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WO2005011659A1 - Utilisation des n-alkanols comme activateurs du canal cftr - Google Patents

Utilisation des n-alkanols comme activateurs du canal cftr Download PDF

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WO2005011659A1
WO2005011659A1 PCT/FR2004/001662 FR2004001662W WO2005011659A1 WO 2005011659 A1 WO2005011659 A1 WO 2005011659A1 FR 2004001662 W FR2004001662 W FR 2004001662W WO 2005011659 A1 WO2005011659 A1 WO 2005011659A1
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WO
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cftr
alkanols
octanol
channel
cells
Prior art date
Application number
PCT/FR2004/001662
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Inventor
Bernard Verrier
Brice Marcet
Patrick Delmas
Original Assignee
Centre National De La Recherche Scientifique
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Publication date
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    • A61K31/045—Hydroxy compounds, e.g. alcohols; Salts thereof, e.g. alcoholates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys

Definitions

  • the present invention relates to a new use of n-alkanols as activators of the CFTR channel (cystic fibrosis ans'ansmembrane conductance regulator) and to the application of said use to the treatment of pathologies in which there is a dysfunction of said channel, such as cystic fibrosis.
  • the CFTR protein located in the apical region of the epithelial cells, is a chloride channel controlled by the level of cAMP and involved in the hydration of the fluids secreted by the submucosal glands. A dysfunction of this CFTR channel is responsible for cystic fibrosis, an autosomal recessive genetic disease.
  • Cystic Fibrosis in English terminology
  • Cystic Fibrosis in English terminology
  • Cystic Fibrosis gene called CF involved in cystic fibrosis has been identified, cloned and located on the long arm of chromosome 7 (Riordan et al, 1989). Cystic fibrosis is the most common autosomal recessive genetic disorder in Caucasian populations.
  • CF gene consists of 250,000 base pairs defining 27 exons and codes for the protein CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator), which contains 1480 amino acids (Riordan et al., 1989).
  • Cystic fibrosis is a canalopathy, that is, a pathology related to dysfunction of ion channels, insofar as the protein CFTR has been characterized as a chloride channel.
  • CFTR a canalopathy
  • more than 1300 mutations in the CF gene have already been reported, which alter the properties and function of the CFTR channel.
  • the CFTR protein is expressed in many organs including the exocrine pancreas, lungs, sweat glands, intestine, liver tissue, reproductive system, kidney and heart tissue.
  • the interest in cystic fibrosis had important consequences for the understanding of the secretory mechanisms of normal epithelial cells.
  • the CFTR protein which is mainly located at the apical pole of the epithelial cells, is a chloride channel, of low conductance, activated by the cAMP pathway.
  • CFTR is involved in the hydration of fluids secreted by the submucosal glands and is said to influence the secretion of mucins, glycoproteins which participate in particular in the formation of bronchial mucus.
  • dysfunction of the CFTR channel affects the apical secretion of Cl ions, activated by cAMP.
  • the electrolyte transport which has become abnormal, causes the thickening of the extracellular mucus and thus leads to obstructions in the lumens of the various tissues. These obstructions are the cause of chronic bronchitis due to opportunistic bacterial pulmonary infections, pancreatic and hepatic insufficiencies, abnormally concentrated sweat secretion and male infertility.
  • the CFTR protein is a glycoprotein with a molecular weight of
  • 170 kD comprising five domains (Riordan et al., 1989): two transmembrane domains each with 6 transmembrane segments or ⁇ helices (numbered from 1 to
  • the CFTR protein has, in addition to its chloride channel activity, many other cellular functions which have not yet been elucidated. It would regulate other ion channels such as the outgoing rectifying chloride channel ORCC (Schwiebert et al., 1995), the epithelial sodium channel ENaC (Quinton et al., 1999) or the calcium-dependent chloride channel CaCC (Wei et al. , 1999). It also has a regulatory activity on the release of ATP from the inside to the outside of the cell (Schwiebert et al., 1995).
  • the CFTR shares a sequence and structure homology, with the ABC transporters (for "ATP-binding cassette") which constitute a large family of membrane proteins very conserved in evolution.
  • the absence of chloride current after stimulation of the epithelial cells of the exocrine glands by cAMP is the main characteristic showing the presence of an abnormality in the CF gene and in particular of the mutation ( ⁇ F508).
  • the highest mutation density is found in the two nucleotide binding domains (NBD1 and NBD2). Seven other significant mutations are present with frequencies above 1%.
  • the G551D mutation corresponds to the substitution of a glycine residue (G) at position 551 of the protein with an aspartic acid (D).
  • CF patients carrying this mutant have a severe pathology with pancreatic insufficiency and serious pulmonary disorders (Cutting et al., 1990).
  • Heterozygous people would have been more resistant to epidemics of typhoid fever, cholera, tuberculosis or secretory diarrhea.
  • a correlation between heterozygous carriers for the CF gene and susceptibility to develop various pathologies such as asthma, nasal polyposis, chronic sinusitis and bronchitis, bronchiectasis, allergic bronchopulmonary aspergillosis or pancreatitis has been established by certain studies. (Griesenbach et al., 1999). Mutations occurring in flanking regions between exons-introns of the CF gene have also been described. For example, there are polymorphic variants 9-, 7- or 5-thymidines between intron 8 and exon 9.
  • the polymorphic variant 5T decreases the synthesis of the protein CFTR, moreover normal.
  • the association of the 5T variant on one allele with a CFTR mutation on the other allele leads to congenital agenesis of vas deferens (ACCD), characterized in male patients by secretory infertility without any other classic cystic fibrosis disorder. A certain proportion of sterile men could actually carry these mutations in the CF gene, without developing cystic fibrosis itself.
  • This discovery opens a debate on the diagnosis and classification of cystic fibrosis, linked to physiological disorders listed in heterozygous individuals.
  • bromotetramisole did not have the expected activating effect.
  • - Benzimidazolones (NSOO4) (Gribkoff et al, 1994). These compounds, derived from the imidazole nucleus such as levamisole, can, under certain conditions, and in particular when the CFTR channel has been phosphorylated, open the channel. Benzimidazolones are however also activators of many potassium channels (Olesen et al., 1994) and are therefore not very specific to the CFTR channel.
  • Substituted xanthines such as 1TBMX (3-isobutyl-1-methyl-xanthine) or theophylline are first known as inhibitors of intracellular phosphodiesterases (cAMP degradation enzymes), phosphatases and antagonists of membrane receptors which fix adenosine; they also act on the mobilization of intracellular calcium. Regardless of these properties, they are activators of the CFTR channel (Chappe et al., 1998). The mechanic nism of action of xanthines on CFTR is still poorly understood but could imply their fixation on the nucleotide binding domains (NBD1 and NBD2).
  • transmembrane ionics in particular chloride, and in particular in epithelial cells in humans or animals.
  • the present invention more particularly aims to provide new drugs which can be used in the context of the treatment of cystic fibrosis, cases of "atypical cystic fibrosis" (asthma, chronic sinusitis, bronchiectasis ...), prevention or treatment of obstructions of the bronchial or digestive tracts (in particular pancreatic or intestinal), cardiovascular or renal diseases.
  • the inventors have in fact surprisingly found that certain n-alkanols specifically activate the CFTR chloride channel (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator).
  • the CFTR channel activity is measured using the radioactive iodide efflux technique ( 125 I) or the patch clamp technique.
  • the order of activation of CFTR by the n-alkanols is hexanol-Kheptanol-Koctanol-Koctanol-2 ⁇ decanol-1 (1 mM).
  • the present invention therefore relates to the use of n-alkanols with linear hydrocarbon chains, branched or not, or C 6 -C 10 cyclic, for the preparation of a medicament intended for the treatment of pathologies associated with disorders CFTR chloride channels (transmembrane chloride flow), in particular in epithelial cells, in humans or animals.
  • n-alkanols are n-alkanols with linear hydrocarbon chains, branched or not, in which the OH group is in position 1 (primary alcohol) or in position 2 (secondary alcohol).
  • said n-alkanols are n-alkanols with cyclic hydrocarbon chains carrying one or more alcohol groups (cyclohexane, for example).
  • the n-alkanols have, in this application, a certain number of advantages: - no activation by n-alkanols is detected in CHO control cells which do not express CFTR, whereas activation of CFTR by n-alkanols in CHO Chinese Hamster Ovary cells) expressing the CFTR channel is blocked by the addition of glibenclamide (100 ⁇ M), used to specifically block the CFTR channel.
  • n-alkanols do not modify the basic level of cAMP; n-alkanols thus specifically activate the CFTR channel by a route independent of cAMP.
  • the activation of CFTR by n-alkanols is independent of the potential effect of these molecules on cellular decoupling.
  • the n-alkanols act by a mechanism independent of the protein kinase C.
  • octanol which has already been proposed in numerous applications: 1. as anesthetic molecules; it exerts complex effects on biological membranes. A physico-chemical theory had been advanced to explain the effective power of anesthetics.
  • n-alkanols are involved in the relaxation of smooth muscles in the airways by notably reducing the intracellular concentration of calcium ([Ca 2+ ] j) (Sakihara et al., 2002). action at the level of cell junctions by altering the conductance of communicating junctions in numerous tissues including the epithelial tissue (Weingart et al., 1998); this effect relates more specifically to lipophilic agents, such as n- long-chain alkanols The molecular mechanism resulting from cellular decoupling remains unclear 5. Alcohols such as octanol, as anti-emulsifying agents, have already been used, as an aerosol, in patients suffering from pulmonary edema (Miller and al.
  • n-alkanols in the treatment of pathologies associated with transmembrane chloride ion flow disorders in epithelial cells and in particular cystic fibrosis and atypical cystic fibrosis has just been found by the inventors. Indeed, surprisingly, the n-alkanols in C ⁇ -C t o, in particular nebulized in the bronchi of patients in the form of an aerosol or nebuliser, activate or potentiate the activity of wild or mutated CFTR channels but present at the cell membrane especially in patients with cystic fibrosis.
