WO2006067867A1

WO2006067867A1 - 細胞接着因子発現抑制剤

Info

Publication number: WO2006067867A1
Application number: PCT/JP2004/019792
Authority: WO
Inventors: Kinya Takagaki; Sadao Mori
Original assignee: Toyo Shinyaku Co., Ltd.
Priority date: 2004-12-24
Filing date: 2004-12-24
Publication date: 2006-06-29
Also published as: WO2006067867A8

Abstract

本発明は、プロアントシアニジンを含有する細胞接着因子発現抑制剤を提供する。好ましくは松樹皮由来のプロアントシアニジンを含有する。この抑制剤は、植物体由来であり、優れた細胞接着因子発現効果を有する。

Description

細胞接着因子発現抑制剤

技術分野

本発明は、細胞接着因子発現抑制剤に関する。明

背景技術

細胞接着因子は、細胞同士または細胞と書細胞外マトリクスとの接着に関与する分子群であり、その多くは膜貫通型の糖タンパク質である。例えば、セレクチン分子群、インテグリン分子群、免疫グロブリンスーパーファミリー分子群などが知られている。これらの細胞接着因子は、単に細胞間を接着させるだけでなく、生体内の種々の重要な反応に関与している。例えば、炎症反応においては、白血球が、血管内皮細胞に接着し、外来異物が存在する場所（炎症局所）に浸潤することによって、生体防御が行われる。このときの白血球の血管内皮細胞への接着および炎症局所への浸潤は、白血球および血管内皮細胞に発現しているそれぞれの細胞接着因子によつて制御される。上記の浸潤は、具体的には、（1 ) 血管内皮細胞上への白血球の捕捉、 ( 2 ) 白血球のローリング、（3 ) 白血球の内皮細胞への強い接着、および ( 4 ) 白血球の血管外への遊出の過程を経て行われ、これらの過程に細胞接着因子が関与している。すなわち、上記（1 ) および（2 ) において、白血球の捕捉およびローリングは、白血球または血管内皮細胞上に発現しているセレクチン分子群が白血球または血管内皮細胞上の糖鎖抗原に結合することにより惹起される。そして上記（3 ) および（4 ) において、白血球の強い接着および血管外への遊出は、上記セレクチン分子群と、白血球上のインテダリン分子群および血管内皮細胞上の免疫グロプリンスーパーフアミリー分子群との結合に依存する。このように、細胞接着因子が、生体反応に応じて適切に発現されることにより、正常な生体反応が維持されている。

上記のように、細胞接着因子は、炎症性サイトカインの刺激により発現が誘導される。その発現はまた、種々の病変部で亢進されていると考えられており、細胞接着の增強またはこの接着によって引き起こされる細胞間の反応によって、慢性炎症などの多くの病態形成にも関与し得る。例えば、リウマチなどの自己免疫疾患、花粉症などのアレルギー疾患は、細胞接着因子の発現亢進によって細胞間接着が増強され、過剰な炎症反応が引き起こされていると考えられている。また、上記の白血球および血管内皮細胞の細胞接着因子は、癌細胞の転移、 H I V感染にも関与することが報告されている。その他、細胞接着因子が関与する疾患として、例えば、気管支喘息、アトピー性皮膚炎、乾癬、虚血再灌流傷害、腎炎、肝炎、潰瘍性大腸炎、急性呼吸窮迫症候群、移植臓器拒絶反応などの炎症性の疾患；血液または血管に関する疾患（血液の流動性の低下に伴う血液循環不良、動脈硬化など）；敗血症；糖尿病などが挙げられる。さらに、表皮においては、水泡症、角化症、角化不全症、二キビ、肌荒れなどにも関与することが示唆されている。細胞接着因子の発現の制御 ·抑制は、単に細胞の過剰な接着を抑制するだけでなく、上記のような症状や疾患の予防および/または治療に有効である。

