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WO2006051847A1 - Ｈｉｖ等のウイルス感染の有無、又はプリオン感染の有無を近赤外線分光法により検査・判定する方法、及び同方法に使用する装置 - Google Patents

Ｈｉｖ等のウイルス感染の有無、又はプリオン感染の有無を近赤外線分光法により検査・判定する方法、及び同方法に使用する装置 Download PDF

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WO2006051847A1
WO2006051847A1 PCT/JP2005/020595 JP2005020595W WO2006051847A1 WO 2006051847 A1 WO2006051847 A1 WO 2006051847A1 JP 2005020595 W JP2005020595 W JP 2005020595W WO 2006051847 A1 WO2006051847 A1 WO 2006051847A1
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WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
analysis
light
infection
hiv
prion
Prior art date
Application number
PCT/JP2005/020595
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Akikazu Sakudo
Tsenkova Roumiana
Kazuyoshi Ikuta
Takashi Onodera
Original Assignee
The New Industry Research Organization
Osaka University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by The New Industry Research Organization, Osaka University filed Critical The New Industry Research Organization
Priority to US11/718,980 priority Critical patent/US20080113337A1/en
Priority to JP2006544939A priority patent/JPWO2006051847A1/ja
Publication of WO2006051847A1 publication Critical patent/WO2006051847A1/ja

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
    • G01N21/25—Colour; Spectral properties, i.e. comparison of effect of material on the light at two or more different wavelengths or wavelength bands
    • G01N21/31—Investigating relative effect of material at wavelengths characteristic of specific elements or molecules, e.g. atomic absorption spectrometry

Definitions

  • the present invention relates to a method for examining and determining the presence or absence of a virus infection such as HIV or the presence or absence of prion infection by a near-infrared spectroscopy, and an apparatus used for the method.
  • a virus infection such as HIV or the presence or absence of prion infection by a near-infrared spectroscopy
  • detection of viral infections such as HIV (human immunodeficiency virus) and HCV (hepatitis C virus) mainly consists of (l) detection of viral DNA by PCR, or (2) ELISA (fermentation). Detection of antiviral antibodies or viral antigens by means of an immunoassay method) is used as an index.
  • a method of detecting the presence or absence of HIV p24 antigen by an ELISA method or a Western plot method is employed (see Non-Patent Document 1 below).
  • the specific component is quantitatively analyzed by irradiating a sample with visible light and / or near infrared rays and detecting a wavelength band absorbed by the specific component.
  • a sample is injected into a quartz cell, and a near-infrared spectrometer (for example, a near-infrared spectrometer NIRSystem6500 manufactured by Nireco) is used for this. This is performed by irradiating with visible light and / or near infrared rays and analyzing the transmitted light, reflected light, or transmitted / reflected light.
  • a near-infrared spectrometer for example, a near-infrared spectrometer NIRSystem6500 manufactured by Nireco
  • near-infrared light is a low-energy electromagnetic wave that has a very small extinction coefficient of a substance and is difficult to be scattered. Therefore, it is possible to obtain chemical / physical information without damaging the sample. .
  • the sample information can be obtained immediately by detecting the transmitted light from the sample, obtaining the absorbance data of the sample, and performing multivariate analysis on the obtained absorbance data.
  • the process of changes in the structure and function of biomolecules can be captured directly and in real time.
  • Patent Document 1 discloses a method for obtaining information from a subject using visible-near infrared rays, specifically, a method for determining a group to which an unknown subject belongs, a method for identifying an unknown subject, and a subject.
  • a method for monitoring changes in the specimen over time in real time has been disclosed.
  • Virus detection and prion detection by near infrared spectroscopy are not disclosed in the literature.
  • Patent Document 2 body cells in milk or breast are measured by multivariate analysis of the obtained absorbance data using absorption bands of water molecules in the visible light and / or near infrared region. A method for diagnosing bovine mastitis is disclosed.
  • Patent Document 3 discloses a method for diagnosing changes induced by transmissible spongiform encephalopathy (TSE) in animal and human tissues by measuring the infrared spectrum of the tissues. This method is also intended for examination of postmortem histopathology, and is a postmortem examination.
  • TSE transmissible spongiform encephalopathy
  • Non-Patent Document 1 Valdiserri RO, Holtgrave DR, West GR. Promoting early HIV diagnosis and entry into care. AIDS. 1999 13 (17): 2317—30.
  • Non-Patent Document 2 Aguzzi A, Heikenwalder M, Miele G. Progress and problems in the biology, diagnostics, and therapeutics of prion diseases. J Clin Invest. 2004 ⁇ ⁇ 4 (2): 15 3-60.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Laid-Open No. 2002-5827 (Pages 1-9, Fig. 1)
  • Patent Document 2 International Publication No. WO01 / 75420 (Page 1-5, Fig. 1)
  • Patent Document 3 Special Table 2003-500648
  • the present invention is a method for quantitatively or qualitatively and simply, rapidly and accurately detecting the presence or absence of viral infection such as HIV in a subject using near infrared spectroscopy. It is an object of the present invention to provide a novel method and apparatus.
  • the present invention further uses a near-infrared spectroscopy to provide a novel method for quantitatively or qualitatively examining, quickly, and accurately determining the presence or absence of prion infection in a subject. It is an object of the present invention to provide a method and apparatus.
  • the present inventor has conducted near infrared spectroscopy. It is possible to test and diagnose HIV and other virus infections and prion infections, and in particular, devise a method for measuring visible-near-infrared (VIS-NIR) spectra and analyzing the spectrum data obtained. By creating an analysis model in this way, it has been found that good detection and diagnosis using the analysis model is possible, and the present invention has been completed.
  • VIS-NIR visible-near-infrared
  • the present invention includes the following inventions as medically and industrially useful inventions.
  • A) Absorbance spectrum data is obtained by irradiating a specimen sample derived from a subject or other animal with light in the wavelength range of 400 nm to 2500 nm or a partial range thereof, and detecting the reflected light, transmitted light or transmitted reflected light. After that, by analyzing the absorbance at all wavelengths or a specific wavelength, using a previously created analysis model, the presence or absence of virus infection such as HIV or prion infection is quantitatively or qualitatively detected. ⁇ 'How to judge.
  • the predetermined conditions are concentration change (including concentration dilution), repeated irradiation of light, extension of irradiation time, addition of electromagnetic force, change of optical path length, temperature, pH, pressure, mechanical vibration, and other conditions.
  • concentration change including concentration dilution
  • extension of irradiation time addition of electromagnetic force
  • change of optical path length temperature, pH, pressure, mechanical vibration, and other conditions.
  • the inspection / determination method as described in B) above which is a combination of a force or a combination of those that cause a physical or chemical change by the change in
  • H Used for HIV testing or prion testing.
  • Regression analysis such as PLS method using each value of perturbation such as concentration change value as objective variable.
  • Regression vector obtained by the analysis.
  • any one of the above B) to E) is characterized by predicting the presence or absence of infection or the duration of infection using a qualitative model created by performing classification analysis such as SIMCA method. Inspection / determination method described.
  • the specimen sample is blood (including plasma'serum), urine, other body fluids, tissues, tissue extracts, or a part of a living body such as ear, abdomen, nasal cavity, fingertips of limbs, etc.
  • the inspection 'determination method according to any one of A) to J) above.
  • N Spectral measurements are performed on the specimen sample while adding perturbations by adding predetermined conditions, and analysis is performed to extract the perturbation effect.
  • L Inspection 'diagnosis device described.
  • the predetermined conditions are concentration change (including concentration dilution), repeated irradiation of light, extension of irradiation time, addition of electromagnetic force, change of optical path length, temperature, pH, pressure, mechanical vibration, and other conditions.
  • concentration change including concentration dilution
  • extension of irradiation time addition of electromagnetic force
  • change of optical path length temperature, pH, pressure, mechanical vibration, and other conditions.
  • the inspection / diagnosis device according to N) above which is a combination of those that cause a physical or chemical change due to a change in the above.
  • L) ⁇ which is used for HIV screening or prion testing and predicts the presence or absence of infection or the duration of infection using a qualitative model created by classification analysis such as SIMCA method.
  • T) The examination / diagnosis device according to any one of the above L) to S), wherein the wavelength range of the light irradiated to the specimen sample is set to a range necessary for analysis using an analysis model. Place.
  • the specimen sample is blood (including plasma'serum), urine, other body fluids, tissues, tissue extracts, or a part of a living body such as ear, abdomen, nasal cavity, fingertips of limbs, etc.
  • the inspection / diagnosis device according to any one of L) to U) above.
  • the presence / absence of virus infection such as HIV and the presence / absence of prion infection can be easily and quickly examined and determined with high accuracy, and can be widely used for various virus tests and prion tests. it can. Because it is simple and rapid, it is useful when it is necessary to examine a large number of samples simultaneously. In addition, the target substance in the sample can be quantified with high accuracy.
  • the present invention can be used for various virus detections and prion tests using blood-derived samples such as plasma and serum. Application is also possible.
  • tissue tissue mass
  • tissue extracts tissue homogenates
  • living organisms such as ears, abdomen, nasal passages, and fingertips of limbs can be used. It is also possible to examine a part of the specimen without damaging the living body.
  • FIG. 1 is a block diagram showing a schematic configuration of an apparatus according to the present embodiment.
  • FIG. 2 is a diagram for explaining two spectroscopic methods, pre-spectroscopy and post-spectroscopy, which can be adopted in the above apparatus.
  • FIG. 3 is a diagram for explaining three detection methods that can be employed in the above-described apparatus, that is, reflected light detection, transmitted reflected light detection, and transmitted light detection.
  • FIG. 4 is a diagram for explaining a preferable spectrum measurement method and data analysis method in the present invention.
  • FIG. 5 is a diagram for explaining the course after HIV infection.
  • FIG. 6 is a graph showing Coomans Plots obtained by SIMCA analysis of each specimen sample diluted 10-fold in 13 specimens of HIV test.
  • FIG. 8 A graph showing the results of Factor Select in PLS regression analysis performed to create an analysis model for predicting the amount of HIV p24 in a sample.
  • FIG. 9 A graph summarizing the results of the above PLS regression analysis, showing the comparison between the measured value (horizontal axis) of p24 and the estimated value (vertical axis). 10] This is a graph showing the results of the PLS regression analysis described above and the total partial regression coefficient (regression vector) of the multiple regression equation created as a quantitative model.
  • FIG. 11 is a graph showing the results of Factor Select for specimen sample 1 (Samplel).
  • FIG. 12 Results of PLS regression analysis of sample sample 1 (Samplel), with sample dilution taken as X-axis, and the value predicted by the quantitative model obtained by this analysis Is plotted on the Y axis.
  • FIG. 13 is a graph showing the results of PLS regression analysis for sample 1 (Samplel), showing the total partial regression coefficient (regression vector) of the multiple regression equation created as a quantitative model.
  • FIG. 14 A graph comparing the regression vectors of Sample 1-5 (Sample No. 1-5) belonging to Class 1.
  • FIG. 15 A graph comparing the regression vectors of samples 7, 9, 10, 13 (Sample Nos. 7, 9, 10, 13) belonging to class 2.
  • FIG. 16 is a graph showing the comparison of regression vector scores of samples 6, 8, 11 1 and 12 (Sample Nos. 6, 8, 11 and 12) belonging to class 3.
  • FIG. 18 is a graph showing Discriminating Power (vertical axis) at each wavelength (horizontal axis) obtained as a result of performing the same SIMCA analysis as in FIG. 17 except for samples 12 and 13.
  • This graph shows Coomans Plots obtained by SIMCA analysis of near-infrared absorption spectra of brain tissue collected from wild-type mice, prion protein gene knockout mice, and prion-infected wild-type mice.
  • FIG. 23 Near-infrared absorption spectra were measured over time from the ears of chandler strain-inoculated mice, obihiro strain-inoculated mice, normal brain homogenate-inoculated mice, and PBS-inoculated mice, and 170 days after inoculation created by SIMCA analysis. It is a graph which shows Coomans Plot (Factor40) of the discrimination model of subsequent prion infection and non-infection.
  • FIG. 24 is a graph showing the prediction result by the above identification model obtained by measurement from the ear, and showing the percentage (%) at which prion-infected mice measured over time are diagnosed as prion-infected by the model. .
  • FIG. 25 is a graph showing discrimination power (Factor 40) for each wavelength of prion infection and non-infection in the above discrimination model obtained by measurement from the ear.
  • FIG.26 Near-infrared absorption spectra were measured over time from the abdomen of chandler strain inoculated mice, obihiro strain inoculated mice, normal brain homogenate inoculated mice, and PBS inoculated mice, and 170 days after inoculation prepared by SIMCA analysis. It is a graph which shows Coomans Plot (Factor60) of the discrimination model of subsequent prion infection and non-infection.
  • FIG. 27 is a graph showing a prediction result by the above identification model obtained by measurement from the abdomen and showing a percentage (%) at which prion-infected mice are diagnosed as prion infection by the model measured over time. .
  • FIG. 28 is a graph showing discrimination power (Factor 60) for each wavelength of prion infection and non-infection in the above discrimination model obtained by measurement from the abdomen.
  • this apparatus an apparatus for quantitatively or qualitatively examining and diagnosing the presence or absence of virus infection such as HIV or the presence of prion infection (hereinafter referred to as “this apparatus”). This will be described with reference to the drawings.
