WO2006001196A1

WO2006001196A1 - 細胞分離装置、及び細胞分離方法

Info

Publication number: WO2006001196A1
Application number: PCT/JP2005/010876
Authority: WO
Inventors: Nobuhide Kasagi; Naoki Shikazono; Yuji Suzuki; Wei Heong Tan
Original assignee: The University Of Tokyo
Priority date: 2004-06-24
Filing date: 2005-06-14
Publication date: 2006-01-05
Also published as: JP2006006166A

Abstract

　マイクロミキサーに設けられた第１の流体分断手段を用いて、磁気ビーズと所定の細胞とを含む流体を左右に分断し、前記マイクロミキサーに設けられた第２の流体分断手段を用いて、前記左右に分断された前記流体を上方に分断する。次いで、前記マイクロミキサーに設けられた第３の流体分断手段を用いて、前記左右に分断された前記流体を下方に分断し、前記マイクロミキサーに設けられた流体合流手段を用いて、前記上方に分断された前記流体と前記下方に分断された前記流体とを合流させる。その後、前記マイクロミキサーを透過した後の、前記流体中における前記磁気ビーズと、前記磁気ビーズに付着した前記細胞とを、セパレータによって前記流体の残部から分離する。

Description

明細書

細胞分離装置、及び細胞分離方法

技術分野

[0001] 本発明は、細胞分離装置、及び細胞分離方法に関する。

背景技術

[0002] 従来の磁気ビーズを用いた細胞分離装置としては、例えば US5536475がある力大量な試料力所望の造血細胞などを抽出することを目的としているため、タンクで攪拌しながら磁気ビーズと細胞を混合させた上、前記磁気ビーズと前記細胞とが分子拡散によって接合するための十分なインキュベーション時間が必要であった。

[0003] 一方、幹細胞等は自己増殖が可能なので、ごく微少な試料力ごくわずかでも抽出することができれば、その後の分ィ匕ゃ成長を観察する上では十分である。しかしながら、微細な試料から目的とする細胞を抽出するシステムでは、流れのレイノルズ数が低下するため磁気ビーズと細胞の混合が抑制され、目的とする細胞の抽出ができないという課題があった。

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0004] 本発明は、磁気ビーズを用いた細胞分離において、レイノルズ数の大小によらず、前記磁気ビーズと細胞とを十分に混合し、前記磁気ビーズに前記細胞を付着させ、前記細胞の分離を簡易かつ確実に行うことを目的とする。

課題を解決するための手段

[0005] 上記目的を達成すべく、本発明は、

磁気ビーズと所定の細胞とを含む流体を左右に分断するための第 1の流体分断手段、前記左右に分断された前記流体を上方に分断するための第 2の流体分断手段、前記左右に分断された前記流体を下方に分断するための第 3の流体分断手段、及び前記上方に分断された前記流体と前記下方に分断された前記流体とを合流させる流体合流手段を有するマイクロミキサーと、

前記マイクロミキサーを透過した後の、前記流体中における前記磁気ビーズと、前記磁気ビーズに付着した前記細胞とを、前記流体の残部から分離するためのセパレータと、

を具えることを特徴とする、細胞分離装置に関する。

[0006] また、本発明は、

マイクロミキサーに設けられた第 1の流体分断手段を用いて、磁気ビーズと所定の細胞とを含む流体を左右に分断する第 1の工程と、

前記マイクロミキサーに設けられた第 2の流体分断手段を用いて、前記左右に分断された前記流体を上方に分断する第 2の工程と、

前記マイクロミキサーに設けられた第 3の流体分断手段を用いて、前記左右に分断された前記流体を下方に分断する第 3の工程と、

前記マイクロミキサーに設けられた流体合流手段を用いて、前記上方に分断された前記流体と前記下方に分断された前記流体とを合流させる第 4の工程と、

前記マイクロミキサーを透過した後の、前記流体中における前記磁気ビーズと、前記磁気ビーズに付着した前記細胞とを、セパレータによって前記流体の残部力分離するための第 5の工程と、

