WO2006070667A1

WO2006070667A1 - Ｅｇｆｒ遺伝子変異の検出法ならびに検出キット

Info

Publication number: WO2006070667A1
Application number: PCT/JP2005/023486
Authority: WO
Inventors: Masamitsu Shimada; Fumitsugu Hino; Ikunoshin Kato
Original assignee: Takara Bio Inc.
Priority date: 2004-12-28
Filing date: 2005-12-21
Publication date: 2006-07-06
Also published as: JPWO2006070667A1

Abstract

　疾病予知や薬効ならびに副作用にも関連したＥＧＦＲ遺伝子の欠損変異を迅速・簡便・高感度に検出する方法ならびにキット。

Description

明細書

EGFR遺伝子変異の検出法ならびに検出キット

技術分野

[0001] 本発明は疾病予知や薬効ならびに副作用にも関連した EGFR遺伝子の欠損変異を迅速 ·簡便 ·高感度に検出する方法ならびにキットに関する。

背景技術

[0002] 近年、遺伝子レベルでの多彩な変異（点変異、欠損、挿入、重複）が遺伝病のみに限らず、生活習慣病に密接に絡んでいることが明らかにされつつある。さらには、薬効予測や副作用予測といった薬理ゲノム解析が臨床にも応用されつつある。中でも、肺癌治療薬である EGFR阻害剤と EGFRの変異との関係が明らかにされた (非特許文献 1、 2、 3、 4参照）。

上記遺伝子変異のうち点変異の検出法としては、従来から様々な方法が報告されている（非特許文献 5参照）。例えば、 3 '末端が変異特異的な配列を有するプライマ一を用いて核酸増幅の有無を調べる方法（特許文献 1参照）、プローブ技術を用いる方法 (TaqMan法、特許文献 2、 3参照）、 Invader法（特許文献 4参照）、 Cycling p robe technology (非特許文献 6参照）、 CataCleave probe法（非特許文献 7参照）、 Cycleave法（特許文献 5参照）、 Hybridization probe法（特許文献 6参照）、 Scorpion法 (非特許文献 8参照）、シーケンス法、 1塩基伸長法などがある。これらの方法は例えば Ras変異、各種 SNPタイピングに広く用いられており、 EGFRに存在する点変異（例えばェキソン 21に存在するコドン 858の L―〉 R変異)解析にも応用可能である。

[0003] また、欠損変異解析もシーケンス法や高性能電気泳動法によって実施されてきた。

例えば、 CC chemokine receptor 5 (CCR5)遺伝子の + / Δ 32欠損変異に代表される例では、上記遺伝子欠損変異は、その欠損パターンが一定であるため、正常配列に対する通常のプライマーで核酸増幅し、 TaqManなど正常配列および欠損ジャンクション領域に対する 2種類のプローブを用いてシグナルの有無や強度を調ベてタイピングしてレ、る（非特許文献 9)。 [0004] 特許文献 1：特許第 2853864号公報

特許文献 2:米国特許第 5， 210, 015号明細書

特許文献 3:米国特許第 5， 487, 972号明細書

特許文献 4:米国特許第 5， 846, 717号明細書

特許文献 5：国際公開第 03Z074696号パンフレット

特許文献 6：国際公開第 97Z46714号パンフレット

非特許文献 l:Science、 304, p. 1497-1500(2004)

非特許文献 2:New England Journal of Mededicine、 350、 p. 2129-213 9(2004)

非特許文献 3 : British Journal of Cancer, 93, p. 355— 363(2005) 非特許文献 4: Clinical Cancer Research, 11(12), p.4289-4294(2005) 非特許文献 5 : Nature Reviews, 3、 p. 749-761(2004)

非特許文献 6:BioTechniques、 20、 p. 240-248(1996)

非特許文献 7 Analytical Biochemistry, 333(2), p. 246— 255(2004) 非特許文献 8: Nucleic Acids Research, 28、 p. 2752— 3761(2000) 非特許文献 9 : Clinical Chemistry, 46, p. 24— 30(2000)

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0005] このように欠損パターンが一定の欠損変異解析については検討されている力 S、欠損パターンが一定でない非定型欠損変異の検出においては、個々の症例に応じてシーケンス解析、核酸増幅後の高性能電気泳動解析 (例えばキヤビラリ一電気泳動）や TOF— MSによる質量分析といった、大掛力りで煩雑な工程を経なければならず、簡便に迅速にできないという問題があった。さらに、検体ががん組織である場合には通常の遺伝子多型解析のように 100%か 50%かという混在率ではなぐ大多数の正常細胞の存在下に混在するがん細胞由来の遺伝子を検出する必要がある。例えば、 5%という混在率で存在する変異遺伝子を検出する事は困難であった。

[0006] 本発明の目的は、変異のパターンが多彩でありかつ欠損配列が短い、いわゆる欠損パターンが一定していない Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR)遺伝子のェキソン 19における体細胞欠損変異について、抗癌剤（EGFR阻害剤）の効果予測、疫学調查、疾患予測の面から有用な、簡便で迅速でなおかつ高感度なスクリーニング法を提供することにある。課題を解決するための手段

[0007] 本発明者らは鋭意検討し、 EGFR正常遺伝子中に 5%の割合で混在する欠損変異遺伝子であっても検出することが可能な新規な技術を開発した。更には、前記の検出を同一反応系で閉鎖'密閉系で迅速に行う新規な技術を開発した。すなわち、シングルチューブで閉鎖.均一系でクロスコンタミの危険性を防げ、 90分という短時間で、多検体を同時測定でき、なおかつ正常遺伝子中に 5%の欠損変異遺伝子が存在するだけで検出可能な高感度検出法ならびに試薬キットを開発し、本発明を完成させた。

