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WO2006064020A1 - Fractions peptidiques favorisant la croissance et la synthese de produit(s) d'interet en culture de cellules et/ou de tissus - Google Patents

Fractions peptidiques favorisant la croissance et la synthese de produit(s) d'interet en culture de cellules et/ou de tissus Download PDF

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WO2006064020A1
WO2006064020A1 PCT/EP2005/056782 EP2005056782W WO2006064020A1 WO 2006064020 A1 WO2006064020 A1 WO 2006064020A1 EP 2005056782 W EP2005056782 W EP 2005056782W WO 2006064020 A1 WO2006064020 A1 WO 2006064020A1
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WO
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medium
serum
cells
extract
culture
Prior art date
Application number
PCT/EP2005/056782
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English (en)
Inventor
Annie Marc
Jean-Louis Goergen
Bérangère FARGES-HADDANI
Original Assignee
Pierre Fabre Medicament
Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs)
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Filing date
Publication date
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Priority to BRPI0518634-0A priority patent/BRPI0518634A2/pt
Priority to CA002590693A priority patent/CA2590693A1/fr
Priority to AU2005315612A priority patent/AU2005315612A1/en
Publication of WO2006064020A1 publication Critical patent/WO2006064020A1/fr
Priority to IL183711A priority patent/IL183711A0/en
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    • C12N2500/90—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
    • C12N2500/92—Medium free of human- or animal-derived components

Definitions

  • the present invention relates to the field of supplementation of cell or tissue culture media. More particularly, the subject of the present invention is a cell culture medium without serum and / or "protein free" comprising peptide fractions isolated from rapeseeds, in particular rapeseed cake. The invention also relates to a cell culture method comprising these peptide fractions and their use.
  • cell cultures used undefined media such as plasma, serum or embryonic extracts. It was not until the mid-1950s that the first defined culture medium appeared that included, in addition to salts and glucose, various amino acids as well as vitamins that cells could not synthesize.
  • L-glutamine plays an essential role both as a source of energy and as a source of carbon and nitrogen, mainly to allow the synthesis of purine and pyrimidine.
  • a first drawback lies in the fact that glutamine is not stable in the form of free amino acid and will tend to decompose into ammonium ions and pyroglutamic acid.
  • a solution based on the use of cereal hydrolysates has been made to this problem by the patent application WO 96/26266 filed on behalf of QUEST INTERNATIONAL.
  • the cells and tissues, and more particularly the animal cells are cultured in vitro in a nutritional medium, called basal or basal medium, supplemented with 5 to 20% serum, usually fetal calf serum or FCS. (according to the Anglo-Saxon nomenclature "Fetal CaIf Serum").
  • Basal or basal medium supplemented with 5 to 20% serum, usually fetal calf serum or FCS.
  • FCS fetal calf serum
  • FCS fetal calf serum
  • BSE bovine spongiform encephalopathy
  • SFM As for SFM lacking material of animal origin, they are generally derived from protein-rich raw materials such as, for example, cereal raw materials such as rice (WO 98/15614, WO 99/57246) or wheat. By way of example of other raw materials used, mention may also be made of soybean (WO 01/23527, WO 00/03000) or cucumber (WO 99/47648).
  • cereal raw materials such as rice (WO 98/15614, WO 99/57246) or wheat.
  • soybean WO 01/23527, WO 00/03000
  • cucumber WO 99/47648
  • culture media are relatively expensive to obtain and are generally derived from high protein potential raw materials that can be used for other applications such as, for example, food applications. There is therefore a real need to develop culture media completely devoid of animal products and low costs or, at least, from a poorly valued and / or recoverable raw material.
  • the present invention proposes to overcome this lack of the prior art by providing a culture medium devoid of serum and obtained from a vegetable raw material low initial protein content.
  • the present invention relates to the use of a peptide extract for the preparation and / or supplementation of an in vitro culture medium of cells or tissues, without serum, said extract being obtained by successive fractionations of a vegetable raw material, characterized in that said vegetable raw material consists of rapeseed.
  • Hybridomas are monoclonal antibody-producing cells whereas VERO and CHO cells are generally used for the production of recombinant viruses or proteins.
  • this enumeration is in no way limiting and any type of cell may be concerned by the present invention.
  • a first feature of the invention is based on the use of oleaginous and especially rapeseed.
  • this seed is particularly rich in lipids and low in protein.
  • rapeseed for the preparation of culture media because it was accepted that, for this purpose, it was necessary to use preferentially raw materials rich in protein.
  • the present invention relates to the use of an extract as described above, characterized in that said peptide extract provides a function at the level of the increase of the cellular or tissue concentration and / or at the level of the increase in the life of the cells and / or in the specific rate of production of one or more molecules of interest, said function being linked not only by the elemental amino-acid composition but by the composition in peptide form of said amino-acids.
  • This particularly positive effect has been established in comparison with the effect caused by a medium of elementary composition, that is to say consisting of free amino acids, identical in all respects to the composition of the peptide extract which is the object of the invention. except that, in the extract according to the invention, the amino acids are in peptide form. This point will be more clearly established in the light of the examples below.
  • the present invention shows, quite surprisingly, that the peptide extract which is the subject of the invention and obtained by successive fractionations of a raw material derived from rapeseeds provides an invaluable function for the growth and maintenance of cells or tissues in culture. Indeed, as will become more clearly apparent from the examples described below, it has been shown that, for the same amounts in each amino acid, it is necessary that they be in the form of peptides for an increase in concentration. , and more particularly an increase in the life of the cells or tissues and the specific production rate of one or more molecules of interest, is observed. It seems that the invention relies not only on amounts of free amino acids but on a composition of peptides, preferably di- trietetra- or penta-peptides, given.
  • the extract which is the subject of the present invention not only plays a positive role in growth but also plays a role in reducing the induction of apoptosis.
  • the present invention relates to the use of a peptide extract for the preparation and / or supplementation of an in vitro culture medium of cells or tissues, "protein free", said extract being obtained by fractionations.
  • successive vegetable raw material characterized in that said plant raw material consists of rapeseed.
  • the use of the peptide extract as described above is characterized in that said peptide extract provides a function at the level of the increase of the cellular or tissue concentration and / or or at the level of increasing the life of the cells and / or at the specific rate of production of one or more molecules of interest, said function being linked not only by the elemental amino acid composition but by the composition in peptide form of said amino-acids.
  • the invention relates to the use as described above, said use being characterized in that the vegetable raw material consists of rapeseed cake.
  • An advantage of the present invention therefore lies in the low cost of the raw material used. In fact, in all oilseed crops, cakes are the by-products obtained and little valorized to date, from the oil industry.
  • the present invention thus provides a way of recovery and recovery of waste from the oil industry.
  • the peptide extracts are preferably obtained by hydrolysis of rapeseed cake. A fractionation process for obtaining such extracts has been developed.
  • FIG. 1 represents a "flow sheet" type diagram of a preferred method. Of course, any obvious modification for those skilled in the art of this process is part of the present invention.
  • Step 1 Protein Extraction This step aims at producing a rapeseed protein concentrate, in order to have a raw material enriched with rapeseed proteins (70- 80% of protein material compared to the dry matter, against 30-45% in rapeseed cake).
  • Step 2 Hydrolysis
  • the purpose of this step is to hydrolyze the proteins to obtain a solution consisting of peptides.
  • This step aims to eliminate "large” molecules, essentially proteins and large peptides present in the hydrolyzate, which reduces clogging during subsequent filtration steps.
  • Step 4 Ultrafiltration with a 3 kDa cut-off membrane
  • the goal of this step is the recovery of small peptides through elimination molecules of a size greater than 3000 Da (phenolic compounds of the tannin type and polypeptides).
  • the method used is a conventional membrane process for enriching small peptides contained in a hydrolyzate.
  • Step 5 Nanofiltration with a cut-off membrane 500 Da The aim is to reduce the free amino acid level in the solution of small peptides obtained after step 4 and to desalt this same solution in order to decrease
  • Fosmolarity of the mixture It is used a conventional desalting process. A drop
  • Step 6 Ultrafiltration with a 1 kDa cut-off membrane
  • the final retentate corresponding to the peptide extract according to the invention, has a higher content of peptides containing acidic amino acids, and lower in peptides containing basic amino acids.
  • the peptide extract used in the context of the invention is characterized in that it consists of at least 80%, preferably at least 90% by mass of nitrogenous material.
  • nitrogenous material in the present description any material consisting of amino acids, the latter may be in free form or associated peptides or proteins.
  • concentration of nitrogenous matter from a low-protein oilseed, and more particularly rapeseed, is obtained by the method described above. This feature is of great interest in that most excerpts supplementation plants for culture medium have much lower nitrogen content.
  • the extracts derived from cereals described in the patent application in the name of QUEST INTERNATIONAL (WO 96/26266) have contents of nitrogenous matter, respectively 54% for the extracts of soya, 75% for the extracts wheat and 69% for rice extracts.
  • the present invention is thus distinguished from the prior art by the high content of nitrogenous material of the peptide extract used.
  • said nitrogenous material comprises few free amino acids but consists mainly of very small peptides.
  • the use according to the invention is characterized in that said nitrogenous material consists of about 50% to about 60% of peptides having a molecular size of less than 500 Daltons. It is generally accepted that peptides of less than 500 Daltons are mainly in the form of di-, tri- tetra- or penta-peptides. Indeed, the average molar mass of amino acids is about 150 g / mol, with the lowest corresponding to 75.1 g / mol for glycine and the highest to 204.2 g / mol for tryptophan.
  • the use is characterized in that said nitrogenous material consists of about 20% to about 30% of peptides having a molecular size between 500 and 1000 Daltons.
  • the present invention thus relates to the use as described above, characterized in that said extract comprises between 20 and 40 mol% of aspartic acid and glutamic acid and / or their respective amides.
  • the invention is characterized in that said peptide extract comprises less than 1% by weight of phenolic compounds. More particularly, said peptide extract has the following composition in terms of total amino acids: amino acids% molar
  • the use according to the invention is characterized in that said cells consist of eukaryotic cells, preferably animal cells.
  • eukaryotic cells By way of nonlimiting example of preferred eukaryotic cells, mention may be made of cells used in industry, for example CHO, BHK, NSO, PER C6, VERO, HEK293, etc. cells.
  • the present invention is not limited to the use of a peptide extract as described above as a supplementation element, but it also relates to a culture medium without serum.
  • the present invention provides a serum-free cell or tissue culture medium obtained by use of or comprising a peptide extract as described above.
  • the culture media preferably consist of a so-called "basal" medium selected according to the type of desired culture to which are added Sera or supplements of hydrolysates type.
  • the culture medium which is the subject of the present invention differs from the nature of the extract itself. added, namely an extract derived from oilseeds, more particularly from rapeseeds, as described above.
  • IMDM Iscove's Modified Dulbecco's Medium
  • Ham's Ham's
  • NCTC NCTC
  • TC100 TC100
  • Grace ...
  • the extracts according to the invention are used in the form of solutions in which the concentrations of these same peptide extracts may vary according to the type of culture desired.
  • concentrations of these same peptide extracts may vary according to the type of culture desired.
  • culture of CHO type cells according to the English nomenclature "Chinese
  • the preferred concentrations are of the order of 2 to 6 g / l, preferably 4 g / l. As will be apparent from the examples below, a lower concentration is not sufficient and a higher concentration results in inhibition of cell growth or potentially cell apoptosis.
  • the reference medium used is RPMI medium
  • the culture medium according to the invention is characterized in that it comprises, in addition, vitamins, inorganic salts, free amino acids, organic acids and / or sugars.
  • the present invention also covers the use of a culture medium according to the present invention for the mass culture of cells or tissues.
  • a culture medium not only without serum but also "protein free”, that is to say, as explained above, devoid of animal protein.
  • the subject of the present invention is also a cell or tissue culture medium, "protein free”, obtained by use of a, or comprising a peptide extract as described above.
  • the "protein free” culture medium according to the invention may further comprise vitamins, inorganic salts and free amino acids. organic acids and / or sugars.
  • the invention also covers the use of a "protein free” culture medium according to the present invention for the mass culture of cells or tissues.
  • the present invention relates to a method of in vitro culture of cells or tissues.
  • steps of the process mention may be made, as a non-limiting example, i) culture in static mode and on a very small scale (96-well plates), ii) culture in static mode at somewhat larger scales ( culture flasks of 25 cm 2 , 75 cm 2 and 175 cm 2 ) then, iii) culture in agitated mode, at increasing scales (flasks of Erlenmeyer flask, spinners and cytocultors controlled). More particularly, the seeding can be carried out by any conventional technique known to those skilled in the art.
  • the present invention relates to a method of in vitro culture of cells or tissues in a serum-free medium, characterized in that it consists in seeding the said cells or tissues in a medium comprising a peptide extract obtained by successive fractionations of a vegetable raw material, said vegetable raw material consisting of rapeseed.