を具えることを特徴とする、細胞分離方法に関する。

[0007] 本発明によれば、磁気ビーズと所定の細胞とを含む流体を左右方向に分断し、さらにこの分断された流体をそれぞれ上下方向に分断した後、これら分断された流体を合流させるようにしている。この過程において、前記上下方向に分断された流体の断面は、それぞれ最初の流体の断面に対して所定の角度だけ回転することができ、さらに前記上下方向に分断された流体が合流される際に、再度前記最初の流体の断面に対して所定の角度だけ回転することができる。したがって、上記過程を経ることにより、前記最初の流体は分断されるとともに、分断された流体の断面が所定角度回転された後、合流されることになるので、前記流体は十分に撹拌され混合されることになる。

[0008] したがって、前記流体中に含まれる前記磁気ビーズ及び前記細胞も、互いに十分に撹拌混合されるようになるので、前記細胞は前記磁気ビーズに十分に付着するようになり、前記マイクロミキサーの後方に設けられたセパレータによって高効率に磁気的に分離されるようになる。

[0009] なお、上述した説明から明らかなように、本発明では、流体の分断及び流体断面の回転によって前記流体の撹拌及び混合を実施して！/、るので、前記流体のレイノルズ数の大小によらず、前記磁気ビーズと前記細胞との撹拌混合を十分に促進して、前記細胞を前記磁気ビーズの付着することができる。

発明の効果

[0010] 以上説明したように、本発明によれば、磁気ビーズを用いた細胞分離にぉ、て、レイノルズ数の大小によらず、前記磁気ビーズと細胞とを十分に混合し、前記磁気ビーズに前記細胞を付着させ、前記細胞の分離を簡易かつ確実に行うことができる。図面の簡単な説明

[0011] [図 1]本発明の細胞分離装置の一例を示す構成図である。

[図 2]図 1に示す細胞分離装置におけるマイクロミキサーの一例を示す分解構成図である。

[図 3]図 2に示すマイクロミキサー内を流れる際の、流体の状態を示す図である。

[図 4]同じぐ図 2に示すマイクロミキサー内を流れる際の、流体の状態を示す図である。

[図 5]図 1に示す細胞分離装置におけるセパレータを含む周辺部分を拡大して示す図である。

[図 6]図 1に示す細胞分離装置における純化分離装置を含む周辺部分を拡大して示す図である。

[図 7]図 1に示す細胞分離装置の変形例を示す構成図である。

符号の説明

[0012] 10 細胞分離装置

11、 12 入り口

13、 14 ノレブ

15、 16 出口

20 マイクロミキサー部

21 マイクロミキサー 30 セパレータ部

31 セパレータ

40 流路

51 純化分離装置

60 バイパス流路

61 ポンプ

S1、S2 多層流体

発明を実施するための最良の形態

[0013] 以下、本発明の詳細、並びにその他の特徴及び利点について、最良の形態に基づいて詳細に説明する。

[0014] 図 1は、本発明の細胞分離装置の一例を示す構成図である。図 1に示す細胞分離装置 10は、複数のマイクロミキサー 21が直列に接続されてなるマイクロミキサー部 20 と、複数のセパレータ 31が直列に配列されてなるセパレータ部 30と、磁気ビーズ及び細胞を含む流体を流し、マイクロミキサー部 20及びセパレータ部 30を通ることにより、以下に詳述する工程に従って前記流体を細胞分離に供するようにするための流路 40とを具えている。

[0015] 図 1に示す細胞分離装置 10においては、例えば入り口 11から磁気ビーズを含む流体を導入し、入り口 12から骨髄液や血液などの幹細胞、あるいは血球細胞などを含む流体を導入し、流路 40中で混合する。次いで、混合して得た流体はマイクロミキサ一部 20内に導入され、各マイクロミキサー 21内で以下に詳述するように撹拌混合される。

