WO2006067920A1

WO2006067920A1 - 骨髄幹細胞移植治療用医薬

Info

Publication number: WO2006067920A1
Application number: PCT/JP2005/020697
Authority: WO
Inventors: Hiroshi Shimizu; Riichiro Abe; Daisuke Inokuma
Original assignee: National University Corporation Hokkaido University
Priority date: 2004-12-21
Filing date: 2005-11-11
Publication date: 2006-06-29
Also published as: JPWO2006067920A1

Abstract

　本発明は、骨髄幹細胞を利用した再生治療、特に移植された骨髄幹細胞を利用した皮膚疾患の再生治療に有効な、ＣＴＡＣＫ（T-cell attracting chemokine）を有効成分とする医薬を提供するものである。特に本発明は、根本的治療が困難とされてきた先天性皮膚疾患、例えば先天性表皮水疱症に対して、新たな治療法を提供するものである。

Description

明細書

骨髄幹細胞移植治療用医薬

技術分野

[0001] 本発明は、これまで難病として報告されてきた先天性皮膚疾患、例えば先天性表皮水疱症に対する、皮膚細胞再生による新たな治療法における、ケモカインの利用に開する。

背景技術

[0002] 先天性すなわち遺伝性の疾患は、その殆どが、正常な生体の維持に必要とされる蛋白質あるいは遺伝子に、その本来の機能が損なわれるような変異あるいは欠失が存在することで発症する疾患である。そのため、一般に、外科的治療あるいは薬物等の投与による薬学的治療によって根本的に治癒することは難しいとされている。

[0003] 皮膚組織におけるこの様な先天性疾患の一つに、先天性表皮水疱症（epidermoysi s bullosa、以下 EBとする）がある。 EBは、先天的に皮膚が脆弱であり、弱い外力でも表皮真皮の結合が解離し、皮膚に容易に水疱をきたす先天性疾患の総称として理解されている (例えば斎田俊明ら編集、「今日の皮膚疾患治療方針」、第 3版、医学書院発行、第 308〜309頁，非特許文献 1)。

[0004] EBは遺伝子性の非常に多様な疾患であり、水疱形成が電子顕微鏡観察下でどの部位に生ずる力を基に、表皮細胞内水疱形成 (単純型）、水疱形成 (接合部型)および直下の真皮内水疱形成 (栄養障害型）に大別される (清水宏、「表皮水疱症の分類」、前実績研修講習会必須 Aコース用資料、日本皮膚科学会研修医委員会発行、 2002年'非特許文献 2)。単純型ではケラチン 5あるいはケラチン 14遺伝子に、接合部型ではラミニン 5遺伝子に、栄養障害型では VII型コラーゲン遺伝子に、それぞれ変異あるいは傷害が生じて、ることが発症原因であると考えられて、る。

[0005] この EBと、う遺伝性疾患に対して、これまでには有効な根治的治療法はなぐ対症的な外用療法として抗生物質あるいは抗炎症剤を与える程度の療法しかないのが現状である。そのため、有効な治療法としては、異常が確認された遺伝子の機能を復活させる、いわゆる遺伝子治療の開発が持たれている（澤村大輔ら、「表皮水疱症に対する遺伝子治療の可能性」、 2002年、西日本皮膚科別冊、第 64卷、第 3号、第 2 77〜280頁'非特許文献 3)。

[0006] 非特許文献 1 :斎田俊明ら編集、「今日の皮膚疾患治療方針」、第 3版、医学書院発行、第 308〜309頁。

非特許文献 2 :清水宏、「表皮水疱症の分類」、前実績研修講習会必須 Aコース用資料、日本皮膚科学会研修医委員会発行、 2002年。

非特許文献 3 :澤村大輔ら、「表皮水疱症に対する遺伝子治療の可能性」、 2002年、西日本皮膚科別冊、第 64卷、第 3号、第 277〜280頁。

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0007] し力しながら、遺伝子治療は日常的に行!、得る治療法であるとは言、難ぐより汎用性の高!、、新、EB治療法の開発が望まれて、る。

[0008] 本発明は、特に、有効な薬学的治療法のない遺伝性疾患、例えば先天性表皮水疱症を、遺伝子治療以外の方法によって有効に治療あるいは症状を改善させる方法と、該方法に有用な医薬を提供するものである。

