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WO2006052007A1 - 血糖調節剤 - Google Patents

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WO2006052007A1
WO2006052007A1 PCT/JP2005/021068 JP2005021068W WO2006052007A1 WO 2006052007 A1 WO2006052007 A1 WO 2006052007A1 JP 2005021068 W JP2005021068 W JP 2005021068W WO 2006052007 A1 WO2006052007 A1 WO 2006052007A1
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WO
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salt
receptor protein
protein
agent
receptor
Prior art date
Application number
PCT/JP2005/021068
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English (en)
French (fr)
Inventor
Fumika Inazuka
Akio Uchida
Yugo Habata
Makoto Kobayashi
Original Assignee
Takeda Pharmaceutical Company Limited
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Publication date
Application filed by Takeda Pharmaceutical Company Limited filed Critical Takeda Pharmaceutical Company Limited
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Definitions

  • the present invention relates to a blood glucose regulator. Specifically, the present invention relates to an agent that regulates blood glucose by promoting or inhibiting glucose uptake through P 2 Y 2 receptors in skeletal muscle. Background art
  • Skeletal muscle is a high-density tissue that accounts for about 40% of body weight. It is positioned as one of the main organs of glucose metabolism. The increase in blood glucose concentration (blood glucose level) due to meals is quickly processed by increasing glucose (sugar) uptake activity in skeletal muscle due to insulin action. Therefore, glucose uptake activity in skeletal muscle is said to directly affect blood glucose level, and elucidation of its regulatory function is an important issue in diabetes research.
  • Glucose uptake in skeletal muscle is performed by a protein called glucose transporter (G 1 uTransporter: G LUT) that penetrates the cell membrane 12 times. GLUT forms a family of highly homologous proteins, and the presence of GLUT 1 to GLUT 7 has been reported.
  • G 1 uTransporter G LUT
  • G LUT 1 and GL UT 4 are functionally expressed, and G LU T 1 is normally localized to the cell membrane and is thought to be involved in basic sugar uptake.
  • G LUT 4 is usually present in the intracellular microsomal fraction, but it moves to the cell membrane (translocation) and functions to incorporate extracellular sugar into the cell. It has been. Stimulation of skeletal muscle such as insulin and muscle contraction is known to translocate GL UT 4 and increase the rate of sugar uptake (Nesheret a 1., Am. J. Physio, 24 9: 02 2 6-2 3 2, 1 9 8 5).
  • Gq signal via GPCR (G-protein-coupled receptor) promotes GLUT 4 membrane translocation and sugar uptake.
  • GPCR G-protein-coupled receptor
  • GPCR is a seven-transmembrane receptor that performs intracellular signal transduction through the activation of a coupled G protein (G protein: guaninenu c-'leotide—binding protein) and when the activity of the receptor.
  • Agonist is a physiologically active substance such as various hormones, neurotransmitters, etc.
  • G-proteins that are conjugated to receptors are activated by binding of these ligands to specific receptors.
  • the activated G protein activates further downstream signal transduction pathways and transmits information
  • G protein conjugated to GP CR is a trimeric protein and its ⁇ subunit Depending on the type of signal, the signal to be transmitted differs, and the subunit is classified into four families: G s, G i, G q, and G 12.
  • the signal transmitted to the G q subunit is downstream.
  • Phospholipase C Activated it is known to cause intracellular calcium mobilization.
  • G LUT 4 Contact Yopi PAF p 1 ate 1 et- activatingfactor
  • IAP I slet — activating protein
  • PI 3— kinase P inhibitors W rtmannin
  • PKC inhibitors PKC inhibitors
  • P 2 Y 2 is a GPCR (accession # BC 0 2 8 1 3 5) is one of the GPCR families belonging to AT P of the purine receptors P 2 Fuami Li one to ligand. In the P 2 family, an ion channel P 2 X family has also been identified.
  • the P 2 Y 2 receptor is a Gi- and G q-coupled GPCR and its ligands are UTP and ATP.
  • GP CR specifically expressed in skeletal muscle is G LU We thought it could be a signal for T4 membrane translocation and promotion of sugar uptake.
  • ⁇ 1 Expression of all GPCRs except for factoy GPCR Approximately 3 70 types of expression From the results of the analysis, GPCRs that were specifically highly expressed in human and mouse skeletal muscle were examined. As a result, P 2 Y 2 was identified as a GPCR that is highly expressed in both human and mouse skeletal muscle.
  • m 2 ⁇ expression level of ⁇ 2 ⁇ 2 receptor increases in myoblasts from myoblasts to myotube cells in C 2 C 12 cells.
  • An increase in the mRNA expression level of the P 2 Y 2 receptor accompanying this differentiation was also confirmed in rat skeletal muscle-derived cell L 6.
  • Specific and high expression of P 2 Y 2 receptor in skeletal muscle, ⁇ 2 agonists promote glucose uptake in mouse myotubes, and insulin-independent GLUT 4 by G q signal This suggests that the P 2 Y 2 receptor may be directly involved in sugar uptake in skeletal muscle.
  • G LUT 4 is strongly expressed stably expressed was the rat skeletal muscle-derived cells L 6 in [rho 2 Upsilon 2 receptor, glucose uptake by AT P is a ligand of the [rho 2 Upsilon 2 receptor
  • ATP that is, P 2 Y 2 agonist-specific promotion of sugar uptake was confirmed, and further research was conducted to complete the present invention.
  • a hypoglycemic agent comprising a compound that promotes the activity of a receptor protein or a salt thereof or a salt thereof;
  • a hypoglycemic agent comprising a compound that promotes expression of a receptor protein or a salt thereof or a salt thereof;
  • a blood glucose-elevating agent comprising a compound that inhibits the activity of a receptor protein or a salt thereof or a salt thereof;
  • a hyperglycemic agent comprising a compound or a salt thereof that inhibits expression of a gene for a P 2 Y 2 receptor protein or a salt thereof;
  • ⁇ 2 ⁇ 2 receptor protein or salt thereof is a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or a partial peptide or salt thereof Agent according to claims 1 to 8;
  • Antihyperglycemic agent comprising a polynucleotide comprising a polynucleotide encoding a receptor protein or a partial peptide thereof;
  • Prevention of diabetes, obesity or hyperlipidemia ⁇ The agent according to claim 11, which is a therapeutic agent;
  • the polynucleotide encoding the receptor protein is a polynucleotide having the same or substantially the same base sequence as the base sequence represented by SEQ ID NO: 2. 1 Agent described in 2;
  • An antihyperglycemic agent comprising a receptor protein or a partial peptide thereof or a salt thereof;
  • [1 6] ⁇ 2 ⁇ 2 A protein or its partial peptide, wherein the receptor protein or a salt thereof contains the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • An agent for increasing blood glucose comprising an antisense polynucleotide containing a base sequence complementary to or substantially complementary to the base sequence of a polynucleotide encoding a receptor protein or a part thereof ; [1 8] The agent according to claim 17, which is a hypoglycemia prevention / treatment agent;
  • P 2 Y 2 encoding receptor protein polynucleotide is SEQ ID NO: a nucleotide sequence the same or substantially the same base sequence represented by to 1 7 claims a polynucleotide having free 1 agent according to 8;
  • An antihyperglycemic agent comprising an antibody against a receptor protein or a salt thereof;
  • [2 2] ⁇ 2 ⁇ 2 A protein or its partial peptide or a peptide thereof, wherein the receptor protein or a salt thereof contains the amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the agent according to claim 20 which is a salt;
  • ⁇ 2 ⁇ 2 receptor protein or a salt thereof is a skeletal muscle ⁇ 2 ⁇ 2 receptor protein or a salt thereof;
  • [2 9] ⁇ 2 ⁇ 2 A method for screening a compound that regulates blood glucose or a salt thereof, characterized by using a polynucleotide encoding a receptor protein;
  • the polynucleotide encoding the receptor protein is SEQ ID NO:
  • the screening method according to claim 29, which is a polynucleotide having the same or substantially the same nucleotide sequence as the nucleotide sequence represented by No. 2:
  • [3 1] characterized by containing a polynucleotide encoding a P 2 Y 2 receptor protein ', a kit for screening a compound that regulates blood glucose or a salt thereof;
  • ⁇ 2 ⁇ 2 which comprises using the receptor protein or a salt thereof, ⁇ 2 ⁇ 2 receptor protein or screening method Agonisu bets to salts thereof;
  • [3 4] (1) ⁇ the 2 Upsilon 2 receptor protein or a labeled ligand or a salt of a salt thereof, and when contacted with the protein or a salt thereof, (2) test compound and [rho 2 Upsilon 2 receptor When a labeled ligand of a body protein or a salt thereof or a salt thereof is contacted with the protein or a salt thereof,
  • the screening method according to claim 32 or 33 wherein the amount of binding between the labeled ligand of the 2 2 receptor protein or a salt thereof or a salt thereof and the protein or the salt thereof is measured. ;
  • [3 5] (1) ⁇ the 2 Upsilon 2 receptor protein or a labeled ligand or a salt of a salt thereof, and when contacted with a cell or a cell membrane fraction containing the protein, (2) test compound the and [rho 2 Upsilon 2 receptor protein or a labeled ligand or a salt of a salt thereof, in the case also cells containing the protein is in contact with the cell membrane fraction, [rho 2 Upsilon 2 receptor protein or its A binding amount of a ligand labeled with a salt or a salt thereof and a cell containing the protein or a cell membrane fraction thereof is measured.
  • Receptor protein or its salt ligand or its salt It is characterized by measuring a cell stimulating activity via a P 2 Y 2 receptor protein when a test compound is brought into contact with a cell containing the protein or its cell membrane fraction in the presence or absence.
  • [4 1] A method for lowering blood glucose characterized by promoting the activity of P 2 Y 2 receptor protein or a salt thereof;
  • [4 2] ⁇ 2 ⁇ 2 A method for lowering blood glucose, characterized by promoting expression of a receptor protein or a salt thereof;
  • [4 5] A method for increasing blood glucose characterized by inhibiting the activity of ⁇ 2 ⁇ 2 receptor protein or a salt thereof;
  • a method for lowering blood glucose comprising administering to a mammal an effective amount of a compound or a salt thereof that promotes expression of a receptor protein or a salt thereof;
  • [5 3] ⁇ 2 ⁇ 2 A method for increasing blood glucose, comprising administering to a mammal an effective amount of a compound that inhibits the activity of a receptor protein or a salt thereof or a salt thereof;
  • [5 4] ⁇ 2 ⁇ 2 A method for increasing blood glucose, comprising administering to a mammal an effective amount of a compound or salt thereof that inhibits expression of a receptor protein or a salt thereof;
  • ⁇ 2 ⁇ 2 receptor protein or a salt thereof is according to claim 5 7, or 5 8, wherein the skeletal muscle [rho 2 Upsilon 2 receptor ⁇ white matter or a salt thereof; [60] The use according to any one of claims 57 to 59, wherein the hypoglycemic agent is a method for preventing / treating diabetes, obesity or hyperlipidemia;
  • hyperglycemic agent is a hypoglycemia prevention / treatment agent
  • FIG. 1 shows the expression of mRN ⁇ in the top 40 GP CCR species in human or mouse skeletal muscle.
  • Figure 2 represents the expression distribution of P 2Y 2 mRN ⁇ .
  • FIG. 3 represents the expression of P 2 Y 2 mRNA in 'myoblast differentiation'.
  • FIG. 4 represents sugar uptake induced by ATP in rat myoblasts L 6 -S G 4 -81.
  • the P 2 Y 2 receptor protein used in the present invention is a receptor protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • ⁇ 2 ⁇ 2 receptor protein can be used in any cell (eg, spleen cell, nerve, etc.) of, for example, human mammals (eg, guinea pigs, rats, mice, rabbits, pigs, hidges, bushes, monkeys, etc.).
  • human mammals eg, guinea pigs, rats, mice, rabbits, pigs, hidges, bushes, monkeys, etc.
  • Cells glial cells, knee ⁇ cells, knees Langerhans islets, bone marrow cells, mesangial cells, Langerhans cells, epidermal cells, epithelial cells, endothelial cells, fibroblasts, fibrocytes, muscle cells, fat Cells, immune cells (eg, macrophages, T cells, B cells, natura 3 killer cells, mast cells, neutrophils, basophils, eosinophils, monocytes), megakaryocytes, synovial cells, cartilage Cells, bone cells, osteoblasts, osteoclasts, breast cells, hepatocytes or stromal cells, or progenitors of these cells, stem cells or cancer cells) or blood cells, or their Any tissue in which cells are present, for example, brain, brain regions (eg, olfactory bulb, cephalic nucleus, basal sphere, hippocampus, hypothalamus, hypothalamic nucleus, cerebral cortex, medulla, cerebellum, occip
  • the amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is, for example, about 85% or more, preferably 90% or more, more preferably, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • Examples include amino acid sequences having about 95% homology.
  • the amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is mouse P 2 Y 2 (P 2 U) (Gen Bank Accession No. LI 4 7 5 1; SEQ ID NO: 3), rat P 2 Y 2 (P 2 U) (Gen Bank Accession No. U 0 9 4 0 2; SEQ ID NO: 4), and the like.
  • Examples of the protein containing the amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 of the present invention include an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • a protein having substantially the same activity as the protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is preferred.
  • the activity of substantially the same quality examples include ligand binding activity and signal information transmission action. With substantially the same quality, their activity is sex Qualitatively the same quality. Therefore, the ligand binding activity and the activity such as Danal signal transduction are equivalent (eg, about 0.1 to 100 times, preferably about 0.5 to 2 times Q, more preferably Is preferably about 0.5 to 2 times), but the degree of these activities may be different in quantitative factors such as the molecular weight of protein.
  • Measurement of activities such as ligand binding activity and signal signal transduction can be performed according to a method known per se, for example, it can be measured according to a screening method described later.
  • the P 2 Y 2 receptor protein includes: a) 1 or 2 or more (preferably about 1 to 30 and more preferably 1 to 10) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. Degree, more preferably several (1-5) amino acid sequences lacking amino acids, b) 1 or more amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 1 (preferably 1 to An amino acid sequence to which about 30 amino acids, more preferably about 1 to 10 amino acids, and more preferably several (1 to 5) amino acids are added; c) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 1 or 2 or more (preferably about 1 to 30 amino acids, more preferably about 1 to 10 amino acids, more preferably several (1 to 5)) amino acids substituted with other amino acids Sequence, or d) Proteins containing amino acid sequences that combine them are also used. I can.
  • the P 2 Y 2 receptor protein has a left end at the heel end (amino end) and a right end at the C end (carboxyl end) in accordance with the convention of peptide labeling.
  • R in the ester e.g., methyl, Echiru, n- propyl, isopropyl also properly n - C w alkyl group such as heptyl, if example embodiment, consequent opening pentyl, C 3 _ 8 consequent such hexyl consequent opening mouth
  • Anorekinore group for example, Fuweniru, 'alpha - C 6, such as naphthyl - 12 Ariru group, for example, Ben Phenyl, phenethyl and other phenyl C 2 alkyl groups or monomethyl naphthyl such as phenylmethyl C 7 — 14 aralkyl groups and other viva commonly used as an oral ester
  • a royloxymethyl group is used.
  • the P 2 Y 2 receptor protein has a carboxyl group (or carboxylate) other than the C-terminus
  • a protein in which the carboxyl group is amidated or esterified is also used in the present invention. 2 Included in receptor protein.
  • the ester in this case, for example, the above-mentioned C-terminal ester is used.
  • [rho 2 Upsilon 2 The receptor protein, in the protein described above, Amino group protecting groups Mechionin residues of ⁇ -terminus (e.g., C chi _ 6 such as formyl group, C 2 _ 6 Arukanoiru group such Asechiru That are protected with an acyl group, etc., a dartamyl group that is cleaved in vivo on the heel side, and a dartamine-oxidized amino acid, a substituent on the side chain of an amino acid in the molecule (for example, protection _ SH, Amino group, Lee imidazole group, fin d'groups, etc.
  • C chi _ 6 such as formyl group
  • a dartamyl group that is cleaved in vivo on the heel side and a dartamine-oxidized amino acid, a substituent on the
  • Guanijino group appropriate protecting groups (e.g., formyl group, etc. C w Ashiru group such as C 2 _ 6 Arukanoi Le group such Asechiru) Or a complex protein such as a so-called glycoprotein to which a sugar chain is bound.
  • appropriate protecting groups e.g., formyl group, etc.
  • C w Ashiru group such as C 2 _ 6 Arukanoi Le group such Asechiru
  • a complex protein such as a so-called glycoprotein to which a sugar chain is bound.
  • the partial peptide of the P 2 Y 2 receptor protein may be any partial peptide of the above-mentioned ⁇ 2 ⁇ 2 receptor protein S, for example, ⁇ 2 ⁇ 2 receptor Among protein molecules of body proteins, those that are exposed to the outside of the cell membrane and have substantially the same receptor binding activity are used.
  • the partial peptide of ⁇ 2 ⁇ 2 receptor protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is an extracellular region (hydrophilic site) in the hydrophobic plot analysis. And a peptide containing the analyzed portion. A peptide partially containing a hydrophobic site can also be used. Peptides containing individual domains can also be used, but peptides that contain multiple domains simultaneously may be used.
  • the number of amino acids in the partial peptide of the present invention is at least 20 or more, preferably 50 or more, more preferably 100 or more of the constituent amino acid sequences of the acceptor protein of the present invention described above. Peptides having the above amino acid sequence are preferred. ⁇ .
  • the partial peptide used in the present invention lacks one or more (preferably about 1 to 10, more preferably several (1 to 5)) amino acids in the above amino acid sequence.
  • one or more amino acids are added to the amino acid sequence (preferably about 1 to 20, more preferably about 1 to 10, more preferably several (1 to 5)).
  • one or more (preferably about 1 to 10, more preferably several, more preferably about 1 to 5) amino acids in the amino acid sequence are substituted with other amino acids. You can do it.
  • the C-terminus is either a carboxyl group (one COOH), canolepoxylate (one COOO—), an amide (one CONH 2 ) or an ester (one COOR). It ’s okay.
  • the partial peptide used in the present invention has a carboxyl group (or carboxylate) in addition to the C-terminus, those in which the carboxyl group is amidated or esterified are also used in the present invention. Included in peptides.
  • the ester in this case, for example, the above C-terminal ester or the like is used.
  • the amino acid group of the methionine residue at the heel end is protected with a protecting group, and the heel end side is in vivo.
  • G 1 ⁇ cleaved by cleaved by pyroglutamine oxidation, substituents on the side chains of amino acids in the molecule are protected with appropriate protecting groups, or so-called sugar peptides with sugar chains attached Also includes complex peptides.
  • the salt include physiologically acceptable salts with acids or bases, and physiologically acceptable acid addition salts are particularly preferable.
  • examples of such salts include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid), or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, malein). Acid, succinic acid, tartaric acid, citrate, malic acid, succinic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid) and the like are used.
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid
  • organic acids eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, malein.
  • the P 2 Y 2 receptor protein or salt thereof used in the present invention can be produced from the above-described human mammalian cells or tissues by a known method for purifying receptor protein, and will be described later. It can also be produced by culturing a transformant containing DN 2 that codes for 2 2 receptor protein. Moreover, it can also be produced according to the protein synthesis method described later or this.
  • a commercially available resin for protein synthesis can be used.
  • resins include black methyl resin, hydroxymethyl resin, benzhydrylamine resin, aminomethyl resin, 4-benzyloxybenzyl alcohol resin, 4-methylbenzhydrylamine resin, ⁇ ⁇ ⁇ resin, 4 -Hydroxymethylmethyl phenylamide methyl resin, polyacrylamide resin, 4_ (2 ', 4, dimethyoxyphenylhydroxymethyl) phenoxy resin, 4 (2', 4'dimethyoxyphenyru F moc (Aminoethyl) phenoxy resin and the like.
  • an amino acid having an ⁇ -amino group and a side chain functional group appropriately protected is condensed on the resin according to various known condensation methods according to the sequence of the target protein.
  • Anti At the end of the reaction, the protein is cut out from the resin and at the same time, various protecting groups are removed, and an intramolecular disulfide bond forming reaction is performed in a highly diluted solution to obtain the target protein or its amide.
  • calpositimides include DCC, N, N′-diisopropylcarbodiimide, N-ethyl-N, mono (3-dimethylaminoprolyl) carbodiimide, and the like.
  • the ability to add a protected amino acid directly to the resin together with a racemization-suppressing additive, such as HOB t, HOOB t, or a symmetric anhydride or HOB t ester is a HOOB t ester Can be added to the resin after activation of the protected amino acid in advance.
  • the solvent used for the activation of the protected amino acid and the condensation with the resin may be appropriately selected from solvents known to be usable for the protein condensation reaction.
  • solvents known to be usable for the protein condensation reaction For example, N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, acid amides such as N-methylpyrrolidone, halogenated hydrocarbons such as methylene chloride and chlorohonolem, and trifnoreo oral ethanol Alcohols such as mono-ole, sulfoxides such as dimethyl sulfoxide, ethers such as pyridine, dioxane and tetrahydrofuran, -tolyls such as acetonitrile and propio-tolyl, methyl acetate and ethyl acetate Esters or appropriate mixtures thereof are used.
  • the reaction temperature is appropriately selected from a range known to be used for protein bond forming reaction, and is usually selected appropriately from a range of about ⁇ 20 ° C. to 50 ° C.
  • Activated amino acid derivatives are usually used in excess of 1.5 to 4 times.
  • Examples of protecting groups for the amino group of the raw material include Z, Boc, tertiary pentinorexinoreboninore, isobonorenoreoxycarboninore, and 4-methoxypendinoreoxycanorepo.
  • Nyl C 1-1 Z, B 1-- Z, adamantyl 'oxycanolebonyl, trifnoleoloacetinore, phthaloidol, honoreminore, 2-12 trophenylsnofenenore, dipheninorephosphinothioinore, F moc Etc. are used.
  • the carboxyl group is, for example, alkyl esterified (for example, methyl, ethinole, propyl, petitenole, tert-butinole, cyclopentinole, cyclohexyl, cycloheptinole, succulent cutinore, 2-adamantinore, etc.
  • alkyl esterified for example, methyl, ethinole, propyl, petitenole, tert-butinole, cyclopentinole, cyclohexyl, cycloheptinole, succulent cutinore, 2-adamantinore, etc.
  • the hydroxyl group of selenium can be protected by, for example, esterification or etherification.
  • the group suitable for esterification include a group derived from carbonic acid such as a lower alkyl group such as acetyl group, an aryl group such as benzoyl group, a benzyloxycarbonyl group, and a ethoxycarbonyl group. Used.
  • groups suitable for etherification include a benzyl group, a tetrahydrobiranyl group, and a t-butyl group.
  • Examples of the protecting group for the phenolic hydroxyl group of tyrosine include B z 1, C l 2 — B zl, 2-nitrite benzyl, B r— Z, and tertiary butyl.
  • Examples of the protecting group for imidazole of histidine include Tos, 41-Methoxy-1, 2,3-, 6-trimethylbenzene sulphononiole, DNP, benzenoreoxymethyl, B um, B oc, T rt, F moc, etc. are used.
  • Examples of the activated carboxyl group of the raw material include ⁇ "corresponding acid anhydride, azide, active ester [alcohol (eg, pentac oral phenol, 2, 4, 5 — trichlorophenol). , 2,4-dinitrophenol, cysomethino alcohol, norani trofenore, HONB, N-hydroxy succinide, N-hydroxy phthalenolide, ester with HOB t) etc.
  • As the activated amino group for example, a corresponding phosphate amide is used.
  • Examples of methods for removing (eliminating) protecting groups include catalytic reduction in a hydrogen stream in the presence of a catalyst such as Pd-black or Pd-carbon, and anhydrous hydrogen fluoride and methanesulfone.
  • Acid treatment with acid, ⁇ rifroleoromethane sulfonic acid, trifluoroacetic acid, or a mixture of these, base treatment with diisopropylpropylamine, triethylamine, piperidine, piperazine, etc., and sodium in liquid ammonia Reduction with hum is also used.
  • the elimination reaction by the acid treatment is performed at a temperature of about 120 ° C. to 40 ° C.
  • anisole for example, anisole, phenol, thioanisole, methazolesole, norac Addition of cation scavengers such as resorenoles, dimethinolesnore, 1,4-butanedithionore, 1,2-ethanedithionore is effective.
  • cation scavengers such as resorenoles, dimethinolesnore, 1,4-butanedithionore, 1,2-ethanedithionore is effective.
  • the 2,4-dinitophenyl phenyl group used as an imidazole protecting group for histidine was removed by thiophenol treatment
  • the formyl group used as an indole protecting group for tryptophan was the above 1,2-ethanedithiol, 1, 4
  • it can also be removed by alkaline treatment with dilute sodium hydroxide solution or dilute ammonia.
  • the protection of the functional group that should not be involved in the reaction of the raw material, the protecting group, the removal of the protecting group, the activation of the functional group involved in the reaction, etc. can be appropriately selected from known groups or known means.
  • the ⁇ -stroxyl group of a carboxyl terminal amino acid is amidated to be protected, After extending the peptide (protein) chain to the desired chain length on the non-group side, remove only the N-terminal ⁇ -amino protecting group of the peptide chain and the C-terminal carboxyl protecting group.
  • the removed protein is produced, and both proteins are condensed in a mixed solvent as described above.
  • the details of the condensation reaction are the same as described above.
  • all the protecting groups are removed by the above method to obtain the desired crude protein.
  • This crude protein can be purified using various known purification means, and the main fraction can be freeze-dried to obtain an amide of the desired protein.
  • ester of a protein for example, the a-carboxyl group of the carboxy terminal amino acid is condensed with a desired alcohol to form an amino acid ester, and then the ester of the desired protein is obtained in the same manner as the protein amide. Can be obtained.
  • the partial peptide of P 2 Y 2 receptor protein or a salt thereof used in the present invention is produced according to a known peptide synthesis method or by cleaving ⁇ 2 ⁇ 2 receptor protein with an appropriate peptidase. be able to.
  • a peptide synthesis method for example, either a solid phase synthesis method or a liquid phase synthesis method may be used. That, [rho 2 Upsilon 2 receptor protein by condensing portion Bae flop tides or amino acids and the remaining portion may constitute, when the product Ru-which have a protecting group for the purposes of Bae by leaving a protective group Peptide can be manufactured. Examples of known condensation methods and protecting group removal include the methods described in a) to e) below.
  • the partial peptide of the present invention can be purified and isolated by combining ordinary purification methods, for example, solvent extraction 'distillation' color chromatography / liquid chromatography / recrystallization.
  • solvent extraction 'distillation' color chromatography / liquid chromatography / recrystallization When the partial peptide obtained by the above method is a free form, it can be converted into an appropriate salt by a known method. Conversely, when it is obtained as a salt, it is released by a known method. Can be converted into a body.
  • the polynucleotide encoding the P 2 Y 2 receptor protein used in the present invention contains the base sequence encoding D 2 2 receptor protein (D 2 or RNA, preferably DNA). Anything can be used.
  • the polynucleotide is a DNA encoding a P 2 Y 2 receptor protein, an RNA such as mRNA, and may be double-stranded or single-stranded. In the case of double-stranded DNA, double-stranded DNA, double-stranded RNA or DN A: RNA hybrid may be used. In the case of a single strand, it may be a sense strand (ie, a code strand) or an antisense strand (ie, a non-coding strand).
  • Examples of the DNA encoding the P 2 Y 2 receptor protein used in the present invention include genomic DNA, genomic DNA library, cDNA derived from the cells / tissues described above, and cDNA library derived from the cells / tissues described above. Any of synthetic DNA may be used.
  • the vector used for the library may be any of bacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like. Further, it can also be directly amplified by reverse transcriptase polymerase chain reaction (hereinafter abbreviated as RT-PCR method) using a total RNA or mRNA fraction prepared from the above-mentioned cell tissue.
  • RT-PCR method reverse transcriptase polymerase chain reaction
  • D ⁇ ⁇ ⁇ encoding the P 2 Y 2 receptor protein used in the present invention is, for example, DNA containing a base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or represented by SEQ ID NO: 2.
  • a P 2 Y receptor protein consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and a base sequence that is complementary to the base sequence and a base sequence that is hybridized under highly stringent conditions; Any DNA may be used as long as it encodes a receptor protein having substantially the same quality of activity (eg, ligand binding activity, signal signaling, etc.).
  • the DNA that can hybridize with the base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 is, for example, about 85% or more, preferably about 90% or more, with the base sequence represented by SEQ ID NO: 2. More preferably, a DNA containing a nucleotide sequence having a homology of about 95% or more is used.
  • DNA that can be hybridized with a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 is mouse P 2 Y 2 (P 2 U) (Gen Bank Acession No L 1 4 7 5 1; SEQ ID NO: 5), Rat P 2 Y 2 (P 2 U) (Gen Bank Accession No. U 0 9 4 0 2; SEQ ID NO: 6) It is done.
  • Hybridization can be performed according to a known method or a method similar thereto, for example, the method described in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). . Moreover, when using a commercially available library, it can be carried out according to the method described in the attached instruction manual. More preferably, it can be carried out according to highly stringent conditions.
  • the high stringent conditions include, for example, a sodium concentration of about 19 to 40 mM, preferably about 19 to 20 mM, and a temperature of about 50 to 70 ° C, preferably about 60 to 6 Indicates conditions at 5 ° C.
  • a sodium concentration of about 19 to 40 mM, preferably about 19 to 20 mM
  • a temperature of about 50 to 70 ° C, preferably about 60 to 6 Indicates conditions at 5 ° C.
  • the sodium concentration is about 19 mM and the temperature is about 65 ° C.
  • D ⁇ ⁇ ⁇ encoding the human P 2 Y 2 receptor protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is DN A containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 2. Etc. are used.
  • the polynucleotide containing a part of the base sequence of DN ⁇ ⁇ ⁇ encoding the P 2 Y 2 receptor protein used in the present invention includes not only the DNA encoding the partial peptide of the present invention described below. Including RNA Used to mean.
  • an antisense polynucleotide capable of inhibiting the replication or expression of a P 2 Y 2 receptor protein gene is used as a clone of DN ⁇ ⁇ ⁇ encoding ⁇ 2 ⁇ 2 receptor protein. It is possible to design and synthesize based on the base sequence information obtained or determined.
  • a polynucleotide can be hybridized with the RNA of the P 2 Y 2 receptor protein gene and can inhibit the synthesis or function of the RNA, or the P 2 Y 2 receptor protein. It is possible to regulate and control the expression of P 2 Y 2 receptor protein gene through the interaction with RN ⁇ ⁇ related to.
  • Polynucleotides that can be specifically hybridized with polynucleotides that are complementary to selected sequences of ⁇ 2 ⁇ 2 receptor proteins, R ⁇ ⁇ ⁇ , and RNAs associated with P 2 Y 2 receptor proteins are are useful for modulating 'controls the expression of [rho 2 Upsilon 2 receptor protein gene in vivo Contact Yopi vitro, also useful for the treatment or diagnosis of diseases.
  • the term “corresponding” means homologous to or complementary to a specific sequence of nucleotides, base sequences or nucleic acids including genes.
  • “Corresponding” between a nucleotide, nucleotide sequence or nucleic acid and peptide (protein) usually refers to the amino acid of the peptide (protein) in the instruction derived from the sequence of the nucleotide (nucleic acid) or its complement. ing. ⁇ 2 ⁇ 2 receptor protein gene 5, end hairpin loop, 5 'end 6 — base pair' repeat, 5, end untranslated region, polypeptide translation initiation codon, protein coding region, ORF translation stop codon 3 'end untranslated region, 3' end palindromic region, opium 3, and end hairpin loop can be selected as preferred target regions, but any region within the P 2 Y 2 receptor protein gene can be selected as target. sell.
  • the relationship between the target nucleic acid and a polynucleotide that can be hybridized to be complementary to at least a part of the target region can be said to be “antisense J”.
  • Polyoxyribonucleotides containing Doxyribose, Polyribonucleotides containing D-ribose, Purine or Pyridine Other types of polynucleotides that are N-glycosides of the midine base; tides, or other polymers with non-nucleotide backbones (eg, commercially available protein nucleic acids and synthetic sequence-specific nucleic acid polymers) or other containing special linkages (However, the polymer contains a nucleotide having a configuration that allows attachment of a base as found in DNA or RNA).
  • RNA hybrids DNA: RNA hybrids, and unmodified polynucleotides (or unmodified oligonucleotides).
