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WO2006064739A1 - 核酸増幅反応を行うための生物学的試料の処理方法 - Google Patents

核酸増幅反応を行うための生物学的試料の処理方法 Download PDF

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WO2006064739A1
WO2006064739A1 PCT/JP2005/022676 JP2005022676W WO2006064739A1 WO 2006064739 A1 WO2006064739 A1 WO 2006064739A1 JP 2005022676 W JP2005022676 W JP 2005022676W WO 2006064739 A1 WO2006064739 A1 WO 2006064739A1
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WO
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nucleic acid
biological sample
sample
solution
gene
Prior art date
Application number
PCT/JP2005/022676
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English (en)
French (fr)
Inventor
Takeshi Nagasaka
Nagahide Matsubara
Noriaki Tanaka
Original Assignee
National University Corporation Okayama University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by National University Corporation Okayama University filed Critical National University Corporation Okayama University
Publication of WO2006064739A1 publication Critical patent/WO2006064739A1/ja

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay

Definitions

  • the present invention provides a nucleic acid derived from a target gene without separating and purifying the nucleic acid from the sample by a complicated process as in the prior art when amplifying a nucleic acid that may be contained in a biological sample. It is related with the processing method for extracting easily from a sample. Furthermore, the present invention relates to a method for amplifying a nucleic acid using the treatment method.
  • Intestinal flora and pathogenic bacteria, viruses, or other gene fragments present in mammalian digestive tract mucosal cells, malignant neoplastic cells, neoplastic cells, and secretions It is very useful for understanding the health status of individuals and for early detection of malignant neoplasms.
  • the current technology for separating and purifying genes in stool is cumbersome and laborious.
  • Nucleic acids isolated from stool force are generally obtained by dissolving stool in an alkaline lysate, centrifuging, and destroying alcohol.
  • nucleic acids from microorganisms are isolated by washing the sample with a phosphate buffer (PBS) or the like, crushing the cells by the salt benzil method, denaturing the protein, and precipitating with alcohol. It was broken. However, it has been pointed out that this method hardly recovers nucleic acid from some bacteria such as Gram-positive cocci.
  • PBS phosphate buffer
  • Non-patent Document 2 a method of crushing bacterial cells by collecting beads with a diameter of about 0.1 mm and shaking vigorously in the presence of phenol. According to this method, nucleic acids can be efficiently isolated from a wide variety of species.
  • MagExtractor manufactured by Toyobo
  • QIAamp Stool DNA Isolation Kit manufactured by QIAGEN
  • the former has a problem that the yield of nucleic acid is poor because the nucleic acid adsorbed on the beads is recovered with magnetic beads after the cells are crushed with beads.
  • the latter is a method in which cell membrane proteins are denatured by heating and nucleic acids are isolated, but this method also has a problem in yield.
  • Patent Document 1 There is also a method for extracting nucleic acids by using beads and gel filtration (Patent Document 1). Force The complexity of the work process and the direct workability cannot be avoided.
  • Patent Document 2 a method for extracting fecal force and DNA using a piece of dry filter paper.
  • the filter paper described in this document contains a stool sample that is not directly related to DNA extraction, and can be easily collected for handling such as transportation and storage by enclosing it in a plastic bag. Is. In order to extract DNA from stool samples contained in filter paper, the following steps (1) to (4) are required.
  • Non-Patent Literature 1 Sidransky D. et. Al. 1992.Identincation of ras oncogene mutations in the stool of patients with curable colorectal tumors. Science. Apr. 3; 256 (5053): 102
  • Non-Patent Document 2 Wilson, K. ⁇ . And R. ⁇ . Blithington. 1996. Human colonic biota studied by ribosomal DNA sequence analysis. Appl. Environ. Micro Diol. 62: 2273-2278 — Publication No. 306175
  • Patent Document 2 JP 2001-221721 A
  • the problem to be solved by the present invention is to separate and purify nucleic acid such as sample force DNA by a complicated process when amplifying a nucleic acid derived from a target gene that may be contained in a biological sample. It is to establish and provide a treatment method for extracting nucleic acids easily.
  • the present inventors have conducted extensive research, and as a result, dissolved a biological sample in a lysis solution, and contained the lysis solution in a carrier for development, thereby inhibiting the reaction. And the nucleic acid contained in the sample is separated and adsorbed on the development carrier, the development carrier can be directly used for the nucleic acid amplification reaction, and it may be contained in a biological sample.
  • the method of the present invention was completed by successfully amplifying a nucleic acid derived from a target gene simply and efficiently.
  • the present invention comprises the following.
  • a method of processing a biological sample to amplify nucleic acid derived from a gene that may be contained in the biological sample including the following steps:
  • a method for analyzing a gene present in a biological sample wherein a target gene is identified from the nucleic acid amplification product obtained by the amplification method described in item 4 above.
  • a nucleic acid derived from a target gene can be easily extracted from a biological sample without being separated and purified by a complicated process as in the past, and a nucleic acid amplification reaction can be performed. It becomes.
  • FIG. 1 is an explanatory diagram for preparing a stool solution by adding stool to a sample dissolution buffer.