課題を解決するための手段

[0009] 本発明者らは、皮膚で発現するケモカインである CTACK(T-cell attracting chemo kine)が、これを投与された皮膚組織に骨髄幹細胞を誘引（ケモアトラタト)し、最終的に表皮細胞（bone marrow derived- keratinocytes、 BMDK)へと分化させる機能を有していることを見出し、これを骨髄幹細胞の移植と組み合わせることで、皮膚疾患、例えば EBの治療が可能となり得ること等を見出し、本発明を完成した。

[0010] すなわち本発明は、 CTACKを有効成分とする骨髄幹細胞を利用した再生治療用医薬、特に移植された骨髄幹細胞を利用した再生治療用医薬に関する。特に、移植された骨髄幹細胞を表皮細胞に分化させる CTACKを有効成分とする医薬に関する

[0011] 骨髄幹細胞を用いた再生治療は、血管新生療法、心不全、肝臓再生など、様々な疾患の治療法として期待されており、財団法人骨髄移植推進財団 (http：〃 www.jmdp .or.jp/index.html)がいわゆる骨髄バンクを設立して、骨髄幹細胞の有効利用を推進している。皮膚疾患に対しても、骨髄幹細胞力皮膚を再生させることで治療を行おうとする試みがなされているが、 CTACKの骨髄幹細胞に対するケモアトラタト作用ならびに表皮細胞への分化誘導作用、ならびにその骨髄幹細胞移植治療への利用については報告がない。

[0012] 本発明は、皮膚疾患治療としての皮膚再生医療においてその効率を向上させるために CTACKを利用するものである。

[0013] 本発明における CTACKは、国際特許公開公報 WO98Z23750号に記載された全 112アミノ酸残基力なる蛋白質、あるいはそのアミノ酸残基の一部が同公報記載のものとは異なっている力なお骨髄幹細胞に対するケモアトラタト活性ならびに BM DKへの分ィ匕誘導活性を保持している蛋白質を意味する。

[0014] これまでに、 CTACKの機能としては、 CLA+記憶 T細胞の選択的な誘引活性、皮膚榭状細胞 (ランゲルノヽンス細胞）およびこれらの前駆体への作用などが知られており、特に免疫系が関与する皮膚障害、例えば乾癬、皮膚癌、炎症、アレルギー、皮膚炎、創傷治癒、感染などに対して、一定の治癒効果が期待されることが報告されている（前記国際特許公開公報 WO98Z23750号、 Janine Moralesら、 Proc. Natl. Ac ad. Sci. U. S.A.ゝ第 96卷、第 25号、第 14470〜14475頁、 1999年、 Bernhard Ho meyら、 Nature Medicine,第 8卷、第 2号、第 157〜165頁、 2002年）。

[0015] これらの報告によれば、 CTACKは、ケモカインレセプターである CCR10に結合し、 CLA+細胞、 T細胞、榭状細胞または榭状細胞前駆体等の細胞をケモアトラタトして、これらを皮膚の真皮層内および Zまたは表皮層内に移動させることで、免疫系細胞に関連した皮膚疾患の治療効果を示すことが報告されている。し力しながら、 CTA CKが、免疫系細胞とは異なる骨髄幹細胞をケモアトラタトし、さらにこれを表皮細胞へと分化誘導する機能を有して、ることにつ、ては、何ら報告されて!、な！/、。

[0016] 本発明は、 CTACKの骨髄幹細胞に対する分化誘導機能を活用することで、 CTA CKについての用途を、従来提唱されていた免疫系細胞が関与する皮膚疾患の治療と、う適用枠の外に位置する新たな皮膚疾患の治療へと、拡大するものである。

[0017] 本発明は、骨髄幹細胞の表皮細胞への分化誘導を、皮膚損傷の場において行うことができ、特に根本的治癒が困難であるとされてきた先天性皮膚疾患、例えば先天性表皮水疱症に対して、新たな治療法ならびに該治療のための医薬を提供することができる。