  • Inspection by this apparatus' Diagnosis employs the method of the present invention, that is, (a) wavelength light in the range of 400 nm to 250 Onm or a part of the wavelength is applied to a specimen sample derived from a subject or other animals. (B) After detecting the reflected light, transmitted light or transmitted / reflected light to obtain absorbance spectrum data, (C) Analytical model prepared in advance for the absorbance of all wavelengths or specific wavelengths measured in it. By using the analysis, the presence or absence of virus infection such as HIV or the presence or absence of prion infection is quantitatively or qualitatively determined.
  • the first feature of this device is that it makes simple and rapid and high-precision diagnosis of viral diseases and prion diseases. Prenatal diagnosis of prion diseases using blood samples and the like is also possible.
  • the range of the wavelength with which the specimen is irradiated is in the range of 400 nm to 2500 nm or a part thereof (for example, 600 to:! OOOnm). This wavelength range can be set as one or a plurality of wavelength ranges including wavelength light necessary for detection / determination by the analysis model after the analysis model is created.
  • a halogen lamp 'power that can use an LED or the like is not particularly limited.
  • the light emitted from the light source is applied to the specimen sample directly or via a light projecting means such as a fiber probe.
  • a pre-spectral method in which spectroscopy is performed by a spectroscope before irradiating the sample may be employed, or a post-spectroscopy method in which spectroscopy is performed after irradiation (see FIG. 2).
  • the pre-spectral method there are a method in which the light from the light source is simultaneously dispersed with a prism at once, and a method in which the wavelength is continuously changed by changing the slit interval of the diffraction grating.
  • the sample is irradiated with continuous wavelength light whose wavelength is continuously changed by decomposing light from the light source with a predetermined wavelength width.
  • light having a wavelength in the range of 600 to:! OOOnm is decomposed with a wavelength resolution of lnm, and the sample is irradiated with light having a wavelength continuously changed by lnm.
  • Reflected light, transmitted light, or transmitted / reflected light of the light applied to the sample is detected by the detector, and raw absorbance spectrum data is obtained.
  • the raw absorbance spectrum data may be used as is, but the analysis model may be used to make a judgment, but the peaks in the obtained spectrum may be decomposed into element peaks by spectroscopic or multivariate analysis techniques. It is preferable to perform a data conversion process, and use the absorbance spectrum data after conversion to perform verification and determination using an analysis model. Examples of spectroscopic techniques include second-order differential processing and Fourier transform, and examples of multivariate analysis techniques include wavelet transform and neural network method, but are not particularly limited. [0027] In the spectrum measurement by this apparatus, it is preferable to perturbation by adding a predetermined condition to the specimen sample, and this will be described later.
  • This device detects and diagnoses viral diseases or prion diseases by analyzing the absorbance at a specific wavelength or all measured wavelengths in the absorbance spectrum data obtained as described above using an analysis model. I do. In other words, an analysis model must be created in advance in order to perform final screening. However, this analysis model may be created at the time of spectrum measurement.
  • the spectrum data obtained at the time of measurement is divided into two for analysis model creation and for inspection and diagnosis, and for analysis model creation.
  • the analysis model obtained based on the data may be used for examination and diagnosis. For example, when testing a large number of specimens at the same time, a part of the specimen specimen is used for creating an analysis model. In this case, an analysis model is created at the time of measurement. With this method, an analysis model can be created without teacher data. Both quantitative and qualitative models can be handled.
  • SIMCA method performs principal component analysis for each of multiple groups (classes) and creates principal component models for each class. Then, the unknown sample is compared against the principal component model of each class, and the unknown sample is assigned to the class of the main component model that best matches.
  • classification analysis such as SIMCA method can be said to classify absorption spectra and regression vectors into each class by pattern recognition.
  • An analysis model assembled using such multivariate analysis software is saved as a file, and this file is called during inspection / diagnosis of an unknown sample, and quantification using the analysis model is performed on the unknown sample. Or qualitative inspection ⁇ Diagnosis. This enables simple and quick virus inspection and prion inspection.
  • the analysis model is preferably stored as a file with a plurality of analysis models such as quantitative models and qualitative models, and each model is updated as appropriate.
  • the wavelength light necessary for the inspection and diagnosis by the analysis model is determined.
  • the device configuration can be further simplified by irradiating the sample with one or more wavelength regions determined in this way.
  • perturbation refers to obtaining a plurality of different spectral data by causing a change in absorbance of a sample by setting and measuring a plurality of types and conditions for a certain condition.
  • Conditions include concentration change (including concentration dilution), repeated light irradiation, extended irradiation time, addition of electromagnetic force, optical path length change, temperature, pH, pressure, mechanical vibration, and other changes in the conditions. Any of the forces that bring about physical or chemical changes, or a combination thereof, can be mentioned: (1) relating to light irradiation and (2) relating to sample preparation-preparation Broadly divided. As for (1), repeated irradiation of light and (2) as an example of concentration dilution will be described below.
  • the repeated irradiation of light is a method of performing spectrum measurement of a sample specimen by giving a perturbation of multiple measurements by irradiating light continuously or at regular time intervals. is there. For example, by continuously irradiating light three times, the absorbance of the sample slightly changes (fluctuates), and multiple different spectral data can be obtained.
  • spectral data for multivariate analysis such as SIMCA method and PLS method, analysis accuracy can be improved, and highly accurate inspection and diagnosis are possible.
  • measurement is performed by irradiating light multiple times, but this is intended to produce an average value, which is different from “perturbation” here.
  • the HIV p2 4 amount of each sample is improved by performing regression analysis by the PLS method using the absorbance spectrum data obtained by such repeated irradiation three times. Quantification was possible.
  • the specimen sample was diluted 10-fold in 10 steps, but the number of dilutions and the degree of dilution were not particularly limited. Since it is only necessary that fluctuations occur in the spectrum acquired by perturbation due to concentration dilution, these values can be set arbitrarily.
  • the amount of HIV p24 present in the sample at a very low concentration could be quantified with high accuracy by the PLS method using a 10-fold diluted sample. Therefore, according to the method of the present invention, it is considered possible to quantify the target substance present in the sample at an extremely low concentration (pg / mL order). In addition, even when samples diluted about 10 5 times were used, each sample could be classified as infected / non-infected by SIMCA method without misclassification. Therefore, according to the method of the present invention, it is considered that the class can be identified even when the target substance is present in the sample at a very low concentration (femto g / mL order). As described above, according to the present invention, it is possible to realize inspection with extremely high accuracy.
  • data analysis to extract the perturbation effect is to create an analysis model using multiple spectral data obtained by perturbation for one sample, and to use that analysis model to create data. This refers to performing analysis, and specific examples of data analysis methods The following three methods can be cited (see Figure 4).
  • Quantitative analysis A method for quantifying HIV p24 and other target substances in a sample using a quantitative model created by regression analysis such as PLS
  • a quantitative model is created using multiple spectral data obtained by perturbation per sample. By quantifying the target substance in the sample, not only the presence or absence of virus infection or prion infection, but also the degree of infection, infection period (window period or AIDS period, etc.), severity, progression, etc. Can do.
  • a qualitative model is created using multiple spectral data obtained by perturbation per sample.
  • regression analysis is performed using multiple spectral data obtained by perturbation per sample.
  • the configuration of the inspection / diagnosis system of this device is as follows.
  • the probe 1 has a function of guiding light from a light source such as a halogen lamp (LED) (entire range of wavelength 400 nm to 2500 nm or a partial range thereof) to a sample to be measured.
  • a light source such as a halogen lamp (LED) (entire range of wavelength 400 nm to 2500 nm or a partial range thereof)
  • LED halogen lamp
  • a near-infrared spectrometer probe can be manufactured at low cost and is low in cost.
  • the light emitted from the light source may be directly projected onto the sample to be measured, but in this case, no probe is required, and the light source functions as the light projecting means.
  • wavelength light necessary for detection and diagnosis using the analysis model is determined.
  • This device can further simplify the device configuration by irradiating the sample with one or more wavelength regions determined in this way.
  • This apparatus has a configuration of a near-infrared spectrometer as a measurement system.
  • a near-infrared spectrometer irradiates a measurement object with light, and a detection unit detects reflected light, transmitted light, or transmitted reflected light from the object. Furthermore, the absorbance of the detected light with respect to incident light is measured for each wavelength.
  • the spectroscopic methods include pre-spectroscopy and post-spectroscopy (see Fig. 2). Pre-spectrometry is performed before projecting on the measurement object. Post-spectroscopy detects and separates light from the measurement object.
  • the separation / detection unit 2 of the present apparatus may employ either a pre-spectral or post-spectral spectroscopic method.
  • reflected light detection In the reflected light detection and the transmitted light detection, the reflected light and the transmitted light from the measurement object are detected by a detector, respectively.
  • transmitted / reflected light detection refracted light incident on the object to be measured is reflected inside the object, and light emitted outside the object again detects light that interferes with the reflected light.
  • the spectroscopic / detection unit 2 of this apparatus may adopt any detection method of reflected light detection, transmitted light detection, and transmitted reflected light detection.
  • the detector in the spectroscopic / detection unit 2 is a force that can be configured by, for example, a CCD (Charge Coupled Device) that is a semiconductor element. Of course, other light receiving elements that are not limited to this are used. May be.
  • the spectroscope can also be configured by known means. wear.
  • Absorbance for each wavelength that is, absorbance spectrum data is obtained from the spectroscopic detection unit 2. Based on this absorbance spectrum data, the data analysis unit 3 performs virus detection or prion detection using the analysis model created in advance as described above.
  • analysis model a plurality of analysis models such as a quantitative model and a qualitative model are prepared, and different models may be used depending on whether a quantitative evaluation or a qualitative evaluation is performed.
  • both analysis models for virus detection and prion detection can be created for the analysis model, and either one can be configured with a single device, or depending on the type of virus to be detected. Different analysis models can be created, and a single device can be used for multiple types of virus testing.
  • the data analysis unit 3 includes a storage unit that stores various data such as spectrum data, a multivariate analysis program, and an analysis model, and an arithmetic processing unit that performs arithmetic processing based on the data and the program. For example, it can be realized by an IC chip. Therefore, it is easy to reduce the size of the apparatus in order to make it portable.
  • the above analysis model is also written in a storage unit such as an IC chip.
  • the result display unit 4 displays the analysis result in the data analysis unit 3. Specifically, the concentration value of the target substance such as HIV p24 content in the sample obtained as a result of analysis using the analysis model is displayed. Alternatively, in the case of a qualitative model, the indications such as “infected”, “high possibility of infection”, “low possibility of infection”, “non-infection”, “window period”, “AIDS period”, etc. are displayed based on the classification result. If the device is portable, the result display unit 4 is preferably a flat display such as a liquid crystal display.
  • This device can be either (1) for virus detection, (2) for prion detection, (3) for both virus and prion detection, or for specific virus detection such as HIV (dedicated
  • a certain machine may be configured for multiple types of virus detection (general-purpose machines).
  • Viruses to be tested are not particularly restricted, but besides HIV, hepatitis C Viruses, hepatitis viruses such as hepatitis B virus, BDV (Borna disease virus), SARS coronavirus, adult T-cell leukemia virus, human parvovirus, enterovirus, adenovirus, Kokusaki group A and ⁇ group
  • hepatitis viruses such as hepatitis B virus, BDV (Borna disease virus), SARS coronavirus, adult T-cell leukemia virus, human parvovirus, enterovirus, adenovirus, Kokusaki group A and ⁇ group
  • Illustrate viruses that cause various viral diseases in humans or livestock such as viruses, echoviruses, simple henopeseuinoles, infureno enauinoles, noroinoles, mouth tainoles, poliovirus, measles virus, rubella virus, etc. Can do.
  • the present apparatus is preferably used for detection and diagnosis of such viral diseases, but the method and apparatus of the present invention is not limited to this.
  • the method of the present invention may be used for virus inspection of food and drink.
  • Prion screening includes Creutzfeldt 'Jakob's disease (CJD), bovine prion disease, bovine spongiform encephalopathy (BSE' mad cow's disease), Hidge, goat prion disease, Scrapie (Scr apie), chronic debilitating disease (CWD), which is a prion disease of force, and can be used for the inspection and diagnosis of prion diseases in humans or livestock.
  • CJD Creutzfeldt 'Jakob's disease
  • BSE' mad cow's disease bovine spongiform encephalopathy
  • Hidge goat prion disease
  • Scrapie Scrapie
  • Scr apie chronic debilitating disease
  • CWD chronic debilitating disease
  • the absorption spectrum of each sample was measured by the following measurement method.
  • a total of 13 samples including 5 normal donor plasmas and 8 HIV-infected plasma samples were diluted 10-fold with PBS buffer to 10 levels. 10-fold dilutions (diluted one not a 10-fold concentration 10 1 times to 10-1Q-fold) was used as a test sample.
  • the obtained absorption spectrum was analyzed by SIMCA method for each dilution.
  • the following is an analysis example of 10-fold dilution.
  • HIV p24j is the result of measuring the amount of p24 antigen
  • HIV PCRj is the result of investigating the presence or absence of HIV gene
  • Anti-HIV 1/2 is the result of examining the presence or absence of anti-HIV antibody
  • a detection value of less than Ipg / mL was negative (one), and based on these results, the above 13 specimens were classified into three classes 1 to 3 according to the following classification.
  • Class 1 HIV p24 (-), HIV PCR (-), Anti-HIV (-) (non-HIV infection)
  • Class 2 HIV p24 (+), HIV PCR (+), Anti—HIV (-)
  • Class 3 HIV p24 ( ⁇ ), HIV PCR (+), Ant HIV (-)
  • HIV antigen level CD4 positive T cell count
  • anti-HIV antibody level in patients' blood after HIV infection
  • class 3 is a group of specimens that can be detected only by PCR, high-sensitivity methods, which are very early in the window period (corresponding to the period when the amount of virus has not increased so much after infection). It is.