  • One embodiment consists of implementing the fractionation method described above so as to obtain an extract having the enumerated properties.
  • the process according to the invention is characterized in that said raw material consists of rapeseed cake.
  • the process according to the invention is characterized in that said extract consists of at least 80%, preferably at least 90% by weight of nitrogenous material.
  • the process according to the invention is characterized in that said nitrogenous material consists of about 50% to about 60% of peptides having a molecular size of less than 500 Daltons.
  • the process according to the invention is characterized in that said nitrogenous material consists of about 20% to about 30% of peptides having a molecular size between 500 and 1000 Daltons.
  • said process according to the invention is characterized in that said extract comprises between 20 and 40 mol% of aspartic acid and glutamic acid and / or their respective amides.
  • said extract has the following composition in total amino acids:
  • another aspect of the present invention relates to a method of in vitro culturing of cells or tissues, said method being characterized by the fact that it is in "protein bound" medium.
  • the process for the in vitro culture of cells or tissues in a "protein free” medium characterized in that it consists in seeding the said cells or tissues in a medium comprising a peptide extract obtained by successive fractionations.
  • a vegetable raw material said vegetable raw material consisting of rapeseed.
  • the present method of culture in "protein free” medium is characterized in that said raw material consists of rapeseed cake.
  • the process according to the invention is characterized in that the said extract consists of at least 80%, preferably at least 90% by mass of nitrogenous material. Even more particularly, the process according to the invention is characterized in that said nitrogenous material is comprised of from about 50% to about 60% of peptides having a molecular size of less than 500 Daltons.
  • the process according to the invention is characterized in that said nitrogenous material consists of about 20% to about 30% of peptides having a molecular size of between 500 and 1000 Daltons.
  • the process according to the invention is characterized in that said extract comprises between 20 and 40 mol% of aspartic acid and glutamic acid and / or their respective amides.
  • the process according to the invention is characterized in that said extract has the following composition in total amino acids:
  • the present invention thus relates to a method for directly transferring an in vitro culture in serum medium to a culture in serum-free medium, characterized in that it consists in recovering the cells and / or the tissue from the medium with serum and at (1 ') inoculate directly into serum-free medium as described in this patent application.
  • the present invention relates to a method for adapting an in vitro culture in a medium with serum to a culture in serum-free medium, characterized in that it consists in recovering the cells and / or the tissue medium with serum and (1 ') inoculate stepwise in media with respectively decreasing serum concentrations.
  • the present invention covers an adaptation method as described above, characterized in that said adaptation method comprises the following four steps:
  • Step 1 75% medium with serum / 25% medium without serum + peptide extract
  • Step 2 50% medium with serum / 50% medium without serum + peptide extract
  • Step 3 25% medium with serum / 75% medium without serum + peptide extract
  • Step 4 100% medium without serum + peptide extract.
  • the subject of the invention is a method for directly transferring an in vitro culture in a serum medium to a culture in a "protein free” medium, characterized in that it consists in recovering the cells and / or the tissue of the medium with serum and to (1 ') inoculate directly in a "protein free” medium as described in the present invention.
  • the present invention covers a method for adapting an in vitro culture in serum medium to a medium culture.
  • Protein free characterized in that it consists of recovering the cells and / or the tissue from the medium with serum and to (1 ') inoculate them stepwise in media respectively having decreasing serum concentrations.
  • adaptation method comprises the following four steps:
  • Step 1 75% medium with serum / 25% medium without serum + peptide extract
  • Step 2 50% medium with serum / 50% medium without serum + peptide extract
  • Step 3 25% medium with serum / 75% medium without serum + peptide extract
  • Step 4 100% medium without serum + peptide extract.
  • the subject of the present invention is a method for adapting an in vitro culture in a medium with serum to a culture in a "protein free" medium, characterized in that said method comprises the following steps: Step 1: implement the method which is the subject of the invention
  • Step 2 recover the cells and / or the tissues of the medium without serum
  • Step 3 Inoculate the said cells and / or tissues directly in protein free medium.
  • FIG. 1 represents a flow diagram, otherwise called a "flow sheet" of an embodiment of a method making it possible to obtain the peptide extract in accordance with the invention
  • FIG. 2 represents the effect of a sterilizing filtration on the extract according to the invention
  • FIG. 3 represents, in the form of a histogram, the effect of the concentration of the extract according to the invention on the maximum cell density
  • FIG. 4 illustrates the adaptation of VERO cells from a medium with serum to a medium without serum and to a "protein free" medium comprising the extract according to the invention
  • FIG. 5 illustrates the adaptation of the hybridoma type cells of a medium with serum to a medium without serum comprising the extract according to the invention
  • - Figure 6 illustrates the adaptation of the CHO KI dhfr Cells "a medium with serum to a serum-free medium and a medium” protein free “comprising the extract according to the invention
  • FIGS. 7A and 7B illustrate the adaptation of CHO C5 cells from a serum-free medium to a medium without serum and to a "protein free" medium comprising the extract according to the invention
  • FIG. 8 represents the evolution of the concentration of viable cells during prolonged cultures of CHO C5 cells
  • FIGS. 9, 10 and 11 illustrate the effect of the extract according to the invention on the specific rate of production of interferon by cultured CHO C5 cells.
  • FIG. 12 shows that the function of the extract according to the invention is not related solely to the elementary amino acid composition but to the peptide-form composition of said amino acids.
  • Step 1 Protocol for extracting rapeseed proteins
  • the vegetable proteins used are deoiled industrial flour, residue of the oil industry (Novance, Compiègne, France), containing 35% by weight of nitrogenous material. From this substrate, a protein concentrate is prepared (75% nitrogenous material) by extraction with sodium hydroxide and acid precipitation at the isoelectric pH of the proteins (pH 4).
  • the total protein yield of the concentrate production process from the rapeseed meal is about 28%.
  • composition of the concentrate obtained is as follows (see Table 1):
  • the concentrate is hydrolyzed enzymatically in a stirred stirred reactor (60 ° C) by the action of Alcalase 2.4 L ® (NovoNordisk, Bagsvaerd,
  • step 2 The pH of the hydrolyzate obtained at the end of step 2 is then lowered to 4 in order to precipitate the large molecules and concentrate the peptides in the supernatant.
  • This new step makes it possible to eliminate the large molecules responsible for clogging during the subsequent filtration steps and to concentrate peptides of relatively small size.
  • Step 4 Ultrafiltration with a 3 kDa cut-off membrane
  • the objective of this step is the purification of small peptides by the elimination of molecules of a size greater than 3000 Da (phenolic compounds + polypeptides).
  • the method uses a conventional regenerated cellulose membrane to concentrate peptides with a theoretical molecular weight of less than 3000 g / mol.
  • Step 5 Nanofiltration with a Cutoff Threshold Membrane 500 Da
  • the objective of this step is to reduce the free amino acid content in the solution of small peptides obtained after step 4 and to desalt the same solution in order to reduce the osmolarity of the mixture.
  • Step 6 Ultrafiltration with a 1 kDa cut-off membrane
  • the goal is to split the small peptides according to their size and charge. It is used a conventional regenerated cellulose membrane in order to fractionate according to their size but also according to their load, depending on the conditions of implementation of the membrane, the peptides recovered after step 5, the molar masses of which must theoretically be between 500 and 3000 g / mol. Execution of this step leads to two fractions:
  • a permeate essentially containing peptides with a molar mass theoretically less than 1000 g / mol; a retentate which, relative to the permeate, has, on the one hand, a higher content of peptides containing acidic amino acids, and, on the other hand, a lower content of peptides containing basic amino acids.
  • the peptide extract which is the subject of the present invention consists of the retentate obtained by carrying out the process as described above. Obviously, changes can be made. By way of nonlimiting example, it may be envisaged to adjust the pH to 4 during steps 5 and 6, instead of 9 or to delete step 5.
  • Multi-Dosimat Automatic Titration System Metrohm, Herisau, Switzerland - Kjeldatherm ® KT 12 S Mineralization Bench: Gerhardt GmbH & Co. KG, Bonn, Germany
  • the protein content was determined by the Kjeldahl method. This assay method is based on the transformation of organic nitrogen into inorganic nitrogen in the form of ammonium sulphate (NH 4 ) 2SO 4 . Dosage is performed automatically with the Vapodest 4S. For each sample, the analysis is performed twice so that an average value can be calculated. It is also necessary to perform a blank determination to obtain, after subtraction, a value of the total nitrogen actually contained in the sample.
  • V 0 volume of H2SO 4 necessary for the titration of the blank in ml
  • N titre of the solution of H 2 SO 4 (mol / l)
  • 3-mercaptopropionic acid (3-MPA): Sigma, M-6750 - 10 mg of each of the compounds (OPA and 3-MPA) in 1 ml of 0.4 N borate buffer and pH 10.5: Hewlett-Packard, 5061-3339
  • Solvent A 20 mM sodium acetate, 3 H 2 O (OSI, 27652.298), 0.024% (v / v) triethylamine (OSI, 28745.296) and 0.5% (v / v) tetrahydrofuran ( OSI, 28,556,293). The mixture is adjusted to pH 7.2 with acetic acid (OSI, 104, 298).
  • Solvent B 20% (v / v) of a 100 mM sodium acetate buffer (OSI, 27,652,298) adjusted to pH 7.2 with acetic acid, 40% (v / v) of acetonitrile and 40% (v / v) methanol (Prolabo, 20,865,322). • Material
  • Acid hydrolysis of the peptide fractions is carried out beforehand to obtain a homogeneous mixture of free amino acids.
  • a sample of 1 g or 1 ml is placed in a test tube with stopper.
  • 4 ml of hydrochloric acid (6 N) are added and the test tube is placed under a nitrogen atmosphere before being sealed.
  • the hydrolysis is then carried out in an oven at 110 ° C. for 24 hours.
  • the hydrolysates are neutralized to a pH of about 6 by adding 4N sodium hydroxide.
  • the samples are finally filtered on a 0.22 micron syringe filter.
  • amino acids as well as the alanyl-glutamine and glycylglutamine dipeptides are assayed by reverse phase liquid chromatography after derivatization in the presence of o-phtahaldhyde (OPA) and 9-fluorenyl-methyl chloroformate (FMOC).
  • OPA o-phtahaldhyde
  • FMOC 9-fluorenyl-methyl chloroformate
  • the derivation principle is as follows: the primary amino acids are placed in the presence of OPA and 3-mercapto-propionic acid (3-MPA), to give highly fluorescent and absorptive isoindoles in the UV domain (338 nm (Godel et al., 1992, Automated amino acid analysis using combined OPA and FMOC-Cl precolumn derivatization, LC-GC ES [TL, 5, 44-49).
  • the secondary amino acids are derived in the presence of FMOC, to give highly fluorescent and absorbent derivatives in the UV range (262 nm).
  • the detection threshold is of the order of 100 pmoles.
  • Samples are automatically derived using an HP 1090 system
  • Hewlett Packard Liquid Chromatograph 3 ⁇ l of sample are first neutralized with 1.5 ⁇ l of 2 N NaOH to obtain a total derivation. Then, the whole is mixed with 6.0 ⁇ l of 0.4 N borate buffer, 2.5 ⁇ l of the OPA + 3-MPA solution and 2.5 ⁇ l of the FMOC solution. The mixture lasts 15 minutes to allow the bypass; finally, the whole is injected at the level of the separation column Hypersil Cl 8.
  • the elution solvent is composed of 100% of solution A, for 17 minutes, then 40% of solution A and 60% of solution B for 1 mn and finally 100% of solution B, for 7 minutes.
  • Amino acids are separated according to their polarity; the more polar ones come out at the beginning of the analysis and the less polar at the end of the analysis.
  • the primary amino acids and dipeptides are detected by a UV detector at 338 nm, and the secondary amino acids are detected by a UV detector at 262 nm.
  • the total duration of the analysis is 25 minutes.
  • the determination of the free amino acid level is carried out according to the same protocol, except for the absence of an acid hydrolysis step.
  • three solutions, containing 17 amino acids at concentrations of 0.25, 0.5 and 2.5 mM respectively, are derived and injected without prior neutralization with 2N NaOH. standard range for each amino acid, which then makes it possible to determine the concentration of each amino acid contained in a sample after integration of the peaks (Hewlett Packard system).
  • Moisture determination was made by taking the samples (1-5 g) at 105 ° C in an oven until a constant mass was obtained.
  • Minisart RC 25 Sartorius, Goettingen, Germany - Vacuum filtration device, glass frit SM 16309: Sartorius, Goettingen, Germany
  • the operating conditions are as follows:
  • the column was previously calibrated with peptides of known molar masses. Two lines were obtained by plotting logarithmic molar mass versus retention time. Determining the relationship between molar mass
  • (MM) molecules at their retention time on the column allowed to define the distribution according to the size of the peptides contained in the different fractions.