図面の簡単な説明

[0018] [図 1]図 1は、インビトロ試験による、 CTACKの骨髄幹細胞に対するケモアトラクト活性を示す。

[図 2]図 2は、インビボ試験による、 CTACKの骨髄幹細胞に対する表皮細胞への分化誘導活性を示す。

[図 3]図 3は、 G— CSFで前処理したマウスにおける、 CTACKの骨髄幹細胞に対する表皮細胞への分化誘導活性を示す。

[図 4]図 4は、末梢血中の CD34陽性骨髄幹細胞数を増加させたマウスにおける、 C TACKの骨髄幹細胞に対する表皮細胞への分化誘導活性を示す。

発明を実施するための最良の形態

[0019] 本発明で使用する CTACKは、国際特許公開公報 WO98Z23750号あるいは前記 Moralesらの文献の記載に従って、組換え的に調製することができる。

[0020] 例えば、国際特許公開公報 WO98Z23750号に記載された CTACKをコードする遺伝子の塩基配列の全部または一部力もなるプローブを用いて、同公報の記載に従ってクロー-ングすればよい。また、 CTACKの全長をコードする DNAを DNA合成機などを用いて合成し、これを用いて組換え的に調製することができる。また、米国ミネアポリスの R&D System社あるいはその他の機関から市販されて!、る CTACK を利用しても良い。

[0021] また、同国際公報等に具体的に記載されたアミノ酸配列あるいは DNA配列以外であっても、例えば 1以上のアミノ酸が置換、欠失、および Z若しくは付加したアミノ酸配列からなる、骨髄幹細胞に対するケモアトラタト活性ならびに BMDKへの分ィ匕誘導活性を有するポリペプチドも、本発明において利用することができる。

[0022] 例えば、アミノ酸残基の電荷、大きさ、疎水性等の物理ィ匕学的性質にっ、て保存性の高、変異、例えばグリシン（Gly)とプロリン (Pro)、 Glyとァラニン (Ala)またはバリン (Val)、ロイシン（Leu)とイソロイシン（lie)、グルタミン酸（Glu)とグルタミン（Gin) 、ァスパラギン酸 (Asp)とァスパラギン (Asn)、システィン（Cys)とスレオニン (Thr)、 Thrとセリン (Ser)または Ala、リジン（Lys)とアルギニン (Arg)との間の、それぞれの置換等が挙げられる。

[0023] 同様に、力かる CTACKあるいはその変異体をコードする遺伝子も、 CTACK等の組み換え的生産に利用することができる。

[0024] また CTACKをコードする DNAを保持するベクター、該ベクターを用いて形質転換させる宿主等も、先行する文献に記載の組み合わせあるいはその他の汎用の組み合わせを選択して使用すればよい。また、プラスミドの他に、バキュロウィルス、レトロウィルス、ワクシニアウィルス等の種々のウィルスを用いることも可能である。

[0025] 発現は、 CTACK遺伝子固有のプロモーター配列の制御下に発現させてもよぐあるいは、別の適当な発現プロモーターを CTACK遺伝子固有のプロモーター配列に接続あるいは置き換えて使用することもできる。この場合に使用するプロモーターは、宿主及び発現の目的に応じて適宜選択すればよぐ例えば宿主が大腸菌である場合には T7プロモーター、 lacプロモーター、 trpプロモーター、 λ PLプロモーターなど 1S 宿主が酵母である場合には PH05プロモーター、 GAPプロモーター、 ADHプロモーター等が、宿主が動物細胞である場合には SV40由来プロモーター、レトロウイルスプロモーター等を例示できるが、当然ながらこれらには限定されな、。

[0026] 骨髄幹細胞移植を受けた患者への CTACKの投与形態としては、 CTACKを適当な緩衝液、例えば生理食塩水等に溶解した溶液の形態、適当な乳化剤を添加したェマルジヨンの形態、これらの溶液あるいはェマルジヨンを保持した不織布などのシートの形態など、いずれも採ることができる。これらは患部に直接塗布あるいは貼付して使用することができる。

[0027] 以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。

実施例 1

[0028] CTACKの骨髄幹細胞に対するケモアトラタト活性を、インビトロ試験により確認した。

[0029] マウス（C57BL6)の骨髄から Wileyらの方法（Current Protocols of Immunology, ISS N 0-471-52276-7)に従って骨髄細胞を分離した。次いで、細胞表面に発現している CD34抗原に特異的な抗体を用いた抗体染色（PharMingen社製）を行、、 CD34陽性骨髄幹細胞を FACSVantage (BD Bioscience社製）を用いて分離した。