  • # of lncluded Samples is the number of samples (number of spectra) used in the analysis, and the number of samples 39 is three times consecutively for each sample sample diluted 10-fold. This means that the three absorbance data obtained from each irradiation were used.
  • Preprocessing indicates preprocessing
  • Autoscale indicates that a method of performing averaging after distributed scaling is used.
  • Power For “Scope”, the power “Local” with Global and Local was selected.
  • Maximum factors indicates the maximum number of Factors (principal components) to be analyzed, and the maximum number of factors that can be selected is selected.
  • Optimal Factors indicates the optimal number of Factors for creating the model of the analysis , "6,5,6" Classl is optimal up to Factor6, Class2 is up to Factor5 Optimal, Class3 up to Factor6 is optimal.
  • Probability thresholdj indicates the threshold value used to determine whether a device belongs to a certain class.
  • “Calibration transfer” indicates whether or not a mathematical adjustment is performed to alleviate the difference between devices.
  • Figure 6 shows the Coomans Plot obtained as a result of SIMCA analysis.
  • Table 2 shows the results of class distances and Table 3 shows the results of misclassifications.
  • Table 2 refers to CS 1, CS2, CS3f, Class 1, Class 2, and Class 3, respectively (the same shall apply hereinafter).
  • CS 1 @ 6 means that 6 factors (principal components) are used in class 1, and the number after @ indicates the number of factors used. If the class distance is “3” or more, it can be considered that the classes are distinguished.
  • FIG. 7 is a graph summarizing the results with respect to the interclass distance.
  • “1” to “10” indicate the results from 101-fold dilution to io 1- Q dilution. Even in the case of io 1Q dilution, it was possible to distinguish between classes by the obtained analysis model. From this, it is considered that this method has higher accuracy than conventional HIV detection 'diagnosis' and can be diagnosed with a smaller amount of sample.
  • this method has higher accuracy than conventional HIV detection 'diagnosis' and can be diagnosed with a smaller amount of sample.
  • the result of misclassification, etc. create an analysis model with relatively good accuracy when dilution is 10 to 10 5 times (concentration from 10 to 1 to 10 to 5 ). I was able to.
  • the sample number 12 was obtained by three consecutive irradiations for each of the above four samples diluted 10 times.
  • Figure 8 shows the results of Factor Select, where the horizontal axis shows the number of Factors used and the vertical axis shows SEV.
  • Figures 9 and 10 show the results of the analysis.
  • Figure 9 shows the quantitative model obtained by this analysis for the value of the objective variable (ie, HIV p24 level [pg / mL]) on the X axis. The value predicted by is plotted on the Y axis.
  • the objective variable ie, HIV p24 level [pg / mL]
  • the value predicted by is plotted on the Y axis.
  • “10_1_3” indicates the data of the third irradiation of the sample 10 diluted to the first power of 10 with PBS (the same applies hereinafter).
  • Figure 10 shows the partial regression coefficient (Regression Vector) of the multiple regression equation created as a quantitative model.
  • the horizontal axis indicates the wavelength, and the vertical axis indicates the coefficient value.
  • the wavelength used is 600nm to lOOOnm, and the wavelength resolution is lnm.
  • the HIV p24 amount [pg / mL] of each sample could be predicted with high accuracy.
  • the analysis model assembled in this way is saved as a file, and this file is called at the time of examination and diagnosis of an unknown sample, and the HIV p24 amount [pg / mL] of the unknown sample is predicted by the analysis model. This will enable simple and rapid testing and diagnosis of HIV infection.
  • a Sampnore number of 30 means that the three absorbance data obtained by three consecutive irradiations were used for each specimen sample diluted 115 times with lC ⁇ -lO.
  • the meaning of each item is as described above.
  • Figure 11 shows the results of Factor Select for Specimen Sample 1 (Samplel).
  • the horizontal axis represents the number of Factors used, and the vertical axis represents SEV (Standard Error of Cross-Validation). ).
  • PLS regression was performed by selecting the factor number 6 (in this case, the correlation coefficient r is 0.9520) that minimizes SEV by this Factor Select.
  • Figures 12 and 13 show the results of the analysis.
  • Figure 12 shows the value of the value of the objective variable (ie dilution) on the X-axis and the value axis predicted by the quantitative model obtained by this analysis.
  • Is plotted in FIG. 13 shows the total partial regression coefficient (Regression Vector) of the multiple regression equation created as a quantitative model.
  • the horizontal axis indicates the wavelength, and the vertical axis indicates the coefficient value.
  • the wavelength used is 600nm to lOOOnm, and the wavelength resolution is lnm.
  • Figures 14 to 16 show the comparison of the regression vectors of the samples obtained as a result of each class.
  • Figure 14 shows samples 1-5 (Sample No. 1-5) belonging to class 1
  • Fig. 15 shows samples 7, 9, 10, 13 (Sample No. 7, 9, 10, 13) belonging to class 2
  • Fig. 16 shows samples 6, 8, 11, 12 (Sample No. 6, 8, 11 and 12) are compared and shown.
  • the regression vector obtained by the analysis is stored as a reference database, the regression vector of the unknown sample is compared with the stored regression vector, and the regression vector is compared with the regression vector of the healthy person and the HIV-infected person.
  • pattern recognition such as SIMCA
  • FIG. 17 shows the discriminating at each wavelength (horizontal axis) obtained as a result of the SIMCA analysis.
  • Discriminating Power discriminatory power
  • the wavelength power S of the sharp peak with high Discriminating Power is considered to be one of the effective wavelengths for discrimination of plasma between healthy and HIV-infected persons. Therefore, it is possible to easily and quickly diagnose the presence or absence of HIV infection by making a discrimination by paying attention to the wavelength obtained by the SIMCA analysis.
  • FIG. 18 shows the Discriminating Power (longitudinal drive) at each wavelength (horizontal axis) obtained as a result of the above SIMCA analysis excluding the samples 12 and 13.
  • This sharp peak wavelength with high discriminating power is considered to be one of the effective wavelengths for distinguishing plasma between healthy and HIV-infected individuals. Therefore, it is possible to easily and quickly diagnose the presence or absence of HIV infection by focusing on the wavelength obtained by such SIMCA analysis.
  • the first analysis is performed using one of the three absorbance data obtained by three consecutive irradiations, two combinations of data, or all three data.
  • SIMCA analysis was performed using the same algorithm as the method. For the analysis, 10-fold diluted samples were used.
  • FIG. 19 is a graph summarizing the above analysis results with respect to the distance between classes (Interclass Distance).
  • “1” is only used for the first irradiation data
  • “2” and “3” are 2 respectively.
  • “1 2” uses the data for the first and second irradiations
  • “2-3” uses the data for the second and third irradiations.
  • “3 1” is used, the data of the first and third irradiations are used, and “1_2_3” is when all the data of the first to third irradiations are used.
  • the absorption spectrum of each sample was measured by the following measurement method.
  • Each brain tissue, brain homogenate and blood of wild type mouse (WT mouse), prion protein gene knockout mouse (Rikn PrP-/-mouse), and prion-infected wild type mouse (Prion-infected WT mouse) were used as specimen samples.
  • Prion is Obihiro strain and is derived from scrapie.
  • the blood used was the collected blood ⁇ ⁇ / i L dissolved in lmLPBS.
  • As the brain tissue half of the brain tissue was used as a sample.
  • As the brain homogenate 10% brain homogenate dissolved in 20 / i LPBS was further dissolved in lmL PBS.
  • FIG. 20 to 22 show the Coomans Plot obtained as a result of this SIMCA analysis.
  • Figure 20 shows the results of blood samples, and
  • Figures 21 and 22 show the results of using brain tissue and brain homogenate as samples, respectively.
  • the analysis model assembled in this way is saved as a file, and this file is called at the time of diagnosis of 'unknown sample' diagnosis, and the analysis model predicts which class the unknown sample is classified into. This enables simple and quick detection and diagnosis of prion infection.
  • this method can use blood as a sample, it can be applied to prenatal diagnosis. In addition, a large number of samples can be analyzed with high accuracy by making this measurement online.
  • mice inoculated with chandler strain scrapie-infected brain homogenate and C57BL6 mice inoculated with obihiro strain scrapie-infected brain homogenate were used as prion-infected mice.
  • mice inoculated with normal brain homogenate in the brain and mice inoculated with PBS in the brain were used. These mice were observed for the onset of prion disease using various symptoms such as shaking, abnormal footing, whether or not to get up from the back, and various symptoms, and in about 170 days after inoculation with chandler strain scrapie. Mice appeared, and all of them developed in about 180 days.
  • mice inoculated with obihiro strain scrapie a mouse that developed about 200 days after inoculation appeared, and all mice developed about 210 days. In contrast, none of the normal brain homogenate-inoculated mice and PBS-inoculated mice developed.
  • SIMCA analysis was performed on the spectrum data obtained by the above measurement using the same algorithm as the first analysis method.
  • a model to distinguish between prion infection and non-infection after 170 days after inoculation was created and a Coomans plot was confirmed.
  • a group of chandler and obihiro strain prion-infected mice and normal brain homogenate were inoculated.
  • FIG. 25 shows the discrimination power for each wavelength of prion infection and non-infection in the discrimination model obtained by measurement from the ear. Interestingly, peaks were observed at wavelengths related to oxyhemoglobin (HbO) and deoxyhemoglobin (deoxy-Hb) (700, 730, 750 nm). As a result of the analysis, it was found that prion-inoculated mice had lower oxyhemoglobin concentrations and higher deoxyhemoglobin concentrations than control mice. From these results, it is considered that the identification model discriminates between prion infection and non-infection based on spectrum data reflecting such in vivo differences.
  • HbO oxyhemoglobin
  • deoxy-Hb deoxyhemoglobin
  • FIG. 28 shows the discrimination power for each wavelength of prion infection and non-infection in the discrimination model obtained by measurement from the abdomen. Interestingly, there was a peak at the wavelength (780 nm) associated with the reduction of copper containing cytochrome C oxidase.
  • a virus infection such as HIV
  • the presence or absence of prion infection such as a virus infection test or a diagnosis of prion disease. It can be widely used.

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Abstract

本発明は、波長４００ｎｍ～２５００ｎｍの範囲またはその一部範囲の波長光を被検者その他動物由来の検体試料に照射し、その反射光、透過光または透過反射光を検出して吸光度スペクトルデータを得た後、その中の測定全波長あるいは特定波長の吸光度を、予め作成した解析モデルを用いて解析することによってＨＩＶ等のウイルス感染の有無、又はプリオン感染の有無を定量的または定性的に検査・判定する方法および装置である。解析モデルは、例えば摂動を与えながらスペクトル測定を行うと共に、その摂動効果を引き出すような多変量解析を行うことによって作成される。

Description

明 細 書
HIV等のウィルス感染の有無、又はプリオン感染の有無を近赤外線分光 法により検査 '判定する方法、及び同方法に使用する装置
技術分野
[0001] 本発明は、 HIV等のウィルス感染の有無、又はプリオン感染の有無を近赤外線分 光法により検査 ·判定する方法、及び同方法に使用する装置に関するものである。 背景技術
[0002] 現在、 HIV (ヒト免疫不全ウィルス）、 HCV (C型肝炎ウィルス）等のウィルス感染検 查は、主として、 （l) PCR法によるウィルス DNAの検出、または、（2) ELISA法（酵 素免疫測定法)等による抗ウィルス抗体もしくはウィルス抗原の検出、を指標に行わ れている。例えば、 HIV感染検査の場合には、 HIVの p24抗原の有無を ELISA法 やウェスタンプロット法などによって検出する方法が採用されている（後記の非特許 文献 1参照）。
[0003] しかし、上記方法は、煩雑な処理を必要とし、時間も力かる方法である。このため、 簡易かつ迅速なウィルス感染の検查 ·診断法が求められている。
[0004] 一方、プリオン感染の検查およびプリオン病の診断には、抗プリオン蛋白質抗体を 用いた ELISA法やウェスタンプロット法もしくは免疫組織化学的方法による異常型 プリオン蛋白質 (PrPSe)の検出が主に用いられ、研究においては動物接種によるバイ オアッセィも用いられている（後記の非特許文献 2参照）。しかし、これらの方法は、す ベて死後検査である。また、煩雑な処理を必要とし、時間も力かる方法である。このた め、プリオンの検出においても、簡易かつ迅速な生前検査 '診断法が求められている
[0005] ところで最近では、種々の分野で近赤外線を用いた成分分析が行われている。例 えば、可視光及び/又は近赤外線を試料に照射して、特定成分に吸収される波長 帯を検出することで、前記特定成分を定量分析することが行われている。
[0006] これは、例えば石英セル中に試料を注入し、これに近赤外分光器 (例えば、ニレコ 社製近赤外分光器 NIRSystem6500)を用いて、 400nm〜2500nmの波長範囲の可 視光及び/又は近赤外線を照射して、その透過光、反射光、又は透過反射光を分 析することで行う。
[0007] 一般に、近赤外線は、物質の吸光係数が非常に小さく散乱を受け難ぐエネルギ 一の低い電磁波であるので、試料にダメージを与えることなく化学的 ·物理的情報を 得ること力 Sできる。
[0008] そのために、試料からの透過光等を検出して、試料の吸光度データを求めて、得ら れた吸光度データを多変量解析することで、直ちに試料の情報を得ることができ、例 えば生体分子の構造や機能の変化の過程を直接的にまたリアルタイムに捉えること ができる。
[0009] このような近赤外線分光法に関する従来技術として、下記の特許文献 1 · 2記載のも のが挙げられる。特許文献 1には、可視—近赤外線を用いて被検体から情報を得る 方法、具体的には、未知の被検体が属する群を判別する方法、未知の被検体を同 定する方法、及び被検体における経時変化をリアルタイムでモニターする方法が開 示されている。近赤外線分光法によるウィルス検出やプリオン検出については当該 文献に開示されていない。
[0010] 特許文献 2には、可視光及び/又は近赤外線領域における水分子の吸収バンドを 用いて、得られた吸光度データを多変量解析することで、牛乳または乳房中の体細 胞を測定して牛の乳房炎の診断を行う方法が開示されている。
[0011] また、特許文献 3には、動物およびヒトの組織における伝達性海綿状脳症 (TSE) に誘導された変化を該組織の赤外線スペクトルを測定することによって診断する方法 が開示されている。この方法も死後の病理組織片を検査対象とするものであり、死後 検查である。
[0012] 非特許文献 1： Valdiserri RO, Holtgrave DR, West GR. Promoting early HIV diagnosi s and entry into care. AIDS. 1999 13(17):2317— 30.