  • n-alkanols Activation of the CFTR channel by n-alkanols, could further promote a bronchodilator effect on the smooth muscle fibers of the bronchi and bronchioles, and contribute to the improvement of the respiratory function of patients suffering from cystic fibrosis as well as patients with respiratory failure not related to cystic fibrosis, such as asthma.
  • said n-alkanols can be administered parenterally: intradermal, intravenous, intramuscular or subcutaneous administration; by intranasal and oral route: aspiration or nebulization by aerosol; orally; sublingually.
  • said n-alkanols are administered in a form suitable for intra-nasal or buccal administration, so as to obtain direct contact between said n-alkanols and the surface of the bronchopulmonary mucous membranes.
  • said n-alkanols are presented in a liquid form, for administration in the form of an aerosol or in the form of a nebulizer, and this using a nebulizing device, of the type of those used in the treatment of both asthma and cystic fibrosis.
  • said n-alkanols are associated with at least one pharmaceutically acceptable vehicle suitable for said intra nasal or buccal administration.
  • said n-alkanols are preferably administered at a concentration of between 0.001% and 0J% (v / v), corresponding to a value of between 10 and 1000 ppm (parts per million ), i.e. from 10 mg / kg to 1 g / kg.
  • the invention also comprises other provisions, which will emerge from the description which follows, which refers to examples of implementation of the use which is the subject of the present invention, as well as to the accompanying drawings.
  • FIG. 1 illustrates: (A) Comparison of the effect of octanol-1 and FSK on the efflux of I25 I (% on the ordinate) as a function of time (min, on the abscissa) in CHO-CFTR (+) cells. (B) Effect of octanol-1 and FSK on the efflux of 125 I (% on the ordinate) as a function of time (min on the abscissa) in the CHO-CFTR (-) control cells.
  • FIG. 4 illustrates: (A) Effect of the length of the hydrocarbon chain of n-alkanols (on the abscissa) in the activation of l efflux of I25 I (efflux speed in min "1 on the ordinate). (B) Effect of octanol-2 on the activation of the efflux of I (efflux speed in min " on the ordinate).
  • - Figure 5 illustrates the effect of octanol-1 (1 mM) and 18-alpha glycerrhetinic acid ( ⁇ -GA 10 ⁇ M) on the calcium response induced by a stimulation of ATP which involves communication intercellular.
  • FIG. 7 illustrates: (A) Effect of the inhibition of protein kinase A by H-89 (30 ⁇ M, 30 min) on the activation of the efflux of I (efflux rate in min " in ordered) induced by octanol-1 (1 mM), FSK (1 ⁇ M) or co-stimulation octanol-1 + FSK.
  • FIG. 9 illustrates:
  • the arrow represents the moment when octanol-1 (1 mM) is added, with or without glibenclamide and with or without DIDS.
  • FIG. 11 illustrates the reversibility of the effect of octanol-1 (1 mM) on the activation of CFTR studied by patch clamp in whole cell configuration in CHO-BQ1 cells.
  • - Figure 12 illustrates the structure of n-alkanols in C2-CK). It should be understood, however, that these examples are given only by way of illustration of the subject of the invention, of which they do not in any way constitute a limitation.
  • CHO-CFTR (-) and are cultured in DMEM / F12 medium under the same conditions as above.
  • CFTR studies are also carried out on Calu-3 cells (ATCC No. HTB-55) which are human pulmonary epithelial cells endogenously expressing the CFTR channel. These cells are cultivated under the same culture conditions as CHO cells.
  • Study of the mutated CFTR channel is carried out on JME / CF15 cells, epithelial cells extracted from the respiratory airways of patients suffering from cystic fibrosis (homozygous ⁇ F508) (Jefferson et al., 1990). These cells therefore express the mutated CFTR channel ⁇ F508.
  • the resistance of a pipette or a microelectrode makes it possible to appreciate the fineness of the tip: the greater the resistance, the finer the tip or the electrode is blocked.
  • the diameter of the patch-clamp pipette does not allow it to enter the cell, but on the other hand, it effectively allows a piece of membrane to be trapped in the tip. Interactions between the membrane and the glass will form, helped by a slight suction or negative pressure of the pipette.
  • the quality of this interaction (or sealing) is also appreciated by measuring the resistance between the glass and the membrane. To measure global currents in whole cell configuration, a sealing resistance of 1 G ⁇ is sufficient.
  • electrical current records are measured through a patch containing, for example, a channel.
  • amp ) is generally in millivolts.
  • E c The imposed membrane potential
  • amp is generally in millivolts.
  • the current oscillates weakly around a basic level (state F). This tiny basic current flows through the "leaks" between the patch and the tip of the pipette.
  • the channel opens (state O) the current jumps to another level, then returns to the basic level when the channel closes and so on.
  • the measurements can be carried out in one of the following configurations: attached cell (cell-attached), whole cell (whole-cell), excised patch inside-outside (inside-ouf) or excised patch outside-outside (outside-ouf) . Patch-clamp experiments are carried out on confluent cells.
  • the culture dishes are placed in an experimental tank (volume 1 ml) on the stage of an inverted microscope (Nikon) equipped with phase contrast lighting.
  • the whole-cell configuration is used for recording cell currents (Hamill et al., 1981).
  • the experiments are carried out at room temperature (20-22 ° C).
  • the currents are amplified with an Axopatch 200B amplifier (Axon Instrument LTd) having a 2-5 kHz low-pass filter (6-pole Bessel filter) and recorded on the hard drive of a PC computer after digitization at 10-25 kHz. .
  • the pipettes are made from 1 mm diameter glass tubes (Clark Electromedical Instrument) in four stages with a horizontal drawing machine (Bruwn Flaming 97, CA).
  • the drugs to be tested are dissolved according to the desired concentration, at 37 ° C, in medium B at pH 7.4, containing in mM: 137 NaCl, 5.36 KCl, 0, 8 mM MgCl 2 1.8 mM CaCl 2 , 5.5 glucose and 10 HEPES-NaOH.
  • the wells are washed 4 times with 500 ⁇ l of medium B.
  • the solution is then replaced by 500 ⁇ l of loading solution containing 1 ⁇ M Kl and 0.5 ⁇ Ci of 125 INa / ml for 30 min.
  • the exit kinetics of i are carried out after eliminating the loading solution and washing the wells 4 times with 500 ⁇ l of medium B.
  • the tracer contained in the cell layer at the start of the efflux is calculated as the sum of the samples and extracts counted.
  • the efflux curves are constructed by expressing the percentage of the content remaining in the cell layer (1%) over time.
  • the cells are incubated in culture medium DMEM / F12 without serum in the presence of the permeable form of fura-2 (fura- 2 / AM, 2.5 ⁇ M) for 1 h at 37 ° C.
  • CHO-CFTR (+) cell line CHO-CFTR (-) cells not expressing the CFTR protein were used as control cells.
  • 1 L ⁇ 23187 (2 ⁇ M) (a calcium ionophore) has no effect on the efflux of I in both CHO-CFTR (+) and CHO-CFTR (-) cells, showing that there is no Cl channels "dependent intracellular calcium (Chappe et al., 1998).
  • the CFTR channel is mainly regulated by protein kinase A, the control experiments have used the KSF to boost the level of intracellular cAMP.
  • Figure 1 A shows an activation of CFTR obtained by applying either 1 ⁇ M of FSK (FSK), octanol-1 (1 mM) or a combined application of FSK (1 ⁇ M) and octanol-1 (1 mM) in CHO-CFTR (+) cells.
  • Activation of the CFTR channel measured by the efflux of 125 I induces an increase in the amplitude of the iodide efflux (expressed as% of 125 I released in the medium) and of the exit speed of 125 I.
  • FIG. 1 A shows an activation of CFTR obtained by applying either 1 ⁇ M of FSK (FSK), octanol-1 (1 mM) or a combined application of FSK (1 ⁇ M) and octanol-1 (1 mM) in CHO-CFTR (+) cells.
  • FIG. 2 represents a dose-response curve of octanol-1 (0.1 to 5 mM) or FSK (0.1 to 5 ⁇ M) on the activation of CFTR. It can be seen in FIG. 2 that the activation of CFTR by FSK or by octanol-1 is dependent on the concentration with an EC 5 o of approximately 0.5 ⁇ M for FSK and of 0.5 mM for octanol-l. The effects of octanol-1 on the activation of CFTR are observable for concentrations of octanol-1 from 0.3 mM to 5 mM, with a plateau reached at 1 mM and a half-activation dose of 0, 5 mM.
  • FIGS. 3A and 3B respectively show that FSK (1 ⁇ M) and octanol-1 (I mM) produce an increase of approximately 10 times in the membrane conductance compared to the control.
  • the reversion potential of the current induced by FSK or by octanol-1 is 1 ⁇ 0.6 mV, showing that Cl " is the main ion which contributes to this current.
  • FIG. 3B shows that an application octanol-1 alone (1 mM), ie without FSK, induces full activation of the CFTR channel 2.2)
  • Octanol-l specifically stimulates the CFTR channel in human bronchial epithelial cells (Calu- The capacity of octanol-1 to stimulate CFTR in a human bronchial epithelial cell line (Calu-3) was also tested. As shown in FIG.
  • octanol-1 activates the output of iodide in Calu-3 cells.
  • efflux activated by octanol-1 is strongly blocked by treatment (1 hour) with glibenclamide (100 ⁇ M), a CFTR channel inhibitor, while treatment (1 hour) with 500 ⁇ M DIDS (4.4 '-diisothiocyanatostilbene-2,2'-disulfonic acid), used to block Cl channels " except the CFTR channel which is insensitive to it, has no effect (Figure 9B). All of these results show that octanol-l specifically activates the endogenous human CFTR channel expressed in human bronchial epithelial cells Calu-3.
  • octanol-1 activates the human CFTR channel of in a dose-dependent manner (0.1 to 10 mM) in Calu-3 cells ( Figures 9C, D)
  • a dose-response curve of octanol-1 performed in the presence of FSK (1 ⁇ M) shifts towards the left the dose-response curve of octanol-1, indicating a potency by forskolin of the activation of CFTR by octanol-1.
  • the ⁇ F508 mutation is found in more than 70% of patients with cystic fibrosis.