[0030] 孔径 3 μ mのインサート (倉敷紡績社製)の上部インサートに DMEM培地に懸濁した CD34陽性骨髄幹細胞 1 X 10⁵個を、下部プレートに同培地に溶解した 0〜500n gZmlの CTACK(R&D System社製）またはストロマ細胞由来因子 1 (stroma cell d erived factor- 1、 SDF— 1)をそれぞれ加え、 37°Cでインキュベートした。 4時間後、下部プレートに遊走した CD34陽性骨髄幹細胞の個数をへモサイトメーターで計測した。

[0031] この結果、 lOngZml以上の濃度において、 CTACKは濃度依存的に CD34陽性骨髄幹細胞をケモアトラタトした（図 1)。

実施例 2

[0032] CTACKの皮膚損傷部位における骨髄幹細胞の誘導分化活性を、インビボ試験により確認した。

[0033] βァクチンプロモーターの制御下に GFP蛋白質遺伝子を置、た組換え遺伝子を用いて作成されたトランスジエニックマウス（GFPマウス、米国 Jackson Laboratoriesより分与)から、実施例 1と同様にして骨髄幹細胞を分離した。

[0034] この細胞を、 850cradの放射線処理によって骨髄細胞を破壊したマウス野生株（C5 7BI/6)の骨髄内に注射した後、 4週間、標準的な条件下で飼育して、骨髄由来細胞のみが GFPの蛍光を発する、 GFPキメラマウスを作成した。

[0035] キメラマウスを 4群に分け、それぞれのキメラマウスの背部に直径 6mmの皮膚欠損創を作成した直後に、 1群には CTACK (R&D System社製、 IngZリン酸緩衝食塩水 30 1)を、 2群には SDF— l (lngZリン酸緩衝食塩水 30 1)を、 3群には 2次リンパ球組織ケモカイン（secondary lymphoid tissue chemokine、 IngZリン酸緩衝食塩水 30 /z l)を、 4群には同緩衝液のみをそれぞれ創部周辺に局所投与し、さらに創傷が完全に治癒するまで (約 28日）標準的な条件下で飼育した。

[0036] 飼育後、創部を切除し、 OCTcompoundに包埋し、厚さ 5 μ 1の組織片を作成し、ケラチン 14、 CTACK,ならびに他のケモカインに対する抗体および蛍光色素（FITC、 RI TC)が結合した 2次抗体を用いて、いずれの抗体反応も濃度 100倍希釈、作用時間 1時間、室温の条件下で行って蛍光組織染色を行った。

[0037] 染色した組織片を、共焦点レーザー顕微鏡 (Laser Scanning Confocal Imaging Syst em MRC 1024、 Bio- Rad社製）を用いて観察し、 GFP陽性かつケラチン 14陽性である細胞を骨髄幹細胞力分ィ匕した表皮細胞として、全表皮細胞中の割合を計測した。

[0038] その結果、 CTACK投与を行った群において、有意に骨髄幹細胞由来の表皮細胞の割合が増カロした（図 2)。

実施例 3

[0039] CTACK投与前に、 150 g/kg/日の G— CSFを 3日間連続投与して、末梢血中の CD34陽性骨髄幹細胞数を増加させた (約 100倍)以外は、実施例 1と同様にして行!、、骨髄幹細胞から分化した表皮細胞の全表皮細胞中の割合を計測した（図 3

) o

[0040] また、 GFPマウスの骨髄細胞内から、 MACS法 (magnetic activated cell sorting, Mil tenyl Biotec社)を用いて CD34陽性細胞を分離し、この細胞（5 X 10⁵個）を正常マウスの尾部力も静脈内注射して、末梢血中の CD34陽性骨髄幹細胞数を増カロさせた以外は、実施例 1と同様にして行い、骨髄幹細胞から分化した表皮細胞の全表皮細胞中の割合を計測した (図 4)。

[0041] その結果、実施例 1の場合よりも、より多い数の骨髄幹細胞由来表皮細胞を確認することがでさた。

Claims

請求の範囲

[1] CTACKを有効成分とする、骨髄幹細胞を利用した再生治療用医薬。

[2] 移植された骨髄幹細胞を利用した再生治療である、請求項 1に記載の医薬。

[3] 再生治療が皮膚再生治療である、請求項 1又は 2に記載の医薬。

[4] 移植された骨髄幹細胞を表皮細胞に分化させて皮膚再生を行う治療である、請求項 3に記載の医薬。