  • nucleotide-modified eg with uncharged bonds (eg methinorephosphonate, phosphotriestenole, phosphonoreamidate, carpamate, etc.), charged bond or sulfur-containing Have binding (eg phosphorothioate, phosphorodithioate, etc.), eg proteins (nucleases, nucleases' inhibitors, Toxins, antibodies, signal peptides, poly-L-lysine, etc.) and sugars (for example, monosaccharides), etc., and side-current groups (eg, acridine, psoralen, etc.) Those containing chelating compounds (eg metals, radioactive metals, boron, oxidizing metals, etc.), those containing alkylating agents, those with
  • nucleoside may include those containing not only purine and pyrimidine bases but also other modified heterocyclic bases. Such modifications may include methylated purines and pyrimidines, acylated purines and pyrimidines, or other heterocycles. Modified nucleotides and modified nucleotides may also be modified at the sugar moiety, eg, one or more hydroxyl groups are replaced by halogens, aliphatic groups, etc. Or may be converted to a functional group such as ether or amine.
  • the antisense polynucleotide (nucleic acid) of the present invention is RNA, DNA, or modified nucleic acid (RNA, DNA).
  • modified nucleic acids include, but are not limited to, nucleic acid sulfur derivatives, thiophosphate derivatives, and those that are resistant to degradation of polynucleoside amide nucleoside amides. It is not something.
  • the antisense nucleic acid of the present invention can be preferably designed according to the following policy. That is, make the antisense nucleic acid more stable in the cell, increase the cell permeability of the antisense nucleic acid, increase the affinity for the target sense strand, and if it is toxic This makes the antisense nucleic acid less toxic.
  • the antisense nucleic acid of the present invention may be altered or contain modified sugars, bases and bonds, provided in special forms such as ribosomes, microspheres, applied by gene therapy, or added.
  • it can be used in an additional form as a polycationic substance such as polylysine, which acts to neutralize the charge of the phosphate group skeleton, enhance the interaction with the cell membrane, or incorporate nucleic acid.
  • examples include lipids that increase the amount of crude water (for example, phospholipids, cholesterol, etc.).
  • Preferred lipids to be added include cholestadiol and its derivatives (eg, cholesteryl chloroformate, cholesteric acid, etc.).
  • nucleic acids include the 3 'end or 5' of nucleic acids.
  • Other groups are specifically located at the 3' or 5 'end of the nucleic acid. It is a base for capping to prevent degradation by nucleases such as exonuclease and RNase. Can be mentioned. Examples of the group for capping include, but are not limited to, hydroxyl protecting groups known in the art, including glycols such as polyethylene glycol and tetraethylene glycol. . .
  • the inhibitory activity of the antisense nucleic acid is examined using the transformant of the present invention, the in vivo or in vitro gene expression system of the present invention, or the in vivo or in vitro translation system of the G protein-coupled receptor protein. Can do.
  • the nucleic acid can be applied to cells by various known methods.
  • the DN ⁇ ⁇ ⁇ encoding the partial peptide of the P 2 Y 2 receptor protein used in the present invention is any as long as it contains a base sequence encoding the partial peptide used in the present invention. May be.
  • any of genomic DNA, genomic DNA library, cDNA derived from the above-described cell 'tissue, cDNA library derived from the above-described cell / tissue, and synthetic DNA may be used.
  • the vector used for the library may be any of bacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like.
  • it can be directly amplified by RT_PCR using a mRNA prepared from the above-mentioned cell tissue.
  • the DNA encoding the partial peptide of the P 2 Y 2 receptor protein used in the present invention is, for example, (1) a partial base of D ⁇ ⁇ having the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 (2) having a sequence, or (2) having a base sequence that is complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 and a base sequence that hybridizes under high stringency conditions, and represented by SEQ ID NO: 1
  • the DN ⁇ ⁇ ⁇ that has is used.
  • Examples of DNA that can be hybridized with a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 include, for example, about 85% or more of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, 'preferably about 90% Or more, more preferably about 95% DNA containing a base sequence having the above homology is used.
  • DN ⁇ ⁇ that completely encodes P 2 Y 2 receptor protein or its partial peptide can be used.
  • the hybridization method can be carried out according to the method described in Molecular Cloning, 2nd u iambrook et al., Cold Spring Harbor Lao. Press, 1989). In addition, when using a commercially available library, it can be performed according to the method described in the attached instruction manual.
  • Substitution of DNA base sequence can be done by using PCR or known kits such as Mu tan TM -super Express Km (Takara Shuzo Co., Ltd.), Mu tan TM Ichi K (Takara Shuzo Co., Ltd.), etc. It can be performed according to a known method such as DA-LAPCR method, Gapped duplex method, Kunkel method or the like, or a method analogous thereto.
  • D ⁇ ⁇ which encodes the cloned P 2 Y 2 receptor protein can be used as it is depending on the purpose, or it can be digested with a restriction enzyme or added with a linker as desired.
  • the DNA may have ATG as a translation initiation codon on the 5 ′ end side, and may have TAA, TGA, or TAG as a translation termination codon on the 3 ′ end side. These translation initiation codons and translation termination codons can also be added using an appropriate synthetic DNA adapter.
  • the expression vector for P 2 Y 2 receptor protein is, for example: (ii) excising the desired DNA fragment from DNA encoding ⁇ 2 ⁇ 2 receptor protein, and (mouth) placing the DN ⁇ fragment in an appropriate expression vector. Linked downstream of the promoter Can be manufactured.
  • the vectors include plasmids derived from E. coli (eg, p BR 3 2 2, p BR 3 25, p UC 12 2, p UC 1 3), and plasmids derived from Bacillus subtilis (eg, p UB 110, p TP 5, p C 1 9 4.), plasmids derived from yeast (eg, p SHI 9, p SH 15), pacteriophages such as ⁇ phage, animal winoles such as retro winoles, vaccinia winores
  • p A l—11, p XT l, p R c ZCMV, p R c / RSV, pc DNA l / Neo, etc. are used.
  • the promoter used in the present invention may be any promoter as long as it is suitable for the host used for gene expression.
  • S Ra promoter, S V 40 promoter, L TR promoter, CMV promoter, H S V -TK promoter and the like can be mentioned.
  • CMV promoter, an SR promoter or the like it is preferable to use.
  • the host When the host is Escherichia, trp promoter, lac promoter, rec A promoter, LPL promoter, lpp promoter, etc.
  • the host When the host is Bacillus, SPO promoter, SP
  • the host When the host is an enzyme such as 02 promoter or pen P promoter, PH05 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter, etc. are preferable.
  • the host is an insect cell, a polyhedrin promoter, P10 promoter, etc. are preferred.
  • expression vectors include enhancers, splicing signals, poly A addition signals, selectable markers, SV 40 replication origin (hereinafter sometimes abbreviated as SV 40 ori), etc. What is contained can be used.
  • a selection marker one, for example, dihydrofolate reductase (hereinafter sometimes abbreviated as dhfr) gene [main source preparative Rekise preparative (MTX) resistance], ampicillin resistant gene (hereinafter, the Am p r Neomycin resistance gene (hereinafter, Neo r) May be abbreviated as G 4 18 resistance).
  • the target gene when used as a selection marker using (J HO (dhfr-) cells, the target gene can also be selected by using a medium that does not contain thymidine.
  • a signal sequence is added to the N-terminal side of the receptor protein of the present invention.
  • the host is a bacterium belonging to the genus Escherichia, Pho A ⁇ signal sequence, Om p A ⁇ signal sequence, etc.
  • the host is an animal cell, such as ⁇ -amylase ⁇ signal sequence, subtilisin 'signal sequence, etc.
  • the host is yeast, MF a ⁇ signal sequence, SUC 2 ⁇ signal sequence, etc. Insulin signal sequence, ct-interferon signal sequence IJ, antibody molecule / signal sequence, etc. can be used.
  • a transformant can be produced by using the thus constructed vector containing DN ⁇ encoding the P 2 Y 2 receptor protein of the present invention.
  • the host for example, Escherichia bacteria, Bacillus bacteria, yeast, insect cells, insects, animal cells, etc. are used.
  • a specific example of the genus Escherichia is Escherichia coli K 1 2 ⁇ D ⁇ 1 [Procedures ⁇ The ⁇ National ⁇ The Power Demi-'op ⁇ Sciences ⁇ (Proc. Natl. Acad. Sci.
  • Bacillus spp. include Bacillus subtilis MI 1 1 4 [gene, 2 4 ⁇ , 2 5 5 (1 9 8 3)], 2 0 7 — 2 1 'Journal of Biochemistry, 9 5 ⁇ , 8 7 (1 9 8 4)], etc. are used.
  • yeast include Saccharqmyces cerevisiae AH 2 2, AH 2 2 R- ' ⁇ A 8 7— 1 1 A, DKD— 5 D, 2 OB— 1 2, Schizosaccharomyces bomb ( Schizosaccharomyces pombe) NCYC 1 9 1 3, NCYC 2 0 3 6 and Pichia pastoris.
  • insect cells for example, when the virus is Ac NPV, larvae-derived strains of larvae (Spodoptera frugiperda cell; Sf cells), MG 1 cells derived from the midgut of Trichoplusia ni, Trichoplusia ni High Five TM Itoda vesicles derived from eggs, Hozuki moon sac from Mamestra brassicae, or cells derived from Estigmena acrea are used.
  • the virus is BmNPV, cocoon-derived cell lines (Bombyxmori N; B mN cells) are used.
  • S f cells include S f 9 cells (ATCCCRL 1711), S f 21 cells (hereinafter, Vaughn, JL et al., In Vivo, 13, 213-217, (1977). ) Etc. are used.
  • insects for example, silkworm larvae are used [Maeda et al., Nature, 3 1 5 ⁇ , 5 9 2 (1 9 8 5)].
  • animal cells examples include monkey cell CO S-7, V ero, Chinese hamster cell CHO (hereinafter abbreviated as CHO cell), dhfr gene-deficient Chinese hamster cell C HO (hereinafter CHO (dhfr)) Abbreviated cells), mouse L cells, mouse At T-20, mouse myeloma cells, rat GH 3, human FL cells, and the like.
  • Insect cells or insects can be transformed, for example, according to the method described in Bio / Technology, 6, 47-55 (1988).
  • a liquid medium is suitable as a medium used for the culture, including a carbon source necessary for the growth of the transformant, Nitrogen sources, inorganic substances, etc. can be included.
  • carbon sources include 'glucose, dextrin, soluble starch, sucrose, etc.
  • nitrogen sources include ammonium salts, nitrates, corn stee' liquor, peptone, casein, meat extract.
  • inorganic or organic substances and inorganic substances such as soybean meal and potato extract include calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, and magnesium chloride.
  • yeast extract, vitamins, growth promoting factors and the like may be added.
  • the pH of the medium is preferably about 5-8.
  • M 9 medium containing glucose and casamino acids For example, M 9 medium containing glucose and casamino acids [Miller, Journal 'Ob'Exeper in Molecular Molecular Genes (Journal) of Experiments in Molecular Genetics), 4 3 1 — 4 3 3, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1 9 7 2].
  • a drug such as 3in ⁇ or rilatalylic acid can be added.
  • the culture is usually carried out at about 15 to 43 ° C for about 3 to 24 hours, and if necessary, aeration or agitation can be added.
  • the culture is usually carried out at about 30 to 40 ° C for about 6 to 24 hours, and if necessary, aeration or agitation can be added.
  • examples of the culture medium include, but are not limited to, Burkholder I / J, medium [Bostian, KL, et al., Proc. ⁇ Sciences ⁇ The ⁇ USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 7 7 4, 4 5 0 5 (1 9 8 0)] and SD media containing 0.5% casamino acid [ Bitter, GA et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 8 1 ⁇ , 5 3 3 0 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 1 9 8 4)].
  • the pH of the medium is preferably adjusted to about 5-8. Incubate at approximately 20 ° C to 35 ° C for approximately 24 to 7 to 2 hours, with aeration and agitation as necessary.
  • the medium When cultivating a transformant whose host is an animal cell, the medium may be, for example, a MEM medium containing about 5 to 20% fetal bovine serum [Science, 1 2 2 ⁇ , 5 0 1 (1 9 5 2)], DMEM medium [Virology, 8 ⁇ , 3 9 6 (1 9 5 9)], R PM I 1 6 4 0 medium [Journal of 'The' American 'Medical' Association (The Journal of the American Medical Association) 1 9 9 ⁇ , 5 1 9 (1 9 6 7)], 1 9 9 Medium [Proceeding of the Society (Proceeding of the Society) for the Biological Medicine), 7 3 ⁇ , 1 (1 9 5 0)].
  • 11 is preferably about 6-8.
  • Cultivation is usually performed at about 30 ° C to 40 ° C for about 15 to 60 hours, with aeration and agitation as necessary.
  • the P 2 Y 2 receptor protein of the present invention can be produced in the cell, in the cell membrane or outside of the transformant.
  • [rho 2 Upsilon 2 receptor protein is extracted culture or cells or found to be used in the present invention, after cultivation, collected bacteria or cells by a known method, suspended in a suitable buffer solution, super waves, fungus body ⁇ Rui such as by lysozyme and / or freeze-thaw then disrupted cells, a method of obtaining a crude extract of more [rho 2 Upsilon 2 receptor protein to a centrifugal separation or filtration is appropriately used.
  • the buffer solution may contain a protein denaturing agent such as urea or guanidine hydrochloride, or a surfactant such as Triton (registered trademark) X-100.
  • Purification of the ⁇ 2 receptor protein contained in the culture supernatant or the extract thus obtained can be performed by appropriately combining known separation and purification methods.
  • These known separation and purification methods include mainly molecular weights such as methods that utilize solubility, such as salting-out solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and SDS-polyatalylamide gel electrophoresis.
  • Method using difference in charge method using difference in charge such as ion exchange chromatography, method using specific newness such as affinity chromatography, difference in hydrophobicity such as reversed-phase high-performance liquid chromatography
  • a method using the difference in isoelectric point such as isoelectric focusing.
  • the P 2 Y 2 receptor protein obtained in this way is obtained in free form, it can be converted to a salt by a known method or a method analogous thereto, and conversely In some cases, it can be converted to a free form or other salt by a known method or a method analogous thereto.
  • ⁇ 2 ⁇ 2 receptor protein produced by the recombinant may be arbitrarily modified or partially removed by allowing an appropriate protein-modifying enzyme to act before or after purification. You can also.
  • protein modifying enzymes include trypsin, chymotribsin, arginyl endopeptidase, protein kinase, and glycosidase.
  • the activity of the 2 2 receptor protein produced in this way can be measured by a binding experiment with a labeled ligand and an enzyme immunoassay using a specific antibody.
  • Antibodies against [rho 2 Upsilon 2 receptor protein used in the present invention if an antibody capable of recognizing the need is [rho 2 Upsilon 2 receptor protein use in the present invention, polyclonal antibodies, be any of the monoclonal antibodies Good.
  • the antibody against the 2 2 receptor protein used in the present invention can be produced according to a known antibody or antiserum production method using the 2 2 receptor protein as an antigen.
  • the P 2 Y 2 receptor protein used in the present invention is administered to a mammal at a site where antibody production is possible by administration, together with a carrier or a diluent.
  • a carrier or a diluent In order to enhance the antibody-producing ability upon administration, complete Freund adjuvant or incomplete Freund adjuvant may be administered. Administration is usually once every 2 to 6 weeks, for a total of 2 to 10 times. Examples of mammals to be used include monkeys, rabbits, dogs, guinea pigs, mice, rats, hidges, and goats, but mouse rats are preferably used.
  • the temperature of the immunized antigen Select individuals with antibody titers from blood animals such as mice, collect spleen or lymph nodes 2-5 days after the last immunization, and fuse antibody-producing cells contained in them with myeloma cells
  • a monoclonal antibody-producing hybridoma can be prepared.
  • the antibody titer in the antiserum can be measured, for example, by reacting the labeled receptor protein described below with the antiserum and then measuring the activity of the labeling agent bound to the antibody.
  • the fusion operation can be carried out according to known methods, for example, the method of Kohler and Milstein [Nature, 2 56 6, pp. 4 95 (1 97 5)].
  • the fusion promoter include polyethylene glycol (PEG) and Sendai virus, but preferably PEG is used.
  • myeloma cells examples include NS-1, P 3 U 1 and SP 2/0, and P 3 U 1 is preferably used.
  • the preferred ratio between the number of antibody producing cells (spleen cells) and the number of myeloma cells is about 1: 1 to 20 : 1, and PEG (preferably P EG 100 00 to PEG 60 00) Is added at a concentration of about 10 to 80%, and cell fusion is carried out efficiently by incubating at about 20 to 4 ° C, preferably about 30 to 37 ° C for about 1 to 10 minutes. it can.
  • a solid phase eg, a microplate
  • a receptor protein antigen is adsorbed directly or with a carrier
  • Add the supernatant and then add anti-immunoglobulin antibody labeled with a radioactive substance or enzyme (if the cells used for cell fusion are mice, use anti-mouse immunoglobulin antibody) or protein A.
  • RPMI 16 40 medium containing 1 to 20%, preferably 10 to 20% fetal bovine serum :!
  • a GIT medium (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) containing ⁇ 10% fetal bovine serum or a serum-free medium for culturing Hypridoma (SFM-101, Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) can be used.
  • the culture temperature is usually 20 to 40 ° C, preferably about 37 ° C.
  • the culture time is usually 5 days to 3 weeks, preferably 1 to 2 weeks.
  • Culture can usually be performed under 5% carbon dioxide.
  • the antibody titer of the hybridoma culture supernatant can be measured in the same manner as the antibody titer in the antiserum described above.
  • Monoclonal antibodies can be separated and purified by immunoglobulin separation and purification methods (eg, salting-out method, alcohol precipitation method, isoelectric precipitation method, electrophoresis method, ion exchanger).
  • immunoglobulin separation and purification methods eg, salting-out method, alcohol precipitation method, isoelectric precipitation method, electrophoresis method, ion exchanger.
  • DEAE adsorption / desorption method, ultracentrifugation method, gel filtration method, antigen binding solid phase or active adsorbent such as protein A or protein G
  • the polyclonal antibody of the present invention can be produced by a known method or a method analogous thereto. For example, a complex of an immunizing antigen (P 2 Y 2 receptor protein antigen) and a carrier protein is prepared, and a mammal is immunized in the same manner as in the production of the monoclonal antibody described above. It can be produced by collecting an antibody-containing substance against the ⁇ 2 ⁇ 2 receptor protein used in the invention and separating and purifying the antibody.
  • P 2 Y 2 receptor protein antigen an immunizing antigen
  • carrier protein a mammal is immunized in the same manner as in the production of the monoclonal antibody described above. It can be produced by collecting an antibody-containing substance against the ⁇ 2 ⁇ 2 receptor protein used in the invention and separating and purifying the antibody.
  • the type of carrier protein and the mixing ratio of carrier and hapten are the antibodies against the hapten immunized by cross-linking the carrier.
  • any ratio can be cross-linked as long as it can be efficiently processed.
  • rosin serum albumin ushisailogrobulin, keyhole limpet, mosianin, etc.
  • a method is used in which the hapten 1 is coupled at a ratio of about 0.1 to 20 and preferably about 1 to 5.
  • various condensing agents can be used for hapten and carrier force printing, such as active aldehyde reagent containing aldehyde aldehyde, maleimide active ester, thiol group, and dithiobilidyl group. Used.
  • the condensation product is administered to a warm-blooded animal either at the site where antibody production is possible, or with a carrier or diluent.
  • a carrier or diluent In order to enhance the antibody-producing ability upon administration, complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered. Administration can be performed about once every 2 to 6 weeks, usually about 3 to 10 times in total.
  • Polyclonal antibodies can be collected from blood, ascites, etc. of mammals immunized by the above method, preferably blood.
  • the polyclonal antibody titer in the antiserum can be measured in the same manner as the above-described measurement of the antibody titer in the serum.
  • the separation and purification of the polyclonal antibody can be performed according to the same method for separating and purifying the immunoglobulin as the above-described separation and purification of the monoclonal antibody.
  • [rho 2 Upsilon 2 receptor protein C-terminal peptide or antibody that recognizes a salt thereof for example, [rho 2 Upsilon 2 receptor protein C-terminal peptide or antibody that recognizes a salt thereof (in particular, monoclonal Antibody).
  • the 2 2 receptor protein used in the present invention is highly expressed particularly in skeletal muscle.
  • the DNA encoding the P 2 Y 2 'receptor protein used in the present invention can be used as a medicine such as ⁇ or a hypoglycemic agent.
  • D Nyuarufa encoding [rho 2 Upsilon 2 receptor protein used in the present invention are, for example, diabetes mellitus, impaired glucose tolerance, ketosis, acidosis, diabetic neuropathy, diabetic nephropathy, diabetic Retinopathy, hyperlipidemia, obesity, metabolic syndrome, sexual dysfunction, skin disease, arthropathy, osteopenia, arteriosclerosis, blood plug disease, dyspepsia, memory learning disorder, etc. preferably used for diabetes be able to. Diabetes includes insulin-dependent (type I) diabetes and non-insulin-dependent (type II) diabetes.
  • the DN 2 encoding the 2 2 receptor protein used in the present invention can be formulated according to conventional means.
  • DNA encoding the P 2 Y 2 receptor protein when used as the above-mentioned hypoglycemic agent, the DNA alone or retrovirus vector, adenovirus vector, adenovirus associated virus vector After inserting into an appropriate vector such as, it can be carried out according to conventional means.
  • the DNA can be used as it is or with an auxiliary agent for promoting intake. Therefore, it can be administered.
  • DNA encoding the P 2 Y 2 receptor protein used in the present invention is orally administered as a tablet, capsule, elixir, mic mouth capsule, etc. It can be used parenterally in the form of sterile solutions with water or other pharmaceutically acceptable liquids or injections such as suspensions.
  • known carriers, flavoring agents, excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders, etc. that are physiologically recognized as D 2 ⁇ ⁇ ⁇ encoding the ⁇ 2 ⁇ 2 receptor protein used in the present invention
  • D 2 ⁇ ⁇ ⁇ encoding the ⁇ 2 ⁇ 2 receptor protein used in the present invention can be prepared by mixing in the unit dosage forms required for accepted formulation practice.
  • the amount of active ingredient in these preparations is such that an appropriate volume within the indicated range can be obtained.
  • Additives that can be incorporated into tablets, force-pellants, etc. include, for example, binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, gum arabic, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin
  • binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, gum arabic
  • excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin
  • a swelling agent such as alginic acid, a lubricant such as magnesium stearate, a sweetening agent such as sucrose, lactose or saccharine, a flavoring agent such as peppermint, squid mono oil or tea.
  • a liquid carrier such as fats and oils can be further contained in the above type of material.
  • Sterile compositions for injection should be treated according to normal formulation practices such as dissolving or suspending active substances in vehicles such as water for injection, naturally occurring vegetable oils such as sesame oil, coconut oil, etc. Can do.
  • aqueous solution for injection for example, physiological saline, isotonic solutions containing glucose and other adjuvants (for example, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.) are used.
  • Soluble solubilizers such as alcohol (eg, ethanol), polyalcohol (eg, propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactants (eg, polysorbate 80 TM, HCO- 50) You can use it together.
  • the oily liquid for example, sesame oil, soybean oil and the like are used, and may be used in combination with solubilizing agents such as benzyl benzoate and benzyl alcohol.
  • solubilizing agents such as benzyl benzoate and benzyl alcohol.
  • the hypoglycemic agent include, for example, a buffer (for example, phosphate buffer, sodium acetate buffer), a soothing agent (for example, benzalkonium chloride, hydrochloride pro-in), and a stabilizer (for example, , Human serum albumin, polyethylene glycol, etc.), preservatives (eg, benzyl alcohol, phenol, etc.), antioxidants, etc.
  • the prepared injection solution is usually filled in a suitable ampoule.
  • the preparations obtained in this way are safe and have low toxicity.
  • human mammals eg rats, mice, rabbits, hidges, pigs, tusks, cats, dogs, monkeys, etc.
  • the dose of DNA encoding the P 2 Y 2 receptor protein used in the present invention varies depending on the administration target, target organ, symptoms, administration method, etc. In the case of 60 kg, it is about 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg per day.
  • the single dose varies depending on the subject of administration, target organ, symptom, administration method, etc.
  • the single dose varies depending on the subject of administration, target organ, symptom, administration method, etc.
  • the single dose varies depending on the subject of administration, target organ, symptom, administration method, etc.
  • the single dose varies depending on the subject of administration, target organ, symptom, administration method, etc.
  • the single dose varies depending on the subject of administration, target organ, symptom, administration method, etc.
  • about 0.1 to 30 mg per day, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to: LO mg is administered by intravenous injection. It is convenient to do.
  • an amount converted per 60 kg can
  • P 2 Y 2 receptor protein or its partial base peptide used in the present invention Anchisensuporinukureochidoma for DN Alpha encoding [rho 2 Upsilon 2 receptor protein used in the present invention for the P 2 Y 2 receptor protein
  • the antibody can be used as a medicine such as a clot raising agent.
  • [rho 2 Upsilon when there are excessive patients of 2 receptor protein a) ⁇ 2 ⁇ 2 antibody to the receptor protein itself or P 2 Y 2 receptor protein is administered to the patient the [rho 2 Upsilon 2 receptor B) an antisense polynucleotide against DN ⁇ ⁇ ⁇ that encodes the P 2 Y 2 receptor protein.
  • the amount of P 2 Y 2 receptor protein in the patient's body is decreased, and receptor function is normalized. can do.
  • antisense polynucleotides against ⁇ 2 ⁇ 2 receptor protein or partial peptides, DN ⁇ ⁇ ⁇ encoding ⁇ 2 ⁇ 2 receptor protein, or antibodies to P 2 Y 2 receptor protein are safe and low toxic. It is useful as a blood glucose raising agent.
  • the present invention is used in [rho 2 Upsilon 2 receptor protein or its parts partial peptide, antisense poly quinuclidine Reochi de or P for DN Alpha encoding
  • [rho 2 Upsilon 2 receptor protein used in the present invention An antibody against 2 Y 2 receptor protein can be used, for example, for hypoglycemia.
  • the DNA alone, retrovirus vector, adenovirus vector, adenovirus association is used as the above-mentioned blood glucose-elevating agent.
  • DNA can be administered as is or with an adjunct to facilitate uptake through a catheter, such as a gene gun or a high-mouth gel catheter.
  • P 2 Y 2 antibody to the receptor protein antisense polynucleotide or P 2 Y 2 receptor protein to DN Alpha encoding are tablets which may be sugar coated as necessary, capsules, elixirs, microcapsules Le It can be used orally as an agent, or parenterally in the form of a sterile solution with water or other pharmaceutically acceptable liquid, or an injection such as a suspension.
  • a known carrier, flavoring agent, and enhancer that is physiologically recognized as an antisense polynucleotide for D 2 ⁇ ⁇ that encodes a 2 2 receptor protein or an antibody for P 2 2 receptor protein used in the present invention.
  • Generally accepted with form, vehicle, preservatives, stabilizers, binders, etc. Can be made by mixing in the unit dosage form required for the implementation of the formulated product. The amount of active ingredient in these preparations is such that an appropriate volume within the indicated range can be obtained.
  • Additives that can be mixed into tablets, capsules, etc. include, for example, binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, gum arabic, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, For example, a swelling agent such as gelatin or alginic acid, a lubricant such as magnesium stearate, a sweetening agent such as sucrose, lactose or saccharin, a flavoring agent such as peppermint, cocoa oil or chili is used.
  • a liquid carrier such as fats and oils can be further contained in the above type of material.
  • Sterile compositions for injection should be treated according to normal pharmaceutical practice, such as dissolving or suspending active substances in vehicles such as water for injection, naturally produced vegetable oils such as sesame oil and coconut oil. Can do.
  • aqueous solution for injection for example, physiological saline, isotonic solutions containing glucose and other adjuvants (for example, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.) are used.
  • Dissolving aids for example, alcohol (eg, ethanol), polyalcohol (eg, propylene dallicol, polyethylene glycol), nonionic surfactant (eg, polysorbate 80 TM , HCO- 50) Do it anyway.
  • oily liquid for example, sesame oil, soybean oil and the like are used, and they may be used in combination with solubilizing agents such as benzyl benzoate and benzyl alcohol.
  • solubilizing agents such as benzyl benzoate and benzyl alcohol.
  • the blood glucose-elevating agent include a buffer (for example, phosphate buffer, sodium acetate buffer), a soothing agent (for example, benzalkonium chloride, hydrochloride pro-in), and a stabilizer (for example, , Human serum albumin, polyethylene glycol, etc.), preservatives (eg, benzyl alcohol, phenol, etc.), antioxidants, etc.
  • the prepared injection solution is usually filled in a suitable ampoule.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic.
  • humans such as mammals (eg rat, mouse, rabbit, hidge, pig, ushi, Cats, dogs, monkeys, etc.).
  • Antisense polynucleotide against DN ⁇ ⁇ ⁇ encoding P 2 Y 2 receptor protein used in the present invention The dose varies depending on the administration subject, target organ, symptom, administration method, etc.
  • administration for example, in hypoglycemic patients (as 60 kg), generally about 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1. 0 to 20 mg.
  • the single dose varies depending on the subject of administration, target organ, symptom, administration method, etc.
  • hypoglycemic patients 60 kg
  • about 0.1 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg per day is administered by intravenous injection. Is convenient. In the case of other animals, an amount converted per 6 O kg can be administered.
  • the dose of the antibody against the P 2 Y 2 receptor protein used in the present invention varies depending on the administration subject, target organ, symptom, administration method, etc., but in the case of oral administration, generally, for example, hypoglycemia In a patient (as 60 kg), it is about 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg per day.
  • the single dose varies depending on the subject of administration, target organ, symptoms, administration method, etc.
  • a hypoglycemic patient 60 (in kg)
  • about 0.1 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg is administered intravenously per day. Is convenient.
  • an amount converted per 60 kg can be administered.
  • the dose of the P 2 Y 2 receptor protein used in the present invention varies depending on the administration subject, target organ, symptom, administration method, and the like.
  • patients with hypoglycemia (As 0 kg) is about 0.1 to 1: OO mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg per day.
  • dosing once The amount varies depending on the administration subject, target organ, symptom, administration method, etc.
  • it is usually about 0.00 per day in a hypoglycemic patient (as 60 kg).
  • an amount converted per 60 kg can be administered.
  • the DN ⁇ ⁇ ⁇ encoding the P 2 Y 2 receptor protein used in the present invention can be used as a prop for humans or mammals (eg rat, mouse, rabbit, hidge, pig, ushi, Cats, dogs, monkeys, etc.) can detect an abnormality (gene abnormality) in DNA or mRNA encoding the P 2 Y 2 receptor protein or its partial peptide used in the present invention. It is useful as a genetic diagnostic agent for damage, mutation or reduction of expression of DNA or mRNA, increase of DNA or mRNA, or excessive expression.
  • mammals eg rat, mouse, rabbit, hidge, pig, ushi, Cats, dogs, monkeys, etc.
  • the above-described genetic diagnosis using the DNA encoding the P 2 Y 2 receptor protein used in the present invention is, for example, the known Northern hybridization using the PCR-SSCP method (Genomics, No. 1). 5 ⁇ , 8 7 4-8 7 9 (1 9 8 9), Proceedings of the National Academy, Op The National, Power Demi 1 Ob, Sciences 'Ob' USA of Sciences of the United States oi America;, pp. 86, pp. 2 706-2 770 (1 9 8 9)).
  • the P 2 Y 2 receptor protein used in the present invention when a decrease in the expression of the P 2 Y 2 receptor protein used in the present invention is detected by Northern hyperpridition, for example, it is related to dysfunction of the ⁇ 2 ⁇ 2 receptor protein used in the present invention. It can be diagnosed that the disease is highly likely or is likely to be affected in the future. In addition, when overexpression of the ⁇ 2 ⁇ 2 receptor protein used in the present invention is detected by Northern hyperprecipitation, for example, it is used in the present invention. It can be diagnosed that the disease is likely caused by overexpression of the P 2 Y 2 receptor protein, or is likely to be affected in the future.
  • diseases associated with dysfunction of ⁇ 2 ⁇ 2 receptor protein used in the present invention include diabetes, impaired glucose tolerance, keto-cissis, acidosis, diabetic neuropathy, diabetic nephropathy, diabetic retinopathy, Examples include hyperlipidemia, obesity, metabolic syndrome, sexual dysfunction, skin disease, arthropathy, osteopenia, arteriosclerosis, thrombotic disease, dyspepsia, memory learning disorder.
  • diseases caused by overexpression of [rho 2 Upsilon 2 receptor proteins are found used in the present invention include, for example, hypoglycemia.
  • the antibodies of the present invention is capable of specifically recognizing the [rho 2 Upsilon 2 receptor protein, quantification of [rho 2 Upsilon 2 receptor protein in a test fluid, especially, for quantification by Sanditsuchi immunoassay can do.