  • a large majority of the mutated CFTR channel ⁇ F508 is degraded by the ubiquitin-pr ⁇ téasome system inside the cell, and only a very small amount of mutated channel reaches the surface of the membrane where it can be activated.
  • JME / CF15 human bronchial epithelial cells extracted from patients with cystic fibrosis and homozygous for the ⁇ F508 mutation were used.
  • the molecule MPB-91 known to address a certain number of CFTR- ⁇ F508 channels to the plasma membrane, (Donner et al., 2001) has also been used.
  • FIG. 10A shows that octanol-1 specifically activates the mutated CFTR channel ⁇ F508.
  • a cocktail of stimulators (FSK 10 ⁇ M + genistein 30 ⁇ M) makes it possible to obtain the maximum activity for the mutated channel CFTR- ⁇ F508.
  • Octanol-1 (1 mM) alone is capable of activating approximately 50% of the maximum activity of the mutated CFTR- ⁇ F508 channel ( Figure 10B).
  • Octanol-1 is therefore of great interest in considering a pharmacotherapeutic treatment for cystic fibrosis.
  • the activating effect of octanol-1 on CFTR is reversible
  • FIG. 4A shows that the use of n-alkanols having lengths of hydrocarbon chains equal to or greater than those of hexanol-1 (C6) to decanol-1 (C10), significantly activates the CFTR channel.
  • the activation of CFTR increases as a function of the length of the hydrocarbon chain (that is to say as a function of the hydrophobicity) of the alcohol.
  • Figure 4 shows an increasing activation of CFTR following the application of hexanol-1 (C6), heptanol-1 (C7), octanol-1 (C8), or decanol-1 (C10) .
  • n-alkanols having short hydro-carbon chains ethanol, butanol-1
  • the efflux of I is not significantly different from the unstimulated efflux, indicating that ethanol and butanol do not activate the CFTR channel.
  • FIG. 4B it can be seen that octanol-2 also activates the protein CFTR. This shows that the position of the OH radical on the molecule in position 1 or in position 2 is not critical for the activation of the CFTR channel.
  • the activation of CFTR by n-alkanols is not due to cellular decoupling Octanol and the other n-alkanols can modify the cellular decoupling due to communicating junctions (gap junction).
  • Octanol has been shown to activate certain subtypes of PKC.
  • a strong PKC inhibitor in the presence of octanol-1 was therefore used. Under these conditions, the activation of CFTR by octanol-1 is not inhibited (FIG. 7).
  • octanol-1 activates CFTR well by a mechanism independent of PKCs.
  • Octanol and n-alkanols can interact directly with the CFTR channel at the hydrophobic sites of the protein, in order to induce a change in conformation favorable to its activation.
  • n-alkanols do not induce an increase in cAMP, the activation of CFTR by the n-alkanols is therefore not due to an increase in the level of cAMP induced by the n-alkanols.
  • the literature indicates that long chain n-alkanols are not potential activators of adenylate cyclase and therefore of the level of intracellular cAMP but rather have an inhibiting effect.

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Abstract

Nouvelle utilisation des n-alkanols comme activateurs du canal CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) et application de ladite utilisation aux traitements des pathologies dans lesquelles on observe un dysfonctionnement dudit canal, telles que la mucoviscidose.

Description

UTILISATION DES N-ALKANOLS COMME ACTIVATEURS DU CANAL CFTR La présente invention est relative à une nouvelle utilisation des n- alkanols comme activateurs du canal CFTR (cystic fibrosis ù'ansmembrane conductance regulator) et à l'application de ladite utilisation aux traitements des pathologies dans lesquelles on observe un dysfonctionnement dudit canal, telles que la mucovisci- dose. La protéine CFTR, localisée dans la région apicale des cellules épithéliales, est un canal chlorure contrôlé par le niveau d'AMPc et impliqué dans l'hydratation des fluides sécrétés par les glandes sous-muqueuses. Un dysfonctionnement de ce canal CFTR est responsable de la mucoviscidose, maladie génétique auto- somique récessive. Dans les cellules épithéliales, les transports d'eau et d'électrolytes sont associés à une augmentation des perméabilités membranaires pour les ions K+, Na+ et Cl". Ces mouvements d'eau et d'électrolytes sont liés à l'activité de protéines membranaires spécialisées (canaux ioniques, transporteurs) ayant une localisation précise dans la membrane plasmique de la cellule (pôle apical ou muqueux ; baso- latéral ou séreux). Les techniques d'électrophysiologie moléculaire (patch-clamp) et de mesure de flux ioniques rendent possible l'étude des transports ioniques transépi- théliaux, de leurs régulations et de leurs dérèglements pathologiques. Un dysfonctionnement des cellules épithéliales et notamment celui des transports d'électrolytes est à l'origine de nombreuses physiopathologies, telle que la mucoviscidose ou fibrose kystique (Cystic Fibrosis (CF), dans la terminologie anglo-saxonne), qui est considérée comme une génopathie des glandes exocrines. Le gène appelé CF impliqué dans la mucoviscidose a été identifié, clone et localisé sur le bras long du chromosome 7 (Riordan et al, 1989). La mucoviscidose est la maladie génétique autosomique récessive la plus commune dans les populations caucasiennes. Aux Etats-Unis et dans la plupart des pays d'Europe, la fréquence des porteurs hétérozygotes du gène CF muté est de 1 sur 20 à 1 sur 30, ce qui représente une naissance d'un enfant malade sur 2500 à 3000 environ. Les progrès réalisés dans le domaine de la recherche médicale et biologique ont fait, depuis les années 60, considérablement progresser l'espérance de vie des patients atteints de mucoviscidose, qui atteint aujourd'hui 30 ans environ. Le gène CF est constitué de 250.000 paires de bases définissant 27 exons et code pour la protéine CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator), qui comporte 1480 acides aminés (Riordan et al., 1989). La mucoviscidose est une canalopathie, c'est-à-dire une patho- logie liée à un dysfonctionnement de canaux ioniques, dans la mesure où la protéine CFTR a été caractérisée comme un canal chlorure. A l'heure actuelle, il a été déjà rapporté plus de 1300 mutations dans le gène CF, qui altèrent les propriétés et la fonction du canal CFTR. La protéine CFTR est exprimée dans de nombreux organes dont le pancréas exocrine, les poumons, les glandes sudoripares, l'intestin, le tissu hépatique, l'appareil reproducteur, le rein et le tissu cardiaque. L'intérêt porté à la mucoviscidose a eu des conséquences importantes pour la compréhension des mécanismes sécrétoires des cellules épithéliales normales. Les cellules épithéliales des glandes exocrines de différents organes, tels que l'intestin, le pancréas ou les poumons, contrôlent le transport de sel et d'eau dans les tissus. La protéine CFTR, qui est surtout localisée au pôle apical des cellules épithéliales, est un canal chlorure, de faible conductance, activé par la voie de l' AMPc. La CFTR est impliquée dans l'hydratation des fluides sécrétés par les glandes sous-muqueuses et influencerait la sécrétion des mucines, glycoprotéines qui participent notamment à la formation du mucus bronchique. Dans la mucoviscidose, le dysfonctionnement du canal CFTR affecte la sécrétion apicale d'ions Cl, activée par l'AMPc. Le transport électrolytique, devenu anormal, provoque l'épaississement du mucus extracellulaire et entraîne ainsi des obstructions au niveau des lumières des différents tissus. Ces obstructions sont la cause de bronchites chroniques dues à des infections bactériennes pulmonaires opportunistes, des insuffisances pancréatique et hépatique, d'une sécrétion sudoripare anormalement concentrée et de l'infertilité masculine. La protéine CFTR est une glycoprotéine d'un poids moléculaire de
170 kD comportant cinq domaines (Riordan et al., 1989) : deux domaines transmem- branaires avec chacun 6 segments transmembranaires ou hélices α (numérotées de 1 à
12, comportant chacun de 21 à 22 acides aminés), deux domaines intracellulaires de fixation des nucléotides (NBD1 et 2 pour Nucleotide Binding Domain) et un large domaine intracellulaire de régulation (domaine R). La régulation de la CFTR a été particulièrement étudiée. Deux processus complexes contrôlent l'activité du canal CFTR : la phosphorylation du domaine R par des protéines kinases et la fixation et l'hydrolyse d'ATP sur les deux domaines NBD. La déphosphorylation du canal CFTR entraîne une perte d'activité du canal jusqu'à sa fermeture (Tabcharani et al., 1991 ; Becq et al., 1994). Plusieurs études ont montré que la protéine CFTR a, en plus de son activité canal chlorure, de nombreuses autres fonctions cellulaires non encore éluci- dées. Elle régulerait d'autres canaux ioniques tels que le canal chlorure rectifiant sortant ORCC (Schwiebert et al., 1995), le canal sodium épithélial ENaC (Quinton et al., 1999) ou le canal chlorure dépendant du calcium CaCC (Wei et al., 1999). Elle aurait aussi une activité régulatrice sur la libération d'ATP de l'intérieur vers l'extérieur de la cellule (Schwiebert étal., 1995). La CFTR partage une homologie de séquence et de structure, avec les transporteurs ABC (pour "ATP-binding cassette") qui constituent une grande famille de protéines membranaires très conservées dans l'évolution. Ces transporteurs sont impliqués dans la translocation de substrats variés à travers les membranes cellulaires. Cependant, alors que chez les procary otes de nombreux couples transpor- teurs/substrats ont été définis, ces informations sont plus rares chez les eucaryotes. Chez les mammifères, on dénombre actuellement 48 transporteurs ABC dont les dysfonctionnements pourraient être associés à une pathologie. La glycoprotéine P (ou MDR pour Multi Drug Résistance) est impliquée dans le rejet de drogues cyto- toxiques. La CFTR contrôle le transport de chlorure transépithélial et l'hydratation des compartiments muqueux, alors qu'une des isoformes de la MDR serait plutôt impliquée dans la translocation de la phosphatidylcholine. Parmi les quelques 1300 mutations du gène CF recensées jusqu'à aujourd'hui et qui provoquent la mucoviscidose, la plus fréquemment retrouvée est une délétion de trois paires de bases dans une région codante (exon 10) du gène CF. Cette mutation correspond à la délétion, dans la protéine, d'une phénylalanine en position 508 (ΔF508) dans le domaine NBD1. La fréquence d'apparition de cette mutation est de 70 % des allèles mutés en moyenne dans les analyses génétiques (Tsui et al., 1991) et 50% des patients sont homozygotes pour cette mutation. Les conséquences de cette mutation sont dramatiques car la protéine anormale issue de la transcription du gène muté (ΔF508) n'est plus capable d'assurer ses fonctions dans le transport