[0016] 図 2は、図 1に示す細胞分離装置 10におけるマイクロミキサー 21の一例を示す分解構成図である。図 2に示すマイクロミキサー 21は、第 1の板状部材 22と、第 1の板状部材 22の上方において順次に設けられた第 2の板状部材 23及び第 4の板状部材 25と、第 1の板状部材 22の下方において順次に設けられた第 3の板状部材 24及び第 5の板状部材 26とを含んで、る。

[0017] 第 1の板状部材 22には、 T字型の第 1の開口部 221及び I字型の第 4の開口部 222 が形成され、これら開口部の端部 221A及び 222Aは、それぞれ第 1の板状部材 22 の、互いに相対向する側端部に開口している。

[0018] また、第 2の板状部材 23には、 L字型の第 2の開口部 231が形成され、その一方の端部 231Aは、第 1の板状部材 22における第 1の開口部 221の上辺開口部の端部 1 11Bと連続している。さらに、第 2の開口部 231の他方の端部 231Bは、第 1の板状部材 22における第 4の開口部 222の前方端部 222Bと連続している。

[0019] 第 3の板状部材 24には、同じく L字型の第 3の開口部 241が形成され、その一方の端部 241Aは、第 1の板状部材 22における第 1の開口部 221の上辺開口部の端部 2 21Cと連続している。また、第 3の開口部 241の他方の端部 241Bは、第 1の板状部材 22における第 4の開口部 222の前方端部 222Bと連続している。

[0020] なお、第 4の板状部材 25及び第 5の板状部材 26は、それぞれ第 1の開口部 221から第 4の開口部 222までを密閉するために云わば蓋として設けられ、図 2に示すマイクロミキサーを実際の素子として機能させるためのものである。

[0021] 次に、図 2に示すマイクロミキサー 21を用いた流体の混合方法について説明する。

図 3及び図 4は、図 2に示すマイクロミキサー 21内を流れる際の、流体の状態を示す図である。なお、本例においては、磁気ビーズを含む流体と細胞を含む流体とが上下方向に層をなしてなる多層流体の場合について説明する。

[0022] 最初に、多層流体 S1は、マイクロミキサー 21の第 1の板状部材 22における第 1の開口部 221に導入される。この際、多層流体 S1は第 1の開口部 221の上辺部において左右方向に分断される。次いで、左右方向に分断された多層流体 S1は、それぞれ第 1の開口部 221と連続した、第 2の板状部材 23における第 2の開口部 231及び第 3の板状部材 24における第 3の開口部 241に導入され、この結果、上下方向に分断されることになる。この際、多層流体 S1は、その流れ方向に対して 90度回転させられるので、その断面が 90度回転することになる。

[0023] 次いで、多層流体 S1は、第 2の開口部 231及び第 3の開口部 241と連続した、第 1 の板状部材 22の第 4の開口部 222に導入され、上下方向に分断された多層流体 S1 が合流して多層流体 S2となる。この際、分断されたそれぞれの多層流体 S1は、それぞれ流れ方向に対してさらに 90度回転させられるので、その断面が 90度回転することになる。したがって、多層流体 S2は、先の多層流体 S1に対して、その断面が 180 度回転して各層を構成する流体の積層順序が逆転するとともに、積層数が 2倍となる

[0024] 結果として、図 2に示すマイクロミキサー 21内を通ることにより、多層流体 S1が断面方向にお、て分断されるとともに、その断面自体が 180度回転するようになるので、得られた多層流体 S 2では、多層流体 S1に比較して、各層同士がより混合して均一となる。したがって、各層中に含まれる磁気ビーズと細胞との混合撹拌が促進され、前記細胞は前記磁気ビーズに対して高効率で付着するようになる。

[0025] なお、前記細胞の表面には表面マーカーとしての抗原を付着しておき、前記磁気ビーズの表面には前記抗原と抗原抗体反応を生ぜしめる抗体を付着させておくことが好ましい。この場合、前記細胞を前記抗原抗体反応を通じて前記磁気ビーズにより効率的かつ強固に付着させることができるようになる。

