記（c)については、例え ば Appl. Microbiol. Biotechnol, 39, 318-323(1993)および Agric. Biol. Chem., 39, 37 1-377(1987)など、上記（d)については、例えば AppL Environ. MicribioL, 38, 181-19 0(1979)および Agric. Biol. Chem. , 42, 1773-1778(1978)など、上記（e)については、 例えば Agric. Biol. Chem., 36, 1675— 1684(1972)、 Agric. Biol. Chem., 41, 109-116(1 977)、 Agric. Biol. Chem., 37, 2013-2023(1973)および Agric. Biol. Chem., 51, 2089- 2094(1987)などに記載されている。また、該物質が核酸である場合、上記（a)〜（e) の 体的 方法は、 Biotechnology second, completely revised eddition, ed. H. J. Re hm, . Reed, A. Puhler, and P. Stadler, vol. 6， products of primary metabolism" ed . M. Roehr, VCH verlagsgesellschaft mbH, Weinheim(1996)および特開 2002-35508 7号などに記載されている。 [0024] また、 L—グノレタミン力 供給される窒素を利用して生合成される物質を生産する能 力を有することがすでに知られているェシエリヒア属に属する微生物の GlnE蛋白質お よび GlnB蛋白質の活性を上記した方法により低下または喪失させる方法によって得 られる微生物も本発明の微生物としてあげることができる。
L_グルタミン力 供給される窒素を利用して生合成される物質を生産する能力を 有する公知のェシエリヒア属に属する微生物としては、 L—アルギニン生産菌である ェシエリヒア'コリ (特開昭 57-5693号)など、 L—トリプトファン生産菌であるェシエリヒア 'コリ（米国特許第 5,939,295号）、 L ヒスチジン生産菌であるェシエリヒア 'コリ（特開 2001-86998)、 L グルタミン酸生産菌であるェシエリヒア'コリ（特開平 5-244970)、 5 '—イノシン酸生産菌である、ェシエリヒア 'コリ (特開 2002-355087)、 5 '—グァニル酸 生産菌であるェシエリヒア'コリ (特開 2002-355087)などをあげることができる。
2.本発明の製造法
上記 1の方法で調製することができるェシエリヒア属に属する微生物を培地に培養 し、該培地中に L グルタミンまたは L グルタミンから供給される窒素を利用して生 合成される物質を生成、蓄積させ、該培地から Lーグノレタミンまたは該物質を採取す ることにより L グルタミンまたは該物質を製造することができる。
[0025] L グルタミンから供給される窒素を利用して生合成される物質としては、上記 1の 物質をあげることができる。
本発明の製造法で用レ、られる培地は、炭素源、窒素源、無機塩、ビタミンなど本発 明の微生物の増殖、および L—グルタミンまたは L—グノレタミンからから供給される窒 素を利用して生合成される物質の生合成に必要な栄養素を含む限り、合成培地、天 然培地のレ、ずれでもよレヽ。
[0026] 炭素源としては、使用する微生物の資化できる炭素源であればいずれでもよぐグ ノレコース、フラクトースのような糖質、エタノール、グリセロールのようなアルコール類、 酢酸のような有機酸類などをあげることができる。
窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニゥム等のアンモニゥム塩、ァミン等の窒 素化合物、ペプトン、大豆加水分解物のような天然窒素源などをあげることができる。