  • the antibody of the present invention is competitively reacted with a test solution and a labeled P 2 Y 2 receptor protein, and the labeled ⁇ 2 ⁇ 2 receptor protein bound to the antibody is A method for quantifying ⁇ 2 ⁇ 2 receptor protein in a test solution, characterized by measuring a ratio;
  • one antibody is an antibody that recognizes the heel end of the P 2 Y 2 receptor protein and the other antibody is an antibody that reacts with the C terminus of the ⁇ 2 ⁇ 2 receptor protein. It is desirable that
  • the [rho 2 Upsilon 2 can perform quantification of [rho 2 Upsilon 2 receptor protein with monoclonal antibodies to the receptor protein Ho force tissue staining or the like.
  • the antibody molecule itself may be used, or the F (ab ′) 2 , Fab, or Fab fraction of the antibody molecule may be used.
  • the method for quantifying the P 2 Y 2 receptor protein using the antibody of the present invention is not particularly limited, and an antibody corresponding to the amount of antigen in the solution to be measured (for example, ⁇ 2 ⁇ 2 receptor protein mass).
  • any method can be used as long as the amount of antigen or antibody-antigen complex is detected by chemical or physical means, and this is calculated from a standard curve prepared using a standard solution containing a known amount of antigen.
  • the measurement method described above may be used.
  • a nephrometry, a competition method, an immunometric method and a sandwich method are preferably used, but the sandwich method described below is particularly preferable in terms of sensitivity and specificity.
  • Examples of the labeling agent used in the measurement method using the labeling substance include radioisotopes, enzymes, fluorescent substances, and luminescent substances.
  • radioisotope for example, [ 125 I], [ 131 I], [ 3 H], [ 14 C] and the like are used.
  • enzyme a stable enzyme having a large specific activity is preferable.
  • / 3-galactosidase, _darcosidase, alkaline phosphatase, peroxidase, phosphonate dehydrogenase and the like are used.
  • As the fluorescent material for example, fluorescamine, fluorescein isothiocyanate and the like are used.
  • luminescent substance for example, luminol, luminol derivatives, luciferin, lucigenin and the like are used.
  • a piotin-avidin system can be used for the binding between the antibody or antigen and the labeling agent.
  • ⁇ ⁇ 2 ⁇ 2 receptor protein when a decrease in the concentration of 2 2 ⁇ 2 receptor protein is detected by quantifying the concentration of P 2 ⁇ Y 2 receptor protein using the antibody of the present invention, for example, ⁇ ⁇ 2 ⁇ 2 receptor It can be diagnosed that the disease is related to dysfunction of body protein, or is likely to be affected in the future. Further, when increasing concentrations of [rho 2 Upsilon 2 receptor protein is detected, for example, is a disease caused by overexpression of [rho 2 Upsilon 2 receptor protein, or likely to suffer future Can be diagnosed.
  • the diseases associated with dysfunction of the ⁇ 2 ⁇ 2 receptor protein of the present invention include: diabetes, glucose tolerance, ketosis, acidosis, diabetic neuropathy, diabetic nephropathy, diabetic retinopathy Hyperlipidemia, obesity, metabolic syndrome, sexual function Disorders, skin diseases, arthropathy, osteopenia, arteriosclerosis, thrombotic diseases, dyspepsia, memory learning disorders, etc.
  • diseases caused by overexpression of the P 2 Y 2 receptor protein of the present invention include hypoglycemia.
  • test compound is administered at the same time as the drug or physical stress, and after a certain period of time after administration (30 minutes to 3 days, preferably 1 hour to 2 days, more preferably 1 hour to 2 4 hours later), the amount of mRNA in the P 2 Y 2 receptor protein contained in the cells can be quantified and analyzed.
  • the test compound is mixed in the medium and cultured for a certain period of time (after 1 day to 7 days, preferably after 1 day to 3 days, more preferably after 2 days to 3 days later), it can be carried out by quantifying and analyzing the amount of mRN of the P 2 Y 2 receptor protein contained in the transformant.
  • the compound obtained by using the screening method of the present invention or a salt thereof is a compound having an action of changing the expression level of the P 2 Y 2 receptor protein used in the present invention.
  • (I) [rho 2 Upsilon 2 receptor protein, [rho 2 Upsilon mediated cell stimulating activities 2 receptor protein (e.g., Arakidon acid release, Asechirukorin release, intracellular C a 2+ release, cell Activity that promotes or suppresses intracellular cAMP generation, intracellular cGMP generation, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c-fos activation, pH reduction, etc.
  • the compound that changes the expression level of the P 2 Y 2 receptor protein of the present invention obtained by the above screening method can be used for a disease associated with dysfunction of ⁇ 2 ⁇ 2 receptor protein. .
  • the expression level of [rho 2 Upsilon 2 receptor protein of the present invention is increased, a compound that enhances the cell stimulating activity, against diseases associated with functional insufficiency of [rho 2 Upsilon 2 receptor protein of the present invention It is useful as a hypoglycemic agent.
  • the expression level of [rho 2 Upsilon 2 receptor protein of the present invention reduces, compounds that decrease the cell-stimulating activity is safe and low toxic for diseases caused by overexpression of [rho 2 Upsilon 2 receptor protein of the present invention It is useful as a blood glucose raising agent.
  • the diseases associated with dysfunction of the [rho 2 Upsilon 2 receptor protein of the present invention diabetes, impaired glucose tolerance, ketosis, acidosis, diabetic neuropathy, diabetic nephropathy, diabetic retinopathy, high Examples include lipemia, obesity, metabolic syndrome, sexual dysfunction, skin disease, arthropathy, osteopenia, arteriosclerosis, thrombotic disease, dyspepsia, memory learning disorder.
  • diseases caused by overexpression of [rho 2 Upsilon 2 receptor protein of the present invention include, for example, hypoglycemia.
  • salts of the compounds include physiologically acceptable acids (eg, inorganic acids, organic acids, etc.) and bases (eg, alkali metals such as sodium and potassium; alkaline earth metals such as calcium), etc. And physiologically acceptable acid addition salts are particularly preferred.
  • physiologically acceptable acid addition salts are particularly preferred.
  • examples of such salts include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid). Salts with acid, succinic acid, tartaric acid, citrate, malic acid, succinic acid, benzoic acid, methane sulfonic acid, benzene sulfonic acid, etc.).
  • the compound obtained by using the screening method of the present invention or a salt thereof is used as a pharmaceutical composition
  • it can be formulated according to conventional means.
  • the compound may be used orally as tablets, capsules, elixirs, microcapsules, etc. with sugar coating as required, or with water or other pharmaceutically acceptable liquids.
  • It can be used parenterally in the form of an injectable solution such as a sterile solution or suspension.
  • injectable solution such as a sterile solution or suspension.
  • the amount of active ingredient in these preparations is such that an appropriate volume within the indicated range is obtained.
  • additives examples include gelatin, corn starch, tragacanth, binders such as gum arabic, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, and alginic acid.
  • a leavening agent such as magnesium stearate, a sweetening agent such as sucrose, lactose or saccharin, a flavoring agent such as peppermint, cocoa oil, or cherry is used.
  • a liquid carrier such as fats and oils can be further contained in the above type of material.
  • Sterile compositions for injection should be treated according to normal formulation practices such as dissolving or suspending active substances in vehicles such as water for injection, naturally occurring vegetable oils such as sesame oil, coconut oil, etc. Can do.
  • aqueous solution for injection for example, physiological saline, isotonic solutions containing glucose and other adjuvants (for example, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.) are used.
  • Suitable solubilizers such as alcohol (eg, ethanol), polyalcohol (eg, propylene glycol, polyethylene dallicol), nonionic surfactants (eg, polysorbate 80 TM , HCO-50), etc. You may use together.
  • the oily liquid examples include sesame oil and soybean oil, which may be used in combination with a solubilizing agent such as benzyl benzoate or benzyl alcohol.
  • the pharmaceutical composition includes, for example, a buffer (for example, a phosphate buffer, Sodium acetate buffer), soothing agent (eg, benzalkonium chloride, hydrochloride pro-in, etc.), stabilizer (eg, human serum albumin, polyethylene glycol, etc.), preserved IJ (eg, benzyl alcohol, phenol) Etc.), and may be blended with an antioxidant.
  • a buffer for example, a phosphate buffer, Sodium acetate buffer
  • soothing agent eg, benzalkonium chloride, hydrochloride pro-in, etc.
  • stabilizer eg, human serum albumin, polyethylene glycol, etc.
  • preserved IJ eg, benzyl alcohol, phenol
  • the prepared injection solution is usually filled in a suitable ampoule.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic.
  • they can be used in human mammals (eg rats, mice, rabbits, hidges, pigs, tusks, cats, dogs, monkeys, etc.). Can be administered.
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on the administration subject, target organ, symptom, administration method, etc., but in the case of oral administration, for example, in diabetic patients (as 6 O kg), About 0. per day! ⁇ 10 O mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg.
  • the single dose varies depending on the subject of administration, subject organ, symptoms, administration method, etc.
  • diabetic patients for example, diabetic patients (as 60 kg) , About 0.1 to 30 mg per day, preferably about 0.1:! To 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg is administered by intravenous injection. Is convenient. In the case of other animals, an amount converted per 60 kg can be administered.
  • an appropriate ⁇ 2 ⁇ 2 receptor protein fraction and a label are used.
  • Ligand is needed.
  • a labeled ligand As the labeled ligand, a labeled ligand, a labeled ligand analog compound, or the like is used. For example [3 H], [125 I], [14 C], [35 S] A ligand labeled with such as is used.
  • the 3 ⁇ 4 specifically, in performing the disk re one Eng compounds that alter the binding property between a ligand and P 2 Y 2 receptor protein, cells or cell containing first [rho 2 Upsilon 2 receptor protein membrane Prepare ⁇ 2 ⁇ 2 receptor protein preparation by suspending aliquots in a buffer suitable for screening.
  • any buffer can be used as long as it does not inhibit the binding of ⁇ 2 2 receptor protein such as ⁇ ⁇ 4 to 10 (preferably ⁇ ⁇ 6 to 8) phosphate buffer or Tris monohydrochloride buffer. But you can.
  • surfactants such as CHAP S, Tween -80 TM (Kaoichi Atlas), digitonin, and deoxycholate can be added to the buffer.
  • protease inhibitors such as PMS F, leupeptin, E-64 (manufactured by Peptide Institute) and pepstatin can be added for the purpose of suppressing degradation of receptors and ligands by protease.
  • a fixed amount (5 0 00 cpm to 5 OOOOO cpm) of labeled ligand is added to 0.01 ml to 10 ml of the receptor solution, and simultaneously 1 0— 4 M to 1 0_ 1Q M test compound Coexist.
  • the reaction is carried out at about 0 to 50 ° C., preferably about 4 to 37 ° C. for about 20 minutes to 24 hours, preferably about 30 minutes to 3 hours.
  • Another method for screening for a compound that changes the binding property between the ligand and the P 2 Y 2 receptor protein is, for example, cell stimulating activity via the ⁇ 2 ⁇ 2 receptor protein (eg, arachidon). Acid release, acetylcholine release, intracellular Ca2 + release, intracellular cAMP generation, intracellular cGMP generation, wild boar Tall phosphate production, cell membrane potential fluctuation, phosphorylation of intracellular protein, — fos activation, activity to promote or suppress pH reduction, etc. Especially, intracellular Ca 2+ concentration increasing activity, intracellular c The measurement is carried out using a known method or a commercially available measurement kit.
  • ⁇ 2 ⁇ 2 receptor protein eg, arachidon.
  • cells containing the P 2 Y 2 receptor protein of the present invention are cultured on a multiwall plate or the like. Before performing screening, replace with a fresh medium or an appropriate buffer that is not toxic to cells, add test compounds, etc., and incubate for a certain period of time. Quantify the resulting product according to the respective method. If it is difficult to produce a substance (for example, C 2+ , c AMP, etc.) that serves as an index of cell stimulating activity using a degrading enzyme contained in the cell, an inhibitor for the degrading enzyme is added to perform the assay. It's okay. Further, the activity such as cAMP production inhibition can be detected as a production inhibitory action on cells whose basic production amount has been increased with forskolin or the like.
  • a substance for example, C 2+ , c AMP, etc.
  • cells expressing an appropriate P 2 Y 2 receptor protein are required.
  • the cells expressing [rho 2 Upsilon 2 receptor protein, cells having a native-type [rho 2 Upsilon 2 receptor protein strains, such as the above recombinant [rho 2 Upsilon 2 cell lines expressing the receptor protein is desirable.
  • test compounds include peptides, proteins, non-peptide compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, and animal tissue extracts. These compounds are novel compounds. It may be a known compound.
  • [rho 2 Upsilon 2 receptor based on the protein atomic positions coordinate and ligand binding pocket of the active site of, compounds I designed to bind to the ligand binding pocket is preferably used.
  • Measurement of [rho 2 Upsilon 2 receptor protein located atomic coordinates and ligand binding pocket Bok of the active site of the leaves in be conducted using a known method or a method analogous thereto.
  • the specific evaluation method of whether the compound that changes the binding property between the ligand and the P 2 Y 2 receptor protein of the present invention is an agonist or an antagonist is the following (i) or (ii) Just follow.
  • test compound is contacted with a cell containing the P 2 Y 2 receptor protein of the present invention, and the above-mentioned cell stimulating activity is measured.
  • Test compounds that have the cell-stimulating activity is Agonisu preparative for [rho 2 Upsilon 2 receptor protein.
  • P 2 Y 2 receptor protein compounds that activate e.g., ligand
  • activate e.g., ligand
  • the [rho 2 Upsilon 2 receptor protein compounds and the test compounds was measured cell stimulating activity when contacted with a cell containing a [rho 2 Upsilon 2 receptor protein and compared.
  • [Rho 2 Upsilon 2 receptor protein test compound capable of decline the cell stimulating activity induced by the compound that activates the are antagonistic preparative for [rho 2 Upsilon 2 receptor protein.
  • Examples of the screening kit of the present invention include the following.
  • CHO cells expressing the [rho 2 Upsilon 2 receptor protein used in the present invention and passaged 1 2 well plates at 5 X 1 0 5 cells / well, 3 7. C, 5% C 0 2 , 95% air cultured for 2 days.
  • the compound obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention or a salt thereof is a compound having an action of changing the binding property between the ligand and the P 2 Y 2 receptor protein.
  • a compound having a cell stimulating activity via a G protein-coupled receptor so-called agonist for ⁇ 2 ⁇ 2 receptor protein
  • mouth a compound not having the cell stimulating activity (so-called, antagonists g) for [rho 2 Upsilon 2 receptor proteins, binding force between (c) a compound that potentiates the binding affinity of the ligand and the [rho 2 Upsilon 2 receptor protein, or
  • ligands and [rho 2 Upsilon 2 receptor protein Use a compound that reduces.
  • Examples of the compound include peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, and the like. These compounds may be novel compounds or known compounds.
  • the compounds may be filed with compounds designed based on the position of the atomic coordinates Oyopi ligand binding Boke' bets of the active site of the above-mentioned [rho 2 Upsilon 2 receptor protein.
  • Compound or its enhance binding force between Agonisu bets or ligand and [rho 2 Upsilon 2 receptor protein for disk re one Jung method or subscription one obtained using a Jung for kit
  • [rho 2 Upsilon 2 receptor protein of the present invention Salts, for example, diabetes, impaired glucose tolerance, ketosis, acidosis, diabetic neuropathy, diabetic nephropathy, diabetic retinopathy, hyperlipidemia, obesity, metabolic syndrome, sexual dysfunction, skin diseases, joints It can be used for diseases such as symptom, osteopenia, arteriosclerosis, thrombotic disease, indigestion, memory learning disorder, etc., and is preferably useful as a hypoglycemic agent for diabetes.
  • antagonists bets or Li ligand and [rho 2 Upsilon respect is [rho 2 Upsilon 2 receptor protein obtained using the disk Li one Jung method or kit for screening of the present invention.
  • a compound or its compound that decreases the binding power to the receptor protein This salt is useful, for example, as a blood glucose raising agent.
  • the compound obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention or a salt thereof is a compound or a salt thereof that changes the expression level of the P 2 Y 2 receptor protein.
  • Drugs such as other diabetes treatment agents, diabetic complication treatment agents, hyperlipidemia treatment agents, antihypertensive agents, anti-obesity agents, diuretics, chemotherapeutic agents, immunotherapy agents (hereinafter abbreviated as combination drugs) Can be used in combination.
  • the administration time of the compound obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention or a salt thereof and a concomitant drug is not limited, and these are administered simultaneously to the administration subject. May be administered after a time lag.
  • the dose of the concomitant drug can be appropriately selected based on the clinically used dose. Further, the compounding ratio of the compound obtained by using the screening method or screening kit of the present invention or a salt thereof and a concomitant drug should be appropriately selected depending on the administration subject, administration route, target disease, symptom, combination, etc. Can do. For example, when the administration subject is a human, to Agonisu sheet 1 part by weight In example embodiment, a combination drug 0.0 may Re Re for 1 to 1 0 0 parts by Q
  • the compound obtained by using the screening method or screening kit of the present invention or a salt thereof is used as the above pharmaceutical composition, it can be formulated according to conventional means.
  • the compound is sterilized orally as tablets, capsules, elixirs, microcapsules or the like with sugar coating as required, or with water or other pharmaceutically acceptable liquids. It can be used parenterally in the form of injections such as solutions or suspensions.
  • the compound in a unit dosage form generally required for practicing recognized formulations along with known physiologically recognized carriers, flavoring agents, excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders, etc. It can be produced by mixing. The amount of active ingredient in these preparations should be such that an appropriate volume within the indicated range is obtained. Additives that can be mixed into glazes, force-pellants, etc.
  • binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, arabic gum, excipients such as crystalline cellulose, corn starch , Gelatinizing agents such as alginic acid, lubricants such as magnesium stearate, sweeteners such as sucrose, lactose or saccharine, flavoring agents such as peppermint, cocoa oil or tea Used.
  • a liquid carrier such as fats and oils can be further contained in the above type of material.
  • Sterile compositions for injection should be treated according to normal pharmaceutical practice, such as dissolving or suspending active substances in vehicles such as water for injection, naturally occurring vegetable oils such as sesame oil, coconut oil, etc. be able to.
  • aqueous solution for injection for example, physiological saline, isotonic solutions containing buducose and other adjuvants (for example, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.) are used.
  • Suitable solubilizers such as alcohol (eg, ethanol), polyalcohol (eg, propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactants (eg, polysorbate 80 TM, HCO—50) You may use together.
  • alcohol eg, ethanol
  • polyalcohol eg, propylene glycol, polyethylene glycol
  • nonionic surfactants eg, polysorbate 80 TM, HCO—50
  • the above pharmaceutical composition includes, for example, a buffer (for example, phosphate buffer, sodium acetate buffer), a soothing agent (for example, benzalkonium chloride, hydrochloride pro-in, etc.), a stabilizer ( For example, human serum albumin, polyethylene glycol, etc.), preservatives (eg, benzyl alcohol, phenol, etc.), antioxidants, etc. may be added.
  • a buffer for example, phosphate buffer, sodium acetate buffer
  • a soothing agent for example, benzalkonium chloride, hydrochloride pro-in, etc.
  • a stabilizer for example, human serum albumin, polyethylene glycol, etc.
  • preservatives eg, benzyl alcohol, phenol, etc.
  • antioxidants etc.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic.
  • they can be used in human mammals (eg rats, mice, rabbits, hidges, pigs, tusks, cats, dogs, monkeys, etc.). Can be administered.
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on the administration subject, target organ, symptom, administration method, and the like.
  • sick patients about 0.1 to 10 O mg per day, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg.
  • the single dose varies depending on the subject of administration, subject organ, symptom, administration method, etc.
  • the single dose varies depending on the subject of administration, subject organ, symptom, administration method, etc.
  • the single dose varies depending on the subject of administration, subject organ, symptom, administration method, etc.
  • an injection for example, diabetic patients (as 6 O kg )
  • About 0.1 to 30 mg per day, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg is administered by intravenous injection. Is convenient.
  • an amount converted per 60 kg can be administered.
  • mRN A Messenger Ribonucleic acid
  • EDTA ethylenediamine tetraacetic acid
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • TC thiazolidine-4 (R) monocarboxamide group
  • substituents, protecting groups and reagents frequently used in the present specification are described below. Expressed with a number.
  • the amino acid sequence of the human P 2 Y 2 receptor protein used in the present invention is shown.
  • FIG. 2 shows the base sequence of cDNA encoding the human 2-2 receptor protein used in the present invention.
  • [SEQ ID NO: 6] Shows the base sequence of c D ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ encoding rat P 2 Y 2 .
  • Example 2 shows the base sequence of the upstream primer used in Example 2 for amplifying the human P 2 Y 2 region.
  • Example 2 shows the base sequence of the downstream primer used in Example 2 for amplifying the human 2 2 region.
  • Example 2 Used in Example 2, shows the base sequence of the probe for detecting amplification of human [rho 2 Upsilon 2 region. '
  • Example 2 shows the base sequence of an upstream primer used in Example 2 for amplifying the mouse 2 2 region.
  • Example 2 shows the base sequence of the downstream primer used in Example 2 for amplifying the mouse 2 2 region.
  • Example 2 shows the base sequence of a probe used in Example 2 for detecting amplification of the mouse 2 2 region.
  • the base sequence of the upstream primer used in Example 4 for amplifying the rat 2 2 region is shown.
  • Example 4 The base sequence of the downstream primer used in Example 4 for amplifying the rat 2 2 region is shown. [SEQ ID NO: 15] 'This shows the base sequence of the probe used in Example 4 for detecting the amplification of the rat P 2 Y 2 region.
  • Example 1 The present invention will be described in more detail with reference to examples below, but these do not limit the scope of the present invention.
  • Example 1
  • IH ygro (+) [Invitrogen; # V 8 7 0 2 0] is a transfer reagent, Lipofectamine 2 0 0 0 (Invitrogen was used according to the attached protocol) L 6 — SG 4— 8 1 Introduced into 3 7 ° (:, After 4 hours at 5% C_ ⁇ 2 conditions, 1 washed with the medium used during the seeding and 1 2 hour incubation at 3 7 ° C, 5% C_ ⁇ 2 conditions. After washing once with Mimim Essential Essential Medium containing 0.1% fatty acidfree BSA (Sigma) 3 7 in this medium. C and 5% C 0 2 conditions were cultured for 4 hours.
  • the TaqMan method is used to belong to a family of target G protein-coupled receptors, tyrosine kinases, ion channels, etc. in any human and mouse RNA sample.
  • the presence of gene-derived mRNA and the production amount thereof were quantified, and the expression levels of genes belonging to the family, such as target G protein-coupled receptor, tyrosine phosphorylase receptor, and ion channel, were analyzed.
  • target GPCR genes include ORL; Ml; M2; M3; M4; M5; Al; A2A; A2B; A3; A1A; aIB; aID; a2A; a2B; a2C; ⁇ 1; j32 3; ATI; AT2; BB1; BB2; bb3; Bl; B2; CBl; CB2; CCRl; CCR2; CCR3; CCR4; CCR5; CCR6; CCR7; CCR8; CCR9; CCR10; CXCRl; CXCR2; CXCR3; CXCR4; CXCR5 CX3CR1; XCRl; C3a; C5a; fMLP; CCKl; CCK2; CRF1; CRF2; Dl; D2; D3; D4; D5; ETA; ETB; GAL1; GAL2; GAL3; mglul; mglu2;
  • Amplification was performed using the following samples.
  • RNA derived from adult normal skeletal muscle (C 1 ontech) was purchased.
  • the mouse sample was C 5 7 B LZ 6 right femoral skeletal muscle removed,
  • Total I NA was prepared according to the manual of I sogen (Nitsubon Gene).
  • I sogen Neitsubon Gene
  • a serially diluted solution of synthesized cDNA of the amplification region was used.
  • the amplification of the region of human P 2 Y 2 mRN was performed using the upstream primer (SEQ ID NO: 7) and the downstream primer (SEQ ID NO: 8). Detection was performed using a probe (SEQ ID NO: 9) (Applied Biosystems Japan Co., Ltd.).
  • Amplification of the mouse P 2 Y 2 mRNA region was performed using an upstream primer (SEQ ID NO: 10) and a downstream primer (SEQ ID NO: 11). Detection was performed using a probe (SEQ ID NO: 1 2) (Applied Biosystems Japan Co., Ltd.).
  • the probe In order to enable detection in the TaqMan format, the probe has a 5 'end with a fluorescein-type fluorescent dye (FAM: reporter) and a 3' end with a rhodamine-type fluorescent dye (TAMRA: It was labeled with Quenchia. When the labeled probe was not hybridized, the fluorescence of the reporter was suppressed due to the movement of fluorescence resonance energy. In order to prevent extension of the probe by DNA polymerase during amplification, the 3 'end of the probe was synthesized with a phosphate block.
  • FAM fluorescein-type fluorescent dye
  • TAMRA rhodamine-type fluorescent dye
  • reverse transcription reaction was performed on 40 ⁇ g of the RNA described above using random primers.
  • Use reverse transcriptase Superscript II (Invitrogen) react according to the attached protocol, precipitate with ethanol, and add 4 ⁇ / l TE (10 mM Tris—HC 1, 1 mM) Dissolved in EDTA pH 8.0).
  • the synthesized cDNA was dissolved in TE and diluted to 10 ng 1 in TE containing 50 ⁇ g / m 1 yeast tRNA.
  • diluted cDNA solution 2.5 ⁇ 1 (equivalent to 25 ng RNA), TaqMan (registered trademark) Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems Japan Co., Ltd.) was used as the amplification reaction reagent. The total amount of the reaction solution was adjusted. Each The final concentration of lymer and probe was in accordance with the manual.
  • TaqMan (registered trademark) PCR was performed with the ABI PRISM (registered trademark) 7900HT Sequence Detection System (Applied Biosystems Japan Co., Ltd.), and the temperature cycle used was: TaqMan (registered trademark). Universal PCR Master Mix (Applied) DBiosystems Japan) manual.
  • 7900HT SDS software Applied Biosystems Japan Co., Ltd. was used, and the number of copies per sample was calculated by the absolute quantification method.
  • the amount of gene mRNA belonging to the family such as other target G protein-coupled receptors, tyrosin oxidase type receptors, and ion channels was quantified. Then, by comparing the production of all target G protein-coupled receptors, tyrosine phosphatase receptors, ion channels, and other ⁇ -transduced mRNAs, normal human and mouse normal skeletons are compared. Each target G protein-coupled receptor, tyrosine phosphatase receptor, ion channel, and other gene expression levels in muscle were analyzed.
  • FIG. 1 shows the analysis results.
  • RNAs derived from various human tissues were purchased.
  • each tissue was extracted from C 5 7 BL 6 forces, and total RNA was prepared according to the manual of I sogen (Nitsubon Gene).
  • I sogen Nicoon Gene
  • c For DNA synthesis, 40 ⁇ g of RNA was subjected to reverse transcription using random primers. The reverse transcriptase Super Script II (Invitrogen) was used, reacted according to the attached protocol, ethanol precipitated and dissolved in 400 ⁇ I ⁇ . The synthesized cD ⁇ ⁇ was dissolved in ⁇ ⁇ and diluted to 10 ng / ⁇ 1 in TE containing 50 ⁇ g Zm 1 yeast tRNA.
  • TaqMan (registered trademark) PCR was performed with ABI PRISM (registered trademark) 7900HT Sequence Detection System (Applied Biosystems Japan Co., Ltd.), and the temperature cycle used was TaqMan (registered trademark) Universal PCR Master Mix (Applied Biotechnology). System Japan Co., Ltd.) manual.
  • TaqMan analysis of amplified products the number of copies per sample was calculated by absolute quantification using 7900HT SDS software (Applied Biosystems Japan Co., Ltd.).
  • Both cells of mouse skeletal muscle cell line C 2 C 12 (AT CC) and rat skeletal muscle cell line L 6 (distributed from JC Lawrence Jr) are 10% FBS ⁇ lnvitrogen, 50 units / mL Penicillin G Sodium, 5
  • the cells were cultured in Dulbecco's Modified Eagle Medium (Invitrogen) containing 0 g / m1 Streptomycin sulfate (Invitrogen).
  • C 2 C 12 was differentiated by replacing it with Dulbe ⁇ Sco, s Modified Eagle Medium containing 2% horse serum (ICN).
  • L 6 promoted differentiation by replacing 2% FBS with-Minimum Essential Medium Invitrogen.
  • RNAs were prepared according to the manual of I sogen (Nitsubon Gene). .
  • the primers and probes used for quantification are the same as those used in Example 1 for mice, and the upstream primers (SEQ ID NO: 13) and downstream primers (SEQ ID NO: 14) are used for rats. It was. Detection was performed using a probe (sequence number: 15). The final concentration of each primer and probe was in accordance with Magyuannole.
  • TaqMan (registered trademark) PCR was performed with ABI PRISM (registered trademark) 7900HT Sequence Detection System (Applied Biosystems Japan Co., Ltd.), and the temperature cycle used was TaqMan (registered trademark) Universal PCR Master Mix (Applied Dubai). System Japan Co., Ltd.) Quantitative TaqMan analysis of amplification products was tested by the absolute quantification method using 7900HT SDS software (Applied Biosystems Japan Co., Ltd.). The number of copies per fee was calculated.
  • L 6 cells (L 6— SG 4— 8 1 1) are 10% FBS (I ⁇ Vitogen), 50 units / mL Penicillin G Sodium, 50 ⁇ g / m 1 Streptomycin sulfate ( Invitrogen) and cultivated in Dulbecco's Modified Eagle Medium (Invitrogen).
  • P 2 Y 2 agonists can be a novel drug target with a wide range of hypoglycemic effects in diabetics with both insulin secretion deficiency and insulin resistance.