[0026] 図 5は、図 1に示す細胞分離装置 10におけるセパレータ 31を含む周辺部分を拡大して示す図である。図 3から明らかなように、セパレータ 31は、流路 40を挟むようにして対向して配置された一対の磁石 311及び 312を含む。しかしながら、磁石 311及び 312は流路 40を必ずしも挟み込むように配置する必要はなぐ流路 40に近接させて配置すれば良い。なお、図 3において、矢印は流体の流れる方向を示し、黒丸は磁気ビーズを示し、鱗片状部材は細胞を示してヽる。

[0027] マイクロミキサー部 20内を通過した磁気ビーズ及び細胞を含む流体は、セパレータ部 30に至ると、磁石 311及び 312間において磁場 Bの影響を受ける。このとき、前記磁気ビーズ及び前記磁気ビーズに付着した前記細胞は、磁場 Bによって右方へ引き寄せれ、前記流体の残部から分離除去される。

[0028] その後、分離除去された前記磁気ビーズ及び前記付着細胞は、バルブ 13に至り出口 15を介して外部へ取り出される。一方、前記流体の残部は、バルブ 14に至り出口 16を介して外部へ取り出される。したがって、以上のような工程を経ることにより、所望の細胞のみを前記磁気ビーズに付着させ、前記細胞の分離を簡易かつ確実に行うことがでさるよう〖こなる。

[0029] なお、図 1に示していないが、図 1に示す細胞分離装置においては、セパレータ部 30の下流側に純ィ匕分離装置を設けることができる。図 6は、図 1に示す細胞分離装置 10における純ィ匕分離装置 51を含む周辺部分を拡大して示す図である。図 6から明らかなように、純化分離装置 51は、流路 40を挟むようにして対向して配置された一対の磁石 511及び 512を含む。なお、図 6において、矢印は流体の流れる方向を示し、黒丸は磁気ビーズを示し、鱗片状部材は細胞を示している。

[0030] セパレータ部 30を通過することにより、分離除去された前記磁気ビーズ及び前記付着細胞は、バッファ液とともに純ィ匕分離装置 51内に導入される。前記バッファ液は前記磁気ビーズから前記細胞を分離する作用があるので、これらの混合溶液が磁石 511及び 512間において磁場 Bの影響を受けるとき、前記磁気ビーズは前記細胞の分離の有無によらず磁場 Bの影響によって右方に引き寄せられ、ノレブ 13及び出口 15を介して外部に取り出される。一方、前記磁気ビーズから分離された前記細胞は磁場 Bの影響を受けることなぐバルブ 14及び出口 16を介して外部へ取り出される。

[0031] このように、セパレータ部 30の下流側に純ィ匕分離装置 51を設けることによって、磁気ビーズを簡易に回収し、分離すべき前記細胞のみを簡易に取り出すことができるようになる。

[0032] 図 7は、図 1に示す細胞分離装置の変形例を示す構成図である。なお、図 1に示す構成要素と同一あるいは類似の構成要素については同じ参照符号を用いて示している。図 7に示す細胞分離装置 10においては、入り口 11及び 12とマイクロミキサー部 20との間、並びにセパレータ部 30とバルブ 13及び 14との間にバイパス流路 60を設け、セパレータ部 30によって分離除去された磁気ビーズを含む流体を、ポンプ 61 によってマイクロミキサー部 20の上流側へ循環するようにして、る。このような構成によれば、細胞を吸着させるべき磁気ビーズを常に循環させて再利用するようにしているので、細胞分離に使用する全体的な磁気ビーズの使用量を減少させることができる。

[0033] なお、マイクロミキサー 21において、第 1の板状部材 22に設けられた第 1の開口部 221及び第 4の開口部 222、第 2の板状部材 23に設けられた第 2の開口部 231、並びに第 3の板状部材 24に設けられた第 3の開口部 241の少なくとも一つにおいて、角部の面取を行うことができる。これらの開口部において、尖い角部が存在すると、多層流体 S1がそれらの開口部を流れる際に、前記角部において流速が減少してしまうので、多層流体 SIの混合を十分に行うことができない場合がある。したがって、これらの問題発生を抑制するためには、上述したように、上記開口部の角部の面取を行うことが好ましい。

