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WO2006001364A1 - ヒトパピローマウイルス疾患治療薬および抗ヒト免疫不全ウイルス薬 - Google Patents

ヒトパピローマウイルス疾患治療薬および抗ヒト免疫不全ウイルス薬 Download PDF

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WO2006001364A1
WO2006001364A1 PCT/JP2005/011600 JP2005011600W WO2006001364A1 WO 2006001364 A1 WO2006001364 A1 WO 2006001364A1 JP 2005011600 W JP2005011600 W JP 2005011600W WO 2006001364 A1 WO2006001364 A1 WO 2006001364A1
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WO
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lignin
active ingredient
polymer
main active
solution
Prior art date
Application number
PCT/JP2005/011600
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English (en)
French (fr)
Inventor
Hiroshi Sakagami
Yutaka Kawazoe
Mamitarou Otsuki
Youichi Inaba
Bun Sai
Akira Horiuchi
Hideki Nakajima
Chiaki Aratsu
Original Assignee
Nihonsyouyaku Laboratory Corporation
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Publication date
Application filed by Nihonsyouyaku Laboratory Corporation filed Critical Nihonsyouyaku Laboratory Corporation
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    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants

Definitions

  • the present invention relates to a human papillomavirus disease therapeutic agent, and a phenylpropenoid, which is an extract mainly composed of lignin and lignin-like polysaccharide, and mainly contains a component called pinosol or pureanol.
  • the present invention relates to a therapeutic drug for human papillomavirus disease and an anti-human immunodeficiency virus drug, which mainly comprises a synthetic polymer obtained by dehydrogenation polymerization.
  • the present inventors examined the effectiveness of the extract obtained from pine strength especially for other viral diseases, and found that it has a very excellent therapeutic effect on human papillomavirus disease! I started out.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Laid-Open No. 3-206043
  • Patent Document 2 JP-A-1-238532
  • Patent Document 3 JP-A-1-238533
  • Patent Document 4 Japanese Patent Laid-Open No. 1-6218
  • Patent Document 5 JP-A-64-4601
  • Patent Document 6 Japanese Patent Laid-Open No. 62-205032
  • the subject of the present invention is obtained by dehydration polymerization of human papillomavirus disease drugs and phenolic propenoids, which mainly contain an extract containing lignin and lignin-like polysaccharide as main components.
  • the object is to provide a therapeutic agent for human papillomavirus disease and an anti-human immunodeficiency virus agent comprising a synthetic polymer as a main active ingredient.
  • an extract containing lignin and a capita-like polysaccharide as a main component obtained by hot water extraction or aqueous alkaline solution extraction of pine cones (hereinafter referred to as "lignin-like extract”). ) Is a therapeutic agent for human papillomavirus disease.
  • the present invention provides a synthetic polymer obtained by dehydrogenation polymerization of a fuel propenoid represented by the following formula (1) (hereinafter referred to as "polymer [I]").
  • the main active ingredient is human papilloma, a therapeutic agent for mavirus disease.
  • R 1 represents a hydroxyl group or a methoxy group
  • n is an integer of 1 to 5
  • one or more of R 1 is a hydroxyl group
  • R 2 represents a carboxyl group, a hydroxymethyl group or a methoxy group.
  • a carboxyl group is shown.
  • “human papillomavirus” is expressed as “HPV”.
  • the present invention provides an anti-human immunodeficiency virus drug comprising the polymer [I] as a main active ingredient.
  • HIV human immunodeficiency virus
  • the lignin-like extract which is the main active ingredient of one therapeutic agent for HPV disease of the present invention, is obtained by hot water extraction of pine cone or alkaline aqueous solution extraction, and contains lignin and lignin-like polysaccharide.
  • the pine strength used as the raw material for the lignin-like extract is not particularly limited, and various pine strengths such as black pine, red pine, and five leaf pine can be used.
  • the extraction of pine cones is performed with hot water or an aqueous alkaline solution.
  • the lignin-like extract of the present invention comprises components eluted by hot water extraction, components eluted by alkaline aqueous extraction, and hot water. Any of the components eluted by further extracting the residue after extraction with an aqueous alkaline solution, or a mixture of any two or more of these components may be used.
  • the hot water extract contains oil, since this oil contains medicinal ingredients, both non-oil and oil may be administered together when taken orally.
  • Extraction of pine cones with hot water can be performed in accordance with, for example, the methods described in Patent Document 5 and Patent Document 6, and after washing the pine cone as a raw material with cold water or slightly warm water as necessary. Alternatively, it is performed by degreasing and removing low molecular weight substances by washing with alcohol, followed by boiling or roasting in hot water for a certain period of time, and performing these under reflux.
  • the processing conditions such as the amount and temperature of hot water used, the number of extractions, the processing temperature, and the processing time are appropriately selected according to the harvest time, drying state, and amount of pine force used as the raw material. can do.
  • each extract may be administered individually, or two or more extracts may be administered together, but the first extract alone and those containing the extract are preferred.
  • the obtained hot water extract After the obtained hot water extract is cooled to room temperature, it can be administered orally or by injection as it is or after adjusting the concentration.
  • the extract after cooling can be administered by filtering with a gauze, filter paper or the like. If the extract contains oil, the oil may be removed using a separatory funnel, for example.
  • the active ingredient contained in the hot water extract can be fractionated as follows, and each fraction can be administered alone or in admixture of two or more.
  • the hot water extract is filtered to remove insolubles, the filtrate is concentrated under reduced pressure, ethanol (EtOH) is added, and the resulting precipitate is collected by filtration. Then, the precipitate is dissolved in distilled water, and the resulting aqueous solution is dialyzed against distilled water and then treated with a DE AE cellulose column (C1-type) equilibrated with distilled water. Obtain I and adsorbed fraction. The adsorbed fraction was then eluted with 0.5M aqueous sodium chloride solution, 2M aqueous sodium chloride solution or 0.15M aqueous sodium hydroxide solution to give Fr.II, Fr.III and (Fr.IV + Fr.V, respectively). ) Each fraction.
  • Fr.V was further removed by gel filtration with 0.15N sodium hydroxide aqueous solution using Sepharose CL-4B. (Molecular weight range 1 to 70,000) and Fr.V-2 (molecular weight range 70 to 200,000).