  • the amount of phenolic compounds in the fractions was estimated as sinapic acid equivalent.
  • Sinapic acid (Sigma, D 7927), with a molar mass of 224 g / mol, was used as a reference because it is the phenolic acid predominantly present in rapeseed meal (between 70 and 90%) according to Naczk M. et al., 1992, Recovery of rapeseed tannins by various solvent Systems, Food Chem., 45, 51-54.
  • Calibration and measurements were performed using the same chromatographic conditions as those used in HPLC-ET, except for the detection wavelength fixed in this case at 310 nm, which corresponds to the wavelength maximum absorption of this acid (Sakakibara H.
  • Asx aspartic acid + asparagine GIx: glutamic acid + glutamine
  • Culture of CHO C5 cells was made in medium of reference (o) or in medium of interest ( ⁇ ) sterilized once (empty symbols) or 3 times (solid symbols) by sterilizing filtration 0.22 ⁇ m.
  • the culture system used consists of static culture flasks Table 5
  • VERO cells adhered cells
  • the basic medium used is the ⁇ MEM.
  • the adaptation made is a brutal adaptation. The results obtained are shown in FIG.
  • the successive passages of VERO cells represent the adaptation in the presence of extract according to the invention.
  • the curve (o) represents the adaptation of the cells in the absence of extract. From 0 to 7, the FCS is decreased by 10 to 1%. At day 17, the FCS is abruptly removed and replaced by the mixture (peptide extract according to the invention, BITS, ET, Q). At J36, the BITS are deleted. The results obtained show that in the absence of peptide extract according to the invention, adaptation is impossible (death of the cells in 2 passages). In the presence of said extract and BITS, the adaptation of the cells is rapid (recovery of growth at 3 ⁇ 6 passage). In the presence of this same extract and in the absence of animal protein (protein free medium), the adaptation is a little more difficult but remains possible.
  • the basic medium used is RPMI. BRUTAL ADAPTATION
  • the base medium used is ⁇ MEM + ribo- and deoxyribonucleosides.
  • FIG. 8 The evolution of the concentration of viable cells during CHO C5 cell cultures carried out, without prior adaptation, is shown in FIG. 8. More particularly, this figure illustrates the cultures in reference medium (o), in reference medium. without BITS (-), in medium of interest ( ⁇ ) and in medium of interest without BITS (x). It is clear from the results obtained that the reference medium no longer allows the cells to grow when animal proteins are removed. The medium of interest practically doubles the maximum concentration. In addition, the duration The culture (before virtually complete disappearance of viable cells) is multiplied by 3. The medium of interest allows growth when the animal proteins are removed. In the absence of animal proteins, and in the presence of peptide extract, the maximum concentration of cells is not improved but the longevity of the culture is increased by a factor of 2 relative to the reference medium.
  • FIG. 9 represents the kinetics of growth of CHO C5 cells in reference medium (o) and in medium of interest ( ⁇ ).
  • FIG. 10 represents, for its part, the kinetics of production of IFN (interferon gamma) by the same CHO C5 cells in reference medium (o) and in medium of interest ( ⁇ ).
  • FIG. 11 illustrates the specific rate of interferon production by CHO C5 cells in reference medium (dotted lines) and in medium of interest (solid).
  • FIG. 12 represents the kinetics of viable cells CHO C5 grown in spinners, in the reference medium (o), the reference medium supplemented with free amino acids (x) and the medium of interest ( ⁇ ).
  • the free amino acids correspond to the total amino acids present in the peptide extract (peptides and free).
  • the addition of amino acids in the same proportion as those present in the peptide extract, in the form of peptides, does not make it possible to increase the concentration of viable cells.
  • the composition of individualized amino acids equivalent to that of the peptide mixture of the peptide extract used, promotes the maintenance of cells (* 3 relative to the reference medium).
  • the peptide extract improves the quantity, by a doubling of the viable cell population, but also the viability of the cells (50% more time relative to the reference medium + free amino acids, by locating at the maximum cell concentration obtained in that case). These results do not seem to be solely induced by an effect related solely to the overall composition of amino acids. They can also be caused by a "growth factor" effect resulting from the presence of certain peptides, with the particular composition, in the peptide extract according to the invention.

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Abstract

La présente invention concerne le domaine de la préparation et/ou supplémentation de milieux de culture de cellules ou de tissus. Plus particulièrement, la présente invention a pour objet un milieu de culture cellulaire sans sérum et/ou « protein free » comprenant des fractions peptidiques isolées à partir de graines de colza, notamment de tourteaux de colza. L'invention concerne également un procédé de culture cellulaire comprenant ces fractions peptidiques ainsi que leur utilisation.

Description

FRACTIONS PEPTIDIQUES FAVORISANT LA CROISSANCE ET LA SYNTHESE DE PRODUIT(S) D'INTERET EN CULTURE DE CELLULES ET/OU DE TISSUS
La présente invention concerne le domaine de la supplémentation de milieux de culture de cellules ou de tissus. Plus particulièrement, la présente invention a pour objet un milieu de culture cellulaire sans sérum et/ou « protein free » comprenant des fractions peptidiques isolées à partir de graines de colza, notamment de tourteaux de colza. L'invention concerne également un procédé de culture cellulaire comprenant ces fractions peptidiques ainsi que leur utilisation.
Depuis la connaissance de l'existence des cellules vivantes, les types et techniques de culture cellulaire n'ont cessé d'augmenter et de se diversifier.
Initialement, les cultures de cellules utilisaient des milieux non définis comme du plasma, du sérum ou encore des extraits embryonnaires. Il a fallu attendre le milieu des années 1950 pour voir apparaître le premier milieu de culture défini qui comprenait, en plus de sels et de glucose, divers acides aminés ainsi que les vitamines que les cellules ne pouvaient synthétiser.
Plus récemment, il a été montré que parmi tous les acides aminés apportés, la
L-glutamine joue un rôle essentiel à la fois comme source d'énergie et comme source de carbone et d'azote, principalement pour permettre la synthèse de purine et de pyrimidine. Cependant, un premier inconvénient réside dans le fait que la glutamine n'est pas stable sous la forme d'acide aminé libre et va avoir tendance à se décomposer en ions ammonium et en acide pyroglutamique. Une solution, basée sur l'utilisation d'hydrolysats de céréales, a été apportée à ce problème par la demande de brevet WO 96/26266 déposée au nom de QUEST INTERNATIONAL.
De manière générale, les cellules et tissus, et plus particulièrement les cellules animales, sont cultivés in vitro dans un milieu nutritionnel, appelé milieu de base ou basai, supplémenté avec de 5 à 20 % de sérum, généralement du sérum de veau fœtal ou FCS (d'après la nomenclature anglo-saxonne « Foetal CaIf Sérum »). Cependant l'utilisation de tels Sera présente d'autres inconvénients comme i) l'introduction de protéines animales nécessitant par la suite leur élimination, ii) l'introduction potentielle de contaminants comme des champignons, des bactéries, des virus, des prions et iii) une qualité variable et des coûts élevés.
De plus, afin de limiter plus particulièrement les risques d'encéphalopathie spongiforme bovine (ESB) dans les produits pharmaceutiques, les législations tant nationales qu'internationales prévoient l'interdiction d'utiliser des produits d'origine animale dans un futur proche.
Parmi ces inconvénients, le risque d'introduction de contaminants reste le plus problématique et a poussé à l'utilisation de milieu sans sérum ou SFM (d'après la nomenclature anglaise « Sérum Free Médium »). Néanmoins, certains SFM utilisés aujourd'hui comprennent encore des peptones et des hydrolysats issus d'animaux et donc n'apportent pas entière satisfaction quant aux risques de contaminations définis plus haut.
Quant aux SFM dépourvus de matériel d'origine animale, ils sont généralement issus de matières premières riches en protéines telles que, par exemple, les matières premières céréalières comme le riz (WO 98/15614 ; WO 99/57246) ou le blé. A titre d'exemple d'autres matières premières utilisées, on peut également citer le soja (WO 01/23527 ; WO 00/03000), ou encore le concombre (WO 99/47648). Cependant, de tels milieux de culture sont relativement onéreux à obtenir et sont généralement issus de matières premières à fort potentiel protéique pouvant être utilisées pour d'autres applications comme, par exemple, des applications alimentaires. Il existe donc un réel besoin de développer des milieux de culture complètement dépourvus de produits issus d'animaux et de faibles coûts ou, à tout le moins, issus d'une matière première faiblement valorisée et/ou valorisable.
La présente invention se propose de pallier ce manque de l'art antérieur en proposant un milieu de culture dépourvu de sérum et obtenu à partir d'une matière première végétale à faible teneur protéique initiale.
Plus particulièrement, la présente invention concerne l'utilisation d'un extrait peptidique pour la préparation et/ou la supplémentation d'un milieu de culture in vitro de cellules ou de tissus, sans sérum, ledit extrait étant obtenu par fractionnements successifs d'une matière première végétale, caractérisée en ce que ladite matière première végétale consiste en la graine de colza.
Par milieu sans sérum, il faut comprendre un milieu dépourvu de sérum d'origine animale tel que le FCS, le FBS (d'après la nomenclature anglo-saxonne « Foetal Bovine Sérum ») ou tout sérum analogue.
Aujourd'hui, la plupart des produits issus de la culture cellulaire sont les anticorps monoclonaux, les virus et les protéines recombinantes. D'un point de vue industriel, les cellules les plus cultivées aujourd'hui, outre des cellules de tissus ou de remplacement des modèles animaux en toxicologie sont les hybridomes, les cellules VERO (African green monkey kidney cells), BHK (d'après la nomenclature anglo- saxonne « Baby Hamster Kidney »), CHO (d'après la nomenclature anglo-saxonne « Chinese Hamster Ovary »), NSO, ou encore Spodoptera frugiperda (Sf9) infectées par un baculovirus. Les hybridomes sont des cellules productrices d'anticorps monoclonaux alors que les cellules VERO et CHO sont généralement utilisées pour la production de virus ou bien de protéines recombinantes. Bien entendu cette énumération n'est aucunement limitative et tout type de cellules peut être concerné par la présente invention.
On peut également citer, à titre d'exemples non limitatifs, les tissus suivants : cartilage, cellules musculaires, peau, cellules osseuses, tendons, cellules embryonnaires, organes artificiels.
Une première caractéristique de l'invention repose sur l'utilisation même d'oléagineux et, tout particulièrement, de la graine de colza. En effet, contrairement aux céréales ou autres matières premières utilisées à ce jour, cette graine est particulièrement riche en lipides et pauvre en protéines. Pour ces raisons, l'homme de l'art n'a pas, jusqu'à ce jour, cherché à utiliser la graine de colza pour la préparation de milieux de culture car il était admis que, dans ce but, il fallait utiliser préférentiellement des matières premières riches en protéines.
De manière tout à fait surprenante, et contrairement aux préjugés de l'art antérieur, il a été mis en évidence qu'il était possible d'utiliser la graine de colza pour la réalisation de milieux de culture sans sérum et/ou « protein free ». De manière encore plus surprenante, il a également été mis en évidence que de tels milieux comprenant des extraits peptidiques issus de colza permettaient non seulement d'obtenir une augmentation significative de la concentration finale des cellules ou tissus mis en culture mais également une augmentation de la vitesse spécifique de production d'une ou plusieurs molécules d'intérêt par des cellules en culture.
En outre, il a été également mis en évidence le fait qu'une telle augmentation de la concentration finale des cellules ou tissus n'est pas liée uniquement à un effet nutritionnel.
Selon un aspect préféré, la présente invention concerne l'utilisation d'un extrait tel que décrit plus haut, caractérisée en ce que ledit extrait peptidique assure une fonction au niveau de l'augmentation de la concentration cellulaire ou tissulaire et/ou au niveau de l'augmentation de la durée de vie des cellules et/ou au niveau de la vitesse spécifique de production d'une ou plusieurs molécules d'intérêt, ladite fonction étant liée non pas uniquement par la composition élémentaire en acides-aminés mais par la composition sous forme peptidique desdits acides-aminés. Cet effet particulièrement positif a été établi en comparaison de l'effet provoqué par un milieu de composition élémentaire, c'est-à-dire constitué d'acides aminés libres, en tout point identique à la composition de l'extrait peptidique objet de l'invention mis à part le fait que, dans l'extrait selon l'invention, les acides aminés sont sous forme peptidique. Ce point sera plus clairement établi à la lumière des exemples ci- après.
De manière générale, il ressort de l'art antérieur que les milieux de culture utilisés à ce jour ont été réalisés dans le but d'apporter aux cellules ou tissus les nutriments, et surtout les acides aminés, nécessaires comme source d'énergie et comme source de carbone et d'azote à la cellule. Ces acides aminés sont généralement présents dans les milieux de culture sous forme principalement d'acides aminés libres. Certains acides aminés sont présents sous forme de di- ou tri-peptides afin de leur assurer une stabilité suffisante dans un milieu liquide (WO 96/26266).