[0027] 無機塩としては、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、塩ィ匕ナトリウム、硫酸第一鉄、 炭酸カリウムなどをあげることができる。
ビタミンとしては、ピオチンやチアミンなどをあげることができる。さらに必要に応じて 本発明の微生物が生育に要求する物質 (例えばアミノ酸要求性の微生物であれば 要求アミノ酸）を添加することができる。
[0028] 培養は、好ましくは振とう培養や通気攪拌培養のような好気的条件で行う。培養温 度は 20〜50°C、好ましくは 20〜42°C、より好ましくは 28〜38°Cである。培養 pHは 5〜9 、好ましくは 6〜7.5である。培養時間は、 5時間〜 5日間、好ましくは 16時間〜 3日間で ある。
培地中に蓄積した Lーグノレタミンまたは L—グルタミンからから供給される窒素を利 用して生合成される物質は、通常の精製方法によって採取することができる。例えば L—グノレタミンは、培養後、遠心分離などで菌体ゃ固形物を除いたあと、イオン交換 、濃縮、結晶分別によって採取することができる。
[0029] 以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は下記実施例に限定さ れるものではない。
実施例 1
[0030] glnE遣伝子、 sing遺伝子が欠損した微生物の作製
ェシエリヒア'コリの染色体 DNA上の特定遺伝子の欠損は、ラムダファージの相同 組換え系を利用した方法 [Pro Natl. Acad. Sci. USA., 97, 6641- 6645(2000)]に従 つて行った。なお、以下に示すプラスミド pKD46、 pKD3および pCP20は、ェシエリヒア' コリジェネティックストックセンター（米国エール大学)から該プラスミドを保持するェ シエリヒア'コリ株を入手し、当該株から公知の方法により抽出して用いた。
(1)遺伝子欠損用薬剤耐性遺伝子断片のクローニング
ェシエリヒア 'コリ K12株の gln£、 glnnの各遺伝子の塩基配列は既に明らかにされて レ、る [Science, 5331. 1453-1474(1997)] 0報告されている塩基配列に基づいてパーセ プティブ'バイオシステムズ社製 8905型 DNA合成機を用いて、 £遺伝子欠損用の プライマー DNAとして配列番号 1および 2で表される塩基配列からなる DNA、 glnE 遺伝子欠損用のプライマー DNAとして配列番号 3および 4で表される塩基配列から なる DNAを合成した。合成したプライマー DNAは、各々の欠失の標的遺伝子の上 流と下流に位置する 36bpからなる塩基配列に基づき設計した。
[0031] 上記合成 DNAをそれぞれプライマーセットとして用レ、、 pKD3DNAを铸型として P CRを行った。 PCRはプラスミド DNA 10ng、プライマー各 0.5 μ mol/L、 EfiiDNAポリメ ラーゼ (ストラタジーン社製） 2.5units、 Pfu DNAポリメラーゼ用 X 10緩衝液 (ストラタジ ーン社製) 4 μ L、 deoxyNTP各 200 μ mol/Lを含む反応液 40 μ Lを用レ、、 94°Cで 1分間 、 55°Cで 2分間、 72°Cで 3分間からなる工程を 30回繰り返すことにより行った。
[0032] 該反応液の 1/10量をァガロースゲル電気泳動し、 目的の断片が増幅していることを 確認後、残りの反応液と等量の TE[10 mmol/L Tris_HCl(pH8.0)、 lmmol/L EDTA] 飽和フエノール/クロ口ホルム（lvol/lvol)溶液を添加し、混合した。
該混合液を遠心分離後、得られた上層に 2倍容量の冷エタノールを加えて混合し、 -80°Cに 30分間放置した。該溶液を遠心分離して DNAを沈殿させた後、該 DNAを 2
0 しの丁£に溶解した。上記操作により、 glnE遺伝子欠損用、および glnE遺伝子欠損 用のクロラムフエ二コール耐性遺伝子断片をそれぞれ取得した。