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Abstract

本発明は、骨格筋においてＰ２Ｙ2受容体を介して糖取り込みを促進または阻害することにより血糖を調節する剤を提供する。

Description

明細書 血糖調節剤 技術分野
本発明は、 血糖調節剤に関する。 具体的には、 骨格筋において P 2 Y2 受容体を介して糖取り込みを促進または阻害することにより血糖を調節 する剤に関する。 背景技術
骨格筋は、 体重の約 4 0 %を占める比重の大きい組織であり。 糖代謝 の主要器官の一つに位置付けられている。 食事による血中グルコース濃 度 （血糖値） の上昇は、 その大部分がインスリン作用による骨格筋での グルコース （糖） 取り込み活性の増加によって素早く処理される。 それ 故、骨格筋における糖取り込み活性は血糖値に直接影響を及ぼすとされ、 その調節機能の解明は糖尿病研究において重要な課題である。 骨格筋に おける糖の取り込みはグルコース ト ランスポーター （G 1 u c o' s e T r a n s p o r t e r ： G LUT) と呼ばれる細胞膜を 1 2回貫通 する蛋白質により行われている。 G LUTは、 相同性の高い蛋白質のフ アミ リーを形成しており、 現在、 G L U T 1から G L U T 7の存在が報 告されている。 骨格筋では、 これまで G L UT 1、 G L UT 3、 G L U T 4、 G LUT 5の存在が報告されている。 骨格筋では、 G LUT 1 と G L UT 4が機能的に発現しており、 G LU T 1は通常細胞膜に局在し、 基本的な糖取り込みに関与していると考えられている。 一方、 G LUT 4は、 通常細胞内ミクロソーム画分に存在しているが、 これが細胞膜上 へ移動 （ トランスロケーショ ン） し機能することによって、 細胞外にあ る糖を細胞内に取り込むことが知られている。 そして、 インスリンや筋 収縮といった骨格筋への刺激が G L UT 4をトランスロケーショ ンさせ、 糖取り込み速度が増加することが知られている （N e s h e r e t a 1 . , Am. J . P h y s i o し， 24 9 : 02 2 6 - 2 3 2, 1 9 8 5)。インスリ ンの最大刺激による糖取り込み速度と筋収縮による糖取 り込み速度とは相加的な関係にあることより、 インスリ ンと筋収 は異 なる経路によって糖取り込み速度を増加させることが示唆されている。 すなわち、 骨格筋におけて、 細胞膜にトランスロケーショ ンした G LU T 4を介した糖取り込みはィンスリ ン依存性 · 非依存性の両方の経路で 起こると考えられている。 このことから、 骨格筋に直接作用し、 糖取り 込みを促進する薬剤は、 副作用が少なく、 インス リ ン分泌不全 ' イ ンス リ ン抵抗性のいずれの病態においても、 幅広く血糖低下作用を期待でき る新規糖尿病薬になると考えられた。
一般的な培養細胞においてであるが、 インスリ ン非依存的なシグナル として、 G P C R (G— p r o t e i n— c o u p l e d r e c e p t o r ) を介した G qシグナルが、 G L U T 4の膜移行および糖取り込 みを促進するとレヽぅ報告 （K i s h i e t a に， J . B i o l . C h e m., 2 7 1 ： 2 5 6 1— 2 6 5 6 8， 1 9 9 6 ) がある。 G P C R とは、 共役している G蛋白質 （G p r o t e i n : g u a n i n e n u c-'l e o t i d e— b i n d i n g p r o t e i nノ といつ トフ ンスデュサ一の活性化を通じて細胞内のシグナル伝達を行う 7回膜貫通 型受容体である。 そのリガンド （ァゴ二ス ト） は、 様々なホルモンや神 経伝達物質などの生理活性物質である。 それらリガンドが特異的な受容 体と結合することにより受容体と共役している G p r o t e i nが活 性化される。 活性化された G p r o t e i nはさらに下流のシグナル 伝達経路を活性化させ、 情報が伝達される。 GP C Rに共役している G p r o t e i nは、 三量体蛋白質であり、 その α サブュニッ トの種類に より、 伝達されるシグナルが異なる。 ひ サブユニッ トは G s、 G i 、 G q、 G 12の四つのファミ リ一に分類される。 G qサブュニッ トに伝わつ たシグナルは、 下流のホスホリパーゼ Cを活性化し、 細胞内カルシウム 動員を引き起こすことが知られている。 3 T 3 L 1細胞に G LUT 4お よぴ PAF p 1 a t e 1 e t— a c t i v a t i n g f a c t o r ) 受容体を強発現させたところ、 リガンド添加による G L UT 4の膜移行 および糖取り込みの促進が観察された。 P A F刺激による G LUT 4の 膜移行および糖取り込みの促進は、 G i阻害剤 （ I A P ： I s l e t — a c t i v a t i n g p r o t e i n)、 P I 3— k i n a s e P且舍 剤 （Wo r t m a n n i n)、 P KC阻害剤 （P D B u : p h o r b o 1 1 2， 1 3 - d i b u t y r a t e ) の処理を施しても阻害されな かった。 P AF受容体ほ G qおよび G iサブュ-ッ トと共役しているこ とが明らかになつており、 阻害剤を用いた前述の実験より、 G qのシグ ナルが G L U T 4の膜移行および糖取り込みを促進するものと考えられ た。
G P C Rである P 2 Y2 ( a c c e s s i o n # B C 0 2 8 1 3 5) は、 プリン受容体のうち AT Pをリガンドとする P 2フアミ リ一に属す る G P C Rファミ リーのうちの一つである。 P 2ファミ リ一にはィオン チャンネル型の P 2 Xファ ミ リーも同定されている。 P 2 Y2受容体は、 G iおよび G q共役の G P C Rであり、 そのリガンドは、 UT Pおよび AT Pとされている。
また、マウス骨格筋由来細胞 C 2 C 1 2において、 P 2ァゴニス ト （A T P、 UT P、 2— M e S AT P)による糖取り込みの促進が観察され、 C 2 C 1 2細胞を、 筋管細胞に分化させた状態でもこの糖取り込みの促 進は見出されている （K i m e t a l .， A c h i v e s o f B l o c h e m i s t r y a n d B i o p h y s i c s , 4 0 1 : 2 0 5— 2 1 4， 2 0 0 2)。
また、 P 2 Y2受容体蛋白質が、 骨格筋の神経末端との結合部 （n e u r o mu s c u l a r j u n c t i o n) に局在して発現している報 告 (T u n g e t a 1 . , M o 1 . P h a r m a c o l . , 6 6 : 7 9 4— 8 0 6 , 2 0 0 4) もある。 発明の開示
本発明者らは、 骨格筋に特異的に高発現している G P CRが、 G LU T 4の膜移行および糖取り込みの促進のシグナルになり うると考えた。 Ο 1 f a c t o y G P C Rを除く全 G P C Rおよそ 3 7 0種類の発現 解.析の結果より、 ヒ トおよびマウス骨格筋で特異的に高発現している G P C Rを調べた。 その結果、 ヒ ト、 マウス骨格筋に共通に高発現してい る G P C Rとして P 2 Y2を同定した。
さらに、'我々は、 C 2 C 1 2細胞において、 筋芽細胞から筋管細胞へ の分化に伴い Ρ 2 Υ2受容体の mRN Α発現量が増加することを見出し ている。 この分化に伴う P 2 Y2受容体の mR N A発現量の増加は、 ラッ ト骨格筋由来細胞 L 6においても、 確認された。 骨格筋において P 2 Y2 受容体が特異的かつ高発現していることと、 Ρ 2ァゴニス トがマウス筋 管細胞での糖取り込みを促進すること、 G qシグナルによりインスリン 非依存的な GLUT 4の糖取り込みが促進されることから、 P 2 Y2受容 体が骨格筋における糖取り込みに直接関与している可能性が示唆された。 本発明者らは、 G LUT 4を安定発現させたラッ ト骨格筋由来細胞 L 6に Ρ 2 Υ2受容体を強発現させ、 Ρ 2 Υ2受容体のリガンドである AT Pによる糖取り込みを検討した結果、 AT Pすなわち P 2 Y2ァゴニス ト 特異的な糖取り込みの促進を確認し、 さらに研究を進め、 本発明を完成 するに至った。
すなわち、 本発明は、
[ 1 ] Ρ 2 Υ2受容体蛋白質またはその塩の活性を促進する化合物または その塩を含有してなる血糖低下剤；
[ 2 ] Ρ 2 Υ2受容体蛋白質またはその塩の遺伝子の発現を促進する化合 物またはその塩を含有してなる血糖低下剤 ；
[ 3 ] Ρ 2 Υ2受容体蛋白質またはその塩が骨格筋の Ρ 2 Υ2受容体蛋白 質またはその塩である請求項 1または 2記載の剤 ；
[4] 糖尿病、 肥満症または高脂血症予防 ·治療剤である請求項 1ない し 3記載の剤。
[ 5 ] Ρ 2 Υ2受容体蛋白質またはその塩の活性を阻害する化合物または その塩を含有してなる血糖上昇剤 ； [ 6 ] P 2 Y2受容体蛋白質またはその塩の遺伝子の発現を阻害する化合 物またはその塩を含有してなる血糖上昇剤 ；
[ 7 ] P 2 Y2受容体蛋白質またはその塩が骨格筋の P 2 Υ2受容体蛋白 質またはその塩である請求項 5または 6記載の剤；
[ 8 ] 低血糖症予防 ·治療剤である請求項 5ないし 7記載の剤 ；
[ 9 ] Ρ 2 Υ2受容体蛋白質またはその塩が配列番号： 1で表されるアミ ノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質 もしくはその部分べプチドまたはその塩である請求項 1ないし 8記載の 剤 ；
[ 1 0 ] Ρ 2 Υ2受容体蛋白質またはその塩が配列番号： 1で表されるァ ミノ酸配列からなる蛋白質またはその塩である請求項 1ないし 8記載の 剤 ；
[ 1 1 ] Ρ 2 Υ2受容体蛋白質またはその部分べプチドをコードするポリ ヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを含有してなる血糖低下剤； [ 1 2 ] 糖尿病、 肥満症または高脂血症予防 ·治療剤である請求項 1 1 記載の剤；
[ 1 3 ] Ρ 2 Υ2受容体蛋白質をコードするポリヌクレオチドが配列番 号： 2で表される塩基配列と同一もしくは実質的に同一の塩基配列を含 有するポリヌクレオチドである請求項 1 1ないし 1 2記載の剤 ；
[ 1 4 ] Ρ 2 Υ2受容体蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩を 含有してなる血糖上昇剤 ；
[ 1 5 ] 低血糖症予防 ·治療剤である請求項 1 4記載の剤 ；
[ 1 6 ] Ρ 2 Υ2受容体蛋白質またはその塩が配列番号： 1で表されるァ ミノ酸配列と同一もしぐは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白 質もしくはその部分べプチドまたはその塩である請求項 1 4ないし 1 5 記載の剤；
[ 1 7 ] Ρ 2 Υ2受容体蛋白質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列 に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部分を含有す るアンチセンスポリヌクレオチドを含有してなる血糖上昇剤 ； [ 1 8] 低血糖症予防 ·治療剤である請求項 1 7記載の剤 ； ，
[ 1 9 ] P 2 Y2受容体蛋白質をコードするポリヌク レオチドが配列番 号： 2で表される塩基配列と同一もしくは実質的に同一の塩基配列を含 有するポリヌクレオチドである請求項 1 7ないし 1 8記載の剤 ；
[ 2 0] Ρ 2 Υ2受容体蛋白質またはその塩に対する抗体を含有してなる 血糖上昇剤 ；
[2 1 ] 低血糖症予防 ·治療剤である請求項 2 0記載の剤 ；
[ 2 2] Ρ 2 Υ2受容体蛋白質またはその塩が配列番号： 1で表されるァ ミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有する蛋白 質もしくはその部分べプチドまたはその塩である請求項 2 0ないし 2 1 記載の剤 ；
[ 2 3 ] Ρ 2 Υ2受容体蛋白質またはその塩に対する抗体を含有してなる 糖尿病または低血糖症の診断薬；
[ 24] Ρ 2 Υ2受容体蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含有して なる糖尿病または低血糖症の診断薬；
[2 5] Ρ 2 Υ2受容体蛋白質またはその塩を用いることを特徴とする、 血糖値を調節する化合物またはその塩のスクリ一二ング方法；
[2 6] Ρ 2 Υ2受容体蛋白質またはその塩が骨格筋の Ρ 2 Υ2受容体蛋 白質またはその塩である請求項 2 2記載のスクリ一二ング方法；
[ 2 7] Ρ 2 Υ2受容体蛋白質また'はその塩が配列番号： 1で表されるァ ミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白 質もしくはその部分べプチドまたはその塩である請求項 2 5記載のスク リ一ユング方法；
[2 8] Ρ 2 Υ2受容体蛋白質またはその塩を含有することを特徴とする、 血糖値を調節する化合物またはその塩のスクリ一二ング用キッ ト ；
[2 9] Ρ 2 Υ2受容体蛋白質をコードするポリヌクレオチドを用いるこ とを特徴とする、 血糖値を調節する化合物またはその塩のスクリーニン グ方法；
[ 3 0] Ρ 2 Υ。受容体蛋白質をコードするポリヌク レオチドが配列番 号： 2で表される塩基配列と同一もしくは実質的に同一の塩基配 を含 有するポリ ヌク レオチドである請求項 2 9記載のスクリ一ユング方法；
[ 3 1 ] P 2 Y2受容体蛋白質をコードするポリヌク レオチドを含有する ことを特徴とする'、 血糖値を調節する化合物またはその塩のスクリ一二 ング用キッ ト ；
[ 3 2] Ρ 2 Υ2受容体蛋白質またはその塩を用いることを特徴とする、 Ρ 2 Υ2受容体蛋白質またはその塩に対するァゴニス トのスクリーニン グ方法；
[ 3 3 ] Ρ 2 Υ2受容体蛋白質またはその塩を用いることを特徴とする、 Ρ 2 Υ2受容体蛋白質またはその塩に対するアンタゴニス トのスク リー ユング方法 ；
[ 3 4] ( 1 ) Ρ 2 Υ2受容体蛋白質またはその塩の標識されたリガンド またはその塩を、 該蛋白質またはその塩に接触させた場合と、 （2) 試験 化合物および Ρ 2 Υ2受容体蛋白質またはその塩の標識されたリガンド またはその塩を、 該蛋白質またはその塩に接触させた場合における、 Ρ
2 Υ2受容体蛋白質またはその塩の標識されたリガンドまたはその塩と、 該蛋白質またはその塩との結合量を測定することを特徴とする請求項 3 2または 3 3記載のスクリ一二ング方法；
[ 3 5] ( 1 ) Ρ 2 Υ2受容体蛋白質またはその塩の標識されたリガンド またはその塩を、 該蛋白質を含有する細胞またはその細胞膜画分に接触 させた場合と、 （2) 試験化合物および Ρ 2 Υ2受容体蛋白質またはその 塩の標識されたリガンドまたはその塩を、 該蛋白質を含有する細胞また はその細胞膜画分に接触させた場合における、 Ρ 2 Υ2受容体蛋白質また はその塩の標識されたリガンドまたはその塩と、 該蛋白質を含有する細 胞またはその細胞膜画分との結合量を測定することを特徴とする請求項
3 2または 3 3記載のスクリ一二ング方法；
[ 3 6 ] ( 1 ) Ρ 2 Υ2受容体蛋白質またはその塩のリガンドまたはその 塩を、 該蛋白質を含有する細胞またはその細胞膜画分に接触させた場合 と、 （ 2) Ρ 2 Υ。受容体蛋白質またはその塩のリガンドまたはその塩の 存在下または非存在下に、 試験化合物を該蛋白質を含有する細胞 たは その細胞膜画分に接触させた場合における、 P 2 Y2受容体蛋白質を介し た細胞刺激活性を測定することを特徴とする請求項 3 2または 3 3記載 のスクリーニング方法； ·
[ 3 7] ( 1 ) Ρ 2 Υ2受容体蛋白質またはその塩のリガンドまたはその 塩を、 該蛋白質を含有する細胞またはその細胞膜画分に接触させた場合 と、 （ 2) Ρ 2 Υ2受容体蛋白質またはその塩のリガンドまたはその塩の 存在下または非存在下に、 試験化合物を該蛋白質を含有する細胞または その細胞膜画分に接触させた場合における、 細胞内 C a 2+濃度または細 胞内 c AMP生成を測定することを特徴とする請求項 3 2または 3 3記 載のスクリ一ユング方法；
[ 3 8 ] P 2 Y2受容体蛋白質またはその塩に G L UT 4を共存させるこ とを特徴とする請求項 3 2ないし 3 7記載のスクリ一-ング方法； [ 3 9] 骨格筋由来細胞または骨格筋細胞を用いることを特徴とする請 求項 3 2ないし 3 7記載のスクリーニング方法 ；
[4 0] リガンドが U Τ Ρまたは AT Pである請求項 3 2ないし 3 7記 載のスクリ一二ング方法；
[4 1 ] P 2 Y2受容体蛋白質またはその塩の活性を促進することを特徴 とする血糖低下方法；
[4 2] Ρ 2 Υ2受容体蛋白質またはその塩の遺伝子の発現を促進するこ とを特徴とする血糖低下方法；
[4 3] Ρ 2 Υ2受容体蛋白質またはその塩が骨格筋の Ρ 2 Υ2受容体蛋 白質またはその塩である請求項 4 1または 4 2記載の方法；
[4 4] 糖尿病、 肥満症または高脂血症予防 ·治療方法である請求項 4 1ないし 4 3記載の方法；
[4 5] Ρ 2 Υ2受容体蛋白質またはその塩の活性を阻害することを特徴 とする血糖上昇方法；
[4 6 ] Ρ 2 Υ2受容体蛋白質またはその塩の遺伝子の発現を阻害するこ ' とを特徴とする血糖上昇方法； [4 7] P 2 Y2受容体蛋白質またはその塩が骨格筋の P 2 Y2受有体蛋 白質またはその塩である請求項 4 5または 4 6記載の方法；
[4 8] 低血糖症予防 ·治療方法である請求項 4 5ないし 4 7記載の方 法； - [4 9] Ρ 2 Υ2受容体蛋白質またはその塩の活性を促進する化合物また はその塩の有効量を哺乳動物に投与することを特徴とする血糖低下方 法；
[ 5 0 ] Ρ 2 Υ2受容体蛋白質またはその塩の遺伝子の発現を促進する化 合物またはその塩の有効量を哺乳動物に投与することを血糖低下方法；
[ 5 1 ] Ρ 2 Υ2受容体蛋白質またはその塩が骨格筋の Ρ 2 Υ2受容体蛋 白質またはその塩である請求項 4 9または 5 0記載の方法；
[ 5 2] 糖尿病、 肥満症または高脂血症予防 ·治療方法である請求項 4 9ないし 5 1記載の方法 ；
[ 5 3] Ρ 2 Υ2受容体蛋白質またはその塩の活性を阻害する化合物また はその塩の有効量を哺乳動物に投与することを特徴とする血糖上昇方 法；
[ 5 4] Ρ 2 Υ 2受容体蛋白質またはその塩の遺伝子の発現を阻害する化 合物またはその塩の有効量を哺乳動物に投与することを特徴とする血糖 上昇方法；
[ 5 5] Ρ 2 Υ2受容体蛋白質またはその塩が骨格筋の Ρ 2 Υ2受容体蛋 白質またはその塩である請求項 5 3または 5 4記載の方法；
[ 5 6] 低血糖症予防 ·治療方法である請求項 5 3ないし 5 5記載の方 法；
[ 5 7]血糖低下剤の製造のための Ρ 2 Υ2受容体蛋白質またはその塩の 活性を促進する化合物またはその塩の使用 ；
[ 5 8]血糖低下剤の製造のための Ρ 2 Υ2受容体蛋白質またはその塩の 遺伝子の発現を促進する化合物またはその塩の使用 ；
[ 5 9] Ρ 2 Υ2受容体蛋白質またはその塩が骨格筋の Ρ 2 Υ2受容体蛋 白質またはその塩である請求項 5 7または 5 8記載の使用 ； [6 0] 血糖低下剤が糖尿病、 肥満症または高脂血症予防 ·治療方法で ある請求項 5 7ないし 5 9記載の使用 ；
[ 6 1 ]血糖上昇剤の製造のための P 2 Y2受容体蛋白質またはその塩の 活性を阻害する化合物またはその塩の.使用 ；
[ 6 2 ]血糖上昇剤の製造のための Ρ 2 Υ2受容体蛋白質またはその塩の 遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩の使用 ；
[6 3] Ρ 2 Υ2受容体蛋白質またはその塩が骨格筋の Ρ 2 Υ 2受容体蛋 白質またはその塩である請求項 6 1または 6 2記載の使用 ；
[ 6 4] 血糖上昇剤が低血糖症予防 ·治療剤である請求項 6 1ないし 6 3記載の使用 ；
を提供する。 図面の簡単な説明
図 1は、 ヒ トまたはマウスの骨格筋における高発現 G P C R上位 4 0 種における mRN Α発現を示す。
図 2は、 P 2Y2 mRN Αの発現分布を表す。
図 3は、 筋芽細胞分化'における P 2 Y2 mRNAの発現を表す。
図 4は、 ラッ ト筋芽細胞 L 6 - S G 4 - 8 1 1における AT Pにより 誘導される糖取込みを表す。 発明を実施するための最良の形態
本発明で用いられる P 2 Y2受容体蛋白質は、配列番号： 1で表わされ るアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する 受容体蛋白質である。
Ρ 2 Υ2受容体蛋白質は、 例えば、 ヒ トゃ哺乳動物 （例えば、 モルモッ ト、 ラッ ト、 マウス、 ゥサギ、 ブタ、 ヒッジ、 ゥシ、 サルなど） のあら ゆる細胞 （例えば、 脾細胞、 神経細胞、 グリア細胞、 膝臓 β 細胞、 膝臓 ランゲルハンス島、骨髄細胞、メサンギゥム細胞、ランゲルハンス細胞、 表皮細胞、 上皮細胞、 内皮細胞、 繊維芽細胞、 繊維細胞、 筋細胞、 脂肪 細胞、 免疫細胞 （例、 マク ロファージ、 T細胞、 B細胞、 ナチュラ■3ルキ ラー細胞、 肥満細胞、 好中球、 好塩基球、 好酸球、 単球）、 巨核球、 滑膜 細胞、 軟骨細胞、 骨細胞、 骨芽細胞、 破骨細胞、 乳腺細胞、 肝細胞もし くは間質細胞、 ま'たはこれら細胞の前駆細胞、 幹細胞もしくはガン細胞 など） や血球系の細胞、 またはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、 例えば、 脳、 脳の各部位 （例、 嗅球、 扁頭核、 大脳基底球、 海馬、 視床、 視床下部、 視床下核、 大脳皮質、 延髄、 小脳、 後頭葉、 前頭葉、 側頭葉、 被殻、 尾状核、 脳染、 黒質）、 脊髄、 下垂体、 胃、 膝臓、 腎臓、 肝臓、 生 殖腺、 甲状腺、 胆のう、 骨髄、 副腎、 皮膚、 筋肉、 肺、 消化管 （例、 大 腸、 小腸）、 血管、 心臓、 胸腺、 脾臓、 顎下腺、 末梢血、 末梢血球、 前立 腺、 睾丸、 精巣、 卵巣、 胎盤、 子宮、 骨、 関節、 骨格筋などに由来する 蛋白質であってもよく、 また合成蛋白質であってもよい。 特に、 P 2 Y2 受容体蛋白質は骨格筋に高発現している。
配列番号 ： 1で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のァミノ酸配 列としては、例えば、配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と約 8 5 % 以上、 好ましくは 9 0 %以上、 より好ましくは約 9 5 %以上の相同性を 有するアミノ酸配列などが挙げられる。 具体的には、 配列番号： 1で表 わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、 マウス P 2 Y2 (P 2 U) (G e n B a n k A c c e s s i o n N o . L I 4 7 5 1 ；配列番号： 3 )、 ラッ ト P 2 Y2 ( P 2 U) (G e n B a n k A c c e s s i o n N o . U 0 9 4 0 2 ;配列番号： 4 ) などが挙げら れる。
本発明の配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有する蛋白質としては、 例えば、 配列番号： 1で表わさ れるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、 配列番号： 1 で表わされるァミノ酸配列からなる蛋白質と実質的に同質の活性を有す る蛋白質などが好ましい。
実質的に同質の活性としては、 例えば、 リガンド結合活性、 シグナル 情報伝達作用などが挙げられる。 実質的に同質とは、 それらの活性が性 質的に同質であることを示す。 したがって、 リガンド結合活性や、; ダナ ル情報伝達作用などの活性が同等 （例、 約 0 . 0 1〜 1 0 0倍、 好まし くは約 0 . 5〜 2 Q倍、 より好まし-くは約 0 . 5〜 2倍） であることが 好ましいが、 これらの活性の程度ゃ蛋.白質の分子量などの量的要素は異 なっていてもよい。
リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用などの活性の測定は、 自体 公知の方法に準じて行なうことができるが、 例えば、 後に記載するスク リ一二ング方法に従って測定することができる。
また、 P 2 Y 2受容体蛋白質としては、 a) 配列番号： 1で表わされる アミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜 3 0個程度、 よ り好ましくは 1〜 1 0個程度、 さらに好ましくは数個 （ 1〜 5個）） のァ ミノ酸が欠失したァミノ酸配列、 b) 配列番号： 1で表わされるァミノ酸 配列に 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜 3 0個程度、 より好ましく は 1〜 1 0個程度、 さらに好ましくは数個 （ 1〜 5個）） のァミノ酸が付 加したアミノ酸配列、 c) 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列中の 1 または 2個以上 （好ましくは、 1〜 3 0個程度、 より好ましくは 1〜 1 0個程度、 さらに好ましくは数個 （ 1〜 5個）） のアミノ酸が他のアミノ 酸で置換されたアミノ酸配列、 または d) それらを組み合わせたァミノ 酸配列を含有する蛋白質なども用いられる。
本明細書における P 2 Y 2受容体蛋白質は、ぺプチド標記の慣例に従つ て、 左端が Ν末端 （ァミノ末端）、 右端が C末端 （カルボキシル末端） で ある。 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列を含有する Ρ 2 Υ 2受容体 蛋白質をはじめとする蛋白質は、 C末端がカルボキシル基（一 C Ο〇Η )、 カルボキシレート（一 C Ο Ο— )、 アミ ド （一 C O N H 2) またはエステル (—C O O R ) の何れであってもよい。
ここでエステルにおける Rとしては、 例えば、 メチル、 ェチル、 n— プロピル、 イソプロピルもしく は n —プチルなどの C wアルキル基、 例 えば、 シク口ペンチル、 シク口へキシルなどの C 3_8 シク口ァノレキノレ基、 例えば、 フヱニル、 ' α —ナフチルなどの C 6— 12ァリール基、 例えば、 ベン ジル、 フエネチルなどのフエ二ルー C 2アルキル基もしく は ひ一すフチ ルメチルなどの ひ一ナフチルー C Hァノレキル基などの C 7— 14ァラルキル 基のほ力 、 経口用エステルと して汎用されるビバロイルォキシメチル基 などが用いられる。 - '
P 2 Y 2受容体蛋白質が C末端以外にカルボキシル基（またはカルボキ シレー ト） を有している場合、 カルボキシル基がアミ ド化またはエステ ル化されているものも本発明で用いられる Ρ 2 Υ 2受容体蛋白質に含ま れる。 この場合のエステルとしては、 例えば上記した C末端のエステル などが用いられる。
さらに、 Ρ 2 Υ 2受容体蛋白質には、 上記した蛋白質において、 Ν末端 のメチォニン残基のァミノ基が保護基 （例えば、 ホルミル基、 ァセチル などの C 2_6アルカノィル基などの C χ_6ァシル基など） で保護されている もの、 Ν端側が生体内で切断され生成したダルタミル基がピ口ダルタミ ン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば、 一 Ο Η、 _ S H、 ァミノ基、 イ ミダゾール基、 ィン ドール基、 グァニジノ基など） が適当な保護基 （例えば、 ホルミル基、 ァセチルなどの C 2_6アルカノィ ル基などの C wァシル基など） で保護されているもの、 あるいは糖鎖が 結合したいわゆる糖蛋白質などの複合蛋¾質なども含まれる。
P 2 Y 2受容体蛋白質の部分べプチドと しては、 上記した Ρ 2 Υ 2受容 体蛋白質の部分ぺプチドであれば何れのものであってもよい力 S、例えば、 Ρ 2 Υ 2受容体蛋白質の蛋白質分子のうち、細胞膜の外に露出している部 位であって、 実質的に同質の受容体結合活性を有するものなどが用いら れる。
具体的には、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列を有する Ρ 2 Υ 2 受容体蛋白質の部分ペプチドとしては、 疎水性プロッ ト解析において細 胞外領域 （親水性 （Hydrophi l i c) 部位） であると分析された部分を含む ペプチドである。 また、 疎水性 （Hydrophob i c) 部位を一部に含むぺプチ ドも同様に用いることができる。 個々の ドメインを個別に含むぺプチド も用い得るが、 複数のドメインを同時に含む部分のペプチドでも良い。 本発明の部分ぺプチドのアミノ酸の数は、 上記した本発明の受考体蛋 白質の構成ァミノ酸配列のうち少なく とも 2 0個以上、 好ましくは 5 0 個以上、 より好ましくは 1 0 0個以上のァミノ酸配列を有するぺプチド などが好ましい。 ■ .