  • FIG. 2 is a view showing a state where a fecal lysate is centrifuged and separated into a supernatant and a precipitate.
  • FIG. 3 is a view showing a state in which a developing carrier is immersed in a supernatant portion of a stool solution, and the developing carrier including the supernatant portion is dried.
  • FIG. 4 is a view showing a state in which a nucleic acid is extracted by immersing a development carrier including a supernatant portion in a PCR buffer solution.
  • FIG. 5 is a diagram showing an example of a sample solution when stool is used as a sample. (Example 1)
  • FIG. 6 is a diagram showing an example of a sample solution adsorbed and dried using a developing carrier.
  • FIG. 7 shows the results of amplification of the KRAS gene.
  • FIG. 8 shows the results of BRAF gene amplification.
  • FIG. 9 shows the results of amplification of ThrA gene (derived from E. coli). (Example 2)
  • FIG. 10 shows the results of simultaneous amplification of KRAS gene and BRAF gene. (Example 2) Explanation of symbols
  • biological sample refers to tissues, blood, serum, feces, urine, semen, sputum, saliva, nasal discharge, cerebrospinal fluid, tears, and other body fluids collected from mammals. Particularly preferred is feces. Feces are excrement obtained from mammals. Feces include intestinal mucosa cells, blood cells, intestinal cell flora, pathogenic microorganisms (eg, bacteria and viruses), and intestinal neoplasia (including colon cancer and polyps).
  • genes that may be contained in a biological sample refers to various disease-related genes and microorganism-related genes that may be contained in a biological sample. Examples include genes causing genetic diseases, genes derived from colon cancer tissue, genes derived from resident bacteria (microbes, viruses, etc.), and the like.
  • a “gene-derived nucleic acid” is almost synonymous with a gene, but a DNA fragment or an RNA fragment containing a desired position necessary for analysis is not necessary, rather than a complete gene sequence. .
  • the biological sample processing method of the present invention is based on a method including at least the following steps.
  • Step (a) lysing the biological sample with a lysis buffer
  • Step (b) A step of including a sample solution in which a biological sample is dissolved in a developing carrier;
  • Step (c) A step of bringing the obtained carrier for development directly into contact with a nucleic acid amplification reaction solution containing a target nucleic acid-specific primer.
  • the biological sample in order to dissolve the solid matter contained in the sample, the biological sample is first dissolved.
  • lysis solution a known solution can be used.
  • Tris-EDTA buffer or 8.4% (1M) sodium bicarbonate solution can be used as a stool sample solution, and a solution having a pH value of about 9 containing Tris-EDTA buffer is preferable.
  • the amount of lysate added to the biological sample can be determined in relation to the amount of sample. For example, a solution of about 0.1 to 100, preferably 1 to 30 and more preferably about 3 to 7 liters per lmg of sample can be used. The obtained solution is called a sample solution.
  • the sample solution is preferably further heated as desired.
  • the heating is, for example, 60 to 95. C, can be performed for 10 minutes to 10 hours.
  • the sample solution that has been or has not been subjected to the heat treatment can be centrifuged, and the supernatant can be collected and subjected to the next step. Centrifugation may be appropriately performed at a rotational speed of about 3,000 to 8,000 rpm, preferably 4,000 to 6, OOO rpm, more preferably about 5,000 rpm for 1 to 5 minutes.
  • the sample solution obtained by the above step (a) or the supernatant of the sample solution obtained by centrifugation is contained in the developing carrier.
  • the “developing carrier” is not particularly limited as long as it can separate a component necessary for analysis and an unnecessary component by contacting a sample solution or a supernatant.
  • the developing carrier having such a function is desirably one having a retention particle diameter of 1 to 7 m.
  • the retained particle size here refers to the value obtained from the leaked particle size when barium sulfate or the like specified in JIS P 3801 [filter paper (for chemical analysis)] is naturally filtered.
  • An example of such a developing carrier is filter paper (retained particle diameter of 1 to 7 m).
  • the filter paper is not limited to paper, and examples thereof include liquid separation filter paper, chromatographic filter paper, glass fiber filter paper, composite fiber filter paper, silica fiber filter paper, polyflon filter, and cylindrical filter paper. Further, a filter paper having anion exchange ability may be used. Examples of commercially available products include ADVANTEC standard filter papers No. 2 and No. 26, and high purity filter paper No. 5B.
  • the size of the developing carrier depends on the amount of the sample solution. In general, a strip of 10 to 200 mm in length and 1 to 10 mm in width is preferably used.
  • the thickness of the development carrier is generally 0.2 to 0.8 mm fc.
  • step (a) "Including the sample solution in the developing carrier” means immersing 2 to 10 mm of the tip of the developing carrier in the sample solution or supernatant obtained in the above step (a) for 0.5 to 3 seconds. It means to be immersed in.
  • the sample solution or supernatant soaked in the development carrier is naturally developed by the surface tension of the development carrier, and the nucleic acid contained in the sample solution is separated.
  • the nucleic acid can be separated from the amplification reaction inhibitory substance, such as rot acid, present in the sample solution with the use of the carrier for expansion.
  • a hanging process may be performed under suction conditions using, for example, a vacuum pump. Deployment is sufficient at room temperature, but humidity 40
  • the developing carrier containing the sample solution or the supernatant can be dried as necessary.