[0008] すなわち本発明の第 1の発明は、以下の工程を包含することを特徴とする、試料中に含まれる EGFR遺伝子のェキソン 19の欠損変異の有無を検出する方法に関する： EGFR遺伝子の欠損ジャンクション領域にアニーリング可能な少なくとも 1つの欠損配列用プライマーおよび前記欠損配列用プライマーと対向するプライマーを用いて試料中の目的領域を増幅する工程、ここで当該欠損配列用プライマーの 3'末端の塩基配列は当該欠損ジャンクションに隣接する 3'側の非欠損部位由来の 2から 5塩基からなる塩基配列であり、当該欠損配列用プライマーと対向するプライマーは欠損変異及び正常遺伝子のいずれにもアニーリング可能なプライマーである；および増幅産物の有無に基づいて欠損変異を検出する工程。

[0009] また、本発明の第 1の発明において、さらに、欠損部位を認識するプローブおよび非欠損部位を認識するプローブを含む少なくとも 2つのプローブを用いて、増幅反応と同一反応系で欠損変異を検出してもよい。

[0010] また、特に限定はしなレ、が、本発明の第 1の発明においては、配列表の配列番号 6 〜： 10いずれか記載の塩基配列を有するプライマーから選択される欠損配列用プライマー及び配列表の配列番号 11記載の塩基配列を有する前記欠損配列用プライマ一と対向するプライマー、及び/又は配列表の配列番号 16〜： 17記載の塩基配列を有するプローブを用いることが好ましい。 [0011] 本発明の第 2の発明は、以下を含有することを特徴とする本発明の第 1の発明の方法のための組成物に関する：

(1) EGFR遺伝子の欠損ジャンクション領域にアニーリング可能な欠損配列用ブライマ一、ここで当該欠損配列用プライマーの 3 '末端の塩基配列は当該欠損ジャンクシヨンに隣接する 3 '側の非欠損部位由来の 2から 5塩基からなる塩基配列である、

(2) (1)の欠損配列用プライマーと対向するプライマー、ここで当該プライマーは欠損変異及び正常遺伝子のいずれにもアニーリング可能なプライマーである、および

(3) DNAポリメラーゼ。

[0012] 本発明の第 2の発明において、さらに、（4)欠損部位を認識するプローブ（5)非欠損部位を認識するプローブ、ならびに（6)標的配列にハイブリダィズした場合に上記プローブを開裂させるための酵素、を含有してもよレ、。

[0013] また、特に限定はしなレ、が、本発明の第 2の発明においては、配列表の配列番号 6 〜： 10いずれか記載の塩基配列を有するプライマーから選択される欠損配列用プライマー及び配列表の配列番号 11記載の塩基配列を有する前記欠損配列用プライマ一と対向するプライマー、及び/又は配列表の配列番号 16〜： 17記載の塩基配列を有するプローブを含有する事が好ましレヽ。

[0014] 本発明の第 3の発明は、以下を含有することを特徴とする本発明の第 1の発明の方法のためのキットに関する：

(1) EGFR遺伝子の欠損ジャンクション領域にアニーリング可能な欠損配列用ブライマ一、ここで当該欠損配列用プライマーの 3 '末端の塩基配列は当該欠損ジャンクシヨンに隣接する 3 '側の非欠損部位由来の 2から 5塩基からなる塩基配列である、および

(2) (1)の欠損配列用プライマーと対向するプライマー、ここで当該プライマーは欠損変異及び正常遺伝子のいずれにもアニーリング可能なプライマーである。

本発明の第 3の発明おいて、さらに、（3)欠損部位を認識するプローブ、ならびに（ 4)非欠損部位を認識するプローブ、を含有しても良い。

[0015] また、特に限定はしなレ、が、本発明の第 3の発明においては、配列表の配列番号 6 〜： 10いずれか記載の塩基配列を有するプライマーから選択される欠損配列用プライマー及び配列表の配列番号 11記載の塩基配列を有する前記欠損配列用プライマ一と対向するプライマー、及び/又は配列表の配列番号 16〜： 17記載の塩基配列を有するプローブを含有する事が好ましレヽ。

発明の効果

[0016] 本発明により、 EGFR遺伝子のェキソン 19における体細胞欠損変異について、抗癌剤 (EGFR阻害剤）の効果予測、や疫学調査、疾患予測の面から有用な、簡便で迅速でなおかつ高感度なスクリーニングが可能となる。

図面の簡単な説明

[0017] [図 1-1BGFR遺伝子のェキソン 19における欠損変異のパターンを示す図である。

[図 1-2]EGFR遺伝子のェキソン 19における欠損変異のパターンを示す図である。

[図 2]実施例 5の各サンプノレにおける FAMの蛍光強度当たりの HEXの蛍光強度、 H EX/FAM値を算出しプロットした図である。

発明を実施するための最良の形態

[0018] 本明細書において欠損変異とは、正常な配列を持つ DNAから DNAの一部が欠けた変異のことを言う。

[0019] 本明細書において欠損部位とは、上記欠損変異で欠ける DNAの部位のことをいう

[0020] 本明細書において非欠損部位とは、上記欠損部位以外の部位のことをいう

[0021] 本明細書において欠損ジャンクションとは、欠損変異を有する遺伝子において、欠損部位の両側に隣接する塩基と塩基との間の部分を言う。即ち、欠損変異における非欠損部位同士の接合部分のことを言う。

[0022] 本明細書において欠損ジャンクション領域とは、欠損変異を有する遺伝子において

、欠損部位の両側に隣接する塩基を含む領域のことを言う。即ち、欠損変異における非欠損部位同士の接合部分 (即ち、欠損ジャンクション)の両側に隣接する塩基を含む領域のことを言う。