  • the pine strength extraction treatment with an alkaline aqueous solution can be performed in accordance with, for example, the method described in Patent Document 5, and after washing the pine cone as a raw material with cold water or slightly warm water as necessary, or After degreasing and removing low-molecular substances by washing with alcohol, the residue treated directly or by hot water extraction as described above is extracted with an aqueous alkaline solution.
  • the concentration of the aqueous alkaline solution used for the aqueous alkaline solution extraction can be selected as appropriate, but it is preferably not so high because the pH is adjusted to weak acidity in the subsequent step.
  • the processing conditions such as the amount of alkaline aqueous solution used, the number of extractions, the processing temperature, the processing time, etc. depend on the harvest time and drying state of the raw material, pine force, the amount of pine force used, the amount of hot water extraction residue, etc. According Can be selected as appropriate.
  • the extract solution after extraction with alkaline aqueous solution is centrifuged or filtered to separate the precipitate fraction Fr.VI, and then the pH is adjusted to usually 4-6, preferably around 5, with acetic acid, carbonic acid, etc. The Then, add 1 volume of ethanol (EtOH) (EtOH) to the aqueous phase and mix, mix the resulting precipitate, for example by centrifugation or filtration, and separate the precipitate fraction Fr.VII. Separate the precipitate fraction Fr.VIII and the precipitate fraction Fr.IX by treating in the same manner with 2 volumes of ethanol (EtOH) or 5 volumes of ethanol (EtOH). Then, each precipitate fraction is dialyzed against distilled water and lyophilized.
  • the amount of ethanol used is not limited to that described above, but can be selected as appropriate.
  • the alkali of the alkaline aqueous solution used in the alkaline aqueous solution extraction treatment may be an inorganic alkali or an organic alkali, but is preferably sodium hydroxide (NaOH) or potassium hydroxide. Further, instead of ethanol added to the aqueous phase, other alcohols may be used.
  • Figure 1 shows the flow of operations for performing alkaline aqueous solution extraction on the residue after hot water extraction, together with the yield (number in parentheses, unit: wt%) for each fraction.
  • the polymer [I] of the present invention is obtained by dehydrogenation polymerization of the fullerpenoids represented by the above formula (1) (hereinafter referred to as “farpropenoids (1)”). It is obtained.
  • the phenol derivative (1) has a structure in which a monovalent or polyvalent phenol or a derivative thereof has a structure in which a straight carbon chain having 3 carbon atoms having ⁇ and ⁇ double bonds is bonded.
  • 2-Propene derivative has a structure in which a monovalent or polyvalent phenol or a derivative thereof has a structure in which a straight carbon chain having 3 carbon atoms having ⁇ and ⁇ double bonds is bonded.
  • the phenol derivative (1) has a cis type and a trans type depending on the configuration of the substituent R 2 , but the trans type is stable, and the trans type is usually used as a raw material for polymer particles.
  • the phenol derivative (1) has optical activity as a single molecule and exists as a levorotatory or dextrorotatory optical isomer. However, when an equal amount of both optical isomers are mixed, a racemic compound is obtained. Become a body. Any of these optical isomers and racemates can be used as the raw material for the polymer and polymer particles in the present invention.
  • phenol derivative (1) a compound in which a hydroxyl group is present in a position para to the group —CH ⁇ CH—R 2 is particularly preferable.
  • Specific examples of the preferred phenol derivative (1) in the present invention include the following formula (1-1):
  • the compound represented by-(17) can be mentioned.
  • the polymer [I] is prepared, for example, in accordance with the method described in Non-Patent Document 1, with at least one of the phenol derivatives (1) having a pH of generally 6 to 9, preferably 6 to Dehydrogenation polymerization in an aqueous solution of 8, preferably in a buffered aqueous solution such as sodium phosphate buffer solution in the presence of a peroxide such as peroxyhydrogen and a dehydrogenase such as peroxidase. It can be synthesized from what you do.
  • each reaction raw material can be mixed and reacted by an appropriate method.
  • an aqueous solution of the phenol derivative (1) and the peroxide is dehydrated.
  • examples thereof include a method of adding an enzyme solution into an aqueous solution, and a method of adding an aqueous solution of a peroxide into an aqueous solution of a phenol derivative (1) and a dehydrogenase.
  • the polymer [I] after dehydrogenation polymerization is a polymer [I] obtained from an acidic phenol derivative (1) such as trans-p-tamaric acid.
  • the pH is generally 5 or less, preferably 4 or less, so that the polymer [I] can be precipitated and then recovered by filtration, centrifugation, etc., and can be recovered by neutrality such as trans-p-cumyl alcohol.
  • the reaction solution is adjusted to PH3 with acetic acid and concentrated under reduced pressure, and then the residue is dissolved in ethanol. The solution can be recovered by, for example, concentrating the solution under reduced pressure.
  • the polymer [I] typically has a structure in which structural units represented by the following formula [i] (hereinafter referred to as "structural units [i]”) are linked. .
  • R 3 represents a hydroxyl group or a methoxy group
  • m is an integer of 0 to 4
  • Z is represented by the following formula [a]
  • R 1 represents a hydroxyl group or a methoxy group, and n is an integer of 0 to 4.
  • [0037] represents a unit bonded to an oxygen atom at the position of a carbon atom with an arrow ( ⁇ ).
  • R 2 represents a carboxyl group, a hydroxymethyl group or a methoxycarbon group, and the structural unit represented by the formula [i] adjacent in the polymer molecular chain is linked between two bonds marked with *. ing. ]
  • the polymer [I] in order to increase the water solubility of the polymer [I], it can be used by binding mannose or daricans.
  • the average molecular weight of the polymer [I] is usually 1,000 to 200,000, preferably 1,000 to 50,000.
  • the polymer [I] is caused by HPV diseases such as plantar use (warts), vulgaris use, flat-use use, eclampsia, endometriosis, and eclampsia, and HIV. It acts effectively on cases and is extremely useful as a therapeutic agent for these diseases or cases.
  • HPV diseases such as plantar use (warts), vulgaris use, flat-use use, eclampsia, endometriosis, and eclampsia, and HIV. It acts effectively on cases and is extremely useful as a therapeutic agent for these diseases or cases.
  • the polymer [I] has a structure similar to that of natural lignin and directly affects the virus. Expected to suppress the intracellular synthesis of abnormal proteins that are thought to cause autoimmune diseases or suppress the growth of cancer cells by binding and inactivating the virus or activating immunity It can be done.