ここで、 「実質的に同質の受容体活性」 とは、 上記と同意義を示す。 「実 質的に同質の受容体活性」 の測定は上記と同様に行なうことができる。 また、 本発明で用いられる部分ペプチドは、 上記アミノ酸配列中の 1 または 2個以上 （好ましくは、 1〜 1 0個程度、 さらに好ましくは数個 ( 1〜 5個）） のアミノ酸が欠失し、 または、 そのアミノ酸配列に 1また は 2個以上 （好ましく は、 1〜 2 0個程度、 より好ましく は 1〜 1 0個 程度、 さらに好ましく は数個（ 1〜 5個））のアミノ酸が付加し、または、 そのアミノ酸配列中の 1または 2個以上（好ましくは、 1〜 1 0個程度、 より好ましく は数個、 さらに好ましく は 1〜 5個程度） のアミノ酸が他 のァミノ酸で置換されていてもよレ、。
また、本発明で用いられる部分べプチドは C末端がカルボキシル基（一 C OOH)、 カノレポキシレー ト （一 C OO—)、 アミ ド （一 CONH2) ま たはエステル （一 C OOR) の何れであってもよレ、。 本発明で用いられ る部分ぺプチドが C末端以外にカルボキシル基 （またはカルボキシレー ト） を有している場合、 カルボキシル基がアミ ド化またはエステル化さ れているものも本発明で用いられる部分ペプチドに含まれる。 この場合 のエステルと しては、 例えば上記した C末端のエステルなどが用いられ る。
さらに、本発明で用いられる部分べプチドには、 上記した P 2 Y2受容 体蛋白質と同様に、 Ν末端のメチォニン残基のァミノ基が保護基で保護 されているもの、 Ν端側が生体内で切断され生成した G 1 ηがピログル タミン酸化したもの、 分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護 基で保護されているもの、 あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ぺプチド などの複合べプチドなども含まれる。
本発明で用いられる Ρ 2 Υ。受容体蛋白質またはその部分ぺプチドの 塩としては、 酸または塩基との生理学的に許容される塩が挙げられ、 と りわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩と しては、 例えば、 無機酸 （例えば、 塩酸、 リン酸、 臭化水素酸、 硫酸） との塩、 あるいは有機酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸、 プロピオン酸、 フマル酸、 マレ イン酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 蓚酸、 安息香酸、 メ タンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸） との塩などが用いられる。
本発明で用いられる P 2 Y 2受容体蛋白質またはその塩は、上記したヒ トゃ哺乳動物の細胞または組織から公知の受容体蛋白質の精製方法によ つて製造することもできるし、後に記載する Ρ 2 Υ 2受容体蛋白質をコー ドする D N Αを含有する形質転換体を培養することによっても製造する ことができる。 また、 後に記載する蛋白質合成法またはこれに準じて製 造することもできる。
ヒ トゃ哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、 ヒ トゃ哺乳動物 の組織または細胞をホモジナイズした後、 酸などで抽出を行ない、 該抽 出液を逆相クロマ トグラフィー、 イオン交換クロマ トグラフィーなどの クロマ トグラフィーを組み合わせることにより精製単離することができ る。
本発明で用いられる P 2 Y 2受容体蛋白質もしく はその部分べプチド またはその塩またはそのアミ ド体の合成には、 通常市販の蛋白質合成用 樹脂を用いることができる。 そのよう,な樹脂としては、 例えば、 クロ口 メチル樹脂、 ヒ ドロキシメチル樹脂、 ベンズヒ ドリルァミン樹脂、 アミ ノメチル樹脂、 4一べンジルォキシベンジルアルコール樹脂、 4—メチ ルベンズヒ ドリルァミン樹脂、 Ρ Α Μ樹脂、 4ーヒ ドロキシメチルメチ ルフエニルァセ トアミ ドメチル樹脂、 ポリアク リルアミ ド樹脂、 4 _ ( 2 ' , 4， 一ジメ トキシフエ二ルーヒ ドロキシメチル） フエノキシ樹 脂、 4一 （ 2 ' ， 4 ' 一ジメ トキシフエ二ルー F m o cァミノェチル） フエノキシ樹脂などを挙げることができる。 このよ うな樹脂を用い、 α 一アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、 目的とする蛋白 質の配列通りに、 公知の各種縮合方法に従い、 樹脂上で縮合させる。 反 応の最後に樹脂から蛋白質を切り出すと同時に各種保護基を除去 、 さ らに高希釈溶液中で分子内ジスルフィ ド結合形成反応を実施し、 目的の 蛋白質またはそのアミ ド体を取得する。
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、 蛋白質合成に使用できる各 種活性化試薬を用いることができる力 特に、カルポジイミ ド類がよい。 カルポジイ ミ ド類と しては、 D C C、 N， N ' ージイソプロピルカルボ ジイ ミ ド、 N—ェチル— N， 一 ( 3—ジメチルァミノプロ リル) カルボ ジイ ミ ドなどが用いられる。 これらによる活性化にはラセミ化抑制添カロ, 剤 （例えば、 H O B t、 H O O B t ) とともに保護アミノ酸を直接樹脂 に添加する力 、 または、 対称酸無水物または H O B tエステルあるレ、は H O O B tエステルとしてあらかじめ保護ァミノ酸の活性化を行なった 後に樹脂に添加することができる。
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、 蛋 白質縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されう る。 例えば、 N， N—ジメチルホルムアミ ド， N， N—ジメチルァセ ト アミ ド， N—メチルピロ リ ドンなどの酸ァミ ド類、 塩化メチレン、 クロ ロホノレムなどのハロゲンィヒ炭ィ匕水素類、 トリフノレオ口エタノ一ノレなどの アルコール類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジン、 ジォキサン、 テ トラヒ ドロフランなどのエーテル類、 ァセ トニトリル、 プロピ'ォ-ト リルなどの- ト リル類、 酢酸メチル、 酢酸ェチルなどのェ ステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。 反応温度は 蛋白質結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選 択され、 通常約— 2 0 °C〜 5 0 °Cの範囲から適宜選択される。 活性化さ れたアミノ酸誘導体は通常 1 . 5〜4倍過剰で用いられる。 ニンヒ ドリ ン反応を用いたテス トの結果、 縮合が不十分な場合には保護基の脱離を 行う ことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行なう ことが できる。 反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、 無水酢 酸またはァセチルイミダゾールを用いて未反応ァミノ酸をァセチル化す ることができる。 原料のァミノ基の保護基と しては、 例えば、 Z 、 B o c、 ター^ャリ 一ペンチノレォキシカノレボニノレ、 ィソボノレニノレオキシカルボ二ノレ、 4ーメ トキシペンジノレオキシカノレポニル、 C 1 一 Z 、 B 1-— Z、 ァダマンチル' ォキシカノレボニル、 トリフノレオロアセチノレ、 フタロイノレ、 ホノレミノレ、 2 一二 トロフエニルスノレフエ二ノレ、 ジフエニノレホスフイ ノチオイノレ、 F m o cなどが用いられる。
カルボキシル基は、 例えば、 アルキルエステル化 (例えば、 メチル、 ェチノレ、 プロピル、 プチノレ、 タ一シャリーブチノレ、 シクロペンチノレ、 シ ク ロへキシル、 シク ロへプチノレ、 シク 口才クチノレ、 2—ァダマンチノレな どの直鎖状、分枝状もしく は環状アルキルエステル化）、 ァラルキルエス テノレイ匕 (例えば、 ベンジノレエステル、 4 一二 トロベンジノレエステノレ、 4 ーメ トキシベンジノレエステノレ、 4—クロ口べンジノレエステノレ、 ベンズヒ ドリルエステル化）、 フエナシルエステル化、 ベンジルォキシカルボニル ヒ ドラジド化、 ターシャリーブトキシカルボニルヒ ドラジド化、 ト リチ ルヒ ドラジド化などによつて保護することができる。
セリ ンの水酸基は、 例えば、 エステル化またはエーテル化によって保 護することができる。 このエステル化に適する基としては、 例えば、 ァ セチル基などの低級アル力ノィル基、 ベンゾィル基などのァロィル基、 ベンジルォキシカルボニル基、 ェトキシカルボニル基などの炭酸から誘 導される基などが用いられる。 また、' エーテル化に適する基としては、 例えば、 ベンジル基、 テ トラヒ ドロビラニル基、 t—ブチル基などであ る。
チロシンのフエノール性水酸基の保護基としては、 例えば、 B z 1 、 C l 2— B z l 、 2—ニト口ベンジル、 B r— Z、 ターシャ リ一ブチルな どが用いられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基と しては、 例えば、 T o s 、 4一 メ トキシ一 2 , 3 ， 6— ト リ メチルベンゼンスノレホニノレ、 D N P、 ベン ジノレオキシメチル、 B u m、 B o c 、 T r t 、 F m o cなどが用レヽられ ' る。 原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、 例えば、 ^"応す る酸無水物、 アジド、 活性エステル 〔アルコール （例えば、 ペンタク口 口フエノーノレ、 2 , 4 , 5 — ト リ ク ロ口フエノーノレ、 2 ， 4 ージニ トロ フエノール、 シァソメチノレアルコーノレ、 ノ ラニ トロフエノーノレ、 H O N B 、 N—ヒ ドロキシスクシミ ド、 N—ヒ ドロキシフタノレイ ミ ド、 H O B t ) とのエステル〕 などが用いられる。 原料のァミノ基の活性化された ものとしては、 例えば、 対応するリン酸アミ ドが用いられる。
保護基の除去 （脱離） 方法としては、 例えば、 P d—黒あるいは P d 一炭素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、 また、 無水 フッ化水素、 メ タンスルホン酸、 卜 リフノレオロメ タンスルホン酸、 ト リ フルォロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、 ジィソプロ ピルェチルァミ ン、 ト リェチルァミ ン、 ピぺリ ジン、 ピぺラジンなどに よる塩基処理、 また液体アンモニア中ナトリ ゥムによる還元なども用い られる。 上記酸処理による脱離反応は、 一般に約一 2 0 °C〜 4 0 °Cの温 度で行なわれるが、 酸処理においては、 例えば、 ァニソール、 フエノー ノレ、 チオアニソール、 メ タク レゾーノレ、 ノ ラク レゾーノレ、 ジメチノレスノレ フイ ド、 1 ， 4一ブタンジチォ一ノレ、 1 ， 2—エタンジチォーノレなどの ようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。 また、 ヒスチジンのイミダ ゾール保護基として用いられる 2 , 4—ジニト口フエニル基はチォフエ ノール処理により除去され、 トリプトファンのインドール保護基として 用いられるホルミル基は上記の 1 ， 2—エタンジチオール、 1 ， 4ーブ タンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、 希水酸化ナ トリ ゥム溶液、 希アンモニアなどによるアル力リ処理によっても除去さ れる。
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、 および その保護基の脱離、 反応に関与する官能基の活性化などは公知の基また は公知の手段から適宜選択しうる。
蛋白質のアミ ド体を得る別の方法としては、 例えば、 まず、 カルボキ シ末端アミ ノ酸の α—力ルポキシル基をアミ ド化して保護した後、 アミ ノ基側にペプチド （蛋白質） 鎖を所望の鎖長まで延ばした後、 該 プチ ド鎖の N末端の α—アミノ基の保護基のみを除いた蛋白質と C末端の カルボキシル基の保護基のみを除去した蛋白質とを製造し、 この両蛋白 質を上記したような混合溶媒中で縮合させる。 縮合反応の詳細について は上記と同様である。 縮合により得られた保護蛋白質を精製した後、 上 記方法によりすべての保護基を除去し、 所望の粗蛋白質を得ることがで きる。 この粗蛋白質は既知の各種精製手段を駆使して精製し、 主要画分 を凍結乾燥する.ことで所望の蛋白質のアミ ド体を得ることができる。
蛋白質のエステル体を得るには、 例えば、 カルボキシ末端アミノ酸の a—カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しァミノ酸エステルと した後、 蛋白質のアミ ド体と同様にして、 所望の蛋白質のエステル体を 得ることができる。
本発明で用いられる P 2 Y2受容体蛋白質の部分ぺプチドまたはその 塩は、公知のぺプチドの合成法に従って、 あるいは Ρ 2 Υ2受容体蛋白質 を適当なぺプチダーゼで切断することによって製造することができる。 ペプチドの合成法としては、 例えば、 固相合成法、 液相合成法のいずれ によっても良い。 すなわち、 Ρ 2 Υ2受容体蛋白質を構成し得る部分ぺプ チドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、 生成物が保護基を有す · る場合は保護基を脱離することにより 目的のぺプチドを製造することが できる。 公知の縮合方法や保護基の脱離としては、 例えば、 以下の a) 〜e) に記載された方法が挙げられる。
a)M. Bodanszky および M. A. Ondetti、ペプチド シンセシス (Peptide Synthesis) , Interscience Publishers, New York (1966年)
b) Schroeder ぉょぴ Luebke、 ザ ペプチド (The Peptideハ Academic Press, New York (1965年;）
c) 泉屋信夫他、 ペプチド合成の基礎と実験、 丸善（株） （1975年） d)矢島治明 および榊原俊平、生化学実験講座 1、 蛋白質の化学 IV、 205、 (1977年）
e) 矢島治明監修、 続医薬品の開発 第 14卷 ペプチド合成 広川書店 また、 反応後は通常の精製法、 例えば、 溶媒抽出 ' 蒸留 ' カラ クロ マトグラフィー · 液体ク口マ トグラフィ一 ' 再結晶などを組み合わせて 本発明の部分ぺプチドを精製単離することができる。 上記方法で得られ る部分べプチドが遊離体である場合は、 公知の方法によって適当な塩に 変換することができるし、 逆に塩で得られた場合は、 公知の方法によつ て遊離体に変換することができる。
本発明で用いられる P 2 Y2受容体蛋白質をコードするポリヌク レオ チドと しては、 上記した Ρ 2 Υ2受容体蛋白質をコードする塩基配列 （D ΝΑまたは RNA、 好ましく は DNA) を含有するものであればいかな るものであってもよい。 該ポリヌクレオチドとしては、 P 2 Y2受容体蛋 白質をコードする DNA、 mRN A等の RN Aであり、 二本鎖であって も、 一本鎖であってもよい。 二本鎖の場合は、 二本鎖 DNA、 二本鎖 R NAまたは DN A ： RN Aのハイブリ ッ ドでもよレヽ。 一本鎖の場合は、 センス鎖 （すなわち、 コー ド鎖） であっても、 アンチセンス鎖 （すなわ ち、 非コード鎖） であってもよレ、。
本発明で用いられる P 2 Y2受容体蛋白質をコードする DNAと して は、 ゲノム DNA、 ゲノム D N Aライプラリー、 上記した細胞 ·組織由 来の c DNA、 上記した細胞 ·組織由来の c D N Aライブラリー、 合成 DNAのいずれでもよい。 ライブラリーに使用するベクターは、 バクテ リオファージ、 プラスミ ド、 コスミ ド、 ファージミ ドなどいずれであつ てもよい。 また、 上記した細胞 '組織より totalRN Aまたは mRN A 画分を調製したものを用いて直接 Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (以下、 R T— P C R法と略称する） によって増幅する こともできる。
具体的には、本発明で用いられる P 2 Y2受容体蛋白質をコードする D ΝΑと しては、 例えば、 配列番号 ： 2で表わされる塩基配列を含有する DNA、 または配列番号 ： 2で表わされる塩基配列に相補的な塩基配列 とハイス ト リ ンジェントな条件下でハイプリダイズする塩基配列を有し、 配列番号： 1で表わされるァミノ酸配列からなる P 2 Yつ受容体蛋白質と 実質的に同質の活性 （例、 リガンド結合活性、 シグナル情報伝達 用な ど） を有する受容体蛋白質をコードする D N Aであれば何れのものでも よい。
配列番号： 2で表わされる塩基配列に相補的な塩基配列とハイブリダ ィズできる DNAとしては、 例えば、 配列番号： 2で表わされる塩基配 列と約 8 5 %以上、 好ましくは約 9 0 %以上、 より好ましくは約 9 5 % 以上の相同性を有する塩基配列を含有する DN Aなどが用いられる。 具 体的には、 配列番号： 2で表わされる塩基配列に相補的な塩基配列とハ イブリダイズできる D N Aと しては、 マウス P 2 Y2 (P 2 U) (G e n B a n k A c c e s s i o n N o . L 1 4 7 5 1 ;配列番号 ： 5 )、 ラッ ト P 2 Y2(P 2 U) (G e n B a n k A c c e s s i o n N o . U 0 9 4 0 2 ；配列番号： 6 ) などが挙げられる。
ハイブリダイゼーションは、 公知の方法あるいはそれに準じる方法、 例えば、 モレキュラー · クローニング （Molecular Cloning) 2nd (J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方 法などに従って行なうことができる。 また、 市販のライブラリーを使用 する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。 より好ましくは、 ハイス トリンジェントな条件に従って行なうことがで きる。
該ハイス トリンジェントな条件とは、 例えば、 ナトリウム濃度が約 1 9〜 4 0 mM、好ましくは約 1 9〜 2 0 mMで、温度が約 5 0〜 7 0 °C、 好ましくは約 6 0〜 6 5 °Cの条件を示す。 特に、 ナトリゥム濃度が約 1 9 mMで温度が約 6 5 °Cの場合が最も好ましい。
より具体的には、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列を含有する ヒ ト P 2 Y2受容体蛋白質をコードする D Ν Αとしては、配列番号： 2で 表わされる塩基配列を含有する DN Aなどが用いられる。
本発明で用いられる P 2 Y2受容体蛋白質をコードする DN Αの塩基 配列の一部を含有してなるポリヌクレオチドとは、 下記の本発明の部分 ペプチドをコードする DNAを包含するだけではなく、 RNAをも包含 する意味で用いられる。
本発明に従えば、 P 2 Y 2受容体蛋白質遺伝子の複製または発現を阻害 することのできるアンチセンスポリヌク レオチド (核酸) を、 Ρ 2 Υ 2 受容体蛋白質をコードする D N Αのク.ローン化した、 あるいは決定され た塩基配列情報に基づき設計し、 合成しうる。 そうしたポリヌクレオチ ド （核酸） は、 P 2 Y 2受容体蛋白質遺伝子の R N Aとハイプリダイズす ることができ、 該 R N Aの合成または機能を阻害することができるか、 あるいは P 2 Y 2受容体蛋白質に関連する R N Αとの相互作用を介して P 2 Y 2受容体蛋白質遺伝子の発現を調節 ·制御することができる。 Ρ 2 Υ 2受容体蛋白質に関連する R Ν Αの選択された配列に相補的なポリヌ クレオチド、および P 2 Y 2受容体蛋白質に関連する R N Aと特異的にハ ィプリダイズすることができるポリヌクレオチドは、 生体内おょぴ生体 外で Ρ 2 Υ 2受容体蛋白質遺伝子の発現を調節'制御するのに有用であり、 また病気などの治療または診断に有用である。 用語 「対応する」 とは、 遺伝子を含めたヌクレオチド、 塩基配列または核酸の特定の配列に相同 性を有するあるいは相補的であることを意味する。 ヌクレオチド、 塩基 配列または核酸とペプチド （蛋白質） との間で 「対応する」 とは、 ヌク レオチド （核酸） の配列またはその相補体から誘導される指令にあるべ プチド （蛋白質） のアミノ酸を通常指している。 Ρ 2 Υ 2受容体蛋白質遺 伝子の 5， 端ヘアピンループ、 5 ' 端 6 —ベースペア ' リ ピート、 5， 端非翻訳領域、 ポリペプチド翻訳開始コ ドン、 蛋白質コード領域、 O R F翻訳終止コドン、 3 ' 端非翻訳領域、 3 ' 端パリンドローム領域、 お ょぴ 3， 端ヘアピンループは好ましい対象領域として選択しうるが、 P 2 Y 2受容体蛋白質遺伝子内の如何なる領域も対象として選択しうる。 目的核酸と、 対象領域の少なく とも一部に相補的でハイブリダィズす ることができるポリヌクレオチドとの関係は、対象物と 「アンチセンス J であるということができる。 アンチセンスポリヌクレオチドは、 2—デ ォキシ一 D—リボースを含有しているポリデォキシリボヌクレオチド、 D—リボースを含有しているポリ リボヌクレオチド、 プリンまたはピリ ミジン塩基の N—グリ コシドであるその他のタイプのポリヌクレ； チド、 あるいは非ヌクレオチド骨格を有するその他のポリマー （例えば、 市販 の蛋白質核酸および合成配列特異的な核酸ポリマー） または特殊な結合 を含有するその他のポリマー （但し、.該ポリマーは D N Aや R N A中に 見出されるよ うな塩基のペアリングゃ塩基の付着を許容する配置をもつ ヌク レオチドを含有する）などが挙げられる。それらは、 2本鎖 D N A、 1本鎖 D N A、 2本鎖 R N A、 1本鎖 R N A、 さらに D N A : R N Aハ イブリ ツ ドであることができ、 さらに非修飾ポリヌクレオチド （または 非修飾オリ ゴヌク レオチド）、 さらには公知の修飾の付加されたもの、例 えば当該分野で知られた標識のあるもの、 キャップの付いたもの、 メチ ル化されたもの、 1個以上の天然のヌク レオチドを類縁物で置換したも の、分子内ヌク レオチド修飾のされたもの、例えば非荷電結合（例えば、 メチノレホスホネート、 ホスホ トリエステノレ、 ホスホノレアミデート、 カル パメートなど） を持つもの、 電荷を有する結合または硫黄含有結合 （例 えば、 ホスホロチォエート、 ホスホロジチォエートなど） を持つもの、 例えば蛋白質 （ヌク レアーゼ、 ヌク レアーゼ 'インヒ ビター、 トキシン、 抗体、 シグナルペプチド、 ポリ一 L一リジンなど） や糖 （例えば、 モノ サッカライ ドなど） などの側鎖基を有しているもの、 インターカレント 化合物 （例えば、 ァク リジン、 プソラレンなど） を持つもの、 キレート 化合物 （例えば、 金属、 放射活性をもつ金属、 ホウ素、 酸化性の金属な ど） を含有するもの、 アルキル化剤を含有するもの、 修飾された結合を 持つもの （例えば、 α ァノマー型の核酸など） であってもよい。 ここで 「ヌクレオシド」、 「ヌクレオチド」 および 「核酸」 とは、 プリ ンおよび ピリ ミジン塩基を含有するのみでなく、 修飾されたその他の複素環型塩 基をもつようなものを含んでいて良い。 こ う した修飾物は、 メチル化さ れたプリンおよびピリ ミジン、ァシル化されたプリンおよぴピリ ミジン、 あるいはその他の複素環を含むものであってよい。 修飾されたヌクレオ チドおよび修飾されたヌクレオチドはまた糖部分が修飾されていてよく、 例えば、 1個以上の水酸基がハロゲンとか、 脂肪族基などで置換されて いたり、あるいはエーテル、アミンなどの官能基に変換されていてよい。 本発明のアンチセンスポリヌクレオチド （核酸） は、 RNA、 D NA、 あるいは修飾された核酸 （R NA、 D NA) である。 修飾された核酸の 具体例と しては核酸の硫黄誘導体ゃチォホスフ ート誘導体、 そしてポ リヌクレオシドアミ ドゃォリ ゴヌクレオシドアミ ドの分解に抵抗性のも のが挙げられるが、 それに限定されるものではない。 本発明のアンチセ ンス核酸は次のような方針で好ましく設計されうる。 すなわち、 細胞内 でのアンチセンス核酸をより安定なものにする、 アンチセンス核酸の細 胞透過性をより高める、 目標とするセンス鎖に対する親和性をより大き なものにする、 そしてもし毒性があるならアンチセンス核酸の毒性をよ り小さなものにする。
こう した修飾は当該分野で数多く知られており、 例えば J. Kawakami et al. , Pharra Tech Japan, Vol. 8， pp.247, 1992； Vol. 8, pp.395, 1992; S. T. Crooke et al. ed. , Antisense Research and Applications, CRC Press, 1993 などに開示がある。
本発明のアンチセンス核酸は、 変化せしめられたり、 修飾された糖、 塩基、 結合を含有していて良く、 リボゾーム、 ミクロスフエアのような 特殊な形態で供与されたり、 遺伝子治療により適用されたり、 付加され た形態で与えられることができうる。 こ う して付加形態で用いられるも のとしては、 リ ン酸基骨格の電荷を'中和するように働くポリ リジンのよ うなポリカチオン体、 細胞膜との相互作用を高めたり、 核酸の取込みを 増大せしめるよ うな脂質 （例えば、 ホスホリ ピド、 コレステロールなど） といった粗水性のものが挙げられる。付加するに好ましい脂質としては、 コレステ口ールやその誘導体（例えば、コ レステリルク ロ口ホルメ一ト、 コ^ "ル酸など） が挙げられる。 こ う したものは、 核酸の 3 ' 端あるいは 5 ' 端に付着させることができ、 塩基、 糖、 分子内ヌクレオシド結合を 介して付着させることができ うる。 その他の基と しては、 核酸の 3 ' 端 あるいは 5 ' 端に特異的に配置されたキャップ用の基で、 ェキソヌクレ ァーゼ、 R N a s eなどのヌク レアーゼによる分解を阻止するためのも のが挙げられる。 こう したキャップ用の基としては、 ポリエチレ グリ コール、 テトラエチレングリ コールなどのグリ コールをはじめとした当 該分野で知られた水酸基の保護基が举げられるが、 それに限定されるも のではない。 .
アンチセンス核酸の阻害活性は、 本発明の形質転換体、 本発明の生体 内や生体外の遺伝子発現系、 あるいは G蛋白質共役型受容体蛋白質の生 体内や生体外の翻訳系を用いて調べることができる。 該核酸は公知の各 種の方法で細胞に適用できる。
本発明で用いられる P 2 Y2受容体蛋白質の部分べプチドをコードす る DN Αとしては、 上記した本発明で用いられる部分ペプチドをコード する塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。 ま た、 ゲノム DNA、 ゲノム DNAライブラリー、 上記した細胞 '組織由 来の c DNA、 上記した細胞 ·組織由来の c DNAライブラリー、 合成 DNAのいずれでもよい。 ライブラリーに使用するベクターは、 バクテ リオファージ、 プラスミ ド、 コスミ ド、 ファージミ ドなどいずれであつ てもよい。 また、 上記した細胞 '組織より mRN A画分を調製したもの を用いて直接 R T_ P C R法によって増幅することもできる。
具体的には、本発明で用いられる P 2 Y2受容体蛋白質の部分べプチド をコードする DNAとしては、 例えば、 （ 1 ) 配列番号： 2で表わされる 塩基配列を有する D Ν Αの部分塩基配列を有する D ΝΑ、 または （2) 配列番号： 2で表わされる塩基配列に相捕的な塩基配列とハイス ト リ ン ジェントな条件下でハイブリダィズする塩基配列を有し、 配列番号 ： 1 で表わされるアミノ酸配列からなる Ρ 2 Υ2受容体蛋白質と実質的に同 質の活性 （例、 リガンド結合活性、 シグナル情報伝達作用など） を有す る受容体蛋白質をコードする DN Αの部分塩基配列を有する DN Αなど が用いられる。
配列番号： 2で表わされる塩基配列と相補的な塩基配列とハイプリダ ィズできる D N Aとしては、 例えば、 配列番号： 2で表わされる塩基配 列と約 8 5 %以上、 '好ましくは約 9 0 %以上、 より好ましくは約 9 5 % 以上の相同性を有する塩基配列を含有する DNAなどが用いられる,。
本発明で用いられる P 2 Y2受容体蛋白質またはその部分ぺプチドを 完全にコードする DN Αのクローニングの手段としては、 P 2 Y2受容体 蛋白質またはその部分ぺプチドを完全にコードする DN Αの部分塩基配 列を有する合成 DN Aプライマーを用いて P C R法によって増幅する力 、 または適当なべクターに組み込んだ D N Aを P 2 Y2受容体蛋白質また はその部分べプチドを完全にコードする DN Αの一部あるいは全領域に 相当する DNA断片もしくは合成 DN Aを標識したものとハイプリダイ ゼーションを行うことによつて選別することができる。 ハイブリダイゼ ーシヨ ンの方法は、 例えば、 モレキュラー · ク ローニング （Molecular Cloning) 2nd u · iambrook et al. , Cold Spring Harbor Lao. Press, 1989) に記載の方法などに従って行なうことができる。 また、 市販のラ ィブラリーを使用する場合、 添付の使用説明書に記載の方法に従って行 なうことができる。
D N Aの塩基配列の置換は、 P CRや公知のキッ ト、 例えば、 Mu t a n™- s u p e r E x p r e s s Km (宝酒造 （株））、 Mu t a n™ 一 K (宝酒造 （株）） などを用いて、 〇 D A— L A P C R法、 G a p p e d d u p l e x法、 K u n k e l法などの公知の方法あるいはそれら に準じる方法に従って行なうことができる。
クローン化された P 2 Y2受容体蛋白質をコードする D Ν Αは目的に よりそのまま、 または所望により制限酵素で消化したり、 リンカ一を付 加したり して使用することができる。 該 DN Aはその 5 ' 末端側に翻訳 開始コ ドンとしての AT Gを有し、 また 3 ' 末端側には翻訳終止コ ドン としての TAA、 TG Aまたは TAGを有していてもよい。 これらの翻 訳開始コ ドンや翻訳終止コ ドンは、 適当な合成 DNAアダプターを用い て付加することもできる。
P 2 Y2受容体蛋白質の発現ベクターは、 例えば、 （ィ） Ρ 2 Υ2受容体 蛋白質をコードする DNAから目的とする DNA断片を切り出し、 （口） 該 DN Α断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結する ことにより製造することができる。
ベクターとしては、 大腸菌由来のプラスミ ド （例、 p B R 3 2 2、 p B R 3 2 5、 p UC 1 2、 p UC 1 3)、 枯草菌由来のプラスミ ド （例、 p UB 1 1 0、 p T P 5、 p C 1 9 4.)、 酵母由来プラスミ ド （例、 p S H I 9、 p SH 1 5)、 λ ファージなどのパクテリ オファージ、 レ トロ ウイノレス、 ワクシニアゥイ ノレス、 バキュ口ウイゾレスなどの動物ウイノレス などの他、 p A l— 1 1、 p XT l、 p R c ZCMV、 p R c /R S V、 p c DNA l /N e oなどが用いられる。
本発明で用いられるプロモーターと しては、 遺伝子の発現に用いる宿 主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。 例え ば、 動物細胞を宿主と して用いる場合は、 S R a プロモーター、 S V 4 0プロモーター、 L TRプロモーター、 CMVプロモーター、 H S V - TKプロモーターなどが挙げられる。 これらのうち、 CMVプロモータ 一、 S Rひ プロモーターなどを用いるのが好ましい。
宿主がェシエリ ヒア属菌である場合は、 t r pプロモーター、 l a c プロモーター、 r e c Aプロモーター、 ； L PL プロモーター、 l p pプ 口モーターなどが、 宿主がバチルス属菌である場合は、 S P O lプロモ 一ター、 S P 02プロモーター、 p e n Pプロモーターなど、 宿主が酵 母である場合は、 PH05プロモーター、 P GKプロモーター、 GAP プロモーター、 AD Hプロモーターなどが好ましい。 宿主が昆虫細胞で ある場合は、 ポリヘドリ ンプロモーター、 P 1 0プロモーターなどが好 ましい。
発現ベクターには、 以上の他に、 所望によ りェンハンサー、 スプライ シングシグナル、 ポリ A付加シグナル、 選択マーカー、 S V 4 0複製ォ リジン （以下、 S V 4 0 o r i と略称する場合がある） などを含有して いるものを用いることができる。 選択マーカ一と しては、 例えば、 ジヒ ドロ葉酸還元酵素 （以下、 d h f r と略称する場合がある） 遺伝子 〔メ ソ ト レキセー ト （MTX) 耐性〕、 アンピシリ ン耐性遺伝子 （以下、 Am pr と略称する場合がある）、 ネオマイシン耐性遺伝子 （以下、 N e or と略称する場合がある、 G 4 1 8耐性） 等が挙げられる。 特に、 （J HO ( d h f r— )細胞を用いて d h f r遺伝子を選択マーカーと して使用す る場合、 目的遺伝子をチミジンを含まない培地によっても選択できる。 また、 必要に応じて、 宿主に合ったシグナル配列を、 本発明の受容体 蛋白質の N端末側に付加する。 宿主がェシエリ ヒア属菌である場合は、 P h o A · シグナル配列、 Om p A · シグナル配列などが、 宿主がバチ ルス属菌である場合は、 α—ァミラーゼ ·シグナル配列、 サブチリシン ' シグナル配列などが、宿主が酵母である場合は、 MF a ·シグナル配列、 S U C 2 · シグナル配列など、 宿主が動物細胞である場合には、 インシ ユリ'ン ' シグナル配列、 ct一インターフヱロン ' シグナル配歹 IJ、 抗体分 子 · シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
このようにして構築された本発明の P 2 Y2受容体蛋白質をコードす る DN Αを含有するベクターを用いて、 形質転換体を製造することがで きる。 宿主と しては、 例えば、 ェシエリ ヒア属菌、 バチルス属菌、 酵母、 昆虫細胞、 昆虫、 動物細胞.などが用いられる。
ェシエリ ヒァ属菌の具体例と しては、ェシエリ ヒア 'コリ （Escherichia coli) K 1 2 · D Η 1 〔プロシージングズ · ォブ · ザ · ナショナル · ァ 力デミ一'ォプ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ザ ·ユーエスエー （Proc. Natl. Acad. Sci. U S A), 6 0卷， 1 6 0 ( 1 9 6 8 )〕， J M 1 0 3 〔ヌクイ レック - ァシッズ · リサーチ (Nucleic Acids Research) , 9卷， 3 0 9 ( 1 9 8 1 )〕， J A 2 2 1 〔ジャーナル · ォブ 'モレキュラー 'バイオ口 - — (Journal of Molecular Biology) , 1 2 0卷， 5 1 7 ( 1 9 7 8 )], H B 1 0 1 〔ジャーナル'ォブ 'モレキュラー 'バイオロジー， 4 1卷， 4 5 9 ( 1 9 6 9)〕， C 6 0 0 〔ジェネティックス （Genetics), 3 9卷， 4 4 0 (1 9 5 4)〕 などが用いられる。
バチルス属菌と しては、 例えば、 バチルス ' ズプチルス （Bacillus subtilis) M I 1 1 4 〔ジーン， 2 4卷， 2 5 5 ( 1 9 8 3)〕， 2 0 7 — 2 1 〔ジャーナノレ'才ブ'ノ ィ才ケミス ト リ一 (Journal of Biochemistry)， 9 5卷， 8 7 ( 1 9 8 4 )〕 などが用いられる。 酵母と しては、例えば、サッカロマイセス セレビシェ（Saccharqmyces cerevisiae) AH 2 2 , AH 2 2 R- ' Ν A 8 7— 1 1 A, DKD— 5 D、 2 O B— 1 2、 シゾサッカロマイセス ボンべ (Schizosaccharomyces pombe) N C Y C 1 9 1 3 , N C Y C 2 0 3 6、 ピキア パス ト リ ス (Pichia pastoris) など力 用レヽられる。
昆虫細胞と しては、 例えば、 ウィルスが A c N P Vの場合は、 夜盗蛾 の幼虫由来株ィ匕細胞 (Spodoptera frugiperda cell ； S f 細胞）、 Trichoplusia niの中腸由来の MG 1細胞、 Trichoplusia niの卵由来の High Five™ 糸田胞、 Mamestra brassicae 由来の細月包または Estigmena acrea 由来の細胞などが用いられる。 ウィルスが B m N P Vの場合は、 蚕由来株化細胞 （Bombyxmori N； B mN細胞） などが用いられる。 該 S f 細胞と しては、例えば、 S f 9細胞 （ATCCCRL1711)、 S f 2 1細胞 （以 上、 Vaughn, J. L. ら、 イン ' ヴイボ （In Vivo) ，13， 213-217, (1977)) などが用いられる。
昆虫と しては、 例えば、 カイコの幼虫などが用いられる 〔前田ら、 ネ イチヤー （Nature), 3 1 5卷， 5 9 2 ( 1 9 8 5 )〕。