非特許文献 2 : Aguzzi A, Heikenwalder M, Miele G. Progress and problems in the bi ology, diagnostics, and therapeutics of prion diseases. J Clin Invest. 2004 丄丄 4(2): 15 3-60.
特許文献 1 :特開 2002— 5827号公報 (第 1—9頁、第 1図） 特許文献 2 :国際公開 WO01/75420号公報 (第 1— 5頁、第 1図） 特許文献 3：特表 2003— 500648号公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0013] 前述のように、 HIV検査、 HCV検査等のウィルス感染症診断において、簡易、迅 速かつ高精度な検査 ·診断法が求められている。特に、大量の検体を一斉に検査す る必要がある場合などには、このような簡易迅速な検査法開発の要請が高い。例え ば、献血血液のウィルス検査においては、大量の検体について、 HIV、 HBV、 HCV 等のウィルスの有無を簡易迅速かつ安価に検査する方法の開発が望まれている。先 進国、特に日本では、献血血液のウィルス検查は現在、主に抗体検查により行われ ている。一方、開発途上国では、一部の地域でしカ^ィルス検査が行われておらず、 また、献血血液のうち一部しか検査が行われていない。
[0014] そこで、本発明は、近赤外線分光法を使用して、被検体における HIV等のウィルス 感染の有無を定量的または定性的に、簡易、迅速かつ高精度に検查 ·判定するため の新規な方法および装置を提供することをその課題とする。
[0015] 同様に、プリオンの検出およびプリオン病の診断においても、簡易、迅速かつ死後 検査によらない生前検査 ·診断法が求められている。特に、牛海綿状脳症 (狂牛病） ゃスクレイピー（Scrapie)など家畜のプリオン病検查において、大量の検体を一斉に 検査する必要がある場合などには、このような簡易迅速な検査法開発の要請が高い 。また最近、英国で輸血による変異型 CJD感染を示す症例が 2例報告され、社会問 題になっている。ヒッジを用いた実験でも血液を介した伝播が示されたため、現在、 輸血による CJD感染の可能性が危惧されている。そのため、血液から簡易迅速にプ リオン検査する方法が必要とされてレ、る。
[0016] そこで、本発明はさらに、近赤外線分光法を使用して、被検体におけるプリオン感 染の有無を定量的または定性的に、簡易、迅速かつ高精度に検査 '判定するための 新規な方法および装置を提供することをその課題とするものである。
課題を解決するための手段
[0017] 本発明者は、上記の課題に鑑み鋭意研究を進めた結果、近赤外線分光法によつ て HIV等のウィルス感染およびプリオン感染の検査 ·診断が可能であること、特に、 可視光—近赤外線 (VIS— NIR)スペクトルの測定方法、および、得られたスぺクトノレ データの解析方法を工夫して解析モデルを作成することにより、当該解析モデルを 用いた良好な検查 ·診断が可能であること、等を見出し、本発明を完成させるに至つ た。
即ち、本発明は、医療上及び産業上有用な発明として、以下の発明を包含するも のである。
A) 波長 400nm〜2500nmの範囲またはその一部範囲の波長光を被検者その 他動物由来の検体試料に照射し、その反射光、透過光または透過反射光を検出し て吸光度スペクトルデータを得た後、その中の測定全波長あるいは特定波長の吸光 度を、予め作成した解析モデルを用いて解析することによって HIV等のウィルス感染 の有無、又はプリオン感染の有無を定量的または定性的に検查'判定する方法。
B) 前記検体試料に対し、所定の条件を付加することで摂動を与えながらスぺタト ル測定を行うと共に、その摂動効果を引き出すような解析を行うことを特徴とする上記 A)記載の検査 '判定方法。
C) 前記所定の条件が、濃度変更 (濃度希釈を含む）、光の繰り返し照射、照射時 間の延長、電磁力付加、光路長変更、温度、 pH、圧力、機械的振動、その他その条 件の変更によって物理的または化学的な変化をもたらすもののいずれ力、または、そ れらの組み合わせであることを特徴とする上記 B)記載の検査 ·判定方法。
D) 光を 3回繰り返し照射し、得られた 3回の吸光度スペクトルデータのうち少なくと も 2回の吸光度スペクトルデータを使用して多変量解析を行うことを特徴とする上記 C )記載の検査 '判定方法。
E) 1つの試料を複数に濃度希釈してそれぞれスペクトル測定を行レ、、得られたス ぺクトルデータを使用して多変量解析を行うことを特徴とする上記 C)記載の検査-判 定方法。
F) HIV検查またはプリオン検査に用いられ、 PLS法などの回帰分析により作成し た定量モデルを用いて、 HIV p24量など試料中の目的物質を定量することを特徴と する上記 A)〜E)のいずれかに記載の検查 '判定方法。 G) HIV検査またはプリオン検査に用いられ、 SIMCA法などのクラス判別解析に より作成した定性モデルを用いて、感染の有無、あるいはさらに感染期間などを予測 することを特徴とする上記 A)〜E)のいずれかに記載の検査 ·判定方法。
H) HIV検查またはプリオン検査に用いられ、（1)濃度変更値など摂動の各値を 目的変量とする PLS法などの回帰分析を行い、 （2)同分析により得られた回帰べタト ルに対して、 SIMCA法などのクラス判別解析を行うことで作成した定性モデルを用 いて、感染の有無、あるいはさらに感染期間などを予測することを特徴とする上記 B) 〜E)のいずれかに記載の検查 ·判定方法。
I) 前記検体試料に照射される光の波長域が、解析モデルによる解析に必要な範 囲に設定されていることを特徴とする上記 A)〜H)のいずれかに記載の検查 '判定 方法。
J) 前記検体試料に照射される光の波長域が、 600nm〜： !OOOnmの範囲に設定 されていることを特徴とする上記 I)記載の検査 ·判定方法。
K) 前記検体試料が、血液（血漿'血清を含む）、尿、その他の体液、組織、組織 抽出液、または、耳、腹、鼻腔、手足の指先など生体の一部であることを特徴とする 上記 A)〜J)のいずれかに記載の検査 '判定方法。
L) 波長 400nm〜2500nmの範囲またはその一部範囲の波長光を被検者その 他動物由来の検体試料に照射する投光手段と、
投光前又は投光後に分光する分光手段、および、前記試料に照射された光の反 射光、透過光または透過反射光を検出する検出手段と、
検出により得られた吸光度スペクトルデータの中の測定全波長あるいは特定波長 の吸光度を、予め作成した解析モデルを用いて解析することによって HIV等のウイ ルス感染の有無、又はプリオン感染の有無を定量的または定性的に分析するデータ 解析手段と、を備えたことを特徴とする検査 ·診断装置。
M) さらに、分析の結果を表示する表示手段を備えたことを特徴とする上記 L)記 載の検査 '診断装置。
N) 前記検体試料に対し、所定の条件を付加することで摂動を与えながらスぺタト ル測定を行うと共に、その摂動効果を引き出すような解析を行うことを特徴とする上記 L)記載の検査'診断装置。
O) 前記所定の条件が、濃度変更 (濃度希釈を含む)、光の繰り返し照射、照射時 間の延長、電磁力付加、光路長変更、温度、 pH、圧力、機械的振動、その他その条 件の変更によって物理的または化学的な変化をもたらすもののいずれカ または、そ れらの組み合わせであることを特徴とする上記 N)記載の検查 ·診断装置。
P) 光を 3回繰り返し照射し、得られた 3回の吸光度スペクトルデータのうち少なくと も 2回の吸光度スペクトルデータを使用して多変量解析を行うことを特徴とする上記〇 )記載の検査 '診断装置。
Q) HIV検查またはプリオン検査に用いられ、 PLS法などの回帰分析により作成し た定量モデルを用いて、 HIV p24量など試料中の目的物質を定量することを特徴と する上記 L)〜P)のレ、ずれかに記載の検查'診断装置。
R) HIV検查またはプリオン検査に用いられ、 SIMCA法などのクラス判別解析に より作成した定性モデルを用いて、感染の有無、あるいはさらに感染期間などを予測 することを特徴とする上記 L)〜P)のいずれかに記載の検査 ·診断装置。
S) HIV検査またはプリオン検査に用いられ、（1)濃度変更値など摂動の各値を 目的変量とする PLS法などの回帰分析を行い、 （2)同分析により得られた回帰べタト ルに対して、 SIMCA法などのクラス判別解析を行うことで作成した定性モデルを用 いて、感染の有無、あるいはさらに感染期間などを予測することを特徴とする上記 N) 〜P)のいずれかに記載の検査 '診断装置。
T) 前記検体試料に照射される光の波長域が、解析モデルによる解析に必要な範 囲に設定されていることを特徴とする上記 L)〜S)のいずれかに記載の検査 ·診断装 置。
U) 前記検体試料に照射される光の波長域が、 600nm〜： !OOOnmの範囲に設定 されていることを特徴とする上記 T)記載の検査 ·診断装置。
V) 前記検体試料が、血液 (血漿'血清を含む）、尿、その他の体液、組織、組織 抽出液、または、耳、腹、鼻腔、手足の指先など生体の一部であることを特徴とする 上記 L)〜U)のいずれかに記載の検查 ·診断装置。
発明の効果 [0019] 本発明によれば、 HIV等のウィルス感染の有無、プリオン感染の有無を簡易迅速 かつ高精度に検査 ·判定することができ、各種ウィルス検査やプリオン検査に広く利 用すること力 Sできる。簡易迅速であるため、大量の検体を一斉に検査する必要がある 場合などに有用である。また、試料中の目的物質を高精度に定量することができる。
[0020] 本発明は、血漿 '血清など血液由来の試料を使用して、各種ウィルス検查、プリオ ン検査が可能であるので、簡易迅速であることに加えて、プリオン病の生前診断への 応用も可能である。
[0021] 試料には、血液のほか、尿その他の体液、組織 (組織塊）、組織抽出液 (組織ホモ ジネート)も利用可能であり、そのほか、耳や腹、鼻腔、手足の指先など生体の一部 を検体として、生体を傷つけることなく検查することも可能である。
図面の簡単な説明
[0022] [図 1]本実施形態に係る装置の概略的構成を示すブロック図である。
[図 2]上記装置において採用可能な前分光および後分光の 2つの分光方式を説明 する図である。
[図 3]上記装置において採用可能な反射光検出、透過反射光検出、および透過光 検出の 3つの検出方式を説明する図である。
[図 4]本発明における好適なスペクトル測定方法、およびデータ解析方法について説 明する図である。
[図 5]HIV感染後の経過を説明する図である。
[図 6]13検体の HIV検查において、 10倍希釈した各検体試料の SIMCA解析により 得られた Coomans Plotを示すグラフである。
[図 7]13検体の HIV検查において、各検体試料を 101倍希釈から 101Q倍希釈まで濃 度希釈し、各濃度希釈における SIMCA解析の結果をクラス間距離 (Interclass Dista nce)についてまとめたグラフである。
[図 8]試料中の HIV p24量を予測する解析モデル作成のため行った PLS回帰分析 において、 Factor Selectの結果を示すグラフである。
[図 9]上記 PLS回帰分析の結果をまとめたグラフであり、 p24量の実測値 (横軸）と推 定値 (縦軸）とが比較して示される。 園 10]上記 PLS回帰分析を行った結果であり、定量モデルとして作成した重回帰式 の全偏回帰係数（回帰ベクトル）を示すグラフである。
[図 11]検体試料 1 (Samplel)について、 Factor Selectの結果を示すグラフである。
[図 12]検体試料 1 (Samplel)について PLS回帰分析を行った結果であり、試料の希 釈度を X軸とし、その値にっレ、て本分析により得られた定量モデルで予測した値が Y 軸にプロットされる。
[図 13]検体試料 1 (Samplel)について PLS回帰分析を行った結果であり、定量モデ ルとして作成した重回帰式の全偏回帰係数（回帰ベクトル）を示すグラフである。
[図 14]クラス 1に属する試料 1― 5 (Sample No.1-5)の各回帰ベクトルを比較して示す グラフである。
[図 15]クラス 2に属する試料 7, 9, 10， 13 (Sample No.7， 9， 10, 13)の各回帰ベクトル を比較して示すグラフである。
[図 16]クラス 3に属する試料 6, 8, 1 1 , 12 (Sample No.6, 8， 11, 12)の各回帰べクトノレ を比較して示すグラフである。
[図 17]上記回帰べクトノレをスペクトルと見立てて SIMCA解析を行った結果得られた
、各波長（横軸）における Discriminating Power (縦軸）を示すグラフである。
[図 18]試料 12, 13を除いて図 17と同様の SIMCA解析を行った結果得られた、各 波長（横軸）における Discriminating Power (縦軸）を示すグラフである。
[図 19]3回連続照射にて各々得られた 3つの吸光度データのうちの 1つのデータ、又 は 2つ以上のデータを使用して SIMCA解析を行った結果をクラス間距離についてま とめたグラフである。
園 20]野生型マウス、プリオン蛋白質遺伝子ノックアウトマウスおよびプリオン感染野 生型マウスから採取した血液の近赤外吸収スペクトルを測定し、 SIMCA解析により 得られた Coomans Plotを示すグラフである。
園 21]野生型マウス、プリオン蛋白質遺伝子ノックアウトマウスおよびプリオン感染野 生型マウスから採取した脳組織の近赤外吸収スペクトルを測定し、 SIMCA解析によ り得られた Coomans Plotを示すグラフである。
園 22]野生型マウス、プリオン蛋白質遺伝子ノックアウトマウスおよびプリオン感染野 生型マウスから調製した脳ホモジネートの近赤外吸収スペクトルを測定し、 SIMCA 解析により得られた Coomans Plotを示すグラフである。
