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WO2005097787A2 - Derives de benzothiazoles capables de moduler l’activite des cdk et leur utilisation comme agents anticancereux - Google Patents

Derives de benzothiazoles capables de moduler l’activite des cdk et leur utilisation comme agents anticancereux Download PDF

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WO2005097787A2
WO2005097787A2 PCT/FR2005/000761 FR2005000761W WO2005097787A2 WO 2005097787 A2 WO2005097787 A2 WO 2005097787A2 FR 2005000761 W FR2005000761 W FR 2005000761W WO 2005097787 A2 WO2005097787 A2 WO 2005097787A2
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benzothiazol
ester
acid
amino
benzenesulfonic acid
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WO2005097787A3 (fr
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Stéphanie Deprets
Anke Steinmetz
Odile Angouillant-Boniface
Daniel Bezard
Jidong Zhang
Yannick Benedetti
François CLERC
Original Assignee
Aventis Pharma S.A.
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Definitions

  • the present invention relates in particular to new chemical compounds, particularly new derivatives of benzothiazoles, the compositions containing them, and their use as medicaments.
  • the invention relates to new sulfonic esters of benzothiazoles exhibiting anticancer activity, via the modulation of the activity of proteins, in particular kinases.
  • Protein kinases are a family of enzymes that catalyze the phosphorylation of hydroxy groups of specific protein residues such as tyrosine, serine or threonine residues. Such phosphorylations can greatly modify the function of proteins; thus, protein kinases play an important role in the regulation of a wide variety of cellular processes, including in particular metabolism, cell proliferation, cell differentiation, cell migration or cell survival. Among the various cellular functions in which the activity of a protein kinase is involved, certain processes represent attractive targets for treating cancerous diseases as well as other diseases.
  • one of the objects of the present invention is to provide compositions having anti-cancer activity, by acting in particular with respect to kinases.
  • cyclin dependent kinases as well as Aurora-2 are preferred.
  • the progression of the cell cycle is often managed by cyclin dependent kinases (CDKs) which are activated by an interaction with proteins belonging to the cyclin family, activation which ends in the phosphorylation of substrates and finally by cell division.
  • CDKs cyclin dependent kinases
  • the endogenous CDK inhibitors that are activated (family of INK4 and KIP / CIP) negatively regulate the activity of CDKs.
  • normal cell growth is due to a balance between CDK activators (cyclins) and endogenous CDK inhibitors.
  • the expression or aberrant activity of several of these cell cycle regulators has been described.
  • Cyclin E activates the kinase Cdk2 which then acts to phosphorylate the protein pRb (retinoblastoma protein) resulting in an engagement in irreversible cell division and a transition to the S phase (PL Toogood, Medicinal Research Reviews (2001), 21 (6) ); 487-498.
  • the kinase CDK2 and may be CDK3 are necessary for progression into the G1 phase and entry into the S phase.
  • cyclin E they maintain the hyperphosphorylation of pRb to help progression from phase G1 to phase S.
  • CDK2 plays a role in the inactivation of E2F and is necessary for the realization of phase S (TD. Davies et al. (2001) Structure 9 , 389-3).
  • the CDK1 / cyclin B complex regulates the progression of the cell cycle between phase G2 and phase M.
  • the negative regulation of the CDK / Cyclin B complex prevents normal cells from entering the S phase before the G2 phase has been correctly and completely performed.
  • CAKs Cyclin-dependent kinase activators
  • This kinase named aurora2, STK15 or BTAK belongs to the family of serine / threonine kinases. Bischoff et al. have shown that Aurora2 is oncogenic, and is amplified in human colorectal cancers (EMBO J, 1998, 17, 3052-3065). This has also been exemplified in cancers involving epithelial tumors such as breast cancer.
  • the present invention relates to new benzothiazole derivatives. It thus relates to the use of benzothiazole derivatives as kinase inhibiting agents and more particularly as an anticancer agent. Among these, it preferably relates to the sulfonic esters of benzothiazoles. It also relates to the use of said derivatives for the preparation of a medicament intended for the treatment of humans.
  • Y1 can represent a sulfur atom
  • n can be zero
  • Z can be an acylamino group the groups X1, X2, X3, X4, are equal to H or can represent an alkylsulfonyoxy group.
  • • X represents a group chosen from a covalent bond, (Chbjn, with n equal to 1 or 2 • Ar represents an aryl or heteroaryl group; this group is optionally substituted by a group chosen from alkyl, halogen, NR- 1 R 2 (Ri and R 2 being chosen from hydrogen, alkyl or cycloalkyl groups or together may form a heterocyclic or heteroaryl radical, these groups being themselves optionally substituted), SOaalk, Salkyl, alkoxy, heteroaryl, or aryls • R represents a group chosen from hydrogen, an alkyl, cycloalkyl, heterocycloalkyl, aryl, heteroaryl, alkoxy, cycloalkoxy, heterocycloalkoxy, amino group; R may be optionally substituted by one or more groups chosen from the same radicals as those defined for R.
  • R 1 and R 2 are chosen in particular from hydroxy, heteroaryl, cycloalkyl, aminoalkyl groups.
  • alkyl group means straight or branched chains containing 1 to 10 carbon atoms.
  • cycloalkyl group means cyclic alkyl chains containing 3 to 10 carbon atoms.
  • heterocycloalkyl group means cyclic alkyl chains containing 3 to 10 carbon atoms and containing at least one heteroatom chosen from O, N or S.
  • R 2 group is understood to mean amino groups, preferably secondary, ie groups for which at least one of the substituents is hydrogen.
  • aryl and heteroaryl radicals means monocyclic radicals optionally comprising one or more heteroatoms chosen from O, N and S or radicals fused to another cycle comprising 5 or 6 members and optionally one to three heteroatoms chosen from O, N and S.
  • aryl or heteroaryl radicals mention may be made of phenyl, pyridyl, pyrimidine, triazine, pyrrolyl, imidazolyl, thiazolyl, furyl, thienyl, indolyl, azaindazolyl, isobenzofuranyl, isobenzothienyl, benzoxazolyl, benzothiazole groups. , arylamido, arylcarboxamide, aralkylamine, quinoleyl, isoquinoleyl, cinnolyl, quinazolyl, naphthyridyl, triazolyl or tetrazolyl. It is preferred to choose from the aryl and heteroaryl groups the phenyl, thienyl, pyrazolyl, imidazolyl groups which may be substituted.
  • the amino groups and the halogens are preferred, in particular chlorine and fluorine, thus among the aryl groups, the di and trifluorophenyls and the monoalkylamino phenyls are particularly preferred, the alkyl chain optionally being substituted by a hydroxy group , dialkylamino.
  • the compounds of the present invention can be easily prepared from 5-methoxy-benzothiazol-2-ylamine (commercial compound).
  • the starting product is demethoxylated in an acid medium, preferably in an acetic acid / aqueous hydrobromic acid mixture.
  • the 5-hydroxy-benzothiazol-2-ylamides (4) are obtained by reaction between 5-hydroxy-benzothiazol-2-ylamine (2) and an acid of formula (3) (R as defined in the general formula (I)) in the presence of a coupling agent such as HATU or HBTU and a base such as diisopropylethylamine or triethylamine in an appropriate solvent.
  • the sulfono-esters of formula (6) are obtained by reaction between the 5-hydroxy-benzothiazol-2-ylamides (4) and a sulfonyl chloride of formula (5) (X and Ar as defined in the general formula (I)) in an inert solvent (acetone, THF, dichloromethane, toluene) in the presence of a base such as triethylamine or pyridine.
  • the nucleophilic substitution of F by amines of formula (7) (R1R2 as defined in the general formula (I)) to yield the derivatives of formula (8) is carried out in a aprotic solvent such as N-methylpyrrolidone or dimethylformamide at a temperature varying from 90 to 130 ° C in a sealed tube or in the microwave.
  • a aprotic solvent such as N-methylpyrrolidone or dimethylformamide
  • the compounds of the present invention can be easily prepared from 5-methoxy-benzothiazol-2-ylamine (commercial compound).
  • the starting product is demethoxylated in an acid medium, preferably in an acetic acid / aqueous hydrobromic acid mixture.
  • the sulfono-esters of formula (4) are obtained by reaction between 5-hydroxy-benzothiazol-2-ylamine (2) and a sulfonyl chloride of formula (3) (X and Ar as defined in the general formula (I)) in an inert solvent (acetone, THF, dichloromethane, toluene) in the presence of a base such as triethylamine or pyridine.
  • an inert solvent acetone, THF, dichloromethane, toluene
  • the nucleophilic substitution of F by amines of formula (6) (R1 R2 as defined in the general formula (I)) to yield the derivatives of formula (7) is carried out in an aprotic solvent such as N-methylpyrrolidone or dimethylformamide at a temperature varying from 90 to 130 ° C in a sealed tube or in the microwave.
  • an aprotic solvent such as N-methylpyrrolidone or dimethylformamide
  • the carbamates (8) are obtained by reaction between the amines of formulas (4 and 7) and a chloroformate of formula (5) (R3 as defined in general formula (I)) in the presence of an organic base such as pyridine, the triethylamine, diisopropylethylamine or inorganic such as potassium carbonate in an appropriate solvent.
  • an organic base such as pyridine
  • potassium carbonate such as potassium carbonate
  • solvents that can be used we can cite tetrahydrofuran, dichloromethane and dioxane.
  • the temperature of choice for carrying out this reaction is between 0 ° C. and reflux.
  • an aprotic solvent such as N-methylpyrrolidone or dimethylformamide
  • the compounds according to the invention can be used in human therapy and more particularly in the treatment of cancer, more particularly cancers sensitive to inhibitors of Aurora-2 and to those of Cdk2.
  • the present invention will be more fully described with the aid of the following examples which should not be considered as limiting the invention.
  • the DCI spectra were carried out in chemical desorbtion-ionization (reactant gas: ammonia, Finnigan SSQ7000 device).
  • the electrospray spectra (ES + ) were performed on a Platform II device (Micromass).
  • LC / MS analyzes were carried out on a Micromass model LCT device connected to an HP 1100 device.
  • the abundance of the products was measured using an HP G1315A diode array detector over a wave range of 200-600 nm and a Sedex 65 light scattering detector.
  • Mass spectra mass spectra were acquired over a range of 180 to 800. The data were analyzed using Micromass MassLynx software.
  • the separation was carried out on a Hypersil BDS C18 column, 3 ⁇ m (50 ⁇ 4.6 mm), eluting with a linear gradient of 5 to 90% acetonitrile containing 0.05% (v / v) of trifluoroacetic acid ( TFA) in water containing 0.05% (v / v) TFA in 3.5 min at a flow rate of 1 mL / min.
  • TFA trifluoroacetic acid
  • Sedex 65 Mass spectra mass spectra were acquired over a range of 50 to 1500. The data were analyzed using Micromass MassLynx software. The separation was carried out on a 3.5 ⁇ m XTerral column (50 ⁇ 2.1 mm), eluting with a linear gradient of 5 to 95% acetonitrile in water containing 0.1% (v / v) of formic acid in 9 min at a flow rate of 0.7 mL / min. The total analysis time, including the column rebalancing period, is 9 min.
  • the separation was carried out alternately on two Waters Symmetry columns (Cis, 5 ⁇ M, 19x50 mm, catalog reference 186000210), one column being regenerated by a water / acetonitrile 95/5 (v / v) mixture containing 0.07 % (v / v) trifluoroacetic acid, while the other column was being separated. Elution from the columns was carried out using a linear gradient of 5 to 95% acetonitrile containing 0.07% (v / v) of trifluoroacetic acid in water containing 0.07% (v / v) d trifluoroacetic acid, at a flow rate of 10 ml / min.
  • one thousandth of the effluent is separated by an LC Packing Accurate, diluted with methyl alcohol at a flow rate of 0.5 ml / min and sent to the detectors, at a rate of 75% to the diode array detector, and the remaining 25% to the mass spectrometer.
  • the rest of the effluent (999/1000) is sent to the fraction collector where the flow is eliminated until the mass of the expected product is detected by the FractionLynx software.
  • the molecular formulas of the expected products are provided to the FractionLynx software which triggers the collection of the product when the detected mass signal corresponds to the [M + H] + ion and / or to the [M + Na] + .
  • the crude reaction product is purified by preparative LC / MS (basic medium (pH 9)) to lead, after lyophilization, to 21 mg of 4- (2-hydroxy-2-methyl-propylamino) - benzenesulfonic 2- (cyclopropanecarbonylamino) -benzothiazol-6 -yl ester (pale yellow solid).
  • the crude reaction product is purified by preparative LC / MS (basic medium (pH 9)) to lead, after lyophilization, to 63 mg of 4- (3-imidazol-1-yl-propylamino) -benzenesulfonic 2- (cyclopropanecarbonylamino) -benzothiazol- 6-yl ester (white solid).
  • the crude reaction product is purified by preparative LC / MS (basic medium (pH 9)) to lead, after lyophilization, to 61 mg of 4- (2-hydroxy-2-methyl-propylamino) -benzenesulfonic 2- (cyclopropane-carbonylamino) -benzothiazol-6-yl ester (beige solid).
  • reaction crude is purified by preparative LC / MS (basic medium (pH 9)) to lead after lyophilization to 66 mg of 4- (2-hydroxy-2-methyl-propylamino) - benzenesulfonic 2- (cyclopropane-carbonylamino) -benzothiazol-6-yl ester (beige solid).
  • the crude reaction product is purified by preparative LC / MS (basic medium (pH 9)) to lead, after lyophilization, to 36 mg of 4- (2-hydroxy-2-methyl-propylamino) - benzenesulfonic 2- (cyclo-propanecarbonylamino) -benzothiazol -6-yl ester (beige solid).
  • reaction medium is brought to dryness and the residue obtained is washed with dichloromethane and ethyl ether, resulting in 2.35 g of (6-Hydroxy-benzothiazol-2-yl) -carbamic acid tert-butyl ester (beige powder) with a yield of 77%.
  • 1 st step In a test tube with a stir bar, a solution of 4 - ⁇ [6- (4-Fluoro-benzenesulfonyloxy) -benzothiazol-2-ylcarbamoyl] -methyl ⁇ - piperidine-1-carboxylic acid tert-butyl ester (intermediate 17) (174 mg, 0.318 mmol), N-isopropylethylenediamine (97 mg, 0.954 mmol), cesium carbonate (103 mg, 0.318 mmol) in 3 ml of dimethyl sulfoxide is stirred overnight at 90 ° C. 100 ml of water are added to the reaction medium extracted with ethyl acetate.
  • Example 19 Using the same method as Example 18, the following examples are performed using 4 - ⁇ [6- (4-Fluoro-benzenesulfonyloxy) - benzothiazoI-2-ylcarbamoyl] -methyl ⁇ -piperidine-1 - carboxylic acid terf-butyl ester as a precursor (intermediate 17) combined with different amines.
  • the compound obtained after the first step is purified on a flash cartridge of 5 g of Interchim silica (15-35 ⁇ ) ⁇ ) by a gradient of 5 to 10% of methanol in dichloromethane with a flow rate of 10 ml / min.
  • 4-Fluoro-benzenesulfonic acid 2- (8- tert-buto ⁇ ycarbonylamino-octanoylaminp) -benzothiazol-6-yl ester is prepared by combining 4-Fluoro-benzenesulfonic acid 2-amino-benzothiazol -6-yl ester (intermediate 16) with Boc-8-aminocaprylic acid.
  • Example 22 Using the same method as Example 21, the following examples are carried out using 4-Fluoro-benzenesulfonic acid 2- (8-tert-butoxycarbonylamino-octanoylamino) -benzothiazol-6-yl ester (intermediate 20) as a precursor combined with different amines. These examples are presented in the following table:
  • Example 24 4- (2-isopropylamino-ethylamino) -benzenesulfonic acid 2- (3-piperidin-4-yl-propionylamino) -benzothiazol-6-yl ester hydrochloride
  • the compound resulting from the first step (4- (2- ⁇ 6- [4- (2- lsopropylamino-ethylamino) -benzenesulfonyloxy] -benzothiazol-2- ylcarbamoyl ⁇ -ethyl) -piperidine-1 -carboxylic acid tert-butyl ester) is purified on a flash cartridge of 5 g of silica with a porosity of 15-35 ⁇ by a gradient of 1% to 10% of methanol in dichloromethane.
  • Example 25 Using the same method as Example 24, the following examples are carried out using 4- ⁇ 2- [6- (4-Fluoro-benzenesulfonyloxy) - benzothiazol-2-ylcarbamoyl] -ethyl ⁇ -piperidine- 1 -carboxylic acid tert-butyl ester as a precursor (intermediate 23) combined with different amines. These examples are presented in the following table: Intermediate 26: Preparation of 4-isobutylamino-benzenesulfonic acid 2- tert-butoxycarbonylamino-benzothiazol-6-yl ester
  • reaction medium is concentrated to dryness and the residue is washed with ethyl ether leading to 700 mg of 4-isobutylamino-benzenesulfonic acid 2-amino-benzothiazol-6-yl ester in the form of the salt of trifluoroacetic acid (white solid ) with a yield of 52%.
  • the organic phase is washed with water, then with a saturated solution of sodium chloride, dried over magnesium sulfate and concentrated to dryness.
  • the residue obtained is purified by HPLC on a Dynamax C18 column, 60 ⁇ , 21 x 300 mm by a mixture of water / acetonitrile 95/5 for 5 minutes, by a gradient of 5 to 40% in water for 5 minutes, by a gradient of 40 to 80% of acetonitrile in water for 30 minutes, by a gradient from 80 to 95% acetonitrile in water for 5 minutes, then by a mixture of water / acetonitrile 5/95 for 5 minutes with a flow rate of 20 ml / min.
  • the solvents each contain 0.07% (v / v) of trifluoroacetic acid.
  • the fractions are collected every 30 seconds and are checked by analytical HPLC on a Hypersil C18 column, 4.6 x 50 mm. By a gradient from 0 to 100% acetonitrile in water in 10 minutes at a flow rate of 1 ml / min.
  • the solvents each contain 0.07% (v / v) of trifluoroacetic acid.
  • Example 29 Using the same method as Example 28, the following examples are carried out using 4-isobutylamino-benzenesulfonic acid 2-amino-benzothiazol-6-yl ester as precursor (intermediate 27) combined with different acids. These examples are presented in the following table:
  • Example 32 Preparation of Thiophene-2-sulfonic acid 2 - [(piperidine-4-carbonyl) -amino] -benzothiazol-6-yl ester; compound with trifluoro-acetic acid
  • Ee step 2 A solution of 4- [6-Thiophene-2-sulfonyloxy) benzothiazol-2-yl carbamoyl] -piperidine-1-carboxylic acid tert-butyl ester, trifluoroactéique acid (1.5 ml) in 1.5 ml of dichloromethane and 100 ⁇ l of water is stirred overnight at room temperature.
  • reaction medium is concentrated to dryness, taken up in 500 ⁇ l of DMSO and a sample is purified by preparative LC / MS (method B), leading to 3 mg of Thiophene-2-sulfonic acid 2 - [(piperidine-4-carbonyl) -amino] -benzothiazol- 6-yl ester; compound with trifluoro-acetic acid.
  • Example 33 Using the same method as Example 32, the following examples are carried out using Thiophene-2-sulfonic acid 2-amino-benzothiazol-6-yl ester as a precursor (intermediate 31) combined with different acids. These examples are presented in the following table, the LC / MS are produced according to the A1 method:
  • Example 39 Preparation of 4- (2-Diisopropylamino-ethylamino) -benzene-sulfonic acid 2 - [(azetidine-3-carbonyl) -amino] -benzothiazol-6-yl ester.
  • Example 40 Preparation of 4- (2-Diisopropylamino-ethylamino) -benzene-sulfonic acid 2- (8-amino-octanoylamino) -benzothiazol-6-yl ester.
  • Example 43 a Preparafondu4- (2-Diisopropylamino-ethylamino) -benzene-sulfonic acid 2-acetylamino-benzothiazol-6-yl ester hydrochloride:
  • Example 43 a is synthesized from 250 mg (0.557 mmol) of 4- (2-diisopropylamino-ethylamino) -benzenesulfonic acid 2-amino-benzo-thiazol-6-yl ester (intermediate 34) in solution with 57 mg (0.557 mmol) acetic anhydride, 216 mg (1.671 mmol) of N, N-diisopropylethylamine, in 10 ml of dichloromethane. The reaction medium is stirred overnight, then the same amounts of acetic anhydride and of N, N-diisopropylethylamine are added 2 times and the reaction is continued for 3 days at room temperature.
  • Example 44 4- (2-Diisopropylamino-ethylamino) -benzenesulfonic acid 2- (2- methoxy-acetylamino) -benzothiazol-6-yl ester
  • Example 44a Preparation of 4- (2-Diisopropylamino-ethylamino) -benzene-sulfonic acid 2- (2-methoxy-acetylamino) -benzothiazol-6-yl ester hydrochloride:
  • Example 44 a is synthesized according to the method of Example 44, starting from 750 mg (1.672 mmol) of 4- (2-diisopropylamino-ethylamino) -benzenesulfonic acid 2-amino-benzothiazol-6-yl ester (intermediate 34) to obtain the: 4- (2- Diisopropylamino-ethylamino) -benzenesulfonic acid 2- (2-methoxy-acetyl-amino) -benzothiazol-6-yl crude ester. This was dissolved in 1 ml of methanol, 3 ml of dioxane.