[0023] 本明細書において欠損配列用プライマーと対向するプライマーとは、核酸増幅反応において利用されるプライマー対を欠損配列用プライマーとともに構成するプライマーのことを言う。以下、本発明を詳細に説明する。

(A)本発明の EGFR遺伝子欠損変異の検出方法

本発明の検出方法は、

試料中に含まれる EGFR遺伝子のェキソン 19の欠損変異の有無を検出する方法であって、 EGFR遺伝子の欠損ジャンクション領域にアニーリング可能な少なくとも 1 つの欠損配列用プライマー、ここで当該欠損配列用プライマーの 3 '末端の塩基配列は当該欠損ジャンクションに隣接する非欠損部位由来の 2から 5塩基からなる塩基配歹 IJであり、ならびに前記欠損配列用プライマーと対向するプライマー、ここで当該ブライマ一は欠損変異および正常遺伝子のいずれにもアニーリング可能なプライマーであり、を用いて試料中の目的領域を増幅する事を特徴とする。増幅産物の検出方法に特に限定はなぐァガロースゲル電気泳動やプローブを用いた検出方法が例示される。

また、欠損部位を識別するプローブならびに非欠損部位を識別するプローブの少なくとも 2つのプローブを用いて、増幅反応と同一反応系で欠損変異を検出しても良い。

本発明の検出対象となる EGFR遺伝子のェキソン 19の欠損変異としては、 EGFR 遺伝子のェキソン 19のコドン 746から 752に出現する欠損変異が例示される。このような検出対象の好適例としては、前期非特許文献:!〜 4に記載された欠損変異が挙げられ、より好ましくは前記非特許文献 1及び 2に記載された欠損変異（図 1)が例示される。図 1において欠失 Del_ la、 Del- lb, Del_ 3、 Del_4、 Del_ 5、 Del - 2 はそれぞれ、塩基 2235〜2249の欠失（アミノ酸 E746〜A750の欠失）、塩基 2236 〜2250の欠失（アミノ酸 E746〜A750の欠失）、塩基 2239〜2247の欠失（ァミノ酸 L747〜E749の欠失、 A750Pの置換）、塩基 2240〜2257の欠失（アミノ酸 L74 7〜S752の欠失、 P753Sの置換）、塩基 2238〜2255の欠失（アミノ酸 L747〜S7 52の欠失、 E746Vの置換）、塩基 2254〜2277の欠失（アミノ酸 S752〜I759の欠失）である。図 1および上記の塩基番号はヒト EGFR遺伝子の開始コドン ATGの Aを 1とした場合の番号であり、アミノ酸番号は上記開始コドンによってコードされるメチォニン（Met)を 1とした場合の番号である。また、本発明の方法のひとつの態様は、上記欠損変異を検出するための少なくとも 1対のプライマー及び欠損部位ならびに非欠損部位を認識する少なくとも 2つのプローブを用いることを特徴とする。また、本発明の方法の別の態様は、同一反応系で核酸増幅反応とシグナル検出を同時に行い、欠損変異の有無を迅速高感度に検出することを特徴とする。

[0025] 本発明の方法で用いるプライマーは、正常 EGFR遺伝子は実質的に増幅せず、少なくとも一種の欠損変異を実質的に増幅可能なプライマーであればいずれもが好適に使用できる。特に限定はないが、例えば、本発明の方法で用いるプライマーの少なくとも 1つは EGFR遺伝子の欠損ジャンクション領域にアニーリング可能であり、当該プライマーの 3 '末端の塩基配列は欠損ジャンクションに隣接する 3 '側の非欠損部位由来の塩基配列から選ばれる。当該プライマーの 3 '末端の塩基配列は、好ましくは欠損ジャンクションに隣接する 3'側の非欠損部位由来の 2塩基〜 5塩基であり、特に好ましくは 2塩基〜 3塩基である。また、 2種類以上の前記プライマーを同一の反応系で核酸増幅反応に使用する事もできる。この事は、 2種類以上の欠損変異を同一の反応系で検出できるという点において好ましい。前記プライマーを 2種類以上用いる場合、欠損した塩基配列の鎖長をァカーロースゲル電気泳動等で鎖長を求めることによって同定するために、それぞれのプライマーの 5 '末端がアニーリングする位置がー致するようにプライマーを設定しても良レ、。前記プライマーとしては、例えば配列表の配列番号 6〜： 10のいずれか記載の塩基配列を有するものが好適に使用できる

[0026] また、本発明の方法で用いるプライマーのもう一方は、当該遺伝子の欠損変異及び正常遺伝子のいずれにもアニーリング可能なものであれば特に限定はなレ、が、長鎖 DNAの増幅が困難な、例えばパラフィン切片からの DNAを増幅できるように設定されたプライマーが好ましい。前記プライマーとしては、核酸増幅反応によって得られる増幅産物の鎖長が lOObp以下となるように設定されているプライマーが好ましぐより好ましくは増幅産物の鎖長が 87bp以下となるように設定されているプライマーである。前記プライマーとしては、例えば配列表の配列番号 11記載の塩基配列を有するものが好適に使用できる。本発明の方法において上記プライマー対により目的の欠損遺伝子を高感度に検出する事ができる。

[0027] また、本発明の方法で用いるプライマーを設定する際には、上記の事項に加えて公知の文献、例えば内海らの文献 (蛋白質、核酸、酵素、第 35卷、 p3157〜p3163 、 1990年）に記載された、プライマーを作成するためのガイドラインを参考にする事もできる。