このような細胞接着因子の発現を抑制するために、現在までに様々な化学合成物あるいは動物由来の成分が医薬品として提案されている（特開平 1 0 - 3 3 0 2 5 9号公報、特開平 1 0— 8 7 4 9 1号公報、特開 2 0 0 1— 3 3 5 4 9 0号公報および特開 2 0 0 0 - 3 1 9 2 7 8号公報）。し力し、これらは安全な容量範囲が狭いなどの問題があるものが多いため、もっぱら医薬品としての用途に限られており、手軽に利用することはできない。発明の開示そこで、本発明は、より安全でかつ優れた効果を有する植物体由来の細胞接着因子抑制剤を提供することを目的とする。

本発明者等は、細胞接着因子の発現を効果的に抑制できる植物体由来物質について鋭意検討したところ、プロアントシァニジンが優れた細胞接着因子発現抑制作用を有することを見出して本発明の完成に至った。

すなわち、本発明の細胞接着因子発現抑制剤は、プロアントシァニジンを含有する。

好ましい実施態様においては、上記細胞接着因子は、血球細胞上に発現する細胞接着因子である。

好ましい実施態様においては、上記プロアントシァニジンは、松樹皮由来である。

本発明のプロアントシァニジンを含有する細胞接着因子発現抑制剤を経口投与あるいは経皮投与することによって、優れた細胞接着因子発現抑制効果が得られる。本発明の抑制剤は、食品、医薬品、化粧品などとして利用され得、細胞接着因子の発現に起因する種々の疾患の予防および治療に適用され得る。発明を実施するための最良の形態

以下、本発明の細胞接着因子発現抑制剤について説明する。なお、以下に説明する構成は、本発明を限定するものでなく、本発明の趣旨の範囲内で種々改変することができることは当業者に明らかである。

本発明の細胞接着因子発現抑制剤は、プロアントシァニジンを含有し、必要に応じて、その他の成分を含有し得る。以下、各成分について説明する。 (プロアントシァニジン）

本明細書において、プロアントシァニジンとは、フラバン一 3—オールおよびノまたはフラバン一 3， 4一ジォ一ルを構成単位とする重合度が 2以上の縮重合体からなる化合物群をいう。プロアントシァニジンは、抗酸化作用などの種々の活性を有することが知られている。

本発明に用いられるプロアントシァニジンとしては、重合度の低い縮重合体が多く含まれるものが好適である。重合度の低い縮重合体としては、重合度が 2〜 3 0の縮重合体（2〜3 0量体）が好ましく、重合度が 2〜 1 0の縮重合体（2〜1 0量体）がより好ましく、重合度が 2〜4の縮重合体（2 〜4量体）がさらに好ましい。この重合度が 2〜4の縮重合体を、オリゴメリック ·プロアントシァニンン ^oligomeric proanthocyanidin；以^、 O P Cという）という。プロアントシァニジンは、ポリフエノール類の一種で、植物が作り出す強力な抗酸化物質であり、植物の葉、樹皮、果物の皮もしくは種の部分に集中的に含まれている。プロアントシァニジン、特に O P Cは、具体的には、松、樫、山桃などの植物の樹皮；ブドウ、ブルーベリー、イチゴ、ァボガド、ニセアカシア、コケモモの果実もしくは種子；大麦；小麦；大豆；黒大豆；カカオ；小豆；トチの実の殻；ピーナッツの薄皮；ィチヨゥ葉などに含まれている。また、西アフリカのコーラナッツ、ペルーのラタ二ァの根、日本の緑茶にも、 O P Cが含まれることが知られている。 O P Cは、ヒトの体内では、生成することのできない物質である。

特に、 O P C含有量が高いプロアントシァニジンまたは O P C含有量が高いプロアントシァニジンを含む抽出物を用いると、 O P C含有量が低いプロアントシァニジン（重合度の高いプロアントシァニジンを高い割合で含むプ口アントシァニジン）を用いた場合と対比して、優れた細胞接着因子発現抑制効果が得られる。