  • Example 45 4- (2-Diisopropylamino-ethylamino) -benzenesulfonic acid 2- (cyclopentanecarbonyl-amino) -benzothiazol-6-yl ester.
  • This oil is purified by LC / MS to give 55.2 mg of 4- (2-Diisopropylamino-ethylamino) -benzenesulfonic acid 2- (cyclopentane-carbonyl-amino) -benzothiazol-6-yl ester.
  • the reaction medium is extracted with ethyl acetate, washed with a hydrochloric acid N solution and then with water.
  • the organic phase is dried over sodium sulfate, filtered and then evaporated to dryness.
  • the residue is purified by chromatography using the Quad 12/25 on a Biotage type cartridge. (40 g of silica), eluting with a methylene chloride-isopropanol 97: 3 mixture. After evaporation of the solvent, 0.199 g of 4-Fluoro- benzenesulfonic acid 2- (6-tert-butoxycarbonylamino-hexanoylamino) -benzothiazol- 6-yl esters are recovered with a yield of 80%.
  • reaction medium is taken up in water and then brought to pH 8 with 28% ammonia. Extracted with AcOEt, washed with water and then dried the organic phase over sodium sulfate. After filtration, the filtrate is evaporated to dryness, leading to 0.1 g of white powder which is dissolved in 5 ml of methanol and then brought to pH 2 with hydrochloric acid in solution in AcOEt.
  • 4-Fluoro-benzenesulfonic acid 2- (7-tert-butoxycarbonylamino-heptanoylamino) -benzothiazol-6-yl ester is prepared by the action of 4-fluoro-benzenesulfonic acid 2-amino-benzothiazol -6- yl ester (intermediate 16, patent benzothiazole_V2) with BOC-7-aminoheptanoic acid leading to 0.164 g of product.
  • 4- (2-Diisopropylamino-ethylamino) - benzenesulfonic acid 2- (7-tert-butoxycarbonylamino-heptanoylamino) - benzothiazol-6-yl ester is prepared by the action of 4-Fluoro-benzenesulfonic acid 2- (7-tert-butoxycarbonylamino-heptanoylamino) -benzothiazol-6-yl ester with N, N-diisopropylethylenediamine.
  • the product is purified by chromatography on a Biotage type column (8 g of silica) eluting with a CHaC -MeOH 95: 5 mixture, leading to 86 mg of product, ie 44% yield.
  • Example 49 According to the method of Example 49, ie 4- (2-Diisopropylamino-ethylamino) - benzenesulfonic acid 2- (7-amino-heptanoylamino) -benzothiazol-6-yl ester hydrochloride is prepared by hydrolysis of 4- (2-Diisopropylamino -ethylamino) - benzenesulfonic acid 2- (7-tert-butoxycarbonylamino-heptanoylamino) - benzothiazol-6-yl in the presence of hydrochloric acid in solution in AcOEt, leading to 47 mg of hydrochloride, ie 77% yield.
  • the 4-Fluoro-benzenesulfonic acid 2-isobutyrylamino-benzothiazol-6-yl ester is prepared by the action of 4-fluoro- benzenesulfonic acid 2-amino-benzothiazol-6-yl ester (intermediate 16 , patentbenzothiazole_V2) with isobutyric acid.
  • the crude reaction product is crystallized with ethyl ether, after spinning, 0.17 g of colorless solid is isolated, ie 86% yield.
  • the 4-Fluoro-benzenesulfonic acid 2-propionylamino-benzothiazol-6-yl ester is prepared by the action of 4-fluoro- benzenesulfonic acid 2-amino-benzothiazol-6-yl ester (intermediate 16 , patentbenzothiazole_V2) with propionic acid.
  • the product, 0.397 g, is obtained with a yield of 93%.
  • 4-Fluoro-benzenesulfonic acid 2- (cyclobutanecarbonyl-amino) -benzothiazol-6-yl ester is prepared by the action of 4-fluoro-benzenesulfonic acid 2-amino-benzothiazol-6-yl ester with cyclobutanecarboxylic acid.
  • Example 53 4- (2-Diisopropylamino-ethylamino) - benzenesulfonic acid 2- (cyclobutanecarbonyl-amino) -benzothiazol-6-yl ester is prepared by the action of 4-Fluoro-benzenesulfonic acid 2-propionylamino - benzothiazol-6-yl ester with N, N-diisopropylethylenediamine by heating for 10 minutes in the microwave at 150 ° C.
  • the product, 0.054 g is obtained after purification with a yield of 18% in the form of the hydrochloride.
  • the 4 Fluo ⁇ benzenesuifonic acid 2- (3-pyridin-3-yl-propionylamino) -benzothiazol-6-yl ester is prepared by the action of 4-fluoro-benzenesulfonic acid 2-amino-benzothiazol -6-yl ester with 3- (3- pyridyl) -propionic acid.
  • the product is obtained with a quantitative yield.
  • Example 62 Preparation of 4- (2-Diisopropylamino-ethylamino) - benzenesulfonic acid 2- (3-pyridin-3-yl-propionylamino) -benzothiazol-6-yl ester hydrochloride.
  • Example 63 Preparation of 4- (2-Hydroxy-2-methyl-propylamino) - benzenesulfonic acid 2- (3-pyridin-3-yl-propionylamino) -benzothiazol-6-yl ester hydrochloride.
  • Example 67 Preparation of 4- (2-isopropylamino-ethylamino) - benzenesulfonic acid 2- (2-methoxy-acetylamino) -benzothiazol-6-yl ester.
  • the oil obtained is dissolved in 35 ml of dimethylsulfoxide, then purified in 7 times by preparative HPLC on a reverse phase column Nucleodur C18, 100 A, 10 ⁇ m by a gradient in 52 minutes from 5 to 95% acetonitrile added with 0.07% trifluoroacetic acid in water, added with 0.07% trifluoroacetic acid.
  • the flow rate is 70 ml / min.
  • the fractions containing the clean product are concentrated to obtain 300 mg of 4-Fluoro-benzenesulfonic acid 2-propionylamino-benzothiazol-6-yl ester with a yield of 69%.
  • intermediary 72 is synthesized using butyric acid. 80 mg of 4-Fluoro-benzenesulfonic acid 2-butyryl-amino-benzothiazol-6-yl ester are obtained with a yield of 18%.
  • Example 73 is obtained using intermediate 72 with N-isopropylethylenediamine. 37 mg of 4- (2- isopropylamino-ethylamino) -benzene-sulfonic acid 2-butyrylamino-benzothiazol-6-yl ester; compound with trifluoro-acetic acid with a yield of 36%.
  • intermediate 74 is synthesized using isobutyric acid. 75 mg of 4-Fluoro-benzenesulfonic acid 2- isobutyrylamino-benzothiazol-6-yl ester are obtained with a yield of
  • Example 75 is obtained using intermediate 74 with N-isopropylethylenediamine. 49 mg of 4- (2- isopropylamino-ethylamino) -benzenesulfonic acid 2-isobuty ⁇ ylamino-benzothiazol-6-yl ester; compound with trifluoro-acetic acid are obtained with a yield of 44%.
  • intermediate 76 is synthesized using cyclobutanecarboxylic acid. 185 mg of 4-Fluoro-benzenesulfonic acid 2- (cyclobutanecarbonyl-amino) -benzothiazol-6-yl ester are obtained with a yield of 40%.
  • Example 77 is obtained using intermediate 76 with N-isopropylethylenediamine. 41 mg of 4- (2- ls ⁇ propylarnino-ethylamino) -benzenesulfonic acid 2- (cyclobutanecarbonylamino) -benzothiazol-6-yl ester; compound with trifluoro-acetic acid are obtained with a yield of 37%.
  • Example 79 Preparation of 4- (2-Diisopropylamino-ethylamino) - benzenesulfonic acid 2-butyrylamino-benzothiazol-6-yl ester hydrochloride.
  • Example 80 Preparation of 4- (2-Hydroxy-2-methyl-propylamino) - benzenesulfonic acid 2-butyrylamino-benzothiazol-6-yl ester hydrochloride. o In a 5 ml vial for microwaves fitted with a magnetic bar, a solution of 4-Fluoro-benzenesulfonic acid 2-butyrylamino-benzothiazol-6-yl ester (intermediate 78) (135 mg, 0.34 mmol), 1-amino-2-methyl-propan- 2-ol (153 mg, 1,718 mmol) in 3 ml of N-methylpyrrolidone is heated
  • the organic phase is dried over magnesium sulfate, then concentrated to dryness.
  • the dry residue is purified by reverse phase chromatography on a C18 Dynamax 300 x 20 mm column, by a gradient in 5 minutes from 5 to 40% acetonitrile in water supplemented with 0.07% trifluoroacetic acid, then from 40 to 80% in 30 minutes.
  • the solution is then diluted with water, extracted with ethyl acetate, washed with a saturated solution of sodium chloride and dried over sodium sulfate, then evaporated to dryness, leading to 258 mg of crude product.
  • This is purified by flash chromatography on a cartridge of 5 g of silica.
  • the eluents used are respectively dichloromethane, then dichloromethane with 1% of 0.01% ammoniacal methanol at 7M.
  • the reaction medium is filtered and then concentrated.
  • the oil obtained is reacted with 278 mg of ammonium formate (4.41 mmol) and 300 mg of palladium on carbon at 10% in 15 ml of ethanol.
  • the reaction medium is stirred and heated to reflux for 1 hour 20 minutes.
  • the reaction medium is filtered and concentrated to dryness.
  • the residue obtained is purified by preparative LC / Ms (method B) leading to 6.2 mg of 4- (2-Methyl-2-phosphonooxy-propylamino) -benzenesulfonic acid 2- (cyclopropanecarbonyl- amino) -benzothiazol-6-yl ester with a yield of 3%.
  • CDK2 / cyclin E protocol Purification of the CDK2 / CyclineE- (His) 6 complex by IMAC (Immobilized Metal Affinity Chromatography): Two recombinant baculoviruses carrying the human sequences coding respectively for CDK2 and CyclineE (the latter containing a hexa-histidine tag at C terminal) are used to co-infect Sf21 insect cells. Two to three days after the start of co-infection, the cells are harvested by centrifugation, then stored at - ⁇ * 0 ° C until they are used. After thawing and mechanical lysis of the cells, the complex present in the lysis supernatant is purified by affinity chromatography on nickel (IMAC), and stored at -80 ° C.
  • IMAC affinity chromatography on nickel
  • a 96-well plate format coated with streptavidin is used to test the activity of the compounds on the kinase activity of CDK2 / Cyclin E.
  • the biotynilized peptide substrate, fragment of the pRb protein, (biotinyl-SACPLNLPLQNNHTAADMYLSPVRSPKKKGSTTR - OH) is dissolved at the concentration of 1 mM in kinase buffer (HEPES / NaOH 50 mM, NaCI 1 mM, MgCI 2 5 mM, pH 7.5) in order to constitute a stock solution stored at -20 ° C in the form of aliquots of 110 ⁇ l.
  • Dilutions are thus made to 1000 ⁇ M, 333.3 ⁇ M, 111.1 ⁇ M, 37.03 ⁇ M, 12.35 ⁇ M, 4.11 ⁇ M and 1.37 ⁇ M.
  • One ⁇ l of each of these solutions (or 1 ⁇ l of DMSO for the controls) is transferred to the wells of the test plate.
  • 19 ⁇ l of a solution of a mixture of adenosinetriphosphate (ATP) and ATPy 33 P in kinase buffer at the concentration of 5.26 ⁇ M of total ATP and 52.6 are then added to each well. ⁇ Ci / ml of 33 P.
  • the enzymatic reaction is triggered by the addition of 10 ⁇ l per well of a solution of CDK2 / Cyclin E at 200 nM in the kinase buffer containing 1 mM of dithiothreitol (or 10 ⁇ l of kinase buffer containing 1 mM dithiothreitol for reaction blanks).
  • the final volume of each well is 100 ⁇ l
  • the final substrate concentration is 10 ⁇ M
  • the final inhibitor concentrations are 10 ⁇ M, 3.33 ⁇ M, 1.11 ⁇ M, 0.37 ⁇ M , 0.123 ⁇ M, 0.041 ⁇ M and 0.014 ⁇ M (depending on the concentration of the intermediate dilution)
  • the final concentration of ATP is 1 ⁇ M
  • the final quantity of 33 P is 1 ⁇ Ci / well
  • the final concentration of CDK2 / Cyclin complex E is 20 nM.
  • Two recombinant baculoviruses carrying the human sequences respectively coding for CDK4-HA (C terminal fusion with the tag Hemaglufinine) and for Cycline D1- (His) 6 are used to co-infect insect cells S / 9. Sixty hours after the start of co-infection, the cells are harvested by centrifugation, then frozen at -20 ° C until they are used.
  • buffer A HEP 200 mM pH 7.0, NaCI 50 mM, MgCI 2 2 mM, imidazole 25 mM, TCEP 1 mM, glycerol 10% (w / v), 1 mM NaF, 1 mM Na 3 VO
  • IMAC affinity chromatography on nickel
  • Flashplate CDK4 / CvclinD1 assay in 96-well format A 96-well "flashplate” plate test coated with streptavidin is used to evaluate the inhibition of the CDK4 / cyclin D1 kinase complex by the products of the invention.
  • Dilutions are thus made to 1000 ⁇ M, 333.3 ⁇ M, 111.1 ⁇ M, 37.03 ⁇ M, 12.35 ⁇ M, 4.11 ⁇ M and 1.37 ⁇ M.
  • One ⁇ l of each of these solutions (or 1 ⁇ l of DMSO for the controls) is then transferred to the wells of the test plate.
  • 19 ⁇ l of a solution of a mixture of adenosinetriphosphate (ATP) and ATP ⁇ 33 P in the kinase buffer at the concentration of 5.26 ⁇ M of total ATP and 78.9 ⁇ Ci / are then added to each well.
  • the enzymatic reaction is triggered by the addition of 10 ⁇ l per well of a solution of CDK4 / Cycline D1 complex at 250 nM in the kinase buffer containing 1 mM of dithiothreitol (or 10 ⁇ l of kinase buffer containing 1 mM dithiothreitol for reaction blanks).
  • the final volume in each well is 100 ⁇ l
  • the final substrate concentration is 1.8 ⁇ M
  • the final inhibitor concentrations are 10 ⁇ M, 3.33 ⁇ M, 1.11 ⁇ M, 0, 37 ⁇ M, 0.123 ⁇ M, 0.041 ⁇ M and 0.014 ⁇ M (depending on the concentration of the intermediate dilution)
  • the final concentration of ATP is 1 ⁇ M
  • the final quantity 33 P is 1.5 ⁇ Ci / well
  • the final concentration of CDK4 / Cycline D1 complex is 25 nM.
  • the incorporation of 33 P into the substrate peptide is measured by scintillation counting with a Packard Topco ⁇ nt.NXT device.
  • the inhibitory activity of the products of the invention is evaluated by determining the concentration of inhibitor causing a reduction of 50% in the enzymatic activity (IC50).
  • the inhibitory effect of compounds against the Aurora2 kinase is determined by a radioactivity scintillation test.
  • NuMA Nuclear protein which associates with the Mitotic Apparatus
  • the kinase activity of Aurora2 is measured by scintillation in a microplate saturated with nickel chelate (New England Nuclear, model SMP107). Each well contains 100 ⁇ l of the following solution: 0.02 ⁇ M of Aurora2; 0.5 ⁇ M of NuMA substrate; 1 ⁇ M ATP plus 0.5 ⁇ Ci ATP- [ 33 P]. The solutions are incubated for 45 minutes at 37 ° C. The test buffer is then removed and the wells are rinsed twice with 300 ⁇ l of kinase buffer. Radioactivity is measured in each well using a Packard Model Top Count NXT device. The background noise is measured in duplicate in wells containing radioactive ATP alone containing buffered kinase treated in the same way as the other samples. The control activity is carried out by measuring in duplicate the radioactivity in the complete test mixture (ATP, Aurora2 and the NuMA substrate), in the absence of test compound.
  • the inhibition of the activity of Aurora2 with a compound of the invention is expressed as a percentage of inhibition of the control activity in the absence of test compound. Staurosporine is added to each plate as an inhibition control.

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Abstract

La présente invention concerne des dérivés des benzothiazoles de formule (I), les compositions les contenant, et leur utilisation comme inhibiteurs de CDK pour le traitement du cancer.

Description

NOUVEAUX BENZOTHIAZOLES ET LEUR UTILISATION COMME MEDICAMENTS
La présente invention concerne notamment de nouveaux composés chimiques, particulièrement de nouveaux dérivés des benzothiazoles, les compositions les contenant, et leur utilisation comme médicaments.
Plus particulièrement, l'invention concerne de nouveaux esters sulfoniques des benzothiazoles présentant une activité anticancéreuse, via la modulation de l'activité de protéines, en particulier des kinases.
A ce jour, la plupart des composés commerciaux utilisés en chimiothérapie sont des cytotoxiques qui posent des problèmes importants d'effets secondaires et de tolérance par les patients. Ces effets pourraient être limités dans la mesure où les médicaments utilisés agissent sélectivement sur les cellules cancéreuses, à l'exclusion des cellules saines. Une des solutions pour limiter les effets indésirables d'une chimiothérapie peut donc consister en l'utilisation de médicaments agissant sur des voies métaboliques ou des éléments constitutifs de ces voies, exprimés majoritairement dans les cellules cancéreuses, et qui ne seraient pas ou peu exprimés dans les cellules saines.
Les protéines kinase sont une famille d'enzyme qui catalysent la phosphorylation de groupes hydroxy de résidus spécifiques de protéines tels que des résidus tyrosine, serine ou thréonine. De telles phosphorylations peuvent largement modifier la fonction des protéines ; ainsi, les protéines kinases jouent un rôle important dans la régulation d'une grande variété de processus cellulaires, incluant notamment le métabolisme, la prolifération cellulaire, la differentiation cellulaire, la migration cellulaire ou la survie cellulaire. Parmi les différentes fonctions cellulaires dans lesquelles l'activité d'une protéine kinase est impliquée, certains processus représentent des cibles attractives pour traiter les maladies cancéreuses ainsi que d'autres maladies.
Ainsi, un des objets de la présente invention est de proposer des compositions ayant une activité anticancéreuse, en agissant en particulier vis-à-vis de kinases. Parmi les kinases pour lesquelles une modulation de l'activité est recherchée, les kinases cycline dépendantes ainsi que Aurora-2 sont préférées. La progression du cycle cellulaire est souvent gérée par des kinases cycline dépendantes (CDK) qui sont activées par une interaction avec des protéines appartenat à la famille des cyclines, activation qui se termine par la phosphorylation de substrats et finalement par la division cellulaire. En plus les inhibiteurs endogènes des CDK qui sont activés (famille des INK4 et des KIP/CIP) régulent de façon négative l'activité des CDK. La croissance des cellules normales est due à une balance entre les activateurs des CDK (les cyclines) et les inhibiteurs endogènes des CDK. Dans plusieurs types de cancers, l'expression ou l'activité abérante de plusieurs de ces régulateurs du cycle cellulaire a été décrite.
La cycline E active la kinase Cdk2 qui agit ensuite pour phosphoryler la protéine pRb (protéine du rétinoblastome) résultant en un engagement dans la division cellulaire irréversible et une transition vers la phase S (PL Toogood, Médicinal Research Reviews (2001), 21(6) ; 487-498. La kinase CDK2 et peut être CDK3 sont nécessaires pour la progression dans la phase G1 et l'entrée en phase S. Lors de la formation de complexe avec la cycline E, elles maintiennent l'hyperphosphorylation de pRb pour aider la progression de la phase G1 en phase S. Dans les complexes avec la Cycline A, CDK2 joue un rôle dans l'inactivation de E2F et est nécessaire pour la réalisation de la phase S (TD. Davies et al. (2001) Structure 9, 389-3).
Le complexe CDK1/cycline B régule la progression du cycle cellulaire entre la phase G2 et la phase M. La régulation négative du complexe CDK/Cycline B empêche les cellules normale d'entrer en phase S avant que la phase G2 ait été correctement et complètement réalisée. (K.K. Roy and E.A. Sausville Current Pharmaceutical Design, 2001, 7, 1669-1687.
Un niveau de régulation de l'activité des CDK existe. Les activateurs de cycline dépendantes kinases (CAK) ont une action positive de régulation des CDK. CAK phosphoryle les CDK sur le résidu thréonine pour rendre l'enzyme cible totalement active.
La présence de défauts dans les molécules intervenant sur le cycle cellulaire entraîne l'activation des CDK et la progression du cycle, il est normal de vouloir inhiber l'activité des enzymes CDK pour bloquer la croissance cellulaire des cellules cancéreuses. De nombreuses protéines impliquées dans la ségrégation des chromosomes et l'assemblage du fuseau ont été identifiées dans la levure et la drosophile. La désorganisation de ces protéines conduit à la non-ségrégation des chromosomes et à des fuseaux monopolaires ou désorganisés. Parmi ces protéines, certaines kinases, dont Aurora et Ipl1 , provenant respectivement de drosophile et de S. cerevisiae, sont nécessaires pour la ségrégation des chromosomes et la séparation du centrosome. Un analogue humain de Ipl1 de levure a été récemment clone et caractérisé par différents laboratoires. Cette kinase, nommée aurora2, STK15 ou BTAK appartient à la famille des kinases à sérine/thréonine. Bischoff et al. ont montré que Aurora2 est oncogène, et est amplifié dans les cancers colorectaux humains (EMBO J, 1998, 17, 3052-3065). Cela a également été exemplifié dans des cancers impliquant des tumeurs épithéliales telles que le cancer du sein.