[図 23]chandler株接種マウス、 obihiro株接種マウス、正常脳ホモジネート接種マウス、 および PBS接種マウスの耳からそれぞれ経時的に近赤外吸収スペクトルを測定し、 SIMCA解析により作成された接種後 170日以降のプリオン感染と非感染の識別モ デルの Coomans Plot (Factor40)を示すグラフである。
[図 24]耳からの測定で得られた上記識別モデルによる予測結果であり、経時的に測 定されたプリオン感染マウスが当該モデルによりプリオン感染と診断される割合（％) を示すグラフである。
[図 25]耳からの測定で得られた上記識別モデルにおいて、プリオン感染と非感染の 波長ごとの識別力（Factor40)を示すグラフである。
[図 26]chandler株接種マウス、 obihiro株接種マウス、正常脳ホモジネート接種マウス、 および PBS接種マウスの腹からそれぞれ経時的に近赤外吸収スペクトルを測定し、 SIMCA解析により作成された接種後 170日以降のプリオン感染と非感染の識別モ デルの Coomans Plot (Factor60)を示すグラフである。
[図 27]腹からの測定で得られた上記識別モデルによる予測結果であり、経時的に測 定されたプリオン感染マウスが当該モデルによりプリオン感染と診断される割合（％) を示すグラフである。
[図 28]腹からの測定で得られた上記識別モデルにぉレ、て、プリオン感染と非感染の 波長ごとの識別力（Factor60)を示すグラフである。
発明を実施するための最良の形態
以下では、本発明の実施の一形態として、 HIV等のウィルス感染の有無、又はプリ オン感染の有無を定量的または定性的に検査 ·診断する装置 (以下、「本装置」とい う。）について、図面を参照しながら説明する。
〔1〕本装置による VIS— NIRスペクトル測定とデータの解析方法
[1. 1]VIS— NIRスペクトル測定の概略
本装置による検査 '診断は、本発明の方法を採用し、即ち、（a)波長 400nm〜250 Onmの範囲またはその一部範囲の波長光を被検者その他動物由来の検体試料に 照射し、 （b)その反射光、透過光または透過反射光を検出して吸光度スペクトルデー タを得た後、（C)その中の測定全波長あるいは特定波長の吸光度を、予め作成した 解析モデルを用いて解析することによって HIV等のウィルス感染の有無、又はプリォ ン感染の有無を定量的または定性的に検查 '判定する。
[0024] 本装置の第 1の特徴点は、簡易迅速かつ高精度にウィルス病診断、プリオン病診 断を行う点にあり、血液試料などを使用したプリオン病の生前診断も可能である。検 体試料に照射する波長の範囲は、 400nm〜2500nmの範囲またはその一部の範 囲（例えば 600〜： !OOOnm)である。この波長の範囲は、解析モデルを作成した後、 この解析モデルによる検查 ·判定に必要な波長光を含む、 1又は複数の波長域として 設定することができる。
[0025] 光源としては、ハロゲンランプ 'LED等を使用できる力 特に限定されるものではな レ、。光源から発せられた光は、直接またはファイバープローブ等の投光手段を介して 検体試料に照射される。後述のように、試料に照射する前に分光器によって分光す る前分光方式を採用してもよいし、照射後に分光する後分光方式を採用してもよい（ 図 2参照）。前分光方式の場合は、光源からの光をプリズムで一度に同時に分光する 方法と、回折格子のスリット間隔を変化させることにより連続的に波長を変化させる方 法とがある。後者の方法の場合には、光源からの光を所定の波長幅で分解すること によって、連続的に波長を変化させた連続波長光が試料に照射される。後述の実施 例では、 600〜： !OOOnmの範囲の波長光を波長分解能 lnmで分解し、波長を lnm ずつ連続的に変化させた光を試料に照射している。
[0026] 試料に照射された光の反射光、透過光または透過反射光が検出器により検出され 、生の吸光度スペクトルデータが得られる。生の吸光度スペクトルデータをそのまま使 用して解析モデルによる検查 '判定を行ってもよいが、得られたスペクトル中のピーク を分光学的手法あるいは多変量解析手法により要素ピークに分解するなどのデータ 変換処理を行い、変換後の吸光度スペクトルデータを使用して解析モデルによる検 查-判定を行うことが好ましい。分光学的手法としては、例えば、 2次微分処理やフー リエ変換があり、多変量解析手法としてはゥヱブレット変換、ニューラルネットワーク法 等が例示されるが、特に限定されるものではない。 [0027] なお、本装置によるスペクトル測定においては、検体試料に対し、所定の条件を付 加することで摂動（perturbation)を与えることが好ましレ、が、これにつレ、ては後述する
[0028] [1. 2]データの解析方法 (解析モデルの作成）
本装置は、上述のようにして得られた吸光度スペクトルデータの中の特定波長ほ たは測定全波長）の吸光度を解析モデルで解析することによって、ウィルス疾患ある いはプリオン病の検查 ·診断を行う。つまり、最終的な検查'診断を行うには、解析モ デルが予め作成されていることを要する。もっとも、この解析モデルはスペクトル測定 時にあわせて作成することとしてもよい。
[0029] すなわち、解析モデルは測定前に予め作成しておくことが望ましいが、測定時に取 得するスぺクトノレデータを解析モデル作成用と検查 ·診断用とに 2分割し、解析モデ ル作成用データをもとに得られた解析モデルを使用して検查 '診断を行ってもよい。 例えば、大量の検体を一斉に検査する場合、検体試料の一部を解析モデル作成用 とする。この場合は、測定時に解析モデルを作成することになる。この手法では教師 データが無くても解析モデルを作成できる。定量および定性モデルの両方に対応可 能である。
[0030] 解析モデルは多変量解析によって作成可能である。例えば、 HIV検査のため試料 中の HIV p24量 (濃度）を予測する場合、スペクトル測定により取得した全波長の吸 収スペクトルを格納するデータ行列を特異値分解によりスコアとローデイングとに分解 し、試料中の p24量の変動を要約する主成分を抽出する（主成分分析)。これにより、 共線性（=説明変量間の相関が高いこと）の少ない独立な成分を重回帰分析に使用 できるようになる。そして説明変量をスコア、 目的変量を p24量とする重回帰分析を適 用する。これにより、測定全波長あるいは特定波長の吸収スペクトルから HIV p24量 を推定する解析モデルを作成できる。これら一連の作業（多変量解析）は主成分回 市法 (Pし R: Principal component Regression) fcoレヽ f PLS (Partial Least squares) 回帰法として確立されている (参考文献:尾崎幸洋、宇田明史、赤井俊男「化学者の ための多変量解析一ケモメトリックス入門」、講談社、 2002年)。回帰分析法としてはこ のほかに CLS (Classical Least Squares)法、クロスバリデーシヨン法などが挙げられる [0031] 上記方法は定量的解析モデル作成の場合であつたが、定性的解析モデルの作成 には、クラス判別用の主成分分析法（PCA : Principal Component Analysis) , SIMC Α法 (soft independent modeling of class analogy)、 KNN法 (k nearest neighbors)等 の多変量解析を適用することができる。 SIMCA法は、複数のグループ (クラス）につ いてそれぞれ主成分分析を行い、各クラスの主成分モデルを作成する。そして、未知 試料が各クラスの主成分モデルに対して比べられ、その未知試料が一番適合する主 成分モデルのクラスに割り当てられる。また、 SIMCA法などのクラス判別解析は、パ ターン認識により吸収スペクトルや回帰ベクトルを各クラスに分類する方法ということ ができる。
[0032] 上記 SIMCA法や PLS法などの多変量解析を使用した解析モデルの作成は、 自 作ソフトや市販の多変量解析ソフトを用いて行うことができる。また、使用目的に特化 したソフトの作成により、迅速な解析が可能になる。
[0033] このような多変量解析ソフトを用いて組み立てられた解析モデルをファイルとして保 存しておき、未知試料の検査 ·診断時にこのファイルを呼び出し、未知試料に対して 解析モデルを用いた定量的または定性的な検査 ·診断を行う。これにより、簡易迅速 なウィルス検査、プリオン検査が可能になる。なお解析モデルは、定量モデル、定性 モデルなど複数の解析モデルをファイルとして保存しておき、各モデルは適宜更新さ れることが好ましい。
[0034] 解析モデルが作成されれば、当該解析モデルによる検査'診断に必要な波長光が 決定される。本装置は、こうして決定された 1又は複数の波長域を試料に照射する構 成とすることで装置構成をより単純化することができる。
[0035] [1. 3]本装置による好適な VIS— NIR測定方法とデータ解析方法
本装置によるスペクトル測定においては、検体試料に対し、所定の条件を付加する ことで摂動 (perturbation)を与えることが好ましぐまた、本装置によるデータ解析に おいては、この摂動の効果を引き出すようなデータ解析が好ましいものとなる。以下 では、この点について図 4を参照しながら説明する。
[0036] [1. 3. 1]摂動（perturbation) ここで、「摂動」とは、ある条件について複数の種類 ·条件を設定し測定することで試 料の吸光度変化をもたらし、互いに異なる複数のスペクトルデータを取得することを いう。条件としては、濃度変更 (濃度希釈を含む）、光の繰り返し照射、照射時間の延 長、電磁力付加、光路長変更、温度、 pH、圧力、機械的振動、その他その条件の変 更によつて物理的または化学的な変化をもたらすもののいずれ力、、または、それらの 組み合わせを挙げることができ、（1)光照射の仕方に関するものと、（2)試料の準備- 調製の仕方に関するものとに大別される。 （1)については光の繰り返し照射、（2)に ついては濃度希釈の場合を例に挙げ、以下説明する。
[0037] 光の繰り返し照射は、図 4に示すように、連続して又は一定の時間間隔で光を繰り 返し照射して複数回の測定という摂動を与えて試料検体のスペクトル測定を行う方法 である。例えば、光を 3回連続照射することにより、試料の吸光度が微妙に変化し (揺 らぎ）、互いに異なる複数のスペクトルデータが得られる。これらのスペクトルデータを SIMCA法や PLS法等の多変量解析に用いることにより、解析精度を向上することが でき、高精度な検査，診断が可能になる。なお、通常スぺ外ルを測定するときは、光 を複数回照射し測定するが、これは平均値を出すことが目的であり、ここでいう「摂動 」とは異なる。
[0038] 摂動による試料の吸光度変化は、試料中の水分子の吸収に変化 (揺らぎ）が生じる ためと考えられる。すなわち摂動として光を 3回繰り返し照射することによって、 1回目 、 2回目、 3回目それぞれ水の応答、吸収に微妙に異なる変化が起こり、その結果ス ベクトルに揺らぎが生じるものと考えられる。
[0039] 後述の実施例では、このような 3回繰り返し照射によりそれぞれ得られた吸光度スぺ タトルデータを使用して PLS法による回帰分析を行うことによって、各試料の HIV p2 4量を良好に定量することができた。
[0040] また、このように光を 3回繰り返し照射した場合、得られた 3回の吸光度スペクトルデ ータのうち少なくとも 2回の吸光度スぺクトノレデータを使用して SIMCA法によるクラス 判別を行うことによって、各試料を良好に分類することができ、高精度な検査 '診断が 可能である。光照射回数は特に 3回に制限されないが、データ解析の煩雑さ等を考 慮すると、 3回程度が好ましい。 [0041] 他方、濃度希釈による摂動は、試料を数段階に希釈したものを準備し、各試料のス ベクトル測定を行う。これにより、 1つの検体試料について複数のスペクトルデータが 得られ、これらのスペクトルデータを多変量解析に用いることにより、高精度な検査 · 診断が可能になる。この場合の多変量解析例としては、後述のように、まず各検体試 料につき希釈度を目的変量とする PLS回帰分析を行い、次いで、得られた回帰べク トルを SIMCA法などのパターン認識を用いて分類する。こうして作成されたクラス判 別モデルを用いて、未知試料の回帰ベクトルがいずれのクラスの回帰ベクトル（パタ ーン）に近いかを判別'分類することによって、検查 '診断が可能である。
[0042] 後述の実施例では、検体試料を 10倍ずつ 10段階まで濃度希釈したものを使用し たが、希釈数や希釈の程度は特に制限されるものではなレ、。濃度希釈による摂動に よって取得するスペクトルに揺らぎが生じればよいので、これらの数値は任意に設定 すること力 Sできる。
[0043] 後述の実施例では、 10倍希釈した試料を用いて PLS法により試料中に極低濃度（ pg/mLオーダー）で存在する HIV p24量を高精度に定量することができた。このこ とから、本発明の方法'装置によれば、試料中に極低濃度 (pg/mLオーダー）で存 在する目的物質の定量が可能と考えられる。また、 105倍程度に濃度希釈した試料を 用いた場合にも SIMCA法により分類ミス（Misclassification)なく各試料を感染 ·非感 染に分類することができた。このことから、本発明の方法 '装置によれば、試料中に目 的物質が極低濃度（フェムト (femto) g/mLオーダー）で存在する場合にもクラス判 別可能と考えられる。このように本発明によれば、極めて精度の高い検査が実現可能 である。
[0044] 濃度希釈、光の繰り返し照射以外の摂動の条件についても同様に、取得するスぺ タトルに揺らぎを生じさせるよう、各条件について複数の種類'条件を設定し、スぺタト ル測定を行えばょレ、（特願 2003— 379517号参照）。