La présente invention montre, de manière tout à fait surprenante, que l'extrait peptidique objet de l'invention et obtenu par fractionnements successifs d'une matière première issue de graines de colza assure une fonction iàvorable à la croissance et au maintien en vie des cellules ou tissus en culture. En effet, comme il ressortira plus clairement des exemples décrits ci-après, il a été montré que, pour des mêmes quantités en chaque acide aminé, il est nécessaire que ceux-ci soient sous forme de peptides pour qu'une augmentation de la concentration, et plus particulièrement une augmentation de la durée de vie des cellules ou tissus et de la vitesse spécifique de production d'une ou plusieurs molécules d'intérêt, soit observée. Il semble que l'invention repose non pas uniquement sur des quantités en acides aminés libres mais bien sur une composition en peptides, préférentiellement di- tri- tetra- ou penta-peptides, donnée.
Sans vouloir être lié par une quelconque théorie, il semble probable que l'extrait objet de la présente invention joue non pas uniquement un rôle positif sur la croissance mais tient également un rôle au niveau de la réduction de l'induction de l'apoptose.
Selon un autre aspect, la présente invention concerne l'utilisation d'un extrait peptidique pour la préparation et/ou la supplémentation d'un milieu de culture in vitro de cellules ou de tissus, « protein free », ledit extrait étant obtenu par fractionnements successifs d'une matière première végétale, caractérisée en ce que ladite matière première végétale consiste en la graine de colza.
De manière similaire au milieu sans sérum décrit plus haut, l'utilisation de l'extrait peptidique tel que décrit ci-dessus est caractérisée en ce que ledit extrait peptidique assure une fonction au niveau de l'augmentation de la concentration cellulaire ou tissulaire et/ou au niveau de l'augmentation de la durée de vie des cellules et/ou au niveau de la vitesse spécifique de production d'une ou plusieurs molécules d'intérêt, ladite fonction étant liée non pas uniquement par la composition élémentaire en acides-aminés mais par la composition sous forme peptidique desdits acides-aminés.
Par l'expression « protein free », il faut non pas comprendre un milieu totalement dépourvu de protéines mais un milieu totalement dépourvu de protéine d'origine animale. Cette expression englobe, entre autre, les dénominations ADCF
(d'après la nomenclature anglo-saxonne « Animal Derived Component Free ») ou encore « animal protein free ».
En effet, la présence de protéines est généralement nécessaire à la croissance de cellules ou de tissus. Le point important, comme mentionné plus haut, réside en l'absence de protéine d'origine animale. Un tel milieu de culture permet d'éliminer encore plus radicalement que les milieux sans sérum tout risque de contamination par une molécule, ou partie d'une telle molécule, qui serait d'origine animale.
Selon une forme d'exécution préférée, l'invention vise l'utilisation telle que décrite plus haut, ladite utilisation étant caractérisée en ce que la matière première végétale consiste en du tourteau de colza.
Par tourteau, il faut comprendre le résidu solide obtenu lors du traitement des grains et des fruits oléagineux en vue de l'extraction d'huile (Définition du Petit Larousse Illustré, 1989, page 975). Un avantage de la présente invention réside donc dans le faible coût de la matière première utilisée. En effet, les tourteaux constituent, dans toutes les cultures oléagineuses, les co-produits obtenus et faiblement valorisés à ce jour, de l'industrie huilière. La présente invention apporte donc une voie de récupération et de valorisation des déchets de l'industrie huilière.
Les extraits peptidiques, objet de la présente invention, sont, de manière préférée, obtenus par hydrolyse de tourteaux de colza. Un procédé de fractionnement permettant d'obtenir de tels extraits a été développé. La figure 1 représente un diagramme de type « flow sheet » d'un procédé préféré. Bien entendu, toute modification évidente pour l'homme de l'art de ce procédé fait partie de la présente invention.
Plus particulièrement, ce procédé comprend six étapes successives correspondant respectivement à : Etape 1 : Extraction des protéines Cette étape a pour objectif la production d'un concentrât de protéines de colza, afin d'avoir une matière première enrichie en protéines de colza (70-80 % de matière protéique par rapport à la matière sèche, contre 30-45 % dans le tourteau de colza). Etape 2 : Hydrolyse
Le but de cette étape est d'hydrolyser les protéines afin d'obtenir une solution constituée de peptides.
Ici également, le procédé utilisé est classique. L'utilisation de l'Alcalase® qui est une préparation enzymatique d'origine microbienne, est par conséquent sans risque de transmission d'éléments biologiques d'origine animale (virus pathogènes à rencontre de cellules animales, prions, ...). Durée d'hydrolyse : 5 heures, T° = 60°C, pH = 9, rapport concentration enzyme/concentration substrat = 1/10. Contenu de l'hydrolysat en acides aminés libres : 4 % massiques. Etape 3 : Précipitation acide pH 4
Cette étape vise l'élimination des « grosses » molécules, essentiellement protéines et peptides de grande taille, présentes dans l'hydrolysat, ce qui permet de diminuer le colmatage lors des étapes de filtration ultérieures.
Etape 4 : Ultrafiltration avec une membrane de seuil de coupure 3 kDa
L'objectif de cette étape est la récupération des petits peptides par l'élimination des molécules d'une taille supérieure à 3000 Da (composés phénoliques de type tannins et polypeptides). Le procédé utilisé est un procédé membranaire classique pour enrichir en peptides de petite taille contenus dans un hydrolysat.
Etape 5 : Nanofiltration avec une membrane de seuil de coupure 500 Da Le but est de diminuer le taux d'acides aminés libres dans la solution de petits peptides obtenue après l'étape 4 et dessaler cette même solution afin de diminuer
Fosmolarité du mélange. Il est utilisé un procédé de dessalage classique. Une baisse de
80 % de la concentration en sels permet un meilleur fractionnement des peptides selon leur charge dans l'étape 5. Etape 6 : Ultrafiltration avec une membrane de seuil de coupure 1 kDa
II s'agit ici de fractionner les petits peptides selon leur taille et leur charge. Cette étape présente un intérêt particulier en ce sens qu'elle est basée sur l'utilisation d'une membrane d'ultrafiltration dans le but de fractionner, selon leur taille et leur charge, les peptides contenus dans un hydrolysat végétal. Par rapport au perméat, le rétentat final, correspondant à l'extrait peptidique selon l'invention, a une teneur plus élevée en peptides contenant des acides aminés acides, et plus faible en peptides contenant des acides aminés basiques.
Il faut noter que le procédé décrit ci-dessus n'est donné qu'à titre d'illustration d'une forme de réalisation mais n'est aucunement limitatif. Toute modification ou amélioration de ce dernier doit être considérée comme faisant partie de la présente invention.
Afin de mieux caractériser les extraits peptidiques, objet de la présente invention, plusieurs études et dosages ont été réalisés dont les protocoles et résultats détaillés sont présentés plus loin dans les exemples. Néanmoins, il ressort que l'extrait peptidique utilisé dans le cadre de l'invention se caractérise en ce qu'il est constitué d'au moins 80 %, préférentiellement au moins 90 %, en masse de matière azotée.
Par l'expression « matière azotée », on entend désigner dans la présente description toute matière constituée d'acides aminés, ces derniers pouvant être sous forme libres ou bien associés en peptides ou protéines. Une telle concentration en matière azotée, à partir d'un oléagineux à faible teneur protéique, et plus particulièrement du colza, est obtenue grâce au procédé décrit plus haut. Cette caractéristique est de grand intérêt en ce sens que la plupart des extraits végétaux de supplémentation pour milieu de culture ont des teneurs en matière azotée beaucoup plus faibles. A titre d'exemple, les extraits issus de céréales décrits dans la demande de brevet au nom de QUEST INTERNATIONAL (WO 96/26266) présentent des teneurs en matière azotée, respectivement de 54 % pour les extraits de soja, 75 % pour les extraits de blé et 69 % pour les extraits de riz.
La présente invention se distingue donc de l'art antérieur de par la teneur élevée en matière azotée de l'extrait peptidique utilisé.
En outre, il a également été mis en évidence par les inventeurs que ladite matière azotée comprend peu d'acides aminés libres mais est principalement constituée de très petits peptides. Pour les protocoles et résultats, se reporter aux exemples plus loin.
Plus particulièrement, l'utilisation selon l'invention est caractérisée en ce que ladite matière azotée est constituée d'environ 50 % à environ 60 % de peptides présentant une taille moléculaire inférieure à 500 Daltons. II est généralement admis que des peptides de moins de 500 Daltons sont sous forme principalement de di-, tri- tetra- ou penta-peptides. En effet, la masse molaire moyenne des acides aminés est d'environ 150 g/mol, avec la plus faible correspondant à 75,1 g/mol pour la glycine et la plus élevée à 204,2 g/mol pour le tryptophane.
Selon encore un aspect de l'invention, l'utilisation est caractérisée en ce que ladite matière azotée est constituée d'environ 20 % à environ 30 % de peptides présentant une taille moléculaire comprise entre 500 et 1000 Daltons.
Toujours dans un souci de caractérisation de l'extrait peptidique objet de la présente invention, il a été mis en évidence que celui-ci présente une teneur élevée en acides aminés acides. Plus particulièrement, la présente invention concerne donc l'utilisation telle que décrite plus haut, caractérisée en ce que ledit extrait comprend entre 20 et 40 % molaire d'acide aspartique et d'acide glutamique et/ou de leurs amides respectifs.
Enfin, l'invention se caractérise en ce que ledit extrait peptidique comprend moins de 1 % en masse de composés phénoliques. Plus particulièrement, ledit extrait peptidique présente la composition suivante en acides aminés totaux : acides aminés % molaire
Alanine 2 - 6
Arginine 5 - 9
Acide aspartique + Asparagine 10 - 14
Cystéine 0
Acide Glutamique + Glutamine 15 - 19
Glycine 7 - 11
Histidine 1 - 5
Isoleucine 2 - 6
Leucine 5 - 9
Lysine 2 - 6
Méthionine 0 - 3
Phénylalanine 1 - 5
Proline 3 - 7
Serine 5 - 9
Thréonine 5 - 9
Tryptophane Non déterminé
Tyrosine 1 - 5
Valine 5 - 9
Les pourcentages indiqués dans le tableau ci-dessus consistent en des moyennes dont les modes de mesure sont clairement détaillés dans les exemples. Diverses concentrations préférées seront également illustrées dans les mêmes exemples. Selon une forme d'exécution préférée, l'utilisation selon l'invention est caractérisée en ce que lesdites cellules consistent en des cellules eucaryotes, préférentiellement des cellules animales.
A titre d'exemple non limitatif de cellules eucaryotes préférées, on peut citer les cellules utilisées dans l'industrie comme, par exemple, les cellules CHO, BHK, NSO, PER C6, VERO, HEK293, etc.
Selon un autre aspect, la présente invention ne se limite pas à l'utilisation d'un extrait peptidique tel que décrit plus haut comme élément de supplémentation, mais elle concerne également un milieu de culture sans sérum.
Plus particulièrement, la présente invention vise un milieu de culture de cellules ou de tissus, sans sérum, obtenu par utilisation d'un, ou comprenant un extrait peptidique tel que décrit plus haut.
Comme mentionné plus haut, les milieux de culture sont préférentiellement constitués d'un milieu dit « basai » sélectionné selon le type de culture souhaitée auquel sont additionnés des Sera ou bien des suppléments de type hydrolysats. Le milieu de culture objet de la présente invention se différencie de par la nature même de l'extrait ajouté, à savoir un extrait issu d'oléagineux, plus particulièrement de graines de colza, tel que décrit plus haut.
Les milieux dits « de base » utilisés dépendent donc de la nature de la culture souhaitée. A titre d'exemples non limitatifs, on peut citer les milieux suivants : RPMI (Roswell Park Mémorial Institute), MEM (Minimum Essential Médium), Iscove's,
IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's médium), Ham's, NCTC, TC100, Grâce, ...
Dans la pratique, les extraits selon l'invention sont utilisés sous forme de solutions dans lesquelles les concentrations en ces mêmes extraits peptidiques peuvent varier selon le type de culture souhaitée. A titre d'exemple non limitatif, dans le cas de culture de cellules de type CHO (d'après la nomenclature anglo-saxonne « Chinese
Hamster Ovary ») les concentrations préférées sont de l'ordre de 2 à 6 g/1, préférentiellement 4 g/1. Comme il ressortira des exemples ci-après, une concentration plus faible n'est pas suffisante et une concentration plus élevée entraîne une inhibition de la croissance cellulaire ou potentiellement l'apoptose des cellules. Pour les exemples ci-après, le milieu de référence utilisé est le milieu RPMI
1640 (SIGMA - ALDRICH).