La présente invention concerne de nouveaux dérivés des benzothiazoles. Elle concerne ainsi l'utilisation des dérivés des benzothiazoles comme agents d'inhibition des kinases et plus particulièrement comme agent anticancéreux. Parmi ceux ci elle concerne préférentiellement les esters sulfoniques des benzothiazoles. Elle concerne également l'utilisation desdits dérivés pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de l'homme.
Parmi l'art antérieur connu à ce jour décrivant les esters sulfoniques des benzothiazoles on peut citer la demande de brevet publiée JP 0539036 qui décrit un procédé de préparation de dérivés de formule générale suivante :
Figure imgf000004_0001
ou
Y1 peut représenter un atome de soufre, n peut être égal à zéro,
Z peut être un groupe acylamino les groupes X1, X2, X3, X4, sont égaux à H ou peuvent représenter un groupe alkylsulfonyoxy. Parmi l'immense majorité des composés inclus dans la formule générale du brevet ci-dessus référencé aucun des exemples ne décrit de composés correspondant aux composés actifs selon l'invention ni même ne décrit la synthèse de benzothiazoles. Les composés selon l'invention répondent à la formule générale (I) suivante :
Figure imgf000005_0001
dans laquelle • X représente un groupe choisi parmi une liaison covalente, (Chbjn, avec n égal à 1 ou 2 • Ar représente un groupe aryle ou hétéroaryle; ce groupe est éventuellement substitué par un groupe choisi parmi les groupes alkyles, halogènes, NR-1R2 (Ri et R2 étant choisis parmi les groupes hydrogène, alkyles, cycloalkyles ou ensemble peuvent former un radical hétérocyclique ou hétéroaryle, ces groupes étant eux même éventuellement substitués), SOaalk, Salkyl, alkoxy, hétéroaryles, ou aryles • R représente un groupe choisi parmi l'hydrogène, un groupe alkyle, cycloalkyle, hétérocycloalkyle, aryle, hétéroaryle, alkoxy, cycloalkoxy, hétérocycloalkoxy, amino; R peut être éventuellement substitué par un ou plusieurs groupes choisis parmi les mêmes radicaux que ceux définis pour R.
Les éventuels substituants du groupes Ri et R2 sont choisis notamment parmi les groupes hydroxy, hétéroaryles, cycloalkyle, aminoalkyles.
On entend au sens de la présente invention par groupe alkyle des chaînes droites ou ramifiées contenant 1 à 10 atomes de carbone.
On entend au sens de la présente invention par groupe cycloalkyle des chaînes alkyles cycliques contenant 3 à 10 atomes de carbone. On entend au sens de la présente invention par groupe hétérocycloalkyle des chaînes alkyles cycliques contenant 3 à 10 atomes de carbone et contenant au moins un hétéroatome choisis parmi O, N ou S.
On entend au sens de la présente invention par groupe NR-|R2 des groupes amino de préférence secondaire c'est à dire des groupes pour lesquels au moins un des substituants est l'hydrogène.
Tous ces groupes sont éventuellement substitués par un groupe alkyle, cycloalkyle, hétérocycloalkyle, hétéroaryle, aryle, amino, hydroxy, alkoxy ou halogène. On entend au sens de la présente invention par radicaux aryle et hétéroaryle les radicaux monocycliques comportant éventuellement un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi O, N et S ou les radicaux fusionnés à un autre cycle comportant 5 ou 6 chaînons et éventuellement un à trois hétéroatomes choisis parmi O, N et S. De préférence parmi les radicaux aryles ou hétéroaryles on peut citer les groupes phényle, pyridyle, pyrimidine, triazine, pyrrolyle, imidazolyle, thiazolyle, furyle, thiényle, indolyle, azaindazolyle, isobenzofuranyle, isobenzothiényle, benzoxazolyle, benzothiazolyle, arylvinylène, arylamido, arylcarboxamide, aralkylamine, quinoléyle, isoquinoléyle, cinnolyle, quinazolyle, naphtyridyle, triazolyle ou tétrazolyle. On préfère choisir parmi les groupes aryle et hétéroaryle les groupes phényle, thiényle, pyrazolyle, imidazolyle éventuellement substitué.
Parmi les substituants du groupe phényle on préfère les groupes amino et les halogènes en particulier le chlore et le fluor, ainsi parmi les groupes aryles on préfère tout particulièrement les di et trifluorophényles et les monoalkylamino phenyles, la chaîne alkyle étant éventuellement substituée par un groupe hydroxy, dialkylamino.
On préfère encore choisir parmi les composés de formule (I) ceux pour lesquels X représente une liaison covalente et ceux pour lesquels R représente un radical cycloalkyle. On peut citer parmi les composés répondant à la formule (I) les composés suivants : 4-(2-hydroxy-2-methyI-propylamino)-benzenesulfonic acid 2-[(piperidine-4- carbonyl)-amino]-benzothiazol-6-yl ester 4-Fluoro-benzenesulfonic acid 2-(cyclopropanecarbonyl-amino)-benzothiazol- 6-yl ester 4-cyclopentylamino-benzenesuîfonic 2-(cyclopropanecarbonylamino)-benzo- thiazol-6-yl ester
4-(3-imidazol-1 -yl-propylamino)-benzenesulfonic 2-(cyclopropanecarbonyl- amino)-benzothiazol-6-yl ester
4-methylamino- benzenesulfonic 2-(cyclopropanecarbonylamino)- benzothiazol-6-yl ester
4-(2-hydroxy-2-methyl-propylamino)-benzenesulfonic 2-(cyclopropane- carbonylamino)-benzothiazol-6-yl ester
4-(2-diisopropylamino-ethylamino)- benzenesulfonic 2-(cyclopropane- carbonylamino)-benzothiazol-6-yl ester 4-[4-(4-pyridin-3-yl-imidazol-1 -yl)-butylamino]- benzenesulfonic 2-(cyclo- propanecarbonylamino)-benzothiazol-6-yl ester
4-(2-lsopropylamino-ethylamino)-benzenesulfonic acid 2-(2-piperidin-4-yl- acetylamino)-benzothiazol-6-yl ester chlorhydrate
4-(3-lmidazol-1 -yl-propylamino)-benzenesulfonic acid 2-(2-pî perid i n-4-yl- acetylamino)-benzothiazol-6-yl ester chlorhydrate
4-(2-Ethylamino-ethylamino)-benzenesulfonic acid 2-(2-piperidin-4-yl- acetylamino)-benzothiazol-6-yl ester chlorhydrate
4-[2-(2-Hydroxy-ethylamino)-ethylamino]-benzenesulfonic acid 2-(2-piperidin- 4-yl-acetylamino)-benzothiazol-6-yl ester chlorydrate 4-(2-Hydroxy-2-methyl-propylamino)-benzenesulfonic acid 2-(2-piperidin-4-yl- acetylamino)-benzothiazol-6-yl ester chlorhydrate
4-(2-isopropylamino-ethylamino)-benzenesulfonic acid 2-(8-amino- octanoylamino)-benzothiazol-6-yl ester chlorhydrate
4-(3-imidazol-1 -yl-propylamino)-benzenesulfonic acid 2-(8-amino- octanoylamino)-benzothiazol-6-yl ester chlorhydrate 4-(2-ethylamino-ethylamino)-benzene sulfonic acid 2-(8-amino- octanoylamino)-benzothiazol-6-yl ester 4-[2-(2-hydroxy-ethylamino)-ethylamino]-benzenesulfonic acid 2-(8-amino- octanoylamino)-benzothiazol-6-yl ester chlorhydrate 4-(2=Hydroxy-2-methy!-propylamino)-benzenesulfonic acid 2-(8-amino- octanoylamino)-benzothiazol-6-yl ester chlorhydrate
4-(2-lsopropylamino-ethylamino)-benzenesulfonic acid 2-(3-piperidin-4-yl- propionylamino)-benzothiazol-6-yl ester chlorhydrate
4-(3-lmidazol-1-yl-propylamino)-benzenesulfonic acid 2-(3-piperidin-4-yl- propionylamino)-benzothiazol-6-yl ester chlorhydrate
4-(2-Ethylamino-ethylamino)-benzenesulfonic acid 2-(3-piperidin-4-yl- propionylamino)-benzothiazol-6-yl ester chlorhydrate
4-[2-(2-Hydroxy-ethylamino)-ethylamino]-benzenesulfonic acid 2-(3-piperidin- 4-yl-propionylamino)-benzothiazol-6-yl ester chlorhydrate 4-lsobutylamino-benzenesulfonic acid 2-(2-piperidin-4-yl-acetylamino)- benzothiazol-6-yl ester chlorhydrate
4-lsobutylamino-benzenesulfonic acid 2-(3-piperidin-4-yl-propionylamino)- benzothiazol-6-yl ester chlorhydrate
4-lsobutylamino-benzenesulfonic acid 2-(8-amino-octanoy!amino)- benzothiazol-6-yl ester chlorhydrate
Thiophene-2-sulfonic acid 2-[(piperidine-4-carbonyl)-amino]-benzothiazol-6-yl ester; compound with trifluoro-acetic acid
Thiophene-2-sulfonic acid 2-(3-piperidin-4-yl-propionylamino)-benzothiazol-6- yl ester; compound with trifluoro-acetic acid Thiophene-2-sulfonic acid 2-(2-amino-acetylamino)-benzothiazol-6-yl ester
Thiophene-2-sulfonic acid 2-(2-methylamino-acetylamino)-benzothiazol-6-yl ester; compound with trifluoro-acetic acid
Thiophene-2-sulfonic acid 2-(3-amino-propionylamino)-benzothiazol-6-yl ester; compound with trifluoro-acetic acid Thiophene-2-sulfonic acid 2-(8-amino-octanoylamino)-benzothiazol-6-yl ester; compound with trifluoro-acetic acid Thiophene-2-sulfonic acid 2-(3-diethylamino-propionylamino)-benzothiazol-6- yl ester; compound with trifluoro-acetic acid Thiophene-2-sulfonic acid 2-(cyclopropanecarbonyl-amino)-benzothiazol-6-yl ester
4-(2-Diisopropylamino-ethylamino)-benzenesulfonic acid 2-[(azetidine-3- carbonyl)-amino]-benzothiazol-6-yl ester
4-(2-Diisopropylamino-ethylamino)-benzenesulfonic acid 2-(8-amino- octanoylamino)-benzothiazol-6-yl ester
4-(2-Diisopropylamino-ethylamino)-benzenesulfonic acid 2-[(1 -amino- cyclopentanecarbonyl)-amino]-benzothiazol-6-yl ester
4-(2-Diisopropylamino-ethylamino)-benzenesulfonic acid 2-(2-piperidin-4-yl- acetylamino)-benzothiazol-6-yl ester 4-(2-Diisopropylamino-ethylamino)-benzenesulfonic acid 2-acetylamino- benzothiazol-6-yl ester
4-(2-Diisopropylamino-ethylamino)-benzenesulfonic acid 2-(2-methoxy- acetylamino)-benzothiazol-6-yl ester
4-(2-Diisopropylamino-ethylamino)-benzenesulfonic acid 2-(cyclopentane- carbonyl-amino)-benzothiazol-6-yl ester
4-(2-Diisopropylamino-ethylamino)-benzenesulfonic acid 2-(6-amino- hexanoylamino)-benzothiazol-6-yl ester chlorhydrate
4-.2-DiisoproDylamino-ethylamino)-benzenesulfonic acid 2-(7-amino- heptanoylamino)-benzothiazol-6-yl ester chlorhydrate
4-(2-isopropylamino-ethylamino)- benzenesulfonic 2-
(cyclopropanecarbonylamino)-benzothiazol-6-yl ester chlorhydrate
4-(2-Diisopropylamino-ethylamino)-benzenesulfonic acid 2-isobutyrylamino- benzothiazol-6-yl ester chlorhydrate
4-(2-Diisopropylamino-ethylamino)-benzenesulfonic acid 2-propionylamino- benzothiazol-6-yl ester chlorhydrate 4-f2-Hvdroxy-2-methyl-propylamino)-benzenesulfonic acid 2-propionylamino- benzothiazol-6-yl ester
4-(2-Diisopropylamino-ethylamino)-benzenesulfonic acid 2- (cyclobutanecarbonyl-amino)-benzothiazol-6-yl ester chlorhydrate 4-Fluoro-benzenesulfonic acid 2-(3-pyridin-3-yl-propionylamino)-benzothiazol- 6-yl ester
4-(2-Diisopropylamino-ethylamino)-benzenesulfonic acid 2-(3-pyridin-3-yl- propionylamino)-benzothiazol-6-yl ester chlorhydrate
4-(2-Hvdroxy-2-methyl-propylamino.-benzenesulfonic acid 2-(3-pyridin-3-yl- propionylamino)-benzothiazol-6-yl ester chlorhydrate
4-(1 -oxyl-2.2.6.6-tetramethyl-piperidin-4-ylamino)-benzenesulfonic acid 2- (cvclopropanecarbonylamino)-benzothiazol-6-yl ester
4-(2-Hvdroxy-2-methyl-propylamino)-benzenesulfonic acid 2-(3-piperidin-4-yl- propionylamino)-benzothiazol-6-yl ester chlorvdrate 4-(2-Diisopropylamino-ethylamino)-benzenesulfonic acid 2-butyrylamino- benzothiazol-6-yl ester chlorhydrate
4-(2-isopropylamino-ethylamino)-benzenesulfonic acid 2-butyrylamino- benzothiazol-6-yl ester; compound with trifluoro-acetic acid
4-(2-isopropylamino-ethylamino)-benzenesulfonic acid 2-isobutyrylamino- benzothiazol-6-yl ester; compound with trifluoro-acetic acid
4-(2-Hvdroxy-2-methyl-propylamino)-benzenesulfonic acid 2-butyrylamino- benzothiazol-6-yl ester chlorhydrate
4-(2-isopropylamino-ethylamino)-benzenesulfonic acid 2-propionylamino- benzothiazol-6-yl ester; compound with trifluoro-acetic acid 4-(2-isopropylamino-ethylamino)-benzenesulfonic acid 2-aceylamino- benzothia2ol-6-yl ester
4-(2-isopropylamino-ethylamino)-benzenesulfonic acid 2-acetylamino- benzothiazol-6-yl ester chlorhydrate
4-(2-lsopropylamino-ethylamino)-benzenesulfonic acid 2-(2-methoxy- acetylaminoVbenzothiazol-6-yl ester 4-(2-lsopropylamino-ethylamino)-benzenesulfonic acid 2- (cyclopentanecarbonyl-amino)-benzothiazol-6-yl ester
4-(2-lsopropylamino-ethylamino)-benzenesulfonic acid 2- (cyclobutanecarbonyl-amino)-benzothiazol-6-yl ester; compound with trifluoro- acetic acid
1-Methyl-1 H-imidazole-4-sulfonic acid 2-(cyclopropanecarbonyl-amino)- benzothiazol-6-yl ester
5-Pyridin-2-yl-thiophene-2-sulfonic acid 2-(cyclopropanecarbonyl-amino)- benzothiazol-6-yl ester
4-(2-Methyl-2-phosphonooxy-propylamino)-benzenesulfonic acid 2- (cyclopropanecarbonyl-amino)-benzothiazol-6-yl ester
Un des procédés de préparation des composés selon l'invention peut être schématisé de la façon suivante :
1. Les composés de formule (I) pour lesquels R = alkyle, cycloalkyle, aryle, hétéroaryle peuvent être préparés selon le schéma de synthèse 1.
SCHEMA 1
Figure imgf000012_0001
(8)
Les composés de la présente invention peuvent être préparés facilement à partir de 5-méthoxy-benzothiazol-2-ylamine (composé commercial). Dans une première étape, le produit de départ est déméthoxylé en milieu acide, preférentiellement dans un mélange acide acétique/acide bromhydrique aqueux. Dans une deuxième étape, les 5-hydroxy-benzothiazol-2-ylamides (4) sont obtenues par réaction entre la 5-hydroxy-benzothiazol-2-ylamine (2) et un acide de formule (3) (R tel que défini dans la formule générale (I)) en présence d'un agent de couplage tel que HATU ou HBTU et d'une base telle que la diisopropyléthylamine ou la triéthylamine dans un solvant appropié. Parmi les solvants pouvant être utilisés, nous pouvons citer la diméthylformamide, le dichlorométhane. La température de choix pour effectuer cette réaction est comprise entre température ambiante et reflux. Dans une troisième étape, les sulfono-esters de formule (6) sont obtenus par réaction entre les 5-hydroxy-benzothiazol-2-ylamides (4) et un chlorure de sulfonyle de formule (5) (X et Ar tels que définis dans la formule générale (I)) dans un solvent inerte (acétone, THF, dichlorométhane, toluène) en présence d'une base telle que la triéthylamine ou la pyridine. Dans le cas où XAr correspond au 4-fluorophényl, la substitution nucléophile du F par des aminés de formule (7) (R1R2 tels que définis dans la formule générale (I)) pour conduire aux dérivés de formule (8) est effectuée dans un solvant aprotique tel que la N-methylpyrrolidone ou la diméthylformamide à une température variant de 90 à 130°C en tube scellé ou au micro-ondes.
2. Les composés de la présente invention pour lesquels R = alkoxy, cycloaikoxy, heterocycloaikoxy peuvent être préparés selon le schéma de synthèse 2.
SCHEMA 2
Figure imgf000014_0001
(8)
Les composés de la présente invention peuvent être préparés facilement à partir de 5-méthoxy-benzothiazol-2-ylamine (composé commercial). Dans une première étape, le produit de départ est déméthoxylé en milieu acide, preférentiellement dans un mélange acide acétique/acide bromhydrique aqueux.
Dans une deuxième étape, les sulfono-esters de formule (4) sont obtenus par réaction entre la 5-hydroxy-benzothiazol-2-ylamine (2) et un chlorure de sulfonyle de formule (3) (X et Ar tels que définis dans la formule générale (I)) dans un solvent inerte (acétone, THF, dichlorométhane, toluène) en présence d'une base telle que la triéthylamine ou la pyridine.
Dans le cas où XAr correspond au 4-fluorophényl, la substitution nucléophile du F par des aminés de formule (6) (R1 R2 tels que définis dans la formule générale (I)) pour conduire aux dérivés de formule (7) est effectuée dans un solvant aprotique tel que la N-methylpyrrolidone ou la diméthylformamide à une température variant de 90 à 130°C en tube scellé ou au micro-ondes. Les carbamates (8) sont obtenus par réaction entre les aminés de formules (4 et 7) et un chloroformate de formule (5) (R3 tel que défini dans la formule générale (I)) en présence d'une base organique telle que la pyridine, la triéthylamine, la diisopropylethylamine ou inorganique telle que le carbonate de potassium dans un solvant appropié. Parmi les solvants pouvant être utilisés, nous pouvons citer le tétrahydrofurane, le dichlorométhane et le dioxane. La température de choix pour effectuer cette réaction est comprise entre 0°C et reflux.
3. Les composés de la présente invention pour lesquels R = aikylamino, cycloalkylamino, heterocycloamino peuvent être préparés selon le schéma de synthèse 3.
Figure imgf000015_0001
(10)
Les urées de formule (10) peuvent être obtenues par réaction entre les carbamates de formule (8) (R3 = Me de préférence) et une aminé de formule (9) (R4 et R5 tels que définis dans la formule générale (I)) dans un solvant aprotique tel que la N-méthylpyrrolidone ou la diméthylformamide à une température variant de 90°C à 130°C en tube scellé ou au micro-ondes.
Les composés selon l'invention sont utilisables en thérapie humaine et plus particulièrement dans le traitement du cancer, plus particulièrement des cancers sensibles aux inhibiteurs d'Aurora-2 et à ceux de Cdk2.
La présente invention sera plus complètement décrite à l'aide des exemples suivants qui ne doivent pas être considérés comme limitatifs de l'invention. Les spectres DCI ont été réalisés en désorbtion-ionisation chimique (gaz réactant : ammoniac, appareil Finnigan SSQ7000). Les spectres en électrospray (ES+) ont été réalisés sur un appareil Platform II (Micromass).
Analyses LC/MS Méthode d'analyse par LC/MS (méthode A1 )
Les analyses LC/MS ont été réalisées sur un appareil Micromass modèle LCT relié à un appareil HP 1100. L'abondance des produits a été mesurée à l'aide d'un détecteur à barrette de diodes HP G1315A sur une gamme d'onde de 200-600 nm et un détecteur à dispersion de lumière Sedex 65. L'acquisition des spectres de masses Mass spectra a été réalisée sur une gamme de 180 à 800. Les données ont été analysées en utilisant le logiciel Micromass MassLynx. La séparation a été effectuée sur une colonne Hypersil BDS C18, 3 μm (50 x 4.6 mm), en éluant par un gradient linéaire de 5 à 90 % d'acétonitrile contenant 0,05 % (v/v) d'acide trifluoroacétique (TFA) dans l'eau contenant 0,05 % (v/v) TFA en 3,5 mn à un débit de 1 mL/mn. Le temps total d'analyse, incluant la période de rééquilibration de la colonne, est de 7 mn.