本発明の抑制剤に用いられるプロアントシァニジンとしては、上記植物の樹皮、果実もしくは種子の粉砕物、またはこれらの抽出物のような材料を使用することができる。これらの中で、上記抽出物を用いることが好ましく、特に、松樹皮由来の抽出物を用いることが好ましい。松樹皮由来の抽出物は、上記プロアントシァニジンを含有する植物に由来する抽出物の中でも特に高い生理活性を示す。これは、上記プロアントシァニジンを含む植物のうち、松樹皮が O P Cを豊富に含むためと考えられる。したがって、松樹皮は、プ口アントシァニジンの原料として好ましく用いられる。

以下、 O P Cを豊富に含む松樹皮を原料植物として用いた例に挙げて、プ口アントシァニジンを主成分とする抽出物の調製方法を説明する。

松樹皮抽出物としては、フランス海岸松（Pinus Martima) 、カラマツ、クロマツ、ァカマツ、ヒメコマツ、ゴヨウマツ、チョウセンマツ、ハイマツ、リュウキユウマツ、ゥックシマツ、ダイォゥマツ、シロマツ、カナダのケべック地方のァネダなどのマツ目に属する植物の樹皮の抽出物が好ましく用いられる。中でも、フランス海岸松（Pinus Martima) の榭皮抽出物が好ましい。

フランス海岸松は、南仏の大西洋沿岸の一部に生育している海洋性松をいう。このフランス海岸松の樹皮、プロアントシァニジン、有機酸、ならびにその他の生理活性成分などを含有し、その主要成分であるプロアントシァ二ジンに、活性酸素を除去する強レ、抗酸化作用があることが知られている。松樹皮抽出物は、上記の松樹皮を水または有機溶媒で抽出して得られる。水を用いる場合には、温水または熱水を用いることが好ましい。これらの水には、抽出効率を向上させる点から、塩化ナトリウムなどの塩を添加することが好ましい。抽出に用いる有機溶媒としては、食品あるいは薬剤の製造に許容される有機溶媒が用いられ、例えば、メタノール、エタノール、 1ープロパノール、 2—プロパノーノレ、 1—ブタノール、 2—ブタノール、ァセトン、へキサン、シクロへキサン、プロピレングリコーノレ、含水エタノール、含水プロピレングリコール、メチルェチルケトン、グリセリン、酢酸メチル、酢酸ェチル、ジェチルェ一テル、ジクロロメタン、食用油脂、 1 ， 1 , 1 , 2—テトラフルォロェタン、および 1 , 1 , 2—トリクロロェテンが挙げられる。これらの水および有機溶媒は単独で用いてもよいし、組合わせて用いてもよい。特に、水、熱水、エタノール、含水エタノール、および含水プロピレンダリコールが好ましく、食品、医薬品に用いるときの安全性の観点から、水、熱水、エタノール、および含水エタノールがより好ましい。

松樹皮からプロアントシァニジンを抽出する方法は、特に限定されない。例えば、松樹皮の乾燥重量 1重量部に対して、 5 0〜1 2 0 °C、好ましくは 7 0〜1 0 0 °Cの熱水を 1〜1 0 0重量部加えて抽出することによって、生理活性作用が高く、水溶解性の高い松樹皮抽出物を得ることができる。加温抽出法、超臨界流体抽出法などを用いてもよい。

超臨界流体抽出法は、物質の気液の臨界点（臨界温度、臨界圧力）を超えた状態の流体である超臨界流体を用いて抽出を行う方法である。超臨界流体としては、二酸化炭素、エチレン、プロパン、亜酸化窒素（笑気ガス）などが用いられ、二酸化炭素が好ましく用いられる。

超臨界流体抽出法は、目的成分を超臨界流体によって抽出する抽出工程と、目的成分と超臨界流体とを分離する分離工程とを行う。分離工程では、圧力変化による抽出分離、温度変化による抽出分離、または吸着剤 ·吸収剤を用いた抽出分離のいずれを行ってもよい。