de chlorure des cellules épithéliales affectées. L'absence de courant chlorure après stimulation des cellules épithéliales des glandes exocrines par l'AMPc est la principale caractéristique montrant la présence d'une anomalie sur le gène CF et notamment de la mutation (ΔF508). La densité de mutations la plus élevée se trouve dans les deux domaines de fixation des nucléotides (NBD1 et NBD2). Sept autres mutations importantes sont présentes avec des fréquences supérieures à 1 %. La mutation G551D correspond à la substitution d'un résidu glycine (G) en position 551 de la protéine par un acide aspartique (D). Les patients CF porteurs de ce mutant ont une pathologie sévère avec une insuffisance pancréatique et des troubles pulmonaires graves (Cutting et al., 1990). La fréquence d'observation de cette mutation atteint 3 à 5 % chez certaines populations de patients atteints de mucoviscidose. A l'inverse de la délétion ΔF508, la protéine CFTR portant la mutation G551D est mature et est incorporée dans la membrane (Gregory et al., 1991). Cependant, la mutation entraîne une imperméabilité membranaire et la stimulation de la voie de l'AMPc n'ouvre pas le canal associé à l'expression de ce mutant (Gregory et al., 1991 ; Becq et al., 1994). D'autres mutations comme R117H, R334W et R347P apparaissent avec des fréquences basses de 0,8, 0,4 et 0,5% respectivement et sont associées à des pathologies moins sévères (Sheppard et al., 1993). Ces trois mutants expriment une protéine CFTR mature, glycosylée permettant son insertion dans la membrane. Cependant l'amplitude du courant, la conductance unitaire et la probabilité d'ouverture du canal, associées avec chacune des trois mutations, sont modifiées (Sheppard et al., 1993 ; Becq et al. 1994). La régulation par la voie de l'AMPc semble toutefois normale pour ces trois différents mutants, y compris pour ΔF508 (Becq et al., 1994). Les porteurs hétérozygotes du gène CF, c'est-à-dire ayant une copie du gène normal et une copie du gène muté, sont généralement sains et représentent environs 5 % de la population caucasienne. Un avantage sélectif est suggéré pour expliquer le pourcentage relativement élevé de cette mutation à l'état hétérozygote au cours de l'évolution. Les personnes hétérozygotes auraient été plus résistantes à des épidémies de fièvre typhoïde, de choléra, de tuberculose ou de diarrhées sécrétoires. Cependant une corrélation entre porteurs hétérozygotes pour le gène CF et susceptibilité à développer des pathologies diverses, telles que l'asthme, des polyposes nasales, des sinusites et bronchites chroniques, des bronchectasies, des aspergilloses bronchopulmonaires allergiques ou des pancréatites a été établie par certains travaux (Griesenbach et al., 1999). Des mutations survenant dans des régions flanquantes entre exons-introns du gène CF ont également été décrites. Par exemple, il existe des variants polymorphiques 9-, 7- ou 5- thymidines entre l'intron 8 et l'exon 9. Le variant polymo hique 5T diminue la synthèse de la protéine CFTR, au demeurant normale. L'association du variant 5T sur un allèle avec une mutation de CFTR sur l'autre allèle conduit à une agénésie congénitale de canaux déférents (ACCD), se caractérisant chez le patient masculin par une infertilité sécrétoire sans aucun autre trouble classique de mucoviscidose. Une certaine proportion d'hommes stériles pourrait en fait être porteurs de ces mutations dans le gène CF, sans développer la mucoviscidose proprement dite. Cette découverte ouvre un débat sur le diagnostic et la classification de la mucoviscidose, lié aux désordres physiologiques répertoriés chez des individus hétérozygotes. On pourrait ainsi définir, à côté des cas de mucoviscidose classique, des cas atypiques : - Dans le cas classique, les patients homozygotes malades, (e.g. ΔF508/ΔF508) ou hétérozygotes composites (e.g. ΔF508/G551D) présentent la majorité des troubles caractérisés par cette maladie. - Dans les cas atypiques, les patients, hétérozygotes composites (ΔF508/5T...) ou hétérozygotes vrais, montrent des troubles divers : ACCD, asthme, sinusites chroniques, etc., tels que précisés ci-dessus. Afin de pallier le déficit en protéines CFTR fonctionnelles, aussi bien dans les cas classiques de mucoviscidose que dans les cas atypiques marqués par différents troubles (asthme, bronchectasies, sinusites...), il peut être envisagé d'activer pharmacologiquement la protéine CFTR sauvage encore présente (hétérozygotes), et les mutants, tels que ΔF508 ou G551D, insérés dans la membrane, mais inactifs. Malgré un défaut d'adressage de la protéine ΔF508 dans les membranes de cellules épithéliales affectées par la mucoviscidose, plusieurs groupes ont montré que cette protéine pouvait être fonctionnellement présente, en petit nombre, dans les membranes (Dalemans et al., 1991 ; Drumm et al, 1991 ; Becq et al, 1994). Ainsi, l'utilisation d' activateurs du canal CFTR et notamment d'ouvreurs du canal CFTR peut optimiser les chances de succès d'une pharmaco- thérapie des maladies liées à un dysfonctionnement du canal CFTR. Malgré les progrès réalisés dans la génétique de la mucoviscidose et dans la biologie et la biochimie de la protéine CFTR, la pharmacologie des ouvreurs du canal CFTR est peu développée. Plusieurs études ont montré qu'en plus des agents généraux bien connus pour activer la protéine CFTR par la voie de l'AMPc, tels que la forskoline (FSK), il était possible d'utiliser d'autres molécules pour activer les canaux CFTR. Le mode d'action de ces activateurs est encore peu connu et leurs effets limités. On peut citer les quelques familles de molécules aujourd'hui connues pour leurs propriétés d' activateurs ou d'ouvreurs du canal CFTR : - Les phénylimidazothiazoles (lévamisole et bromotétramisole) (Becq et al., 1994). Il a été montré que le lévamisole et le bromotétramisole permettent de contrôler l'activité et le niveau de phosphorylation du canal CFTR. Toutefois, ces molécules ne semblent pas pouvoir agir dans toutes les cellules. De plus, dans un modèle de souris transgéniques présentant la mutation G551D/GS51D, le bromotétramisole n'a pas eu l'effet activateur attendu. - Les benzimidazolones (NSOO4) (Gribkoff et al, 1994). Ces composés, dérivés du noyau imidazole comme le lévamisole peuvent, dans certaines conditions, et notamment lorsque le canal CFTR a été phosphorylé, ouvrir le canal. Les benzimidazolones sont toutefois également activateurs de nombreux canaux potassium (Olesen et al., 1994) et sont, de ce fait, peu spécifiques du canal CFTR. - Les xanthines substituées comme 1TBMX (3-isobutyl-l-méthyl- xanthine) ou la théophylline sont d'abord connus comme des inhibiteurs des phospho- diesterases intracellulaires (enzymes de dégradation de l'AMPc), de phosphatases ainsi que des antagonistes des récepteurs membranaires fixant l'adénosine ; elles agissent en outre sur la mobilisation du calcium intracellulaire. Indépendamment de ces propriétés ce sont des activateurs du canal CFTR (Chappe et al., 1998). Le méca- nisme d'action des xanthines sur le CFTR est encore mal connu mais pourrait impliquer leur fixation sur les domaines de fixation des nucléotides (NBD1 et NBD2). - Les benzo(c)quinolizinium (Demande internationale PCT WO 98/05642 ; Becq et al., 1999) qui sont davantage spécifiques du CFTR mais peuvent induire des effets indésirables ; en effet, ces molécules activent le canal CFTR par une voie indépendante de l'AMPc. Cependant, à l'heure actuelle, les tests de toxicité relative à cette famille de molécules n'ont pas encore été effectués et il n'est pas improbable que ces molécules puissent se révéler avoir des effets toxiques sur l'animal. Ainsi, l'ensemble des traitements actuellement préconisés, soit manquent de spécificité, soit entraînent trop d'effets indésirables. C'est pourquoi la Demanderesse s'est donné pour but de pourvoir à des médicaments qui activent spécifiquement le canal chlorure CFTR, tout en ne modifiant pas le taux de base de l'AMPc, destinés au traitement de pathologies associées à des troubles des flux ioniques transmembranaires, notamment de chlorure, et notamment dans les cellules épithéliales chez l'homme ou l'animal. La présente invention a plus particulièrement pour but de fournir de nouveaux médicaments susceptibles d'être utilisés dans le cadre du traitement de la mucoviscidose, des cas de "mucoviscidose atypiques" (asthme, sinusites chroniques, bronchectasies...), de la prévention ou du traitement des obstructions des voies bronchiques ou des voies digestives (notamment pancréatique ou intestinale), de maladies cardio-vasculaires ou encore rénales. Les Inventeurs ont en effet trouvé, de manière surprenante, que certains n-alkanols activent spécifiquement le canal chlorure CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator). L'activité du canal CFTR est mesurée à l'aide de la technique d'efflux d'iodure radioactif (125I) ou de la technique de patch- clamp. L'ordre d'activation de CFTR par les n-alkanols est hexanol-Kheptanol- Koctanol-Koctanol-2<decanol-l (1 mM). La présente invention a, en conséquence, pour objet l'utilisation des n-alkanols à chaînes hydrocarbonées linéaires, ramifiées ou non, ou cycliques en C6- Cio, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des pathologies associées à des troubles des canaux chlorure CFTR (flux chlorures transmembranaires), notamment dans les cellules épithéliales, chez l'homme ou l'animal. Le fait que les n-alkanols en CÔ-CK) ne modifient pas le niveau d' AMPc des cellules est un avantage pour au moins deux raisons : - cela est en faveur d'une spécificité d'interaction entre les n- alkanols et le canal CFTR - cela permet d'éviter des effets secondaires et non spécifiques qui peuvent être induits par une augmentation d'AMPc dans les cellules. Selon un mode de réalisation avantageux de ladite utilisation, lesdits n-alkanols sont des n-alkanols à chaînes hydrocarbonées linéaires, ramifiées ou non, dans lesquels le groupe OH est en position 1 (alcool primaire) ou en position 2 (alcool secondaire). Selon un autre mode de réalisation avantageux de ladite utilisation, lesdits n-alkanols sont des n-alkanols à chaînes hydrocarbonées cycliques portant un ou plusieurs groupements alcool (cyclohexane, par exemple). Les n-alkanols présentent, dans cette application, un certain nombre d'avantages : - aucune activation par les n-alkanols n'est détectée dans des cellules CHO contrôles qui n'expriment pas de CFTR, alors que l' activation de CFTR par les n-alkanols dans des cellules CHO Chinese Hamster Ovary) exprimant le canal CFTR est bloquée par l'ajout de glibenclamide (100 μM), utilisé pour bloquer spécifique- ment le canal CFTR. - les n-alkanols ne modifient pas le niveau de base d'AMPc ; les n- alkanols activent ainsi spécifiquement le canal CFTR par une voie indépendante de l'AMPc. L'activation