  • it can be dried under the above suction conditions, or it can be dried by air drying.
  • the development carrier obtained by the above step (b) is used as a nucleus containing a target nucleic acid-specific primer.
  • Contact the acid amplification reaction solution For example, immerse the carrier for development containing the supernatant of the sample solution in the nucleic acid amplification reaction solution in step (c)!
  • a development carrier containing a sample solution for example, a stool solution
  • the portion of the development carrier colored by contact with the stool solution is lightly colored. What is necessary is just to immerse in the said nucleic acid amplification reaction solution.
  • the "nucleic acid amplification reaction solution” may be a reaction solution used in a desired nucleic acid amplification method.
  • a currently known method can be applied as the nucleic acid amplification method.
  • PCR method Science, 230: 1350-1354, 1985
  • NASBA method Nucleic Acid Sequence Based Amplification method, Nature, 350, 91-92, 1991
  • LAMP method Japanese Patent Laid-Open No. 2001-242 169.
  • the PCR method can be preferably applied.
  • the PCR method will be described as an example.
  • the desired nucleic acid can be extracted into the nucleic acid reaction solution.
  • the extracted nucleic acid can be subjected to the nucleic acid amplification treatment by either of the following methods (i) or (ii). You can choose which method to use depending on the situation.
  • a PCR buffer can be used as the nucleic acid amplification reaction solution.
  • Ampdirect crude DNA buffer (Shimadzu Corporation) is preferably used, but not limited to this, widely known PCR buffers can be used.
  • step (b) Method of performing nucleic acid amplification treatment by immersing the development carrier obtained in step (b) in the nucleic acid amplification reaction solution for 0 seconds, and then removing the development carrier.
  • step (ii) A method in which a necessary portion of the development carrier obtained in step (b) is cut out and nucleic acid amplification treatment is performed while the cut out development carrier is immersed in a nucleic acid amplification reaction solution.
  • the reaction solution soaked with the above-described carrier for development contains a target nucleic acid-specific primer, the reaction solution is directly applied to a nucleic acid amplification processing apparatus to cause a nucleic acid amplification reaction. Can do.
  • the present invention also includes detecting and identifying the target gene using the nucleic acid amplification product obtained by the above method. For example, by performing hybridization using a DNA chip, a clone library method, denatured radish endogel electrophoresis (DGGE method), temperature dalaziendo gel electrophoresis (TGGE) method, SSCP method, for example, Various genetic diseases and tumors It is possible to detect and identify a disease or a specific microorganism that constitutes a microflora in feces.
  • DGGE method denatured radish endogel electrophoresis
  • TGGE temperature dalaziendo gel electrophoresis
  • SSCP method for example, Various genetic diseases and tumors It is possible to detect and identify a disease or a specific microorganism that constitutes a microflora in feces.
  • the biological sample is feces
  • various disease-related gene markers such as genes present in the feces, tumor markers in the feces, and microorganism-related genes such as E. coli. .
  • the present invention extends to a reagent kit including a biological sample dissolving solution and a nucleic acid separation developing carrier that can be used in the nucleic acid amplification method.
  • sample lysis buffer 500 mmol / L Tris-HC1, 16 mmol / L EDTA, lOmmol / L NaCl, pH 9.0 (sample lysis buffer) was prepared.
  • LOOmg of stool was taken in a 1.5 ml tube and 500 L of sample dissolution buffer was added to dissolve the stool.
  • About 20 liters of sample dissolution buffer is desirable for 20 mg of stool to be dissolved.
  • a sample solution obtained by dissolving stool was heat-treated at 95 ° C for 10 minutes. After further centrifugation at 5,000 rpm for 5 minutes, the developing carrier was immersed in the supernatant of the sample solution.
  • the KRAS and BRAF genes present in feces and the thrA gene derived from E. coli were amplified. Rinse the fecal solution supernatant with the spreading carrier part immersed in 50 L of Ampdirect crude DNA buffer (Shimadzu Corporation), which is a buffer solution for each PCR containing the following primers (A) to (D): DNA was extracted.
  • Ampdirect crude DNA buffer Shiadzu Corporation
  • FK-F 5'-TGACTGAATATAAACTTGTGGTAG (SEQ ID NO: 1)
  • FK-106R 5'- ATTGTTGGATCATATTCGTC (SEQ ID NO: 2)
  • FB-F 5'- TAGGTGATTTTGGTCTAGCT (SEQ ID NO: 3)
  • FB-115R 5 -ATCAGTGGAAAAATAGCCTC (SEQ ID NO: 4)
  • thrA-F 5 CCCCGCCAAAATCACCAACCATCT (SEQ ID NO: 5)
  • thrA-101R 5'- CGGCAAAAATACGTTCGGCATCG (SEQ ID NO: 6)
  • nucleic acid amplification method of the present invention it is possible to quickly and sensitively perform tests necessary for genetic diagnosis, early cancer diagnosis, infectious disease diagnosis and the like.
  • the method of the present invention genetic diagnosis of various biological samples, particularly fecal force, can be performed very easily and reliably.
  • feces with unique information which is unique to other biological samples, can be used practically and simply as a non-invasive DNA material is an operation that is useful for the diagnosis of various diseases. Enables the processing of large numbers of specimens. Therefore, it can be applied to various types of screening for colorectal cancer and the like in the normal population, and it is also possible to quickly detect causes such as mass-onset infections.
  • the method of the present invention has contributed to preventive medicine, which has become increasingly important in recent years, and has led to mass outbreaks. Application to rapid diagnosis of infectious diseases that occur is expected.