また、ェントレーナー添加法による超臨界流体抽出を行ってもよい。この方法は、超臨界流体に、例えば、エタノール、プロパノール、 n—へキサン、アセトン、トルエン、その他の脂肪族低級アルコール類、脂肪族炭化水素類、芳香族炭化水素類、またはケトン類を 2〜2 0 WZV%程度添加し、得られた抽出流体で超臨界流体抽出を行うことによって、 O P C、カテキン類（後述）などの目的とする抽出物の抽出溶媒に対する溶解度を飛躍的に上昇させる、あるいは分離の選択性を増強させる方法であり、効率的に松樹皮抽出物を得る方法である。 . 超^界流体抽出法は、比較的低い温度で操作できるため、高温で変質 ·分解する物質にも適用できるという利点；抽出流体が残留しないという利点；および溶媒の循環利用が可能であり、脱溶媒工程などが省略でき、工程がシンプ^^になるという利点がある。

また、松樹皮からの抽出は、上記の方法以外に、液体二酸化炭素回分法、液体二酸化炭素還流法、超臨界二酸化炭素還流法などにより行ってもよい。松樹皮からの抽出は、複数の抽出方法を組み合わせてもよレ、。複数の抽出方法を組み合わせることにより、種々の組成の松樹皮抽出物を得ることが可能となる。

上記抽出により得られた松榭皮抽出物は、プロアントシァニジン含有量を増加させる目的で精製してもよレ、。精製には、通常、酢酸ェチルなどの有機溶媒が用いられるが、食品、医薬品としての安全性の面から、有機溶媒を使用しない方法、例えば、限外濾過、あるいはダイヤイオン H P— 2 0、セフアデックス一 L H 2 0、キチンなどの吸着性担体を用いたカラム法またはバツチ法により精製することが好ましい。

本発明において、プロアントシァニジンを主成分として含む松榭皮抽出物は、具体的には、以下のような方法によりに調製されるが、これは例示であり、この方法に限定されない。

フランス海岸松の樹皮 1 k gを、塩ィヒナトリゥムの飽和溶液 3 Lに入れ、 1 0 0 °Cにて 3 0分間抽出し、抽出液を得る（抽出工程）。その後、抽出液を濾過し、得られる不溶物を塩化ナトリゥムの飽和溶液 5 0 O m Lで洗浄し、洗浄液を得る（洗浄工程）。この抽出液と洗浄液を合わせて、松樹皮の粗抽出液を得る。

次いで、この粗抽出液に酢酸ェチル 2 5 O m Lを添カ卩して分液し、酢酸ェチル層を回収する工程を 5回行う。回収した酢酸ェチル溶液を合わせて、無水硫酸ナトリウム 2 0 0 gに直接添加して脱水する。その後、この酢酸ェチル溶液を濾過し、濾液を元の 5分の 1量になるまで減圧濃縮する。濃縮された酢酸ェチル溶液を 2 Lのクロ口ホルムに注ぎ、攪拌して得られる沈殿物を濾過により回収する。その後、この沈殿物を酢酸ェチル 1 0 O m Lに溶解した後、再度 1 Lのクロ口ホルムに添カ卩して沈殿させる操作を 2回繰り返す洗浄工程を行う。この方法により、例えば、 O P Cを 2 0重量％以上含み、力、つ力テキン類を 5重量％以上含有する、約 5 gの松樹皮抽出物が得られる。上記松樹皮のような原料植物に由来する抽出物は、 4 0重量％以上のプロアントシァニジンを含有することが好ましい。さらに、この原料植物由来の抽出物中に O P Cを 2 0重量％以上含有することが好ましく、 3 0重量％以上含有することがより好ましい。このようにプロアントシァニジンを高い割合で含有する原料として、上述のように松樹皮抽出物が好ましく用いられる。上記松榭皮抽出物などの植物抽出物には、プロアントシァニジン、特に O P Cとともにカテキン（catechin) 類が含まれることが好ましい。カテキン類とは、ポリヒドロキシフラパン一 3—オールの総称である。カテキン類としては、（+ ) —力テキン（狭義のカテキンといわれる）、（一）一ェピ力テキン、（+ ) —ガロカテキン、（一）一ェピガロカテキン、ェピガロカテキンガレート、ェピカテキンガレート、ァフゼレキンなどが知られている。上記松樹皮のような原料植物由来の抽出物からは、上記の（+ ) —力テキンの他、ガロカテキン、ァフゼレキン、（+ ) —カテキンの 3—ガロイル誘導体、およぴガロカテキンの 3—ガロイル誘導体が単離されている。カテキン類は、単独では水溶性が乏しく、その生理活性が低いが、 O P Cの存在下で水溶性が増すと同時に、活性化する性質があり、 O P Cとともに摂取することで効果的に作用する。