du CFTR par les n-alkanols est indépendante de l'effet potentiel de ces molécules sur le découplage cellulaire. - les n-alkanols agissent par un mécanisme indépendant de la protéine kinase C. Parmi les n-alkanols, c'est surtout l'octanol qui a déjà été proposé dans de nombreuses applications : 1. comme molécules anesthésiques ; il exerce des effets complexes sur les membranes biologiques. Une théorie physico-chimique avait été avancée pour expliquer la puissance effectrice des anesthésiques. L'efficacité des anesthésiques augmenterait en fonction de leur solubilité dans les graisses et serait une fonction linéaire du coefficient de partition octanol-eau (la loi de Meyer-Overton sur l'anesthésie). En fait les mécanismes impliqués dans les effets des n-alkanols ne sont pas élucidés. Cependant, deux hypothèses générales ont été proposées pour expliquer les effets des n-alkanols sur les protéines associées aux membranes biologiques : - La première suggère que les n-alkanols altèrent les propriétés physiques de la membrane, propriétés nécessaires au fonctionnement normal des protéines membranaires. - La deuxième suggère que les n-alkanols se fixent directement dans des régions hydrophobes spécifiques des protéines (Mascia et al., 2000). II est probable que les deux mécanismes interviennent. Cependant, c'est actuellement la deuxième hypothèse qui retient l'intérêt, la première ayant été contredite par des expériences qui montrent que les perturbations de la fluidité membranaire, engendrées par les n-alkanols, étaient mimées par une augmentation de température corporelle (fièvre), sans pour autant observer les mêmes effets sur l'activité électrique. Une caractéristique commune de l'action de ces molécules est la modulation du signal électrique qui est due à l'altération de la conductance membranaire par les canaux ioniques. 2. dans la régulation du récepteur-canal Cl" au GABA (acide gamma-aminobutyrique) (Narahashi et al., 1998 ; Marszalec et al., 1994 ; Nakahiro et al., 1991). Ces récepteurs sont exprimés au niveau du système nerveux central. 3. comme broncho-dilatateurs : les n-alkanols interviennent dans la relaxation des muscles lisses des voies aériennes en diminuant notamment la concentration intracellulaire de calcium ([Ca2+]j) (Sakihara et al., 2002). 4. action au niveau des jonctions cellulaires en altérant la conductance des jonctions communicantes dans de nombreux tissus y compris le tissu épithé- lial (Weingart et al., 1998) ; cet effet concerne plus spécifiquement les agents lipo- philes, tels que les n-alkanols â longue chaîne. Le mécanisme moléculaire résultant du découplage cellulaire demeure obscur. 5. Les alcools tel que l'octanol, comme agents anti-émulsifiants, ont déjà été utilisés, en aérosol, chez des patients souffrant d'oedèmes pulmonaires (Miller et al., 1973), mais leurs mécanismes d'action demeurent inconnus. L'utilisation de certains n-alkanols, dans le traitement des pathologies associées à des troubles des flux ioniques transmembranaires de chlorure dans les cellules épithéliales et notamment de la mucoviscidose et des mucoviscidoses atypiques vient d'être trouvé par les Inventeurs. En effet, de manière surprenante, les n-alkanols en Cβ-Cto, notamment nébulisées dans les bronches des patients sous forme d'aérosol ou de nébulisat, activent ou potentialisent l'activité de canaux CFTR sauvages ou mutés mais présents à la membrane des cellules notamment chez des patients atteints de mucoviscidose. L' activation du canal CFTR par les n-alkanols, pourrait en outre favoriser un effet broncho-dilatateur au niveau des fibres musculaires lisses des bronches et bronchioles, et contribuer à l'amélioration de la fonction respiratoire des patients atteints de mucoviscidose aussi bien que des patients atteints d'insuffisance respiratoire, non liée à une mucoviscidose, telle que l'asthme. De manière générale, lesdits n-alkanols peuvent être administrés par voie parentérale : administration intradermique, intraveineuse, intramusculaire ou sous-cutanée ; par voie intra nasale et buccale : aspiration ou nébulisation par aérosol ; par voie orale ; par voie sublinguale. De manière préférée, lesdits n-alkanols sont administrés sous une forme adaptée à une administration intra nasale ou buccale, de manière à obtenir un contact direct entre lesdits n-alkanols et la surface des muqueuses broncho-pulmonaires. Par exemple, lesdits n-alkanols sont présentés sous une forme liquide, pour une administration sous la forme d'un aérosol ou sous la forme d'un nébulisat, et ce à l'aide d'un dispositif de nébulisation, du type de ceux utilisés aussi bien dans le traitement de l'asthme que dans celui de la mucoviscidose. Selon un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, lesdits n-alkanols sont associés à au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable adapté à ladite administration intra nasale ou buccale. Selon un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, lesdits n-alkanols sont de préférence administrés à une concentration comprise entre 0,001 % et 0J % (v/v), correspondant à une valeur comprise entre 10 et 1000 ppm (parties par million), soit de 10 mg/kg à 1 g/kg. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en œuvre de l'utilisation objet de la présente invention ainsi qu'aux dessins annexés dans lesquels : - la figure 1 illustre : (A) Comparaison de l'effet de l'octanol-1 et de la FSK sur l'efflux de I25I (% en ordonnée) en fonction du temps (min, en abscisse) dans les cellules CHO-CFTR(+). (B) Effet de l'octanol-1 et de la FSK sur l'efflux de 125I (% en ordonnée) en fonction du temps (min en abscisse) dans les cellules contrôles CHO-CFTR(-). (C) Effet de l'octanol-1 (0,25 à 5 raM) et de la FSK (5 μM) sur l'efflux de I (vitesse d'efflux en ordonnée) dans les cellules contrôles CHO CFTR(-) (D) Effet de l'inhibition spécifique de CFTR par 100 μM de glibenclamide sur l'efflux de I (vitesse d'efflux en min" en ordonnée) stimulé par l'octanol-1, la FSK ou l'octanol-1 et la FSK, dans les cellules CHO-CFTR(+). - la figure 2 illustre l'effet de doses croissantes (en abscisse) de FSK ou d'octanol-1 sur l'efflux de 125I (vitesse d'efflux en min"1 en ordonnée) dans les cellules CHO-CFTR(+). - la figure 3 illustre : (A) Effet de la FSK (1 μM) en présence et en l'absence de glibenclamide (100 μM) sur le courant enregistré en configuration cellule entière, représentant l'activation du canal CFTR. (B) Effet de l'octanol-1 (1 mM) sur le courant induit par l'activation de CFTR, en présence et en l'absence de glibenclamide (100 μM) pour inhiber spécifiquement le canal CFTR. L'enregistrement est effectué dans les cellules CHO-CFTR(+), n = 4. - la figure 4 illustre : (A) Effet de la longueur de la chaîne hydrocarbonée des n-alkanols (en abscisse) dans l'activation de l'efflux de I25I (vitesse d'efflux en min"1 en ordonnée). (B) Effet de l'octanol-2 sur l'activation de l'efflux de I (vitesse d'efflux en min" en ordonnée). - la figure 5 illustre l'effet de l'octanol-1 (1 mM) et de l'acide 18- alpha glycerrhetinique (α-GA 10 μM) sur la réponse calcique induite par une stimulation d'ATP qui met enjeu la communication intercellulaire. - la figure 6 illustre l'effet du découplage cellulaire dans l'activation de l'efflux de 12DI (% en ordonnée), par une application d'acide 18-alpha glycerrhetinique (a-GA 10 et 100 μM) (n = 12), en comparaison à l'effet de l'octanol-1. - la figure 7 illustre : (A) Effet de l'inhibition de la protéine kinase A par du H-89 (30 μM, 30 min) sur l'activation de l'efflux de I (taux d'efflux en min" en ordonnée) induite par l'octanol-l (1 mM), la FSK (1 μM) ou une co-stimulation octanol-1 + FSK. (B) Effet de l'inhibition de la protéine kinase C (GF109203X, 100 nM, 30 min) sur l'activation de l'efflux de I (taux d'efflux en min" en ordonnée) induite par l'octanol-l (1 mM). - la figure 8 illustre l'effet des n-alkanols sur le niveau de l'AMPc intracellulaire total en comparaison au niveau basai et à une stimulation par de la FSK (5 μM). - la figure 9 illustre : (A) Effet de l'octanol-l (1 mM) sur l'efflux d'iodure (min"1) en fonction du temps (min) dans les cellules épithéliales humaines d'origine bronchiques Calu-3, avec (n = 8) ou sans prétraitement par du glibenclamide (100 μM, 1 heure) (n = 8), et avec (n = 8) ou sans prétraitement par du DIDS (500 μM, 1 heure) (n = 8). La flèche représente le moment où l'octanol-l (1 mM) est ajouté, avec ou sans glibenclamide et avec ou sans DIDS. (B) L'effet maximum de l'octanol-l est normalisé à 100 %. Effet du traitement par du DIDS (500 μM, 1 heure) ou du glibenclamide (100 μM, 1 heure) sur la réponse maximale de l'octanol-l, le niveau basai est indiqué. (Test t : *** P < 0.001 ; ns : non significatif). (C) Effet de doses croissantes (en abscisse) d'octanol-1 en présence ou non de FSK (1 μM) sur l'efflux de 125I (vitesse d'efflux en min"1 en ordonnée) dans les cellules Calu-3. (D) Courbe dose-réponse d'octanol-1 (n = 8 pour chaque concentration testée) en présence ou en absence de FSK (1 μM), représentée en % du maximum d' activation obtenue pour 10 mM d'octanol-1. La concentration de demi-effet (EC5o) de l'octanol-l est de 512 μM en présence de FSK (1 μM) et de 1,14 mM en absence de FSK (1 μM). - la figure 10 illustre : (A) Effet de l'octanol-l (1 mM) (n = 8) ou d'un cocktail de drogues utilisé pour activer de façon maximale le canal muté CFTR- ΔF508 (FSK 10 μM plus génistéine (GST) 30 μM) (n = 8) sur l'efflux d'iodure (min" l) en fonction du temps (min) dans les cellules épithéliales bronchiques humaines JME/CF15 extraites à partir de patients atteints de mucoviscidose. La flèche repré- sente le moment où l'octanol-l (1 mM) ou la FSK 10 μM + GST 30 μM sont ajoutés. (B) Représentation du pourcentage d'activation de CFTR-ΔF508 obtenu avec l'octanol-l (1 mM) par rapport à l'activité maximale obtenue avec le cocktail FSK 10 μM + GST 30 μM, qui est normalisée à 100 % de la réponse maximale. (C) Effet du prétraitement par du glibenclamide (100 μM, 1 heure) (n = 8) ou du prétraitement par du DIDS (500 μM, 1 heure) (n = 8) sur la réponse maximale (normalisée à 100 % d'activation) obtenue avec 1 mM d'octanol-1 (Test t : *** P < 0.001 ; ns : non signi- ficatif). - la figure 11 illustre la réversibilité de l'effet de l'octanol-l (1 mM) sur l'activation de CFTR étudiée par patch-clamp en configuration cellule entière dans les cellules CHO-BQ1. Famille de courants évoquée dans une cellule CHO-BQ1 par des dépolarisations successives entre -80 et +15 mN à partir d'un potentiel de maintien de -60 mN et par incrémentation de 5 mN, en absence (contrôle), en présence d'octanol-1 (1 mM) et après 15 min de lavage de l'octanol-l par un milieu salin physiologique de rinçage. - la figure 12 illustre la structure des n-alkanols en C2-CK). Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.