[0028] 本発明においては、本発明の方法により増幅された DNA断片を、プローブを使用して検出しても良い。

[0029] 本発明の方法に用いるプローブは、欠損部位を認識する塩基配列ならびに非欠損部位を認識する塩基配列を有するものであれば特に限定はされなレ、が、標的配列に相補的な配列を持つものが好ましい。前記プローブとしては、例えば標的配列にハイブリダィズした場合に特定の核酸分解酵素により切断を受けるプローブが好ましい。このようなプローブとしては、 TaqMan™プローブ、 DNA—RNA— DNAキメラプローブが挙げられる。特に好ましいプローブとしては、 DNA—RNA—DNAキメラプローブである。前記キメラプローブの RNA部分の鎖長は特に限定されないが、プロ一ブの安定性の観点から 1〜5塩基である事が好ましぐ更に好ましくは 1塩基である。プローブ全体の鎖長は、好ましくは 6〜30塩基であり、更に好ましくは 10〜： 15塩基である。

上記プローブのうち、欠損部位を認識するプローブは、さまざまな欠損変異において共通して欠損している領域を選択することが好ましい。当該プローブの一部の配列は非欠損部位を含んでも構わなレ、が、増幅された欠損 DNAと当該プローブの非欠損部位とが増幅温度条件の範囲でァニールすることを避けることが好ましい。当該プローブの非欠損部位は、好ましくは 0〜： 12塩基、さらに好ましくは 0〜6塩基である。特に限定はされないが、例えば配列表の配列番号 16に記載の塩基配列を有するものが好ましい。

[0030] また、非欠損部位を認識するプローブは、さまざまな欠損において共通して欠損を受けない領域を選択されたものが好適に使用できる。特に限定はされないが、例えば配列表の配列番号 17に記載の塩基配列を有するものが好ましい。 [0031] また、欠損部位に他の欠損変異と共通した領域が存在しないか、又は共通して欠損している領域の鎖長がプローブを設定するのに十分でない欠損変異が存在する場合、その欠損変異に対しては、上記の欠損部位を認識するプローブは非欠損部位を認識するプローブとして、非欠損部位を認識するプローブは欠損部位を認識するプローブとして用レ、ることもできる。

特に限定はされないが、例えば図 1に記載の EGFR遺伝子のェキソン 19の欠損変異を例に挙げて説明すると、欠損配列 Del_ la、 Del- lb, Del— 3、 Del_4、 Del —5の欠損部位を認識するプローブ DF (配列番号 16)は、欠損配歹 IjDel— 2に対しては非欠損部位を認識するプローブとして用いることができる。また、欠損配列 Delia Del- lb, Del— 3、 Del— 4、 Del— 5の非欠損部位を認識するプローブ NH (酉己列番号 17)は、欠損配列 Del— 2に対しては欠損部位を認識するプローブとして用いること力 Sできる。

[0032] さらに本発明の方法において、特に限定はされないが例えば、 PCR法、 ICAN法、 LAMP法、 SDA法等などの当分野でよく用いられる遺伝子増幅法が利用できる。特に好ましい方法としては、例えば PCR法である。

[0033] さらに本発明において利用できるリアルタイム検出法としては、 TaqMan法、 Scoi^p ion法、 Cycling probe法、ノヽイブリダィゼーシヨンプローブ法、 Cycleave法など力 S 挙げられる。特に限定はされないが Cycleave法が好ましレ、。当該 Cycleave法では、増幅産物と RNA含有プローブでハイブリッドを形成させ、増幅産物とプローブの塩基配列が完全マッチのみ反応液中の RNaseHによりプローブの RNA部が切断され、ミスマッチの時は RNaseHにより RNA部は切断されなレ、。このことを利用して、前記のプローブとして、波長の異なる 2種以上の蛍光色素で標識され、前記蛍光色素間での蛍光の干渉が生じるようなプローブを使用した場合には、プローブの切断によつてその蛍光物質の蛍光強度が変化する事から、変異の有無が判断できる。当該蛍光色素としては蛍光波長が 20nm以上へだたればよぐ例ぇば6 _FAM (6 _ carboxy fluorescein)と HEX (Hexachloro _ 6 _ carboxyfluoresceiru、 6— FAMと ROX (6 - carboxy-X-rhodamine,いずれも ABI社製）などの組合せが利用できる。

[0034] また、当該プローブを蛍光物質と該蛍光物質の発する蛍光を消光する作用を有する物質、例えば Eclipse (Epoch Biosciences社製）または DABCYL (4_ dimeth ylaminoazobenzene - 4 '—sulfone)との両者で、互いに適当な間隔をとつて標識したものであってもよい。このようなプローブは、インタタトな状態では蛍光物質の発する蛍光の一部は消光物質によって熱エネルギーに変換されるが、切断されて蛍光物質と消光物質との距離が離れた場合には上記作用が解消され、検出される蛍光シグナル強度が上昇する。

[0035] また、 Cycleave法では、同一反応系で 2種類以上のプローブを使用することができる。このような場合、それぞれのプローブは波長の異なる蛍光色素で標識され、その蛍光強度変化の比から、より明確に変異の有無が判定できる。例えば、標的核酸中の欠損部位を検出するプローブと正常部位を検出するプローブをそれぞれ波長が異なる蛍光物質で標識し、 Cycleave法に用いた場合、欠損が存在する場合には、 2つのプローブのうち欠損部位に相当するプローブによる蛍光シグナル強度の上昇は検出されず、正常部位に相当する他方のプローブによる蛍光シグナル強度の上昇のみを検出することができる。

[0036] (B)本発明の方法のための組成物

本発明の組成物は、

上記 (A)記載の方法のための組成物であって、

(1) EGFR遺伝子の欠損ジャンクション領域にアニーリング可能な欠損配列用ブライマ一、ここで当該欠損配列用プライマーの 3 '末端の塩基配列は当該欠損ジャンクシヨンに隣接する 3 '側の非欠損部位由来の 2から 5塩基からなる塩基配列であり、