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Abstract

　生物学的試料に含有可能性のある目的遺伝子由来核酸を増幅処理するにあたり、従来のように煩雑な工程により試料からDNAなどの核酸を分離精製することなく、簡便に核酸を抽出するための処理方法を確立し、提供することを課題とする。（a）試料の溶解用緩衝液で生物学的試料を溶解する工程、（b）該溶解液を展開用担体に含ませる工程、（c）得られた展開用担体を核酸増幅反応溶液に接触させる工程、を含む方法による。本発明の方法によれば、煩雑な核酸の分離精製工程を経ることなく、簡便に効率よく生物学的試料中の目的遺伝子由来の核酸を増幅させることができる。

Description

明 細 書
核酸増幅反応を行うための生物学的試料の処理方法
技術分野
[0001] 本発明は、生物学的試料に含有可能性のある核酸を増幅処理するにあたり、従来 のような複雑な工程により試料カゝら核酸を分離精製することなぐ目的とする遺伝子 由来の核酸を試料から簡便に抽出するための処理方法に関する。さらには、該処理 方法を用いた核酸の増幅方法に関する。
[0002] 本出願は、参照によりここに援用されるところの、日本特許出願特願 2004— 3594 68号優先権を請求する。
背景技術
[0003] ほ乳類の糞便中に存在する、腸内細菌叢や病原性細菌、ウィルス、またはその他 ほ乳類の消化管粘膜細胞、悪性新生物細胞、新生物細胞、および分泌液に存在す る遺伝子断片を用いて、各種類の疾患の原因探求や診断に用いることは、個体の健 康状態の把握や悪性新生物の早期発見のために非常に有用である。し力しながら、 糞便中の遺伝子を分離精製する技術は煩雑で手間が力かるのが現状である。
[0004] 現状の解析手段として、例えば、病原性細菌を同定した ヽ場合は、対象となる試料
(個体の糞便)を希釈液で希釈し、これを種々の選択培地上に撒き、嫌気性培養を 行う必要があった。しかし、培養の際には数日力も数週間の時間を要することとなり、 コロニー数のカウントを行うなど操作も煩雑であった。
[0005] これに対し、近年になって、分子生物学的手法を用いた系統分類'同定法が信頼 できる手法として注目を集めている。各種遺伝子を標的とした、特異的なプローブ'プ ライマーによって、幅広い種の細菌について、迅速かつ特異的な検出が可能となり、 これらは微生物の検出において鍵となる技術になりつつある。特にポリメラーゼ 'チェ ーン 'リアクション法 (PCR法)を用いた方法は、簡便 ·迅速 '正確に目的とする細菌等 の検出'同定を行うことができる。
[0006] また、糞便中に存在する悪性新生物細胞の遺伝子変異を同定することは、例えば 大腸癌などのスクリーニング可能であるなどの有用性が指摘されて 、る (非特許文献 D o
[0007] 糞便力ゝらの核酸の単離は、アルカリ性の溶解液に糞便を溶解し、遠心分離、および アルコール沈滅による方法が一般的である。
[0008] また、微生物からの核酸の単離は、試料をリン酸緩衝液 (PBS)等で洗浄し、塩ィ匕べ ンジル法により菌体を破砕'タンパク質変性してアルコール沈殿することにより行われ ていた。し力しこの方法では、グラム陽性球菌などの一部の細菌からはほとんど核酸 を回収できな 、ことが指摘されて 、る。
[0009] また、最近では、試料からの核酸単離の際、直径 0.1mm程度のビーズをカ卩えてフエ ノール存在下で激しく振とうすることにより菌体を破砕する方法が広く用いられるよう になっており、この方法によれば、多岐にわたる種の細菌力 効率よく核酸を単離す ることができる (非特許文献 2)。
[0010] し力しながら、糞便等の検体には、 PCR等の増幅反応において、反応を阻害する物 質 (腐敗酸等）が含まれていることがわ力つており、これらの方法ではこの阻害物質の 除去に問題があると考えられている。
[0011] 核酸単離用キットの市販品として、 MagExtractor (東洋紡製）や QIAamp Stool DNA Isolation Kit (QIAGEN製)が販売されている。前者はビーズで菌体を破砕した後、ビ ーズに吸着した核酸を磁気ビーズで回収するものである力 核酸の収率が悪いという 問題がある。一方、後者は加熱により菌体膜タンパクを変性させ、核酸を単離するも のであるが、やはりこの方法によっても収率に問題がある。
[0012] また、ビーズとゲル濾過を用いることにより核酸を抽出する方法もある（特許文献 1) 力 作業工程の複雑さ、直接作業性の悪ィ匕を避けることはできない。
[0013] また、乾燥濾紙片を用いて糞便力も DNA抽出を行う方法についても開示がある（特 許文献 2)。しかし、本文献に記載の濾紙は、 DNAの抽出に直接関係するものではな ぐ糞便試料を濾紙に含ませ、プラスチック袋に封入することにより輸送、保管などの 取扱 、を容易に採取するためのものである。濾紙に含ませた糞便試料から DNAを抽 出するためには、以下の（1)〜 (4)の工程を必要とする。
[0014] (1)乾燥便を濾紙と共にマイクロチューブに取り、 DNA分解酵素の阻害剤として EDT Aを、また陰イオン多糖体のイオン対除去のための陽イオン性界面活性剤；セチルトリ メチルアンモ-ゥムブロミド (以下 CTAB)を含む高塩濃度の抽出用溶液を加え煮沸（ ボイル）処理を行う。
(2)次にクロ口ホルムを加え混合後、遠心分離を行うことにより、陰イオン多糖体- CT AB対、過剰の CTAB、便残渣成分と濾紙は下層のクロ口ホルム層に、目的の DNA溶 液は上層の水層へと分離する。
(3)得られた水層を新たなチューブに分取し、再度、クロ口ホルムによる抽出操作を 繰返して得られた水層に 2-プロパノールをカ卩えて遠心後、 DNAの沈澱を得る。