(2)染色体 DNA上の £lnE遺伝子が欠損したェシエリヒア 'コリ JM101株の作製 ェシエリヒア 'コリ JM 101株を pKD46で形質転換した後、 100mg/lのアンピシリンを含 む LB寒天培地上で pKD46を保持するェシエリヒア'コリ JM101株（以下、ェシエリヒア' コリ JM101/pKD46と称す）を選択した。 10mmol/Lの L-ァラビノースと 50 μ g/mlのアン ピシリン存在下で培養したェシエリヒア'コリ JM101/pKD46を、電気パルス法により gin E遺伝子欠損用クロラムフヱニコール耐性遺伝子断片を用いて形質転換し、 JM101株 の染色体 DNA上の glnE遺伝子にクロラムフエ二コール耐性遺伝子が揷入され、 glnE 構造遺伝子が欠損するように組換えられた株を 25mg/Lのクロラムフヱニコールを含 む LB寒天培地上で選択した。
[0033] 取得したクロラムフエ二コール耐性株を、 25mg/Lのクロラムフエ二コールを含む LB 寒天培地にレプリカし、 42°Cで保温した状態で単コロニー分離を実施した。得られた 各コロニーを 25mg/Lのクロラムフエ二コール含む LB寒天培地、および 100mg/Lのァ ンピシリンを含む LB寒天培地にレプリカし、クロラムフエ二コール耐性かつアンピシリ ン感受性を示すコロニーを選択した。次にこの pKD46脱落株を pCP20で形質転換し、 100mg/Lのアンピシリンを含む LB寒天培地に塗布して、 30°Cでー晚培養した。 [0034] 生育してきたアンピシリン耐性株を薬剤無添カ卩の LB寒天培地にレプリカし、 42°Cで 保温した状態で単コロニー分離を実施した。得られた各コロニーを薬剤無添加の LB 寒天培地、 25mg/Lのクロラムフエ二コール含む LB寒天培地、および 100mg/Lのアン ピシリンを含む LB寒天培地にレプリカし、クロラムフエ二コール感受性かつアンピシリ ン感受性を示すコロニーを選択した。ここで得られた各株からそれぞれ染色体 DNA を常法 (生物工学実験書、 日本生物工学会編 97〜98頁、培風館、 1992年)により調 製した。 gkiE遺伝子の内部配列を元に設計した配列番号 5および 6で表される塩基 配列からなるプライマー DNAを用いて、コロニー PCRを行った。
コロニー PCRは、 200 μ 1のピペットチップをコロニーに触れさせることで取得した量 の菌体、プライマー各 0.5 μ mol/L、 E£iDNAポリメラーゼ 2.5units、 Pfo DNAポリメラー ゼ用 X 10緩衝液 4 μ L、 deoxyNTP各 200 μ mol/Lを含む反応液 40 μ 1を用レ、、 94°Cで 1分間、 55°Cで 2分間、 72°Cで 3分間からなる工程を 30回繰り返すことにより行った。 P CRに供した株のうちで遺伝子増幅の見られなかった株は、 glnE遺伝子欠損株である ことを確認し、ェシエリヒア'コリ JGLE1と命名した。
[0035] また、上記と同様の操作により、ェシエリヒア'コリ JM101/pKD46を glnE遺伝子欠損 用クロラムフエ二コール耐性遺伝子断片を用いて形質転換し、 ginn遺伝子が欠損し たェシエリヒア ·コリを取得し、ェシエリヒア ·コリ JGLB 1と命名した。
(3)染色体 DNA上の ginE遺伝子および glnS遺伝子が欠損したェシエリヒア'コリ JM1
01株の作製
上記（2)で得られたェシエリヒア'コリ JGLE1株を pKD46で形質転換した後、 100mg/ Lのアンピシリンを含む LB寒天培地に塗布し、 30°Cでー晚培養することにより pKD46 を保持するェシエリヒア'コリ JGLE1株（以下、ェシエリヒア'コリ JGLEl/pKD46と称す） を取得した。上記（2)と同様の操作により、ェシエリヒア'コリ JGLE1/DKD46を glnB遣 伝子欠損用クロラムフエニコール耐性遺伝子断片を用いて電気ノ^レス法により形質 転換し、染色体 DNA上の 遺伝子が欠損するように組換えられた株を取得した。