  • HPV disease therapeutic drug to be divided is not to administer each fraction obtained by the extraction process described above alone, or to apply it, or to administer any two or more fractions in combination. Apply it.
  • HPV disease therapeutic agent and a polymer containing a lignin-like extract as a main active ingredient and a polymer [I] as a main active ingredient are administered and not administered as an HPV disease therapeutic agent.
  • oral administration of powder or solution, application of ointment, injection of solution, etc. may be employed.
  • an anti-HIV drug containing the polymer [I] as a main active ingredient oral administration of powder or solution, injection of solution, etc. can be employed as an aspect of administering or applying an anti-HIV drug containing the polymer [I] as a main active ingredient. can be employed.
  • lignin-like extract or polymer [I] When a lignin-like extract or polymer [I] is used as a powder, generally the smaller the particle size, the less absorbed the body and the less the resistance when taken orally. Lignin-like extracts and polymers [I] are not only facilitated by penetration into the skin, absorption into cells, and absorption, but also facilitate preparation of ointments and solutions. It is possible to promote absorption into the body by breaking down the molecular chain and reducing the molecular weight.
  • a pulverizer such as a ball mill or a rod mill, enzyme treatment, etc. can be employed.
  • the medium of the solution used for oral administration and injection for example, water, physiological saline, or a mixture thereof can be used.
  • HPV disease drugs and anti-HIV drugs are supplemented with auxiliary medicinal ingredients such as polysaccharides and vitamins that are effective in enhancing immunity to improve or adjust their medicinal effects, or seasoning ingredients such as licorice and herbs. Can be added to facilitate oral administration.
  • the Fr. VI and Fr. VII granules shown in Figure 1 are encapsulated in gelatin capsules, and this is lignin-like extract 1 to 3 times a day.
  • 20 mgZ day of oral administration was continuously taken orally.
  • 47 days after the start of administration no progression of cancer was observed and the progression was la.
  • the egg Surgery was performed to remove the uterus while leaving the nest, and no cancer cells were found in the affected area.
  • the lignin-like extract is effective as a therapeutic agent for eclampsia cancer caused by HPV.
  • fractions Fr. VI and Fr. VII shown in Fig. 1 patients No. 1 to 9 and 16 to 25 in Table 1 were mixed with an aqueous solution dissolved in pure water to obtain a fraction concentration of 5 ⁇ 10 wt.% Ointment was prepared, and this ointment was applied to the patient's diseased sites shown in Table 1 2-3 times a day.
  • the same fractions Fr.VI and Fr.VII 3 mg per capsule was encapsulated in gelatin capsules, and this was administered orally once to 6 times a day, and the lignin-like extract dose was 3 to 18 mg Z days.
  • excellent treatment effect was confirmed except for the progression of some patients. This therapeutic effect on HPV disease was not seen with other conventional treatments, both for ointment application and oral administration.
  • “Period” in the “Treatment Results” section means the treatment period from the time of first visit.
  • This polymer [I] has a molecular weight of less than 10,000, 52% by weight, a molecular weight of 10,000 to 30,000, less than 00, 27% by weight and a molecular weight of 30,000 or more to 21% by weight, and an average molecular weight of 14 , 300 and IR, NMR and UV were as follows:
  • polymer [la] This polymer [I] is referred to as “polymer [la]”.
  • solution A and solution B were mixed, and 65 liters of solution C was added dropwise over 1 hour with stirring, then acetic acid was added to adjust the solution to pH 3 and cooled in the refrigerator for 1 hour. .
  • the resulting suspension is treated with a 6, OOOrpm centrifuge to collect the precipitate, washed twice with 400 ml of dilute hydrochloric acid at pH 2, and then dissolved in 80 ml of methanol. It filtered with the filter paper of No. 2. Thereafter, 800 ml of dilute hydrochloric acid having a pH of 2 was added dropwise to the filtrate while stirring, and then cooled again in the refrigerator for 30 minutes.
  • the polymer [I] has a molecular weight of less than 10,000, 18% by weight, a molecular weight of 10,000 or more and less than 3,000, 47% by weight and a molecular weight of 30,000 or more and 35% by weight, and an average molecular weight of 21 , 700 and IR, NMR and UV were as follows:
  • polymer [lb] This polymer [I] is referred to as “polymer [lb]”.
  • solution A and solution B were mixed, and 2.86 liters of solution C was added dropwise over 1 hour with stirring, and then acetic acid was added to adjust the solution to pH3. Then, it concentrated with the rotary evaporator, the obtained solid substance was melt
  • the polymer [I] has a molecular weight of 27% by weight less than 10,000, a molecular weight of 10,000 or more and less than 3,000, 54% by weight and a molecular weight of 30,000 or more and 19% by weight, and an average molecular weight of 19 , 20
  • the IR, ⁇ -NMR and UV were as follows.
  • polymer [Ic] This polymer [I] is referred to as “polymer [Ic]”.
  • Table 3 shows the evaluation results. This confirmed that the polymer [la] and the polymer [lb] showed better anti-HIV activity than the natural lignin glycoside.
  • the therapeutic agent for HPV disease of the present invention comprises an extract based on lignin and a lignin-like polysaccharide extracted from pine force that is easily and widely available, and a stable industrial process.
  • the polymer [I] which can be produced with high purity by the method described above, has newly found excellent medicinal effects, and the anti-HIV drug of the present invention comprising the polymer [I] as a main active ingredient is used for infection. Shows extremely good efficacy against the growing HIV. In particular, the polymer [I] stably exhibits an excellent medicinal effect rather than natural lignin.
  • FIG. 1 is a diagram illustrating the flow of hot water extraction and alkaline aqueous solution extraction of pine cones.