(4) 70%のエタノールで沈澱を洗浄後、トリス緩衝液- EDTA溶液をカ卩えて最終的な DN A溶液を得る。
[0015] 上記の方法では、糞便力 DNAを抽出するための操作は、煩雑である。
非特干文献 1 : Sidransky D. et. al. 1992. Identincation of ras oncogene mutations in the stool of patients with curable colorectal tumors. Science. Apr. 3; 256 (5053): 102
- 5
非特許文献 2 : Wilson, K. Η. and R. Β. Blithington. 1996. Human colonic biota studi ed by ribosomal DNA sequence analysis. Appl . Environ . Micro Diol . 62:2273-2278 特許文献 1 :特開 2002— 306175号公開公報
特許文献 2：特開 2001— 221721号公開公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0016] 本発明が解決しょうとする課題は、生物学的試料に含有可能性のある目的遺伝子 由来核酸を増幅処理するにあたり、煩雑な工程により試料力 DNAなどの核酸を分 離精製することなぐ簡便に核酸を抽出するための処理方法を確立し、提供すること である。
課題を解決するための手段
[0017] 上記課題を解決するために本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、生物学的試料 を溶解液に溶解し、該溶解液を展開用担体に含ませ、反応を阻害する物質およびそ の試料に含まれる核酸を展開用担体に分離、吸着させることで、該展開用担体を直 接核酸増幅反応に用いることができることを見出し、生物学的試料に含有可能性の ある目的遺伝子由来の核酸を簡便に効率良く増幅させることに成功し、本発明の方 法を完成した。
[0018] すなわち、本発明は、以下からなる。
1.以下の工程を含む、生物学的試料に含有可能性のある遺伝子由来核酸を増幅 するための生物学的試料の処理方法：
(a)溶解用緩衝液で生物学的試料を溶解する工程；
(b)生物学的試料を溶解した試料溶液を展開用担体に含ませる工程；
(c)得られた展開用担体を直接、目的核酸特異的プライマーを含む核酸増幅反応溶 液に接触させる工程。
2.前記工程 (a)で得られた試料溶液を 60〜95°Cで 10分〜 10時間加熱する工程を含 む、前項第 1項に記載の処理方法。
3.前記工程 (b)により、生物学的試料を溶解した溶液中の増幅反応阻害物質と目 的核酸を分離する前項第 1項または第 2項に記載の処理方法。
4.前記工程 (c)により得られた核酸増幅反応溶液を、核酸増幅処理する前項第 1項 〜第 3項のいずれか 1項に記載の処理方法を用いた核酸の増幅方法。
5.前項第 4項に記載の増幅方法により得られた核酸増幅産物から、目的遺伝子を 同定する、生物学的試料中に存在する遺伝子の解析方法。
6.生物学的試料中に存在する遺伝子が、疾患関連遺伝子もしくは微生物由来遺伝 子である前項第 5項に記載の遺伝子の解析方法。
発明の効果
[0019] 本発明の方法によれば、従来のように煩雑な処理により分離精製することなぐ生 物学的試料から目的とする遺伝子由来核酸を簡便に抽出でき、核酸増幅反応を行う ことが可能となる。
図面の簡単な説明
[0020] [図 1]糞便を試料溶解用緩衝液に加え、糞便溶解液を調製する説明図である。（実施 例 1)
[図 2]糞便溶解液を遠心分離し、上澄みおよび沈殿に分離した状態を示す図である 。（実施例 1) [図 3]展開用担体を糞便溶解液の上澄み部分に浸し、該上澄み部分を含んだ展開 用担体を乾燥させる状態を示す図である。（実施例 1)
[図 4]上澄み部分を含む展開用担体を PCR用緩衝液に浸し、核酸を抽出する状態を 示す図である。（実施例 1)
[図 5]便を試料としたときの試料溶液の一例を示す図である。（実施例 1)
[図 6]展開用担体を用いて試料溶液を吸着 ·乾燥させたものの一例を示す図である。
(実施例 1)
[図 7]KRAS遺伝子の増幅結果を示す図である。（実施例 2)
[図 8]BRAF遺伝子の増幅結果を示す図である。（実施例 2)
[図 9]ThrA遺伝子 (大腸菌由来)の増幅結果を示す図である。（実施例 2)
[図 10]KRAS遺伝子と BRAF遺伝子の同時増幅の結果を示す図である。（実施例 2) 符号の説明
[0021] a 糞便
b 試料溶解用緩衝液
c 糞便溶液
cl 糞便溶液 (沈殿）
c2 糞便溶液 (上澄み）
d 展開用担体 (濾紙）
e PCR用緩衝液
SM サイズマーカー
発明を実施するための最良の形態
[0022] 本発明にお 、て「生物学的試料」とは、ほ乳類等力も採取した組織、血液、血清、 糞便、尿、精液、喀痰、唾液、鼻汁、脳脊髄液、涙等の体液が挙げられ、特に好適に は、糞便が挙げられる。糞便とは、ほ乳類より得られる排泄物である。糞便には腸粘 膜細胞、血液細胞、腸内細胞叢、病原微生物 (例えば細菌やウィルス）、腸内新生組 織 (大腸癌やポリープを含む)などが存在する。
[0023] 本発明にお 、て「生物学的試料に含有可能性のある遺伝子」とは、生物学的試料 中に含まれる可能性のある各種疾患関連遺伝子や微生物関連遺伝子を示し、例え ば遺伝病等の原因遺伝子、大腸癌組織由来遺伝子や常在菌ゃ感染した微生物 (細 菌、ウィルスなど）由来遺伝子等が挙げられる。本発明において「遺伝子由来核酸」と は、遺伝子と殆ど同義であるが、完全な遺伝子の配列を必要とするのではなぐ解析 に必要な所望の位置を含む DNA断片や、 RNA断片などを ヽぅ。