[0045] [1. 3. 2]摂動効果を引き出すデータ解析方法
ここで、「摂動効果を引き出すデータ解析」とは、 1つの試料につき摂動により得ら れた複数のスペクトルデータを使用して解析モデルを作成すること、および、その解 析モデルを使用してデータ解析を行うことをいうが、そのデータ解析方法の具体例と して、下記 3つの方法を挙げることができる（図 4参照）。
[0046] (a)定量的解析: PLS法などの回帰分析により作成した定量モデルを用いて、 HIV p24量など試料中の目的物質を定量する方法
定量モデルは、 1つの試料につき摂動により得られた複数のスペクトルデータを使 用して作成する。試料中の目的物質の定量により、ウィルス感染の有無、プリオン感 染の有無のみならず、感染の程度、感染期間（ウィンドウ期かエイズ期か等）、重篤 度合い、進行度合いなどを予測することができる。
[0047] (b)定性的解析 1： SIMCA法などのクラス判別解析により作成した定性モデルを用 いて、感染の有無を検査 '判別する方法
定性モデルは、 1つの試料につき摂動により得られた複数のスペクトルデータを使 用して作成する。 3クラス以上のクラス判別モデルを作成することにより、ウィルス感染 の有無、プリオン感染の有無のみならず、感染の程度、感染期間、重篤度合い、進 行度合いなどを予測することができる。
[0048] (c)定性的解析 2 : (1)濃度希釈値 (希釈度)など摂動の各値 (摂動を与えるため条件 を振った各値)を目的変量とする回帰分析 (PLS法など)を行い、（2)同分析により得 られた回帰ベクトルに対して、 SIMCA法などのクラス判別解析を行うことで作成した 定性モデルを用いて、感染の有無を検査'判別する方法
回帰分析は、上記のように、 1つの試料につき摂動により得られた複数のスぺクトノレ データを使用して行う。 3クラス以上のクラス判別モデルを作成し、パターン認識によ り分類することによって、ウィルス感染の有無、プリオン感染の有無のみならず、感染 の程度、感染期間、重篤度合い、進行度合いなどを予測することができる。
[0049] 〔2〕本装置の具体的構成
本装置の検查 ·診断システムの構成としては、図 1に示すように、プローブ（投光部）
1、分光'検出部 2、データ解析部 3および結果表示部 4の 4つの要素を備えて構成 すること力 Sできる。以下では、各要素について説明する。
[0050] [2. 1]プローブ（投光手段）
プローブ 1は、ハロゲンランプ 'LED等の光源からの光（波長 400nm〜2500nmの 全範囲またはその一部範囲）を測定対象である試料に導く機能を有する。例えばファ ィバープローブとし、柔軟な光ファイバ一を介して測定対象 (試料）に投光する構成 が挙げられる。一般に近赤外線分光器のプローブは安価に作製することができ、低 コストである。
[0051] なお、光源から発せられた光を直接測定対象である試料に投光する構成としてもよ レ、が、その場合プローブは不要であり、光源が投光手段として機能する。
[0052] 前述のように、解析モデルが作成されれば、当該解析モデルによる検查'診断に必 要な波長光が決定される。本装置は、こうして決定された 1又は複数の波長域を試料 に照射する構成とすることで装置構成をより単純化することができる。
[0053] また前述のように、本装置は、摂動を与えながらスペクトル測定を行うため、摂動付 与に必要な構成を適宜備えることが好ましい。
[0054] [2. 2]分光'検出部 (分光手段および検出手段）
本装置は、測定システムとして近赤外線分光器の構成を有する。近赤外線分光器 は一般に、光を測定対象物に照射し、この対象物からの反射光や透過光あるいは透 過反射光を検出部で検出する。さらに、検出された光について波長別に入射光に対 する吸光度が測定される。
[0055] 分光方式には前分光と後分光とがある（図 2参照)。前分光は、測定対象物に投光 する前に分光する。後分光は、測定対象物からの光を検出し分光する。本装置の分 光'検出部 2は、前分光、後分光いずれの分光方式を採用するものであってもよい。
[0056] 検出方法には 3種類あり、反射光検出、透過光検出および透過反射光検出がある（ 図 3参照）。同図に示すように、反射光検出および透過光検出は、それぞれ、測定対 象物からの反射光と透過光とを検出器によって検出する。透過反射光検出は、入射 光が測定対象物内に入射した屈折光が物体内で反射し、再び物体外に放射された 光が反射光と干渉する光を検出する。本装置の分光 ·検出部 2は、反射光検出、透 過光検出および透過反射光検出のいずれの検出方式を採用するものであってもよ レ、。
[0057] 分光 ·検出部 2内の検出器は、例えば半導体素子である CCD (Charge Coupled De vice)などによって構成することができる力 勿論これに限定されるものではなぐ他の 受光素子を使用してもよい。分光器についても公知の手段によって構成することがで きる。
[0058] [2. 3]データ解析部（データ解析手段）
分光'検出部 2から波長別の吸光度、即ち吸光度スペクトルデータが得られる。デ ータ解析部 3は、この吸光度スペクトルデータをもとに、前述のように予め作成した解 析モデルを使用して、ウィルス検查、又はプリオン検查を行う。
[0059] 解析モデルは、定量モデル、定性モデルなど複数の解析モデルを用意しておき、 定量的評価を行うか、あるいは定性的評価を行うかに応じて、異なるものを使用して もよレ、。また、解析モデルは、ウィルス検查用、プリオン検查用の両モデルを作成して おき、 1つの装置でいずれの検查も可能な構成としてもよいし、検查対象のウィルス の種類に応じてそれぞれ異なる解析モデルを作成しておき、 1つの装置で複数種類 のウィルス検査が可能な構成としてもよい。
[0060] データ解析部 3は、スペクトルデータ、多変量解析用プログラム、解析モデルなどの 各種データを記憶する記憶部と、これらのデータおよびプログラムに基づき演算処理 を行う演算処理部とによって構成することができ、例えば ICチップなどによって実現 可能である。したがって、本装置を携帯型とするため小型化することも容易である。上 記の解析モデルも、 ICチップなどの記憶部に書き込まれる。
[0061] [2. 4]結果表示部（表示手段）
結果表示部 4は、データ解析部 3における解析結果を表示する。具体的には、解析 モデルによる解析の結果得られた試料中の HIV p24量など目的物質の濃度値を表 示する。あるいは、定性モデルの場合は、そのクラス判別結果に基づき「感染有り」「 感染可能性高い」「感染可能性低い」「非感染」「ウィンドウ期」「エイズ期」などといつ た表示を行う。なお、本装置を携帯型とする場合は、結果表示部 4を液晶等のフラット ディスプレイとすることが好ましレ、。
[0062] 〔3〕本装置の用途
本装置は、（1)ウィルス検查用、 （2)プリオン検查用、 （3)ウィルス ·プリオン両検查 用、のいずれであってもよいし、 HIVなど特定のウィルス検查用（専用機）として、ある レ、は、複数種類のウィルス検查用（汎用機）として構成してもよレ、。
[0063] 検查対象のウィルスは、特に制限されるものではなレ、が、 HIV以外に、 C型肝炎ゥ ィルス、 B型肝炎ウィルスなどの肝炎ウィルス、 BDV (Borna disease virus :ボルナ病 ウィルス）、 SARSコロナウィルス、成人 T細胞白血病ウィルス、ヒトパルボウイルス、ェ ンテロウィルス、アデノウイルス、コクサツキ一 A群 · Β群ウィルス、エコーウィルス、単 純へノレぺスゥイノレス、インフノレエンザゥイノレス、ノロゥイノレス、口タウイノレス、ポリオウイ ルス、麻疹ウィルス、風疹ウィルスなど、ヒト又は家畜のウィルス性疾患の各種原因ゥ ィルスを例示することができる。
[0064] なお、本装置は、このようなウィルス性疾患に関する検查 ·診断に使用することが好 ましいが、本発明の方法 ·装置はこれに制限されるものではなぐ例えば飲食品の安 全性検査として、飲食品に対するウィルス検査に本発明の方法'装置を使用してもよ レ、。
[0065] プリオン検查としては、クロイツフェルト 'ヤコプ病（CJD)のほカ 牛のプリオン病で ある牛海綿状脳症（BSE '狂牛病）、ヒッジ、ャギのプリオン病であるスクレイピー（Scr apie)、シ力のプリオン病である慢性消耗病（CWD)など、ヒト又は家畜のプリオン病の 検査 ·診断に使用することができる。
実施例
[0066] 以下、本発明の実施例について説明するが、本発明は下記実施例によって何ら限 定されるものではない。
〔実施例 1 :近赤外線分光法による HIV感染の有無の検査 '診断〕
[1. 1]吸収スぺタトノレの測定
本実施例では、以下の測定方法により、各試料の吸収スぺクトノレを測定した。
[0067] 健常人の血漿（Normal donor plasma) 5検体および HIV感染患者の血漿（HIV_infe cted plasma) 8検体の合計 13検体について、それぞれ PBS緩衝液で 10倍ずつ段階 的に 10段階まで濃度希釈した 10倍希釈系列 (濃度を 10— 1倍から 10— 1Q倍まで 10倍ず つ希釈したもの）を検体試料として使用した。
[0068] 各試料 2mLをポリスチレン製キュベットに入れ、近赤外線分光装置 (製品名「Fruit_ Tester-20 (FT— 20) (Japan Fantec Research Institute, Smzuoka, Japan)」) 使用し飞 光繰り返し照射の摂動を与えながら測定を行った。具体的には、 600〜： !OOOnmの 波長光を連続して 3回試料に照射し、各反射光を検出することによって吸収スぺタト ルを測定した。波長分解能は lnmである。試料を透過する光路長は 10mmに設定し た。
[0069] [1. 2]吸収スペクトルの解析
本実施例では、得られた吸収スぺクトノレについて様々な解析を行レ、、最適な解析 モデルの検討を行った。
[0070] [1. 2. 1]第 1の解析方法： SIMCA法によるクラス分けと HIV診断
まず、得られた吸収スペクトルについて、希釈度ごとに SIMCA法による解析を行つ た。以下に、 10倍希釈の解析例を示す。
[0071] 解析モデル作成のため、各試料（10倍希釈）における HIVの p24抗原量を ELISA 法により測定した。また、 PCR法により HIV遺伝子の有無を確認すると共に、抗 HIV 抗体の有無についても調査した。その結果を下記の表 1に示す。
[表 1]
Figure imgf000021_0001
(+ ： pos i t i ve ; —)： negat I ve ; N1： not tested
表中、「HIV p24jは p24抗原量の測定結果、「HIV PCRjは HIV遺伝子の有無を調 ベた結果、「Anti-HIV 1/2」は抗 HIV抗体の有無を調べた結果、であり、 （+ )は陽性 、（一）は陰性、「NT」は未検査である。「HIV p24」については検出値 Ipg/mL未満 を陰性 (一)とし、これらの結果をもとに次のような分類にしたがって上記 13検体を 1 _ 3の 3つのクラスに分類した。
クラス 1 : HIV p24 (-)， HIV PCR (-)， Anti- HIV (-) (HIV非感染）
クラス 2 : HIV p24 (+)， HIV PCR (+)， Anti— HIV (-) クラス 3 : HIV p24 (―)， HIV PCR (+)， Antト HIV (-)
[0073] HIV感染後の患者の血液中の HIV抗原量、 CD4陽性 T細胞数、抗 HIV抗体量は
、図 5に示すように変化する。上記クラス 2 · 3の検体はいずれも、図中 *印で示される
HIV量が高いウィンドウ期（感染後 11日以後）に属するが、クラス 2は ELISA法によ り p24の検出可能な時期、クラス 3は HIVは存在する力 同法による p24の検出がで きない時期のサンプルである。すなわち、クラス 3は、ウィンドウ期の中でもごく初期（ 感染してからまだウィルス量がそれほど増えてレ、ない時期に相当）で、 PCRとレ、ぅ感 度の高い方法でのみ検出可能な検体群である。
[0074] 本実施例において、解析モデルの作成には市販の多変量解析用ソフト（商品名「Pi rouette ver.3.01 (Informetrics社）」）を使用し、以下に示されるアルゴリズムにより SI
MCA解析を行った。
# or included Samples: 39
Preprocessing: Autoscale
Scope: Local
Maximum factors: 11
Optimal Factors: 6,5,6
Probability threshold: 0.9500
Calibration transfer: Not enabled
Transform: Smooth(25)
[0075] 上記アルゴリズムについて簡単に説明すると、「 # of lncluded Samples]は、解析に 使用したサンプノレ数 (スペクトル数)であり、サンプル数 39は、 10倍希釈の各検体試 料につき、 3回連続照射にて各々得られた 3つの吸光度データを使用したことを意味 する。
[0076] 「Preprocessing」は前処理を示し、「Autoscale」は分散スケーリングの後に平均を行 う方法を用いたことを示す。 「Scope」は Globalと Localがある力 Localを選択した。 「Ma ximum factors] 最大に解析する Factor (主成分）数を示し、選択できる最大の Fac tor数まで選択した。 「Optimal Factors」は解析の結果モデルを作成するのに最適だ つた Factor数を示し、「6,5,6」は Classlが Factor6までが最適、 Class2が Factor5までが 最適、 Class3が Factor6までが最適であることを示す。 「Probability thresholdjはあるク ラスに属するか判断する際の閾値を示す。 「Calibration transfer」は装置間の違いを 緩和させる数学的な調整を行うか否かを示す。 「Transform」は変換を示し、「Smooth」 は平滑化をしたことを示す。平滑化の変換は Savitzky-Golayの多項式フィルターの原 理に基づき、中心データの点と片側の n個のポイントを含むウィンドウ内の説明変数 への回旋を行っており、 n = 25を選択したことを示している。