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Abstract

　リグニンおよびリグニン様多糖類を主成分とする抽出物を主有効成分とするヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）疾患治療薬、並びにフェニルプロペノイド類の脱水素重合により得られる合成重合体を主有効成分とする、ＨＰＶ疾患治療薬および抗ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）薬を提供する。 （１）松かさの熱水抽出あるいはアルカリ水溶液抽出により得られるリグニンおよびリグニン様多糖類を主成分とする抽出物を主有効成分とするＨＰＶ疾患治療薬。 （２）下記式（１）で表されるフェニルプロペノイド類の脱水素重合により得られる合成重合体を主有効成分とするＨＰＶ疾患治療薬。 　　【化１】 （Ｒ1 は水酸基またはメトキシ基、ｎは１～５の整数で、かつＲ1 の１個以上が水酸基であり、Ｒ2 はカルボキシル基、ヒドロキシメチル基またはメトキシカルボニル基。） （３）前記合成重合体を主有効成分とする抗ＨＩＶ薬。

Description

明 細 書
ヒトパピローマウィルス疾患治療薬および抗ヒト免疫不全ウィルス薬 技術分野
[0001] 本発明は、リグニンおよびリグ-ン様多糖類を主成分とする抽出物であり、ピノソー ルあるいはピュアノールと呼ばれる成分を主有効成分とするヒトパピローマウィルス疾 患治療薬、並びにフエニルプロぺノイド類の脱水素重合により得られる合成重合体を 主有効成分とする、ヒトパピローマウィルス疾患治療薬および抗ヒト免疫不全ウィルス 薬に関する。
背景技術
[0002] 既に、松の木、松かさ等の針葉樹材料や広葉樹のほか、茶、メグスリノキ、カカオノヽ スク等の植物材料を、熱水やアルカリ水溶液で抽出して得られるリグニンおよびリグ ニン様多糖類を主成分とする抽出物が、各種のウィルス疾患 (例えば、インフルェン ザウィルス、ヘルぺスウィルス、ヒト免疫不全ウィルス等によるもの）に有効な薬理作 用を有することが知られ (例えば、特許文献 1〜4参照。）、また同様の抽出物は腹水 癌や固形癌に有効であることが知られている（例えば、特許文献 5、特許文献 6参照 。）。
その後、本発明者らは特に松力さから得られる抽出物について、他のウィルス性疾 患への有効性を検討したところ、ヒトパピローマウィルス疾患にも非常に優れた治療 効果を奏することを見!ヽだした。
[0003] 特許文献 1 :特開平 3— 206043号公報
特許文献 2：特開平 1― 238532号公報
特許文献 3：特開平 1― 238533号公報
特許文献 4:特開平 1— 6218号公報
特許文献 5：特開昭 64 - 4601号公報
特許文献 6：特開昭 62— 205032号公報
[0004] 一方、前述した植物材料からリグニンおよびリグ-ン様多糖類を抽出する処理工程 は煩雑で、例えば特許文献 1に記載されたウィルス感染防止剤を取得する方法の場 合、木質化植物材料をアルコールで煮沸還流したのち、該植物材料を苛性ソーダ水 溶液で浸出し、得られた浸出液を酸で pH調節し、さらに透析処理を行う必要があり、 工業的には必ずしも有利とはいえない。また、天然物由来のリグニンおよびリグニン 様物質の場合、原料となる植物材料の種類によって純度や成分組成が変わり、また 同一種の植物材料であっても、産地、生育年齢や気候状態などにより成分組成にバ ラツキがあるため、有効な薬理効果を安定的に確保するのは必ずしも容易でなかつ た。
そこで、高品質なリグニン様合成物質を有効成分とし、優れた薬理作用を安定して 示す薬剤の開発が望まれている。 発明の開示
[0005] 本発明の課題は、リグニンおよびリグ-ン様多糖類を主成分とする抽出物を主有効 成分とするヒトパピローマウィルス疾患治療薬、並びにフエ-ルプロぺノイド類の脱水 素重合により得られる合成重合体を主有効成分とする、ヒトパピローマウィルス疾患 治療薬および抗ヒト免疫不全ウィルス薬を提供することにある。
[0006] 本発明は、第一に、松かさの熱水抽出あるいはアルカリ水溶液抽出により得られる リグニンおよびリグ-ン様多糖類を主成分とする抽出物（以下、「リグニン様抽出物」と いう。）を主有効成分とするヒトパピローマウィルス疾患治療薬、力 なる。
[0007] 本発明は、第二に、下記式（1)で表されるフエ-ルプロぺノイド類の脱水素重合に より得られる合成重合体 (以下、「重合体 [I]」という。）を主有効成分とするヒトパピ口 一マウィルス疾患治療薬、からなる。
[0008] [化 1]
Figure imgf000004_0001
〔式（1)において、 R1は水酸基またはメトキシ基を示し、 nは 1〜5の整数であり、かつ R1の 1個以上が水酸基であり、 R2はカルボキシル基、ヒドロキシメチル基またはメトキ シカルボ二ル基を示す。〕 以下では、「ヒトパピローマウィルス」を「HPV」と表記する。
[0009] 本発明は、第三に、重合体 [I]を主有効成分とする抗ヒト免疫不全ウィルス薬、力 なる。
以下では、「ヒト免疫不全ウィルス」を「HIV」と表記する。
[0010] 以下、本発明について詳細に説明する。
リグニン様抽出物
本発明の一方の HPV疾患治療薬の主有効成分であるリグニン様抽出物は、松か さの熱水抽出あるいはアルカリ水溶液抽出により得られるもので、リグニンおよびリグ ニン様多糖類を含むものである。
リグニン様抽出物の原料となる松力さとしては、特に限定されるものでなぐ黒松、 赤松、五葉松等の種々の松力さを使用することができる。
[0011] 松かさの抽出は、熱水あるいはアルカリ水溶液により行われ力 本発明のリグニン 様抽出物は、熱水による抽出処理により溶出した成分、アルカリ水溶液による抽出処 理により溶出した成分、および熱水抽出後の残渣をさらにアルカリ水溶液で抽出する ことにより溶出した成分のいずれでも、またこれらのいずれか 2つ以上の成分の混合 物でもよい。熱水抽出液が油分を含む場合、この油分にも薬効成分が含まれている ため、経口服用の場合には非油分と油分の両者を併せて投与してもよい。
[0012] 熱水抽出