[0034] また、各板状部材は如何なる材料からも形成することができるが、上述した本発明の流体混合方法を実現することができる限り、榭脂ゃ金属、ガラスなど力も形成することができる。したがって、各板状部材の準備、及び各板状部材に対する加工が容易になり、上述した開口部の形成、すなわちマイクロミキサー自体の形成を簡易に行うことがでさるよう〖こなる。

[0035] 以上、具体例を挙げながら発明の実施の形態に基づいて本発明を詳細に説明してきたが、本発明は上記内容に限定されるものではなぐ本発明の範疇を逸脱しない限りにお、てあらゆる変形や変更が可能である。

[0036] 例えば、上記具体例では、磁気ビーズと細胞とが多層流体を構成する場合につ!ヽて述べたが、本発明は前記磁気ビーズなどが多層流体を構成する場合のみならず、単層の流体である場合においても好適に使用することができる。また、上記具体例では、マイクロミキサー部 20を複数のマイクロミキサー 21から構成するとともに、セパレータ部 30を複数のセパレータ 31から構成するようにしている力それぞれ単一のマイク口ミキサー及び単一のセパレータカも構成することもできる。

[0037] また、マイクロミキサー 21において、多層流体 S1を第 4の開口部 222から第 2の開口部 231及び第 3の開口部 241を経て、第 1の開口部 221へ向けて逆流させることもできる。この場合、多層流体 S1は、第 2の開口部 231で多層流体 S1を上方に分断し、第 3の開口部 241で多層流体 S1を下方に分断し、第 1の開口部 221で前記上方に分断された多層流体 S 1と前記下方に分断された多層流体 S 1とを合流させるようにすることもできる。この場合においても、多層流体 S1は、図 3及び 4に示すような態様で十分に混合され、多層流体 S2とすることができる。

Claims

請求の範囲

[1] 磁気ビーズと所定の細胞とを含む流体を左右に分断するための第 1の流体分断手段、前記左右に分断された前記流体を上方に分断するための第 2の流体分断手段、前記左右に分断された前記流体を下方に分断するための第 3の流体分断手段、及び前記上方に分断された前記流体と前記下方に分断された前記流体とを合流させる流体合流手段を有するマイクロミキサーと、

を具えることを特徴とする、細胞分離装置。

[2] 前記マイクロミキサーにおいて、前記第 1の流体分断手段は、第 1の板状部材において、その端部に一端が開口した T字型の第 1の開口部を含むことを特徴とする、請求項 1に記載の細胞分離装置。

[3] 前記マイクロミキサーにおいて、前記第 2の流体分断手段は、第 2の板状部材において、前記第 1の開口部の、上辺開口部における左端部又は右端部と連続した L字型の第 2の開口部を含むことを特徴とする、請求項 2に記載の細胞分離装置。

[4] 前記マイクロミキサーにおいて、前記第 3の流体分断手段は、第 3の板状部材において、前記第 1の開口部の、前記上辺開口部における、前記第 2の開口部が連続した前記左端部又は前記右端部の残りと連続した L字型の第 3の開口部を含むことを特徴とする、請求項 3に記載の細胞分離装置。

[5] 前記マイクロミキサーにおいて、前記流体合流手段は、前記第 1の板状部材において、前記第 1の開口部の後方において、前記第 2の開口部の先端部及び前記第 3の開口部の先端部と連続した I字型の第 4の開口部を含むことを特徴とする、請求項 4 に記載の細胞分離装置。

[6] 前記マイクロミキサーの前記第 2の流体分断手段において、前記流体の断面を、前記流体の、前記第 1の流体分断手段への流入時と比較して、 90度回転させることを特徴とする、請求項 1〜5のいずれか一に記載の細胞分離装置。