Selon un mode d'exécution, le milieu de culture selon l'invention est caractérisé en ce qu'il comprend, en outre, des vitamines, des sels inorganiques, des acides aminés libres, des acides organiques et/ou des sucres. La présente invention couvre également l'utilisation d'un milieu de culture selon la présente invention pour la culture en masse de cellules ou de tissus.
Selon un autre aspect de la présente invention, il est également couvert un milieu de culture non seulement sans sérum mais également « protein free », c'est-à- dire, comme explicité plus haut, dépourvu de protéines animales. La présente invention a également pour objet un milieu de culture de cellules ou de tissus, « protein free », obtenu par utilisation d'un, ou comprenant un extrait peptidique tel que décrit ci-avant.
De manière similaire à ce qui a été décrit plus haut pour les milieux sans sérum, selon un mode de réalisation le milieu de culture « protein free » selon l'invention, peut comprendre en outre des vitamines, des sels inorganiques, des acides aminés libres, des acides organiques et/ou des sucres. L'invention couvre également l'utilisation d'un milieu de culture « protein free » selon la présente invention pour la culture en masse de cellules ou de tissus.
Selon une autre forme d'exécution, la présente invention concerne un procédé de culture in vitro de cellules ou de tissus. Pour ce qui est des étapes mêmes du procédé, on peut citer, comme exemple non limitatif, i) culture en mode statique et à très petite échelle (plaques 96 puits), ii) culture en mode statique à des échelles un peu plus importantes (flacons de culture de 25 cm2, 75 cm2 et 175 cm2) puis, iii) culture en mode agité, à des échelles croissantes (fioles d'Erlenmeyer, spinners et cytoculteurs contrôlés). Plus particulièrement, l'ensemencement peut être réalisé par toute technique classique connue de l'homme de l'art.
Plus particulièrement, la présente invention vise un procédé de culture in vitro de cellules ou de tissus dans un milieu dépourvu de sérum, caractérisé en ce qu'il consiste à ensemencer lesdit(e)s cellules ou tissus dans un milieu comprenant un extrait peptidique obtenu par fractionnements successifs d'une matière première végétale, ladite matière première végétale consistant en la graine de colza.
Une forme de réalisation consiste à mettre en œuvre le procédé de fractionnement décrit plus haut de manière à obtenir un extrait présentant les propriétés énumérées.
Plus particulièrement, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que ladite matière première consiste en du tourteau de colza.
Encore plus particulièrement, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que ledit extrait est constitué d'au moins 80 %, préférentiellement au moins 90 %, en masse de matière azotée.
Plus particulièrement, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que ladite matière azotée est constituée d'environ 50 % à environ 60 % de peptides présentant une taille moléculaire inférieure à 500 Daltons.
Encore plus particulièrement, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que ladite matière azotée est constituée d'environ 20 % à environ 30 % de peptides présentant une taille moléculaire comprise entre 500 et 1000 Daltons. De manière préférée, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que ledit extrait comprend entre 20 et 40 % molaire d'acide aspartique et d'acide glutamique et/ou de leurs amides respectifs. Enfin, de manière encore plus préférée, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que ledit extrait présente la composition suivante en acides aminés totaux :
acides aminés % molaire
Alanine 2 - 6
Arginine 5 - 9
Acide aspartique + Asparagine 10 - 14
Cystéine 0
Acide Glutamique + Glutamine 15 - 19
Glycine 7 - 11
Histidine 1 - 5
Isoleucine 2 - 6
Leucine 5 - 9
Lysine 2 - 6
Méthionine 0 - 3
Phénylalanine 1 - 5
Proline 3 - 7
Serine 5 - 9
Thréonine 5 - 9
Tryptophane Non déterminé
Tyrosine 1 - 5
Valine 5 - 9
De manière similaire aux milieux de culture tels que décrits plus haut, un autre aspect de la présente invention concerne un procédé de culture in vitro de cellules ou tissus, ledit procédé étant caractérisé par le fait qu'il est en milieu « protein fiée ».
Plus particulièrement, le procédé de culture in vitro de cellules ou de tissus dans un milieu « protein free », caractérisé en ce qu'il consiste à ensemencer lesdit(e)s cellules ou tissus dans un milieu comprenant un extrait peptidique obtenu par fractionnements successifs d'une matière première végétale, ladite matière première végétale consistant en la graine de colza.
De manière similaire au procédé de culture en milieu sans sérum, le présent procédé de culture en milieu « protein free » se caractérise en ce que ladite matière première consiste en du tourteau de colza.
Plus particulièrement, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que ledit extrait est constitué d'au moins 80 %, préférentiellement au moins 90 %, en masse de matière azotée. Encore plus particulièrement, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que ladite matière azotée est constituée d'environ 50 % à environ 60 % de peptides présentant une taille moléculaire inférieure à 500 Daltons.
De manière préférée, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que ladite matière azotée est constituée d'environ 20 % à environ 30 % de peptides présentant une taille moléculaire comprise entre 500 et 1000 Daltons.
De manière encore plus préférée, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que ledit extrait comprend entre 20 et 40 % molaire d'acide aspartique et d'acide glutamique et/ou de leurs amides respectifs.
Plus particulièrement, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que ledit extrait présente la composition suivante en acides aminés totaux :
acides aminés % molaire
Alanine 2 - 6
Arginine 5 - 9
Acide aspartique + Asparagine 10 - 14
Cystéine 0
Acide Glutamique + Glutamine 15 - 19
Glycine 7 - 11
Histidine 1 - 5
Isoleucine 2 - 6
Leucine 5 - 9
Lysine 2 - 6
Méthionine 0 - 3
Phénylalanine 1 - 5
Proline 3 - 7
Serine 5 - 9
Thréonine 5 - 9
Tryptophane Non déterminé
Tyrosine 1 - 5
Valine 5 - 9
Enfin, selon un dernier aspect de la présente invention, des propriétés particulièrement intéressantes ont été mises en évidence quant à l'adaptation d'un milieu avec sérum à un milieu selon l'invention. En effet, il peut être avantageux, pour différentes raisons connues de l'homme de l'art, comme (i) l'obtention de nouvelles lignées cellulaires par modulation génétique (transfection), (ii) une viabilité cellulaire plus élevée lors de la décongélation suite à une congélation dans un milieu contenant du sérum, (iii) une croissance plus importante et (iv) une résistance plus élevée des cellules aux forces de cisaillement, de débuter une culture dans un milieu avec sérum et, plus ou moins rapidement, de faire passer cette culture en milieu dépourvu de sérum et/ou « protein free ». Il est connu que de tels transferts sont difficiles à mettre en œuvre car les cellules ont du mal à supporter un tel changement qui constitue un stress pour elles qui, dans la plupart des cas, leur est fatal. Pour éviter un tel stress, il est procédé à un transfert en douceur des cellules dans des milieux comprenant des concentrations décroissantes en sérum de manière à adapter les cellules au nouveau milieu sans sérum en douceur. Une telle période, dite d'adaptation, est relativement longue et fastidieuse.
De manière tout à fait surprenante, les inventeurs ont montré que ce stress pouvait être évité en transférant les cultures dans un milieu sans sérum contenant la fraction peptidique objet de l'invention, et ce même de manière brutale. Cette propriété de l'invention ressortira clairement des exemples et figures ci-après.
La présente invention concerne donc un procédé de transfert direct d'une culture in vitro en milieu avec sérum à une culture en milieu sans sérum, caractérisé en ce qu'il consiste à récupérer les cellules et/ou le tissu du milieu avec sérum et à les (1') ensemencer directement dans un milieu sans sérum tel que décrit dans la présente demande de brevet.
Selon encore un autre aspect avantageux, la présente invention concerne un procédé d'adaptation d'une culture in vitro en milieu avec sérum à une culture en milieu sans sérum, caractérisé en ce qu'il consiste à récupérer les cellules et/ou le tissu du milieu avec sérum et à les (1') ensemencer par étape dans des milieux présentant respectivement des concentrations en sérum décroissantes.
La présente invention couvre un procédé d'adaptation tel que décrit ci-dessus, caractérisé en ce que ledit procédé d'adaptation comprend les quatre étapes suivantes :
- Etape 1 : 75 % milieu avec sérum / 25 % milieu sans sérum + extrait peptidique, - Etape 2 : 50 % milieu avec sérum / 50 % milieu sans sérum + extrait peptidique,
- Etape 3 : 25 % milieu avec sérum / 75 % milieu sans sérum + extrait peptidique,
- Etape 4 : 100 % milieu sans sérum + extrait peptidique.
Selon un autre aspect, l'invention a pour objet un procédé de transfert direct d'une culture in vitro en milieu avec sérum à une culture en milieu « protein free », caractérisé en ce qu'il consiste à récupérer les cellules et/ou le tissu du milieu avec sérum et à les (1') ensemencer directement dans un milieu « protein free » tel que décrit dans la présente invention. Selon encore une forme d'exécution, la présente invention couvre un procédé d'adaptation d'une culture in vitro en milieu avec sérum à une culture en milieu
« protein free », caractérisé en ce qu'il consiste à récupérer les cellules et/ou le tissu du milieu avec sérum et à les (1') ensemencer par étape dans des milieux présentant respectivement des concentrations en sérum décroissantes.
Plus particulièrement, le procédé d'adaptation selon l'invention est caractérisé en ce que ledit procédé d'adaptation comprend les quatre étapes suivantes :
- Etape 1 : 75 % milieu avec sérum / 25 % milieu sans sérum + extrait peptidique,
- Etape 2 : 50 % milieu avec sérum / 50 % milieu sans sérum + extrait peptidique, - Etape 3 : 25 % milieu avec sérum / 75 % milieu sans sérum + extrait peptidique,
- Etape 4 : 100 % milieu sans sérum + extrait peptidique.
Enfin, selon un dernier aspect, la présente invention a pour objet un procédé d'adaptation d'une culture in vitro en milieu avec sérum à une culture en milieu « protein free », caractérisé en ce que ledit procédé comprend les étapes suivantes : - Etape 1 : mettre en œuvre le procédé objet de l'invention,
- Etape 2 : récupérer les cellules et/ou les tissus du milieu sans sérum,
- Etape 3 : ensemencer lesdit(e)s cellules et/ou tissus directement en milieu « protein free ».
Les avantages de la présente invention seront mis en évidence à la lumière des exemples et des figures ci-après dans lesquelles :
- la figure 1 représente un diagramme en flux, autrement appelé « flow sheet » d'une forme d'exécution d'un procédé permettant d'obtenir l'extrait peptidique conforme à l'invention ;
- la figure 2 représente l'effet d'une filtration stérilisante sur l'extrait selon l'invention ;
- la figure 3 représente, sous la forme d'un histogramme, l'effet de la concentration de l'extrait selon l'invention sur la densité cellulaire maximale ;
- la figure 4 illustre l'adaptation des cellules VERO d'un milieu avec sérum à un milieu sans sérum et à un milieu « protein free » comprenant l'extrait selon l'invention ;
- la figure 5 illustre l'adaptation des cellules type hybridomes d'un milieu avec sérum à un milieu sans sérum comprenant l'extrait selon l'invention ; - la figure 6 illustre l'adaptation des cellules CHO Kl dhfr" d'un milieu avec sérum à un milieu sans sérum et à un milieu « protein free » comprenant l'extrait selon l'invention ;
- les figures 7A et 7B illustrent l'adaptation des cellules CHO C5 d'un milieu sans sérum à un milieu sans sérum et à un milieu « protein free » comprenant l'extrait selon l'invention ;
- la figure 8 représente l'évolution de la concentration de cellules viables au cours de cultures prolongées de cellules CHO C5 ;
- les figures 9, 10 et 11 illustrent l'effet de l'extrait selon l'invention sur la vitesse spécifique de production d'interféron par les cellules CHO C5 cultivées ; et
- la figure 12 met en évidence que la fonction de l'extrait selon l'invention n'est pas liée uniquement à la composition élémentaire en acide aminé mais à la composition sous forme peptidique desdits acides aminés.
EXEMPLE 1 : Protocoles du procédé de génération de l'extrait peptidique objet de l'invention
Le protocole décrit ci-après est illustré par la Figure 1. Plus particulièrement, le présent exemple reprend l'ensemble des étapes en les détaillant selon une des formes d'exécution préférée. Il est bien entendu que des variantes, évidentes pour l'homme de l'art, pourront être apportées à ce procédé.
Etape 1 : Protocole d'extraction des protéines de colza
Le protocole suivi pour cette étape est représenté dans le schéma ci-dessous.