カテキン類は、上記原料植物抽出物に、 5重量％以上、好ましくは 1 0重量％以上含有されていることが好ましい。さらに好ましくは、該抽出物中に 0 ?じを2 0重量％以上、そしてカテキン類が 5重量％以上含有される。例えば、抽出物のカテキン類含量が 5重量％未満の場合、力テキン類を添加し、最終的な含量が 5重量％以上となるように調整してもよい。 0 じを2 0重量％以上含有し、かつ力テキン類を 5重量％以上含有する松樹皮抽出物を用いることが最も好ましい。

(その他の成分）

本発明の抑制剤は、必要に応じて、ァスコルビン酸またはその誘導体および種々の成分を含有し得る。

ァスコルビン酸またはその誘導体は、本発明に用いられるプロアントシァ二ジン、特に O P Cの効果をより効率よく発揮させることができる点で、本発明の抑制剤に含有させることが好ましい。ァスコルビン酸またはその誘導体としては、食品添加物として用いられるァスコルビン酸またはその誘導体、例えば、ァスコルビン酸グリコシド、ァスコルビン酸ナトリウム、ァスコルビン酸マグネシゥムなどが用いられる。ァスコルビン酸を豊富に含む天然素材（例えば、レモン、オレンジ、ァセロラなどの果実由来の天然素材、あるいは、ブロッコリ一、メキャベツ、ピーマン、コマツナ、カリフラワーなどの野菜由来の天然素材）も、本発明においてァスコルビン酸として用いることができる。

ァスコルビン酸またはその誘導体をプロアントシァニジン（中でも、 O P C ) とともに摂取すると、ァスコルビン酸の吸収率や生理活性の持続性も高くなる。本発明では、血管の保護、特に血管の柔軟性および強度を増強させる目的で、ならびに血中のコレステロールを低下させる目的で、ァスコルビン酸またはその誘導体を含有してもよい。特に、ァスコルビン酸またはその誘導体は、血管だけでなくあらゆる組織の構成タンパク質であるコラーゲンの合成を促進する作用、ストレス（特に、酸化ストレス）を軽減する作用、抗血栓作用、および免疫力を高める作用があることが知られているため、血管保護や血液の流動性の改善効果だけでなく、生体内全体の組織を改善する効果がある。

ァスコルビン酸またはその誘導体の含有量に特に制限はない。好ましくは、プロアントシァニジンとァスコルビン酸との重量比が、 1 : 0 . 1〜： I ： 5 0、より好ましくは 1 ： 0 . 2〜 1 ： 2 0となるように、本発明の抑制剤に含有される。

種々の成分としては、例えば、通常の食品や医薬品として添加し得る成分 (賦形剤、増量剤、結合剤、増粘剤、乳化剤、滑沢剤、湿潤剤、懸濁剤、着色料、香料、栄養成分、食品添加物など）が挙げられる。上記成分は、単独で含有させてもよく、組み合わせて含有させてもよい。