£klS遺伝子の内部配列を元に設計した配列番号 7および 8で表される塩基配列から なるプライマー DNAを用いて、上記（2)の条件下でコロニー PCRを行った。該 PCR により遺伝子増幅が見られなかった株は、 glnE遺伝子欠損株であることを確認し、ェ シエリヒア'コリ JGLBE1と命名した。
実施例 2
[0036] glnE遺伝子、 遺伝子が欠損した微生物を用いた L グルタミンの発酵生産（1)
ェシエリヒア 'コリ JM101、実施例 1で得られたェシエリヒア 'コリ JGLB1、ェシエリヒア •コリ JGLE1およびェシエリヒア'コリ JGLBE1をそれぞれ 8mlの LB培地 [lOg/1バクトトリ プトン (ディフコ社製）、 5g/lイーストエキス (ディフコ社製）、 5g/l塩ィ匕ナトリウム]が入 つている試験管に接種し、 28°Cで 17時間培養した。該培養液をそれぞれ生産培地 [1 6g/Lリン酸水素二カリウム、 14g/Lリン酸二水素カリウム、 5g/L硫酸アンモニゥム、 1 g/Lクェン酸（無水）、 5g/Lカザミノ酸（ディフコ社製）、 10g/Lグルコース、 10mg/L ビタミン B、 25mg/L硫酸マグネシウム · 7水和物、 50mg/L硫酸鉄 · 7水和物、 pH7.2
1
に 10mol/Lの水酸化ナトリウムで調整、グルコース、ビタミン B、硫酸マグネシウム · 7
1
水和物、硫酸鉄 · 7水和物は別個に蒸煮後添加した]が 8ml入っている試験管に 1 % 接種し、 30°Cで 24時間培養した後、該培養液を遠心分離し培養上清を取得した。
[0037] 培養上清中の生成物を F_moc化法で誘導体化した後に HPLC法により分析した。 H PLC法による分析は、分離カラムに ODS- HG5 (野村化学社製）、溶離液として八液（ 酢酸 6ml/l、 20。/。(ν/ν)ァセトニトリル、トリェチルァミンにて ρΗ4·8に調整）および Β液 (酢酸 6ml/l、 70%(v/v)ァセトニトリル、トリェチルァミンにて ρΗ4·8に調整）を用い、 分析開始後 5分までは Α液： B液 =8： 2、 5分〜 20分までは、 20分に達したときに A液： B液 = 1： 1になるようにリニアーグラジェントをかける条件で分析を行った。結果を表 1 に示す。
[0038] [表 1] L-グルタミン （mg/L) L-グルタミン酸 （mg/L)
JM101 0 24
JGLB1 0 25
JGLE1 10 53
JGLBE1 620 29
[0039] 表 1に示すように、 £ΐπΕ遺伝子または glnS遺伝子の単独欠損株であるェシエリヒア- コリ JGLB1およびェシエリヒア'コリ JGLE1に比べ、 glnE遺伝子および glnB遺伝子力 ^ 欠損しているェシエリヒア'コリ JGLBE1は、培地中に著量の L グノレタミンを蓄積する ことがわかった。
実施例 3
slnE遺伝子および glnE遺伝子が欠損した微生物を用いた L グルタミンの発酵生産 (2)
実施例 1で得られたェシエリヒア 'コリ JGLBE1を 50mlの LB培地が入っている 300ml 容の三角フラスコに接種し、 28°Cで 17時間培養した。
[0040] 該培養液を 950mlのジャー培養用生産培地 [7g/Lリン酸二水素カリウム、 5g/L塩 化アンモニゥム、 lg/Lクェン酸 (無水）、 5g/L酵母エキス (極東製薬工業社製）、 10m g/L硫酸マンガン · 7水和物、 20g/Lグルコース、 10mg/Lビタミン B、 2g/L硫酸マグ
1
ネシゥム · 7水和物、 0.2g/L硫酸鉄 · 7水和物、 ρΗ7.2に 10mol/Lの水酸化ナトリウムで 調整、グルコース、ビタミン B、硫酸マグネシウム · 7水和物、硫酸鉄 · 7水和物は別個
1