[0024] 本発明の生物学的試料の処理方法は、少なくとも以下の工程を含む方法による。
[工程 (a) ]溶解用緩衝液で生物学的試料を溶解する工程；
[工程 (b) ]生物学的試料を溶解した試料溶液を展開用担体に含ませる工程；
[工程 (c) ]得られた展開用担体を直接、目的核酸特異的プライマーを含む核酸増幅 反応溶液に接触させる工程。
[0025] [工程 (a) ]
本発明の処理方法においては、試料に含まれる固形物を溶解するために、まず、 生物学的試料の溶解を行う。試料の溶解用緩衝液 (以下、単に「溶解液」ともいう。 ) としては公知のものを用いることができる。例えば、糞便試料溶解液として Tris-EDTA 緩衝液や 8.4% (1M)炭酸水素ナトリウム溶液等を利用することができ、好適には Tris- EDTA緩衝液を含む pH値が 9前後の溶液が挙げられる。生物学的試料への溶解液 の添加量は、試料の量との関係で決定することができる。例えば、試料 lmgに対し、 0. 1〜100 レ好ましくは 1〜30 レより好ましくは 3〜7 L前後の溶解液を用いること ができる。得られた溶液を試料溶液という。
[0026] 該試料溶液は、所望によりさらに加熱することが好ましい。加熱は、例えば 60〜95 。C、 10分間〜 10時間行うことができる。力かる加熱処理により、試料溶液中に含まれ るタンパク質を変性させることができ、後の工程をより効果的に行うことができる。また 、加熱処理を行った、もしくは行っていない試料溶液を遠心分離し、上澄みを採取し 、次の工程に付すことができる。遠心分離は、 3,000〜8,000rpm、好ましくは 4,000〜6, OOOrpm、より好ましくは 5,000rpm前後の回転数で 1分から 5分間の間で適宜行えばよ い。
[0027] [工程 (b) ]
次いで、上記工程 (a)により得た試料溶液もしくは遠心分離により得られた試料溶 液の上澄みを展開用担体に含ませる。 本発明にお!ヽて「展開用担体」とは、試料溶液もしくは上澄みを接触させることによ り、分析に必要な成分と不要な成分を分離可能であればよぐ特に限定されない。か 力る機能を有する展開用担体は、保留粒子径 1〜7 mのものが望ましい。ここでいう 保留粒子径とは、 JIS P 3801 [ろ紙 (ィ匕学分析用)]で規定された硫酸バリウムなどを、 自然濾過したときの漏洩粒子径により求めたものを指す。このような展開用担体とし て、濾紙 (保留粒子径 1〜7 m)が挙げられる。濾紙は紙に限定されず、例えば分液 濾紙、クロマトグラフィー用濾紙、ガラス繊維濾紙、複合繊維濾紙、シリカ繊維濾紙、 ポリフロンフィルター、円筒濾紙などを例示することができる。また陰イオン交換能を 有する濾紙であってもよい。市販品としては、 ADVANTEC社の標準濾紙 2号、 26号、 および高純度濾紙 No.5B等が例示される。
展開用担体の大きさは試料溶液の量に依存する力 一般的には縦 10〜200mm、横 l〜10mmの短冊形が好適に用いられる。展開用担体の厚さは、一般的に 0.2〜0.8m mで fc 。
[0028] 「試料溶液を展開用担体に含ませる」とは、展開用担体の先端部分の 2〜10mmを 上記工程 (a)により得た試料溶液または上澄みに 0.5〜3秒間浸し、展開用担体に浸 み込ませることをいう。
[0029] 展開用担体に浸み込んだ試料溶液もしくは上澄みは、展開用担体の表面張力に よって自然展開され、試料溶液中に含有される核酸の分離が行われる。カゝくして展 開用担体によって、試料溶液中に存在する増幅反応阻害物質、例えば腐敗酸等と 核酸との分離を行うことができる。
展開用担体での展開を高めるために、所望により、例えば真空ポンプなどを用いた 吸引条件下で、ぶら下げ処理を行ってよい。展開は、室温で十分であるが、湿度 40
〜60%、温度 15〜37°Cで行うことがより好ましい。
[0030] 試料溶液もしくは上澄みを含む展開用担体は、必要に応じて乾燥させることができ る。例えば、上記吸引条件下でも乾燥させることができるし、風乾により乾燥させるこ とちでさる。
[0031] [工程 (c) ]
上記工程 (b)により得られた展開用担体を、目的核酸特異的プライマーを含む核 酸増幅反応溶液に接触させる。例えば、試料溶液の上澄みを含む展開用担体を、 工程 (c)の核酸増幅反応溶液に浸せばよ!、。ある!、は、遠心分離を行って!、な 、試 料溶液、例えば糞便溶液を含む展開用担体の場合は、該糞便溶液との接触で着色 された展開用担体の色が薄い部分を、前記核酸増幅反応溶液に浸せばよい。
[0032] 「核酸増幅反応溶液」とは、所望の核酸増幅方法に使用される反応溶液であれば よい。ここで核酸増幅方法としては、現在公知の方法を適用することができる。具体 的には、 PCR法（Science, 230: 1350-1354, 1985)や NASBA法（Nucleic Acid Sequenc e Based Amplification法、 Nature, 350,91-92, 1991)および LAMP法（特開 2001- 242 169号公報)等が挙げられ、好ましくは PCR法を適用することができる。以下では、 PC R法を例示して説明をする。
[0033] 試料溶液もしくは上澄みを含む展開用担体を、核酸増幅反応溶液に浸した後、核 酸反応溶液中に所望の核酸を抽出することができる。抽出した核酸について、核酸 増幅処理を行うのは、次の（i)または（ii)のいずれかの方法によることができる。いず れの方法を用いるかは状況に応じて使い分けることができる。また、核酸増幅反応溶 液として PCR用緩衝液を用いることができる。 PCR用緩衝液として、例えば Ampdirect 粗精製 DNA用バッファー (島津製作所)を用いることが好ましいが、これに限定されず 、広く公知の PCR用緩衝液を使用することができる。