Méthode d'analyse par LC/MS (méthode A2)
Les analyses LC/MS ont été réalisées sur un appareil Micromass modèle Platfom. L'abondance des produits a été mesurée à l'aide d'un détecteur à barrette de diodes HP G1315A sur une gamme d'onde de 200-400 nm et un détecteur à dispersion de lumière
Sedex 65. L'acquisition des spectres de masses Mass spectra a été réalisée sur une gamme de 50 à 1500. Les données ont été analysées en utilisant le logiciel Micromass MassLynx. La séparation a été effectuée sur une colonne XTerral 3,5 μm (50 x 2.1 mm), en éluant par un gradient linéaire de 5 à 95 % d'acétonitrile dans l'eau contenant 0,1 % (v/v) d'acide formique en 9 mn à un débit de 0.7 mL/mn. Le temps total d'analyse, incluant la période de rééquilibration de la colonne, est de 9 mn. Purification par LC/MS préparative (Méthode B): Les produits ont été purifiés par LC/MS en utilisant un système Waters FractionsLynx composé d'une pompe à gradient Waters modèle 600, d'une pompe de régénération Waters modèle 515, d'une pompe de dilution Waters Reagent Manager, d'un auto-injecteur Waters modèle 2700, de deux vannes Rheodyne modèle LabPro, d'un détecteur à barrette de diodes Waters modèle 996, d'un spectromètre de masse Waters modèle ZMD et d'un collecteur de fractions Gilson modèle 204. Le système est contrôlé par du logiciel Waters FractionLynx. La séparation a été effectuée alternativement sur deux colonnes Waters Symmetry (Cis, 5 μM, 19x50 mm, référence catalogue 186000210), une colonne étant en cours de régénération par un mélange eau/acétonitrile 95/5 (v/v) contenant 0,07 % (v/v) d'acide trifluoroacétique, pendant que l'autre colonne était en cours de séparation. L'élution des colonnes a été effectuée en utilisant un gradient linéaire de 5 à 95 % d'acétonitrile contenant 0,07 % (v/v) d'acide trifluoroacétique dans l'eau contenant 0,07 % (v/v) d'acide trifluoroacétique, à un débit de 10 mL/mn. A la sortie de la colonne de séparation, un millième de l'effluent est séparé par un LC Packing Accurate, dilué à l'alcool méthylique à un débit de 0,5 mL/mn et envoyé vers les détecteurs, à raison de 75 % vers le détecteur à barrette de diodes, et les 25 % restants vers le spectromètre de masse. Le reste de l'effluent (999/1000) est envoyé vers le collecteur de fractions où le flux est éliminé tant que la masse du produit attendu n'est pas détectée par le logiciel FractionLynx. Les formules moléculaires des produits attendus sont fournies au logiciel FractionLynx qui déclenche la collecte du produit quand le signal de masse détecté correspond à l'ion [M+H]+ et/ou au [M+Na]+. Dans certains cas, dépendant des résultats de LC/MS analytique, quand un ion intense correspondant à [M+2H]++ a été détecté, la valeur correspondant à la moitié de la masse moléculaire calculée (MW/2) est aussi fournie au logiciel FractionLynx. Dans ces conditions, la collecte est aussi déclenchée quand le signal de masse de l'ion [M+2H]++ et/ou [M+Na+H]++ sont détectés. Les produits ont été collectés en tube de verre tarés. Après collecte, les solvants ont été évaporés, dans un évaporateur centrifuge Savant AES 2000 ou Genevac HT8 et les masses de produits ont été déterminées par pesée des tubes après évaporation des solvants.
Purification par chromatoαraphie flash : les produits bruts sont purifiés par chromatographie flash sur silice de granulométrie 15-35 μm sous une pression d'argon de 0.5 bar. Les fractions correspondant au produit attendu sont rassemblées et concentrées sous pression réduite à l'évaporateur rotatif. La présente invention sera plus complètement décrite à l'aide des exemple suivants qui ne doivent pas être considérés comme limitatifs de l'invention : Intermédiaire 1 : Préparation du 2-amino-benzothiazol-6-ol
Figure imgf000018_0001
Une solution de 2-amino-6-ethoxybenzothiazole (5 g, 25.74 mmol) et d'acide hydrobromique à 48 % dans l'eau (130 ml, 1.141 mol) dans 65 ml d'acide acétique est répartie dans 10 tubes de 20 ml pour micro-ondes, puis chauffée à 150°C au micro-ondes pendant 200 secondes. Le milieu reactionnel est concentré. Le résidu est repris par 200 ml d'eau, basifié à pH 8 par addition de 75 ml d'une solution saturée de NaHCO3 et extrait à l'acétate d'éthyle, lavé par une solution saturée de chlorure de sodium, séché sur sulfate de magnésium et concentré à sec pour conduire à 3.4 g de 2-Amino- benzothiazol-6-ol (poudre grise). LC/MS (méthode A1) : [M+H]+=167.00, temps de rétention : 1.07 min.
Intermédiaire 2 : Préparation du 4-(6-hydroxy-benzothiazol-2-ylcarbamoyl)- piperidine-1-carboxylic acid tert-butyl ester
Figure imgf000018_0002
Une solution de pipéridine-1,4-dicarboxylic acid mono-tert-butyl ester (276 mg, 1.203 mmol), d'HATU (549 mg, 1.444 mmol) et de diisopropylethylamine (187 mg, 1.44 mmol) dans 3 ml de DMF est agitée à température ambiante pendant 15 minutes. Le 2-amino-benzothiazol-6-ol (intermédiaire 1) (200 mg, 1.203 mmol) en solution dans 3 ml de DMF est additionné en une fois. Le milieu reactionnel est agité à température ambiante pendant 2 heures, versé sur une solution de 10 % Na2CO3 dans l'eau (20 ml) et extrait à l'acétate d'éthyle. Le brut reactionnel est purifié par chromatographie sur colonne (éluant : EtOAc/ heptane (1/1)) pour conduire à 401 mg de 4-(6-hydroxy-benzothiazol-2-ylcarbamoyl)- pipéridine-1-carboxylic acid tert-butyl ester (solide blanc). LC/MS (méthode A2) : [M+H]+ = 378.0, temps de rétention : 3.9 minutes.
Intermédaire 3 : Préparation du 4-[6-(4-fluoro-benzènesulfonyloxy)- benzothiazol-2-ylcarbamoyl]-piperidine-1-carboxylic acid tert-butyl ester
Figure imgf000019_0001
Une solution de 4-(6-hydroxy-benzothiazol-2-ylcarbamoyl)-pipéridine-1- carboxylic acid tert-butyl ester (intermédiaire 2) (454 mg, 1.20 mmol), de 4-fluoro-benzènesulfonyl chloride (234 mg, 1.20 mmol) et de triéthylamine (320 μl) dans 10 ml d'acétone est agitée à température ambiante pendant 1 heure. Le chlorhydrate de triéthylamine est filtré et le filtrat évaporé. Le brut reactionnel est purifié par chromatographie sur colonne (éluant : EtOAc/ Heptane (7/3) pour conduire à 400 mg de 4-fluoro-benzènesulfonic 2-[(pipéridine-4-carbonyl)-amino] benzothiazol-6-yl ester (solide blanc). LC/MS (méthode A2) : [M+H]+ = 535.9, temps de rétention : 4.9 minutes.
Intermédaire 4 : Préparation du 4-fluoro-benzènesulfonic 2-[(pipéridine-4- carbonyl)-amino] benzothiazol-6-yl ester
Figure imgf000019_0002
Une solution de 4-[6-(4-fluoro-benzènesulfonyloxy)-benzothiazol-2-y| carbamoyl]-pipéridine-1-carboxylic acid tert-butyl ester (intermédiaire 3) (100 mg, 0.187 mmol), de TFA (0.5 ml) dans du dichlorométhane (4.5 ml) est agitée à température ambiante pendant 1 heure. Le milieu reactionnel est ramené à sec. Le résidu repris dans le minimum d'eau, neutralisé par addition d'une solution aqueuse 10 % de Na2CO3 et extrait à l'acétate d'éthyle pour conduire à 55 mg de 4-fluoro-benzenesulfonic 2-[(piperidine-4-carbonyl)- amino] benzothiazol-6-yl ester (solide blanc). LC/MS (méthode A2) : [M+H]+ = 435.9, temps de rétention : 3.0 minutes. Exemple 5 : Préparation du 4-(2-hydroxy-2-methyl-propylamino)- benzenesulfonic acid 2-[(piperidine-4-carbonyl)-amino]-benzothiazol-6-yl ester
Figure imgf000020_0001
Une solution de 4-fluoro-benzenesulfonic 2-[(piperidine-4-carbonyl)-amino] benzothiazol-6-yl ester (intermédiaire 4) (50 mg, 0.114 mmol) et de 4-(4- pyridin-3-yl-imidazol-1-yl)-butylamine (40.93 mg, 0.459 mmol) dans 0.5 ml de NMP est chauffée à 130°C au micro-ondes pendant 5 minutes. Le brut reactionnel est purifié par LC/MS préparative (milieu basique (pH 9)) pour conduire après lyophilisation à 21 mg de 4-(2-hydroxy-2-methyl-propylamino)- benzenesulfonic 2-(cyclopropanecarbonylamino)-benzothiazol-6-yl ester (solide jaune pâle). LC/MS (méthode A2) : [M+H]+ = 505.2, temps de rétention : 2.70 minutes.
Intermédaire 6 : Préparation du Cyclopropanecarboxylic acid (6-hydroxy- benzothiazol-2-yl)-amide
Figure imgf000020_0002
Dans un ballon de 100 ml, muni d'un barreau aimanté, une solution de 2-amino-benzothiazol-6-ol (intermédiaire 1) (850 mg, 4.6 mmol), d'acide cyclopropane-carboxylique (1.564 g, 18.1 mmol), de N,N-diisopropyl- ethylamine (3.6 ml, 24.4 mmol), d'HBTU (4.1 g, 5.53 mmol) dans 40 ml de diméthylformamide est agitée à température ambiante pendant 16 heures. 150 ml d'eau sont ajoutés au milieu reactionnel, extrait à l'acétate d'éthyle, lavé par une solution saturée de chlorure de sodium, séché sur sulfate de magnésium et concentré à sec. Le résidu obtenu est lavé par de l'acétate d'éthyle conduisant à 893 mg de Cyclopropanecarboxylic acid 2-(cyclopropanecarbonyl-amino)-benzothiazol-6-yl ester. LC/MS :
[M+H]+=303.18, TR=3.53 min. A ce produit est ajoutée une solution de lithium hydroxide monohydrate (200 mg, 4.768 mmol) dans 50 ml de méthanol et 5 ml d'eau. Le milieu reactionnel est mis au reflux sous agitation pendant une heure. Le milieu reactionnel est concentré, acidifié à pH 1 par une solution d'acide chlorhydrique 2N, dilué avec 100 ml d'eau et extrait à l'acétate d'éthyle. La phase organique est lavée par de l'eau, puis par une solution saturée de chlorure de sodium, ramenée à sec conduisant à 500 mg de Cyclopropanecarboxylic acid (6-hydroxy-benzothiazol-2-yl)-amide avec un rendement de 72 % (poudre beige). RMN : Spectre RMN 1H ( 400MHz ) - δ en ppm - dans le DMSO-d6 : de 0,90 à 1,00 (mf, 4H) ; 1,98 (mf, 1H) ; 6,88 (dd, J = 8,5 et 3,0 Hz, 1H) ; 7,27 (d, J = 3,0 Hz, 1 H) ; 7,54 (d, J = 8,5 Hz, 1 H) ; 9,51 (s large, 1 H) ; 12,4 (s large, 1 H) .
Exemple 7 : Préparation du 4-Fluoro-benzenesulfonic acid 2-(cyclopropane- carbonyl-amino)-benzothiazol-6-yl ester
Figure imgf000021_0001
Dans un ballon de 100 ml, muni d'un barreau aimanté, une solution de cyclopropanecarboxylic acid (6-hydroxy-benzothiazol-2-yl)-amide
(intermédiaire 6) (1.81 g, 7.72 mmol), de 4-fluorobenzenesulfonylchloride (1.5 g, 7.72 mmol), de triéthylamine (2.14 ml, 15.45 mmol) dans 43 ml d'acétone est mise sous agitation pendant une heure à température ambiante. Le précipité obtenu est filtré et le filtrat est évaporé. Le résidu est lavé par de l'acétone et de l'éther éthylique, conduisant à 1.92 g de 4-fluoro- benzenesulfonic acid 2-(cyclopropane-carbonyl-amino)-benzothiazol-6-yl ester (poudre blanc cassé) avec un rendement de 66 %.
Masse : IE: m/z 392 [M+], m/z 324 : [M+]-COC3H5 , m/z 233 : [M+]-SO2PhF , m/z 165 : 324-SO2PhF, m/z 69 (pic de base) : [COC3H5]+.
Spectre RMN 1 H ( 300MHz ) - δ en ppm - dans le DMSO-d6 : de 0,92 à 1,03 (mf, 4H) ; 2,02 (mf, 1H) ; 7,04 (dd, J = 8,5 et 2,5 Hz, 1H) ; 7,54 (mf, 2H) ; 7,70 (d, J = 8,5 Hz, 1H) ; 7,80 (d, J = 2,5 Hz, 1H) ; 7,97 (mf, 2H) ; 12,75 (s large, 1 H) . Exemple 8 : Préparation du 4-cyclopentylamino-benzenesulfonic 2-(cyclo- propanecarbonylamino)-benzothiazol-6-yl ester :
Figure imgf000022_0001
Une solution de 4-fluoro-benzenesulfonic 2-(cyclopropanecarbonylamino)~ benzothiazol-6-yl ester (exemple 7) (50 mg, 127.4 μmol) et de cyclopentylamine (51 μl, 0.51 mmol) dans 0.5 ml de NMP est chauffée à 150°C au micro-ondes pendant 5 minutes. Le brut reactionnel est purifié par LC/MS préparative (milieu basique (pH 9)) pour conduire après lyophilisation à 38 mg de 4-cyclopentylamino-benzenesulfonic 2-(cyclopropanecarbonyl- amino)-benzothiazol-6-yl ester (solide blanc). LC/MS (méthode A2) : [M+H]+ = 458.0, temps de rétention : 4.39 minutes.
Exemple 9 : Préparation du 4-(3-imidazol-1-yl-propylamino)-benzenesulfonic 2-(cyclopropanecarbonylamino)-benzothiazol-6-yl ester
Figure imgf000022_0002
Une solution de 4-fluoro-benzenesulfonic 2-(cyclopropanecarbonylamino)- benzothiazol-6-yl ester (exemple 7) (100 mg, 0.255 mmol) et de 3-imidazol-1- yl-propylamine (123 μl, 1.019 mmol) dans 2 ml de NMP est chauffée à 150°C au micro-ondes pendant 5 minutes. Le brut reactionnel est purifié par LC/MS préparative (milieu basique (pH 9)) pour conduire après lyophilisation à 63 mg de4-(3-imidazol-1 -yl-propylamino)-benzenesulfonic 2-(cyclopropanecarbonyl- amino)-benzothiazol-6-yl ester (solide blanc). LC/MS (méthode A2) : [M+H]+ = 498.0, temps de rétention : 2.90 minutes.
Exemple 10 : Préparation du 4-methylamino-benzenesulfonic 2-(cyclo- propanecarbonylamino)-benzothiazol-6-yl ester :
Figure imgf000022_0003
Une solution de 4-fluoro-benzenesulfonic 2-(cyclopropanecarbonylamino)- benzothiazol-6-yl ester (exemple 7) (25 mg, 63.71 μmol) et de methylamine (2N dans MeOH, 200 μl) dans 300 μl de NMP est chauffée à 150°C au microondes pendant 3 minutes. Le brut reactionnel est purifié par LC/MS préparative (milieu basique (pH 9)) pour conduire après lyophilisation à 6.7 mg de 4-méthylamino-benzenesulfonic 2-(cyclopropanecarbonylamino)- benzo-thiazol-6-yl ester (solide beige). LC/MS (méthode A2) : [M+H]+ = 404.1 , temps de rétention : 3.83 minutés.
Exemple 11 : Préparation du 4-(2-hydroxy-2-methyl-propylamino)-benzene- sulfonic 2-(cyclopropanecarbonylamino)-benzothiazol-6-yl ester :
Figure imgf000023_0001
Une solution de 4-fluoro-benzenesulfonic 2-(cyclopropanecarbonylamino)- benzothiazol-6-yl ester (exemple 7) (100 mg, 255 μmol) et de 1~amino-2- methyl-propan-2-ol (91 mg, 1.02 mmol) dans 2 ml de NMP est chauffée à 150°C au micro-ondes pendant 5 minutes. Le brut reactionnel est purifié par LC/MS préparative (milieu basique (pH 9)) pour conduire après lyophilisation à 61 mg de 4-(2-hydroxy-2-methyl-propylamino)-benzenesulfonic 2-(cyclo- propane-carbonylamino)-benzothiazol-6-yl ester (solide beige). LC/MS (méthode A2) : [M+H]+ = 462.1 , temps de rétention : 3.83 minutes.
Exemple 12 : Préparation du 4-(2-diisopropylamino-ethylamino)-benzene- sulfonic 2-(cyclopropanecarbonylamino)-benzothiazol-6-yl ester
Figure imgf000023_0002
Une solution de 4-fluoro-benzenesulfonic 2-(cyclopropanecarbonylamino)- benzothiazol-6-yl ester (exemple 7) (100 mg, 255 μmol) et de N,N- diisopropyl-ethane-1 , 2-diamine (147 mg, 1.02 mmol) dans 2 ml de NMP est chauffée à 110°C au micro-ondes pendant 10 minutes. Le brut reactionnel est purifié par LC/MS préparative (milieu basique (pH 9)) pour conduire après lyophilisation à 66 mg de 4-(2-hydroxy-2-methyl-propylamino)- benzenesulfonic 2-(cyclopropane-carbonylamino)-benzothiazol-6-yl ester (solide beige). LC/MS (méthode A2) : [M+H]+ = 517.1, temps de rétention : 2.93 minutes. Exemple 13 : Préparation du 4-[4-(4-pyridin-3-yI-imidazoi-1-yl)-butyiamino]- benzenesulfonic 2-(cyclopropanecarbonylamino)-benzothiazol-6-yl ester
Figure imgf000024_0001
Une solution de 4-fluoro-benzenesulfonic 2-(cyclopropanecarbonylamino)- benzothiazol-6-yl ester (exemple 7) (50 mg, 127.4 μmol) et de 4-(4-pyridin-3- yl-imidazol-1-yl)-butylamine (110.2 mg, 0.51 mmol) dans 0.5 ml de NMP est chauffée à 150°C au micro-ondes pendant 8 minutes. Le brut reactionnel est purifié par LC/MS préparative (milieu basique (pH 9)) pour conduire après lyophilisation à 36 mg de 4-(2-hydroxy-2-methyl-propylamino)- benzenesulfonic 2-(cyclo-propanecarbonylamino)-benzothiazol-6-yl ester (solide beige). LC/MS (méthode A2) : [M+H]+ = 589.0, temps de rétention : 3.14 minutes.
Intermédiaire 14 : Préparation du (6-Hydroxy-benzothiazol-2-yl)-carbamic acid tert-butyl ester
Figure imgf000024_0002
Dans un ballon de 100 ml, muni d'un barreau aimanté, une solution de 2-amino-benzothiazol-6-ol (intermédiaire 1) (1.91 g, 11.49 mmol), de di-tert- butyl dicarbonate (7.52 g, 34.47 mmol), de triéthylamine (4.9 ml, 34.47 mmol), de 4-diméthylaminopyridine (168 mg, 1.38 mmol) dans 50 ml de dichlorométhane est agitée une nuit à température ambiante. Le milieu reactionnel est ramené à sec et le résidu obtenu est lavé par du dichlorométhane et de l'éther éthylique conduisant à 4.2 g de Carbonic acid 2-tert-butoxycarbonylamino-benzothiazol-6-yl ester tert-butyl ester avec un rendement quantitatif. LC/MS : [M+H]+ :311.16, temps de rétention : 5.27 min.
A ce produit est ajoutée une solution de soude (920 mg, 22.8 mmol) dans 110 ml de méthanol. Le milieu reactionnel est agité 2 heures à température ambiante sous ultra-sons, puis acidifié à pH4 avec une solution d'acide chlorhydrique 2N.
Le milieu reactionnel est ramené à sec et le résidu obtenu est lavé par du dichlorométhane et de l'éther éthylique conduisant à 2.35 g de (6-Hydroxy- benzothiazol-2-yl)-carbamic acid tert-butyl ester (poudre beige) avec un rendement de 77 %.
Masse : IE: m/z 266 [M+], m/z 166 (pic de base) : [M+]-CO2tBu
IR : KBr
3422; 3263; 3091; 2981; 1725; 1608; 1562; 1468; 1278; 1245; 1154; 1049;
862 et 852 cm-1 Spectre RMN 1 H ( 300MHz ) - δ en ppm - dans le DMSO-d6 :
1,52 (s, 9H) ; 6,85 (dd, J = 9,0 et 3,0 Hz, 1H) ; 7,24 (d, J = 3,0 Hz, 1H) ; 7,49 (d, J = 9,0 Hz, 1 H) ; 9,44 (mf étalé, 1 H) ; 11 ,5 (mf, étalé, 1 H) .