に蒸煮後添加した]が入っている 2Lのジャーフアーメンターに 1 %接種した。培養中 の培地 pHは 18%水酸化アンモニゥムで pH7.0に保持し、培養温度 30°C、撹拌速度 90 0卬 m、滅菌フィルターで除菌した圧縮空気を l.Owmで通気しながら培養した。最初 に添カ卩したグノレコースがなくなった後（24時間後）、滅菌した 60%グノレコース溶液を 1 時間あたり 10〜 13mlの速度で供給した。
50時間培養した後の培養液を実施例 2と同様の方法で分析した結果、培養液中に は 8.0g/Lの L グノレタミンが蓄積していた。
産業上の利用可能性
[0041] 本発明により、 L グルタミンまたは Lーグノレタミンから供給される窒素を利用して生 合成される物質を効率よく製造することができる。
配列表フリ' —テキスト
[0042] 配列番号 1 - -人工配列の説明 ：合成 DNA
配列番号 2 - -人工配列の説明 ：合成 DNA
配列番号 3 - -人工配列の説明 ：合成 DNA
配列番号 4 - -人工配列の説明 ：合成 DNA
配列番号 5 - -人工配列の説明 ：合成 DNA
配列番号 6 - -人工配列の説明 ：合成 DNA
配列番号 7 - -人工配列の説明 ：合成 DNA
配列番号 8 - -人工配列の説明 ：合成 DNA
配列番号 9 - -人工配列の説明 ：合成 DNA

Claims

請求の範囲
[1] グルタミンシンテターゼアデ二リルトランスフェラーゼ（以下、 GlnE蛋白質と称す）およ びグノレタミンシンテターゼ調節蛋白質 ΡΠ (ΡΠ regulatory protein for glutamine synthe tase0以下、 GlnB蛋白質と称す）の活性が低下または喪失し、かつ L グノレタミンまた は L グルタミン力 供給される窒素を利用して生合成される物質を生成、蓄積する 能力を有するェシエリヒア属に属する微生物。
[2] ェシエリヒア属に属する微生物が野生型の GlnE蛋白質をコードする遺伝子、および 野生型の GlnB蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列中に塩基の欠失、置換または 付加がある該遺伝子を有する微生物である、請求項 1記載の微生物。
[3] ェシエリヒア属に属する微生物がェシエリヒア'コリである、請求項 1または 2記載の微 生物。
[4] L—グノレタミンから供給される窒素を利用して生合成される物質がアミノ酸または核酸 である、請求項 1〜3のいずれか 1項に記載の微生物。
[5] アミノ酸が L—アルギニン、 L—トリプトファン、 L—ヒスチジンおよび L—グルタミン酸 力もなる群より選ばれるアミノ酸である、請求項 4記載の微生物。
[6] 核酸がアデノシン、イノシン、グアノシン、キサントシン、シチジン、ゥリジン、チミジン、
5 '—アデニル酸、 5 '—イノシン酸、 5，—グァニル酸、 5 '—シチジル酸、 5，—キサン チル酸、 5 '—ゥリジル酸および 5 '—チミジル酸からなる群より選ばれる核酸である、 請求項 4記載の微生物。
[7] 請求項 1〜3のいずれ力 1項に記載の微生物を培地に培養し、該培地中に L—ダル タミンまたは Lーグノレタミンから供給される窒素を利用して生合成される物質を生成、 蓄積させ、該培地から L グルタミンまたは該物質を採取することを特徴とする Lーグ ルタミンまたは該物質の製造法。
[8] Lーグノレタミンから供給される窒素を利用して生合成される物質がアミノ酸または核酸 である、請求項 7記載の製造法。
[9] アミノ酸が L アルギニン、 L トリプトファン、 L ヒスチジンおよび L グルタミン酸 力もなる群より選ばれるアミノ酸である、請求項 8記載の製造法。
[10] 核酸がアデノシン、イノシン、グアノシン、キサントシン、シチジン、ゥリジン、チミジン、 5'—アデニル酸、 5'—イノシン酸、 5，—グァニル酸、 5'—シチジル酸、 5，—キサン チル酸、 5'—ゥリジル酸および 5'—チミジル酸からなる群よりえらばれる核酸である、 請求項 8記載の製造法。
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