(2) (1)の欠損配列用プライマーと対向するプライマー、ここで当該プライマーは欠損変異及び正常遺伝子のいずれにもアニーリング可能なプライマーであり、および

(3) DNAポリメラーゼを含有することを特徴とする。

更には、

(4)欠損部位を識別するプローブ、および

(5)非欠損部位を認識するプローブを含有する事を特徴とする。

[0037] 本発明の組成物において、特に限定はされないが例えば、配列表の配列番号 6〜 10のいずれか記載の塩基配列を有するプライマーから選択される欠損配列用プライマー及び配列表の配列番号 11記載の塩基配列を有する前記欠損配列用プライマ一と対向するプライマーを含有してレ、てもよレ、。

さらには、配列表の配列番号 16、 17いずれか記載の塩基配列を有するプローブを含有していてもよい。

また、前記プローブは、上記 (A)に記載された標識を付されていてもよい。

[0038] また、本発明の組成物に含有される DNAポリメラーゼとしては、特に限定するものではないが、 DNA増幅に一般的に利用されている DNAポリメラーゼが好ましぐ例えは raq (Thermus aquaticus 由来 DNAポリメフーゼ、 Pfu (Pyrococcus furio sus由来 DNAポリメラーゼ、 Tli (Thurmococcus litoralis)由来 DNAポリメラーゼ、 KOD (Thermococcus kodakaraensis)由来 DNAポリメラーゼ、 Bca (Bacillus caldotenaxノ由来 DNAポリフーセ、 Bst (Geobacillus stearothermophilus; 由来 DNAポリメラーゼ、および前記 DNAポリメラーゼを 2種類以上混合した DNAポリメラーゼが挙げられ、より好ましくは、 Taq由来 DNAポリメラーゼである。

[0039] また、本発明の組成物には、当該組成物が Cycling probe法あるいは Cycleave 法に使用できるものであった場合には、プローブを開裂するための酵素を含有していてもよぐ特に限定はされないが例えば、 RNaseH (リボヌクレアーゼ H)が挙げられる。 RNaseHは古細菌由来のものがより好適であり、特に、国際公開第 02/2283 1号パンフレット記載の方法で調製することができる RNaseH (Tli RNaseH)が好適に使用できる。さらに当該組成物においては核酸増幅反応試薬等を含有していてもよい。

[0040] (C)本発明の方法のためのキット

本発明のキットは、

上記（A)記載の方法のためのキットであって、

(1) EGFR遺伝子の欠損ジャンクション領域にアニーリング可能な欠損配列用ブライマ一、ここで当該欠損配列用プライマーの 3 '末端の塩基配列は当該欠損ジャンクシヨンに隣接する 3 '側の非欠損部位由来の 2から 5塩基からなる塩基配列であり、および

(2) (1)の欠損配列用プライマーと対向するプライマー、ここで当該プライマーは欠損変異及び正常遺伝子のいずれにもアニーリング可能なプライマーであり、を含有する事を特徴とする。

更には、

(3)欠損部位を識別するプローブ、ならびに

(4)非欠損部位を認識するプローブを含有することを特徴とする。

[0041] 本発明のキットにおいて、特に限定はされないが例えば、配列表の配列番号 6〜1 0のいずれか記載の塩基配列を有するプライマーから選択される欠損配列用プライマー及び配列表の配列番号 11記載の塩基配列を有する前記欠損配列用プライマ一と対向するプライマーを含有してレ、てもよレ、。

さらには、配列表の配列番号 16、 17いずれか記載の塩基配列を有するプローブを含有していてもよい。また、前記プローブは、上記 (A)に記載された標識を付されていてもよい。

[0042] また、本発明のキットに含有される DNAポリメラーゼとしては、上記（2)で例示されたものが好適に使用できる。

[0043] また、本発明のキットには、上記（2)で例示された酵素を含有していてもよい。さらに核酸増幅反応試薬等を含有してレ、てもよレ、。

[0044] 上記の、本発明の組成物及び/又は本発明のキットを使用する事により、 EGFR 遺伝子における欠損変異の有無を簡便に検出する事が可能となる。

[0045] 以下に実施例をもって本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は実施例の範囲に限定されるものではない。

実施例 1

[0046] まず、コントロールテンプレート DNA、欠損配列検出用プライマーの合成を行った。即ち、ヒト EGFR遺伝子配歹 IJ (GenBank Accession No. AF288738)の 1648 56番目〜： 164948番目の核酸配列より、正常配列コントロールテンプレート DNA ( 配列表の配列番号 1)を DNA合成機により合成した。この配歹 IJは、ヒト EGFR遺伝子ェキソン 19 (配列表の配列番号 18)の一部を含む。また、 Paezらの文献、 Science, 304、 1497— 1500 (2004)に幸艮告された EGFRェキソン 19の欠損酉己歹 ijDel— la、 Del- lb, Del— 3、 Del— 4のアミノ酸配列情報および上記のヒト EGFR遺伝子配列情報より、 CTDel— la (配列表の配列番号 2)、 CTDel— lb (配列表の配列番号 3) 、 CTDel— 3 (配列表の配列番号 4)、及び CTDel— 4 (配列表の配列番号 5)をそれぞれ DNA合成機により合成し、欠損配列コントロールテンプレート DNAとした。得られた正常配列コントロールテンプレート DNA及び欠損配列コントロールテンプレート DNAは、滅菌蒸留水でそれぞれ lOOfgZ 1となるように調製した。