栄養成分としては、例えば、細胞接着因子に関連する疾病および疾患を予防する効果を有する成分；およびさらに機能性を付与する成分が挙げられる力これらに限定されない。

細胞接着因子に関連する疾病および疾患を予防する効果を有する成分としては、例えば、プロアントシァニジンと同様に細胞接着因子の発現を抑制する成分（ムコ多糖類、アミノ糖などの動物由来の成分）；血糖値の増加、血中脂質の増加、または高血圧を抑制する作用、抗血栓作用、抗炎症作用、抗月重瘍作用などを有する成分（含硫有機化合物、ビタミン、ビタミン E、キチン .キトサンおよびその誘導体、コラーゲンなど）；および血管保護作用または抗酸化作用を有する成分（ヘスペリジン、ケルセチン、ルチン、これらの誘導体など）が挙げられる。

機能性を付与する成分としては、例えば、フラボノイド類；ビタミン A、ビタミン B群などのァスコルビン酸以外のビタミン類；水溶性食物繊維；口ーャルゼリー；プロテイン；ミネラル；レシチン；クロレラ末；ァシタバ末；モロヘイヤ末などが挙げられる。

食品添加物としては、ステビア末、抹茶パウダー、レモンパウダー、はちみつ、還元麦芽糖、乳糖、糖液、調味料などが挙げられる。 (細胞接着因子発現抑制剤）

本発明の細胞接着因子発現抑制剤は、上述のように、プロアントシァニジンを含有し、必要に応じて、ァスコルビン酸またはその誘導体および種々の成分を含有し得る。

本発明の抑制剤中のプロアントシァニジンの含有量に特に制限はない。経口投与の場合は、好ましくは 0. 001重量％〜50重量％、より好ましくは 0. 005重量％〜20重量⁰ /。である。経皮投与の場合は、プロアントシァニジンが、抑制剤中に、好ましくは 0. 00001重量％〜20重量％、より好ましくは 0. 0001重量％〜20重量％、さらに好ましくは 0. 0 01重量％〜15重量％の割合で含有され得る。なお、経口投与の場合は、成人の 1 日あたりの摂取量が、プロアントシァニジンとして 0. 001〜1. O g、好ましくは 0. 002 g〜0. 5 g、より好ましくは 0. 002 g〜 0. 2 gとなるように含有する。

本発明の抑制剤は、目的に応じて、例えば、食品、医薬品、医薬部外品、化粧品などとして、各種の形態に調製することができる。

上述の用途のうち、本発明の抑制剤を食品、医薬品、医薬部外品などとして経口摂取（経口投与）する場合、その形態に特に制限はない。例えば、ハ —ドカプセル、ソフトカプセルなどのカプセル剤、錠剤、丸剤、粉末（散剤）、顆粒、ティーバッグ、飴状の粘稠な液体、液体、ペーストなどの当業者が通常用いる形態で利用される。これらは、形状または好みに応じて、そのまま摂取してもよく、あるいは水、湯、牛乳などに溶いて飲んでもよく、成分を浸出させたものを摂取してもよい。

本発明の抑制剤を医薬部外品、化粧品などとして皮膚に塗布（経皮投与）する場合にも、これらの形態に特に制限はなく、軟膏剤、ゲル、クリーム剤、乳液、ローション、パック、湿布剤、浴用剤などの当業者が通常皮膚外用剤として用いる形態であればいずれでもよい。

本発明の細胞接着因子発現抑制剤は、経口投与（摂取）あるいは経皮投与 (塗布）することにより、血球細胞、血管内皮細胞、繊維芽細胞などの細胞接着因子、特に血球細胞上での細胞接着因子の発現を抑制し得る。細胞接着因子としては、カドヘリンファミリー、免疫グロブリンスーパーファミリー、インテグリンファミリー、セレクチンファミリー、リンクタンパク質フアミリー、およびシァロムチンファミリーなどが挙げられる。本発明の抑制剤は、特にインテグリンブアミリーおよびセレクチンファミリーの発現を抑制する効果に優れる。本発明の抑制剤は、食品、医薬品、医薬部外品、化粧品などとして利用され得、自己免疫疾患、炎症性疾患、循環器系疾患、腫瘍の転移などの細胞接着因子の発現に起因する種々の疾患の予防および治療に適用され得る。実施例