30 kg de tourteau déshuilé de colza + 300 L de soude 0,2 M
turbo mélangeur (30 mn, T° ambiante)
mélange tourteau / extrait alcalin
décanteur centrifuge horizontal (3500 g)
récupération de l'extrait et ajustement à pH 4 avec HCl (35 % v/v)
séparateur à assiettes en i iode clarification (3000 g)
récupération du précipité
lavages finaux di précipité à l'eau
Concentrât de protéines de tourteau de colza
Les protéines végétales utilisées sont une farine industrielle déshuilée, résidu de l'industrie huilière (Novance, Compiègne, France), contenant 35 % en poids de matière azotée. A partir de ce substrat, un concentrât protéique est préparé (75 % de matière azotée) par extraction à la soude et précipitation acide au pH isoélectrique des protéines (pH 4).
Le rendement total en protéines du procédé d'obtention du concentrât à partir du tourteau de colza est d'environ 28 %.
La composition du concentrât obtenu est la suivante (voir Tableau 1) :
Tableau 1 : Composition du concentrât obtenu
Protéines Fibres Lipides Cendres Autres
Teneur (%) 75 14 Etape 2 : Protocole d'hydrolyse du concentrât de protéines de tourteau de colza
Utilisation de l'Alcalase 2.4 L® qui est une préparation enzymatique d'origine microbienne à un rapport concentration enzyme/concentration substrat = 1/10.
Le concentrât est hydrolyse enzymatiquement dans un réacteur agité thermostaté (60°C) par l'action de l'Alcalase 2.4 L® (NovoNordisk, Bagsvaerd,
Danemark), avec régulation de pH (pH 9 maintenu par addition de soude). Après 5 heures d'hydrolyse, correspondant à un degré d'hydrolyse de 28 % (technique du pH- stat), la réaction est arrêtée par inactivation de l'enzyme (90°C pendant 10 mn).
Etape 3 : Précipitation acide pH 4
Le pH de l'hydrolysat obtenu à la fin de l'étape 2 est ensuite abaissé à 4 afin de précipiter les molécules de grande taille et concentrer les peptides dans le surnageant. Cette nouvelle étape permet d'éliminer les grosses molécules responsables du colmatage lors des étapes de filtration ultérieures et de concentrer les peptides de tailles relativement petites.
Etape 4 : Ultrafiltration avec une membrane de seuil de coupure 3 kDa
L'objectif de cette étape est la purification des petits peptides par l'élimination des molécules d'une taille supérieure à 3000 Da (composés phénoliques + polypeptides).
Le procédé utilise une membrane en cellulose régénérée classique pour concentrer les peptides de masse molaire théorique inférieure à 3000 g/mol.
Etape 5 : Nanofiltration avec une membrane de seuil de coupure 500 Da L'objectif de cette étape est de diminuer le taux d'acides aminés libres dans la solution de petits peptides obtenue après l'étape 4 et dessaler cette même solution afin de diminuer Fosmolarité du mélange.
Cette étape de séparation qui met en jeu une membrane constituée d'un film composite polyamide/polysulfone, conduit à une baisse de 80 % de la concentration en sels, ce qui permet un meilleur fractionnement des peptides selon leur charge dans l'étape suivante 6. Etape 6 : Ultrafiltration avec une membrane de seuil de coupure 1 kDa
L'objectif est de fractionner les petits peptides selon leur taille et leur charge. Il est utilisé une membrane en cellulose régénérée classique dans le but de fractionner selon leur taille mais aussi selon leur charge, en fonction des conditions de mise en œuvre de la membrane, les peptides récupérés après l'étape 5 dont les masses molaires doivent théoriquement être comprises entre 500 et 3000 g/mol. L'exécution de cette étape conduit à deux fractions :
- un perméat contenant essentiellement des peptides de masse molaire théoriquement inférieure à 1000 g/mol, - un rétentat qui, par rapport au perméat, présente, d'une part, une teneur plus élevée en peptides contenant des acides aminés acides, et, d'autre part, une teneur plus faible en peptides contenant des acides aminés basiques.
L'extrait peptidique objet de la présente invention consiste en le rétentat obtenu par mise en œuvre du procédé tel que décrit ci-dessus. De manière évidente, des modifications peuvent être apportées. A titre d'exemple non limitatif, il peut être envisagé d'ajuster le pH à 4 lors des étapes 5 et 6, au lieu de 9 ou encore de supprimer l'étape 5.
EXEMPLE 2 : Protocoles mis en œuvre pour la caractέrisation de l'extrait objet de l'invention
2.1. Dosage d'azote par la méthode de Kjeldahl
• Réactifs
- Catalyseur de minéralisation (Na2SO4 17 % ; CuSO4.5 H2O 1,5 % ; sels 1,5 %) : Prolabo, 22550-293 - H2SO4 I N : Labosi A4715891
- H2O2 35 % : Labosi, A4823251
- NaOH 40 % : Merck, 191537
- H3BO3 : Labosi, A4703851
• Matériel - Appareil de Kjeldahl automatique Vapodest 4 titramatic : Gerhardt GmbH & Co. KG, Bonn, Allemagne
- Système de titrage automatique 645 Multi-dosimat : Metrohm, Herisau, Suisse - Banc de minéralisation Kjeldatherm® KT 12 S: Gerhardt GmbH & Co. KG, Bonn, Allemagne
• Protocole du dosage
La teneur protéique a été déterminée par la méthode de Kjeldahl. Cette méthode de dosage est basée sur la transformation de l'azote organique en azote minéral sous forme de sulfate d'ammonium (NH4)2SO4. Le dosage est réalisé de façon automatique avec le Vapodest 4S. Pour chaque échantillon, l'analyse est effectuée deux fois de manière à pouvoir calculer une valeur moyenne. Il est également nécessaire de faire un dosage à blanc pour obtenir, après soustraction, une valeur de l'azote total réellement contenu dans l'échantillon.
Les résultats sont exprimés en concentration massique d'azote, selon la formule : taux d'azote (g/1) = (V-VO) x N x 14 / E avec V : volume d'H2SO4 nécessaire à la titration de l'échantillon en mL,
V0 : volume d'H2SO4 nécessaire à la titration du blanc en mL, N : titre de la solution d'H2SO4 (mol/1),
E : prise d'échantillon en mg ou en ml.
Le pourcentage de protéines est obtenu à l'aide du coefficient de transformation pour les protéines de colza (6,25), lui-même calculé à partir de la teneur en azote de ces protéines (16 %) : taux de protéines = 6,25 x taux d'azote. Il ressort de ce calcul que le % protéique de l'extrait objet de l'invention est d'environ 90 % (voir tableau 2 plus loin).
2.2. Hydrolyse acide des peptides et dosage des acides aminés
• Réactifs - Acide trichloroacétique à 50 % (p/v) dans l'eau : Prolabo, 20734.295
- 9-Fluorénylméthyl chloroformate (FMOC-Cl) : OSI, A4 700.792,
- 2,5 mg/ml dans l'acétonitrile : Fluka, 23184
- o-phthalaldéhyde (OPA) : Fluka, 79760
- Acide 3-mercaptopropionique (3 -MPA) : Sigma, M-6750 - 10 mg de chacun des composés (OPA et 3 -MPA) dans 1 ml de tampon borate 0,4 N et pH 10,5 : Hewlett-Packard, 5061-3339
- Solution étalon de mélange des acides aminés : Sigma, AA-S-18 - Solution de NaOH 2 N : Fluka, 72071
- HCl 6 N : Labosi, A4715801 Solutions d'élution :
Solvant A : 20 mM d'acétate de sodium, 3 H2O (OSI, 27652.298), à 0,024 % (v/v) de triéthylamine (OSI, 28 745.296) et 0,5 % (v/v) de tétrahydrofurane (OSI, 28 556.293). Le mélange est ajusté à pH 7,2 avec de l'acide acétique (OSI, 20 104. 298).
Solvant B : 20 % (v/v) d'un tampon d'acétate de sodium à 100 mM (OSI, 27 652.298) ajusté à pH 7,2 avec de l'acide acétique, 40 % (v/v) d'acétonitrile et 40 % (v/v) de méthanol (Prolabo, 20 865.322). • Matériel
- Filtres à usage unique 0,22 μm : Schleicher & Schuell, Dassel, Allemagne
- Etuve modèle 700 : Memmert, Schwabach, Allemagne
- Colonne Hypersil Cl 8 : Interchim, H5 Cl 8-20R, Montluçon, France
- Système de chromatographie HP 1090 : Hewlett Packard, PaIo Alto, Etats-Unis • Méthode
Une hydrolyse acide des fractions peptidiques est préalablement effectuée pour obtenir un mélange homogène d'acides aminés libres. Un échantillon de 1 g ou de 1 ml est placé dans un tube à essais avec bouchon. Puis 4 ml d'acide chlorhydrique (6 N) sont ajoutés puis le tube à essais est mis sous atmosphère d'azote avant d'être fermé hermétiquement. L'hydrolyse se fait ensuite dans une étuve à 110°C pendant 24 h.
Après refroidissement, les hydrolysats sont neutralisés jusqu'à un pH d'environ 6 par ajout de soude 4 N. Les échantillons sont finalement filtrés sur filtre seringue à 0,22 μm.
L'inconvénient de l'hydrolyse acide est la destruction du tryptophane et la transformation de la glutamine et de l'asparagine, respectivement en acide glutamique et en acide aspartique. L'analyse du tryptophane peut être effectuée après une hydrolyse basique par chromatographie d'échange d'ions (Hugli T.E. et al., 1972, Détermination of the tryptophane content of proteins by ion exchange chromatography of alcaline hydrolysates, Ibid., 247, 2828-2834). Etant donné que la quantité en tryptophane est très limitée dans le colza (Godon B., 1996, Les méthodes courantes de laboratoire pour la séparation et l'analyse des protéines végétales. In : Eds Lavoisier. Protéines végétales, 65-80), cet acide aminé n'est pas analysé. Quant à la glutamine et l'asparagine, leur quantification sera intégrée avec les acides aminés acides correspondant, sous les formes GIx et Asx (GIx = GIn + Glu, Asx = Asn + Asp). • Protocole
Les acides aminés ainsi que les dipeptides alanyl-glutamine et glycyl- glutamine sont dosés par Chromatographie Liquide en Phase Inverse après dérivation en présence d'o-phtahaldéhyde (OPA) et de 9-fluorényl-méthyl chloroformate (FMOC). Le principe de la dérivation est le suivant : les acides aminés primaires sont placés en présence d'OPA et d'acide 3-mercapto-propionique (3-MPA), pour donner des isoindoles hautement fluorescents et absorbants dans le domaine UV (338 nm) (Godel et al., 1992, Automated amino acid analysis using combined OPA and FMOC-Cl precolumn derivatization, LC-GC ES[TL., 5, 44-49).
Selon le même principe, les acides aminés secondaires sont dérivés en présence de FMOC, pour donner des dérivés hautement fluorescents et absorbants dans le domaine UV (262 nm). Le seuil de détection est de l'ordre de 100 pmoles. Les échantillons sont dérivés automatiquement à l'aide d'un système HP 1090
Liquid Chromatograph Hewlett Packard. 3 μl d'échantillon sont tout d'abord neutralisés avec 1,5 μl de NaOH 2 N pour obtenir une dérivation totale. Puis, le tout est mélangé à 6,0 μL de tampon borate 0,4 N, 2,5 μl de la solution d'OPA + 3-MPA et 2,5 μl de la solution de FMOC. Le mélange dure 15 mn afin de permettre la dérivation ; enfin, le tout est injecté au niveau de la colonne de séparation Hypersil Cl 8. Le solvant d'élution est composé de 100 % de solution A, pendant 17 mn, puis de 40 % de solution A et 60 % de solution B pendant 1 mn et enfin de 100 % de solution B, pendant 7 mn. Les acides aminés sont séparés selon leur polarité ; les plus polaires sortent en début d'analyse et les moins polaires en fin d'analyse. En sortie de colonne, les acides aminés primaires et les dipeptides sont détectés par un détecteur UV, à 338 nm, et les acides aminés secondaires sont détectés par un détecteur UV, à 262 nm. La durée totale de l'analyse est de 25 mn.
La détermination du taux d'acides aminés libres est effectuée selon le même protocole, exceptée l'absence d'étape d'hydrolyse acide. Avant analyse des échantillons, trois solutions, contenant 17 acides aminés aux concentrations de 0,25, 0,5 et 2,5 mM respectivement, sont dérivées et injectées sans neutralisation préalable avec du NaOH 2 N. Les profils obtenus servent à établir une gamme étalon pour chaque acide aminé, ce qui permet ensuite de déterminer la concentration de chaque acide aminé contenu dans un échantillon après intégration des pics (système Hewlett Packard).
2.3. Dosage de la matière sèche
La détermination de l'humidité a été faite en portant les échantillons (1 à 5 g) à 105°C dans une étuve jusqu'à l'obtention d'une masse constante.