Exemple : Mise en évidence des propriétés des n-alkanols comme ouvreurs ou activateurs de CFTR 1) Méthodes expérimentales. 1 J) Cellules en culture. Les études sur la CFTR sont d'une part réalisées sur des cellules CHO (Chinese Hamster Ovary cells) qui expriment la protéine CFTR humaine recombinante (CHO-CFTR(+)) (Riordan et al., 1989). Ces cellules sont cultivées à 37°C dans une étuve saturée en eau contenant 5% de CO2 dans du milieu αMEM additionné de sérum de veau foetal (7,5 %), de 2 mM glutamine, de 50 I.U/ml de pénicilline et de 50 μg/ml de streptomycine. Les cellules qui n'expriment pas la CFTR sont notées CHO-CFTR(-) et sont cultivées dans du milieu DMEM/F12 dans les mêmes conditions que précédemment. Les études de CFTR sont aussi réalisées sur les cellules Calu-3 (ATCC n° HTB-55) qui sont des cellules épithéliales pulmonaires humaines exprimant de façon endogène le canal CFTR. Ces cellules sont cultivées dans les mêmes conditions de culture que les cellules CHO. L'étude du canal CFTR muté est réalisée sur les cellules JME/CF15, cellules épithéliales extraites de voies aériennes respiratoires de patients atteints de mucoviscidose (homozygote ΔF508) (Jefferson et al., 1990). Ces cellules expriment donc le canal CFTR muté ΔF508. Ces cellules sont cultivées dans les mêmes conditions que précédemment mais le milieu de culture est supplémenté avec un mélange hormonal contenant : adénine (180 μM), insuline (5 μg/ml), transférine (5 μg/ml), hydrocortisone (1,1 μM), triiodothyronine (2 nM), épinéphrine (5,5 μM), facteur de croissance épidermique (1,64 nM). 1.2) Technique du patch-clamp. appliquée à l'étude des cellules en culture. La technique du patch-clamp consiste à appliquer une pipette ou une microélectrode de verre à la surface d'une cellule. En aspirant légèrement, il est possible de faire adhérer la membrane au verre. Un petit morceau de membrane (patch) est ainsi isolé au bout de la pipette : c'est le principe du patch-clamp (O.P. Hamill et al. Pflûgers Arch., 1981, 391, 85-100 ; R. Penner, A Practical Guide to Patch Clamping, 1995, In Single Channel Recording, 2ème édition (Eds. B. Sakamnn et al.) Plénum Press, New York, 3-30). Pour ce faire, la pipette de patch-clamp doit avoir une pointe de l'ordre de 1 μm de diamètre et une résistance de l'ordre de 1-5 MΩ. La résistance d'une pipette ou d'une microélectrode permet d'apprécier la finesse de la pointe : plus la résistance est grande, plus la pointe est fine ou l'électrode est bouchée. Le diamètre de la pipette de patch-clamp ne permet pas de pénétrer dans la cellule mais par contre, il permet effectivement d'emprisonner un morceau de membrane dans la pointe. Des interactions entre la membrane et le verre vont se former, aidées par une légère succion ou pression négative de la pipette. La qualité de cette interaction (ou scellement) est également appréciée en mesurant la résistance entre le verre et la membrane. Pour mesurer des courants globaux en configuration cellule entière, une résistance de scellement de 1 GΩ est suffisante. De manière générale, on mesure des enregistrements de courant électrique à travers un patch contenant, par exemple, un canal. Le potentiel de membrane imposé (Ec|amp) est généralement en millivolts. Lorsque le canal est fermé le courant oscille faiblement autour d'un niveau de base (état F). Cet infime courant de base circule dans les « fuites » entre le patch et l'extrémité de la pipette. Lorsque le canal s'ouvre (état O), le courant saute à un autre niveau, puis revient au niveau de base quand le canal se ferme et ainsi de suite. Les mesures peuvent être réalisées dans l'une des configurations suivantes : cellule attachée (cell-attached), cellule entière (whole-cell), patch excisé intérieur-extérieur (inside-ouf) ou patch excisé extérieur-extérieur (outside-ouf). Les expériences de patch-clamp sont effectuées sur des cellules confluentes. De manière plus précise, les boîtes de culture (support des cellules) sont placées dans une cuve d'expérimentation (volume 1 ml) sur la platine d'un microscope inversé (Nikon) équipé avec un éclairage en contraste de phase. La configuration cellule entière (whole-cell) est utilisée pour l'enregistrement des courants cellulaires (Hamill et al., 1981). Les expériences sont réalisées à température ambiante (20-22°C). Les courants sont amplifiés avec un amplificateur Axopatch 200B (Axon Instrument LTd) possédant un filtre passe-bas de 2-5 kHz (filtre Bessel à 6 pôles) et enregistrés sur le disque dur d'un ordinateur PC après digitalisation à 10-25 kHz. La fabrication des pipettes s'effectue à partir de tubes de verre de 1 mm de diamètre (Clark Electromedical Instrument) en quatre étapes avec une étireuse horizontale (Bruwn Flaming 97, CA). Les pipettes, remplies d'une solution intracellulaire contenant en mM : 60 KCl; 80 NMDG (N-méthyl-G-glucamine); 10 HEPES ; 5 EGTA ; CaCl2 1; MgATP 4; Na3GTP 0,2; pH 7,4 titré avec KOH), ont une résistance de 5 MΩ. Les potentiels sont exprimés comme la différence entre le potentiel de l'électrode de patch et celui du bain. En configuration cellule entière, ils représentent le potentiel de la membrane de la cellule. Les potentiels de jonction qui se forment entre l'électrode d'enregistrement et le milieu extracellulaire sont annulés avant le contact de l'électrode avec la cellule. Le potentiel d'inversion du courant chlore est obtenu à partir de l'équation de Nernst (Erev = (RT/F) log ([Cl]i/[Cl]e)) ; i et e concentration ionique intracellulaire et extracellulaire, R, T et F ont leur signification habituelle. Les relations courant- voltage à l'état stationnaire sont déterminés en utilisant des rampes lentes (20 mV/.s) de voltage en condition de voltage imposé. La solution extracellulaire d'enregistrement est constituée (en mM) : 110 NaCl ; 23 NaHCO3 ; 3 KCl ; 1,2 MgCl2 ; 2 CaCl2 ; 5 HEPES ; 11 D-glucose; gazée avec du CO2 5 % - 02 95 % ; pH 7,4. 1.3) Mesure des flux de traceurs radioactifs appliquée à l'étude des cellules épithéliales en culture. Le canal CFTR étant perméable aux halogénures (Br"> Cl"> I" > F"), la mesure d'efflux d'iodure radioactif 125I s'est révélé être une technique efficace pour mesurer l'activité du canal CFTR (Chang et al., 1998). Cette technique permet de e suivre la cinétique de sortie de l'iodure radioactif I. Les cellules sont cultivées dans des plaques 24 puits avec une dilution au 1/10 après passage. Le quatrième jour de culture, les drogues à tester sont mises en solution en fonction de la concentration voulue, à 37°C, dans du milieu B à pH 7,4, contenant en mM : 137 NaCl, 5,36 KCl, 0,8 mM MgCl2 1,8 mM CaCl2, 5,5 glucose et 10 HEPES-NaOH. Les puits sont lavés 4 fois avec 500 μl de milieu B. La solution est ensuite remplacée par 500 μl de solu- tion de charge contenant 1 μM Kl et 0.5 μCi de 125INa/ml pendant 30 min. La cinétique de sortie de i est réalisée après avoir éliminé la solution de charge et lavé 4 fois les puits par 500 μl de milieu B. Pour la cinétique de sortie de I, 500 μl de milieu B contenant ou non les molécules à tester sont incubés 30 sec dans le puits et récupérés dans un tube à hémolyse pour être remplacés par 500 μl de milieu B conte- nant ou non les molécules à tester. L'opération est répétée toutes les 30 s pendant 2 à 6 min. A la fin de l'efflux, les ions intracellulaires sont extraits en ajoutant 1 ml d'acide trichloracétique (7,5 %) sur la couche cellulaire. Tous les échantillons sont comptés dans un compteur gamma (Kontron). Les protéines précipitées sont solubilisées dans 0,1 N NaOH et quantifiées en utilisant un test colorimétrique. 1.4) Analyse des données Le traceur contenu dans la couche cellulaire au début de l'efflux est calculé comme la somme des échantillons et des extraits comptés. Les courbes d'efflux sont construites en exprimant le pourcentage du contenu restant dans la couche cellulaire (1%) par rapport au temps. Les constantes de taux d'efflux (k, min"1) stimulé ou non sont déterminés en lissant les courbes d'efflux en une fonction monoexponentielle 1% = 100*exp(-kt) en utilisant une régression linéaire du logarithme népérien des données, k est utilisé pour calculer l'iodure libéré dans le milieu par rapport au temps. L'hypothèse est faite que, en présence d'un stimulateur, l'efflux est la somme de deux efflux d'iodure survenant en parallèle : un efflux basai et un efflux stimulé caractérisé respectivement par les constantes kb et ks. L'efflux net total est alors décrit par l'équation It %=100*(l-exp(-ktt)) où kt est la somme de kb et ks. Finalement, ks calculée comme kt-kb est utilisée pour établir une relation dose-réponse pour des antagonistes. Les données sont exprimées comme des moyennes ± SD, et le test-t est utilisé pour déterminer les significativités. Les courbes concentration-réponse d'agonistes ou d'antagonistes sont lissées en utilisant l'équation hyperbolique Y = Ymax* X/(EC5o + X), où Y est la réponse. Y commence au basai et va jusqu'au plateau (Ymax), X est la concentration et les valeurs de demi-effet (EC sont calculées en utilisant GraphPad Prism v3.0 (GraphPad Software). 