熱水による松かさの抽出処理は、例えば特許文献 5や特許文献 6に記載された方 法に準拠して行うことができ、原料となる松かさを必要に応じて、冷水あるいは微温水 で洗浄したのち、あるいはアルコール洗浄して脱脂および低分子物質を除去したの ち、熱水中で一定時間、煮沸ないし煎じることにより行われ、これらを還流下で行って ちょい。
[0013] 熱水の使用量や温度、抽出回数、処理温度、処理時間等の処理条件は、原料で ある松力さの収穫時期や乾燥状態、松力さの使用量等に応じて適宜選定することが できる。複数回抽出した場合は、各抽出液を個別に投与しても、 2回分以上の抽出 液を併せて投与してもよいが、最初の抽出液のみおよび該抽出液を含むものが好ま しい。 [0014] 得られた熱水抽出液は、常温まで冷却したのち、そのままあるいは濃度調整して、 経口または注射により投与することができる。また、冷却後の抽出液をガーゼ、ろ紙 等によりろ過して投与することもできる。抽出液が油分を含む場合は、該油分を例え ば分液漏斗などで分液除去してもよ ヽ。
[0015] また、熱水抽出液中に含まれる有効成分は次のようにして分画し、各画分を単独で または 2つ以上を混合して投与することもできる。
分画に際しては、熱水抽出液をろ過して不溶分を除去し、ろ液を減圧下で濃縮した のち、エタノール (EtOH)を投入し、生じた沈殿をろ取する。その後、沈殿を蒸留水に 溶解し、得られた水溶液を蒸留水に対して透析したのち、蒸留水で平衡化された DE AE セルロースカラム（C1—型）で処理して、非吸着画分 Fr.Iおよび吸着画分を得る 。次いで、吸着画分を 0. 5M塩ィ匕ナトリウム水溶液、 2M塩ィ匕ナトリウム水溶液または 0. 15M水酸化ナトリウム水溶液により溶出して、それぞれ Fr.II、 Fr.IIIおよび（Fr.IV+ Fr.V)の各画分を得る。また、 0. 15M水酸ィ匕ナトリウム水溶液による溶出画分のうち 、 Fr.Vは、セファロース CL— 4Bを用いた 0. 15N水酸化ナトリウム水溶液でのゲルろ 過により、さらに Fr.V-1 (分子量範囲 1〜7万）と Fr.V-2 (分子量範囲 7〜20万）に分 ける。
以上の熱水抽出操作の流れを、各画分の松かさ重量に対する収率 (括弧内数値、 単位：重量％)と併せて図 1に示す。
[0016] アルカリ水溶液抽出
アルカリ水溶液による松力さの抽出処理は、例えば特許文献 5に記載された方法に 準拠して行うことができ、原料となる松かさを必要に応じて、冷水あるいは微温水で洗 浄したのち、あるいはアルコール洗浄して脱脂および低分子物質を除去したのち、直 接あるいは前述した熱水抽出により処理した残渣を、アルカリ水溶液により抽出する
[0017] アルカリ水溶液抽出に使用されるアルカリ水溶液の濃度は、適宜選択することがで きるが、後工程で pHを弱酸性に調整することから、あまり高くない方が好ましい。また 、アルカリ水溶液の使用量、抽出回数、処理温度、処理時間等の処理条件は、原料 である松力さの収穫時期や乾燥状態、松力さの使用量、熱水抽出の残渣量等に応じ て適宜選定することができる。
[0018] アルカリ水溶液抽出後の抽出液は、例えば遠心分離やろ過して沈殿画分 Fr.VIを 分離したのち、 pHを例えば酢酸、炭酸等で、通常 4〜6、好ましくは 5前後に調整す る。その後、水相に、 1倍量 (容積換算。以下同様。）のエタノール (EtOH)を加えて 混合し、生じた沈殿を例えば遠心分離やろ過して沈殿画分 Fr.VIIを分離したのち、 2 倍量のエタノール（EtOH)または 5倍量のエタノール（EtOH)を用いて順次同様に処 理することにより、それぞれ沈殿画分 Fr.VIIIおよび沈殿画分 Fr.IXを分離する。その 後、各沈殿画分を蒸留水に対して透析したのち、凍結乾燥する。なお、エタノールの 使用量は前記のものに限定されるものではなぐ適宜選択することができる。
[0019] アルカリ水溶液抽出処理で、使用されるアルカリ水溶液のアルカリとしては、無機ァ ルカリでも有機アルカリでもよいが、好ましくは水酸ィ匕ナトリウム (NaOH)、水酸化カリ ゥムである。また、水相に加えるエタノールに代えて他のアルコールを用いてもよい。 熱水抽出後の残渣についてアルカリ水溶液抽出を行う操作の流れを、各画分の松 カゝさ重量に対する収率 (括弧内数値、単位：重量％) )と併せて図 1に示す。
[0020] 重合体「II
次に、本発明の重合体 [I]は、前記式（1)で表されるフ -ルプロぺノイド類 (以下 、「フエ-ルプロぺノイド類（1)」という。）の脱水素重合により得られるものである。
[0021] フ ノール誘導体（1)は、 1価もしくは多価のフ ノールないしそれらの誘導体に α , β 二重結合を有する炭素数 3の直鎖炭素鎖が結合した構造を有する 1 フエ二 ルー 2—プロペン誘導体である。
フエノール誘導体（1)は、置換基 R2の立体配置によりシス型とトランス型があるが、 トランス型が安定であり、通常トランス型が重合体粒子の原料として使用される。また 、フエノール誘導体（1)は、単一分子としては光学活性を有し、左旋性ないし右旋性 の光学異性体として存在するが、両者の光学異性体が等量づっ混合されたときラセ ミ体となる。本発明における重合体および重合体粒子の原料には、これらの何れの 光学異性体でもラセミ体でも使用することができる。
フエノール誘導体（1)としては、特に、水酸基が基—CH = CH—R2に対してパラ 位に存在する化合物が好ま 、。 [0022] 本発明における好ましいフ ノール誘導体（1)の具体例としては、下記式（1— 1)
〜（1 7)で表される化合物を挙げることができる。
[0023] [化 2]
Figure imgf000008_0001
(トランス一 p _タマリルアルコ一ノレ)
[0024] [化 3]
Figure imgf000008_0002
(トランスーコニフエリルアルコ
[0025] [化 4]
Figure imgf000008_0003
(トランスーシナピルアルコ
[0026] [化 5]
Figure imgf000008_0004
(トランス一 p タマル酸）
[0027] [化 6]
Figure imgf000009_0001
(トランス一カフェイン酸)
[0028] [ィ匕 7]