[0034] (0数秒間、核酸増幅反応溶液に工程 (b)により得られた展開用担体を浸した後、展 開用担体を取り除き、核酸増幅処理を行う方法。
(ii)工程 (b)により得られた展開用担体の必要な部分を切り出し、該切り出した展開 用担体を核酸増幅反応溶液に浸したまま核酸増幅処理を行う方法。
[0035] 上述の展開用担体を浸した核酸増幅反応溶液には、目的核酸特異的プライマー を含んでいるので、該反応液を直接核酸増幅処理装置に付して、核酸増幅反応をさ せることができる。
[0036] 本発明は、上記方法により得た核酸の増幅産物を用いて、目的遺伝子を検出 '同 定することも含まれる。例えば、 DNAチップによるハイブリダィゼーシヨンや、クローン ライブラリ一法、変性ダラジエンドゲル電気泳動法 (DGGE法）、温度ダラジエンドゲル 電気泳動法 (TGGE)法、 SSCP法を行うことにより、例えば、遺伝病や腫瘍等の各種 疾患の検出、あるいは糞便中の微生物叢を構成する微生物を特異的に検出'同定 することができる。
例えば生物学的試料が糞便の場合には、該糞便中に存在する遺伝子、糞便中の 腫瘍マーカー等の各種疾患関連遺伝子マーカーや、大腸菌等の微生物関連遺伝 子の解析方法を提供することができる。
[0037] なお本発明は、上記核酸増幅方法に用いることのできる生物学的試料溶解用の溶 液、核酸分離用展開用担体を含む試薬キットにも及ぶものである。
以下に具体的な実施形態を示す。
実施例
[0038] (実施例 1)糞便溶液を含む展開用担体 (濾紙)の作製
糞便の溶解液として， 500mmol/L Tris- HC1, 16mmol/L EDTA, lOmmol/L NaCl, p H9.0の組成の溶液 (試料溶解用緩衝液)を調製した。 1.5mlチューブに糞便を lOOmg 取り、試料溶解用緩衝液を 500 L入れ、糞便を溶解した。溶解する糞便 20mgに対し 、試料溶解用緩衝液は 100 L前後が望ましい。糞便を溶解して得た試料溶液を、 95 °C-10分間加熱処理した。さらに 5,000rpm-5分間遠心分離した後、展開用担体を試 料溶液の上澄みに浸した。本実施例では展開用担体は ADVANTEC社の標準濾紙 2 号を用いた。次に、上澄みを浸み込ませた展開用担体を乾燥させ、その上澄み液を 含む展開用担体部分を、 PCR用緩衝液である Ampdirect粗精製 DNA用バッファー (島 津製作所)に直接 2〜3秒間浸け、軽く濯ぐことにより糞便中に存在する DNAを PCR反 応混合溶液内に抽出した（図 1〜6)。
[0039] (実施例 2)糞便中の遺伝子の増幅
実施例 1による方法で得た展開用担体を用いて、糞便に存在する KRAS遺伝子と B RAF遺伝子、および大腸菌由来の thrA遺伝子の増幅を行った。糞便溶液の上澄み 液の付着した展開用担体部分を、以下の (A)〜 (D)各プライマーを含む各 PCR用緩 衝液である Ampdirect粗精製 DNA用バッファー (島津製作所) 50 Lに浸けて濯ぎ、 D NAを抽出した。
(A) KRAS遺伝子コドン 12, 13を挟んで増幅するプライマーペア一
FK-F: 5'- TGACTGAATATAAACTTGTGGTAG (配列番号 1) FK-106R: 5'- ATTGTTGGATCATATTCGTC (配列番号 2)
(B) BRAF遺伝子コドン 599を挟んで増幅するプライマーペア一
FB-F: 5'- TAGGTGATTTTGGTCTAGCT (配列番号 3)
FB-115R: 5 -ATCAGTGGAAAAATAGCCTC (配列番号 4)
(C)大腸菌に特異的な ThrA遺伝子を増幅するプライマーペア一
thrA-F: 5し CCCCGCCAAAATCACCAACCATCT (配列番号 5)
thrA-101R: 5'- CGGCAAAAATACGTTCGGCATCG (配列番号 6) )
(D) (A)に記載の KRAS遺伝子を増幅するプライマーペア一と (B)に記載の BRAF遺 伝子を増幅するプライマーペア一とを含む。
(A)、（B)、（C)、（D)の各遺伝子増幅反応はすべて、アニーリング温度 53°Cの条件 で 40サイクルの PCR反応を行った。その後、 3%ァガロースゲルにて電気泳動を行い 、目的とする遺伝子が増幅されていることを確認した（図 7〜10)。
産業上の利用可能性
[0040] 本発明の方法を用いることにより、煩雑な手法により生物学的試料力 核酸を精製 •抽出することなぐ極めて簡便に目的とする遺伝子由来の核酸を抽出し、増幅'検 出が可能となる。よって、本発明の核酸増幅方法を用いることにより、遺伝子診断、早 期ガン診断、感染症診断などに必要な検査を迅速かつ鋭敏に行うことが可能となる。
[0041] 本発明の実施例によると、試料として糞便を用いた場合に、正常粘膜組織由来 DN A、および正常粘膜組織由来 DNAが大量に存在する条件下での微量の大腸癌組織 由来 DNAを検出することが可能であった。さらに、細菌 DNAの直接検出も本発明によ り可能であることが確認された。
よって、本発明の方法を用いれば、極めて容易かつ確実に各種の生物学的試料、 特に糞便力 の遺伝子診断を行うことができる。他の生物学的試料にはな 、特有の 情報を有する糞便が、非侵襲 DNA材料として、実用的に簡便に利用可能となること は、各種疾患の診断上有用であるば力りではなぐ操作的に多数検体の処理を可能 にする。従って、正常集団を対象とした大腸癌等の各種検診への応用も可能であり、 また集団発症的な感染症などの原因を迅速に検出することも可能となる。本発明の 方法は、近年、益々重要性が高まっている予防医学への貢献、および集団発症を引 き起こす感染症等の迅速な診断への応用が期待できる。