1.5) Dosage de l'AMPc intracellulaire total Les cellules CHO sont cultivées . pendant quatre jours dans une plaque de culture de 24 puits. Au quatrième jour de culture, chaque puits est rincé deux fois avec 500 μl de milieu B, et 500 μl de ce tampon contenant la molécule à tester sont ajoutés à chaque puits. Après 5 min d'incubation à 37°C, la réaction est arrêtée en ajoutant un tampon de lyse cellulaire. La lyse cellulaire est vérifiée au bleu Trypan. La quantité d'AMPc contenue dans les cellules est déterminée en utilisant le kit de dosage Enzyme Immuno Assay (Amersham Biotechnology). Le niveau d'AMPc est exprimé en pmoles/puits ± SD. 1.6) Imagerie cellulaire et mesure de la concentration intracellulaire de Ca2+ (TCa2+1Λ Les mesures de Ca -2+ sont réalisées en présence de fura-2 (sonde fluorescente imperméante) qui lie le Ca . Les cellules sont incubées dans du milieu de culture DMEM/F12 sans sérum en présence de la forme perméante du fura-2 (fura- 2/AM, 2,5 μM) pendant lh à 37°C. Les cellules placées sur la platine d'un microscope (Olympus) à épifluorescence (objectif 20 X), sont perfusées avec les solutions à tester (e.g ATP, octanol). Elles sont séquentiellement illuminées à 340 nm et 380 nm et la fluorescence émise (F) est mesurée à 510 nm. Elle est détectée via une caméra CCD 12-bits (Sony) connectée à une unité informatique pour le traitement des données (TILL Photonics). La concentration de Ca2+ intracellulaire [Ca2+]j est calculée en utili- sant l'équation de Grynckiewicz (Grynckiewicz et al, 1985) : [Ca2+];=Kd*(R- Rmin/Rmax-R. à partir de l'analyse ratiométrique R (340/380 nm) de la fluorescence (TILL Vision) ; Rmax et Rmin désignent le rapport de fluorescence mesuré en présence ou en l'absence de Ca2+. 2) Résultats Les concentrations des n-alkanols mises en oeuvre vont de 0J à 10 mM. Ces concentrations représentent des proportions finales (v/v) de 0,001 % (pour 0,1 mM d'alcools) à 0,1 % au maximum (pour 10 mM d'alcools). 2J) E 'octanol active spécifiquement le canal CFTR Les molécules testées sont les n-alkanols et notamment l'octanol-l, qui ont été testées pour leur capacité à activer le canal CFTR. Le criblage des molécules en tant qu'ouvreurs du canal CFTR a été réalisé en mesurant leur effet sur l'efflux d'iodure radioactif 125I et sur les courants de chlorure transmembranaires. Ces données ont été complémentées par la mesure du taux d'AMP cyclique (AMPc) intracellulaire et de ses variations dans diverses situations expérimentales L'évaluation de l'effet d' activation du CFTR par les n-alkanols est tout d'abord réalisée sur la lignée cellulaire CHO-CFTR(+). Les cellules CHO- CFTR(-) n'exprimant pas la protéine CFTR ont été utilisées comme cellules contrôles. 1 LΑ23187 (2 μM) (un ionophore de calcium) est sans effet sur l'efflux de I aussi bien dans les cellules CHO-CFTR(+) que CHO-CFTR(-), montrant qu'il n'y a pas de canaux Cl" dépendants du calcium intracellulaire (Chappe et al., 1998). Le canal CFTR étant principalement régulé par des protéines kinases A, les expériences contrôles ont fait appel à la FSK pour stimuler le taux d'AMPc intracellulaire. La figure 1 A montre une activation de CFTR obtenue par une application soit de 1 μM de FSK (FSK), d'octanol-1 (1 mM) ou une application combinée de FSK (1 μM) et d'octanol-1 (1 mM) dans des cellules CHO-CFTR(+). L'activation du canal CFTR, mesurée par l'efflux de 125I induit une augmentation de l'amplitude de l'efflux d'iodure (exprimé en % de 125I libéré dans le milieu) et de la vitesse de sortie de 125I. Sur la figure 1B, les expériences contrôles permettant d'évaluer la spécificité des molécules testées sur l'activité du canal CFTR ont été réalisées sur des cellules CHO-CFTR(-), en présence ou non d'activateurs (FSK 1 μM, octanol-1 1 mM). Dans ces cellules CHO-CFTR(-), l'octanol-l (0,1 à 5 mM) et la FSK (5 μM) ne modifient pas significativement le niveau basai de l'efflux de I (figure 1C). L'effet activateur de l'octanol-l aussi bien que de la FSK (1 μM) ou d'une application combinée de FSK et octanol-1 sur CFTR est complètement inhibé par l'addition de glibenclamide (100 μM) communément utilisé pour inhiber spécifiquement le canal CFTR (Figure 1D). Ces résultats confirment la spécificité de l'octanol-l sur l'activité de CFTR. Les cellules CHO-CFTR(+) sont ensuite stimulées avec des concen- trations croissantes de FSK ou d'octanol-1, et les constantes de vitesses d'efflux de I sont mesurées. La figure 2 représente une courbe dose-réponse d'octanol-1 (0,1 à 5 mM) ou de FSK (0,1 à 5 μM) sur l'activation de CFTR. On peut voir sur la figure 2 que l'activation de CFTR par la FSK ou par l'octanol-l est dépendante de la concentration avec une EC5o d'environ 0,5 μM pour la FSK et de 0,5 mM pour l'octanol-l. Les effets de l'octanol-l sur l'activation du CFTR sont observables pour des concentrations d'octanol-1 de 0,3 mM à 5 mM, avec un plateau atteint à 1 mM et une dose de demi-activation de 0,5 mM. De même, l'activation de CFTR par la FSK ou l'octanol-l est observée en patch-clamp, en configuration cellule entière. Les figures 3A et 3B montrent respectivement que la FSK (1 μM) et l'octanol-l (I mM) produisent une augmentation d'environ 10 fois de la conductance membranaire par rapport au contrôle. Le potentiel de réversion du courant induit par la FSK ou par l'octanol-l est de 1 ± 0,6 mV, montrant que le Cl" est l'ion principal qui contribue à ce courant. Ce courant induit par la FSK ou par l'octanol-l est complètement inhibé par l'application de glibenclamide montrant que c'est bien le canal CFTR qui est impliqué dans le courant induit soit par la FSK soit par l'octanol-l. La figure 3B montre qu'une application d'octanol-1 seul (1 mM), c'est-à-dire sans FSK, induit une pleine activation du canal CFTR. 2.2) L 'octanol-l stimule spécifiquement le canal CFTR dans des cellules épithéliales bronchiques humaines (Calu-3). La capacité de l'octanol-l à stimuler CFTR dans une lignée de cellules épithéliales bronchiques humaines (Calu-3) a également été testée. Comme le montre la figure 9A l'octanol-l active la sortie d'iodure dans les cellules Calu-3. Cet efflux activé par l'octanol-l est fortement bloquée par un traitement (1 heure) par le glibenclamide (100 μM), un inhibiteur du canal CFTR, alors qu'un traitement (1 heure) par 500 μM de DIDS (4,4'-diisothiocyanatostilbène-2,2'-acide disulfonique), utilisé pour bloquer les canaux Cl" sauf le canal CFTR qui y est insensible, est sans effet (Figure 9B). L'ensemble de ces résultats montre que l'octanol-l active spécifiquement le canal CFTR humain endogènement exprimé dans les cellules épithéliales bronchiques humaines Calu-3. De plus, comme observé dans les cellules CHO- CFTR(+) (voir figure 1), l'octanol-l active le canal CFTR humain d'une manière dose-dépendante (0,1 à 10 mM) dans les cellules Calu-3 (Figures 9C, D). Enfin, une courbe dose-réponse d'octanol-1 réalisée en présence de FSK (1 μM) déplace vers la gauche la courbe dose-réponse d'octanol-1, indiquant une potentialisation par la forskoline de l'activation de CFTR par l'octanol-l. En outre, l'activation du canal CFTR par de l'octanol-l pour des concentrations supérieures à 0,5 mM est supérieure à celle obtenue par la FSK (1 μM), puisque l'octanol-l potentialise l'activité du canal CFTR stimulé par la FSK (1 μM) (Figures 9C, D). 