Figure imgf000009_0002
[0029] [ィ匕 8]
Figure imgf000009_0003
[0030] 重合体 [I]は、例えば、非特許文献 1に記載された方法に準拠して、フ ノール誘 導体（1)の少なくとも 1種を、 pHが一般に 6〜9、好ましくは 6〜8の水溶液中、好まし くは、ナトリウム リン酸緩衝溶液などの緩衝水溶液中にて、例えば過酸ィ匕水素など の過酸化物および例えばペルォキシダーゼなどの脱水素酵素の存在下で、脱水素 重合すること〖こより合成することができる。
前記脱水素重合に際しては、各反応原料は適宜の方法により混合して反応させる ことができるが、その好ましい混合操作の例としては、フエノール誘導体（1)と過酸ィ匕 物との水溶液を脱水素酵素の水溶液中に加える方法、過酸化物の水溶液をフエノー ル誘導体（1)と脱水素酵素との水溶液中に加える方法等を挙げることができる。 [0031] 非特許文献 1 : Chem. Pharm. Bull, Vol.39, No.4, p.950- 955 (1991)
[0032] 脱水素重合後の重合体 [I]は、例えばトランス p タマル酸などの酸性のフエノ ール誘導体（1)から得られた重合体 [I]の場合は、反応溶液を酢酸、塩酸などで pH を一般に 5以下、好ましくは 4以下として、重合体 [I]を沈殿させたのち、ろ過、遠心 分離などにより回収する方法により回収することができ、またトランス p クマリルァ ルコールなどの中性のフ ノール誘導体（1)から得られた重合体 [I]の場合は、例え ば、反応溶液を酢酸で PH3に調整して、減圧下で濃縮したのち、残渣をエタノール に溶解し、得られた溶液を減圧下で濃縮する方法などにより回収することができる。
[0033] 重合体 [I]は、典型的には、下記式 [i]で表される構造単位 (以下、「構造単位 [i] 」と 、う。）が連結した構造を有するものである。
[0034] [化 9]
Figure imgf000010_0001
[0035] 〔式 [i]において、 R3は水酸基またはメトキシ基を示し、 mは 0〜4の整数であり、 Zは 下 3 式 [a]
[0036] [化 10]
Figure imgf000011_0001
(式 [a]中、 R1は水酸基またはメトキシ基を示し、 nは 0〜4の整数である。 )
[0037] で表され、矢印 (→)を付した炭素原子の位置で酸素原子に結合して ヽる単位を示し
R2はカルボキシル基、ヒドロキシメチル基またはメトキシカルボ-ル基を示し、重合体 分子鎖中で隣接する式 [i]で表される構造単位は *印を付した 2つの結合手間で連 結している。〕
また、重合体 [I]の水溶性を高めるため、マンノースやダリカン類を結合させて使用 することちでさる。
[0038] 重合体 [I]の平均分子量は、通常 1, 000〜200, 000、好ましくは 1, 000〜50, 000である。
[0039] 重合体 [I]は、例えば、足底ユウゼィ (疣贅）、尋常性ユウゼィゃ扁平ユウゼィのほ 力 子宫内膜炎ゃ子宫けい癌などの HPVに起因する疾患、並びに HIVに起因する 症例に対して有効に作用し、これらの疾患ないし症例の治療薬として極めて有用で ある。
また、自己免疫疾患や DNA異常による癌なども様々のウィルスによる感染によって 引き起こされることが次第に明らかになりつつあるが、重合体 [I]は、天然リグニン類 似の構造を有し、ウィルスに直接結合してウィルスを不活性ィ匕し、あるいは免疫を活 性化させることによって、自己免疫疾患の原因と考えられている異常蛋白の細胞内 合成を抑え、あるいは癌細胞の増殖を抑える作用も期待できるものである。
[0040] HPV疾患治療蓉および杭 HIV蓉
熱水抽出あるいはアルカリ水溶液抽出により得られたリグニン様抽出物を主有効成 分とする HPV疾患治療薬は、前述した抽出工程により得られた各画分をそれぞれ単 独で投与な 、し施用しても、あるいは 、ずれか 2つ以上の画分を併せて投与な 、し 施用してちょい。
[0041] リグニン様抽出物を主有効成分とする HPV疾患治療薬および重合体 [I]を主有効 成分とする HPV疾患治療薬を投与な 、し施用する態様としては、症例や患部の場 所に応じて、粉末または溶液の経口服用、軟膏の塗布、溶液の注射などを採用する ことができる。 また、重合体 [I]を主有効成分とする抗 HIV薬を投与ないし施用する 態様としては、粉末または溶液の経口服用、溶液の注射などを採用することができる
[0042] リグニン様抽出物や重合体 [I]を粉末として用いる場合、一般にそれらの粒径が小 さいほど、体内で吸収されやすぐ経口服用時の抵抗感も少なくなり、また軟膏として 塗布したときの皮膚内への浸透性や細胞への吸収な 、し吸着も促進され、かつ軟膏 の調合や溶液の調製も容易となるだけではなぐ微細化することによりリグニン様抽出 物や重合体 [I]の分子鎖が切断されて低分子化されることによる体内への吸収促進 ち計ることがでさる。
リグニン様抽出物や重合体 [I]の粒径を小さくする際には、例えば、乳鉢や、ボー ルミル、ロッドミルなどの粉砕機による処理、酵素処理等を採用することができる。
[0043] 経口服用および注射に用いられる溶液の媒体には、例えば、水、生理食塩水や、 これらの混合物を用いることができる。
また、 HPV疾患治療薬および抗 HIV薬には、免疫増強に有効な多糖類やビタミン 等の補助薬効成分を添加して、薬効を改善ないし調整したり、あるいは甘草やハー ブ等の味付け成分を添加して経口服用しやすくすることができる。 発明を実施するための最良の形態
[0044] 治験例 1
進行性子宫けい癌の患者 (進行度 lb)に、図 1に示す画分 Fr.VIおよび Fr.VIIの粒 をゼラチンカプセルに封入し、これを 1日に 1〜3回、リグニン様抽出物の投与量とし て 20mgZ日を経口により継続服用させたところ、服用開始力 47日後の所見として 、癌の進行は認められず進行度 laとなった。その後も服用を 40日継続したのち、卵 巣を残して子宮を切除する手術を行ったところ、切除された患部に癌細胞は全く発 見できなかった。これにより、リグニン様抽出物が HPVに起因する子宫けい癌に対す る治療薬として有効であることが確認された。