[0047] 次に EGFRェキソン 19の欠損配列 Del_ la、 Del- lb, Del_ 3、 Del_4の検出用上流プライマーとして、 FlDla (配列表の配列番号 6)、 F2Dlb (配列表の配列番号 7)、 F3D3 (配列表の配列番号 8)、 F4D4 (配列表の配列番号 9)及び F5D5 (配列表の配列番号 10)をそれぞれ DNA合成機により合成した。また、 EGFRェキソン 19 の欠損配列および正常配列に共通の検出用下流プライマーとして、 RV (配列表の配列番号 11)を DNA合成機により合成した。さらに、 EGFRェキソン 19の欠損配列 Del- la, Del- lb, Del— 3、 Del— 4の検出用上流プライマーとして、 3'末端一塩基のみが正常配列と異なる F1— 2Dla (配列表の配列番号 12)、 F2— 2Dlb (配列表の配列番号 13)、 F3— 2D3 (配列表の配列番号 14)、及び F4— 2D4 (配列表の配列番号 15)についても、それぞれ DNA合成機により合成した。図 1に下流プライマー RVの位置を示す。図 1において、それぞれの上流プライマーの位置を下線で示す。

実施例 2

[0048] 実施例 1で調製した欠損配列用プライマーを用いたマルチプレックス PCR法による EGFRェキソン 19欠損遺伝子の高感度検出について検討した。まず、鎳型となる D NAを以下のようにして調製した。即ち、欠損配歹 IjCTDel— laが全コントロールテンプレートに対して 5モル⁰ /₀となるように、実施例 1で調整した lOOfg/ μ Ι CTDel- 1 a欠損配列コントロールテンプレート DNA溶液を lOOfg/ μ 1 正常配列コントロールテンプレート DNA溶液で希釈し、 5モル％〇丁061— la欠損配列コントロールテンプレート DNA溶液とした。同様に、 CTDel— lb溶液、 CTDel— 3溶液、及び CTDel 4溶液についても、それぞれ lOOfg/ μ Ι 正常配列コントロールテンプレート DN A溶液で希釈し、 5モル％欠損配列コントロールテンプレート DNA溶液とした。

[0049] 上記で調製した各 5モル％欠損配列コントロールテンプレート DNA溶液中の欠損配列 DNAの検出をマルチプレックス PCR法によって行った。反応液組成は、 10 X P CRバッファー（タカラバイオ社製）、铸型として lOOfgの 5モル⁰ /₀の欠損配列を含むコントロールテンプレート DNAまたは l OOfgの正常配列コントロールテンプレート DNA 、並びに 1. 25Uの TaKaRa Taq DNAポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を使用し、最終濃度力 ^s0. 2mM dNTP、 2mM MgCl 、 0. 2 μ Μ FlDlaプライマー、 0. 2

2

μ Μ F2Dlbプライマー、 0. 2 μ Μ F3D3プライマー、 0. 2 μ M F4D4プライマ一、 0. 2 μ Μ F5D5プライマー、 0. 2 μ Μ RVプライマーとなるように調製した。なお、反応液容量は、 25 μ 1である。 PCR増幅装置は、サーマルサイクラ一 MP (タカラノくィォ）を用レヽ、反応条件 ίま、 95。C 30禾少、 60。C 30禾少、 72。C 30禾少を 1サイクノレとする 35サイクル反応とした。反応終了後、増幅産物を 3%NuSieve3 : lァガロース (タカラバイオ社製）で電気泳動し、ェチジゥムブロマイド染色を行いて増幅産物を検出した。

[0050] その結果、 4種類の 5モル％欠損配列コントロールテンプレートを铸型にしたすベてのサンプルにおいて、それぞれの欠損配列コントロール DNAに特異的な増幅鎖長に相当する増幅バンドのみが検出された。また、正常配列コントロールテンプレート D NAを铸型にしたサンプルでは、正常増幅鎖長に相当する 87bpの増幅バンドは確認できなかった。このこと力ら、本発明の方法によって、サンプル中の欠損配列を正確に増幅できることを確認した。

実施例 3

[0051] ARMS法として報告されている 3 '末端 1塩基のみが正常配列と異なる欠損配列用プライマーを用いたマルチプレックス PCR法による EGFRェキソン 19欠損遺伝子検出と本発明の方法にっレ、て比較 ·検討した。

即ち、実施例 1で調製した 3 '末端の 1塩基のみが EGFRェキソン 19正常配列と異なる EGFRェキソン 19欠損配列用上流プライマー Fl— 2Dla、 F2— 2Dlb、 F3— 2 D3、 F4— 2D4、及び F5— 2D5を用いて、 5モル％欠損配列コントロールテンプレート DNA溶液中の欠損配列 DNAの検出を行つた。使用する欠損配列検出用上流プライマー以外は、 PCR条件とその後の増幅産物の検出は、実施例 2と同様の条件で行った。 [0052] その結果、 Del— 1および Del— lbの 5モル％欠損配列コントロールテンプレート D NAを铸型とした場合は、正常配列 DNAを鎳型とした増幅鎖長に相当する 88bpの増幅産物のみが検出された。また、 Del— 4では正常配列 DNAを鎳型とした増幅鎖長に相当する 88bpの増幅産物と、 Del— 4欠損配列 DNAに特異的な増幅鎖長に相当する 70bpの増幅産物が 1： 1の割合で検出された。

以上の結果および実施例 2の結果より、大多数の正常配列 DNA存在下の欠損配歹 1JDNAの高感度検出には、実施例 2で用いたような欠損配列に特異的かつプライマーの 3 '末端が正常配列と 2塩基乃至 3塩基異なる配列を有するプライマーが有効であることが確認できた。