Intermédiaire 15 : Préparation du 4-Fluoro-benzenesulfonic acid 2-tert- butoxycarbonylamino-benzothiazol-6-yl ester
Figure imgf000025_0001
Dans un ballon de 100 ml, muni d'un barreau aimanté, une solution de (6-Hydroxy-benzothiazol-2-yl)-carbamic acid tert-butyl ester (intermédaire 14) (3.61 g, 13.08 mmol), de 4-fluorobenzenesulfonylchloride (2.56 g, 13.08 mmol), de triéthylamine (3.63 ml, 26.16 mmol) dans 65 ml d'acétone est mise sous agitation à température ambiante pendant une nuit. Filtrafion du précipité obtenu et le filtrat est ramené à sec. Le résidu sec est lavé par de l'acétate d'éthyle conduisant à 5.02 g de 4-Fluoro-benzenesulfonic acid 2-tert- butoxycarbonylamino-benzothiazol-6-yl ester (poudre blanche) avec un rendement de 62 %. Spectre RMN 1 H ( 400MHz ) - δ en ppm - dans le DMSO-d6 : 1,53 (s, 9H) ; 7,02 (dd, J = 9,0 et 2,5 Hz, 1H) ; 7,55 (t, J = 9,0 Hz, 2H) ; 7,65 (d, J = 9,0 Hz, 1H) ; 7,78 (d, J = 2,5 Hz, 1H) ; 7,98 (dd, J = 5,0 et 9,0 Hz, 2H) ; 11,9 (s large, 1 H) .
Intermédiaire 16 : Préparation du 4-Fluoro-benzenesulfonic acid 2-amino- benzothiazol-6-yl ester
Figure imgf000026_0001
Dans un ballon de 100 ml, muni d'un barreau aimanté, une solution de 4-Fluoro-benzenesulfonic acid 2-tert-butoxycarbonylamino-benzothiazol-6-yl ester (intermédiaire 15) (1.7 g, 3.60 mmol), de 10 ml d'acide trifluoroacétique (130 mmol) dans 10 ml de dichlorométhane, et 1 ml d'eau est mise sous agitation pendant 2 heures à température ambiante. Le milieu reactionnel est ramené à sec et le résidu obtenu est lavé par de l'éther éthylique conduisant à 1.31 g de 4-Fluoro-benzenesulfonic acid 2-amino-benzothiazol-6-yl ester sous forme de sel d'acide trifluoroacétique (poudre blanche) avec un rendement de 83 %. LC/MS (méthode A1): [M+H]+ :325.13, temps de rétention : 3.12 min.
Intermédiaire 17 : Préparation du 4-{[6-(4-Fluoro-benzenesulfonyloxy)-benzo- thiazol-2-ylcarbamoyl]-methyl}-piperidine-1-carboxylic acid tert-butyl ester
Figure imgf000026_0002
Dans un tube à essai, muni d'un barreau aimanté, une solution de 4-Fluoro- benzenesulfonic acid 2-amino-benzothiazol-6-yl ester (intermédiaire 16) (580 mg, 1.32 mmol), de 4-carboxymethyl-piperidine-1-carboxylic acid tert- butyl ester (640 mg, 2.63 mmol), d'HBTU (1.1 g, 2.9 mmol), de N,N- diisopropylamine (1.2 ml, 6.89 mmol) dans 12 ml de diméthylformamide est agitée 3 jours à température ambiante. 200 ml d'eau sont ajoutés au milieu reactionnel extrait à l'acétate d'éthyle. La phase organique est ensuite lavée à l'eau et par une solution saturée de chlorure de sodium, puis séchée sur sulfate de magnésium et évaporée. Le résidu obtenu est repris par de l'acétate d'éthyle et purifié sur cartouche flash Varian contenant 50 g de silice de porosité 15-35 μ par un gradient de 5 à 30 % d'acétate d'éthyle dans le cyclohexane en 100 minutes. Après évaporation du solvant, 700 mg de 4-{[6- (4-Fluoro-benzenesulfonyloxy)-benzothiazol-2-ylcarbamoyl]-methyl}- piperidine-1-carboxylic acid ferf-butyl ester sont obtenus (huile jaune) avec un rendement de 96 %. LC/MS (méthode A1): [M+H]+ .550.11, temps de rétention : 4.14 min. Exemple 18 : Préparation du 4-(2-lsopropylamino-ethylamino)-benzene- sulfonic acid 2-(2-piperidin-4-yl-acetylamino)-benzothiazol-6-yl ester chlorhydrate
Figure imgf000027_0001
1ere étape : Dans un tube à essai, muni d'un barreau aimanté, une solution de 4-{[6-(4-Fluoro-benzenesulfonyloxy)-benzothiazol-2-ylcarbamoyl]-methyl}- piperidine-1-carboxylic acid tert-butyl ester (intermédiaire 17) (174 mg, 0.318 mmol), de N-isopropylethylenediamine (97 mg, 0.954 mmol), de carbonate de césium (103 mg, 0.318 mmol) dans 3 ml de dimethylsulfoxyde est agitée pendant une nuit à 90°C. 100 ml d'eau sont ajoutés au milieu reactionnel extrait à l'acétate d'éthyle. La phase organique est ensuite lavée à l'eau et par une solution saturée de chlorure de sodium, puis séchée sur sulfate de magnésium et évaporée conduisant à 103 mg de 4-({6-[4-(3-lmidazol-1-yl- propylaminô)-benzenesulfonyloxy]-benzothiazol-2-ylcarbamoyl}-methyl)- piperidine-1-carboxylic acid tert-butyl ester (poudre blanche) avec un rendement de 50 %.
2eme étape : Une solution 103 mg de 4-({6-[4-(3-lmidazol-1-yl-propylamino)- benzenesulfonyloxy]-benzothiazol-2-ylcarbamoyl}-methyl)-piperidine-1- carboxylic acid tert-butyl ester, de 2 ml de dioxanne, de 2 ml d'acide chlorhydrique 4N dans le dioxanne est agitée pendant 3 heures à température ambiante. Le précipité obtenu est filtré et lavé par du dioxanne et de l'éther éthylique conduisant à 110 mg de 4-(2-lsopropylamino-ethylamino)- benzenesulfonic acid 2-(2-piperidin-4-yl-acetylamino)-benzothiazol-6-yl ester chlorhydrate (poudre blanche) avec un rendement de 88 %. Masse : LC/MS: m/z 532 [M+Hf , m/z 407 (pic de base) : [M+H]+ - C5H10NCH2CO IR : KBr 3432; 2960; 2793; 2464; 2598; 1560; 1470; 1364; 1162; 1120; 1093; 915; 853 et 753 cm"1
Spectre RMN 1 H ( 400MHz ) - δ en ppm - dans le DMSO-d6 : 1 ,28 (d, J = 7,0 Hz, 6H) ; 1,48 (m, 2H) ; 1 ,83 (d large, J = 12,5 Hz, 2H) ; 2,12 (mf, 1 H) ; 2,52 (masqué, 2H) ; 2,92 (m, 2H) ; 3,10 (mf, 2H) ; 3,28 (d large, J = 12,5 Hz, 2H) ; 3,36 (mt, J = 7,0 Hz, 1 H) ; 3,50 (t, J = 6,0 Hz, 2H) ; 6,78 (d large, J = 9,0 Hz, 2H) ; 7,03 (dd, J = 8,5 et 2,5 Hz, 1H) ; 7,30 (mf, étalé, 1 H) ; 7,56 (d large, J = 9,0 Hz, 2H) ; 7,71 (d, J = 8,5 Hz, 1 H) ; 7,78 (d, J = 2,5 Hz, 1 H) ; 8,58 (mf étalé, 1H) ; 8,81 (mf étalé, 1 H) ; 9,00 (mf étalé, 2H) ; 12,5 (s large, 1 H) .
Exemple 19 : En utilisant la même méthode que l'exemple 18, les exemples suivants sont réalisés en utilisant le 4-{[6-(4-Fluoro-benzenesulfonyloxy)- benzothiazoI-2-ylcarbamoyl]-methyl}-piperidine-1 -carboxylic acid terf-butyl ester comme précurseur (intermédiaire 17) combiné avec différentes aminés. Dans les exemples suivants, le composé obtenu après la première étape est purifié sur cartouche flash de 5 g de silice Interchim (15-35μ) μ) par un gradient de 5 à 10 % de méthanol dans le dichlorométhane avec un débit de 10 ml/min. Ces exemples sont présentés dans le tableau suivant :
Figure imgf000029_0001
Figure imgf000030_0001
Intermédiaire 20 : Préparation du 4-Fluoro-benzenesulfonic acid 2-(8-tert- butoxycarbonylamino-octanoylamino)-benzothiazol-6-yl ester
Figure imgf000031_0001
Selon la méthode de l'intermédiaire 17, le 4-Fluoro-benzenesulfonic acid 2-(8- tert-butoχycarbonylamino-octanoylaminp)-benzothiazol-6-yl ester est préparé en combinant le 4-Fluoro-benzenesulfonic acid 2-amino-benzothiazol-6-yl ester (intermédiaire 16) avec du Boc-8-aminocaprylic acid.
LC/MS (méthode A1 ): [M+H]+:566.01 , temps de rétention : 4.21 min.
Exemple 21 : Préparation du 4-(2-isopropylamino-ethylamino)-benzene- sulfonic acid 2-(8-amino-octanoylamino)-benzothiazol-6-yl ester chlorhydrate
Figure imgf000031_0002
Selon la méthode de l'exemple 18, le 4-(2-isopropylamino-ethylamino)- benzenesulfonic acid 2-(8-amino-octanoylamino)-benzothiazol-6-yl ester chlorhydrate est préparé en combinant le 4-Fluoro-benzenesulfonic acid 2-(8- tert-butoxycarbonylamino-octanoylamino)-benzothiazol-6-yl ester
(intermédiaire 20) avec la N-isopropylethylenediamine. Le composé issu de la première étape (4-(2-isopropylamino-ethylamino)-benzenesulfonic acid 2-(8- tert-butoxycarbonylamino-octanoylamino)-benzothiazol-6-yl ester est purifié sur silice par un gradient de 4 à 15 % de méthanol dans le dichlorométhane. Masse : El: m/z 406 : [M+] - C8Hι6O , m/z 335 : [M+] - C4H10N , m/z 72 C4H10N (pic de base). Cl : m/z 548 [M+H]+ (pic de base) , m/z 407 : [M+H]+ - C8H16NO IR : KBr
3426; 2923; 2448;1717; 1597; 1563; 1472; 1371 ; 1165; 1092; 911; 857; 755; 574 et 548 cm"1 Spectre RMN 1H ( 400MHz ) - δ en ppm - dans le DMSO-d6 : 1,30 (t, J = 7,0 Hz, 6H) ; 1,33 (mf, 6H) ; 1,58 (mf, 2H) ; 1,67 (mf, 2H) ; 2,52 (masqué, 2H) ; 2,79 (mf, 2H) ; 3,01 (mf, 2H) ; 3,36 (mt, J = 7,0 Hz, 1H) ; 3,48 (mf, 2H) ; 6,78 (d large, J = 9,0 Hz, 2H) ; 7,02 (dd, J = 8,5 et 2,5 Hz, 1H) ; 7,30 (mf, 1H) ; 7,56 (d large, J = 9,0 Hz, 2H) ; 7,70 (d, J = 8,5 Hz, 1H) ; 7,77 (d, J = 2,5 Hz, 1H) ; 7,82 (mf étalé, 3H) ; 9,00 (mf étalé, 2H) ; 12,45 (s large, 1H) .
Exemple 22 : En utilisant la même méthode que l'exemple 21 , les exemples suivants sont réalisés en utilisant le 4-Fluoro-benzenesulfonic acid 2-(8-tert- butoxycarbonylamino-octanoylamino)-benzothiazol-6-yl ester (intermédiaire 20) comme precruseur combiné avec différentes aminés. Ces exemples sont présentés dans le tableau suivant :
Figure imgf000032_0001
Figure imgf000033_0002
Intermédiaire 23 : Préparation du 4-{2-[6-(4-Fluoro-benzenesulfonyloxy)- benzo-thiazol-2-ylcarbamoyl]-ethyl}-piperidine-1 -carboxylic acid tert-butyl ester
Figure imgf000033_0001
Selon la méthode de l'intermédiaire 17, le 4-{2-[6-(4-Fluoro- benzenesulfonyloxy)-benzothiazol-2-ylcarbamoyl]-ethyl}-piperidine-1- carboxylic acid tert-butyl ester est préparé en combinant le 4-Fluoro- benzenesulfonic acid 2-amino-benzothiazol-6-yl ester (intermédiaire 16) avec du N-Boc-4-piperidinepropionic acid. LC/MS (méthode A1): [M+H]+ :564.16, temps de rétention : 4.24 min.
Exemple 24 : 4-(2-lsopropylamino-ethylamino)-benzenesulfonic acid 2-(3- piperidin-4-yl-propionylamino)-benzothiazol-6-yl ester chlorhydrate
Figure imgf000034_0001
Selon la méthode de l'exemple 18, le 4-(2-lsopropylamino-ethylamino)- benzenesulfonic acid 2-(3-piperidin-4-yl-propionylamino)-benzothiazol-6-yl ester chlorhydrate est préparé en combinant le 4-{2-[6-(4-Fluoro- benzenesulfonyloxy)-benzothiazol-2-ylcarbamoyl]-ethyl}-piperidine-1- carboxylic acid tert-butyl ester (intermédiaire 23) avec la N,N- diisopropylamine. Le composé issu de la première étape ( le 4-(2-{6-[4-(2- lsopropylamino-ethylamino)-benzenesulfonyloxy]-benzothiazol-2- ylcarbamoyl}-ethyl)-piperidine-1 -carboxylic acid tert-butyl ester) est purifié sur cartouche flash de 5 g de silice de porosité 15-35 μ par un gradient de 1 % à 10 % de méthanol dans le dichlorométhane.
Masse : LC/MS: m/z 546 [M+H]+, m/z 407: [M+H]+ - C5Hι0NC2H4CO , m/z
274 : [M+2H]2+ m/z 294 (pic de base).
Spectre RMN 1H ( 300MHz ) - δen ppm - dans le DMSO-d6 :
1 ,25 (d, J = 7,0 Hz, 6H) ; 1 ,32 (m, 2H) ; de 1 ,45 à 1 ,65 (mf, 3H) ; 1 ,81 (d large, J = 12,5 Hz, 2H) ; 2,52 (masqué, 2H) ; 2,82 (m, 2H) ; 3,07 (mf, 2H) ; 3,25 (d large, J = 12,5 Hz, 2H) ; 3,35 (masqué, 1H) ; 3,45 (mf, 2H) ; 6,73 (d large, J = 9,0 Hz, 2H) ; 6,99 (dd, J = 8,5 et 2,5 Hz, 1 H) ; 7,20 (mf, étalé, 1H) ; 7,52 (d large, J = 9,0 Hz, 2H) ; 7,67 (d, J = 8,5 Hz, 1 H) ; 7,73 (d, J = 2,5 Hz, 1 H) ; 8,40 (mf étalé, 1H) ; 8,65 (mf étalé, 1H) ; 8,87 (mf étalé, 2H) ; 12,4 (s large, 1 H) .
Exemple 25 : En utilisant la même méthode que l'exemple 24, les exemples suivants sont réalisés en utilisant le 4-{2-[6-(4-Fluoro-benzenesulfonyloxy)- benzothiazol-2-ylcarbamoyl]-ethyl}-piperidine-1 -carboxylic acid tert-butyl ester comme précurseur (intermédiaire 23) combiné avec différentes aminés. Ces exemples sont présentés dans le tableau suivant :
Figure imgf000035_0001
Figure imgf000036_0002
Intermédiaire 26 : Préparation du 4-lsobutylamino-benzenesulfonic acid 2- tert-butoxycarbonylamino-benzothiazol-6-yl ester
Figure imgf000036_0001
Une solution de 4-Fluoro-benzenesulfonic acid 2-tert-butoxycarbonylamino- benzothiazol-6-yl ester (intermédiaire 15) (1 g, 2.32 mmol), d'isobutylamine (517 mg, 7.07 mmol), de carbonate de césium (845 mg, 2.59 mmol)dans 12 ml de DMSO est agitée à 80°C pendant une nuit. Au milieu reactionnel, 60 ml d'eau sont ajoutés. Il est extrait par de l'acétate d'éthyle. La phase organique est lavée par de l'eau et par une solution saturée de chlorure de sodium, séchée sur sulfate de magnésium puis évaporée à sec. Le résidu est lavé par de l'éthér éthylique conduisant à 880 mg de 4-lsobutylamino- benzenesulfonic acid 2-tert-butoxycarbonylamino-benzothiazol-6-yl ester (solide beige) avec un rendement de 80 %. LC/MS (méthode A1): [M+H]+ .478.01, temps de rétention : 4.31 min. intermédiaire 27 : Préparation du 4-lsobutylamino-benzenesulfonic acid 2- amino-benzothiazol-6-yl ester
Figure imgf000037_0001
Une solution de 4-lsobutylamino-benzenesulfonic acid 2-tert-butoxycarbonyl- amino-benzothiazol-6-yl ester (intermédiaire 26) (880 mg, 1.93 mmol), d'acide trifluoroacétique (5.7 ml, 74 mmol) dans 6 ml de dichlorométhane et 600 μl d'eau est mise sous agitation pendant une nuit à température ambiante.
Le milieu reactionnel est concentré à sec et le résidu est lavé par de l'ether éthylique conduisant à 700 mg de 4-lsobutylamino-benzenesulfonic acid 2-amino-benzothiazol-6-yl ester sous forme de sel d'acide trifluoroacétique (solide blanc) avec un rendement de 52 %.
LC/MS (méthode A1): [M+H]+ :378.05, temps de rétention : 3.60 min.
Exemple 28 : Préparation du 4-lsobutylamino-benzenesulfonic acid 2-(2- piperidin-4-yl-acetylamino)-benzothiazol-6-yl ester chlorhydrate CIH
Figure imgf000037_0002
1ere étape : Une solution de 4-lsobutylamino-benzenesulfonic acid 2-amino- benzothiazol-6-yl ester (intermédiaire 27) (300 mg, 0.495 mmol) de 4-carboxymethyl-piperidine-1 -carboxylic acid tert-butyl ester (361 mg, 1.485 mmol), d'HBTU (563 mg, 1.485 mmol), de N-N-diisopropylethylamine (432 μl, 2.475 mmol) dans 4 ml de diméthylformamide est agitée à température ambiante pendant une nuit. De l'eau est ajoutée au milieu reactionnel qui est extrait par de l'acétate d'éthyle. La phase organique est lavée par de l'eau, puis par une solution saturée de chlorure de sodium, séchée sur sulfate de magnésium et concentrée à sec. Le résidu obtenu est purifié par CLHP sur colonne Dynamax C18, 60Â, 21 x 300 mm par un mélange d'eau/acétonitrile 95/5 pendant 5 minutes, par un gradient de 5 à 40 % dans l'eau pendant 5 minutes, par un gradient de 40 à 80 % d'acétonitrile dans l'eau pendant 30 minutes, par un gradient de 80 à 95 % d'acétonitrile dans l'eau pendant 5 minutes, puis par un mélange d'eau/acétonitrile 5/95 pendant 5 minutes avec un débit de 20 ml / min. Les solvants contiennent chacun 0.07 % (v/v) d'acide trifluoroacétique. Les fractions sont collectées toutes les 30 secondes et sont contrôlées par CLHP analytique sur colonne Hypersil C18, 4,6 x 50 mm. Par un gradient de 0 à 100 % d'acétonitrile dans l'eau en 10 minutes à un débit de 1 ml/min. Les solvants contiennent chacun 0.07 % (v/v) d'acide trifluoroacétique. Les fractions contenant l'attendu sont concentrés à sec conduisant au 4-{[6-(4- lsobutylamino-benzenesulfonyloxy)-benzothiazol-2-ylcarbamoyl]-methyl} piperidine-1 -carboxylic acid tert-butyl ester.