[0045] 治験例 2
図 1に示す画分 Fr.VIおよび Fr.VIIを用い、表 1の患者 No. 1〜9および 16〜25で は、純水に溶解した水溶液を親水性軟膏に混ぜて、画分濃度 5〜 10重量％の軟膏 を調製し、この軟膏を表 1に示す患者の疾患部位に 1日 2〜3回塗布し、また患者 No . 10〜15では、同画分 Fr.VIおよび Fr.VIIの粒をゼラチンカプセルに 1カプセル当た り 3mg封入し、これを 1日に 1〜6回、リグニン様抽出物の投与量を 3〜18mgZ日と して、経口により継続投与したところ、表 1に示すように、一部の患者で進行が停止し たほかは、優れた治療効果が確認された。この HPV疾患に対する治療効果は、軟膏 塗布、経口投与とも従来の他の治療薬には見られないものであった。表 1において、 「治療結果」の項の「期間」は初診時点からの治療期間を意味する。
[0046] [表 1]
表 1
Figure imgf000014_0001
合成例で得た重合体 [I]の分子量、赤外吸収スペクトル (IR) 共鳴スペクトル NMR)および紫外吸収スペクトル (UV)は、それぞれ次の要領 で測定した。
分子量：
試料をリン酸緩衝液（lZl5MPB ;pH = 7. 4)に溶解した濃度 25 gZミリリットル の溶液を、遠心限外ろ過装置 Centri Cell™ (Polys cience社製）を用い、分画分子量 10, 000ダノレトンと 30, 000ダノレ卜ンのろ過膜を使用し、遠'、力 2, 500g (gは重力カロ 速度）にて 25分間遠心分離を行って測定した。
IR:
Perkin Elmer FT-IR1600分光計を用い、重合体粉末と KBr粉末との混合物で測定 した。
一 NMR:
JEOL EX270分光計を用い、ジメチルスルホキシド溶液で測定した。
UV:
Shimadsu UV-2100分光光度計を用い、水溶液で測定した。
合成例 1
トランス— p—タマル酸 lgを 0. 05Mナトリウム—リン酸緩衝液 (pH = 8. 0) 200ミリリ ットルに溶解し、 1N水酸ィ匕ナトリウム水溶液で中和して、溶液 Aを調製した。また、ぺ ノレ: キシダーゼ 10mgを 0. 05Mナ卜!;クム ジン„褸夜（pH = 8. 0) 200ミジジッ卜 ルに溶解して、溶液 Bを調製した。また、 35重量％過酸ィ匕水素水 10ミリリットルを 0. 0 5Mナトリウム—リン酸緩衝液 (pH = 8. 0) 3. 49リットルに加え、攪拌して、溶液 C3. 5リットルを調製した。
次いで、溶液 Aと溶液 Bを混合し、これに溶液 C3. 13リットルを、攪拌しながら 1時 間かけて滴下したのち、酢酸を加えて溶液を pH3に調整し、冷蔵庫内で 1時間冷却 した。その後、得られた懸濁液を 6, OOOrpmの遠心分離機で処理して、沈殿物を回 収し、 pH2の希塩酸 400ミリリットルで 2回洗浄したのち、沈殿物をメタノール 80ミリリ ットルに溶解し、 No. 2のろ紙でろ過した。その後、ろ液に pH2の希塩酸 800ミリリット ルを攪拌下しながら滴下したのち、再び冷蔵庫内で 30分間冷却した。その後、得ら れた懸濁液を 6, OOOrpmの遠心分離機で処理して、沈殿物を回収し、乾燥して、重 合体 [I] 0. 64gを得た。
[0049] この重合体 [I]は、分子量 10, 000未満が 52重量％、分子量 10, 000以上 30, 0 00未満が 27重量％および分子量 30, 000以上が 21重量％で、平均分子量 14, 30 0であり、 IR、 一 NMRおよび UVは下記のとおりであった。
IR (cm_1)：
3600— 3000 (0— H伸縮）、 1705 (C = O伸縮）、 1610— 1490 ( ベンゼン環の 二重結合伸縮）、 1300— 1170 (C O伸縮)。
iH—NMR (ィ匕学シフト； ppm)：
9. 6 (brs ;カルボキシル基の H)、 7. 7— 6. 0 (m;ベンゼン環および脂肪 族二重 結合の H)、4. 4- 3. 7 (m;酸素原子に隣接する CHの H)。
UV (最大強度波長 = 280nm;光学濃度 = 2. 51 (濃度 = 50 gZミリリットル)）： このスペクトルの特徴は天然リグニンとほぼ一致した。
この重合体 [I]を「重合体 [la]」とする。
[0050] 合成例 2
トランス一フェルラ酸 lgを 0. 05Mナトリウム一リン酸緩衝液 (pH = 8. 0) 200ミリリツ トルに溶解し、 1N水酸ィ匕ナトリウム水溶液で中和して、溶液 Aを調製した。また、ペル ： キシダーゼ 10mgを 0. 05Mナ卜!;クム ジン„褸夜（pH = 8. 0) 200ミジジッ卜ノレ に溶解して、溶液 Bを調製した。また、 35重量％過酸ィ匕水素水 10ミリリットルを 0. 05 Mナトリウム—リン酸緩衝液 (pH = 8. 0) 3. 49リットルに加え、攪拌して、溶液 C3. 5 リットルを調製した。
次いで、溶液 Aと溶液 Bを混合し、これに溶液 C2. 65リットルを、攪拌しながら 1時 間かけて滴下したのち、酢酸を加えて溶液を pH3に調整し、冷蔵庫内で 1時間冷却 した。その後、得られた懸濁液を 6, OOOrpmの遠心分離機で処理して、沈殿物を回 収し、 pH2の希塩酸 400ミリリットルで 2回洗浄したのち、沈殿物をメタノール 80ミリリ ットルに溶解し、 No. 2のろ紙でろ過した。その後、ろ液に pH2の希塩酸 800ミリリット ルを攪拌下しながら滴下したのち、再び冷蔵庫内で 30分間冷却した。その後、得ら れた懸濁液を 6, OOOrpmの遠心分離機で処理して、沈殿物を回収し、乾燥して、重 合体 [I] 0. 39gを得た。 [0051] この重合体 [I]は、分子量 10, 000未満が 18重量％、分子量 10, 000以上 30, 0 00未満が 47重量％および分子量 30, 000以上が 35重量％で、平均分子量 21, 70 0であり、 IR、 一 NMRおよび UVは下記のとおりであった。
IR (cm_1)：
3600— 3000 (0— H伸縮）、 1704 (C = O伸縮）、 1640- 1430 ( ベンゼン環の 二重結合伸縮）、 1340— 1130 (C— O伸縮)。