動物細胞と しては、 例えば、 サル細胞 CO S— 7， V e r o , チヤィ ニーズハムスター細胞 C H O (以下、 CHO細胞と略記）、 d h f r遺伝 子欠損チャイニーズハムスター細胞 C HO (以下、 CHO (d h f r一） 細胞と略記）、 マウス L細胞， マウス A t T— 2 0、 マウスミエ口一マ細 胞、 ラッ ト GH 3、 ヒ ト F L細胞などが用いられる。
ェシエリ ヒア属菌を形質転換するには、 例えば、 プロシージングズ · ォプ ·ザ ·ナショナル 'アカデミー ·ォブ 'サイェンジィズ 'ォブ 'ザ ' ユーエスエー (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 6 9卷， 2 1 1 0 ( 1 9 7 2) やジーン （Gene), 1 7巻， 1 0 7 ( 1 9 8 2) などに記載の方法 に従って行なうことができる。
バチルス属菌を形質転換するには、 例えば、 モレキュラー · アンド ' ジェネラノレ - ジェネティ ックス (Molecular & General Genetics) , 1 6 8巻， 1 1 1 ( 1 9 7 9 )などに記載の方法に従って行なうことができ 酵母を形質転換するには、 例えば、 メッソズ ' イン 'ェンザィモロジ 一 (Methods in Enzymology)， 1 9 4卷， 1 8 2— 1 8 7 ( 1 9 9 1 )、 プ口シージングズ ··ォブ · ザ ·ナショ .ナル ' アカデミー■ォブ 'サイエ ンシィズ ' ォブ ·ザ · ユーエスエー （Proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 7 5卷， 1 9 2 9 ( 1 9 7 8 ) などに記載の方法に従って行なうことができ る。
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、 例えば、 バイオ/テクノロ ジー （Bio/Technology) , 6， 47- 55 (1988)などに記載の方法に従って行 なうことができる。
動物細胞を形質転換するには、 例えば、 細胞工学別冊 8新細胞工学実 験プロ トコール. 2 6 3 — 2 6 7 ( 1 9 9 5 ) (秀潤社発行）、 ヴィロロ ジー （Virology), 5 2卷， 4 5 6 ( 1 9 7 3 )に記載の方法に従って行な うことができる。
このようにして、 P 2 Y2受容体蛋白質をコードする DN Αを含有する 発現べクターで形質転換された形質転換体が得られる。
宿主がェシエリヒア属菌、 バチルス属菌である形質転換体を培養する 際、 培養に使用される培地としては液体培地が適当であり、 その中には 該形質転換体の生育に必要な炭素源、 窒素源、 無機物その他が含有せし められる。 炭素源としては、 例え 、'グルコース、 デキス ト リ ン、 可溶 性澱粉、 ショ糖など、 窒素源としては、 例えば、 アンモニゥム塩類、 硝 酸塩類、 コーンスチープ ' リカー、 ペプトン、 カゼイン、 肉エキス、 大 豆粕、 バレイショ抽出液などの無機または有機物質、 無機物としては、 例えば、 塩化カルシウム、 リン酸二水素ナトリ ウム、 塩化マグネシウム などが挙げられる。 また、 酵母エキス、 ビタミン類、 生長促進因子など を添加してもよい。 培地の p Hは約 5〜 8が望ましい。
ェシエリ ヒァ属菌を培養する際の培地としては、例えば、グルコース、 カザミノ酸を含む M 9培地 〔ミラー （Miller), ジャーナル 'ォブ 'ェク スペリ メ ンッ · イン · モ レキュラー · ジエネティ ックス (Journal of Experiments in Molecular Genetics)， 4 3 1 — 4 3 3， Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1 9 7 2 ] が好ましい。 ここに必要によ りプロモータ一を効率よく働かせるために、 例えば、 3 一イ ン ^、リル アタリル酸のような薬剤を加えること.ができる。
宿主がェシエリ ヒア属菌の場合、 培養は通常約 1 5〜 4 3 °Cで約 3〜 2 4時間行ない、 必要により、 通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、 培養は通常約 3 0〜 4 0 °Cで約 6〜 24 時間行ない、 必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えば、 ノ ークホーノレダー (Burkholder) 最 /J、培地 [Bostian, K. L. ら、 プロシ 一ジングズ .ォプ . ザ ' ナショナル · アカデミー ·ォブ · サイエンシィ ズ ·ォプ ·ザ ·ユーエスエー (Proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 7 7卷， 4 5 0 5 (1 9 8 0)〕や 0. 5 %カザミノ酸を含有する S D培地〔Bitter， G. A. ら、 プロシージングズ 'ォブ · ザ ·ナショナル ' アカデミー 'ォ プ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ザ ·ユーエスエー （Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 8 1卷， 5 3 3 0 ( 1 9 8 4)〕 が挙げられる。 培地の p Hは約 5 〜 8に調整するのが好ましい。 培養は通常約 2 0 °C〜 3 5 °Cで約 2 4〜 7 2時間行ない、 必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、 培地とし ては、 Grace' s Insect Medium (Grace, T. C. C. , ネイチヤー (Nature) ， 195, 788(1962)) に非動化した 1 0 %ゥシ血清等の添加物を適宜加えた ものなどが用いられる。 培地の p Hは約 6. 2〜 6. 4に調整するのが 好ましい。 培養は通常約 2 7 °Cで約 3〜 5 日間行ない、 必要に応じて通 気や撹拌を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例え ば、約 5〜 20 %の胎児牛血清を含む MEM培地〔サイエンス（Science), 1 2 2卷， 5 0 1 (1 9 5 2)〕， DMEM培地〔ヴィ口口ジー（Virology)， 8卷， 3 9 6 (1 9 5 9)〕， R PM I 1 6 4 0培地 〔ジャーナル ·ォブ · ' ザ ' アメ リカン ' メディカル ' アソシエーショ ン (The Journal of the American Medical Association) 1 9 9卷， 5 1 9 ( 1 9 6 7)〕， 1 9 9 培地 〔プ口シージング ' ォブ 'ザ ' ソサイエティ ' フォー ' ザ 'バイオ 口ンカノレ · メアイスン (Proceeding of the Society for the Biological Medicine), 7 3卷， 1 ( 1 9 5 0 )〕 などが用いられる。 11は約 6〜 8 であるのが好ましい。 培養は通常約 3 0 °C〜 4 0 °Cで約 1 5〜 6 0時間 行ない、 必要に応じて通気や撹拌を加える。
以上のようにして、 形質転換体の細胞内、 細胞膜または細胞外に本発 明の P 2 Y2受容体蛋白質を生成せしめることができる。
上記培養物から本発明で用いられる Ρ 2 Υ2受容体蛋白質を分離精製 するには、 例えば、 下記の方法により行なうことができる。
本発明で用いられる Ρ 2 Υ2受容体蛋白質を培養菌体あるいは細胞か ら抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、 これを適当な緩衝液に懸濁し、 超音波、 リゾチームおよび/または凍結 融解などによって菌体ぁるいは細胞を破壊したのち、 遠心分離やろ過に より Ρ 2 Υ2受容体蛋白質の粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。 緩衝液の中に尿素や塩酸グァニジンなどの蛋白質変性剤や、 T r i t o n (登録商標） X— 1 0 0などの界面活性剤が含まれていてもよい。 培 養液中に P 2 Y2受容体蛋白質が分泌される場合には、培養終了後、公知 の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、 上清を集める。
このようにして得られた培養上清、 あるいは抽出液中に含まれる Ρ 2 Υ2受容体蛋白質の精製は、公知の分離 ·精製法を適切に組み合わせて行 なうことができる。 これらの公知の分離、 精製法としては、 塩析ゃ溶媒 沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、 および S D S—ポリアタリルァミ ドゲル電気泳動法などの主として分子 量の差を利用する方法、 イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差 を利用する方法、 ァフィ二ティークロマトグラフィーなどの特異的新和 性を利用する方法、 逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差 を利用する方法、 等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法な どが用いられる。 ' · このよ うにして得られる P 2 Y 2受容体蛋白質が遊離体で得ら た場 合には、 公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換するこ とができ、 逆に塩で得られた場合には公知の方法あるいはそれに準じる 方法により、 遊離体または他の塩に変換することができる。
なお、 組換え体が産生する Ρ 2 Υ 2受容体蛋白質を、 精製前または精製 後に適当な蛋白修飾酵素を作用させることにより、 任意に修飾を加えた り、 ポリペプチドを部分的に除去することもできる。 蛋白修飾酵素とし ては、 例えば、 ト リプシン、 キモ ト リブシン、 アルギニルエンドべプチ ダーゼ、 プロテインキナーゼ、 グリ コシダーゼなどが用いられる。
このようにして生成する Ρ 2 Υ 2受容体蛋白質の活性は、標識したリガ ンドとの結合実験および特異抗体を用いたェンザィムィムノアッセィな どにより測定する.ことができる。
本発明で用いられる Ρ 2 Υ 2受容体蛋白質に対する抗体は、本発明で用 いられる Ρ 2 Υ 2受容体蛋白質を認識し得る抗体であれば、ポリクローナ ル抗体、 モノクローナル抗体の何れであってもよい。
本発明で用いられる Ρ 2 Υ 2受容体蛋白質に対する抗体は、 Ρ 2 ¥ 2受 容体蛋白質を抗原と して用い、 公知の抗体または抗血清の製造法に従つ て製造することができる。
〔モノクロニナル抗体の作製〕
( a ) モノクローナル抗体産生細胞の作製
本発明で用いられる P 2 Y 2受容体蛋白質は、哺乳動物に対して投与に より抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、 希釈剤とともに投 与される。 投与に際して抗体産生能を高めるため、 完全フロイントアジ ュバントや不完全フロイントアジュバン トを投与してもよい。 投与は通 常 2〜 6週毎に 1回ずつ、 計 2〜 1 0回程度行なわれる。 用いられる哺 乳動物と しては、 例えば、 サル、 ゥサギ、 ィヌ、 モルモッ ト、 マウス、 ラッ ト、 ヒッジ、 ャギが挙げられるが、 マウスおょぴラッ トが好ましく 用いられる。
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、 抗原を免疫された温 血動物、 例えば、 マウスから抗体価の認められた個体を選択し最释免疫 の 2〜 5 日後に脾臓またはリ ンパ節を採取し、 それらに含まれる抗体産 生細胞を骨髄腫細胞と融合させることにより、 モノクローナル抗体産生 ハイプリ ドーマを調製することができる。 抗血清中の抗体価の測定は、 例えば、 後記の標識化受容体蛋白質と抗血清とを反応させたのち、 抗体 に結合した標識剤の活性を測定することにより行なう ことができる。 融 合操作は既知の方法、 例えば、 ケーラーとミルスタインの方法 〔ネイチ ヤー （Nature)、 2 5 6卷、 4 9 5頁 （ 1 9 7 5年）〕 に従い実施するこ とができる。 融合促進剤と しては、 例えば、 ポリエチレングリ コール （ P EG) やセンダイウィルスなどが挙げられるが、 好ましくは P E Gが用 いられる。
骨髄腫細胞としては、 例えば、 N S— 1、 P 3 U 1、 S P 2/0など が挙げられるが、 P 3 U 1が好ましく用いられる。 用いられる抗体産生 細胞 （脾臓細胞） 数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は 1 ： 1〜 2 0 : 1程度であり、 P E G (好ましくは、 P EG 1 0 0 0〜P E G 6 0 0 0 ) が 1 0〜 8 0 %程度の濃度で添加され、 約 2 0〜 4 ◦ °C、 好ましくは約 3 0〜 3 7 °Cで約 1〜 1 0分間ィンキュベートすることにより効率よく 細胞融合を実施できる。
モノクローナル抗体産生ハイブリ ドーマのスク リ一ユングには種々の 方法が使用できるが、 例えば、 受容体蛋白質の抗原を直接あるいは担体 とともに吸着させた固相 （例、 マイクロプレート） にン、イブリ ドーマ培 養上清を添加し、 次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリ ン抗体 （細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、 抗マウス免疫グロ ブリン抗体が用いられる） またはプロテイン Aを加え、 固相に結合した モノクローナル抗体を検出する方法、 抗免疫グロブリ ン抗体またはプロ ティン Aを吸着させた固相にハイプリ ドーマ培養上清を添加し、 放射性 物質や酵素などで標識した受容体蛋白質を加え、 固相に結合したモノク ローナル抗体を検出する方法などが挙げられる。
' モノクローナル抗体の選別は、 公知あるいはそれに準じる方法に従つ て行なう ことができるが、 通常は H A T (ヒポキサンチン、 アミノプテ リ ン、チミジン）を添加した動物細胞用培地などで行なう ことができる。 選別および育種用培地と しては、 ハイプリ ドーマが.生育できるものなら ばどのような培地を用いても良い。 例えば、 1〜 2 0 %、 好ましくは 1 0〜 2 0 %の牛胎児血清を含む R P M I 1 6 4 0培地、：！〜 1 0 %の牛 胎児血清を含む G I T培地 （和光純薬工業 （株）） またはハイプリ ドーマ 培養用無血清培地 （S F M— 1 0 1、 日水製薬 （株）） などを用いること ができる。培養温度は、通常 2 0〜 4 0 °C、好ましくは約 3 7 °Cである。 培養時間は、 通常 5 日〜 3週間、 好ましくは 1週間〜 2週間である。 培 養は、 通常 5 %炭酸ガス下で行なうことができる。 ハイプリ ドーマ培養 上清の抗体価は、 上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定でき る。
( b ) モノクローナル抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、 通常のポリ クローナル抗体の分離 精製と同様に免疫グロプリ ンの分離精製法 〔例、 塩析法、 アルコール沈 殿法、 等電点沈殿法、 電気泳動法、 イオン交換体 （例、 D E A E ) によ る吸脱着法、 超遠心法、 ゲルろ過法、 抗原結合固相またはプロテイン A あるいはプロティン Gなどの活性吸着剤によ り抗体のみを採取し、 結合 を解離させて抗体を得る特異的精製法〕 に従って行なうことができる。
〔ポリ クローナル抗体の作製〕
本発明のポリ クローナル抗体は、 公知あるいはそれに準じる方法にし たがって製造することができる。 例えば、 免疫抗原 （P 2 Y 2受容体蛋白 質抗原） とキャリアー蛋白質との複合体をつく り、 上記のモノクローナ ル抗体の製造法と同様に哺乳動物に免疫を行ない、 該免疫動物から本発 明で用いられる Ρ 2 Υ 2受容体蛋白質に対する抗体含有物を採取して 、 抗体の分離精製を行なう ことにより製造できる。
哺乳動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキヤリア一蛋白質と の複合体に関し、 キヤリァー蛋白質の種類およびキヤリア一とハプテン との混合比は、 キャ リ アーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体 が効率良くできれば、 どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよい が、 例えば、 ゥシ血清アルブミン、 ゥシサイログロブリ ン、 キーホール ' リ ンぺッ ト .へモシァニン等を重量比でハプテン 1に対し、約 0 . 1〜 2 0、 好ましくは約 · 1〜 5の割合でカプルさせる方法が用いられる。
また、 ハプテンとキャリアーの力プリ ングには、 種々の縮合剤を用い ることができるが、 ダルタルアルデヒ ドゃカルポジイミ ド、 マレイ ミ ド 活性エステル、 チオール基、 ジチオビリ ジル基を含有する活性エステル 試薬等が用いられる。
縮合生成物は、 温血動物に対して、 抗体産生が可能な部位にそれ自体 あるいは担体、 希釈剤と ともに投与される。 投与に際して抗体産生能を 高めるため、 完全フロイン トアジュバントゃ不完全フロイン トアジュバ ントを投与してもよい。 投与は、 通常約 2〜 6週毎に 1回ずつ、 計約 3 〜 1 0回程度行なうことができる。
ポリ クローナル抗体は、 上記の方法で免疫された哺乳動物の血液、 腹 水など、 好ましく は血液から採取することができる。
抗血清中のポリ クローナル抗体価の測定は、 上記の血清中の抗体価の 測定と同様にして測定できる。 ポリ クローナル抗体の分離精製は、 上記 のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロプリ ンの分離精製法 に従って行なうことができる。
具体的には、本発明で用いられる Ρ 2 Υ 2受容体蛋白質に対する抗体と しては、 例えば、 Ρ 2 Υ 2受容体蛋白質の C末端ぺプチドまたはその塩を 認識する抗体 （特に、 モノ クローナル抗体） などが好ましい。
また、本発明で用いられる Ρ 2 Υ 2受容体蛋白質は、特に骨格筋で高発 現している。
したがって、 本発明で用いられる Ρ 2 Υ 2受容体蛋白質、 Ρ 2 Υ 2受容 体蛋白質をコードする D N A、 P 2 Y 2受容体蛋白質に対する抗体、 P 2 Y 2受容体蛋白質をコ一ドする D Ν Αに対するアンチセンス D Ν Αは、以 下の用途を有している。
' ( 1 ) '血糖低下剤 本発明で用いられる P 2 Y2 '受容体蛋白質をコードする DNAを λ、血糖 低下剤などの医薬として使用することができる。
例えば、 生体内において Ρ 2 Υ2受容体蛋白質が減少しているために、 リガンドである UT Ρまたは AT Pなどの生理作用が期待できない （P 2 Y2受容体蛋白質の欠乏症） 患者がいる場合に、 a ) P 2 Y2受容体蛋 白質を該患者に投与し該 Ρ 2 Υ2受容体蛋白質の量を補充したり、 b ) (ィ） P 2 Y2受容体蛋白質をコードする DN Αを該患者に投与し発現さ 'せることによって、 あるいは （口） 対象となる細胞に本発明で用いられ る P 2 Y2受容体蛋白質をコードする D Ν Αを挿入し発現させた後に、該 細胞を該患者に移植することなどによって、患者の体内における P 2 Y2 受容体蛋白質の量を増加させ、 リガンドの作用を充分に発揮させること ができる。すなわち、本発明で用いられる Ρ 2 Υ2受容体蛋白質をコード する DNAは、 安全で低毒性な血糖低下剤として有用である。
具体的には、本発明で用いられる Ρ 2 Υ2受容体蛋白質をコードする D ΝΑは、 例えば、 糖尿病、 耐糖能障害、 ケトーシス、 アシドーシス、 糖 尿病性神経障害、 糖尿病性腎症、 糖尿病性網膜症、 高脂血症、 肥満症、 代謝症候群、 性機能障害、 皮膚疾患、 関節症、 骨減少症、 動脈硬化、 血 栓性疾患、 消化不良、 記憶学習障害など、 好ましくは糖尿病に使用する ことができる。 糖尿病には、 インス リ ン依存型 （ I型） 糖尿病、 インス リン非依存型 （ I I型） 糖尿病などが含まれる。
本発明で用いられる Ρ 2 Υ2受容体蛋白質をコードする DN Αを上記 血糖低下剤として使用する場合は、 常套手段に従って製剤化することが できる。
一方、 P 2 Y2受容体蛋白質をコードする DNAを上記血糖低下剤とし て使用する場合は、 該 DNAを単独あるいはレ トロ ウイルスベクター、 アデノ ウィルスベクター、 アデノ ウィルスァソシエーテッ ドウィルスべ クタ一などの適当なベクターに揷入した後、 常套手段に従って実施する ことができる。 DNAは、 そのままで、 あるいは摂取促進のための補助 ■ 剤とともに、 遺伝子銃やハイ ド口ゲルカテーテルのようなカテーテルに よって投与できる。 4 例えば、本発明で用いられる P 2 Y 2受容体蛋白質をコードする D N A は、 必要に応じて糖衣を施した錠剤、 カプセル剤、 エリキシル剤、 マイ ク口カプセル剤などとして経口的に、 .あるいは水もしくはそれ以外の薬 学的に許容し得る液との無菌性溶液、 または懸濁液剤などの注射剤の形 で非経口的に使用できる。 例えば、 本発明で用いられる Ρ 2 Υ 2受容体蛋 白質をコードする D Ν Αを生理学的に認められる公知の担体、 香味剤、 賦形剤、 べヒクル、 防腐剤、 安定剤、 結合剤などとともに一般に認めら れた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造す ることができる。 これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適 当な容量が得られるようにするものである。
錠剤、 力プセル剤などに混和することができる添加剤と しては、 例え ば、 ゼラチン、 コーンスターチ、 トラガント、 アラビアゴムのような結 合剤、 結晶性セルロースのような賦形剤、 コーンスターチ、 ゼラチン、 アルギン酸などのような膨化剤、 ステアリ ン酸マグネシウムのような潤 滑剤、 ショ糖、 乳糖またはサッカリ ンのような甘味剤、 ペパーミント、 ァカモノ油またはチヱリ一のような香味剤などが用いられる。 調剤単位 形態がカプセルである場合には、 上記タイプの材料にさらに油脂のよう な液状担体を含有することができる。 注射のための無菌組成物は注射用 水のようなべヒクル中の活性物質、 胡麻油、 椰子油などのような天然産 出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処 方することができる。 注射用の水性液と しては、 例えば、 生理食塩水、 ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液 （例えば、 D—ソルビトール、 D—マンニ トール、 塩化ナトリ ウムなど） などが用いられ、 適当な溶解 補助剤、 例えば、 アルコール （例、 エタノール）、 ポリアルコール （例、 プロ ピレンダリ コール、 ポリエチレングリ コール）、 非ィォン性界面活性 剤 （例、 ポリ ソルベート 8 0 TM、 H C O— 5 0 ) などと併用してもよレヽ。 油性液と しては、 例えば、 ゴマ油、 大豆油などが用いられ、 溶解補助剤 である安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコールなどと併用してもよレ、。 また、 上記血糖低下剤は、 例えば、 緩衝剤 （例えば、 リン酸塩緩衝液、 酢酸ナトリ ゥム緩衝液）、 無痛化剤 (例えば、 塩化ベンザルコニゥム、 塩 酸プロ力インなど）、 安定剤 （例えば、 ヒ ト血清アルブミン、 ポリエチレ ングリ コールなど）、 保存剤 （例えば、. ベンジルアルコール、 フエノール など）、 酸化防止剤などと配合してもよい。 調製された注射液は通常、 適 当なアンプルに充填される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒ トゃ哺乳動物 （例えば、 ラッ ト、 マウス、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して投与することができる。
本発明で用いられる P 2 Y2受容体蛋白質をコードする DNAの投与 量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などにより差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に例えば、 糖尿病患者 （6 0 k gとして） にお いては、一日にっき約 0. 1〜 1 0 0 m g、 好ましくは約 1. 0〜 5 0 m g、 より好ましくは約 1. 0〜 2 0 m gである。 非経口的に投与する場 合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などによ つても異なるが、 例えば、 注射剤の形では通常例えば、 糖尿病患者 （6 0 k gとして） においては、 一日にっき約 0. 0 1〜 3 0m g程度、 好 ましくは約 0. l〜 2 0 m g程度、 より好ましくは約 0. 1〜： L O m g 程度を静脈注射により投与するのが好都合である。 他の動物の場合も 6 0 k g当たりに換算した量を投与することができる。
(2) 血糖上昇剤
本発明で用いられる P 2 Y2受容体蛋白質もしくはその部分べプチド、 本発明で用いられる Ρ 2 Υ2受容体蛋白質をコードする DN Αに対する アンチセンスポリヌクレオチドま は P 2 Y2受容体蛋白質に対する抗 体を、 血糠上昇剤などの医薬として使用することができる。
例えば、 Ρ 2 Υ2受容体蛋白質の過多症患者がいる場合に、 a ) Ρ 2 Υ 2受容体蛋白質自体または P 2 Y2受容体蛋白質に対する抗体を該患者に 投与し該 Ρ 2 Υ2受容体蛋白質の活性を阻害したり、 b ) P 2 Y2受容体 蛋白質をコードする DN Αに対するアンチセンスポリヌクレオチドを該 患者に投与し P 2 Y2受容体蛋白質をコードする D Ν Αの発現を抑制す ることによって、患者の体内における P 2 Y2受容体蛋白質の量を減少さ せ、 受容体機能を正常にすることができる。 すなわち、 Ρ 2 Υ2受容体蛋 白質もしくはその部分べプチド、 Ρ 2 Υ2受容体蛋白質をコードする DN Αに対するアンチセンスポリヌクレオチドまたは P 2 Y2受容体蛋白質 に対する抗体は、 安全で低毒性な血糖上昇剤として有用である。
具体的には、本発明で用いられる Ρ 2 Υ2受容体蛋白質もしくはその部 分ぺプチド、本発明で用いられる Ρ 2 Υ2受容体蛋白質をコードする DN Αに対するアンチセンスポリヌク レオチ ドまたは P 2 Y2受容体蛋白質 に対する抗体は、 例えば、 低血糖症に使用することができる。
Ρ 2 Υ2受容体蛋白質をコードする DNAに対するアンチセンスポリ ヌクレオチドまたは Ρ 2 Υ2受容体蛋白質に対する抗体を上記血糖上昇 剤として使用する場合は、 常套手段に従って製剤化することができる。
一方、 Ρ 2 Υ2受容体蛋白質をコードする D Ν Αに対するアンチセンス ポリヌク レオチドを上記血糖上昇剤として使用する場合は、 該 DNAを 単独あるいはレ トロ ウイルスベクター、 アデノウイルスベクター、 アデ ノウィルスァソシエーテッ ドウィルスべクターなどの適当なべクターに 挿入した後、 常套手段に従って実施することができる。 DNAは、 その ままで、 あるいは摂取促進のための補助剤とともに、 遺伝子銃やハイ ド 口ゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。
例えば、 P 2 Y2受容体蛋白質をコードする DN Αに対するアンチセン スポリヌクレオチドまたは P 2 Y2受容体蛋白質に対する抗体は、必要に 応じて糖衣を施した錠剤、 カプセル剤、 エリキシル剤、 マイクロカプセ ル剤などとして経口的に、 あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容 し得る液との無菌性溶液、 または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的 に使用できる。例えば、本発明で用いられる Ρ 2 Υ2受容体蛋白質をコー ドする D Ν Αに対するアンチセンスポリヌクレオチドまたは P 2丫2受 容体蛋白質に対する抗体を生理学的に認められる公知の担体、 香味剤、 賦形剤、 べヒクル、 防腐剤、 安定剤、 結合剤などとともに一般に認めら れた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって 造す ることができる。 これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適 当な容量が得られるようにするものである。
錠剤、 カプセル剤などに混和するこ.とができる添加剤と しては、 例え ば、 ゼラチン、 コーンスターチ、 トラガント、 アラビアゴムのような結 合剤、 結晶性セルロースのよ うな賦形剤、 コーンスターチ、 ゼラチン、 アルギン酸などのような膨化剤、 ステアリ ン酸マグネシウムのような潤 滑剤、 ショ糖、 乳糖またはサッカリンのよ うな甘味剤、 ペパーミント、 ァカモノ油またはチヱリ一のような香味剤などが用いられる。 調剤単位 形態がカプセルである場合には、 上記タイプの材料にさらに油脂のよう な液状担体を含有することができる。 注射のための無菌組成物は注射用 水のようなべヒクル中の活性物質、 胡麻油、 椰子油などのよ うな天然産 出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処 方することができる。 注射用の水性液と しては、 例えば、 生理食塩水、 ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液 （例えば、 D—ソルビトール、 D—マンニトール、 塩化ナトリ ウムなど） などが用いられ、 適当な溶解 補助剤、 例えば、 アルコール （例、 エタノール）、 ポリアルコール （例、 プロピレンダリ コール、 ポリエチレングリ コール）、 非イオン性界面活性 剤 （例、 ポリ ソルベート 8 0 TM、 H C O— 5 0 ) などと併用してもよレヽ。 油性液としては、 例えば、 ゴマ油、 大豆油などが用いられ、 溶解補助剤 である安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコールなどと併用してもよい。 また、 上記血糖上昇剤は、 例えば、 緩衝剤 （例えば、 リ ン酸塩緩衝液、 酢酸ナトリ ウム緩衝液）、 無痛化剤 （例えば、 塩化ベンザルコニゥム、 塩 酸プロ力インなど）、 安定剤 （例えば、 ヒ ト血清アルブミン、 ポリエチレ ングリ コールなど）、 保存剤 （例えば、 ベンジルアルコール、 フエノール など）、 酸化防止剤などと配合してもよい。 調製された注射液は通常、 適 当なアンプルに充填される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒ トゃ哺乳動物 （例えば、 ラッ ト、 マウス、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して投与することができる。 , 本発明で用いられる P 2 Y2受容体蛋白質をコードする DN Αに対す るアンチセンスポリヌクレオチドの.投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症 状、 投与方法などにより差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に例え ば、 低血糖症患者 （ 6 0 k gとして） においては、 一日にっき約 0. 1〜 1 00m g、 好ましくは約 1. 0〜 5 0 m g、 より好ましくは約 1. 0〜 2 0 m gである。 非経口的に投与する場合は、 その 1回投与量は投 与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などによっても異なるが、 例えば、 注射剤の形では通常例えば、 低血糖症患者 （6 0 k g として） において は、 一日につき約 0. 0 1〜 3 0 m g程度、 好ましくは約 0. 1〜 2 0 m g程度、 より好ましくは約 0. 1〜 1 0 m g程度を静脈注射により投 与するのが好都合である。 他の動物の場合も、 6 O k g当たりに換算し た量を投与することができる。
本発明で用いられる P 2 Y2受容体蛋白質に対する抗体の投与量は、投 与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などにより差異はあるが、 経口投与 の場合、一般的に例えば、低血糖症患者（6 0 k g として） においては、 一日につき約 0. 1〜 1 0 0m g、 好ましくは約 1. 0〜 5 0 m g、 より 好ましくは約 1. 0〜 2 0 m gである。 非経口的に投与する場合は、 そ の 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などによっても異 なるが、 例えば、 注射剤の形では通常例えば、 低血糖症患者 （6 0 k g として） においては、 一日につき約 0. 0 1〜 3 0 m g程度、 好ましく は約 0. l〜 2 0 m g程度、 より好ましくは約 0. l〜 1 0 m g程度を 静脈注射により投与するのが好都合である。 他の動物の場合も、 6 0 k g当たりに換算した量を投与することができる。
本発明で用いられる P 2 Y2受容体蛋白質の投与量は、投与対象、対象 臓器、 症状、 投与方法などにより差異はあるが、 経口投与の場合、 一般 的に例えば、 低血糖症患者 （6 0 k g として） においては、 一日につき 約 0. 1〜： l O O m g、 好ましくは約 1. 0〜 5 0 m g、 より好ましくは 約 1. 0〜 2 0 m gである。 非経口的に投与する場合は、 その 1回投与 量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などによっても異なる 、 例 えば、 注射剤の形では通常例えば、 低血糖症患者 （ 6 0 k gとして） に おいては、 一日につき約 0. 0 1〜 3 0 m g程度、 好ましくは約 0. 1 〜 2 0 m g程度、 より好ましくは約ひ. ；！〜 1 0 m g程度を静脈注射に より投与するのが好都合である。 他の動物の場合も、 6 0 k g当たりに 換算した量を投与することができる。
(3) 糖尿病または低血糖症の診断薬
本発明で用いられる P 2 Y2受容体蛋白質をコードする DN Αは、プロ ープとして使用することにより、 ヒ トまたは哺乳動物（例えば、ラッ ト、 マウス、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） におけ る本発明で用いられる P 2 Y2受容体蛋白質またはその部分べプチドを コードする DNAまたは mRNAの異常 （遺伝子異常） を検出すること ができるので、 例えば、 該 D N Aまたは mR N Aの損傷、 突然変異ある いは発現低下や、 該 DN Aまたは mRN Aの増加あるいは発現過多など の遺伝子診断剤として有用である。
本発明で用いられる P 2 Y2受容体蛋白質をコードする DNAを用い る上記の遺伝子診断は、 例えば、 公知のノーザンハイブリダィゼーショ ンゃ P CR— S S C P法 （ゲノミ ックス （Genomics)， 第 5卷， 8 7 4〜 8 7 9頁 （ 1 9 8 9年）、 プロシージングズ .ォプ ·ザ ·ナショナル · ァ 力デミ一 ·ォブ ·サイェンシィズ 'ォブ 'ユーエスエー (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States oi America; , 第 8 6卷， 2 7 6 6〜 2 7 7 0頁 （ 1 9 8 9年）） などにより実施するこ とができる。
例えば、 ノーザンハイプリダイゼーシヨンにより本発明で用いられる P 2 Y2受容体蛋白質の発現低下が検出された場合は、例えば、本発明で 用いられる Ρ 2 Υ2受容体蛋白質の機能不全に関連する疾患である可能 性が高いまたは将来罹患する可能性が高いと診断することができる。 また、 ノーザンハイプリダイゼーションにより本発明で用いられる Ρ 2 Υ2受容体蛋白質の発現過多が検出された場合は、例えば、本発明で用 いられる P 2 Y2受容体蛋白質の過剰発現に起因する疾患である可能性 が高いまたは将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
本発明で用いられる Ρ 2 Υ2受容体蛋白質の機能不全に関連する疾患 としては、 糖尿病、 耐糖能障害、 ケト.一シス、 アシドーシス、 糖尿病性 神経障害、 糖尿病性腎症、 糖尿病性網膜症、 高脂血症、 肥満症、 代謝症 候群、 性機能障害、 皮膚疾患、 関節症、 骨減少症、 動脈硬化、 血栓性疾 患、 消化不良、 記憶学習障害などが挙げられる。 また、 本発明で用いら れる Ρ 2 Υ2受容体蛋白質の過剰発現に起因する疾患としては、 例えば、 低血糖症などが挙げられる。
また本発明の抗体は、 Ρ 2 Υ2受容体蛋白質を特異的に認識することが できるので、被検液中の Ρ 2 Υ2受容体蛋白質の定量、特にサンドィツチ 免疫測定法による定量などに使用することができる。
すなわち、 本発明は、
( i ) 本発明の抗体と、被検液および標識化された P 2 Y2受容体蛋白質 とを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化された Ρ 2 Υ2受容体蛋 白質の割合を測定することを特徴とする被検液中の Ρ 2 Υ2受容体蛋白 質の定量法、 および.