2eme étape : Une solution de 4-{[6-(4-lsobutylamino-benzenesulfonyloxy)- benzothiazol-2-ylcarbamoyl]-methyl}piperidine-1 -carboxylic acid tert-butyl ester (110 mg, 182 μmol), de dioxanne (2 ml) et d'acide chlorhydrique 4N dans le dioxanne est mise sous agitation pendant 2 heures à température ambiante. Le milieu reactionnel est concentré à sec et le résidu obtenu est lavé par de l'éther éthylique conduisant à 183 mg de 4-lsobutylamino- benzenesulfonic acid 2-(2-piperidin-4-yl-acetylamino)-benzothiazol-6-yl ester chlorhydrate (poudre blanche) avec un rendement de 64 %. Masse : IE: m/z 502 [M+], m/z 377 : [M+] - C7H12NO , m/z 212 : [SO2PhNHiBu]+- m/z 165 : [377 - 212] +-, m/z 126 : [C7Hι2NO]+- (pic de base). Spectre RMN 1 H ( 300MHz ) - δ en ppm - dans le DMSO-d6 : 0,94 (d, J = 6,5 Hz, 6H) ; 1,45 (m, 2H) ; de 1,77 à 1,88 (mf, 3H) ; 2,10 (mf étalé, 1H) ; 2,52 (masqué, 2H) ; 2,83 (m, 2H) ; 2,91 (d, J ≈ 6,5 Hz, 2H) ; 3,25 (d large, J = 12,5 Hz, 2H) ; 6,67 (d large, J = 9,0 Hz, 2H) ; 7,00 (dl, J = 9,0 Hz, 1H) ; 7,15 (mf très étalé, 1H) ; 7,45 (d large, J = 9,0 Hz, 2H) ; 7,67 (d, J = 9,0 Hz, 1H) ; 7,73 (d, J = 2,5 Hz, 1H) ; 8,62 (mf étalé, 1H) ; 8,85 (mf étalé, 1H) ; 12,5 (s large, 1 H)
Exemple 29 : En utilisant la même méthode que l'exemple 28, les exemples suivants sont réalisés en utilisant le 4-lsobutylamino-benzenesulfonic acid 2-amino-benzothiazol-6-yl ester comme précurseur (intermédiaire 27) combiné avec différents acides. Ces exemples sont présentés dans le tableau suivant :
Figure imgf000039_0001
Intermédiaire 30 : Préparation de Thiophene-2-sulfonic acid 2-tert- butoxycarbonyl-amino-benzothiazol-6-yl ester
Figure imgf000040_0001
Une solution de (6-Hydroxy-benzothiazol-2-yl)-carbamic acid tert-butyl ester (intermédiaire 14) (527 mg, 1.979 mmol), de 2-thiophènesulfonylchloride (433 mg, 2.37 mmol), de triéthylamine (677 μl, 4.75 mmol) dans 10 ml d'acétone est mise sous agitation pendant une nuit à température ambiante. Le milieu reactionnel est concentré à sec. Le résidu obtenu est lavé à l'eau, à l'acétone puis à l'éther éthylique conduisant à 621 mg de Thiophene-2- sulfonic acid 2-tert-butoxycarbonylamino-benzothiazol-6-yl ester (poudre gris clair) avec un rendement de 76 %. LC/MS : [M+H]+=412.98, temps de rétention : 3.99 min.
[intermédiaire 31 : Préparation du Thiophene-2-sulfonic acid 2-amino-benzo- thiazol-6-yl ester
Figure imgf000040_0002
Une solution de Thiophene-2-sulfonic acid 2-tert-butoxycarbonylamino- benzothiazol-6-yl ester (intermédiaire 30) (1.5 g, 3.63 mmol), d'acide trifluoroacétique (15 ml, 196 mmol) dans 15 ml de dichlorométhane et 600 μl d'eau est mise sous agitation pendant 2 heures à température ambiante. Le milieu reactionnel est concentré à sec conduisant à 900 mg de Thiophene-2- sulfonic acid 2-amino-benzothiazol-6-yl ester sous forme de sel d'acide trifluoroacétique (huile) avec un rendement de 76 %.
LC/MS (méthode A1): [M+H]+ :313, temps de rétention : 3.11 min.
Exemple 32 : Préparation du Thiophene-2-sulfonic acid 2-[(piperidine-4- carbonyl)-amino]-benzothiazol-6-yl ester; compound with trifluoro-acetic acid
Figure imgf000040_0003
1 ère étape : Une solution de Thiophene-2-sulfonic acid 2-amino-benzothiazol- 6-yl ester (intermédiaire 31) (80 mg, 0.256 mmol), de Boc-isonipecotic acid (176 mg, 0.768 mmol) d'HBTU (291 mg, 0.768 mmol), de N,N- diisopropylethylamine (223 μl, 1.28 mmol) dans 4 ml de diméthylformamide est mise sous agitation pendant 3 jours à température ambiante. 30 ml d'eau sont ajoutés au milieu reactionnel qui est extrait par de l'acétate d'éthyle. La phase organique est lavée par de l'eau et par une solution saturée de chlorure de sodium, séchée sur sulfate de magnésium et concentrée à sec conduisant au 4-[6-Thiophene-2-sulfonyloxy)benzothiazol-2-ylcarbamoyl]- piperidine-1 -carboxylic acid tert-butyl ester. LC/MS :[M+H]+ :523.96, temps de rétention : 4.00 min.
2e e étape : Une solution de 4-[6-Thiophene-2-sulfonyloxy)benzothiazol-2-yl carbamoyl]-piperidine-1 -carboxylic acid tert-butyl ester, d'acide trifluoroactéique (1.5 ml) dans 1.5 ml de dichlorométhane et 100 μl d'eau est mise sous agitation pendant une nuit à température ambiante. Le milieu reactionnel est concentré à sec, repris dans 500 μl de DMSO et un échantillon est purifié par LC/MS préparative (méthode B), conduisant à 3 mg de Thiophene-2-sulfonic acid 2-[(piperidine-4-carbonyl)-amino]-benzothiazol- 6-yl ester; compound with trifluoro-acetic acid.
LC/MS : [M+H]+ :423.97, temps de rétention : 2.74 min.
Exemple 33 : En utilisant la même méthode que l'exemple 32, les exemples suivants sont réalisés en utilisant le Thiophene-2-sulfonic acid 2-amino- benzothiazol-6-yl ester comme précurseur (intermédiaire 31) combiné avec différents acides. Ces exemples sont présentés dans le tableau suivant , les LC/MS sont réalisés selon la méthode A1 :
Figure imgf000041_0001
Figure imgf000042_0001
Intermédiaire 34 : Préparation du 4-(2-diisopropylamino-ethylamino)- benzenesulfonic acid 2-amino-benzothiazol-6-yl ester
Figure imgf000042_0002
Une solution de 4-fluoro-benzenesulfonic acid 2-amino-benzothiazol-6-yl ester (intermédiaire 16) (100 mg, 0.225 mmol. et de N,N- diisopropylethylenediamine (395 μl, 2.25 mmol.) dans 5 ml de NMP est chauffée à 150°C par micro-ondes Εmrys ™ Optimizer" pendant 20 minutes. Le brut reactionnel est repris par 50 ml d'acétate d'éthyle, la solution résultante est lavée par 5 fois 50 ml d'eau. Après décantation la phase organique est séchée sur sulfate de sodium, filtrée et évaporée sous pression réduite pour donner 100 mg de 4-(2-diisopropylamino-ethylamino)- benzenesulfonic acid 2-amino-benzothiazol-6-yl ester . LC/MS (méthode A1) : [M+H]+ = 449.22, temps de rétention : 2.36 min. Intermédiaire 35 : Préparation du 3-{6-[4-(2-Diisopropylamino-ethylamino)- benzenesulfonyloxy]-benzothiazol-2-ylcarbamoyl}-azetidine-1-carboxylic acid tert-butyl ester
Figure imgf000043_0001
Sur une solution de 4-(2-diisopropylamino-ethylamino)-benzenesulfonic acid 2-amino-benzothiazol-6-yl ester (intermédiaire 34) (100 mg, 0.225 mmol.) dans 5 ml de diméthylformamide sont ajoutés 68 mg de Azetidine-1,3- dicarboxylic acid mono-tert-butyl ester, 256 mg de HBTU, 235 μl de DIEA. La solution obtenue est agitée 20 heures à température ambiante. Après avoir ajouté 50 ml d'eau, le mélange reactionnel est extrait par 3 fois 25 ml d'acétate d'éthyle. Les extraits séchés sur sulfate de magnésium, filtrés et évaporés sous pression réduite, conduisent à 700 mg d'huile brute. Cette huile est purifiée par élution dans un mélange dichlorométhane / methanol 95:5 débit de 10 ml/mn.sur 20 g de silice pour donner 39 mg de 3-{6-[4-(2- Diisopropylamino-ethylamino)-benzenesulfonyloxy]-benzothiazol-2- ylcarbamoyl}-azetidine-1 -carboxylic acid tert-butyl ester.
LC/MS : [M+H]+ : 632.11 Temps de rétention : 3.00 min. Méthode A1
Intermédiare 36 : Préparation du 4-(2-Diisopropylamino-ethylamino)-benzene- sulfonic acid 2-(8-tert-butoxycarbonylamino-octanoylamino)-benzothiazol-6-yl ester
Figure imgf000043_0002
Sur une solution de 4-(2-diisopropyIamino-ethylamino)-benzenesulfonic acid 2-amino-benzothiazol-6-yl ester (intermédiaire 34) (100 mg, 0.225 mmol.) dans 5 ml de diméthylformamide sont ajoutés 175 mg de 8-tert- Butoxycarbonylamino-octanoic acid, 256 mg de HBTU, 235 μl de DIEA. La solution obtenue est agitée 20 heures à température ambiante. Après avoir ajouté 50 ml d'eau, le mélange reactionnel est extrait par 3 fois 25 ml d'acétate d'éthyle. Les extraits sont séchés sur sulfate de magnésium, filtrés et évaporés sous pression réduite, et conduisent à 338 mg d'huile brute. Cette huile est purifiée par élution dans un mélange dichlorométhane/ methanol 95:5 débit de 10 ml/mn. sur 10 g de silice pour donner 153 mg de 4- (2-Diisopropylamino-ethylamino)-benzenesulfonic acid 2-(8-tert-butoxy- carbonylamino-octanoylamino)-benzo-thiazol-6-yl ester. LC/MS : [M+H]+ : 690.33 Temps de rétention : 3.25 min. Méthode A1
Intermédiaire 37 : Préparation du 4-(2-Diisopropylamino-ethylamino)- benzene-sulfonic acid 2-[(1 -tert-butoxycarbonylamino-cyclopentanecarbonyl)- amino]-benzothiazol-6-yl ester.
Figure imgf000044_0001
Sur une solution de 4-(2-diisopropylamino-ethylamino)-benzenesulfonic acid 2-amino-benzothiazol-6-yl ester (intermédiaire 34) (100 mg, 0.225 mmol.) dans 5 ml de diméthylformamide sont ajoutés 155 mg de 1-tert- Butoxycarbonylamino-cyclopentanecarboxylic acid, 256 mg de HBTU, 235 μl de DIEA. La solution obtenue est agitée 20 heures à température ambiante. Après avoir ajouté 50 ml d'eau, le mélange reactionnel est extrait par 3 fois 25 ml d'acétate d'éthyle. Les extraits sont séchés sur sulfate de magnésium, filtrés et évaporés sous pression réduite, et conduisent à 720 mg d'huile brute. Cette huile est purifiée par élution dans un mélange dichlorométhane / methanol 95:5 débit de 10 ml/mn.sur 10 g de silice pour donner 120 mg de 4- (2-Diisopropylamino-ethylamino)-benzenesulfonic acid 2-[(1 -tert-butoxy- carbonyl amino-cyclopentanecarbonyl)-amino]-benzothiazol-6-yl ester.
LC/MS : [M+H]+ : 660.56 Temps de rétention : 3.11 min. Méthode A1 [intermédiaire 38 : Préparation du 4-({6-[4-(2-Diisopropylamino-ethylamino)- benzenesulfonyloxy]-benzothiazol-2-carbamoyl}-methyl)-piperidine-1- carboxylic acid tert-butyl ester
Figure imgf000045_0001
Sur une solution de 4-(2-diisopropylamino-ethylamino)-benzenesulfonic acid 2-amino-benzothiazol-6-yl ester (intermédiaire 34) (100 mg, 0.225 mmol.) dans 5 ml de diméthylformamide sont ajoutés 164 mg de 4-Carboxymethyl- piperidine-1 -carboxylic acid tert-butyl ester, 256 mg de HBTU, 235 μl de DIEA. La solution obtenue est agitée 20 heures à température ambiante. Après avoir ajouté 50 ml d'eau, le mélange reactionnel est extrait par 3 fois 25 ml d'acétate d'éthyle. Les extraits sont séchés sur sulfate de magnésium, filtrés et évaporés sous pression réduite, et conduisent à 380 mg d'huile brute. Cette huile est purifiée par élution dans un mélange dichlorométhane/ methanol 95:5 débit de 10 ml/mn.sur 10 g de silice pour donner 90 mg de 4-({6-[4-(2-Diisopropylamino-ethylamino)-benzenesulfonyloxy]-benzothiazol- 2-carbamoyl}-methyl)-piperidine-1 -carboxylic acid tert-butyl ester.
LC/MS : [M+H]+ : 674.57 Temps de rétention : 3.11 mim. Méthode A1
Exemple 39 : Préparation du 4-(2-Diisopropylamino-ethylamino)-benzene- sulfonic acid 2-[(azetidine-3-carbonyl)-amino]-benzothiazol-6-yl ester.
Figure imgf000045_0002
A une solution de 39 mg de 3-{6-[4-(2-Diisopropylamino-ethylamino)- benzenesulfonyloxy]-benzothiazol-2-ylcarbamoyl}-azetidine-1 -carboxylic acid tert-butyl ester (intermédiaire 35) dans 1.5 ml de dioxanne est ajoutée 1.5 ml de dioxanne chlorhydrique. La solution résultante est agitée pendant 5 heures à température ambiante puis évaporée sous pression réduite pour conduire à 49 mg d'huile, purifiée par LC/MS donne 9.7 mg de 4-(2-Diisopropylamino- ethylamino)-benzenesulfonic acid 2-[(azetidine-3-carbonyl)-amino]-benzo- thiazol-6-yl ester. MS : DCI : m/z=532 [M+Hf ES+ : m/z=532 [M+H]+ ; m/z=266,8 [M+2H]++
Exemple 40 : Préparation du 4-(2-Diisopropylamino-ethylamino)-benzene- sulfonic acid 2-(8-amino-octanoylamino)-benzothiazol-6-yl ester.
Figure imgf000046_0001
A une solution de 153 mg de 3-{6-[4-(2-Diisopropylamino-ethylamino)- benzenesulfonyloxy]-benzothiazol-2-ylcarbàmoyl}-azetidine-1 -carboxylic acid tert-butyl ester (intermédiaire 36) dans 3 ml de dioxanne est ajoutée 3 ml de dioxanne chlorhydrique. La solution résultante est agitée pendant 5 heures à température ambiante puis évaporée sous pression réduite pour conduire à 152 mg de 4-(2-Diisopropylamino-ethylamino)-benzenesulfonic acid 2-(8- amino-octanoylamino)-benzothiazol-6-yl ester. MS : DCI : m/z=590 [M+Hf ES+ : m/z=590 [MH]+ ; m/z=295.95 [M+2H]++ Spectre RMN 1 H ( 300MHz ) - δ en ppm - dans le DMSO-d6 : De 1,20 à 1,38 (mf, 16H) ; de 1,42 à 1 ,68 (mf, 6H) ; 2,29 (t, J = 7,0 Hz, 2H) ; 2,74 (mf , 4H) ; 3,16 (mf, 2H) ; de 3,50 à 3,80 (mf, 2H) ; 6,71 (d large, J = 9,0 Hz, 2H) ; 6,96 (d large, J = 9,0 Hz, 1H) ; 7,33 (t large, J = 6,0 Hz, 1H) ; 7,51 (d large, J = 9,0 Hz, 2H) ; 7,64 (d, J = 9,0 Hz, 1H) ; 7,68 (s large, 1H) ; 7,85 (mf étalé, 3H) ; 9,98 (mf, 1H) ; 12,4 (s large, 1H) .
Exemple 41 : Préparation du 4-(2-Diisopropylamino-ethylamino)-benzene- sulfonic acid 2-[(1-amino-cyclopentanecarbonyl)-amino]-benzothiazol-6-yl ester
Figure imgf000047_0001
A une solution de 120 mg de 4-(2-Diisopropylamino-ethylamino)- benzenesulfonic acid 2-[(1-tert-butoxycarbonylamino-cyclopentanecarbonyl)- amfnô]-bënzothiazol-6-yl ester (intermédiaire 37) dans 3 ml de dioxanne est ajoutée 3 ml de dioxanne chlorhydrique. La solution résultante est agitée pendant 5 heures à température ambiante puis évaporée sous pression réduite pour conduire à 90 mg d'huile, purifiée par LC/MS donne 32 mg de 4-(2-Diisopropylamino-ethylamino)-benzenesulfonic acid 2-[(1 -amino- cyclopentanecarbonyl)-amino]-benzothiazol-6-yl ester. Spectre RMN 1H ( 300MHz ) - δ en ppm - dans le DMSO-d6 + 1 goutte AcCOD :
1,26 (d, J = 6,5 Hz, 12H) ; de 1,85 à 2,02 (mf, 6H) ; 2,35 (mf, 2H) ; 3,19 (t, J = 7,0 Hz, 2H) ; 3,50 (t, J = 7,0 Hz, 2H) ; 3,68 (mt, J = 6,5 Hz, 2H) ; 6,72 (d large, J = 9,0 Hz, 2H) ; 6,98 (dd, J = 8,5 et 2,5 Hz, 1H) ; 7,55 (d large, J = 9,0 Hz, 2H) ; 7,76 (d, J = 8,5 Hz, 1 H) ; 7,85 (d, J =2,5 Hz, 1 H) .
Exemple 42 : Préparation du 4-(2-Diisopropylamino-ethylamino)-benzene- sulfonic acid 2-(2-piperidin-4-yl-acetylamino)-benzothiazol-6-yl ester
Figure imgf000047_0002
A une solution de 90 mg de 4-({6-[4-(2-Diisopropylamino-ethylamino)~ benzenesulfonyloxy]-benzothiazol-2-carbamoyl}-methyl)-piperidine-1- carboxylic acid tert-butyl ester (intermédiaire 38) dans 3 ml de dioxanne est ajoutée 3 ml de dioxanne chlorhydrique. La solution résultante est agitée pendant 5 heures à température ambiante puis évaporée sous pression réduite pour conduire à 90 mg d'huile, purifiée par LC/MS donne 101 mg de 4-(2-Diisopropylamino-ethylamino)-benzenesulfonic acid 2-(2-piperidin-4-yl- acetylamino)-benzo-thiazol-6-yl ester. LC/MS : [M+H]+ : 574.23 Temps de rétention : 2.24 min. Méthode A1 MS : DCI : m/z=574 [MH+] ES+ : m/z=574 [MH+] ; m/z=287,9 [(M+2H)/2]+ Spectre RMN 1H ( 400MHz ) - δ en ppm - dans le DMSO-d6 + 1 goutte AcCOD à 383 K (110°C) : 1 ,33 (d, J = 7,0 Hz, 12H) ; de 1 ,42 à 1 ,58 (mf, 2H) ; de 1 ,85 à 1 ,95 (mf, 2H) ; 2,15 (mf, 1H) ; 2,31 (d, J = 7,0 Hz, 2H) ; de 2,87 à 2,97 (mf, 2H) ; 3,22 (t, J = 6,5 Hz, 2H) ; de 3,24 à 3,32 (mf, 2H) ; 3,58 (t, J = 6,5 Hz, 2H) ; de 3,65 à 3,75 (mf, 2H) ; 6,75 (d large, J = 9,0 Hz, 2H) ; 7,08 (dd, J = 8,5 et 2,5 Hz, 1 H) ; 7,58 (d large, J = 9,0 Hz, 2H) ; 7,62 (d, J = 2,5 Hz, 1H) ; 7,65 (d, J = 8,5 Hz, 1H) .
Exemple 43 : Préparation du 4-(2-Diisopropylamino-ethylamino)-benzene-sulfonic acid 2-acetylamino-benzothiazol-6-yl ester
Figure imgf000048_0001
Sur une solution de 4-(2-diisopropylamino-ethylamino)-benzenesulfonic acid 2-amino-benzothiazol-6-yl ester(intermédiaire 34) (70 mg, 0.156 mmol.) dans 4 ml de diméthylformamide sont ajoutés 28 mg d'acide acétique, 177.5 mg de HBTU, 163 μl de DIEA. La solution obtenue est agitée 20 heures à température ambiante. Après avoir ajouté 50 ml d'eau, le mélange reactionnel est extrait par 3 fois 25 ml d'acétate d'éthyle. Les extraits séchés sur sulfate de magnésium, filtrés et évaporés sous pression réduite, conduisent à 130 mg d'huile brute. Cette huile est purifiée par LC/MS donner 15 mg de 4-(2-Diisopropylamino-ethylamino)-benzenesulfonic acid 2-acetylamino- benzo-thiazol-6-yl ester. IR : 3420; 2989; 2680; 1674; 1599; 1542; 1452; 1367; 1268; 1202; 1176; 1161 ; 1134; 1094; 914; 851 ; 831 ; 753; 720 et 579 cm-1
Spectre RMN 1 H ( 300MHz ) - δ en ppm - dans le DMSO-d6 : 1 ,30 (d, J = 6,5 Hz, 12H) ; 2,22 (s, 3H) ; 3,23 (mf , 2H) ; 3,51 (mf, 2H) ; 3,72 (mf, 2H) ; 6,74 (d large, J = 9,0 Hz, 2H) ; 6,90 (mf étalé, 1H) ; 7,03 (d large, J = 9,0 Hz, 1H) ; 7,56 (d large, J = 9,0 Hz, 2H) ; 7,68 (d, J = 9,0 Hz, 1H) ; 7,70 (d, J = 3,0 Hz, 1H) ; 8,46 (mf, 1H) ; 12,4 (s large, 1H) . Exemple 43 a : Préparafondu4-(2-Diisopropylamino-ethylamino)-benzene- sulfonic acid 2-acetylamino-benzothiazol-6-yl ester chlorhydrate :
Figure imgf000049_0001
L'exemple 43 a est synthétisé à partir de 250 mg (0.557 mmol) de 4-(2- diisopropylamino-ethylamino)-benzenesulfonic acid 2-amino-benzo-thiazol-6- yl ester(intermédiaire 34) en solution avec 57 mg (0.557 mmol) d'anhydride acétique, de 216 mg (1.671 mmol) de N,N-diisopropylethylamine, dans 10 ml de dichlorométhane. Le milieu reactionnel est mis une nuit sous agitation, puis les mêmes quantités d'anhydride acétique et de N,N- diisopropylethylamine sont ajoutées 2 fois et la réaction est continuée pendant 3 jours à température ambiante. 50 ml de dichlorométhane sont ensuite ajoutés au milieu reactionnel qui est lavé à l'eau. La phase organique est additionnée d'une solution d'acide chlorhydrique 2N jusqu'à pH 3, puis est lavée par une solution aqueuse saturée de chlorure de sodium, séchée sur sulfate de magnésium et évaporée à sec conduisant à 140 mg de 4-(2- Diisopropylamino-ethylamino)-benzene-sulfonic acid 2-acetylamino- benzothiazol-6-yl ester chlorhydrate avec un rendement de 48 %.