図 6は、 SIMCA解析の結果得られた Coomans Plotを示す。表 2にはクラス距離（Int erclass Distances)の結果を、表 3には分類ミス（Misclassification)の結果をそれぞれ 示す。
[表 2]
Figure imgf000023_0001
表 2ίこおレヽて、 CS 1、 CS2、 CS3fま、それぞれ、クラス 1、クラス 2、クラス 3を意味す る（以下同じ）。また、 CS 1 @ 6は、クラス 1で Factor (主成分）を 6個使用していることを 意味し、以下同様に、 @の後の数値は使用した Factor数を示す。クラス距離が「3」以 上であれば、クラス間の識別ができていると考えることができる。
[表 3]
Figure imgf000023_0002
表 3において、「Actuall」は実際のクラスが「1」であることを意味し、他も同様である 。また、「Predl」は本 SIMCA解析により得られた解析モデルを用いて予測されたクラ スが「1」であることを意味し、他も同様である。「No match」は実際のクラスと予測クラ スとの不一致を数値化したものであり、「0」の場合は両者が完全に一致していること を意味する。また、表中の数値、例えば「15」は、 Classlの 5サンプルを 3回測定した ので、 5 X 3 = 15スペクトルの解析をしたことを示す。この 15スペクトルはすべて、 Cla sslと正しく判別された。
[0080] 以上の結果から、本 SIMCA解析により得られた解析モデルを用いて、各試料を良 好にクラス分けすることができた。こうして組み立てられた解析モデルをファイルとして 保存しておき、未知サンプルの検查.診断時にこのファイルを呼び出し、未知サンプ ノレがどのクラスに分類されるかを解析モデルで予測する。これにより、簡易迅速な HI V感染の検查 '診断が可能になる。
[0081] 以上は 10倍希釈の解析例であったが、 100倍希釈以降も同様の方法で解析を行 つた。図 7は、その結果をクラス間距離（Interclass Distance)についてまとめたグラフ であり、図中、「1」から「10」は 101倍希釈から io1Q倍希釈までの結果を示す。 io1Q倍 希釈した場合であっても、得られた解析モデルによってクラス間の識別は可能であつ た。このことから、本方法は、従来の HIV検查 '診断と比較して高い精度を有し、より 微量のサンプルで検査'診断可能と考えられる。また、分類ミスの結果等を考慮する と、 10倍希釈から 105倍希釈の場合 (濃度を 10— 1倍から 10— 5倍とした場合)に比較的 精度の良好な解析モデルを作成することができた。
[0082] [1. 2. 2]第 2の解析方法： PLS法による HIV p24量の予測と HIV診断
次に、 PLS法による回帰分析を行レ、、 HIV p24抗原量の定量モデルを作成した。 使用した試料は、 HIV p24 (+)であったクラス 2に属する 4試料（サンプル 7 · 9 · 10 · 13 )であり、各試料 10倍希釈のものを使用した。
[0083] 目的変数（Dependent variable)の数値を HIV p24量 [pg/mL]として、 PLS回帰 分析を以下のアルゴリズムで行った。
# or included Samples: 12
Preprocessing: Autoscale
Maximum factors: 10
Optimal Factors: 3
Validation: Step(l)
Probability threshold: 0.9500
calibration transfer: Not enabled Transform: Smooth(25)
[0084] サンプル数 12は、 10倍希釈の上記 4試料につき、 3回連続照射にて各々得られた
3つの吸光度データを使用したことを意味する。各項目の意味は前述したとおりであ る。「Validation」には St印と Crossがあり、括弧内の数字は取り除くサンプル数を示す
[0085] 図 8は、 Factor Selectを行った結果であり、横軸は使用した Factor数を、縦軸は SEV
(Standard Error of cross- Validation :クロスバリデーシヨンの標準偏差）を示す。この Factor Selectで SEVが最小になる Factor数 4 (このとき、相関係数 rは 0.9908)を選ん で、 PLS回帰を行った。図 9及び図 10はその分析結果であり、図 9は、 目的変数（す なわち HIV p24量 [pg/mL] )の数値を X軸とし、その値について本分析により得ら れた定量モデルで予測した値が Y軸にプロットされる。図中、例えば「10_ 1 _ 3」は 、サンプル 10を PBSで 10の 1乗希釈したサンプルの 3回目照射のデータを示す（以 下同様)。図 10は、定量モデルとして作成した重回帰式の全偏回帰係数（回帰べタト ノレ（Regression Vector) )を示している。横軸が波長を、縦軸が係数の値を示す。使用 した波長は 600nmから lOOOnmで、波長の分解能は lnmである。
[0086] 図 9に示すように、本 PLS解析により得られた解析モデルを用いて、各試料の HIV p24量 [pg/mL]を高精度に予測することができた。こうして組み立てられた解析モ デルをファイルとして保存しておき、未知サンプルの検査.診断時にこのファイルを呼 び出し、未知サンプルの HIV p24量 [pg/mL]を解析モデルで予測する。これによ り、簡易迅速な HIV感染の検査 ·診断が可能になる。
また、解析の結果、 686nm, 731nm, 755nm, 802nm, 879nm, 918nm, 954 nmおよび 979nmの 8つの波長力 HIV定量に大きく寄与していた。勿論、測定条 件、溶媒などによってこれらの波長の具体的数値は変化しうるし、これらの波長以外 の波長を用いた定量モデルによる HIV定量も可能である。
[0087] [1. 2. 3]第 3の解析方法: PLS回帰分析により得られた回帰ベクトルに対するパタ ーン認識と HIV診断
次に、各試料につき 101倍希釈から io1Q倍希釈まですべて使用し、以下のアルゴリ ズムで PLS回帰分析を行った。 # of Included Samples: 30
Preprocessing: Autoscale
Maximum factors: 28
Optimal Factors: 5
Validation: Step(l)
Probability threshold: 0.9500
Calibration transfer: Not enabled
Transform: LoglO Smooth(25)
[0088] サンプノレ数 30は、 lC^— lO115倍希釈の各検体試料につき、 3回連続照射にて各々 得られた 3つの吸光度データを使用したことを意味する。各項目の意味は前述したと おりである。 「Transforai」の「Logl0」はそれぞれの説明変数を常用対数で変換したこ とを示す。すなわち、本解析において、 目的変数（D印 endent variable)を 101倍希釈 は log (10 =1と定義し、以下同様に、 102倍希釈は log (102)=2、 103倍希釈は log (10
10 10 10
3)=3と定義した。
[0089] 図 11は、検体試料 1 (Samplel)について、 Factor Selectを行った結果であり、横軸 は使用した Factor数を、縦軸は SEV (Standard Error of cross-Validation :クロスバリ デーシヨンの標準偏差）を示す。この Factor Selectで SEVが最小になる Factor数 6 (こ のとき、相関係数 rは 0.9520)を選んで、 PLS回帰を行った。図 12及び図 13はその分 析結果であり、図 12は、 目的変数 (すなわち希釈度）の数値を X軸とし、その値につ いて本分析により得られた定量モデルで予測した値力 軸にプロットされる。図 13は 、定量モデルとして作成した重回帰式の全偏回帰係数（回帰ベクトル（Regression Ve ctor) )を示している。横軸が波長を、縦軸が係数の値を示す。使用した波長は 600nm から lOOOnmで、波長の分解能は lnmである。
[0090] 検体試料 2 _ 13 (Sample2-13)についても上記と同様の解析を行った。図 14〜図 1 6はその結果得られた各試料の回帰ベクトルをクラス毎に比較して示した図であり、 図 14はクラス 1に属する試料 1—5 (Sample No. l- 5)、図 15はクラス 2に属する試料 7 , 9, 10， 13 (Sample No.7, 9, 10， 13)、図 16はクラス 3に属する試料 6， 8， 11 , 12 (S ample No.6, 8, 11， 12)、の各回帰ベクトルを比較して示したものである。このような解 析により得られた回帰ベクトルを参照データベースとして保存しておき、未知サンプ ルの回帰ベクトルを保存されている回帰ベクトルと比較し、健常人の試料と HIV感染 者の試料のうちいずれの回帰ベクトルに近いかを SIMCA法などのパターン認識を 用いて調べることによって、 HIV感染の有無の検查 '診断が可能である。
[0091] 実際に前記検体試料 1— 13について、上記解析により得られた回帰ベクトルをス ぺクトルと見立てて、第 1の解析方法と同様のアルゴリズムで SIMCA解析を行ったと ころ、これら試料を良好に分類することができた。表 4はそのクラス距離 (Interclass Di stances)の結果を、表 5は分類ミス（Misclassification)の結果をそれぞれ示す。
[表 4]
Figure imgf000027_0001
[表 5]
Figure imgf000027_0002
[0092] 図 17は、上記 SIMCA解析の結果得られた、各波長（横軸）における Discriminating
Power (縦軸）を示す。 Discriminating Power (識別力）の値が高い波長ほど、当該波 長力 ¾つのクラス間で異なっていることを示す。すなわち、 Discriminating Powerの高 いシャープなピークの波長力 S、健常人と HIV感染者間の血漿の判別に有効な波長 の 1つと考えられる。したがって、このような SIMCA解析により得られた波長に着目し て判別を行うことによって、 HIV感染の有無を簡易迅速かつ精度良く診断することが 可能である。
[0093] さらに、前記検体試料 1 _ 13のうち、他とは異質なパターンの試料 12 · 13を除いて 上記と同様に SIMCA解析を行ったところ、各試料を良好に分類することができた。 またこの解析では、クラス 1と 2の距離は上記解析より大きくなつた。表 6はそのクラス 距離（Interclass Distances)の結果を、表 7は分類ミス（Misclassification)の結果をそ れぞれ示す。
[表 6]
Figure imgf000028_0001
[表 7]
Figure imgf000028_0002
[0094] 図 18は、試料 12 · 13を除いた上記 SIMCA解析の結果得られた、各波長 (横軸） における Discriminating Power (縦車由)を示す。この Discriminating Power (識另リ力)の 高いシャープなピークの波長が、健常人と HIV感染者間の血漿の判別に有効な波 長の 1つと考えられる。したがって、このような SIMCA解析により得られた波長に着 目して判別を行うことによって、 HIV感染の有無を簡易迅速かつ精度良く診断するこ とが可能である。
[0095] [1. 2. 4]第 4の解析方法： SIMCA法によるクラス分けと HIV診断（3回繰り返し照 射による摂動効果確認実験）
次に、 3回連続照射にて各々得られた 3つの吸光度データのうちの 1つのデータ、 2 つの組み合わせに係るデータ、あるいは、 3つすベてのデータを使用して、第 1の解 析方法と同様のアルゴリズムで SIMCA解析を行った。解析には、各試料 10倍希釈 のものを使用した。
[0096] 図 19は、上記解析結果をクラス間距離（Interclass Distance)についてまとめたグラ フである。図中、「1」は 1回目照射のデータのみ使用した場合、「2」「3」はそれぞれ 2 回目照射、 3回目照射のデータのみ使用した場合、「1 2」は 1回目照射および 2回 目照射のデータを使用した場合、「2— 3」は 2回目照射および 3回目照射のデータを 使用した場合、「3 1」は 1回目照射および 3回目照射のデータを使用した場合、「1 _ 2 _ 3」は 1—3回目照射のすべてのデータを使用した場合、である。
[0097] 上記クラス間距離の結果および分類ミス（Misclassification)の結果等を総合考慮す ると、 3回連続照射にて得られた 3つの吸光度データのうち少なくとも 2つの吸光度デ ータを使用して多変量解析を行うことで、良好な検査 ·判定が可能と考えられる。特に 、 2つ以上の吸光度データを使用する場合、 3回目照射のデータを含めて解析を行う ことで、良好な検查 '判定が可能と考えられる。
[0098] 〔実施例 2 :近赤外線分光法によるプリオン感染の有無の検查 '診断〕