(ii) 被検液と担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化された本 発明の別の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、 不溶化担体 上の標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中の P 2 Y2受容 体蛋白質の定量法を提供する。
上記 （ii) の定量法においては、 一方の抗体が P 2 Y2受容体蛋白質の Ν端部を認識する抗体で、他方の抗体が Ρ 2 Υ2受容体蛋白質の C端部に 反応する抗体であることが望ましい。
また、 Ρ 2 Υ2受容体蛋白質に対するモノクローナル抗体を用いて Ρ 2 Υ2受容体蛋白質の定量を行うことができるほ力 組織染色等による検出 を行なうこともできる。 これらの目的には、 抗体分子そのものを用いて もよく、 また、 抗体分子の F (a b')2、 F a b，、 あるいは F a b画分を 用いてもよい。 本発明の抗体を用いる P 2 Y 2受容体蛋白質の定量法は、特に制限され るべきものではなく、 被測定液中の抗原量 （例えば、 Ρ 2 Υ 2受容体蛋白 質量） に対応した抗体、 抗原もしくは抗体一抗原複合体の量を化学的ま たは物理的手段により検出し、 これを既知量の抗原を含む標準液を用い て作製した標準曲線より算出する測定法であれば、 いずれの測定法を用 いてもよい。 例えば、 ネフロメ トリー、 競合法、 ィムノメ ト リ ック法お よびサンドイッチ法が好適に用いられるが、 感度、 特異性の点で、 後述 するサンドィツチ法を用いるのが特に好ましい。
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤と しては、 例えば、 放射 性同位元素、 酵素、 蛍光物質、 発光物質などが用いられる。 放射性同位 元素と しては、 例えば、 〔125 I〕、 〔131 I〕、 〔3H〕、 〔14 C〕 などが用いられ る。上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、 /3—ガラク トシダーゼ、 _ダルコシダーゼ、 アルカリ フォスファタ一 ゼ、 パーォキシダーゼ、 リ ンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。 蛍光物 質と しては、 例えば、 フルォレスカミン、 フルォレツセンイソチォシァ ネートなどが用いられる。 発光物質と しては、 例えば、 ルミノール、 ル ミノール誘導体、ルシフエリン、ルシゲニンなどが用いられる。 さらに、 抗体あるいは抗原と標識剤との結合にピオチン一アビジン系を用いるこ ともできる。
さらに、本発明の抗体を用いて P 2· Y 2受容体蛋白質の濃度を定量する ことによって、 Ρ 2 Υ 2受容体蛋白質の濃度の減少が検出された場合、例 えば、 Ρ 2 Υ 2受容体蛋白質の機能不全に関連する疾患である、 または将 来罹患する可能性が高いと診断することができる。 また、 Ρ 2 Υ 2受容体 蛋白質の濃度の増加が検出された場合には、 例えば、 Ρ 2 Υ 2受容体蛋白 質の過剰発現に起因する疾患である、 または将来罹患する可能性が高い と診断することができる。
本発明の Ρ 2 Υ 2受容体蛋白質の機能不全に関連する疾患と しては、糖 尿病、 耐糖能障害、 ケトーシス、 アシドーシス、 糖尿病性神経障害、 糖 尿病性腎症、 糖尿病性網膜症、 高脂血症、 肥満症、 代謝症候群、 性機能 障害、 皮膚疾患、 関節症、 骨減少症、 動脈硬化、 血栓性疾患、 消化不良、 記憶学習障害などが挙げられる。 また、 本発明の P 2 Y2受容体蛋白質の 過剰発現に起因する疾患としては、例えば、低血糖症などが挙げられる。
( 4 ) 血糖値を調節する化合物のスク.リーニング方法
本発明で用いられる Ρ 2 Υ2受容体蛋白質の発現量を変化させる化合 物のスク リーユングは、
( i ) 正常あるいは疾患モデル非ヒ ト哺乳動物に対して、 薬剤あるい は物理的ス ト レスなどを与える一定時間前 （ 3 0分前〜 2 4時間前、 好 ましくは 3 0分前〜 1 2時間前、 より好ましくは 1時間前〜 6時間前） もしくは一定時間後（ 3 0分後〜 3 日後、好ましくは 1時間後〜 2 日後、 より好ましく は 1時間後〜 2 4時間後）、または薬剤あるいは物理的ス ト レスと同時に被検化合物を投与し、 投与後一定時間経過後 （ 3 0分後〜 3 日後、 好ましくは 1時間後〜 2 日後、 より好ましくは 1時間後〜 2 4 時間後）、 細胞に含まれる P 2 Y2受容体蛋白質の mRN A量を定量、 解 析することにより行なうことができ、
(ii) 形質転換体を常法に従い培養する際に被検化合物を培地中に混 合させ、一定時間培養後（ 1 日後〜 7 日後、好ましくは 1 日後〜 3 日後、 より好ましく は 2 日後〜 3 日後）、 該形質転換体に含まれる P 2 Y2受容 体蛋白質の mRN Α量を定量、解析することにより行なうことができる。 本発明のスク リ一二ング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、 本発明で用いられる P 2 Y2受容体蛋白質の発現量を変化させる作用を 有する化合物であり、 具体的には、 （ィ） Ρ 2 Υ2受容体蛋白質の発現量 を増加させることにより、 Ρ 2 Υ2受容体蛋白質を介する細胞刺激活性 (例えば、 ァラキドン酸遊離、 ァセチルコリン遊離、 細胞内 C a 2+遊離、 細胞内 c AM P生成、 細胞内 c GMP生成、 イノシトールリ ン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリ ン酸化、 c一 f o s の活性化、 p H の低下などを促進する活性または抑制する活性など） を増強させる化合 物、 （口） P 2 Y2受容体蛋白質の発現量を減少させることにより、 該細 • 胞刺激活性を減弱させる化合物である。 該化合物としては、 ペプチド、 蛋白質、 非ペプチド性化合物、 合成化 合物、 発酵生産物などが挙げられ、 これら化合物は新規な化合物であつ てもよいし、 公知の化合物であってもよい。
したがって、上記スクリ一二ング方法で得られる本発明の P 2 Y 2受容 体蛋白質の発現量を変化させる化合物は、 Ρ 2 Υ 2受容体蛋白質の機能不 全に関連する疾患に用いることができる。
具体的には、本発明の Ρ 2 Υ 2受容体蛋白質の発現量を増加させ、細胞 刺激活性を増強させる化合物は、本発明の Ρ 2 Υ 2受容体蛋白質の機能不 全に関連する疾患に対する血糖低下剤として有用である。
本発明の Ρ 2 Υ 2受容体蛋白質の発現量を減少させ、細胞刺激活性を減 弱させる化合物は、本発明の Ρ 2 Υ 2受容体蛋白質の発現過多に起因する 疾患に対する安全で低毒性な血糖上昇剤として有用である。
本発明の Ρ 2 Υ 2受容体蛋白質の機能不全に関連する疾患としては、糖 尿病、 耐糖能障害、 ケトーシス、 アシドーシス、 糖尿病性神経障害、 糖 尿病性腎症、 糖尿病性網膜症、 高脂血症、 肥満症、 代謝症候群、 性機能 障害、皮膚疾患、 関節症、 骨減少症、 動脈硬化、 血栓性疾患、 消化不良、 記憶学習障害などが挙げられる。 また、本発明の Ρ 2 Υ 2受容体蛋白質の 過剰発現に起因する疾患としては、例えば、低血糖症などが挙げられる。 該化合物の塩としては、 生理学的に許容される酸 （例、 無機酸、 有機 酸など） や塩基 （例、 ナトリ ウム、 カリウムなどのアル力リ金属 ； カル シゥムなどのアルカリ土類金属） などとの塩が用いられ、 とりわけ生理 学的に許容される酸付加塩が好ましい。 この様な塩としては、 例えば、 無機酸 （例えば、 塩酸、 リン酸、 臭化水素酸、 硫酸など） との塩、 ある いは有機酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸、 プロピオン酸、 フマル酸、 マレイン 酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 蓚酸、 安息香酸、 メタン スルホン酸、 ベンゼンスルホン酸など） との塩などが用いられる。
以下、 塩としては、 同様のものが用いられる。
本発明のスクリ一ユング方法を用いて得られる化合物またはその塩を 医薬組成物と して使用する場合、 常套手段に従って製剤化することがで 例えば、 該化合物は、 必要に応じて糖衣を施した錠剤、 カプセル剤、 エリ キシル剤、 マイクロカプセル剤などと して経口的に、 あるいは水も しくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、 または懸濁液 剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。 例えば、 該化合物を生理 学的に認められる公知の担体、 香味剤、 賦形剤、 べヒ クル、 防腐剤、 安 定剤、 結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位' 用量形態で混和することによって製造することができる。 これら製剤に おける有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにする ものである。
錠剤、 カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、 例え ば、 ゼラチン、 コーンスターチ、 トラガント、 アラビアゴムのような結 合剤、 結晶性セルロースのような賦形剤、 コーンスターチ、 ゼラチン、 アルギン酸などのような膨化剤、 ステアリン酸マグネシウムのような潤 滑剤、 ショ糖、 乳糖またはサッカ リ ンのような甘味剤、 ペパーミ ン ト、 ァカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。 調剤単位 形態がカプセルである場合には、 上記タイプの材料にさらに油脂のよう な液状担体を含有することができる。 注射のための無菌組成物は注射用 水のようなべヒクル中の活性物質、 胡麻油、 椰子油などのような天然産 出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処 方することができる。 注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩水、 ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液 （例えば、 D —ソルビトール、 D—マン- トール、 塩化ナト リ ゥムなど） などが用いられ、 適当な溶解 補助剤、 例えば、 アルコール （例、 エタノール）、 ポリアルコール （例、 プロ ピレングリ コール、 ポリエチレンダリ コール）、 非イオン性界面活性 剤 （例、 ポリ ソルベート 8 0 TM、 H C O - 5 0 ) などと併用してもよい。 油性液と しては、 例えば、 ゴマ油、 大豆油などが用いられ、 溶解補助剤 である安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコールなどと併用してもよい。 また、 上記医薬組成物は、 例えば、 緩衝剤 （例えば、 リン酸塩緩衝液、 酢酸ナトリ ウム緩衝液）、 無痛化剤 （例えば、 塩化ベンザルコニゥ 、 塩 酸プロ力インなど）、 安定剤 （例えば、 ヒ ト血清アルブミン、 ポリエチレ ングリ コールなど）、 保存斉 IJ (例えば、 ベンジルアルコール、 フエノール など）、 酸化防止剤などと配合してもよい。 調製された注射液は通常、 適 当なアンプルに充填される。
このよ うにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒ トゃ哺乳動物 （例えば、 ラッ ト、 マウス、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与 方法などにより差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に例えば、 糖尿 病患者（ 6 O k gとして）においては、一日につき約 0. ：！〜 1 0 O m g、 好ましくは約 1. 0〜 5 0 m g、 より好ましくは約 1. 0〜 2 0 m gで ある。 非経口的に投与する場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓 器、 症状、 投与方法などによっても異なるが、 例えば、 注射剤の形では 通常例えば、 糖尿病患者 （ 6 0 k gとして） においては、 一日につき約 0. 0 1〜 3 0 m g程度、 好ましくは約 0. ：!〜 2 0 m g程度、 より好 ましくは約 0. 1〜 1 0 m g程度を静脈注射により投与するのが好都合 である。 他の動物の場合も、 6 0 k g当たりに換算した量を投与するこ とができる。
( 5 ) ァゴニス トおょぴ /アンタゴニス トのスク リーニング方法
リガンドと本発明で用いられる P 2 Y2受容体蛋白質との結合性を変 ィ匕させる化合物をスクリ一二ングするためには、 例えば、 適当な Ρ 2 Υ2 受容体蛋白質画分と、 標識したリガンドが必要である。
Ρ 2 Υ2受容体蛋白質画分としては、 天然型の Ρ 2 Υ2受容体蛋白質画 分力ヽまたはそれと同等の活性を有する組換え型 Ρ 2 Υ2受容体蛋白質画 分などが望ましい。 ここで、同等の活性とは、同等のリガンド結合活性、 シグナル情報伝達作用などを示す。
標識したリガンドとしては、 標識したリガンド、 標識したリガンドア ナログ化合物などが用いられる。 例えば 〔3H〕、 〔125I〕、 〔14C〕、 〔35S〕 などで標識されたリガンドなどが用いられる。 ¾ 具体的には、リガンドと P 2 Y2受容体蛋白質との結合性を変化させる 化合物のスク リ一エングを行なうには、まず Ρ 2 Υ2受容体蛋白質を含有 する細胞または細胞の膜画分を、 スク.リ一二ングに適したバッファーに 懸濁することにより Ρ 2 Υ2受容体蛋白質標品を調製す'る。バッファーに は、 ρ Η4〜1 0 (望ましくは ρ Η 6〜8 ) のリン酸バッファー、 トリ ス一塩酸バッファーなどのリガンドと Ρ 2 Υ2受容体蛋白質との結合を 阻害しないバッファーであればいずれでもよい。 また、 非特異的結合を 低減させる目的で、 CHAP S、 Tw e e n - 8 0TM (花王一ァトラス 社）、 ジギトニン、デォキシコレートなどの界面活性剤をバッファーに加 えることもできる。 さらに、 プロテアーゼによる受容体やリガンドの分 解を抑える目的で PMS F、 ロイぺプチン、 E— 6 4 (ペプチド研究所 製）、 ぺプスタチンなどのプロテアーゼ阻害剤を添加することもできる。 0. 0 l m l〜 1 0 m l の該受容体溶液に、 一定量（ 5 0 0 0 c p m〜5 O O O O O c p m) の標識したリガンドを添加し、 同時に 1 0— 4M〜 1 0_1QMの試験化合物を共存させる。 非特異的結合量 （N S B) を知るた めに大過剰の未標識のリガンドを加えた反応チューブも用意する。 反応 は約 0〜 5 0 °C, 望ましくは約 4〜 3 7 °Cで、 約 2 0分から 2 4時間、 望ましくは約 3 0分から 3時間行う。 反応後、 ガラス繊維濾紙等で濾過 し、 適量の同バッファーで洗浄した後、 ガラス繊維濾紙に残存する放射 活性を液体シンチレーションカゥンターまたは γ—力ゥンターで計測 する。 拮抗する物質がない場合のカウント（Β0)から非特異的結合量（Ν S B) を引いたカウント （BO— N S B) を 1 0 0 %とした時、 特異的結 合量 （B— N S B) が、 例えば、 5 0 %以下になる試験化合物を拮抗阻 害能力のある候補物質として選択することができる。
リガンドと P 2 Y2受容体蛋白質との結合性を変化させる化合物をス クリ一-ングする別の方法としては、例えば、 Ρ 2 Υ2受容体蛋白質を介 する細胞刺激活性 （例えば、 ァラキ ドン酸遊離、 アセチルコ リ ン遊離、 細胞内 C a 2+遊離、 細胞内 c AMP生成、 細胞内 c GMP生成、 イノシ トールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 — f o sの活性化、 p Hの低下などを促進する活性または抑制する活性など、 特に細胞内 C a 2+濃度上昇活性、 細胞内 c A M P生成抑制活性） を公知 の方法または市販の測定用キッ トを用いておこなう測定があげられる。 具体的には、 まず、本発明の P 2 Y 2受容体蛋白質を含有する細胞をマ ルチウヱルプレー ト等に培養する。 スク リーユングを行なうにあたって は前もって新鮮な培地あるいは細胞に毒性を示さない適当なバッファー に交換し、 試験化合物などを添加して一定時間ィンキュベートした後、 細胞を抽出あるいは上清液を回収して、 生成した産物をそれぞれの方法 に従って定量する。 細胞刺激活性の指標とする物質 （例えば、 C a 2+、 c A M Pなど） の生成が、 細胞が含有する分解酵素によって検定困難な 場合は、 該分解酵素に対する阻害剤を添加してアツセィを行なってもよ い。 また、 c A M P生成抑制などの活性については、 フォルスコリンな どで細胞の基礎的産生量を増大させておいた細胞に対する産生抑制作用 として検出することができる。
細胞刺激活性を測定してスクリ一二ングを行なうには、適当な P 2 Y 2 受容体蛋白質を発現した細胞が必要である。 ρ 2 Υ 2受容体蛋白質を発現 した細胞としては、天然型の Ρ 2 Υ 2受容体蛋白質を有する細胞株、上記 の組換え型 Ρ 2 Υ 2受容体蛋白質を発現した細胞株などが望ましい。
試験化合物としては、例えば、ぺプチド、蛋白、非ぺプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液な どが用いられ、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし、 公知の 化合物であってもよい。
また、試験化合物としては、 Ρ 2 Υ 2受容体蛋白質の活性部位の原子座 標およびリガンド結合ポケッ トの位置に基づいて、 リガンド結合ポケッ トに結合するよ うに設計された化合物が好ましく用いられる。 Ρ 2 Υ 2 受容体蛋白質の活性部位の原子座標およびリガンド結合ポケッ 卜の位置 の測定は、 公知の方法あるいはそれに準じる方法を用いて行うことがで さる。 リガンドと本発明の P 2 Y2受容体蛋白質との結合性を変化さ る化 合物がァゴニス トであるかアンタゴニス トであるかの具体的な評価方法 は以下の （ i ) または （ i i ) に従えばよい。
( i ) 上記スクリ一二ング方法を行い、 リガンドと P 2 Y2受容体蛋白 質との結合性を変化させる （特に、 結合を阻害する） 化合物またはその 塩を得た後、 該化合物またはその塩が上記した細胞刺激活性を有してい るか否かを測定する。具体的には、 上記した Ρ 2 Υ2受容体蛋白質に対す るァゴニス トのスクリ一二ング方法を用いて確認することができ、 該細 胞刺激活性を有する化合物またはその塩はァゴニス トであり、 該細胞刺 激活性を有しない化合物またはその塩はアンタゴニス トである。
( i i ) ( a ) 試験化合物を本発明の P 2 Y2受容体蛋白質を含有する 細胞に接触させ、 上記した細胞刺激活性を測定する。 細胞刺激活性を有 する試験化合物は Ρ 2 Υ2受容体蛋白質に対するァゴニス トである。
(b ) P 2 Y2受容体蛋白質を活性化する化合物 （例えば、 リガンド） を Ρ 2 Υ2受容体蛋白質を含有する細胞に接触させた場合と、 Ρ 2 Υ2受容 体蛋白質を活性化する化合物および試験化合物を Ρ 2 Υ2受容体蛋白質 を含有する細胞に接触させた場合における細胞刺激活性を測定し、 比較 する。 Ρ 2 Υ2受容体蛋白質を活性化する化合物による細胞刺激活性を減 少させ得る試験化合物は Ρ 2 Υ2受容体蛋白質に対するアンタゴニス ト である。
(6 ) スク リーニングキッ ト
リガンドと Ρ 2 Υ2受容体蛋白質との結合性を変化させる化合物また はその塩のスクリーニング用キッ トは、 Ρ 2 Υ2受容体蛋白質、 Ρ 2 Υ2 受容体蛋白質を含有する細胞、または Ρ 2 Υ2受容体蛋白質を含有する細 胞の膜画分を含有するものなどである。
本発明のスクリ一二ング用キッ トの例としては、 次のものが挙げられ る。
1. スク リ一二ング用試薬
a) 測定用緩衝液および洗浄用緩衝液 Hanks' Balanced Salt Solution (ギブコ社製） に、 0. 0 5 %のゥシ 血清アルブミン （シグマ社製） を加えたもの。
孔径 0. 4 5 μ πιのフィルターで濾過滅菌し、 4 °Cで保存するカ ある いは用時調製しても良い。 - b) P 2 Y2受容体蛋白質標品
本発明で用いられる Ρ 2 Υ2受容体蛋白質を発現させた CHO細胞を、 1 2穴プレートに 5 X 1 05個/穴で継代し、 3 7。C、 5 % C 02、 9 5 % a i rで 2 日間培養したもの。
c) 標識リガンド
市販の 〔3H〕、 〔125 I〕、 〔14C〕、 〔35S〕 などで標識したリガンド 水溶液の状態のものを 4°Cあるいは一 2 0°Cにて保存し、 用時に測定 用緩衝液にて 1 μΜに希釈する。
d) リガンド標準液
リガンドを 0. 1 %ゥシ血清アルプミン （シダマ社製） を含む P B Sで 1 mMとなるように溶解し、 一 2 0°Cで保存する。
2. 測定法
a) 1 2穴組織培養用プレートにて培養した P 2 Y2受容体蛋白質発現 CHO細胞を、 測定用緩衝液 1 m 1で 2回洗浄した後、 4 9 0 1 の測 定用緩衝液を各穴に加える。
b) 1 0— 3〜 1 04°Μの試験化合物溶液を 5 1加えた後、 標識リガン ドを 5 ζ 1加え、 室温にて 1時間反応させる。 非特異的結合量を知るた めには試験化合物の代わりに 1 0 - 3Μのリガンドを 5 μ 1加えておく。 c) 反応液を除去し、 1 m 1 の洗浄用緩衝液で 3回洗浄する。 細胞に結 合した標識リガンドを 0. 2 N N a OH- l % S D Sで溶解し、 4 m 1 の液体シンチレーター A (和光純薬製） と混合する。
d) 液体シンチレーシヨンカウンター （ベックマン社製） を用いて放射 活性を測定し、 Percent Maximum Binding (PMB) を次の式で求める。
PMB = [(B— N S B) / (BO-N S B)] X 1 0 0
PMB ： Percent Maximum Binding B ：検体を加えた時の値
N S B ： Non-spec i f i c B inding (非特異的結合量)
B 0 ：最大結合量
本発明のスク リーニング方法またはスク リーニング用キッ トを用いて 得られる化合物またはその塩は、リガンドと P 2 Y 2受容体蛋白質との結 合性を変化させる作用を有する化合物であり、 具体的には、 （ィ） G蛋白 質共役型受容体を介して細胞刺激活性を有する化合物 （いわゆる、 Ρ 2 Υ 2受容体蛋白質に対するァゴニス ト）、 （口） 該細胞刺激活性を有しない 化合物（いわゆる、 Ρ 2 Υ 2受容体蛋白質に対するアンタゴニス ト）、（ハ） リガンドと Ρ 2 Υ 2受容体蛋白質との結合力を増強する化合物、あるいは (二）リガンドと Ρ 2 Υ 2受容体蛋白質との結合力を減少させる化合物で める。
該化合物としては、 ペプチド、 蛋白、 非ペプチド性化合物、 合成化合 物、 発酵生産物などが挙げられ、 これら化合物は新規な化合物であって もよいし、 公知の化合物であってもよレ、。
また、化合物は、前記した Ρ 2 Υ 2受容体蛋白質の活性部位の原子座標 およぴリガンド結合ボケッ トの位置に基づいて設計された化合物であつ てもよい。
本発明のスク リ一ユング方法またはスクリ一ユング用キッ トを用いて 得られる Ρ 2 Υ 2受容体蛋白質に対するァゴニス トまたはリガンドと Ρ 2 Υ 2受容体蛋白質との結合力を増強する化合物またはその塩は、例えば、 糖尿病、 耐糖能障害、 ケトーシス、 アシドーシス、 糖尿病性神経障害、 糖尿病性腎症、 糖尿病性網膜症、 高脂血症、 肥満症、 代謝症候群、 性機 能障害、 皮膚疾患、 関節症、 骨減少症、 動脈硬化、 血栓性疾患、 消化不 良、 記憶学習障害などの疾患に対して用いることができ、 好ましくは糖 尿病に対する血糖低下剤として有用である。
また、 本発明のスク リ一ユング方法またはスクリーニング用キッ トを 用いて得られる Ρ 2 Υ 2受容体蛋白質に対するアンタゴニス トまたはリ ガンドと Ρ 2 Υ。受容体蛋白質との結合力を減少させる化合物またはそ の塩は、 例えば、 血糖上昇剤として有用である。
本発明のスク リーニング方法またはスク リーニング用キッ トを用いて 得られる化合物またはその塩は、 P 2 Y 2受容体蛋白質の発現量を変化さ せる化合物またはその塩、 発現上記疾患に対する他の薬物や、 他の糖尿 病治療剤、糖尿病性合併症治療剤、高脂血症治療剤、降圧剤、抗肥満剤、 利尿剤、 化学療法剤、 免疫療法剤などの薬剤 （以下、 併用薬剤と略記す ることがある） と組み合わせて用いることができる。 この際、 本発明の スクリーニング方法またはスクリ一-ング用キッ トを用いて得られる化 合物またはその塩および併用薬剤の投与時期は限定されず、 これらを投 与対象に対し、 同時に投与してもよいし、 時間差をおいて投与してもよ レ、。 併用薬剤の投与量は、 臨床上用いられている用量を基準として適宜 選択することができる。 また、 本発明のスク リーニング方法またはスク リーニング用キッ トを用いて得られる化合物またはその塩と併用薬剤の 配合比は、 投与対象、 投与ルート、 対象疾患、 症状、 組み合わせなどに より適宜選択することができる。 例えば投与対象がヒ トである場合、 例 えばァゴニス ト 1重量部に対し、 併用薬剤を 0 . 0 1〜1 0 0重量部用 レ ればよい Q
本発明のスクリーユング方法またはスクリーニング用キッ トを用いて 得られる化合物またはその塩を上記の医薬組成物として使用する場合、 常套手段に従って製剤化することができる。
例えば、 該化合物は、 必要に応じて糖衣を施した錠剤、 カプセル剤、 エリキシル剤、 マイクロカプセル剤などとして経口的に、 あるいは水も しくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、 または懸濁液 剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。 例えば、 該化合物を生理 学的に認められる公知の担体、 香味剤、 賦形剤、 べヒクル、 防腐剤、 安 定剤、 結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位 用量形態で混和することによって製造することができる。 これら製剤に おける有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにする ' ものである。 锭剤、 力プセル剤などに混和することができる添加剤と しては、 例え ば、 ゼラチン、 コーンスターチ、 トラガン ト、 アラ ビアゴムのよ うな結 合剤、 結晶性セルロースのような賦形剤、 コーンスターチ、 ゼラチン、 アルギン酸などのような膨化剤、 ステアリ ン酸マグネシウムのような潤 滑剤、 ショ糖、 乳糖またはサッカ リ ンのような甘味剤、 ペパーミ ン ト、 ァカモノ油またはチヱリーのような香味剤などが用いられる。 調剤単位 形態がカプセルである場合には、 上記タイプの材料にさらに油脂のよう な液状担体を含有することができる。 注射のための無菌組成物は注射用 水のようなべヒ クル中の活性物質、 胡麻油、 椰子油などのような天然産 出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処 方することができる。 注射用の水性液と しては、 例えば、 生理食塩水、 ブドク糖やその他の補助薬を含む等張液 （例えば、 D —ソルビトール、 D—マンニ トール、 塩化ナトリ ウムなど） などが用いられ、 適当な溶解 補助剤、 例えば、 アルコール （例、 エタノール）、 ポリアルコール （例、 プロ ピレングリ コール、 ポリエチレングリ コール）、 非ィオン性界面活性 剤 （例、 ポリ ソルベート 8 0™、 H C O— 5 0 ) などと併用してもよい。 油性液と しては、 例えば、 ゴマ油、 大豆油などが用いられ、 溶解補助剤 である安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコールなどと併用してもよレ、。 また、 上記医薬組成物は、 例えば、 緩衝剤 （例えば、 リ ン酸塩緩衝液、 酢酸ナトリ ゥム緩衝液）、 無痛化剤 （例えば、 塩化ベンザルコニゥム、 塩 酸プロ力インなど）、 安定剤 （例えば、 ヒ ト血清アルブミ ン、 ポリエチレ ングリ コールなど）、 保存剤 （例えば、 ベンジルアルコール、 フエノール など）、 酸化防止剤などと配合してもよい。 調製された注射液は通常、 適 当なアンプルに充填される。
このよ うにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒ トゃ哺乳動物 （例えば、 ラッ ト、 マウス、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与 方法などにより差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に例えば、 糖尿 病患者（ 6 0 k gとして）においては、一日につき約 0. 1〜1 0 O m g、 好ましくは約 1. 0〜 5 0 m g、 より好ましくは約 1. 0〜 2 0 m gで ある。 非経口的に投与する場合は、 ，その 1回投与量は投与対象、 対象臓 器、 症状、 投与方法などによっても異なるが、 例えば、 注射剤の形では 通常例えば、 糖尿病患者 （6 O k gとして） においては、 一日につき約 0. 0 1〜3 0 m g程度、 好ましくは約 0. 1〜 2 0 m g程度、 より好 ましくは約 0. 1〜 1 0 m g程度を静脈注射により投与するのが好都合 である。 他の動物の場合も、 6 0 k g当たりに換算した量を投与するこ とができる。
本明細書および図面において、 塩基やアミノ酸などを略号で表示する 場合、 I U P A C— I UB Commission on Biochemical Nomenclature による略号あるいは当該分野における慣用略号に基づく ものであり、 そ の例を下記する。 またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、 特 に明示しなければ L体を示すものとする。
D N A ： デォキシリボ核酸
c D N A ：相補的デォキシリポ核酸
A ： アデニン
T ： チミ ン
G ： グァニン
C ： シ トシン
U ： ゥラシル
R N A · ： リボ核酸
mRN A ： メッセンジャ一リボ核酸
d AT P ： デォキシァァノシン三リン酸
d T T P ： デ才キシチミジン三リン酸
d G T P ： デォキシグアノシン三リン酸
d C T P ： テ才キシシチジン三リン酸
AT P ： アデノシン三リン酸
E D T A ： エチレンジァミン四酢酸 S D S ： ドデシル硫酸ナトリ ウム
G 1 y ： グリシン
A l a ： ァラニン
V a 1 ： ノ リ ン .
L e u ： ロイシン
I 1 e ： ィ ソロイシン
S e r ： セリ ン
T h r ： スレ才ニン
C y s ： システィ ン
M e t ： メチォニン
G 1 u ： グルタミン酸
A s p ： ァスパラギン酸
L y s ： リ ジン
A r g ： アルギニン
H i s ： ヒスチジン
P h e ： フエ二ルァラニン
T y r ： チロシン
T r p ： ト リブトファン
P r o ： プロ リ ン
A s n ： ァスパラギン
G i n ： グノレタミン
p G 1 u ： ピログルタミン酸
* ： 終止コ ドンに対応する
M e ： メチル基
E t ： ェチル基
B u ： プチノレ基
P h ： フェニノレ基
T C ： チアゾリジン— 4 (R) 一カルボキサミ ド基 また、 本明細書中で繁用される置換基、 保護基および試薬を下記の記 号で表記する。
T o s ρ― トルエンスルフォニル'
C H O ホノレミ ノレ
B z 1 ベンジル -
C 12B z 1 2， 6—ジク ロ口べンジノレ
B o m ベンジノレオキシメチノレ
Z ペンジノレオキシカノレボニノレ
C 1 一 Z 2—クロ口ペンジノレオキシカノレボニノレ
B r - Z 2—ブロモベンジル'ォキシカノレボ二/レ
B o c t—ブ トキシカノレポ二ノレ
D N P ジニ トロフエノーノレ
T r t ト リチル
B um t一ブトキシメチノレ
F m o c N _ 9—フノレオレニノレメ トキシカノレボニノレ
HO B t 1ーヒ ドロキシベンズト リァゾーノレ
HO O B t 3， 4—ジヒ ドロー 3—ヒ ドロキシ一 4ーォキソ一
1 , 2, 3—べンゾ ト リ アジン
H O N B ： 1 -ヒ ドロキシ- 5-ノノレボルネン _2， 3-ジカノレボキシ イ ミ ド
D C C N, N ' ージシク ロへキシルカルポジイ ミ ド 本明細書の配列表の配列番号は、 以下の配列を示す。
[配列番号： 1 ]
本発明で用いられるヒ ト P 2 Y2受容体蛋白質のァミノ酸配列を示す。
[配列番号： 2]
本発明で用レ、られるヒ ト Ρ 2 Υ2受容体蛋白質をコードする c DNA の塩基配列を示す。
[配列番号： 3 ]
マウス P 2 Y 2のァミノ酸配列を示す。
[配列番号： 4] ラッ ト P 2 Y2のアミノ酸配列を示す。
[配列番号： 5 ]
マウス Ρ 2 Υ2をコードする c D Ν Αの塩基配列を示す。
[配列番号： 6] - ラッ ト P 2 Y2をコードする c D Ν Αの塩基配列を示す。
[配列番号： 7]
実施例 2で用いられる、ヒ ト P 2 Y2領域を増幅するための上流プライ マーの塩基配列を示す。
[配列番号： 8 ]
実施例 2で用いられる、ヒ ト Ρ 2 Υ2領域を増幅するための下流プライ マーの塩基配列を示す。
[配列番号： 9 ]
実施例 2で用いられる、ヒ ト Ρ 2 Υ2領域の増幅を検出するためのプロ ーブの塩基配列を示す。 '
[配列番号： 1 0] 、
実施例 2で用いられる、マウス Ρ 2 Υ2領域を増幅するための上流ブラ ィマーの塩基配列を示す。
[配列番号： 1 1 ]
実施例 2で用いられる、マウス Ρ 2 Υ2領域を増幅するための下流ブラ イマ一の塩基配列を示す。
[配列番号： 1 2]
実施例 2で用いられる、マウス Ρ 2 Υ2領域の増幅を検出するためのプ ローブの塩基配列を示す。
[配列番号： 1 3]
実施例 4で用いられる、ラッ ト Ρ 2 Υ2領域を増幅するための上流ブラ ィマーの塩基配列を示す。
[配列番号： 1 4]
実施例 4で用いられる、ラッ ト Ρ 2 Υ2領域を増幅するための下流ブラ ィマーの塩基配列を示す。 [配列番号： 1 5 ] ' 実施例 4で用いられる、ラッ ト P 2 Y2領域の増幅を検出するためのプ ローブの塩基配列を示す。 実施例
以下に実施例を示して、 本発明をより詳細に説明するが、 これらは本 発明の範囲を限定するものではない。 実施例 1
( L 6一 S G 4一 8 1 1における c AMP産生活性の測定）
G L U T 4発現 L 6細胞 （L 6 — S G 4— 8 1 1 ) 〔 J o u r n a l
0 f B i o 1 o g i c a l C h e m i s t r y ( 1 9 9 3 ) v o 1 .