Claims

請求の範囲
[1] 以下の工程を含む、生物学的試料に含有可能性のある遺伝子由来核酸を増幅する ための生物学的試料の処理方法：
(a)溶解用緩衝液で生物学的試料を溶解する工程；
(b)生物学的試料を溶解した試料溶液を展開用担体に含ませる工程；
(c)得られた展開用担体を直接、目的核酸特異的プライマーを含む核酸増幅反応溶 液に接触させる工程。
[2] 前記工程 (a)で得られた試料溶液を 60〜95°Cで 10分〜 10時間加熱する工程を含む
、請求の範囲第 1項に記載の処理方法。
[3] 前記工程 (b)により、生物学的試料を溶解した溶液中の増幅反応阻害物質と目的核 酸を分離する請求の範囲第 1項または第 2項に記載の処理方法。
[4] 前記工程 (c)により得られた核酸増幅反応溶液を、核酸増幅処理する請求の範囲第
1項〜第 3項のいずれか 1項に記載の処理方法を用いた核酸の増幅方法。
[5] 請求の範囲第 4項に記載の増幅方法により得られた核酸増幅産物から、目的遺伝子 を同定する、生物学的試料中に存在する遺伝子の解析方法。
[6] 生物学的試料中に存在する遺伝子が、疾患関連遺伝子もしくは微生物由来遺伝子 である請求の範囲第 5項に記載の遺伝子の解析方法。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2011019505A (ja) * 2009-01-29 2011-02-03 Mukogawa Gakuin 特定遺伝子を検出する方法
JP2012157295A (ja) * 2011-02-01 2012-08-23 Mukogawa Gakuin 遺伝子の増幅方法、特定遺伝子の検出方法

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015019952A1 (ja) * 2013-08-06 2015-02-12 東洋紡株式会社 核酸増幅法
JP7403948B2 (ja) * 2018-10-31 2023-12-25 公益財団法人筑波メディカルセンター 試料の前処理方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4483920A (en) * 1982-05-17 1984-11-20 Hahnemann University Immobilization of message RNA directly from cells onto filter material
JPH08504081A (ja) * 1992-04-01 1996-05-07 ザ ジョーンズ ホプキンズ ユニバーシティー スクール オブ メディシン 糞便試料から単離した哺乳類の核酸を検出する方法、およびその検出用試薬
JP2001221721A (ja) * 2000-02-09 2001-08-17 Sapporo Imuno Diagnostic Laboratory:Kk 乾燥濾紙便による遺伝子診断
JP2002306175A (ja) * 2001-04-11 2002-10-22 Yakult Honsha Co Ltd 核酸の単離方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL8900725A (nl) * 1989-03-23 1990-10-16 Az Univ Amsterdam Werkwijze en combinatie van middelen voor het isoleren van nucleinezuur.
JP2004201607A (ja) * 2002-12-26 2004-07-22 Asahi Kasei Corp 核酸吸着固相体上でのｌａｍｐ反応

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4483920A (en) * 1982-05-17 1984-11-20 Hahnemann University Immobilization of message RNA directly from cells onto filter material
JPH08504081A (ja) * 1992-04-01 1996-05-07 ザ ジョーンズ ホプキンズ ユニバーシティー スクール オブ メディシン 糞便試料から単離した哺乳類の核酸を検出する方法、およびその検出用試薬
JP2001221721A (ja) * 2000-02-09 2001-08-17 Sapporo Imuno Diagnostic Laboratory:Kk 乾燥濾紙便による遺伝子診断
JP2002306175A (ja) * 2001-04-11 2002-10-22 Yakult Honsha Co Ltd 核酸の単離方法

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2011019505A (ja) * 2009-01-29 2011-02-03 Mukogawa Gakuin 特定遺伝子を検出する方法
JP2012157295A (ja) * 2011-02-01 2012-08-23 Mukogawa Gakuin 遺伝子の増幅方法、特定遺伝子の検出方法

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