2.3) L 'octanol-1 active spécifiquement le canal CFTR muté ΔF508 dans des cellules épithéliale d'origine pulmonaire (CF15) de patients atteints de mucoviscidose homozygotes ΔF508. La capacité de l'octanol-l à activer le canal CFTR muté ΔF508 a été testée. La mutation ΔF508 est retrouvée chez plus de 70 % des patients atteints de mucoviscidose. Une grande majorité du canal CFTR muté ΔF508 est dégradée par le système ubiquitine-prόtéasome à l'intérieur de la cellule, et seulement une très faible quantité de canal muté arrive à la surface de la membrane où il peut être activé. Des cellules épithéliales bronchiques humaines JME/CF15 extraites à partir de patients atteints de mucoviscidose et homozygotes pour la mutation ΔF508 ont été utilisées. La molécule MPB-91, connue pour adresser un certain nombre de canaux CFTR-ΔF508 à la membrane plasmique, (Donner et al., 2001) a également été utilisée. Les canaux CFTR mutés ΔF508, présents à la membrane plasmique ont été stimulés, par l'octanol-l (1 mM). La figure 10A montre que l'octanol-l active spécifiquement le canal CFTR muté ΔF508. Un cocktail de stimulateurs (FSK 10 μM + génistéine 30 μM) permet d'obtenir l'activité maximale pour le canal muté CFTR-ΔF508. L'octanol-l (1 mM) est capable, à lui seul, d'activer environ 50 % de l'activité maximale du canal CFTR-ΔF508 muté (Figure 10B). Cette activation de CFTR-ΔF508 est inhibée par le glibenclamide (100 μM) alors qu'elle est insensible au DIDS (500 μM) (Figure 10C), démontrant que l'octanol-l stimule spécifiquement le canal CFTR muté ΔF508. De plus, l'octanol-l n'a aucun effet sur le niveau basai, lorsque le canal muté n'est pas présent à la membrane plasmique, montrant qu'il n'active pas d'autres conductances chlorure et qu'il est bien spécifique du canal CFTR. L'ensemble de ces résultats démontre que l'octanol-l est capable d'activer le canal CFTR muté ΔF508 dans des cellules épithéliales pulmonaires humaines de patients atteints de mucovisci- dose. L'octanol-l est ainsi d'un grand intérêt pour envisager un traitement pharmaco- thérapeutique de la mucoviscidose. 2.4) L 'effet activateur de l 'octanol-1 sur CFTR est réversible Nous avons enfin examiné à l'aide de la technique de patch-clamp en configuration cellule entière sur les cellules CHO-BQ1 qui expriment le canal CFTR humain, si l'effet de l'octanol-l (1 mM) sur les canaux CFTR était réversible. Comme indiqué dans la figure 11, on voit que l'octanol-l (1 mM) entraîne une augmentation de courant due à l'activation de CFTR. Après 15 min de lavage de octanol-1 (1 mM) par une solution saline physiologique, l'activation des canaux CFTR disparaît, indiquant que l'effet activateur de l'octanol-l sur CFTR est réversible. 2.5) Les n-alkanols à chaîne hydrocarbonée longue (C à Cw) activent le canal CFTR (voir figure 12 pour la structure des n-alkanols) L'effet d'autres n-alkanols que l'octanol-l sur l'activation de CFTR a également été testé. La figure 4A montre que l'utilisation de n-alkanols ayant des longueurs de chaînes hydrocarbonées égales ou supérieures à celles de l'hexanol-1 (C6) jusqu'au décanol-1 (C10), active significativement le canal CFTR. L'activation de CFTR augmente en fonction de la longueur de la chaîne hydrocarbonée (c'est-à- dire en fonction de l'hydrophobicité) de l'alcool. La figure 4 montre une activation croissante de la CFTR suite à l'application d'hexanol-1 (C6), d'heptanol-1 (C7), d'octanol-1 (C8), ou de décanol-1 (C10). Pour des n-alkanols ayant des chaînes hydro- carbonées courtes (éthanol, butanol-1), l'efflux de I n'est pas significativement différent de l'efflux non stimulé, indiquant que l'éthanol et le butanol n'activent pas le canal CFTR. Sur la figure 4B, on peut voir que l'octanol-2 active aussi la protéine CFTR. Ce qui montre que la position du radical OH sur la molécule en position 1 ou en position 2 n'est pas critique pour l'activation du canal CFTR. 2.6) E 'activation de CFTR par les n-alkanols n 'est pas due au découplage cellulaire L'octanol et les autres n-alkanols peuvent modifier le découplage cellulaire dû aux jonctions communicantes (jonction gap). Un tel découplage est mis en évidence dans des cellules CHO, en mesurant la réponse calcique induite par une application d'ATP. Pour ce faire, une molécule totalement différente des n-alkanols mais connue pour découpler les cellules, l'acide 18-alpha glycerrhetinique (α-GA), a été utilisée. Les figures 5A-C montrent que l'application d'α-GA (10 à 100 μM) ou d'octanol-1 (1 mM) découple bien les cellules comme le montre la réponse calcique induite par l'ATP. Mais aucun effet de (α-GA) sur l'activité du canal CFTR n'est observé (Fig. 6). L'activation de CFTR par les n-alkanols n'est donc pas due à leur propriété de découplage cellulaire. 2.7) L 'activité de la protéine kinase A est nécessaire à l'activation de CFTR par l 'octanol-l La phosphorylation du canal CFTR notamment par la protéine kinase A (PKA) a été montrée comme nécessaire pour la fonction et l'activation du canal. L'activation du canal CFTR par les n-alkanols est inhibée par le traitement avec du H-89 (30 μM), utilisé pour inhiber les PKA (Figure 5 A), ce qui montre qu'une phosphorylation constitutive du canal CFTR est nécessaire à son activation par l'octanol-l. De récentes études ont montré qu'une phosphorylation de CFTR par la protéine kinase C (PKC) pouvait être un pré-requis pour une activation de CFTR. L'octanol a été montré comme pouvant activer certains sous-types de PKC. Un inhibiteur puissant des PKC en présence d'octanol-1 a donc été utilisé. Dans ces conditions, l'activation de CFTR par l'octanol-l n'est pas inhibée (figure 7). Ces résultats montrent que l'octanol-l active bien CFTR par un mécanisme indépendant des PKC. L'octanol et les n-alkanols peuvent interagir directement avec le canal CFTR au niveau des sites hydrophobes de la protéine, afin d'induire une modification de conformation favorable à son activation. Les n-alkanols n'induisent pas d'augmentation d'AMPc, l'activation de CFTR par les n-alkanols n'est donc pas due à une élévation du taux d'AMPc induite par les n-alkanols. La littérature indique que les n-alkanols à chaîne longue ne sont pas des activateurs potentiels de l'adénylate cyclase et donc du niveau d'AMPc intracellulaire mais auraient plutôt un effet inhibiteur. La figure 8 présente les taux d'AMPc intracellulaire dans la cellule CHO-CFTR(+), mesurés après 5 min en présence de 5 μM ou 1 μM de FSK (activateur de l'enzyme de synthèse de l'AMPc ; adénylate cyclase), de 1 mM d'octanol-1, d'hexanol-1 ou d'éthanol. Alors que la FSK 1 μM ou 5 μM augmente significativement le niveau d'AMPc, ni l'octanol-l, l'hexanol-1 ou l'éthanol ne modifient le niveau basai d'AMPc. Appliqué seul, l'octanol-l déclenche l'activation du canal CFTR sans augmenter le niveau d'AMPc. Ces résultats montrent que l'octanol- et les autres n-alkanols à chaîne hydrocarbonée longue en C6 à CJO stimulent le canal CFTR par une voie indépendante de la voie de l'AMPc.
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Claims

REVENDICATIONS 1°) Utilisation des n-alkanols à chaînes hydrocarbonées linéaires, ramifiées ou non, ou cyclique en C6-Cκ), pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des pathologies associées à des troubles des canaux chlorure CFTR chez l'homme ou l'animal. 2°) Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que lesdits n-alkanols sont des n-alkanols à chaînes hydrocarbonées linéaires, ramifiées ou non, dans lesquels le groupe OH est en position 1 (alcool primaire) ou en position 2 (alcool secondaire). 3°) Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que lesdits n-alkanols sont des n-alkanols à chaînes hydrocarbonées cycliques portant un ou plusieurs groupements alcool. 4°) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que lesdites pathologies sont sélectionnées dans le groupe constitué par la mucoviscidose, les mucoviscidoses atypiques, et les obstructions des voies bronchiques ou des voies digestives. 5°) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que lesdits n-alkanols se présentent sous une forme adaptée à une administration intra nasale ou buccale. 6°) Utilisation selon la revendication 5, caractérisée en ce que lesdits n-alkanols sont présentés sous une forme liquide, pour une administration sous la forme d'un aérosol ou sous la forme d'un nébulisat. 7°) Utilisation selon la revendication 6, caractérisée en ce que lesdits n-alkanols sont associés à au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable adapté à ladite administration intra nasale ou buccale. 8°) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que lesdits n-alkanols sont administrés à une concentration comprise entre 0,001 % et 0,1 % (v/v), correspondant à une valeur comprise entre 10 et 1000 ppm (parties par million), soit de 10 mg/kg à 1 g/kg.
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