以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明がこの実施例により制限されないことはいうまでもない。

(実施例 1 ：細胞接着因子発現抑制効果）

(ヒト末梢血単核球の調製）

まず、被験者から、予めへパリンを添加したシリンジを用いて 5 m L採血し、この血液に 5 m Lのリン酸緩衝化生理食塩液（P B S (-) ) を添加して血液混合液を調製した。この混合液を 6 m Lの P e r c o 1 1 (シグマ社製）上に重層して、室温下、 1， 5 0 0 r p mで 1 0分間遠心分離を行い、ヒト末梢血の単核球（以下、 h P B M Cという）を回収した。次いで、回収した h P B M Cに全量が 1 2 m Lとなるように P B S (―) を添加して再度同条件下で遠心分離を行った。遠心分離後、上清を除去した hPBMCに 5 mLの 1 %非動化ゥシ胎児血清（FBS) を含む RPMI 1640 (シグマ社）を添加して懸濁させた。この懸濁液に含まれる細胞数をカウントした後、 1 X 10⁶細胞 1111^となるょぅに上記の1% 83を含む1^?^41 1 64 0で希釈した溶液を 6ゥエルプレートに lmLずつ播種した。このような 6 ゥエルプレートを 2枚用意した。

(発現抑制試験）

上記播種した 2枚のプレートについて、各 6ゥエルのうちの 2ゥエルの細胞を含有する溶液に、プロアントシァニジンを 80重量％ (O PCを抽出物全体に対して 40重量％含む）およびカテキンを 10重量％の割合で含有する松樹皮抽出物（商品名：フラバンジェノール、株式会社東洋新薬）を I n g Zm Lとなるように添加した。別の 2ゥエルの細胞含有溶液は、上記松榭皮抽出物を 10 n gZmLとなるように添カロした。残りの 2ゥエルの細胞含有溶液には、松榭皮抽出物を添加せずに対照とした。これらのプレートを 5 容量％C0₂雰囲気下、 37 °Cにて 48時間培養した。各培養液をそれぞれ回収した後、室温下、 1, 500 r pmで 10分間遠心分離を行い、上清を除去した。得られた沈殿物に更に lmLの 5%非動化 FB S含有 RPMI 1 640を添加して再度上記と同条件下で遠心分離を行い、上清を除去した (この操作を洗浄操作という）。この洗浄操作を合計 2回行い、各試験細胞を得た。

一方のプレートから得られた 3種類の試験細胞（松樹皮抽出物 1 n gZm L添加細胞、松樹皮抽出物 10 n g/mL添加細胞、および対照細胞）を用いて、 CD 1 8 (インテグリン）の発現量を、他方のプレートから得られた 3種類の試験細胞を用いて CD 62 L (セレクチン）の発現量を以下のよう

• にして測定した。 (CD 1 8発現量の測定）

上記試験細胞に、 5 μ g/mLの抗 CD 18抗体（MEM— 18、 MON O S AN製）を含有する 0. 5 %非動化 F B S含有 R PM I 1640を 10 添カ卩して、 0°Cにて 30分間保持した。次いで、室温下、 1, 500 r pmで 10分間遠心分離を行って、上清を除去した後、上記洗浄操作を行つた。洗浄後、さらに 5 gZmLの F I TC標識抗マウス抗体（BECT ON D I K I NS ON製）を含有する 0. 5 %非動化 F B S含有 R PM I 1640を 100 μ L添加して、 0°Cにて 30分間保持した。その後、上記と同様に遠心分離後、上清除去、および洗浄操作を行った。この細胞を、 1 mLの 0. 5%非動化 FB S含有 RPMI 1640に懸濁した後、フローサィトメトリー（FACSCa l i b u r、 BECTON D I K I NSON 製）により細胞あたりの蛍光強度のピークを測定し、各 2ゥエルから得られた各試験細胞の平均値を求めた。さらに得られた蛍光強度平均値を用いて、 · 以下の式から発現抑制率を求めた。結果を表 1に示す。発現翻 /_{) = 100}- (松樹光強度） 100