2.4. Détermination de la taille des pcptidcs par chromatographie d'exclusion de taille
• Matériel
- Colonne Superdex Peptide HR 10/ 30 (7000-200 Da) : Amersham Biosciences, Uppsala, Suède
- Filtres 0,22 μm Minisart RC 25 : Sartorius, Goettingen, Allemagne - Dispositif de filtration sous vide, fritte en verre SM 16309 : Sartorius, Goettingen, Allemagne
- Système de chromatographie BioCAD® 700E : Applied Biosystems, Foster City, Etats-Unis
- Collecteur de fraction Modèle 203B : Gilson, Middleton, Etats-Unis • Méthode
Les conditions opératoires sont les suivantes :
- Eluant : ACN/H2O/TFA (40/60/0,1 - v/v/v), filtré sur 0,45 μm
- Solvant dégazé à l'hélium : 5 ml/mn
- Débit de l'éluant : 0,6 ml/mn - Température de la colonne : ambiante (25°C)
- Détection : U. V. à 214 nm
- Volume injecté : 50 μL
- Durée d'analyse : 45 mn
La colonne a été préalablement étalonnée avec des peptides de masses molaires connues. Deux droites ont été obtenues en traçant le logarithme de la masse molaire en fonction du temps de rétention. La détermination de la relation liant la masse molaire
(MM) des molécules à leur temps de rétention sur la colonne a permis de définir la distribution selon la taille des peptides contenus dans les différentes fractions.
2.5. Dosage des composés phénoliques
La quantité de composés phénoliques dans les fractions a été estimée en équivalent acide sinapique. L'acide sinapique (Sigma, D 7927), avec une masse molaire de 224 g/mol, a été utilisé comme référence parce qu'il est l'acide phénolique majoritairement présent dans le tourteau de colza (entre 70 et 90 %) selon Naczk M. et al., 1992, Recovery of rapeseed tannins by various solvent Systems, Food Chem., 45, 51-54. L'étalonnage et les mesures ont été effectués en utilisant les mêmes conditions chromatographiques que celles qui sont employées en C.L.H.P.-E.T., exceptée la longueur d'onde de détection fixée dans ce cas à 310 nm, ce qui correspond à la longueur d'onde d'absorption maximale de cet acide (Sakakibara H. et al., 2003, Simultaneous détermination of ail polyphenols in vegetables, fruits and teas, J. Agric. Food Chem., 51, 571-581). La quantité de composés phénoliques dans chaque fraction a été exprimée en mg d'équivalents d'acide sinapique / 100 g de matière sèche. La teneur en composés phénoliques libres a été estimée en calculant la proportion d'aire du pic ayant un temps de rétention (compris entre 34 et 37 mn) identique à celui du standard utilisé pour établir la courbe d'étalonnage. Les résultats de l'exemple 2 sont regroupés dans les tableaux ci-dessous :
Composition de la matière azotée et phénolique de l'extrait pcptidiquc :
(Voir Tableau 2)
Tableau 2 :
Figure imgf000025_0001
MP : Matière Peptidique ; MS : Matière Sèche. Répartition de la taille des pcptidcs (par rapport à la matière pcptidiquc totale)
(Voir Tableau 3)
Tableau 3
Taille (Da) > 5000 5000-1000 1000-500 < 500 extrait 0 % 20 % 23 % 57 %
Composition en acides aminés de l'extrait pcptidiquc (3 analyses) :
(Voir Tableau 4)
Tableau 4
aa % % %
Asx 13 12 12
GIx 17 17 20
Ser 7 7 5
His 3 3 2
GIy 9 9 9
Thr 7 7 5
AIa 4 4 5
Arg 7 7 7
Tyr 2 3 3
Cys 0 0 0
Val 7 7 8
Met 1 1 0
Phe 3 3 3
Ile 4 4 4
Leu 7 7 7
Lys 4 4 4
Pro 5 5 6
100 100 100
Asx : acide aspartique + asparagine GIx : acide glutamique + glutamine
Dans l'ensemble des exemples 4 à 9 ci-après, et sauf information contraire indiquée dans le texte, les cultures ont été réalisées avec les cellules CHO-C5 dans les milieux de culture suivants : Milieu de référence (o) = RPMI 1640 (Sigma)+ BITS + ET + Glutamine Milieu d'intérêt (Δ) = Milieu de Référence + 4 g/L d'extrait peptidique selon l'invention.
EXEMPLE 3 : Effet d'une filtration stérilisante
Le système de culture utilisé consiste en une fiole d'Erlenmeyer de 125 ml, Vu = 25 ml.
La culture des cellules CHO C5 a été faite en milieu de référence (o) ou en milieu d'intérêt (Δ) stérilisé 1 fois (symboles vides) ou 3 fois (symboles pleins) par filtration stérilisante 0,22 μm.
Les résultats obtenus sont représentés dans la figure 2.
Il ressort de ces derniers qu'il n'y a pas de diminution de l'effet de l'extrait peptidique selon l'invention lors de la filtration sur 0,22 μm.
EXEMPLE 4 : Effet "cryoprotecteur" de l'extrait peptidique selon l'invention
(Voir Tableau 5)
Le système de culture utilisé consiste en des flacons de cultures statiques Tableau 5
Durée de la période de stockage à -1961 'C
1 semaine 1 mois 5 mois
Temps après décongélation et 0 24 48 96 0 24 48 96 0 24 48 96 120 remise en culture (h)
M.
61 44 60 81 46 33 36 65 44 34 36 53 72
% Référence
Viabilité M
64 52 56 85 58 46 55 74 39 38 45 68 92
Intérêt
Une meilleure récupération des cellules congelées en présence de l'extrait selon l'invention est observée. Cette propriété est particulièrement intéressante en ce sens que, dans la pratique, les cellules sont souvent congelées puis décongelées afin d'être, par exemple, conservées ou bien transportées. EXEMPLE 5 : Effet de la concentration de l'extrait selon l'invention sur la densité cellulaire maximale
Le système de culture utilisé consiste en des plaques 96 puits, Vu = 200 μL. Le suivi de la croissance a été réalisé avec l'appareil Cellscreen (Innovatis). Les résultats obtenus sont regroupés dans la figure 3.
Ces résultats montrent que la concentration de 4 g/L est celle qui présente les résultats les meilleurs. Des concentrations trop élevées compromettent la croissance.
Sans vouloir être liés par une quelconque théorie, les inventeurs avancent l'hypothèse que la concentration d'inhibiteurs ou de toxiques pourrait annihiler l'effet positif des activateurs.
EXEMPLE 6 : Essais d'adaptation de diverses cellules
6.1. Passage d'un milieu avec 10 % de sérum à un milieu sans sérum contenant l'extrait selon l'invention Le système de culture utilisé consiste en des flacons de cultures statiques.
6.1.1. Cellules VERO (cellules adhérentes)
Le milieu de base utilisé est le αMEM. L'adaptation réalisée est une adaptation brutale. Les résultats obtenus sont représentés dans la figure 4.
Les passages successifs de cellules VERO, illustrés par la courbe (Δ), représentent l'adaptation en présence d'extrait selon l'invention. La courbe (o) représente l'adaptation des cellules en absence d'extrait. De JO à Jl 7, le FCS est diminué de 10 à 1 %. A Jl 7, le FCS est brutalement supprimé et remplacé par le mélange (extrait peptidique selon l'invention, BITS, ET, Q). A J36, les BITS sont supprimés. II ressort des résultats obtenus qu'en absence d'extrait peptidique conforme à l'invention, l'adaptation est impossible (mort des cellules en 2 passages). En présence dudit extrait et de BITS, l'adaptation des cellules est rapide (récupération de la croissance au 3^6 passage). En présence de ce même extrait et en absence de protéines animales (milieu « protein free »), l'adaptation est un peu plus difficile mais reste possible.
En présence de BITS et d'extrait peptidique et en l'absence de sérum, les cellules VERO restent adhérentes. Lorsque les BITS sont enlevés, elles le restent également mais dans une moindre mesure (le temps nécessaire à la trypsination est largement diminué).
6.1.2. Hybridomes (cellules en suspension)
Le milieu de base utilisé est le RPMI. ADAPTATION BRUTALE
Dans le cas d'une adaptation brutale, il est rapidement observé la mort des cellules lors de la substitution brutale du FCS par le mélange (extrait peptidique + BITS + ET + Q).
ADAPTATION DOUCE Des passages successifs de cellules d'hybridomes ont été réalisés. Les résultats obtenus sont illustrés par la figure 5 dont la courbe (Δ) représente l'adaptation en présence d'extrait selon l'invention et la courbe (o) représente l'adaptation des cellules en absence d'extrait selon l'invention. De JO à Jl 7, le FCS est diminué de 10 à 1 %. De J17 à J35, le FCS est progressivement supprimé et remplacé par le mélange (extrait peptidique, BITS, ET, Q). A J47, les BITS sont supprimés.
Les résultats obtenus montrent qu'en absence d'extrait peptidique, l'adaptation est impossible (mort des cellules en 2 passages dans le mélange 25 % I 15 %). En présence d'extrait et de BITS et en absence de sérum, les hybridomes s'adaptent correctement (récupération au 4ème passage). La suppression des protéines animales (BITS) entraîne la mort instantanée des cellules.
6.1.3. CHO Kl dhfr- (CHO DUXBl l)(cellules en suspension)
Le milieu de base utilisé est le αMEM + ribo- et désoxyribonucléosides.
ADAPTATION BRUTALE
Les mêmes observations qu'avec les cellules d'hybridomes sont rapportées (données non montrées).
ADAPTATION DOUCE
Plusieurs passages successifs de cellules CHO Kl dhfr" ont été effectués. Les résultats obtenus sont représentés dans la figure 6 dont la courbe (Δ) représente l'adaptation en présence d'extrait peptidique alors que la courbe (o) représente l'adaptation des cellules en absence d'extrait peptidique. De JO à Jl 2, le FCS est diminué de 10 à 2 %. De Jl 2 à J 40, le FCS est progressivement supprimé et remplacé par le mélange (extrait peptidique, BITS, ET, Q). A J40, les BITS sont supprimés. II ressort de ces résultats qu'en absence d'extrait peptidique, l'adaptation est impossible (mort des cellules en 3 passages dans le mélange 25 % / 75 %). En présence d'extrait peptidique et de BITS et en absence de sérum, les CHO Kl s'adaptent correctement (récupération au 1er passage). La suppression des protéines animales (BITS) entraîne un ralentissement de croissance et une adaptation plus longue (environ 6 passages), mais celle-ci reste possible.
6.2. Passage d'un milieu sans sérum (de référence) à un milieu sans sérum et avec extrait peptidique (d'intérêt ou d'intérêt sans protéine d'origine animale)
6.2.1. Passages successifs de CHO C5 (cellules en suspension) Le système de culture utilisé consiste en des flacons de cultures statiques.
Plusieurs passages successifs de cellules CHO C5 ont été effectués en milieu de référence (o), en milieu d'intérêt (Δ) et en milieu d'intérêt sans protéines animales (x). Les résultats obtenus pour le milieu de référence sont regroupés dans la figure 7A. Les résultats obtenus pour les milieux d'intérêt sont représentés, quant à eux, en figure 7B. II ressort de ces figures que l'adaptation des cellules au milieu d'intérêt ainsi que l'effet positif de l'extrait peptidique est conservé pendant au moins 7 passages. De même, la propagation des cellules dans le milieu sans protéines animales permet d'obtenir des concentrations cellulaires proches de celles observées en milieu de référence pendant au moins 7 passages. II peut être conclu que le milieu « protein-free » selon l'invention peut être utilisé en milieu de routine pour entretenir les cellules, d'autant plus que les cellules peuvent n'être transférées que tous les 3 jours (au lieu de tous les 2 jours pour le milieu de référence).
6.2.2. Cinétiques de cultures prolongées (cellules en suspension) Les systèmes de culture utilisés sont des spinners de 500 ml, Vu = 160 ml.
L'évolution de la concentration de cellules viables au cours des cultures de cellules CHO C5 réalisées, sans adaptation préalable, est représentée à la figure 8. Plus particulièrement, cette figure illustre les cultures en milieu de référence (o), en milieu de référence sans BITS (-), en milieu d'intérêt (Δ) et en milieu d'intérêt sans BITS (x). II ressort clairement des résultats obtenus que le milieu de référence ne permet plus la croissance des cellules lorsqu'on supprime les protéines animales. Le milieu d'intérêt permet pratiquement de doubler la concentration maximale. De plus, la durée de la culture (avant disparition quasi-complète des cellules viables) est multipliée par 3. Le milieu d'intérêt permet la croissance lorsque l'on supprime les protéines animales. En absence de protéines animales, et en présence d'extrait peptidique, la concentration maximale de cellules n'est pas améliorée mais la longévité de la culture est augmentée d'un facteur 2 par rapport au milieu de référence.
EXEMPLE 7 : Effet de l'extrait peptidique sur la vitesse spécifique de production de l'interféron
Le système de culture utilisé consiste en un cytoculteur de 2 litres, Volume utile Vu = 1,2 1.