[2. 1]吸収スぺタトノレの測定
本実施例では、以下の測定方法により、各試料の吸収スぺクトノレを測定した。
野生型マウス（WT mouse)、プリオン蛋白質遺伝子ノックアウトマウス（Rikn PrP-/- mouse)、およびプリオン感染野生型マウス（Prion-infected WT mouse)の各脳組織、 脳ホモジネートおよび血液を検体試料として使用した。プリオンは帯広株で、スクレイ ピー由来である。血液は、採取した血液 Ι Ο /i Lを lmLPBSに溶かしたものを使用し た。脳組織は脳組織半分を試料に使用した。また、脳ホモジネートは 20 /i LPBSで 溶解した 10 %脳ホモジネートをさらに lmLPBSに溶力したものを使用した。
試料の調製を除き、近赤外線分光装置を使用した吸収スペクトルの測定は、実施 例 1と同様に行った。
[0099] [2. 2]吸収スペクトルの解析
得られた吸収スペクトルについて、第 1の解析方法と同様のアルゴリズムで SIMCA 解析を行った。図 20〜図 22は、この SIMCA解析の結果得られた Coomans Plotを示 す。図 20は血液試料の結果、図 21、図 22はそれぞれ脳組織、脳ホモジネートを試 料に使用した結果である。
[0100] これらの図に示すように、本解析の結果、野生型マウスの試料はクラス（CS) 15 - 18 •20に分類され、ノックアウトマウスはクラス（CS) 16 ' 19 ' 21に分類され、プリオン感 染マウスはクラス（CS) 17 - 23 - 22に分類された。 [0101] このように、血液、脳組織、脳ホモジネートのいずれを試料に用いた場合にも、本 SI MCA解析により得られた解析モデルを用いて、プリオン感染動物、プリオン非感染 動物、プリオンノックアウト動物の各試料を良好にクラス分けすることができた。したが つて、こうして組み立てられた解析モデルをファイルとして保存しておき、未知サンプ ルの検查 '診断時にこのファイルを呼び出し、未知サンプルがどのクラスに分類され るかを解析モデルで予測することで、簡易迅速なプリオン感染の検查 '診断が可能に なる。
[0102] 本方法は血液を試料に使用できるため、生前診断への応用も可能である。また、こ の測定をオンラインィ匕することで大量のサンプルを精度良く分析することができる。
[0103] 試料には、血液のほか、尿その他の体液、組織、組織抽出液も利用可能と考えら れる。また、以下に示すように、耳や腹、鼻腔、手足の指先など生体の一部を検体と して、生体を傷つけることなく測定することも可能である。
[0104] [2. 3]耳および腹からの測定
次に、生体の耳および腹力 の測定により、近赤外分光法を用いたプリオン病生前 診断法の可能性について検討した。
[0105] 実験には、プリオン感染マウスとして、 chandler株スクレイピー感染脳ホモジネートを 脳内接種した C57BL6マウス、および obihiro株スクレイピー感染脳ホモジネートを脳 内接種した C57BL6マウスを使用した。また、そのコントロールとして、正常脳ホモジネ 一トを脳内接種したマウス、および PBSを脳内接種したマウスを使用した。これらのマ ウスについて、振るえ、足どりの異常、仰向けから起き上がれるかどうかといつた各種 症状を指標にプリオン病の発症を観察したところ、 chandler株スクレイピーを接種した マウスでは、接種後約 170日で発症するマウスが出現し、約 180日で全頭発症した。 一方、 obihiro株スクレイピーを接種したマウスでは、接種後約 200日で発症するマウ スが出現し、約 210日で全頭発症した。これに対して、正常脳ホモジネート接種マウ スおよび PBS接種マウスでは 1匹も発症しなかった。
[0106] 上記 4種類のマウスの耳からそれぞれ経時的に近赤外分光測定を行った。測定に はファイバープローブを使用し、右耳に光出力部を、左耳に光検出部をそれぞれあ てて脳を挟み込むように測定を行った。測定に使用した波長域など他の測定条件は 実施例 1と同様である。
[0107] 上記測定により取得したスペクトルデータについて、 SIMCA解析を第 1の解析方 法と同様のアルゴリズムで行った。接種後 170日以降のプリオン感染と非感染の識別 モデルを作成し、 Coomans plotを確認した結果、図 23に示すように、 chandler株およ び obihiro株プリオン感染マウスの群と、正常脳ホモジネート接種および PBS接種の プリオン非感染群を識別するモデルを作成することができた。
[0108] 上記モデルを使用し、経時的に測定されたプリオン感染マウスが当該モデルにより プリオン感染と診断される割合について調べた。その結果、図 24に示すように、接種 後 160日頃から急激にプリオン感染と診断される割合が高くなり、最終的に 180日頃 力、らすべてのプリオン感染マウスがプリオン感染と診断された。
[0109] 図 25は、耳からの測定で得られた上記識別モデルにおいて、プリオン感染と非感 染の波長ごとの識別力を示す。興味深いことに、ォキシヘモグロビン (HbO )、デォキ シヘモグロビン（deoxy-Hb)に関連する波長（700、 730、 750nm)にピークがみられ た。また、解析の結果、プリオン接種マウスはコントロールマウスに比べて、ォキシへ モグロビン濃度が低ぐデォキシヘモグロビン濃度が高いことが分かった。これらの結 果から、上記識別モデルは、このような生体内の相違を反映したスペクトルデータに より、プリオン感染と非感染を識別していると考えられる。
[0110] 次に、上記と同様の方法で、腹からの近赤外分光測定を行った。プリオンは、マウ スへの脳内接種、腹腔内接種、経口投与のいずれの場合も脾臓でいったん異常型 プリオン蛋白質が増えたあとに脳内に蓄積する。そこで、上記 4種類のマウスの腹に それぞれファイバープローブをあてて経時的に反射光を測定した。得られたスぺタト ルデータのうち、接種後 170日以降のプリオン感染と非感染の識別モデルを作成し、 Coomans plotを確認した結果、図 26に示すように、 chandler株および obihiro株プリオ ン感染マウスの群と、正常脳ホモジネート接種および PBS接種のプリオン非感染群 を識別するモデルを作成することができた。
[0111] 上記モデルを使用し、経時的に測定されたプリオン感染マウスが当該モデルにより プリオン感染と診断される割合について調べた。その結果、図 27に示すように、接種 後 160日頃から急激にプリオン感染と診断される割合が高くなつた。 [0112] 図 28は、腹からの測定で得られた上記識別モデルにおいて、プリオン感染と非感 染の波長ごとの識別力を示す。興味深いことに、シトクローム Cォキシダーゼ含有銅 の還元に関連する波長（780nm)にピークがみられた。また、解析の結果、コントロー ルマウスではシトクローム Cォキシダーゼ含有銅の還元が日数の経過に従って低くな る傾向にあるのに対して、プリオン接種マウスでは 150日頃からシトクローム Cォキシ ダーゼ含有銅の還元が高まることが分かった。これらの結果から、上記識別モデルは 、このような生体内の相違を反映したスペクトルデータにより、プリオン感染と非感染 を識別していると考えられる。
[0113] 以上の結果から、生体の耳および腹からの測定により、近赤外分光法によるプリオ ン病生前診断が可能であることが示された。
産業上の利用可能性
[0114] 以上のように、本発明は、 HIV等のウィルス感染の有無、プリオン感染の有無を簡 易迅速かつ高精度に検査 ·判定することができ、ウィルス感染検査やプリオン病の診 断などに広く利用できるものである。

Claims

請求の範囲
[1] 波長 400nm〜2500nmの範囲またはその一部範囲の波長光を被検者その他動 物由来の検体試料に照射し、その反射光、透過光または透過反射光を検出して吸 光度スペクトルデータを得た後、その中の測定全波長あるいは特定波長の吸光度を 、予め作成した解析モデルを用いて解析することによって HIV等のウィルス感染の有 無、又はプリオン感染の有無を定量的または定性的に検查 '判定する方法。
[2] 前記検体試料に対し、所定の条件を付加することで摂動を与えながらスペクトル測 定を行うと共に、その摂動効果を引き出すような解析を行うことを特徴とする請求項 1 記載の検査 '判定方法。
[3] 前記所定の条件が、濃度変更、光の繰り返し照射、照射時間の延長、電磁力付カロ 、光路長変更、温度、 pH、圧力、機械的振動、その他その条件の変更によって物理 的または化学的な変化をもたらすもののいずれ力、または、それらの組み合わせであ ることを特徴とする請求項 2記載の検査 ·判定方法。
[4] 光を 3回繰り返し照射し、得られた 3回の吸光度スペクトルデータのうち少なくとも 2 回の吸光度スペクトルデータを使用して多変量解析を行うことを特徴とする請求項 3 記載の検査 '判定方法。
[5] 1つの試料を複数に濃度希釈してそれぞれスペクトル測定を行レ、、得られたスぺク トルデータを使用して多変量解析を行うことを特徴とする請求項 3記載の検査 ·判定 方法。
[6] HIV検查またはプリオン検査に用いられ、 PLS法などの回帰分析により作成した定 量モデルを用いて、 HIV p24量など試料中の目的物質を定量することを特徴とする 請求項:!〜 5のいずれか 1項に記載の検查'判定方法。
[7] HIV検查またはプリオン検査に用いられ、 SIMCA法などのクラス判別解析により 作成した定性モデルを用いて、感染の有無、あるいはさらに感染期間などを予測す ることを特徴とする請求項:!〜 5のいずれか 1項に記載の検査 '判定方法。
[8] HIV検査またはプリオン検査に用いられ、 （1)濃度変更値など摂動の各値を目的 変量とする PLS法などの回帰分析を行い、 （2)同分析により得られた回帰ベクトルに 対して、 SIMCA法などのクラス判別解析を行うことで作成した定性モデルを用いて、 感染の有無、あるいはさらに感染期間などを予測することを特徴とする請求項 2〜5 のいずれか 1項に記載の検査 '判定方法。
[9] 前記検体試料に照射される光の波長域が、解析モデルによる解析に必要な範囲に 設定されていることを特徴とする請求項 1〜8のいずれ力 4項に記載の検查 ·判定方 法。
[10] 前記検体試料に照射される光の波長域が、 600nm〜： !OOOnmの範囲に設定され てレ、ることを特徴とする請求項 9に記載の検查 ·判定方法。
[11] 前記検体試料が、血液 (血漿'血清を含む）、尿、その他の体液、組織、組織抽出 液、または、耳、腹、鼻腔、手足の指先など生体の一部であることを特徴とする請求 項：!〜 10のいずれか 1項に記載の検查'判定方法。
[12] 波長 400nm〜2500nmの範囲またはその一部範囲の波長光を被検者その他動 物由来の検体試料に照射する投光手段と、
投光前又は投光後に分光する分光手段、および、前記試料に照射された光の反 射光、透過光または透過反射光を検出する検出手段と、
検出により得られた吸光度スペクトルデータの中の測定全波長あるいは特定波長 の吸光度を、予め作成した解析モデルを用いて解析することによって HIV等のウイ ノレス感染の有無、又はプリオン感染の有無を定量的または定性的に分析するデータ 解析手段と、を備えたことを特徴とする検査 ·診断装置。
[13] さらに、分析の結果を表示する表示手段を備えたことを特徴とする請求項 12記載 の検査 '診断装置。
[14] 前記検体試料に対し、所定の条件を付加することで摂動を与えながらスペクトル測 定を行うと共に、その摂動効果を引き出すような解析を行うことを特徴とする請求項 1 2記載の検査 '診断装置。
[15] 前記所定の条件が、濃度変更、光の繰り返し照射、照射時間の延長、電磁力付カロ 、光路長変更、温度、 pH、圧力、機械的振動、その他その条件の変更によって物理 的または化学的な変化をもたらすもののいずれカ または、それらの組み合わせであ ることを特徴とする請求項 14記載の検査 ·診断装置。
[16] 光を 3回繰り返し照射し、得られた 3回の吸光度スペクトルデータのうち少なくとも 2 回の吸光度スペクトルデータを使用して多変量解析を行うことを特徴とする請求項 15 記載の検査 '診断装置。
[17] HIV検査またはプリオン検査に用いられ、 PLS法などの回帰分析により作成した定 量モデルを用いて、 HIV p24量など試料中の目的物質を定量することを特徴とする 請求項 12〜： 16のいずれか 1項に記載の検查'診断装置。
[18] HIV検查またはプリオン検査に用いられ、 SIMCA法などのクラス判別解析により 作成した定性モデルを用いて、感染の有無、あるいはさらに感染期間などを予測す ることを特徴とする請求項 12〜： 16のいずれ力、 1項に記載の検查 ·診断装置。
[19] HIV検查またはプリオン検査に用いられ、 （1)濃度変更値など摂動の各値を目的 変量とする PLS法などの回帰分析を行い、 （2)同分析により得られた回帰ベクトルに 対して、 SIMCA法などのクラス判別解析を行うことで作成した定性モデルを用いて、 感染の有無、あるいはさらに感染期間などを予測することを特徴とする請求項 14〜1
6のいずれか 1項に記載の検査 '診断装置。
[20] 前記検体試料に照射される光の波長域が、解析モデルによる解析に必要な範囲に 設定されていることを特徴とする請求項 12〜： 19のいずれ力 1項に記載の検査 '診断 装置。
[21] 前記検体試料に照射される光の波長域が、 600nm〜： !OOOnmの範囲に設定され ていることを特徴とする請求項 20に記載の検査 ·診断装置。
[22] 前記検体試料が、血液 (血漿'血清を含む）、尿、その他の体液、組織、組織抽出 液、または、耳、腹、鼻腔、手足の指先など生体の一部であることを特徴とする請求 項 12〜21のいずれか 1項に記載の検査 '診断装置。
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