(対照細胞の蛍光強度）

(CD 62 L発現量の測定）

上記試験細胞に、 5 n g/mLの PE標識された抗 CD 62 L抗体（CL

8918 PE、 CEDEARLANE製）を含有する 0. 5%非動化 FB S 含有 RPMI 1640を 100 // L添加して、 0°Cにて 30分間保持した。次いで、室温下、 1, 500 r pmで 10分間遠心分離を行って上清を除去した後、上記洗浄操作を行った。この細胞について、上記と同様にフローサィトメトリーにより細胞あたりの蛍光強度のピークを測定し、蛍光強度の平均値および発現抑制率を求めた。結果を表 1に示す。表 1

表 1から、松樹皮抽出物添加細胞では、 CD 18および CD 62 Lの発現が抑制されていることがわかる。このことは、プロアントシァニジンを含有する松樹皮抽出物が、優れた細胞接着因子発現抑制効果を有することを示す。特に、松樹皮抽出物を 1 n gZmL含有する場合は約 20%程度、 10 n g ZmL含有する場合は約 40%程度、 CD 18および CD 62 Lの発現が抑制されていた。このことは、松樹皮抽出物に含まれるプロアントシァニジンは非常に低濃度でもその効果を発揮し得、したがって、食品、医薬品などに少量含有させることにより、十分な効果が得られると考えられる。

(実施例 2 ：錠剤の調製）

以下の各成分を混合して 1錠当たり 20 Omgの碇剤を調製した：

<錠剤の成分〉

松樹皮抽出物

ァスコノレビン酸

ビタミンミックス *

結晶セノレロース

還元麦芽糖

ショ糖エステノレ二酸化ケイ素 2mg ドロマイト 38mg

* 1 ：ビタミン B群を含有（日本香料薬品社製）

* 2 ：カルシウムおよびマグネシウム含有（三共フーヅ社

(実施例 3 ：飲料の調製）

以下の各成分を混合して飲料を調製した：

<飲料の成分〉重量（1 Lあたり）松榭皮抽出物 7 Om g 果糖ブドウ糖液糖 20 g レモン果汁 10 g クェン酸 2 g

Lーァスコルビン酸 2 g 香料 15 Omg ビタミン B ₁ 0. 8mg ビタミン8₂ 1. 2mg ビタミン B₆ 1. 8mg グノレタミン酸 100 m g アルギニン 2 Omg バリン 100 m g ロイシン 10 Omg イソロイシン 10 Omg 純水残量

(実施例 4 ：皮膚外用剤の調製）

以下の各成分を混合して皮膚外用剤を調製した <皮膚外用剤の成分〉（単位は重量％)

松樹皮抽出物： 0 . 0 0 1

ァスコルビン酸グリコシド： 0 . 1

グリセリン： 6

1 , 3—ブチレンングリコーノレ： 4

エタノーノレ： 5

ポリオキシエチレンラウリノレエーテノレ： 1

香料：少量

純水：残部産業上の利用可能性

本発明の細胞接着因子発現抑制剤は、経口投与（摂取）あるいは経皮投与 (塗布）することにより、細胞接着因子の発現、特に血球細胞における細胞接着因子の発現を抑制し得る。本発明の抑制剤は、食品、医薬品、医薬部外品、化粧品などとして利用され得、自己免疫疾患、炎症性疾患、循環器系疾患、腫瘍の転移などの細胞接着因子の発現に起因する種々の疾患の予防および治療に適用され得る。

Claims

請求の範囲

1. プロアントシァニジンを含有する、細胞接着因子発現抑制剤。

2. 前記細胞接着因子が、血球細胞上に発現する細胞接着因子である、請求項 1に記載の抑制剤。

3. 前記プロアントシァニジンが、松樹皮由来である、請求項 1または 2に記載の抑制剤。