実施例 4

[0053] 本発明の検出方法の EGFRェキソン 19欠損遺伝子検出の検出限界について検討した。

即ち、実施例 2で調製した lOOfgZ 1の 5モル％欠損配列コントロールテンプレート DNA溶液をさらに lOOfg/ μ 1の正常配列コントロールテンプレート DNA溶液で希釈し、 1、 0. 1、 0. 01モル％の欠損配列コントロールテンプレート DNA溶液を調製した。これらの DNAをそれぞれ lOOfg用いて、実施例 2と同様の条件で PCR増幅を行レ、、正常配列 DNA存在下の欠損 DNAに対する検出感度を検討した。その結果、 D el_ la及び 061_ 1 は1モル％まで、 Del— 3及び Del— 4は 0. 1モル％まで欠損配歹コントロールテンプレート DNAを検出することができた。

実施例 5

[0054] 欠損特異的プライマーマルチプレックス PCR法による EGFR ェキソン 19欠損遺伝子増幅産物のサイクリングプローブ法を用いた簡便検出について検討した。検出に用いる EGFR ェキソン 19欠損配列検出用プローブとして、 5'末端を FAM (ァプライドバイオシステムズ社製)標識し、 3'末端を Eclipseクェンチヤ一（エポック社製）標識したプローブ DF (配列表の配列番号 16)、及び 5'末端を HEX (アプライドバイォシステムズ社製)標識し、 3'末端を Eclipseクェンチヤ一標識したプローブ NH ( 配列表の配列番号 17)をそれぞれ DNA合成機により合成した。

[0055] 上記のプローブを用いて、欠損特異的プライマーマルチプレックス PCR法による E GFR ェキソン 19欠損遺伝子増幅産物のサイクリングプローブ法を用いた簡便検出を行った。反応液組成は、 10 X PCRバッファー（タカラバイオ社製）、铸型として 100 fgの 5モル％の欠損配列を含むコントロールテンプレート DNA、 l OOfgの正常配列コントロールテンプレート DNAあるいは l OOngの正常ゲノム DNA、 1. 25Uの TaKa Ra Taq DNAポリメラーゼ（タカラバイオ社製）並びに 50U Tli RNaseH II (タカラバイオ国際公開第 02Z22831号パンフレット）を使用し、最終濃度が 0. 2mM dNTP、 2mM MgCl , 0. 2 μ Μ Fl D l aプライマー、 0. 2 μ M F2D lbプライ

2

マー、 0. 2 μ Μ F3D3プライマー、 0. 2 μ Μ F4D4プライマー、 0. 2 μ M F5D5 プライマー、 0· 2 μ Μ RVプライマー、 0· 2 μ Μ プローブ ΝΗ、 0. 2 μ Μ プロ一ブ DFとなるように調製した。なお、反応液容量は、 25 μ 1である。 PCR増幅および蛍光強度の検出には、 ΑΒΙ7500 system (アプライドバイオシステムズ社）を用いた。 PCR条件は、 95°C 15禾少、 60°C 40禾少、 72°C 30禾少を 1サイクノレとする 40サイクノレ反応で行った。また、 PCRと同時に ABI7500 systemにより FAMおよび HEXの蛍光強度を測定した。

[0056] その結果、欠損を受けない領域のプローブ NHの RNaseHによる開裂によって起こる HEXの蛍光強度の上昇は、 5モル％欠損配列コントロールテンプレート DNAを用レ、た全ての反応において顕著に認められた。一方、共通して欠損を受ける領域のプローブ DFの RNaseHによる開裂によって起こる FAMの蛍光強度の上昇は、 5モル %欠損コントロールテンプレート DNAを鎳型にした全ての反応においてほとんど確認されなかった。一方、正常配列コントロールテンプレート DNAおよび正常ゲノム D NAを铸型とした反応では、プローブ DFの RNaseHによる開裂及びプローブ NHの RNaseHによる開裂によって起こる蛍光強度の上昇はほとんど確認されな力つた。このこと力ら、上記プローブを用いてリアルタイム検出ができることを確認した。

[0057] さらに正常配列 DNAを铸型にした場合と変異配列 DNAを鎳型にした場合における蛍光強度上昇の差を明らかにするために、各サンプルにおける FAMの蛍光強度当たりの HEXの蛍光強度、 HEXZFAM値を算出しプロットした。その結果を図 2に示す。ここで、 Nは正常配列コントロールテンプレート DNAを鎳型とした場合の HEX /FAM値を、 N1〜N5は正常ゲノム DNAを铸型とした場合の HEX/FAM値を、 Dell - la, Dell - lb, Del— 3、 Del_4は欠損配列コントロールテンプレート DN Aを鎳型とした場合の HEXZFAM値を示す。図 2に示したように正常配列コントロールテンプレート DNAおよび 5種類の正常ゲノム DNAを鎳型にした反応においては、すべて 0. 5以下の極めて低い HEX/FAM値を示したのに対して、 5モル％欠損配列コントロールテンプレート DNAでは HEXZFAM値は 5. 8〜52. 5であり、欠損配列コントロールテンプレート DNAを含むサンプルでは、正常配列 DNAのみを含むサンプルに比べて 10倍以上の高い値を示した。この様に、 HEXZFAM値を指標にすることにより、 EGFR ェキソン 19欠損配列の存在を明確に判定できることが示され /こ

以上のように、サイクリングプローブ法と欠損配列特異的プライマーマルチプレックス PCR法を組み合わせる事により、正常遺伝子存在下においても EGFR ェキソン 1 9欠損遺伝子の 5モル％混在を検出することができ、高感度で簡便なシングノレチューブでの検出法が有効であることが確認できた。