[7] 前記マイクロミキサーの前記第 3の流体分断手段において、前記流体の断面を、前記流体の、前記第 1の流体分断手段への流入時と比較して、 90度回転させることを特徴とする、請求項 1〜6のいずれか一に記載の細胞分離装置。

[8] 前記マイクロミキサーの前記流体合流手段において、前記流体の断面を、前記流体の、前記第 1の流体分断手段への流入時と比較して、 180度回転させることを特徴とする、請求項 1〜7のいずれか一に記載の細胞分離装置。

[9] 前記流体は、前記磁気ビーズを含む流体と前記細胞を含む流体とが積層された多層流体であることを特徴とする、請求項 1〜8のいずれか一に記載の細胞分離装置。

[10] 前記多層流体は、前記第 1の流体分断手段、前記第 2の流体分断手段及び前記第 3の流体分断手段を介して分断された後、前記流体合流手段で合流された際に、その積層順序が逆転するとともに、その積層数が 2倍となることを特徴とする、請求項 9に記載の細胞分離装置。

[11] 前記マイクロミキサーにおいて、前記第 1の開口部力前記第 4の開口部の少なくとも一つにおいて、角部の面取を実施したことを特徴とする、請求項 1〜： L0のいずれか一に記載の細胞分離装置。

[12] 前記マイクロミキサーにおいて、前記第 1の流体分断手段から前記第 3の流体分断手段、及び前記流体合流手段の少なくとも一つは、榭脂、金属又はガラスからなることを特徴とする、請求項 1〜 11の、ずれか一に記載の細胞分離装置。

[13] 前記流体は、前記マイクロミキサーにおいて、前記流体合流手段から前記第 2の流体分断手段及び前記第 3の流体分断手段を経て、前記第 1の流体分断手段へ向けて逆流させ、前記第 2の流体分断手段で前記流体を上方に分断し、前記第 3の流体分断手段で前記流体を下方に分断し、前記第 1の流体分断手段で前記上方に分断された前記流体と前記下方に分断された前記流体とを合流させるように構成したことを特徴とする、請求項 1〜 12の、ずれか一に記載の細胞分離装置。

[14] 前記マイクロミキサーを複数直列に接続したことを特徴とする、請求項 1〜13のいずれか一に記載の細胞分離装置。

[15] 前記セパレータは、前記流体の流路に設けられた磁石を含むことを特徴とする、請求項 1〜14のいずれか一に記載の細胞分離装置。

[16] 前記マイクロミキサーを透過した後の、前記磁気ビーズ及び前記磁気ビーズに付着した前記細胞を含む流体に対してバッファ液を混合し、前記磁気ビーズに付着した前記細胞を含む流体から、前記細胞のみを分離除去するための純化分離装置を具えることを特徴とする、請求項 1〜 15の、ずれか一に記載の細胞分離装置。

[17] 前記純化分離装置は、前記流体の流路に設けられた磁石を含むことを特徴とする

、請求項 16に記載の細胞分離装置。

[18] 前記細胞の表面には表面マーカーとしての抗原が付着され、前記磁気ビーズの表面には前記抗原と抗原抗体反応を生ぜしめる抗体が付着されたことを特徴とする、請求項 1〜 17の、ずれか一に記載の細胞分離装置。

[19] 前記磁気ビーズを循環し、再利用させるための循環手段を具えることを特徴とする

、請求項 1〜18のいずれか一に記載の細胞分離装置。

[20] マイクロミキサーに設けられた第 1の流体分断手段を用いて、磁気ビーズと所定の細胞とを含む流体を左右に分断する第 1の工程と、

を具えることを特徴とする、細胞分離方法。

[21] 前記第 1の工程における前記第 1の流体分断手段は、第 1の板状部材において、その端部に一端が開口した T字型の第 1の開口部を含むことを特徴とする、請求項 2

0に記載の細胞分離方法。

[22] 前記第 2の工程における前記第 2の流体分断手段は、第 2の板状部材において、前記第 1の開口部の、上辺開口部における左端部又は右端部と連続した L字型の第