2 6 8 P P . 2 2 1 1 9 - 2 2 1 2 6 ] は 1 0 % F B S ( I n v i t r o g e n社）、 5 0 u n i t s /mL P e n i c i l l i n G
S o d i m 、 5 0 μ g / m L S t r e p t o m y c i n s u 1 f a t e ( I n v i t r o g e n社） を含む哺乳類細胞培養基本培地 D u 1 b e c c o s M o d i f i e d E a g l e M e d i u m
( I n V i t r o g e n社） で培養した。 ゥェルあたり 1 X 1 04個にな るよ 5に 1 0 % F B S、 5 0 u n i t s / m 1 P e n i c i l l
1 n G s o d i u m、 5 0 /_i gノ m l S t r e p t o my c i n s u 1 f a t eを含む哺乳類細胞培養基本培地 M i n i m u m E s s e n t i a 1 M e d i u m ( I n v i t r o g e n社） で調製し、 白色 9 6一 w e 1 1 t i s s u e c u l t u r e p l a t e ( C o r n i n g社 こ播種し、 3 7 °C、 5 % C〇2条件下でー晚培養した。 P 2 Y2発現プラスミ ド p c D N A 3 · l H y g r o ( + ) /h P 2 Y2 およぴコン ト ローノレの p c DNA 3. I H y g r o ( + ) 〔 I n v i t r o g e n 社； # V 8 7 0 2 0〕 はトランスフエクシヨン試薬 L i p o f e c t a m i n e 2 0 0 0 ( I n v i t r o g e n社 を用レヽ、 添付プロ トコールに従って L 6 — S G 4— 8 1 1に導入した。 3 7 ° (：、 5 % C〇2条件下で 4時間培養後、上記播種時に用いた培地で 1 洗浄 し、 3 7°C、 5 % C〇2条件下で 1 2時間培養した。 f a t t y a c i d f r e eの B S A (S i g m a社） を 0. 1 %含む M i n i m u m E s s e n t i a l M e d i u mで 1回洗浄後、 この培地で 3 7。C、 5 % C 02条件下で 4時間培養した。 f a t t y a c i d f r e eの B S A (S i g m a社） を 0. 0 5 %含む 1 1 6 mM N a C l 、 4. 7 mM KC 1 、 1. 2 mM KH2P 04、 1. 2 m M M g S〇4、 2 5 mM N a HC 03、 2 4 mM HE P E S、 2. 5 mM C a C 12緩衝液 （0. 0 5 % B S A K R B H) で 1 回洗浄後、 この緩衝液に置換した。 AT Pは最終濃度の 1 0倍濃度にな るように KR B Hで調製し、ゥエルあたり 1 0 m lずつ添加し、 3 Ί。 、 5 % C02条件下で 3 0分培養した。
1 m C i / m 1 [ H] 2— D e o x y— D— g l u c o s e ( P e r k i n E l m e r社） を含む 1 0 0 mM 2— D e o x y— D— g l u c o s eを 0. 0 5 % B S A KR BHで調製し、 ゥ'エルあた り 2 0 m 1ずつ添加し、 3 7 °C、 5 % C O 2条件下で 1時間培養した。 冷やした P B Sで 3回洗浄し、 E t OHをゥエルあたり 2 0 μ 1添加し た。 ί夜体シンチレーシヨンカクテル （O p t i P h a s e ' S u p e r M i x ' 、 W a 1 l a c ) をゥエルあたり 1 0 0 m lずつ添加し、 プレートミキサーで 2分振盪し、 シンチレーシヨ ンカウンター T o p C o u n t (P a c k a r d社） で測定した。 その結果、 P 2 Y2—過性発 現 L 6— S G 4— 8 1 1で有意な AT P濃度依存的な 2— D e o x y— D - g 1 u c o s eの細胞内への取り込みを検出した。 実施例 2
(任意受容体の網羅的発現解析）
この実施例においては、 T a qM a n法によって、 任意のヒ トおよび マウス RNA試料中の、 標的 Gタンパク質共役型レセプター、 チロシン リン酸化酵素型レセプター、 イオンチャネルなどのファミ リーに属する 遺伝子由来 mRN Aの有無及びその産生量を定量し、 標的 Gタンノ ク質 共役型レセプター、 チロシンリン酸化酵素型レセプター、 イオンチヤネ ルなどのフアミ リ一に属する遺伝子の発現レベルを解析した。 本例にお いては、 3 8 4穴プレートを用いて、 . 3 6 0種の標的 Gタンパク質共役 型レセプター、 チロシンリ ン酸化酵素型レセプター、 イオンチャネルな どのフアミ リーに属する遺伝子の発現を解析する。 標的 G P C R遺伝子 と して、 例えば ORL; Ml; M2; M3; M4; M5; Al; A2A; A2B; A3 ； ひ 1A; a IB; a ID; a 2A; a 2B； a 2C; β 1； j32； 3 ; ATI; AT2 ; BB1; BB2; bb3 ； Bl; B2;CBl;CB2;CCRl; CCR2； CCR3； CCR4； CCR5; CCR6; CCR7; CCR8； CCR9； CCR10; CXCRl; CXCR2； CXCR3; CXCR4; CXCR5； CX3CR1; XCRl; C3a; C5a; fMLP ； CCKl; CCK2 ； CRF1; CRF2 ； Dl； D2; D3; D4; D5 ； ETA; ETB ； GAL1; GAL2； GAL 3 ； mglul； mglu2； mglu3； raglu4; mglu5； mglu6； mglu7； raglu8 ； FSH; LSH; TSH ； Hi; H2； H3; H4 ； 5- HT1A; 5- HT1B; 5- HT1D; 5- htlB; 5-htlF;5-HT2A; 5 - HT2F; 5-HT2C; 5 - HT3; 5 - HT4; 5 - ht5A; 5 - ht5B; 5 - HT6; 5-HT7; BLT: CysLTl; CysLT2 ； edgl; edg2; edg3; edg4; MCI; MC2； MC3; MC4; MC5 ； MTl; MT2； MT3 ； Yl; Y2; Y4; Y5; Y6 ； NTS1; NTS2 ； DOP; KOP; MOP; NOP ； P2Y1; P2Y2; P2Y4; P2Y6; P2Y11; P2Y12 ； PPAR- a ； PPAR- β ； PPAR- y ； DP; FP; IP; TP; EP1; EP2； EP3； EP4 ； PARI; PAR2； PAR3； PAR4 ； sstl; sst2; sst3; sst4; sst5;NKl; NK2； NK3； TRHl; TRH2； VPACl; VPAC2; PAC1 ； Via; Vlb; V2； 0T ； N a +チャネル （タイプ I； タイプ 11/タイプ IIA; タイプ III； SCLll/NaG; PN1; NaCh6; NaDRG; SkMl/^u 1, SkM2) ； K+チヤネノレ （Kv; EAG; KQT; IRK; R0MK; GIRK; KATP 等） ； C a 2+チヤ ネル （ a lG; a IE; a IS: a 1C; a ID; a IB; 1A; IP3; リ アノジンレ セプターなど） ； C 1 -チャネル （GABAA; GABAC； グリシンレセプター ； C1C0; ClCl; CFTR など） ； 非選択性カチオンチャネル （nAChR; 5- HT3; NMDA; AMPA; P2XATP; CNGなど） などから選択された。
増幅は、 以下の試料を用いて行った。
ヒ ト試料は成人正常骨格筋由来の全 R N A (C 1 o n t e c h社） を 購入した。 マウス試料は、 C 5 7 B LZ 6 右大腿部骨格筋を摘出し、 I s o g e n (二ツボンジーン社） のマニュアルにしたがって全 I NA を調製した。 ポジテイブコント口ールと して増幅領域の合成 c D N Aの 連続希釈溶液を用いた。
ヒ ト P 2 Y2 mRN Αの領.域の増幅は、 上流プライマー （配列番号 ： 7 ) および下流プライマー （配列番号 ： 8) を用いて行った。 検出は、 プローブ （配列番号： 9) (アプライ ドバイオシステムズジャパン株式会 社） を用いて行った。
マウス P 2 Y2 mRNAの領域の増幅は、 上流プライマー （配列番 号 ： 1 0) および下流プライマー （配列番号 ： 1 1 ) を用いて行った。 検出は、 プローブ （配列番号： 1 2) (アプライ ドバイオシステムズジャ パン株式会社） を用いて行った。
T a qM a n形式での検出を可能にするために、前記プローブは、 5 ' 端をフルォレセイン型の蛍光色素 （FAM : リポーター） で、 3 ' 端を ローダミ ン型の蛍光色素 （T AMR A ： クェンチヤ一） で標識した。 標 識したプローブは、 ハイブリダィズしない状態の場合には、 蛍光共鳴ェ ネルギ一の移動現象により、 リポーターの蛍光は抑制された。 DNAポ リメラーゼによる前記プローブの伸長を、 増幅の間防ぐために、 前記プ ローブの 3 ' 末端はリ ン酸ブロックで合成した。
c DNA合成は、 前述の RNA、 4 0 μ gに対しランダムプライマー を用いて逆転写反応をおこなった。 逆転写酵素 S u p e r s c r i p t I I ( I n v i t r o g e n社） を使用し、 添付のプロ トコールにした がって反応させ、 ェタノール沈殿して 4 Ο Ο / l の T E ( 1 0 mM T r i s— H C 1、 1 mM EDTA p H 8. 0) に溶解した。
' 増幅と定量は下記の通り行った。
合成した c D N Aは T Eに溶解し、 5 0 μ g /m 1 の酵母 t R N Aを 含む T Eに 1 0 n g 1 になるよ うに希釈した。 希釈した c DNA溶 液 2. 5 μ 1 ( 2 5 n g R N A相当） に対し、 増幅反応試薬は、 TaqMan (登録商標） Universal PCR Master Mix (アプライ ドバイオシステムズ ジャパン株式会社） を用い、 1 5 1 の合計反応液量に調製した。 各プ ライマー、 プローブの最終濃度はマニュアルに従った。
TaqMan (登録商標） PCRは、 ABI PRISM (登録商標） 7900HT配列検出 システム （アプライ ドバイオシステムズジャパン株式会社） で行い、 使 用した温度周期は · TaqMan (登録商標). Universal PCR Master Mix (ァ プライ ドバイオシステムズジャパン株式会社） のマニュアルに従った。 増幅生成物の定量的 TaqMan解析は、 7900HT SDS ソフ トウェア （ァプ ライ ドバイオシステムズジャパン株式会社） を用い、 絶対定量法により 試料あたりのコピー数を算出した。
以下、 同様にして、 他の標的 Gタンパク質共役型レセプター、 チロシ ンリ ン酸化酵素型レセプター、 イオンチャネルなどのファミ リーに属す る遺伝子 mR N Aの産生量が定量された。 そして、 全ての標的 Gタンパ ク質共役型レセプター、 チロシンリ ン酸化酵素型レセプター、 イオンチ ャネルなどのファミ リ一に属する Λ伝子 mRN Aの産生量を比較するこ とによって、 ヒ トおよびマウス正常骨格筋における各標的 Gタンパク質 共役型レセプター、 チロシンリ ン酸化酵素型レセプター、 イオンチヤネ ルなどのファミ リ一に属する遺伝子の発現量を解析した。
解析結果を図 1に示す。
ヒ ト骨格筋では測定した全ターゲッ ト G P C R中 P 2 Y2が 4番目に 高い発現量を示した。 その発現量は l n gの全 RNA中、 約 1 5 0 0コ ピーであった。 マウス骨格筋では測定した全ターゲッ ト G P C R中 P 2 Y2が 3番目に高い発現量を示した。 その発現量は 1 n gの全 RNA中、 約 4 0 0 0コピーであった。 実施例 3
(P 2 Y2の組織分布）
ヒ ト試料はヒ ト各種組織由来の全 RN A (C 1 o n t e c h社および B i o c h a i n社） を購入した。 マウス試料は、 C 5 7 B Lノ 6力 ら 各組織を摘出し、 I s o g e n (二ツボンジーン社） のマニュアルにし ' たがって全 R N Aを'調製した。 c D N A合成は、 前述の R N A 4 0 μ gに対しランダムプラ マー を用いて逆転写反応をおこなった。 逆転写酵素 S u p e r S c r i p t I I ( I n v i t r o g e n社） を.使用し、 添付のプロ トコールにした がって反応させ、 エタノール沈殿して 4 0 0 μ I の Τ Εに溶解した。 合 成した c D Ν Αは Τ Εに溶解し、 5 0 μ g Zm 1 の酵母 t R N Aを含む T Eに 1 0 n g / μ 1 になるように希釈した。希釈した c D Ν Α溶液 2 . 5 μ 1 ( 2 5 η g R N A相当） に対し、 増幅反応試薬は、 TaqMan (登 録商標） Universal PCR Master Mix (アプライ ドバイオシステムズジャ パン株式会社) を用い、 1 5 μ 1 の合計反応液量に調製した。 定量に用 いるプライマーとプローブは、 実施例 1 と同じものを使用した。 各プラ イマ一、 プローブの最終濃度はマニュアルに従った。
TaqMan (登録商標） PCRは、 ABI PRISM (登録商標） 7900HT配列検出 システム （アプライ ドバイオシステムズジャパン株式会社） で行い、 使 用した温度周期は TaqMan (登録商標） Universal PCR Master Mix (ァ プライ ドバイオシステムズジャパン株式会社） のマニュアルに従った。 増幅生成物の定量的 TaqMan解析は、 7900HT SDS ソフトウェア （ァプラ イ ドバイオシステムズジャパン株式会社） を用い、 絶対定量法により試 料あたりのコピー数を算出した。
結果を図 2に示す。
ヒ トでは用いた資料中骨格筋で最も発現が高く、 マウスでも心筋、 気 管、 回腸に続き 4番目に骨格筋で高発現していた。 ヒ ト、 マウスいずれ においても P 2 Y2は骨格筋に比較的特異的に高発現していることが示 された。 実施例 4
(骨格筋由来細胞株における Ρ 2 Υ 2の発現解析）
マウス骨格筋由来細胞株 C 2 C 1 2 (AT C C)、 ラット骨格筋由来細 胞株 L 6 (JC Lawrence Jrから分与） のいずれの細胞も 1 0 % F B S ^ l n v i t r o g e n社 、 5 0 units/mL Penicillin G Sodium、 5 0 g / m 1 Streptomycin sulfate ( I n v i t r o g e n社) ,を含 む、 Dulbecco' s Modified Eagle Medium ( I n v i t r o g e n社) で 培養した。 C 2 C 1 2は 2 %ゥマ血清 （ I C N社） を含む Dulbe<Sco， s Modified Eagle Medium に置き換える.ことにより分化を促した。 L 6は 2 % F B Sを - Minimum Essential Medium I n v i t r o g e n 社） に置き換えることにより分化を促した。 それぞれの分化段階の細胞 を 0. 2 5 %トリプシン一 I mM EDTA ( I n v i t r o g e n社） ではがし細胞数を測定した後、 I s o g e n (二ツボンジーン社） のマ ニュアルにしたがって全 RN Aを調製した。
c D NA合成は、 前述の RNA 4 O / gに対しランダムプライマー を用いて逆転写反応をおこなった。 逆転写酵素 S u p e r S c r i p t
1 I ( I n v i t r o g e n社） を使用し、 添付のプロ トコールにした がって反応させ、 ェタノール沈殿して 4 0 0 1の Τ Εに溶解した。 合 成した c DNAは Τ Εに溶解し、 5 0 μ g Zm 1の酵母 t R N Aを含む T Eに l O n
Figure imgf000068_0001
l になるように希釈した。希釈した c DNA溶液 2. 5 μ 1 ( 2 5 n g RNA相当） に対し、 増幅反応試薬は、 TaqMan (登 録商標） Universal PCR Master Mix (アプライ ドバイオシステムズジャ パン株式会社） を用い、 1 5 μ 1の合計反応液量に調製した。 定量に用 いるプライマーとプローブは、 マウスについては実施例 1 と同じものを 使用し、 ラッ トについては上流プライマー （配列番号： 1 3 ) および下 流プライマー （配列番号： 1 4) を用いて行った。 検出は、 プローブ'（配 列番号： 1 5 ) を用いて行った。 各プライマー、 プローブの最終濃度は マ二ユアノレに従った。
TaqMan (登録商標） PCRは、 ABI PRISM (登録商標） 7900HT配列検出 システム （アプライ ドバイオシステムズジャパン株式会社） で行い、 使 用した温度周期は TaqMan (登録商標） Universal PCR Master Mix (ァ プライ ドバイォシステムズジャパン株式会社) のマニュアルに従った。 増幅生成物の定量的 TaqMan解析は、 7900HT SDS ソフ トウェア （ァプラ イ ドバイオシステムズジャパン株式会社） を用い、 絶対定量法により試 料あたりのコピー数を算出した。
結果を図 3に示す。
C 2 C 1 2、 L 6のいずれも筋芽細胞から筋管細胞への分化に伴い P 2 Y2の発現が亢進した。 - 実施例 5
(L 6 - S G 4 - 8 1 1における糖取り込みの測定）
G LUT 4発現 L 6細胞 （L 6— S G 4— 8 1 1 ) は 1 0 % F B S ( I η V i t r o g e n社)、 5 0 units/mL Penicillin G Sodium, 5 0 μ g / m 1 Streptomycin sulfate ( I n v i t r o g e n社) を含 む、 卩甫乳類糸田月包培養基本培地 Dulbecco' s Modified Eagle Medium ( I n v i t r o g e n社） で培養した。 ゥエルあたり 1 X I 04個になるよう に 1 0 % F B S ( I n v i t r o g e n社）、 5 0 units/mL Penicillin G Sodium、 5 0 μ g / m 1 Streptomycin sulfateを 、 哺乳類細胞培養基本培地 Minimum Essential Medium ( I n v i t r o g e n社） で調製し、 白色 96-well tissue culture plate ( C o r n i n g社） に播種し、 3 7°C、 5 % C 02条件下でー晚培養した。 P 2Y2 発現プラスミ ド p c D N A 3. 1 /P 2 Y2およびコン トロールの p c D N A 3. 1はトランスフエクション試薬 Lipofectamine 2000 ( I n v i t r o g e n社） を用い、 添付プロ トコールに従って L 6— S G 4— 8 1 1に導入した。 3 7°C、 5% C〇2条件下で 4時間培養後、 上記播種 時に用いた培地で 1回洗浄し、 3 7°C、 5 % C02条件下で 1 2時間培 養した。 脂肪酸不含 B S A ( S i g m a社） を 0. 1。/。含む Minimum Essential Medium で 1回洗浄後、 この培地で 3 7°C、 5 % C〇2条件 下で 4時間培養した。 脂肪酸不含 B S A (S i g m a社） を 0. 0 5 % 含む 116mM NaCl, 4.7mM KCl, 1.2mM KH2P04, 1.2raM MgS04, 25mM NaHC03, 24mM HEPES, 2.5mM CaCl, 緩衝液 （0.05% BSA KRBH)で 1回洗浄後、 この 緩衝液に置換した。 AT Pは最終濃度の 1 0倍濃度になるように KR B ' Hで調製し、 ゥヱルあたり 1 0 1ずつ添加し、 3 7 °C、 5 % C02 条件下で 3 0分培養した。 ，
1 μ Ci/ml [3H] 2 - Deoxy- D_glucose (PerkinElmer 社）を含む lOOuM 2 - Deoxy_D- glucoseを 0.05% BSA KRBHで調製し、 ゥエルあたり 2 0 μ 1 ずつ添加し、 3 7 PC、 5 % C 02条件下で 1時間培養した。 冷やした P B Sで 3回洗浄し、 ェタノールをゥヱルあたり 2 0 1添加した。 液体 シンチレ一ンヨ ンカクテル (OptiPhase' SuperMix' , Wallac) をゥエルあ たり 1 0 0 μ 1ずつ添加し、 プレートミキサーで 2分振盪し、 シンチレ ーションカウンター TopCount (Packard社）で測定した。
その結果、 図 4に示すように、 P 2 Y2—過性発現 L 6 - S G 4 - 8 1 1で有意な A T P濃度依存的な 2- Deoxy- D- glucoseの細胞内への取り込 みを検出した。 産業上の利用可能性
本発明により有用な血糖調節剤が提供される。 P 2 Y2ァゴニス トはィ ンスリン分泌不全 ·イ ンスリン抵抗性のいずれの成因を持つ糖尿病患者 に対しても、幅広く血糖低下作用を示す新規創薬タ一ゲッ トになり得る。

Claims

請求の範囲 s
I . P 2 Y 2受容体蛋白質またはその塩の活性を促進する化合物またはそ の塩を含有してなる血糖低下剤。 .
2 . Ρ 2 Υ 2受容体蛋白質またはその塩の遺伝子の発現を促進する化合物 またはその塩を含有してなる血糖低下剤。
3 . Ρ 2 Υ 2受容体蛋白質またはその塩が骨格筋の Ρ 2 Υ 2受容体蛋白質 またはその塩である請求項 1または 2記載の剤。
4 . 糖尿病、 肥満症または高脂血症予防 ·治療剤である請求項 1ないし 3記載の剤。
5 . Ρ 2 Υ 2受容体蛋白質またはその塩の活性を阻害する化合物またはそ の塩を含有してなる血糖上昇剤。
6 . Ρ 2 Υ 2受容体蛋白質またはその塩の遺伝子の発現を阻害する化合物 またはその塩を含有してなる血糖上昇剤。
7 . Ρ 2 Υ 2受容体蛋白質またはその塩が骨格筋の Ρ 2 Υ 2受容体蛋白質 またはその塩である請求項 5または 6記載の剤。
8 . 低血糖症予防 ·治療剤である請求項 5ないし 7記載の剤。
9 . Ρ 2 Υ 2受容体蛋白質またはその塩が配列番号： 1で表されるァミノ 酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有する蛋白質も しくはその部分ぺプチドまたはその塩である請求項 1ないし 8記載の剤。
1 0 . Ρ 2 Υ 2受容体蛋白質またはその塩が配列番号： 1で表されるアミ ノ酸配列からなる蛋白質またはその塩である請求項 1ないし 8記載の剤。
I I . Ρ 2 Υ 2受容体蛋白質またはその部分べプチドをコードするポリヌ クレオチドを含有するポリヌクレオチドを含有してなる血糖低下剤。
1 2 . 糖尿病、 肥満症または高脂血症予防 ·治療剤である請求項 1 1記 載の剤。
1 3 . Ρ 2 Υ 2受容体蛋白質をコードするポリヌクレオチドが配列番号 ： 2で表される塩基配列と同一もしくは実質的に同一の塩基配列を含有す ' るポリ.ヌクレオチドである請求項 1 1ないし 1 2記載の剤。
1 4 . P 2 Y 2受容体蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその;^を含 有してなる血糖上昇剤。
1 5 . 低血糖症予防 ·治療剤である請求項 1 4記載の剤。
1 6 . P 2 Y 2受容体蛋白質またはその塩が配列番号： 1で表されるアミ ノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質 もしくはその部分べプチドまたはその塩である請求項 1 4ないし 1 5記 載の剤。
1 7 . Ρ 2 Υ 2受容体蛋白質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列に 相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部分を含有する アンチセンスポリヌクレオチドを含有してなる血糖上昇剤。
1 8 . 低血糖症予防 ·治療剤である請求項 1 7記載の剤。
1 9 . Ρ 2 Υ 2受容体蛋白質をコードするポリヌクレオチドが配列番号： 2で表される塩基配列と同一もしくは実質的に同一の塩基配列を含有す るポリヌクレオチドである請求項 1 7ないし 1 8記載の剤。
2 0 . Ρ 2 Υ 2受容体蛋白質またはその塩に対する抗体を含有してなる血 糖上昇剤。
2 1 . 低血糖症予防 ·治療剤である請求項 2 0記載の剤。
2 2 . Ρ 2 Υ 2受容体蛋白質またはその塩が配列番号： 1で表されるアミ ノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質 もしくはその部分べプチドまたはその塩である請求項 2 0ないし 2 1記 載の剤。
2 3 . Ρ 2 Υ 2受容体蛋白質またはその塩に対する抗体を含有してなる糖 尿病または低血糖症の診断薬。
2 4 . Ρ 2 Υ 2受容体蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含有してな る糖尿病または低血糖症の診断薬。
2 5 . Ρ 2 Υ 2受容体蛋白質またはその塩を用いることを特徴とする、血 糖値を調節する化合物またはその塩のスクリ一二ング方法。
2 6 . Ρ 2 Υ 2受容体蛋白質またはその塩が骨格筋の Ρ 2 Υ 2受容体蛋白 ' 質またはその塩である請求項 2 2記載のスクリ一二ング方法。
2 7. P 2 Y2受容体蛋白質またはその塩が配列番号： 1で表されるァミ ノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質 もしくはその部分べプチドまたはその塩である請求項 2 5記載のスクリ 一二ング方法。 · - 2 8. P 2 Y2受容体蛋白質またはその塩を含有することを特徴とする、 血糖値を調節する化合物またはその塩のスクリーニング用キッ ト。
2 9. Ρ 2 Υ2受容体蛋白質をコードするポリヌクレオチドを用いるこ、と を特徴とする、 血糖値を調節する化合物またはその塩のスクリーユング 方法。
3 0. Ρ 2 Υ2受容体蛋白質をコードするポリヌクレオチドが配列番号： 2で表される塩基配列と同一もしくは実質的に同一の塩基配列を含有す るポリヌクレオチドである請求項 2 9記載のスクリ一ユング方法。
3 1. Ρ 2 Υ2受容体蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含有するこ とを特徴とする、 血糖値を調節する化合物またはその塩のスクリーニン グ用キッ ト。
3 2. Ρ 2 Υ2受容体蛋白質またはその塩を用いることを特徴とする、 Ρ
2 Υ2受容体蛋白質またはその塩に対するァゴニス トのスクリーニング 方法。
3 3. Ρ 2 Υ2受容体蛋白質またはその塩を用いることを特徴とする、 Ρ 2 Υ2受容体蛋白質またはその塩に対するアンタゴニス トのスクリー二 ング方法。 ，
3 4. ( 1 ) Ρ 2 Υ2受容体蛋白質またはその塩の標識されたリガンドま たはその塩を、 該蛋白質またはその塩に接触させた場合と、 （ 2) 試験化 合物および Ρ 2 Υ2受容体蛋白質またはその塩の標識されたリガンドま たはその塩を、 該蛋白質またはその塩に接触させた場合における、 Ρ 2 Υ2受容体蛋白質またはその塩の標識されたリガンドまたはその塩と、該 蛋白質またはその塩との結合量を測定することを特徴とする請求項 3 2 または 3 3記載のスクリ一二ング方法。
' 3 5. ( 1 ) Ρ 2 Υ。受容体蛋白質またはその塩の標識されたリガンドま たはその塩を、 該蛋白質を含有する細胞またはその細胞膜画分に接触さ せた場合と、 （ 2 ) 試験化合物および P 2 Y2受容体蛋白質またはその塩 の標識されたリガンドまたはその塩を、 該蛋白質を含有する細胞または その細胞膜画分に接触させた場合における'、 Ρ 2 Υ2受容体蛋白質または その塩の標識されたリガンドまたはその塩と、 該蛋白質を含有する細胞 またはその細胞膜画分との結合量を測定することを特徴とする請求項 3 2または 3 3記載のスクリ一二ング方法。
3 6. ( 1 ) Ρ 2 Υ2受容体蛋白質またはその塩のリガンドまたはその塩 を、該蛋白質を含有する細胞またはその細胞膜画分に接触させた場合と、 ( 2 ) Ρ 2 Υ2受容体蛋白質またはその塩のリガンドまたはその塩の存在 下または非存在下に、 試験化合物を該蛋白質を含有する細胞またはその 細胞膜画分に接触させた場合における、 Ρ 2 Υ2受容体蛋白質を介した細 胞刺激活性を測定することを特徴とする請求項 3 2または 3 3記載のス クリ一二ング方法。
3 7. ( 1 ) Ρ 2 Υ2受容体蛋白質またはその塩のリガンドまたはその塩 を、該蛋白質を含有する細胞またはその細胞膜画分に接触させた場合と、 ( 2 ) Ρ 2 Υ2受容体蛋白質またはその塩のリガンドまたはその塩の存在 下または非存在下に、 試験化合物を該蛋白質を含有する細胞またはその 細胞膜画分に接触させた場合における、 細胞内 C a 2+濃度または細胞内 c AMP生成を測定することを特徴とする請求項 3 2または 3 3記載の スクリ一ユング方法。
3 8. P 2 Y2受容体蛋白質またはその塩に G LUT 4を共存させること を特徴とする請求項 3 2ないし 3 7記載のスクリーユング方法。
3 9. 骨格筋由来細胞または骨格筋細胞を用いることを特徴とする請求 項 3 2ないし 3 7記載のスク リーニング方法。
4 0. リガンドが UT Pまたは ΑΤ Ρである請求項 3 2ないし 3 7記載 のスクリ一ユング方法。
4 1. Ρ 2 Υ2受容体蛋白質またはその塩の活性を促進することを特徴と ' する血糖低下方法。
4 2 . P 2 Y 2受容体蛋白質またはその塩の遺伝子の発現を促進すること を特徴とする血糖低下方法。
4 3 . P 2 Y 2受容体蛋白質またはその塩が骨格筋の Ρ 2 Υ 2受容体蛋白 質またはその塩である請求項 4 1また.は 4 2記載の方法。
4 4 . 糖尿病、 肥満症または高脂血症予防 ·治療方法である請求項 4 1 ないし 4 3記載の方法。
4 5 . Ρ 2 Υ 2受容体蛋白質またはその塩の活性を阻害することを特徴と する血糖上昇方法。
4 6 . Ρ 2 Υ 2受容体蛋白質またはその塩の遺伝子の発現を阻害すること を特徴とする血糖上昇方法。
4 7 . Ρ 2 Υ 2受容体蛋白質またはその塩が骨格筋の Ρ 2 Υ 2受容体蛋白 質またはその塩である請求項 4 5または 4 6記載の方法。
4 8 .低血糖症予防'治療方法である請求項 4 5ないし 4 7記載の方法。
4 9 . Ρ 2 Υ 2受容体蛋白質またはその塩の活性を促進する化合物または その塩の有効量を哺乳動物に投与することを特徴とする血糖低下方法。
5 0 . Ρ 2 Υ 2受容体蛋白質またはその塩の遺伝子の発現を促進する化合 物またはその塩の有効量を哺乳動物に投与することを血糖低下方法。
5 1 . Ρ 2 Υ 2受容体蛋白質またはその塩が骨格筋の Ρ 2 Υ 2受容体蛋白 質またはその塩である請求項 4 9または 5 0記載の方法。
5 2 . 糖尿病、 肥満症または髙脂血症予防 ·治療方法である請求項 4 9 ないし 5 1記載の方法。
5 3 . Ρ 2 Υ 2受容体蛋白質またはその塩の活性を阻害する化合物または その塩の有効量を哺乳動物に投与することを特徴とする血糖上昇方法。 5 4 . Ρ 2 Υ 2受容体蛋白質またはその塩の遺伝子の発現を阻害する化合 物またはその塩の有効量を哺乳動物に投与することを特徴とする血糖上 昇方法。
5 5 . Ρ 2 Υ 2受容体蛋白質またはその塩が骨格筋の Ρ 2 Υ 2受容体蛋白 質またはその塩である請求項 5 3または 5 4記載の方法。
' 5 6 .低血糖症予防 ·治療方法である請求項 5 3ないし 5 5記載の方法。
5 7.血糖低下剤の製造のための P 2 Y2受容体蛋白質またはその塩の活 性を促進する化合物またはその塩の使用。
5 8.血糖低下剤の製造のための Ρ 2 Υ2受容体蛋白質またはその塩の遺 伝子の発現を促進する化合物またはそ.の塩の使用。
5 9. Ρ 2 Υ2受容体蛋白質またはその塩が骨格筋の Ρ 2 Υ2受容体蛋白 質またはその塩である請求項 5 7または 5 8記載の使用。
6 0. 血糖低下剤が糖尿病、 肥満症または高脂血症予防 ·治療方法であ る請求項 5 7ないし 5 9記載の使用。
6 1.血糖上昇剤の製造のための Ρ 2 Υ2受容体蛋白質またはその塩の活 性を阻害する化合物またはその塩の使用。
6 2.血糖上昇剤の製造のための Ρ 2 Υ2受容体蛋白質またはその塩の遺 伝子の発現を阻害する化合物またはその塩の使用。
6 3. Ρ 2 Υ2受容体蛋白質またはその塩が骨格筋の Ρ 2 Υ2受容体蛋白 質またはその塩である請求項 6 1または 6 2記載の使用。
6 4. 血糖上昇剤が低血糖症予防 ·治療剤である請求項 6 1ないし 6 3 記載の使用。
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