産業上の利用可能性

[0058] 本発明によって、欠損パターンが一定していなレ、 EGFR遺伝子のェキソン 19における体細胞欠損変異の簡便で迅速でなおかつ高感度な検出方法が提供される。該検出方法は、抗癌剤の効果予測や疫学調査、疾患予測において有用である。

配列表フリーテキスト

[0059] SEQ ID NO:l:Control template DNA

SEQ ID NO:2:Control template DNA CTDel-la

SEQ ID NO:3:Control template DNA CTDel-lb

SEQ ID NO:4:Control template DNA CTDel-3

SEQ ID NO:5:Control template DNA CTDel-4

SEQ ID NO:6:PCR primer FlDla to amplify a deletion mutant "Del- la

SEQ ID NO:7:PCR primer F2Dlb to amplify a deletion mutant "Del-lb"

SEQ ID NO:8:PCR primer F3D3 to amplify a deletion mutant "Deト 3"

SEQ ID NO:9:PCR primer F4D4 to amplify a deletion mutant "Del-4"

SEQ ID NO:10:PCR primer F5D5 to amplify a deletion mutant "Deト 5" SEQ ID N〇：11 :PCR primer RV to amplify a deletion mutant of EGFR exon 19 SEQ ID NO: 12:PCR primer Fl-2Dla to amplify a deletion mutant〃Deト la〃

SEQ ID N〇：13:PCR primer F2-2Dlb to amplify a deletion mutant "Del-lb"

SEQ ID N〇：14:PCR primer F3-2D3 to amplify a deletion mutant "Del-3"

SEQ ID N〇：15:PCR primer F4-2D4 to amplify a deletion mutant "Deト 4"

SEQ ID NO: 16:Chimeric oligonucleotide probe DF to detect the DNA fragment of h uman mutant type EGFR exon 19. nucleotides 4 is a ribonucleotides- other nucleoti des are deoxynbonucleotides

SEQ ID N〇：17:Chimeric oligonucleotide probe NH to detect the DNA fragment of h uman mutant type EGFR exon 19. nucleotides 5 is a ribonucleotides-other nucleoti des are deoxynbonucleotides

Claims

請求の範囲

[1] 以下の工程を包含することを特徴とする、試料中に含まれる EGFR遺伝子のェキソン 19の欠損変異の有無を検出する方法：

EGFR遺伝子の欠損ジャンクション領域にアニーリング可能な少なくとも 1つの欠損配列用プライマーおよび前記欠損配列用プライマーと対向するプライマーを用いて試料中の目的領域を増幅する工程、ここで当該欠損配列用プライマーの 3'末端の塩基配列は当該欠損ジャンクションに隣接する 3'側の非欠損部位由来の 2から 5塩基からなる塩基配列であり、当該欠損配列用プライマーと対向するプライマーは欠損変異及び正常遺伝子のいずれにもアニーリング可能なプライマーである；および増幅産物の有無に基づいて欠損変異を検出する工程。

[2] さらに、欠損部位を認識するプローブおよび非欠損部位を認識するプローブを含む少なくとも 2つのプローブを用いて、増幅反応と同一反応系で欠損変異を検出することを特徴とする請求項 1記載の方法。

[3] 配列表の配列番号 6〜： 10のいずれか記載の塩基配列を有するプライマーから選択される欠損配列用プライマー及び配列表の配列番号 11記載の塩基配列を有する前記欠損配列用プライマーと対向するプライマーを用レ、ることを特徴とする請求項 1 記載の方法。

[4] 配列表の配列番号 16、 17いずれか記載の塩基配列を有するプローブを用いる事を特徴とする請求項 2記載の方法。

[5] 以下を含有することを特徴とする請求項 1記載の方法のための組成物：

(1) EGFR遺伝子の欠損ジャンクション領域にアニーリング可能な欠損配列用プライマ一、ここで当該欠損配列用プライマーの 3 '末端の塩基配列は当該欠損ジャンクシヨンに隣接する 3 '側の非欠損部位由来の 2から 5塩基からなる塩基配列である、

(3) DNAポリメラーゼ。

[6] さらに、

(4)欠損部位を認識するプローブ、 (5)非欠損部位を認識するプローブ、ならびに

(6)標的配列にハイブリダィズした場合に上記プローブを開裂させるための酵素、を含有することを特徴とする請求項 5記載の組成物。

[7] 配列表の配列番号 6〜： 10のいずれか記載の塩基配列を有するプライマーから選択される欠損配列用プライマー及び配列表の配列番号 11記載の塩基配列を有する前記欠損配列用プライマーと対向するプライマーを含有することを特徴とする請求項

5記載の組成物。

[8] 配列表の配列番号 16、 17いずれか記載の塩基配列を有するプローブを含有する事を特徴とする請求項 6記載の組成物。

[9] 以下を含有することを特徴とする請求項 1記載の方法のためのキット：

(1) EGFR遺伝子の欠損ジャンクション領域にアニーリング可能な欠損配列用プライマ一、ここで当該欠損配列用プライマーの 3 '末端の塩基配列は当該欠損ジャンクシヨンに隣接する 3 '側の非欠損部位由来の 2から 5塩基からなる塩基配列である、および

[10] さらに、

(3)欠損部位を認識するプローブ、ならびに

(4)非欠損部位を認識するプローブ、を含有することを特徴とする請求項 9記載のキット。

[11] 配列表の配列番号 6〜： 10のいずれか記載の塩基配列を有するプライマーから選択される欠損配列用プライマー及び配列表の配列番号 11記載の塩基配列を有する前記欠損配列用プライマーと対向するプライマーを含有することを特徴とする請求項 9記載のキット。

[12] 配列表の配列番号 16、 17いずれか記載の塩基配列を有するプローブを含有する事を特徴とする請求項 10記載のキット。