iH—NMR (ィ匕学シフト； ppm)：
8. 7 (brs ;カルボキシル基の H)、 7. 6— 6. 0 (m;ベンゼン環および脂肪 族二重 結合の H)、4. 5- 3. 7 (m;酸素原子に隣接する CHの H)、 2. 8 (s ;OCHの H)。
3
UV (最大強度波長 = 280nm;光学濃度 = 1. 72 (濃度 = 50 gZミリリットル)）： このスペクトルの特徴は天然リグニンとほぼ一致した。
この重合体 [I]を「重合体 [lb]」とする。
[0052] 合成例 3
トランス一カフェイン酸 lgを 0. 05Mナトリウム一リン酸緩衝液 (pH = 8. 0) 200ミリリ ットルに溶解し、 1N水酸ィ匕ナトリウム水溶液で中和して、溶液 Aを調製した。また、ぺ ノレ: キシダーゼ 10mgを 0. 05Mナ卜!;クム ジン„褸夜（pH = 8. 0) 200ミジジッ卜 ルに溶解して、溶液 Bを調製した。また、 35重量％過酸ィ匕水素水 10ミリリットルを 0. 0 5Mナトリウム—リン酸緩衝液 (pH = 8. 0) 3. 49リットルに加え、攪拌して、溶液 C3. 5リットルを調製した。
次いで、溶液 Aと溶液 Bを混合し、これに溶液 C2. 86リットルを、攪拌しながら 1時 間かけて滴下したのち、酢酸を加えて溶液を pH3に調整した。その後、ロータリーェ バポレーターで濃縮し、得られた固形物をエタノール 200ミリリットルに溶解し、 No. 2 のろ紙でろ過した。その後、ろ液をロータリーエバポレーターで濃縮し、得られた固形 物を少量の水に溶解したのち、凍結乾燥して、重合体 [I]を含む粗生成物 2. 89gを 得た。なお、粗生成物の収量がトランス—カフェイン酸の使用量（lg)よりかなり多い のは、遠心分離による回収が不可能で、純度が低いためである。
[0053] この重合体 [I]は、分子量 10, 000未満が 27重量％、分子量 10, 000以上 30, 0 00未満が 54重量％および分子量 30, 000以上が 19重量％で、平均分子量 19, 20 0であり、 IR、 Ή— NMRおよび UVは下記のとおりであった。
IR (cm_1)：
3600— 3000 (0— H伸縮）、 1698 (C = 0伸縮）、 1640— 1500 ( ベンゼン環の 二重結合伸縮）、 1273 (じー0伸縮)。
iH— NMR (ィ匕学シフト； ppm)：
9. 2 (brs ;カルボキシル基の H)、 7. 6— 6. 4 (m;ベンゼン環および脂肪 族二重 結合の H)、4. 0 (brs ;酸素原子に隣接する CHの H)。
UV (最大強度波長 = 280nm；光学濃度 = 1. 86 (濃度 = 50 /z gZミリリットル) )： このスペクトルの特徴は天然リグニンとほぼ一致した。
この重合体 [I]を「重合体 [Ic]」とする。
[0054] 治験例 3
合成例 1で得られた重合体 [la]を純水に溶解した水溶液を親水性軟膏に混ぜて、 重合体 [la]濃度 5〜10重量％の軟膏を調製した。この軟膏を表 2に示す患者の疾 患箇所に 1日 2〜3回塗布したところ、表 2に示すように、 HPV疾患に対する優れた 治療効果が確認された。表 2において、「治療結果」の項の「期間」は初診時点からの 治療期間を意味する。
[0055] [表 2]
Figure imgf000018_0001
治験例 4
成人 T細胞白血病ウイノレス（HTLV— 1)陽性細胞あるいは MT— 4細胞を用い、重 合体 [la]および重合体 [lb]について、 HIVに感染していない細胞に対する 50% 細胞毒性濃度 (CC50、単位 μ gZミリリットル (ml) )と HIV感染による細胞傷害を 50 %阻止する濃度 (EC50、単位/ z gZミリリットル (ml) )、および有効係数 (SI = CC50 ZEC50)を評価して、松力さから抽出した天然リグ-ン配糖体を比較した。ここで、 C C50は HIVに感染していない細胞での 50%増殖を抑制する濃度であり、 EC50は H IVに感染させた細胞での HIV増殖を 50%抑制する濃度である。
評価結果を表 3に示す。これにより、重合体 [la]および重合体 [lb]が天然リグニン 配糖体より良好な抗 HIV活性を示すことが確認された。
[0057] [表 3]
Figure imgf000019_0001
産業上の利用可能性
[0058] 本発明の HPV疾患治療薬は、植物材料力 容易かつ大量に入手可能な松力さか ら抽出されるリグニンおよびリグニン様多糖類を主成分とする抽出物、並びに安定し た工業的プロセスにより高純度に製造することができる重合体 [I]について、新たに 優れた薬効を見いだしたものであり、また当該重合体 [I]を主有効成分とする本発明 の抗 HIV薬は、感染が拡大しつつある HIVに対して極めて優れた薬効を示す。特に 、重合体 [I]は、天然リグニンよりむしろ優れた薬効を安定して示すものである。 図面の簡単な説明
[0059] [図 1]松かさの熱水抽出およびアルカリ水溶液抽出の流れを例示する図である。

Claims

請求の範囲
[1] 松かさの熱水抽出あるいはアルカリ水溶液抽出により得られるリグニンおよびリグ- ン様多糖類を主成分とする抽出物を主有効成分とするヒトパピローマウィルス疾患治 療薬。
[2] 下記式（1)で表されるフ ニルプロぺノイド類の脱水素重合により得られる合成重 合体を主有効成分とするヒトパピローマウィルス疾患治療薬。
[化 1]
Figure imgf000020_0001
〔式（1)において、 R1は水酸基またはメトキシ基を示し、 nは 1〜5の整数であり、かつ R1の 1個以上が水酸基であり、 R2はカルボキシル基、ヒドロキシメチル基またはメトキ シカルボ二ル基を示す。〕
請求項 2に記載の合成重合体を主有効成分とする抗ヒト免疫不全ウィルス薬。
PCT/JP2005/011600 2004-06-29 2005-06-24 ヒトパピローマウイルス疾患治療薬および抗ヒト免疫不全ウイルス薬 WO2006001364A1 (ja)

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