La figure 9 représente la cinétique de croissance des cellules CHO C5 en milieu de référence (o) et en milieu d'intérêt (Δ).
La figure 10 représente, quant à elle, la cinétique de production d'IFN (interféron gamma) par les mêmes cellules CHO C5 en milieu de référence (o) et en milieu d'intérêt (Δ).
Enfin, la figure 11 illustre la vitesse spécifique de production d'interféron par les cellules CHO C5 en milieu de référence (pointillés) et en milieu d'intérêt (plein).
+ L'effet positif de l'extrait peptidique sur les cellules viables est confirmé à l'échelle du réacteur (*3,3). + On note une forte augmentation de la production finale d'IFN (*5,3).
+ Cette augmentation peut être le résultat conjugué de l'augmentation de cellules viables, mais également de l'augmentation de la vitesse spécifique de production (valeur maximale quasiment doublée).
EXEMPLE 8 : Mise en évidence de la fonction liée non pas uniquement par la composition élémentaire en acides-aminés mais par la composition sous forme peptidique desdits acides-aminés
Le système de culture utilisé consiste en des spinners de 500 ml, Vu = 160 ml.
La figure 12 représente les cinétiques de cellules viables CHO C5 cultivées en spinners, dans le milieu de référence (o), le milieu de référence additionné d'acides aminés libres (x) et le milieu d'intérêt (Δ). Les acides aminés libres correspondent aux acides aminés totaux présents dans l'extrait peptidique (peptides et libres). L'ajout d'acides aminés en même proportion que ceux présents dans l'extrait peptidique, sous forme de peptides, ne permet pas d'augmenter la concentration de cellules viables. On note, par contre, un effet positif sur la longévité de la culture. La composition en acides aminés individualisés, équivalente à celle du mélange peptidique de l'extrait peptidique utilisée, favorise le maintien en vie des cellules (* 3 par rapport au milieu de référence).
L'extrait peptidique améliore la quantité, par un doublement de la population de cellules viables, mais aussi la viabilité des cellules (50 % de temps supplémentaire par rapport au milieu référence + acides aminés libres, en se repérant au maximum de concentration cellulaire obtenue dans ce cas). Ces résultats ne semblent pas uniquement induits par un effet lié à la seule composition globale en acides aminés. Ils peuvent être également provoqués par un effet « iàcteur de croissance » issu de la présence de certains peptides, à la composition particulière, dans l'extrait peptidique selon l'invention.

Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation d'un extrait peptidique pour la préparation et/ou la supplémentation d'un milieu de culture in vitro de cellules ou de tissus, sans sérum, ledit extrait étant obtenu par fractionnements successifs d'une matière première végétale, caractérisée en ce que ladite matière première végétale consiste en la graine de colza.
2. Utilisation d'un extrait peptidique pour la préparation et/ou la supplémentation d'un milieu de culture in vitro de cellules ou de tissus, « protein free », ledit extrait étant obtenu par fractionnements successifs d'une matière première végétale, caractérisée en ce que ladite matière première végétale consiste en la graine de colza.
3. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que ledit extrait peptidique assure une fonction au niveau de l'augmentation de la concentration cellulaire ou tissulaire et/ou au niveau de l'augmentation de la durée de vie des cellules et/ou au niveau de la vitesse spécifique de production d'une ou plusieurs molécules d'intérêt, ladite fonction étant liée non pas uniquement par la composition élémentaire en acides-aminés mais par la composition sous forme peptidique desdits acides-aminés.
4. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que ladite matière première végétale consiste en du tourteau de colza.
5. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que ledit extrait peptidique est constitué d'au moins 80 %, préférentiellement au moins 90 %, en masse de matière azotée.
6. Utilisation selon la revendication 5, caractérisée en ce que ladite matière azotée est constituée d'environ 50 % à environ 60 % de peptides présentant une taille moléculaire inférieure à 500 Daltons.
7. Utilisation selon l'une des revendications 5 ou 6, caractérisée en ce que ladite matière azotée est constituée d'environ 20 % à environ 30 % de peptides présentant une taille moléculaire comprise entre 500 et 1000 Daltons.
8. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que ledit extrait comprend entre 20 et 40 % molaire d'acide aspartique et d'acide glutamique et/ou de leurs amides respectifs.
9. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que ledit extrait peptidique comprend moins de 1 % en masse de composés phénoliques.
10. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que ledit extrait peptidique présente la composition suivante en acides aminés totaux : acides aminés % molaire
Alanine 2 - 6
Arginine 5 - 9
Acide aspartique + Asparagine 10 - 14
Cystéine 0
Acide Glutamique + Glutamine 15 - 19
Glycine 7 - 11
Histidine 1 - 5
Isoleucine 2 - 6
Leucine 5 - 9
Lysine 2 - 6
Méthionine 0 - 3
Phénylalanine 1 - 5
Proline 3 - 7
Serine 5 - 9
Thréonine 5 - 9
Tryptophane Non déterminé
Tyrosine 1 - 5
Valine 5 - 9
11. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 pour la culture de cellules, caractérisée en ce que lesdites cellules consistent en des cellules eucaryotes, préférentiellement des cellules animales.
12. Milieu de culture de cellules ou de tissus, sans sérum, obtenu par utilisation d'un extrait peptidique selon l'une quelconque des revendications 1 et 3 à 11.
13. Milieu de culture selon la revendication 12, caractérisé en ce qu'il comprend, en outre, des vitamines, des sels inorganiques, des acides aminés libres, des acides organiques et/ou des sucres.
14. Utilisation d'un milieu de culture selon l'une des revendications 12 ou 13 pour la culture en masse de cellules ou de tissus.
15. Milieu de culture de cellules ou de tissus, « protein free », obtenu par utilisation d'un extrait peptidique selon l'une quelconque des revendications 2 à 11.
16. Milieu de culture selon la revendication 15, caractérisé en ce qu'il comprend, en outre, des vitamines, des sels inorganiques, des acides aminés libres, des acides organiques et/ou des sucres.
17. Utilisation d'un milieu de culture selon l'une des revendications 15 ou 16 pour la culture en masse de cellules ou de tissus.
18. Procédé de culture in vitro de cellules ou de tissus dans un milieu dépourvu de sérum, caractérisé en ce qu'il consiste à ensemencer lesdit(e)s cellules ou tissus dans un milieu comprenant un extrait peptidique obtenu par fractionnements successifs d'une matière première végétale, ladite matière première végétale consistant en la graine de colza.
19. Procédé selon la revendication 18, caractérisé en ce que ladite matière première consiste en du tourteau de colza.
20. Procédé selon la revendication 18 ou 19, caractérisé en ce que ledit extrait est constitué d'au moins 80 %, préférentiellement au moins 90 %, en masse de matière azotée.
21. Procédé selon l'une quelconque des revendications 18 à 20, caractérisé en ce que ladite matière azotée est constituée d'environ 50 % à environ 60 % de peptides présentant une taille moléculaire inférieure à 500 Daltons.
22. Procédé selon l'une quelconque des revendications 18 à 21, caractérisé en ce que ladite matière azotée est constituée d'environ 20 % à environ 30 % de peptides présentant une taille moléculaire comprise entre 500 et 1000 Daltons.
23. Procédé selon l'une quelconque des revendications 18 à 22, caractérisé en ce que ledit extrait comprend entre 20 et 40 % molaire d'acide aspartique et d'acide glutamique et/ou de leurs amides respectifs.
24. Procédé selon l'une quelconque des revendications 18 à 23, caractérisé en ce que ledit extrait présente la composition suivante en acides aminés totaux :
acides aminés % molaire
Alanine 2 - 6
Arginine 5 - 9
Acide aspartique + Asparagine 10 - 14
Cystéine 0
Acide Glutamique + Glutamine 15 - 19
Glycine 7 - 11
Histidine 1 - 5 Isoleucine 2 - 6
Leucine 5 - 9
Lysine 2 - 6
Méthionine 0 - 3
Phénylalanine 1 - 5
Praline 3 - 7
Serine 5 - 9
Thréonine 5 - 9 Tryptophane Non déterminé
Tyrosine 1 - 5
Valine 5 - 9
25. Procédé de culture in vitro de cellules ou de tissus dans un milieu « protein free », caractérisé en ce qu'il consiste à ensemencer lesdit(e)s cellules ou tissus dans un milieu comprenant un extrait peptidique obtenu par fractionnements successifs d'une matière première végétale, ladite matière première végétale consistant en la graine de colza.
26. Procédé selon la revendication 25, caractérisé en ce que ladite matière première consiste en du tourteau de colza.
27. Procédé selon la revendication 25 ou 26, caractérisé en ce que ledit extrait est constitué d'au moins 80 %, préférentiellement au moins 90 %, en masse de matière azotée.
28. Procédé selon l'une quelconque des revendications 25 à 27, caractérisé en ce que ladite matière azotée est constituée d'environ 50 % à environ 60 % de peptides présentant une taille moléculaire inférieure à 500 Daltons.
29. Procédé selon l'une quelconque des revendications 25 à 28, caractérisé en ce que ladite matière azotée est constituée d'environ 20 % à environ 30 % de peptides présentant une taille moléculaire comprise entre 500 et 1000 Daltons.
30. Procédé selon l'une quelconque des revendications 25 à 29, caractérisé en ce que ledit extrait comprend entre 20 et 40 % molaire d'acide aspartique et d'acide glutamique et/ou de leurs amides respectifs.
31. Procédé selon l'une quelconque des revendications 25 à 30, caractérisé en ce que ledit extrait présente la composition suivante en acides aminés totaux : acides aminés % molaire
Alanine 2 - 6
Arginine 5 - 9
Acide aspartique + Asparagine 10 - 14
Cystéine 0
Acide Glutamique + Glutamine 15 - 19
Glycine 7 - 11
Histidine 1 - 5
Isoleucine 2 - 6
Leucine 5 - 9
Lysine 2 - 6
Méthionine 0 - 3
Phénylalanine 1 - 5
Proline 3 - 7
Serine 5 - 9
Thréonine 5 - 9
Tryptophane Non déterminé
Tyrosine 1 - 5
Valine 5 - 9
32. Procédé de transfert direct d'une culture in vitro en milieu avec sérum à une culture en milieu sans sérum, caractérisé en ce qu'il consiste à récupérer les cellules et/ou le tissu du milieu avec sérum et à les (1') ensemencer directement dans un milieu selon la revendication 12 ou 13.
33. Procédé d'adaptation d'une culture in vitro en milieu avec sérum à une culture en milieu sans sérum, caractérisé en ce qu'il consiste à récupérer les cellules et/ou le tissu du milieu avec sérum et à les (1') ensemencer par étape dans un milieu selon la revendication 12 ou 13, ledit milieu présentant respectivement des concentrations en sérum décroissantes.
34. Procédé d'adaptation selon la revendication 33, caractérisé en ce que ledit procédé d'adaptation comprend les quatre étapes suivantes :
- Etape 1 : 75 % milieu avec sérum / 25 % milieu sans sérum + extrait peptidique,
- Etape 2 : 50 % milieu avec sérum / 50 % milieu sans sérum + extrait peptidique, - Etape 3 : 25 % milieu avec sérum / 75 % milieu sans sérum + extrait peptidique,
- Etape 4 : 100 % milieu sans sérum + extrait peptidique.
35. Procédé de transfert direct d'une culture in vitro en milieu avec sérum à une culture en milieu « protein free », caractérisé en ce qu'il consiste à récupérer les cellules et/ou le tissu du milieu avec sérum et à les (1') ensemencer directement dans un milieu selon la revendication 15 ou 16.
36. Procédé d'adaptation d'une culture in vitro en milieu avec sérum à une culture en milieu « protein free », caractérisé en ce qu'il consiste à récupérer les cellules et/ou le tissu du milieu avec sérum et à les (1') ensemencer par étape dans un milieu selon la revendication 15 ou 16, ledit milieu présentant respectivement des concentrations en sérum décroissantes.
37. Procédé d'adaptation selon la revendication 36, caractérisé en ce que ledit procédé d'adaptation comprend les quatre étapes suivantes :
- Etape 1 : 75 % milieu avec sérum / 25 % milieu sans sérum + extrait peptidique,
- Etape 2 : 50 % milieu avec sérum / 50 % milieu sans sérum + extrait peptidique, - Etape 3 : 25 % milieu avec sérum / 75 % milieu sans sérum + extrait peptidique,
- Etape 4 : 100 % milieu sans sérum + extrait peptidique.
38. Procédé d'adaptation d'une culture in vitro en milieu avec sérum à une culture en milieu « protein free », caractérisé en ce que ledit procédé comprend les étapes suivantes : - Etape 1 : mettre en œuvre le procédé selon l'une des revendications 32, 33 et 34,
- Etape 2 : récupérer les cellules et/ou les tissus du milieu sans sérum,
- Etape 3 : ensemencer lesdit(e)s cellules et/ou tissus directement en milieu « protein free ».
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