Masse : ES m/z=491 MH+ pic de base
RMN : Spectre RMN 1H à 300 MHz sur spectromètre BRUKER AVANCE DPX-300 avec les déplacements chimiques (δ en ppm) - dans le solvant diméthylsulfoxide - d6 (DMSO-d6) référencé à 2,50 ppm : De 0,90 à 1,35 (m, 12H) ; 2,20 (s, 3H) ; 3,18 (m large, 2H) ; 3,53 (m large, 2H) ; de 3,60 à 3,77 (m large, 2H) ; 6,72 (d large, J = 9,0 Hz, 2H) ; 7,00 (dd, J = 2,5 et 8,5 Hz, 1H) ; 7,04 (m large, 1H) ; 7,53 (d large, J = 9,0 Hz, 2H) ; 7,66 (d, J = 8,5 Hz, 1H) ; 7,68 (d, J = 2,5 Hz, 1H) ; 9,09 (m large, 1H) ; 12,4 (s large, 1 H) .
IR : KBr
3427; 2978; 2658; 1693; 1598; 1542; 1452; 1367; 1267; 1160; 1093; 913; 850 et 578 cm"1 Exemple 44 : 4-(2-Diisopropylamino-ethylamino)-benzenesulfonic acid 2-(2- methoxy-acetylamino)-benzothiazol-6-yl ester
Figure imgf000050_0001
Sur une solution de 4-(2-diisopropylamino-ethylamino)-benzenesulfonic acid 2-amino-benzothiazol-6-yl ester (intermédiaire 34) (70 mg, 0.156 mmol.) dans 4 ml de diméthylformamide sont ajoutés 42.1 mg d'acide méthoxyacétique, 177.5 mg de HBTU, 163 μl de DIEA. La solution obtenue est agitée 20 heures à température ambiante. Après avoir ajouté 50 ml d'eau, le mélange reactionnel est extrait par 3 fois 25 ml d'acétate d'éthyle. Les extraits séchés sur sulfate de magnésium, filtrés et évaporés sous pression réduite, conduisent à 98 mg d'huile brute. Cette huile est purifiée par LC/MS donner 47.8 mg de 4-(2-Diisopropylamino-ethylamino)-benzenesulfonic acid 2-(2- methoxy-acetyl-amino)-benzothiazol-6-yl ester. IR : 3390; 2993; 2666; 1674; 1599; 1541; 1452; 1365; 1269; 1202; 1175; 1161; 1125; 1094; 914; 852; 830; 757; 720 et 570 cm-1
Spectre RMN 1 H ( 300MHz ) - δ en ppm - dans le DMSO-d6 : 1,29 (d, J = 6,5 Hz, 12H) ; 3,23 (mf , 2H) ; 3,40 (s, 3H) ; 3,52 (mf, 2H) ; 3,72 (mf étalé, 2H) ; 4,22 (s, 2H) ; 6,75 (d large, J ≈ 9,0 Hz, 2H) ; 6,90 (t large, J = 6,0 Hz, 1H) ; 7,05 (dd, J = 9,0 et 2,5 Hz, 1H) ; 7,55 (d large, J = 9,0 Hz, 2H) ; 7,70 (d, J = 9,0 Hz, 1H) ; 7,72 (d, J = 2,5 Hz, 1H) ; 8,48 (mf, 1H) ; 12,35 (s, 1H) .
Exemple 44a : Préparation du 4-(2-Diisopropylamino-ethylamino)-benzene- sulfonic acid 2-(2-methoxy-acetylamino)-benzothiazol-6-yl ester chlorhydrate :
Figure imgf000050_0002
L'exemple 44 a est synthétisé selon la méthode de l'exemple 44, à partir de 750 mg (1.672 mmol) de 4-(2-diisopropylamino-ethylamino)-benzenesulfonic acid 2-amino-benzothiazol-6-yl ester (intermédiaire 34) pour obtenir le : 4-(2- Diisopropylamino-ethylamino)-benzenesulfonic acid 2-(2-methoxy-acetyl- amino)-benzothiazol-6-yl ester brut. Celui-ci a été solubilisé dans 1 ml de methanol, 3 ml de dioxanne. 4 ml de dioxanne/HCl 4N ont été ajoutés à la solution. Le milieu reactionnel est mis sous agitation à température ambiante pendant une nuit, puis évaporé à sec. Le résidu obtenu est purifié en chromatographie flash sur une première cartouche de 20 g de silice par un gradient de 0 à 10 % de methanol dans le dichlorométhane. Le produit obtenu ayant une pureté de 90 %, une deuxième purification est réalisée sur une cartouche de 50 g de silice par un gradient de 0 à 10 % de methanol dans le dichlorométhane en 1H30 avec un débit de 20 ml/min. Après concentration à sec des fractions contenant le produit, 205 mg de 4-(2- Diisopropylamino-ethylamino)-benzene-sulfonic acid 2-(2-methoxy-acetyl- amino)-benzothiazol-6-yl ester chlorhydrate sont obtenus avec un rendement de 22 %.
Masse : ES m/z=521 MH pic de base
RMN : Spectre RMN 1H à 300 MHz sur spectromètre BRUKER AVANCE DPX-300 avec les déplacements chimiques (δ en ppm) - dans le solvant diméthylsulfoxide - d6 (DMSO-d6) référencé à 2,50 ppm : De 0,80 à 1,40 (m, 12H) ; de 2,90 à 3,70 (m partiellement masqué, 6H) ; 3,38 (s, 3H) ; 4,20 (s, 2H) ; 6,68 (d large, J = 8,5 Hz, 2H) ; 7,00 (dd, J = 2,5 et 8,5 Hz, 1H) ; 7,49 (d large, J = 8,5 Hz, 2H) ; 7,68 (d, J = 8,5 Hz, 1H) ; 7,70 (d, J = 2,5 Hz, 1H) ; 12,35 (s large, 1H) .
IR : KBr
3388; 2965; 2653; 1704; 1598; 1539; 1451; 1363; 1160; 1093; 914; 852; 754 et 567 cm"1
Exemple 45 : 4-(2-Diisopropylamino-ethylamino)-benzenesulfonic acid 2-(cyclopentanecarbonyl-amino)-benzothiazol-6-yl ester.
Figure imgf000051_0001
Sur une solution de 4-(2-diisopropylamino-ethylamino)-benzenesulfonic acid 2-amino-benzothiazol-6-yl ester (intermédiaire 34) (70 mg, 0.156 mmol.) dans 4 ml de diméthylformamide sont ajoutés 42.1 mg d'acide méthoxyacétique, 177.5 mg de HBTU, 163 μl de DIEA. La solution obtenue est agitée 20 heures à température ambiante. Après avoir ajouté 50 ml d'eau, le mélange reactionnel est extrait par 3 fois 25 ml d'acétate d'éthyle. Les extraits séchés sur sulfate de magnésium, filtrés et évaporés sous pression réduite, conduisent à 135 mg d'huile brute. Cette huile est purifiée par LC/MS donner 55.2 mg de 4-(2-Diisopropylamino-ethylamino)-benzenesulfonic acid 2-(cyclopentane-carbonyl-amino)-benzothiazol-6-yl ester.
IR : 3423; 2968; 2672; 1673; 1599; 1541; 1451; 1365; 1261; 1202; 1175; 1161 ; 1137; 1094; 916; 852; 829; 752; 720 et 568 cm"1
Spectre RMN 1 H ( 300MHz ) - δ en ppm - dans le DMSO-d6 + 1 goutte
AcOD : 1 ,27 (d, J = 6,5 Hz, 12H) ; de 1,52 à 1,80 (mf, 7H) ; 1 ,90 (mf, 1H) ; 2,97 (mt , J = 7,5 Hz, 1H) ; 3,20 (t, J = 6,5 Hz, 2H) ; 3,50 (t, J = 6,5 Hz, 2H) ; 3, 69 (mt, J = 6,5Hz, 2H) ; 6,71 (d large, J = 9,0 Hz, 2H) ; 7,04 (dd, J = 9,0 et 2,5 Hz, 1H) ;7,53 (d large, J = 9,0 Hz, 2H) ; 7,58 (d, J = 2,5 Hz, 1H) ; 7,64 (d, J = 9,0 Hz, 1H) . Intermédiaire 46 - Préparation du 4-Fluoro-benzenesulfonic acid 2-(6-tert- butoxycarbonylamino-hexanoylamino)-benzothiazol-6-yl ester
Figure imgf000052_0001
Dans un ballon de 20 ml muni d'un barreau aimanté, une solution de 4-fluoro- benzenesulfonic acid 2-amino-benzothiazol-6-yl ester (intermédiaire 16, brevetbenzothiazole_V2) (0.15 g 0.46 mmole), de BOC-6-Aminohexanoic acid (0.128 g 0.555 mmole), d'HATU (0.211 g 0.555 mmole), de N,N- diisopropylethylamine (95 μl 0.555 mmole) dans 2ml de DMF est chauffé vers 60°C (ext.) durant 5 heures. Le milieu reactionnel est extrait à l'acétate d'éthyle, lavé avec une solution d'acide chlorhydrique N puis à l'eau. La phase organique est séchée sur sulfate de sodium, filtrée puis évaporée à sec. Le résidu est purifié par chromatographie à l'aide du Quad 12/25 sur une cartouche de type Biotage (40 g de silice) en éluant avec un mélange chlorure de méthylène- Isopropanol 97 : 3. Après évaporation du solvant, 0.199 g de 4-Fluoro- benzenesulfonic acid 2-(6-tert-butoxycarbonylamino-hexanoylamino)-benzo- thiazol-6-yl ester sont récupérés avec un rendement de 80 %. intermédiaire 47 - Préparation du 4-(2-Diisopropylamino-ethylamino)- benzenesulfonic acid 2-(6-tert-butoxycarbonylamino-hexanoylamino)- benzothiazol-6-yl ester
Figure imgf000053_0001
Une solution de 0.194 g de 4-Fluoro-benzenesulfonic acid 2-(6-tert- butoxycarbonylamino-hexanoylamino)-benzothiazol-6-yl ester (0.194 g
0.36 mmole) et de N,N-diisopropylethylenediamine (0.33 ml 1.8 mmole) dans
4 ml de NMP est chauffée 10 minutes à 150°C au micro-ondes. Le brut reactionnel est extrait à l'AcOEt, lavé à l'eau. La phase organique est séchée sur sulfate de sodium, filtrée puis évaporée : on obtient 1.8 g (liquide jaune). On chromatographie sur silice 60 (40-63 μm) en éluant avec un mélange
CH2CI2-MeOH 93 : 7. Après évaporation du solvant on obtient une gomme
(0.215 g) que l'on triture à l'eau. On élimine l'eau, puis reprend la gomme avec du toluène et évapore à sec ce qui conduit à 0.13 g de 4-(2-
Diisopropylamino-ethylamino)-benzenesulfonic acid 2-(6-tert-butoxycarbonyl- amino-hexanoylamino)-benzothiazol-6-yl ester soit un rendement de 54 %.
Exemple 49 - Préparation du 4-(2-Diisopropylamino-ethylamino)- benzenesulfonic acid 2-(6-amino-hexanoylamino)-benzothiazol-6-yl ester chlorhydrate.
Figure imgf000053_0002
Dans un ballon de 10 ml muni d'un barreau aimanté, on introduit 0.12 g de 4- (2-Diisopropylamino-ethylamino)-benzenesulfonic acid 2-(6-tert-butoxy- carbonylamino-hexanoylamino)-benzothiazol-6-yl ester dans 2 ml d'AcOEt, puis on ajoute goutte à goutte 0.5 ml d'acide chlorhydrique en solution dans l'AcOEt. IL se forme une gomme que l'on agite 1 heure à température ambiante.
Le milieu reactionnel est repris à l'eau puis amener à pH 8 avec de l'ammoniaque à 28 %. On extrait à l'AcOEt, lave à l'eau puis sèche la phase organique sur sulfate de sodium. Après filtrafion, le filtrat est évaporé à sec, conduisant à 0.1 g de poudre blanche qui est mise en solution dans 5 ml de methanol puis amenée à pH 2 avec de l'acide chlorhydrique en solution dans l'AcOEt. La suspension est évaporée à sec et reprise avec de 5 ml d'eau avant d'être lyophilisée conduisant à 91 mg de 4-(2-Diisopropylamino- ethylamino)-benzenesulfonic acid 2-(6-amino-hexanoylamino)-benzothiazol- 6-yl ester chlorhydrate soit 80 % de rendement.
Intermédiaire 50 - Préparation du 4-Fluoro-benzenesulfonic acid 2-(7-tert- butoxycarbonylamino-heptanoylamino)-benzothiazol-6-yl
Figure imgf000054_0001
Selon la méthode de l'intermédiaire 46, le 4-Fluoro-benzenesulfonic acid 2-(7-tert-butoxycarbonylamino-heptanoylamino)-benzothiazol-6-yl ester est préparé par action du 4-fluoro-benzenesulfonic acid 2-amino-benzothiazol-6- yl ester (intermédiaire 16, brevetbenzothiazole_V2) avec du BOC- 7-aminoheptanoic acid conduisant à 0.164 g de produit.
Intermédiaire 51 - Préparation du 4-(2-Diisopropylamino-ethylamino)- benzenesulfonic acid 2-(7-tert-butoxycarbonylamino-heptanoylamino)- benzothiazol-6-yl ester
Figure imgf000055_0001
Selon la méthode l'intermédiaire 47, le 4-(2-Diisopropylamino-ethylamino)- benzenesulfonic acid 2-(7-tert-butoxycarbonylamino-heptanoylamino)- benzothiazol-6-yl ester est préparé par action du 4-Fluoro-benzenesulfonic acid 2-(7-tert-butoxycarbonylamino-heptanoylamino)-benzothiazol-6-yl ester avec la N,N-diisopropylethylenediamine. Le produit est purifié par chromatographie sur colonne de type Biotage (8 g de silice) en éluant avec un mélange CHaC -MeOH 95: 5, conduisant à 86 mg de produit soit 44 % dé rendement.
Exemple 52 - Préparation du 4-(2-Diisopropylamino-ethylamino)- benzenesulfonic acid 2-(7-amino-heptanoylamino)-benzothiazol-6-yl ester chlorhydrate.
Figure imgf000055_0002
Selon la méthode de l'exemple 49, ie 4-(2-Diisopropylamino-ethylamino)- benzenesulfonic acid 2-(7-amino-heptanoylamino)-benzothiazol-6-yl ester chlorhydrate est préparé par hydrolyse du 4-(2-Diisopropylamino-ethylamino)- benzenesulfonic acid 2-(7-tert-butoxycarbonylamino-heptanoylamino)- benzothiazol-6-yl en présence d'acide chlorhydrique en solution dans l'AcOEt, conduisant à 47 mg de chlorhydrate soit 77% de rendement.
Exemple 53 - Préparation du 4-(2-isopropylamino-ethylamino)- benzenesulfonic 2-(cyclopropanecarbonylamino)-benzothiazol-6-yl ester chlorhydrate
Figure imgf000056_0001
Une solution de 4-fluoro-benzenesulfonic 2-(cyclopropanecarbonylamino)- benzothiazol-6-yl ester (exemple 53, brevetbenzothiazole_V2) (145 mg, 0.37 mmol) et de N-isopropylethylenediamine (233 μl, 1.85 mmol) dans 4.5 ml de NMP est chauffée à 150°C au micro-ondes pendant 5 minutes. Le brut reactionnel est dilué à l'AcOEt, on lave 3 fois à l'eau et extrait deux fois à l'AcOEt. Les phases organiques sont réunies, séchées sur sulfate de sodium, filtrées puis amenées à sec. Les 165 mg de produit brut sont purifiés par chromatographie sur silice : colonne AIT 8 g. Eluant : CH2CI2 / MeOH/NH-jOH: 90/10/1. Le solide obtenu (96 mg) est mis en solution dans l'AcOEt puis amené à pH 2 avec de l'acide chlorhydrique en solution dans l'AcOEt. La suspension est évaporée à sec et reprise avec 5 ml d'eau avant d'être lyophilisée pour conduire à 76 mg de 4-(2-isopropylamino-ethylamino)- benzenesulfonic 2-(cycloprbpanecarbonylamino)-benzothiazol-6-yl ester chlorhydrate.
Intermédiaire 54 - Préparation du 4-Fluoro-benzenesulfonic acid 2- isobutyrylamino-benzothiazol-6-yl ester
Figure imgf000056_0002
Selon la méthode de l'intermédiaire 46, le 4-Fluoro-benzenesulfonic acid 2-isobutyrylamino-benzothiazol-6-yl ester est préparé par action du 4-fluoro- benzenesulfonic acid 2-amino-benzothiazol-6-yl ester (intermédiaire 16, brevetbenzothiazole_V2) avec l'isobutyric acid. Le brut reactionnel est cristallisé avec de l'éther éthylique, après essorage on isole 0.17 g de solide incolore soit 86 % de rendement.
Exemple 55 - Préparation du 4-(2-Diisopropylamino-ethylamino)- benzenesulfonic acid 2-isobutyrylamino-benzothiazol-6-yl ester chlorhydrate
Figure imgf000057_0001
Selon la méthode de l'exemple 53, le 2, 4-(2-Diisopropylamino-ethylamino)- benzenesulfonic acid 2-isobutyrylamino-benzothiazol-6-yl ester chlorhydrate est préparé par action du 4-Fluoro-benzenesulfonic acid 2-isobutyrylamino- benzothiazol-6-yl ester avec la N,N-diisopropyléthylenediamine. Le brut reactionnel est extrait à l'AcOEt, lavé à l'eau. La phase organique est séchée sur sulfate de sodium, filtrée puis évaporée : on obtient 0.327 g de produit brut qui est chromatographie sur colonne de silice biotage (40 g) en éluant avec un mélange CH2CI2-MeOH 90 : 10. L'huile obtenue cristallise dans l'heptane. Le produit est redissous dans 5 ml d'AcOEt puis on ajoute une solution d'acide chlorhydrique dans l'AcOEt goutte à goutte jusqu'à pH 2.
Le chlorhydrate est essoré, lavé à l'AcOEt puis séché sous vide à 40°C. On isole 0.112 g de 4-(2-Diisopropylamino-ethylamino)-benzenesulfonic acid 2-isobutyrylamino-benzothiazol-6-yl ester chlorhydrate soit 42 % de rendement.
Intermédiaire 56 - Préparation du 4-Fluoro-benzenesulfonic acid 2- propionylamino-benzothiazol-6-yl ester
Figure imgf000058_0001
Selon la méthode de l'intermédiaire 46, le 4-Fluoro-benzenesulfonic acid 2- propionylamino-benzothiazol-6-yl ester est préparé par action du 4-fluoro- benzenesulfonic acid 2-amino-benzothiazol-6-yl ester (intermédiaire 16, brevetbenzothiazole_V2) avec du propionic acid. Le produit, 0.397 g, est obtenu avec un rendement de 93 %.
Exemple 57 - Préparation du 4-(2-Diisopropylamino-ethylamino)- benzenesulfonic acid 2-propionylamino-benzothiazol-6-yl ester chlorhydrate.
Figure imgf000058_0002
Selon la méthode de l'exemple 53, le 4-(2-Diisopropylamino-ethylamino)- benzenesulfonic acid 2-propionylamino-benzothiazol-6-yl ester est préparé par action du 4-Fluoro-benzenesulfonic acid 2-propionylamino-benzothiazol- 6-yl ester avec la N,N-diisopropyléthylenediamine en chauffant 10 minutes au micro-ondes à 150°C. Le produit, 0.09 g, est obtenu après purification avec un rendement de 45 % sous forme de chlorhydrate.