2の開口部を含むことを特徴とする、請求項 21に記載の細胞分離方法。

[23] 前記第 3の工程における前記第 3の流体分断手段は、第 3の板状部材において、前記第 1の開口部の、前記上辺開口部における、前記第 2の開口部が連続した前記左端部又は前記右端部の残りと連続した L字型の第 3の開口部を含むことを特徴とする、請求項 22に記載の細胞分離方法。

[24] 前記第 4の工程における前記流体合流手段は、前記第 1の板状部材において、前記第 1の開口部の後方において、前記第 2の開口部の先端部及び前記第 3の開口部の先端部と連続した I字型の第 4の開口部を含むことを特徴とする、請求項 23に記載の細胞分離方法。

[25] 前記第 2の工程において、前記第 2の流体分断手段により、前記流体の断面を、前記流体の、前記第 1の流体分断手段への流入時と比較して、 90度回転させることを特徴とする、請求項 20〜24の、ずれか一に記載の細胞分離方法。

[26] 前記第 3の工程において、前記第 3の流体分断手段により、前記流体の断面を、前記流体の、前記第 1の流体分断手段への流入時と比較して、 90度回転させることを特徴とする、請求項 20〜25のいずれか一に記載の細胞分離方法。

[27] 前記第 4の工程において、前記流体合流手段により、前記流体の断面を、前記流体の、前記第 1の流体分断手段への流入時と比較して、 180度回転させることを特徴とする、請求項 20〜26のいずれか一に記載の細胞分離方法。

[28] 前記流体は、前記磁気ビーズを含む流体と前記細胞を含む流体とが積層された多層流体であることを特徴とする、請求項 20〜27のいずれか一に記載の細胞分離方法。

[29] 前記多層流体は、前記第 1の流体分断手段、前記第 2の流体分断手段及び前記第 3の流体分断手段を介して分断された後、前記流体合流手段で合流された際に、その積層順序が逆転するとともに、その積層数が 2倍となることを特徴とする、請求項 28に記載の細胞分離方法。

[30] 前記第 1の流体分断手段から前記第 3の流体分断手段、及び前記流体合流手段における前記第 1の開口部力前記第 4の開口部の少なくとも一つにおいて、角部の面取を実施したことを特徴とする、請求項 20〜29のいずれか一に記載の細胞分離方法。

[31] 前記第 1の流体分断手段から前記第 3の流体分断手段、及び前記流体合流手段の少なくとも一つは、榭脂、金属又はガラス力もなることを特徴とする、請求項 20〜3 0のいずれか一に

記載の細胞分離方法。

[32] 前記第 1の工程力も前記第 5の工程を 1サイクルとして、このサイクルを複数回実施することを特徴とする、請求項 20〜31のいずれか一に記載の細胞分離方法。

[33] 前記第 5の工程にぉ、て、前記分離は、前記流体の流路を挟むようにして設けられた磁石による磁力を利用して実施することを特徴とする、請求項 20〜32のいずれか一に記載の細胞分離方法。

[34] 前記マイクロミキサーを透過した後の、前記磁気ビーズ及び前記磁気ビーズに付着した前記細胞を含む流体に対してバッファ液を混合し、前記磁気ビーズに付着した前記細胞を含む流体から、前記細胞のみを分離除去する工程を具えることを特徴とする、請求項 20〜33のいずれか一に記載の細胞分離方法。

[35] 前記分離除去は、前記流体の流路を挟むようにして設けられた磁石による磁力を利用して実施することを特徴とする、請求項 34に記載の細胞分離方法。

[36] 前記細胞の表面に表面マーカーとしての抗原を付着し、前記磁気ビーズの表面に前記抗原と抗原抗体反応を生ぜしめる抗体を付着する工程を具えることを特徴とする、請求項 20〜35のいずれか一に記載の細胞分離方法。

[37] 所定の循環手段により、前記磁気ビーズを循環し、再利用する工程を具えることを特徴とする、請求項 20〜36のいずれか一に記載の細胞分離方法。