Exemple 58 - Préparation du 4-(2-Hydroxy-2-methyl-propylamino)- benzenesulfonic acid 2-propionylamino-benzothiazol-6-yl ester
Figure imgf000058_0003
Selon la méthode de l'exemple 53, le 4-(2-Hydroxy-2-methyl-propylamino)- benzenesulfonic acid 2-propionylamino-benzothiazol-6-yl ester est préparé par action du 4-Fluoro-benzenesulfonic acid 2-propionylamino-benzothiazol- 6-yl ester avec la 1-amino-2-methyl-propan-2-ol en chauffant 20 minutes au micro-ondes à 150°C. Le produit, 0.096 g, est obtenu après purification avec un rendement de 50 % sous forme de chlorhydrate.
Intermédiaire 59 - 4-Fluoro-benzenesulfonic acid 2-(cyclobutanecarbonyl- amino)-benzothiazo!-6-yl ester
Figure imgf000059_0001
Selon la méthode de l'intermédiaire 46, le 4-Fluoro-benzenesulfonic acid 2-(cyclobutanecarbonyl-amino)-benzothiazol-6-yl ester est préparé par action du 4-fluoro-benzenesulfonic acid 2-amino-benzothiazol-6-yl ester avec le cyclobutanecarboxylic acid.
Exemple 60 : Préparation du 4-(2-Diisopropylamino-ethylamino)- benzenesulfonic acid 2-(cyclobutanecarbonyl-amino)-benzothiazol-6-yl ester chlorhydrate
Figure imgf000059_0002
Selon la méthode de l'exemple 53, le 4-(2-Diisopropylamino-ethylamino)- benzenesulfonic acid 2-(cyclobutanecarbonyl-amino)-benzothiazol-6-yl ester est préparé par action du 4-Fluoro-benzenesulfonic acid 2-propionylamino- benzothiazol-6-yl ester avec la N,N-diisopropyléthylenediamine en chauffant 10 minutes au micro-ondes à 150°C. Le produit, 0.054 g, est obtenu après purification avec un rendement de 18 % sous forme de chlorhydrate.
Intermédiaire 61 : Préparation du 4-Fluoro-benzenesulfonic acid 2-(3-pyridin- 3-yl-propionylamino)-benzothiazol-6-yl ester.
Figure imgf000060_0001
Selon la méthode de l'intermédiaire 46, le 4 Fluoπ benzenesuïfonic acid 2-(3- pyridin-3-yl-propionylamino)-benzothiazol-6-yl ester est préparé par action du 4-fluoro-benzenesulfonic acid 2-amino-benzothiazol-6-yl ester avec le 3-(3- pyridyl)-propionic acid. Le produit est obtenu avec un rendement quantitatif.
Exemple 62 :- Préparation du 4-(2-Diisopropylamino-ethylamino)- benzenesulfonic acid 2-(3-pyridin-3-yl-propionylamino)-benzothiazol-6-yl ester chlorhydrate.
Figure imgf000060_0002
Selon la méthode de l'exemple 7, le 4-(2-Diisopropylamino-ethylamino)- benzenesulfonic acid 2-(3-pyridin-3-yl-propionylamino)-benzothiazol-6-yl ester est préparé par action du 4-Fluoro-benzenesulfonic acid 2-(3-pyridin-3-yl- propionylamino)-benzothiazol-6-yl ester avec la N,N-diisopropyléthylene- diamine en chauffant 10 minutes au micro-ondes à 150°C. Le produit, 0.045 g, est obtenu après purification avec un rendement de 23 % sous forme de chlorhydrate.
Exemple 63 : Préparation du 4-(2-Hydroxy-2-methyl-propylamino)- benzenesulfonic acid 2-(3-pyridin-3-yl-propionylamino)-benzothiazol-6-yl ester chlorhydrate.
Figure imgf000061_0001
Selon la méthode de l'exemple 53, le 4-(2-Hydroxy-2-methyl-propylamino)- benzenesulfonic acid 2-(3-pyridin-3-yl-propionylamino)-benzothiazol-6-yl ester est préparé par action du 4-Fluoro-benzenesulfonic acid 2-(3-pyridin-3-yl- propionylamino)-benzothiazol-6-yl ester avec la 1-amino-2-methyl-propan-2-ol en chauffant 20 minutes au micro-ondes à 150°C. Le produit, 0.104 g, est obtenu après purification avec un rendement de 52 % sous forme de chlorhydrate.
Intermédiaire 64 : Préparation du 4-Fluoro-benzenesulfonic acid 2- acetylamino-benzothiazol-6-yl ester
Figure imgf000061_0002
Dans un tube à essai, muni d'un barreau aimanté, une solution de 4-Fluoro- benzenesulfonic acid 2-amino-benzothiazol-6-yl ester (intermédiaire 16) (101.2 mg, 0.312 mmol), d'acide acétique (56.2 mg, 0.936 mmol), d'HBTU (355 mg, 0.936 mmol), de N,N-diisopropylamine (326 μl, 1.872 mmol) dans 5 ml de diméthylformamide est agitée 20 heures à température ambiante. 100 ml d'eau sont ajoutés au milieu reactionnel extrait à l'acétate d'éthyle. La phase organique est séchée sur sulfate de magnésium et évaporée. Le résidu obtenu est repris par de l'acétate d'éthyle et purifié sur cartouche flash Varian contenant 5 g de silice de porosité 15-35 μ par mélange de 1 % de methanol dans le dichlorométhane. Après évaporation du solvant, 66 mg de 4-Fluoro-bénzenesulfonic acid 2-acetylamino-benzothiazol-6-yl ester sont obtenus (huile jaune) avec un rendement de 58 %. LC/MS (méthode A1): [M+H]+ : 367.14, temps de rétention : 3.50 min.
Exemple 65 : Préparation du 4-(2-lsopropylamino-ethylamino)-benzene- sulfonic acid 2-acetylamino-benzothiazol-6-yl ester
Figure imgf000062_0001
Dans un tube à essai, muni d'un barreau aimanté, une solution de 4-Fluoro- benzenesulfonic acid 2-acetylamino-benzothiazol-6-yl ester (intermédiaire 64) (66 mg, 0.180 mmol), de N-isopropylethylenediamine (55.2 mg, 0.540 mmol), de carbonate de césium (58.6 mg, 0.180 mmol) dans 2 ml de dimethylsulfoxyde est agitée pendant une nuit à 80°C. 100 ml d'eau sont ajoutés au milieu reactionnel extrait à l'acétate d'éthyle. La phase organique est ensuite lavée à l'eau, séchée sur sulfate de magnésium et évaporée. Le résidu purifiée par LC/MS conduit à 43 mg de 4-(2-lsopropylamino- ethylamino)-benzenesulfonic acid 2-acetylamino-benzothiazol-6-yl ester (poudre blanche) avec un rendement de 53 %.
LC/MS (méthode A1): [M+H]+ : 449.35, temps de rétention : 3.28 min.
Spectre RMN 1H à 300 MHz sur spectromètre BRUKER AVANCE DPX-300 avec les déplacements chimiques (δ en ppm) - dans le solvant diméthylsulfoxide - d6 (DMSO-d6) référencé à 2,50 ppm :
Forte présomption pour le produit salifié par TFA avec :
1,21 (d, J = 7,0 Hz, 6H) ; 2,20 (s, 3H) ; 3,07 (m , 2H) ; de 3,20 à 3,35 (m masqué, 1 H) ; 3,41 (m, 2H) ; 6,72 (d large, J = 8,5 Hz, 2H) ; 6,93 (t large, J = 6,0 Hz, 1H) ; 7,01 (dd, J = 2,5 et 8,5 Hz, 1H) ; 7,53 (d large, J = 8,5 Hz, 2H) ; 7,68 (d, J = 8,5 Hz, 1H) ; 7,69 (d, J = 2,5 Hz, 1H) ; 8,30 (m étalé, 2H) ; 12,4 (s large, 1H). Intermédiaire 66 : Préparation du 4-Fluoro-benzenesulfonic acid 2-(2- methoxy-acetylamino)-benzothiazol-6-yl ester
Figure imgf000063_0001
Dans un tube à essai, muni d'un barreau aimanté, une solution de 4-Fluoro- benzenesulfonic acid 2-amino-benzothiazol-6-yl ester (intermédiaire 16) (101.2 mg, 0.312 mmol), de methoxyacetique acid (84.3 mg, 0.936 mmol), d'HBTU (355 mg, 0.936 mmol), de N,N-diisopropylamine (326 μl, 1.872 mmol) dans 5 ml de diméthylformamide est agitée 20 heures à température ambiante. 100 ml d'eau sont ajoutés au milieu reactionnel extrait à l'acétate d'éthyle. La phase organique est séchée sur sulfate de magnésium et évaporée. Le résidu obtenu est repris par de l'acétate d'éthyle et purifié sur cartouche flash Varian contenant 5 g de silice de porosité 15-35 μ par mélange de 1 % de methanol dans le dichlorométhane. Après évaporation du solvant, 89 mg de 4-Fluoro-benzenesulfonic acid 2-but-3- enoylamino-benzothiazol-6-yl ester sont obtenus (huile jaune) avec un rendement de 72 %. LC/MS (méthode A1): [M+H]+ : 397.11, temps de rétention : 3.59 min.
Exemple 67 : Préparation du 4-(2-lsopropylamino-ethylamino)- benzenesulfonic acid 2-(2-methoxy-acetylamino)-benzothiazol-6-yl ester.
Figure imgf000063_0002
Dans un tube à essai, muni d'un barreau aimanté, une solution de 4-(2- lsopropylamino-ethylamino)-benzenesulfonic acid 2-(2-methoxy-acetylamino)- benzothiazol-6-yl ester (intermédiaire 66) (89 mg, 0.224 mmol), de N-isopropylethylenediamine (68.7 mg, 0.672 mmol), de carbonate de césium (73 mg, 0.224 mmol) dans 2 ml de dimethylsulfoxyde est agitée pendant une nuit à 80°C. 100 ml d'eau sont ajoutés au milieu reactionnel extrait à l'acétate d'éthyle. La phase organique est ensuite lavée à l'eau, séchée sur sulfate de magnésium et évaporée. Le résidu purifiée par LC/MS conduit à 46.6 mg de 4-(2-lsopropylamino-ethylamino)-benzenesulfonic acid 2-(2-methoxy- acetylamino)-benzothiazol-6-yl ester (poudre blanche) avec un rendement de 43 %.
LC/MS (méthode A1 ): [M+H]+ : 479.35, temps de rétention : 3.33 min.
Spectre RMN 1H à 300 MHz sur spectromètre BRUKER AVANCE DPX-300 avec les déplacements chimiques (δ en ppm) - dans le solvant diméthylsulfoxide - d6 (DMSO-d6) référencé à 2,50 ppm :
Forte présomption pour produit salifié par le TFA avec : 1,21 (d, J = 7,0 Hz, 6H) ; 3,07 (t large, J = 6,5 Hz , 2H) ; de 3,15 à 3,35 (m masqué, 1H) ; 3,38 (s, 3H) ; 3,41 (m, 2H) ; 4,20 (s, 2H) ; 6,72 (d large, J = 8,5 Hz, 2H) ; 6,93 (t large, J = 6,0 Hz, 1 H) ; 7,03 (dd, J = 2,5 et 8,5 Hz, 1 H) ; 7,53 (d large, J = 8,5 Hz, 2H) ; 7,69 (d, J = 8,5 Hz, 1 H) ; 7,71 (d, J = 2,5 Hz, 1H) ; de 8,10 à 8,45 (m étalé, 2H) ; de 12,0 à 12,5 (m très étalé, 1H).
Intermédiaire 68 - Préparation du 4-Fluoro-benzenesulfonic acid 2- (cyclopentane carbonyl-amino)-benzothiazol-6-yl ester
Figure imgf000064_0001
Dans un tube à essai, muni d'un barreau aimanté, une solution de 4-Fluoro- benzenesulfonic acid 2-amino-benzothiazol-6-yl ester (intermédiaire 16) (101.2 mg, 0.312 mmol), decyclopentanecarboxylique acid (53.4 mg, 0.936 mmol), d'HBTU (355 mg, 0.936 mmol), de N,N-diisopropylamine (326 μl, 1.872 mmol) dans 5 ml de diméthylformamide est agitée 20 heures à température ambiante. 100 ml d'eau sont ajoutés au milieu reactionnel extrait à l'acétate d'éthyle. La phase organique est séchée sur sulfate de magnésium et évaporée. Le résidu obtenu est repris par de l'acétate d'éthyle et purifié sur cartouche flash Varian contenant 5 g de silice de porosité 15-35 μ par mélange de 1 % de methanol dans le dichlorométhane. Après évaporation du solvant, 90 mg de 4-Fluoro-benzenesulfonic acid 2- (cyclopentane carbonyl-amino)-benzothiazol-6-yl ester sont obtenus (huile jaune) avec un rendement de 68 %. LC/MS (méthode A1): [M+H]+ : 421.13, temps de rétention : 4.05 min.
Exemple 69 : Préparation du 4-(2-lsopropylamino-ethylamino)- benzenesulfonic acid 2-(cyclopentanecarbonyl-amino)-benzothiazoI-6-yl ester
Figure imgf000065_0001
Dans un tube à essai, muni d'un barreau aimanté, une solution de 4-Fluoro- benzenesulfonic acid 2-(2-methoxy-acetylamino)-benzothiazol-6-yl ester (intermédiaire 68) (90 mg, 0.214 mmol), de N-isopropylethylenediamine (65.6 mg, 0.642 mmol), de carbonate de césium (69.7 mg, 0.214 mmol) dans 2 ml de dimethylsulfoxyde est agitée pendant une nuit à 80°C. 100 ml d'eau sont ajoutés au milieu reactionnel extrait à l'acétate d'éthyle. La phase organique est ensuite lavée à l'eau, séchée sur sulfate de magnésium et évaporée. Le résidu purifiée par LC/MS conduit à 26.2 mg de 4-(2-lsopropylamino- ethylamino)-benzenesulfonic acid 2-(cyclopentanecarbonyl-amino)- benzothiazol-6-yl ester (poudre blanche) avec un rendement de 24 %.
LC/MS (méthode A1): [M+H]+ : 503.39, temps de rétention : 3.68 min.
Spectre RMN 1 H à 300 MHz sur spectromètre BRUKER AVANCE DPX-300 avec les déplacements chimiques (δ en ppm) - dans le solvant diméthylsulfoxide - d6 (DMSO-d6) référencé à 2,50 ppm : Forte présomption pour produit salifié par TFA avec : 1,21 (d, J = 7,0 Hz, 6H) ; de 1 ,50 à 1,80 (m, 6H) ; de 1,82 à 1 ,98 (m, 2H) ; 2,98 (m, 1H) ; 3,04 (m, 2H) ; de 3,15 à 3,55 (m, 3H) ; 6,71 (d large, J = 8,5 Hz, 2H) ; 6,92 (t large, J = 6,0 Hz, 1H) ; 7,02 (dd, J = 2,5 et 8,5 Hz, 1H) ; 7,53 (d large, J = 8,5 Hz, 2H) ; de 7,65 à 7,70 (m, 2H) ; de 8,05 à 8,45 (m très étalé, 2H) ; 12,4 (m étalé, 1 H). Intermédiaire 70 : Préparation du 4-Fluoro-benzenesulfonic acid 2- propionylamino-benzothiazol-6-yl ester
Figure imgf000066_0001
Une solution de 4-Fluoro-benzenesulfonic acid 2-amino-benzothiazol-6-yl ester (intermédiaire 16) (500 mg, 1.14 mmol), d'acide propionic, (253 mg, 3.42 mmol), d'HBTU (1.23g, 3.42 mmol), de N,N-diisopropylamine (737 mg, 5.7 mmol) dans 6.5 ml de diméthylformamide est mise sous agitation pendant une nuit à température ambiante. Le milieu reactionnel est évaporé à sec. Le résidu sec est extrait 2 fois par 50 ml d'acétate d'éthyle et lavé à l'eau. La phase organique est lavée ensuite par une solution saturée de chlorure de sodium. La phase organique est séchée sur sulfate de magnésium, puis évaporée. L'huile obtenue est solubilisée dans 35 ml de dimethylsulfoxyde, puis purifiée en 7 fois par HPLC préparative sur une colonne de phase inversé Nucléodur C18, 100 A, 10 μm par un gradient en 52 minutes de 5 à 95 % d'acétonitrile additionné de 0.07 % d'acide trifluoroacétique dans l'eau, additionnée de 0.07 % d'acide trifluoroacétique. Le débit est de 70 ml/min. Les fractions contenant le produit propre sont concentrées pour obtenir 300 mg de 4-Fluoro-benzenesulfonic acid 2-propionylamino-benzothiazol-6-yl ester avec un rendement de 69 %.
RMN : Spectre RMN 1H à 300 MHz sur spectromètre BRUKER AVANCE DPX-300 avec les déplacements chimiques (δ en ppm) - dans le solvant diméthylsulfoxide - d6 (DMSO-d6) référencé à 2,50 ppm :
1,11 (t, J = 7,5 Hz, 3H) ; 2,50 (m partiellement masqué, 2H) ; 7,01 (dd, J = 2,5 et 8,5 Hz, 1 H) ; 7,51 (t large, J = 9,0 Hz, 2H) ; 7,68 (d, J = 8,5 Hz, 1H) ; 7,79 (d, J = 2,5 Hz, 1H) ; 7,94 (dd large, J = 5,5 et 9,0 Hz, 2H) ; 12,4 (s large, 1 H) . Exemple 71 - Préparation du 4-(2-lsopropylamino-ethylamino)-benzene- sulfonic acid 2-propionylamino-benzothiazol-6-yl ester; compound with trifluoro-acetic acid
Figure imgf000067_0001
Une solution de 4-Fluoro-benzenesulfonic acid 2-propionylamino- benzothiazol-6-yl ester (intermédiaire 70) (300 mg, 0.789 mmol), de N- isopropylethylenediamine (242 mg, 2.37 mmol), de césium carbonate (256 mg, 0.789 mmol) dans 4 ml de dimethylsulfoxyde est mise à 80°C sous agitation pendant 7H30, puis à température ambiante pendant 2 jours. Le milieu reactionnel est filtré, rincé par 8 ml de dimethylsulfoxyde. Le produit attendu est purifié en 3 fois par HPLC préparative dans les mêmes conditions que pour l'intermédiaire 70. 205 mg de 4-(2-lsopropylamino-ethylamino)- benzene-sulfonic acid 2-propionylamino-benzothiazol-6-yl ester; compound with trifluoro-acetic acid sont obtenus avec un rendement de 56 %. RMN : Spectre RMN 1H à 300 MHz sur spectromètre BRUKER AVANCE DPX-300 avec les déplacements chimiques (δ en ppm) - dans le solvant diméthylsulfoxide - d6 (DMSO-d6) référencé à 2,50 ppm :
1.11 (t. J = 7.5 Hz. 3H) : 1.22 (d. J = 6.5 Hz. 6H) : de 2.45 à 2.54 (m partiellement masoué, 2H) ; 3.07 (m. 2H) : de 3,22 à 3.47 (m partiellement masqué, 3H) : 6.72 (d large. J = 9.0 Hz. 2H) : 6.93 (t large. J = 6.0 Hz. 1H) : 7.02 (dd, J = 2.5 et 8.5 Hz. 1H) : 7.53 (d large. J = 9.0 Hz. 2H) : 7.67 (d. J = 8.5 Hz. 1H) : 7,69 (d, J = 2,5 Hz, 1H) : de 8,22 à 8,38 (m étalé. 2H) : 12.35 (s large. 1 H) .
Intermédiaire 72 - Préparation du 4-Fluoro-benzenesulfonic acid 2- butyrylamino-benzothiazol-6-yl ester *-cCτfO-
Selon la méthode de l'intermédiaire 70, l'intermédiaire 72 est synthétisé en utilisant le butyric acid. 80 mg de 4-Fluoro-benzènesulfonic acid 2-butyryl- amino-benzothiazol-6-yl ester sont obtenus avec un rendement de 18 %. RMN : Spectre RMN 1H à 300 MHz sur spectromètre BRUKER AVANCE DPX-300 avec les déplacements chimiques (δ en ppm) - dans le solvant diméthylsulfoxide - d6 (DMSO-d6) référencé à 2,50 ppm : 0,92 (t, J = 7,5 Hz, 3H) ; 1,64 (m, 2H) ; 2,48 (m partiellement masqué, 2H) ; 7,01 (dd, J = 2,5 et 8,5 Hz, 1H) ; 7,51 (t large, J = 9,0 Hz, 2H) ; 7,68 (d, J = 8,5 Hz, 1H) ; 7,78 (d, J = 2,5 Hz, 1H) ; 7,93 (dd large, J = 5,5 et 9,0 Hz, 2H) ; 12,4 (s large, 1H) .
Exemple 73 - Préparation du 4-(2-lsopropylamino-ethylamino)-benzene- sulfonic acid 2-butyrylamino-benzothiazol-6-yl ester; compound with trifluoro- acetic acid
Figure imgf000068_0001
Selon la méthode de l'exemple 71, l'exemple 73 est obtenu en utilisant l'intermédiaire 72 avec la N-isopropylethylenediamine. 37 mg de 4-(2- lsopropylamino-ethylamino)-benzene-sulfonic acid 2-butyrylamino-benzo- thiazol-6-yl ester; compound with trifluoro-acetic acid avec un rendement de 36 %.
RMN : Spectre RMN 1H à 300 MHz sur spectromètre BRUKER AVANCE DPX-300 avec les déplacements chimiques (δ en ppm) - dans le solvant diméthylsulfoxide - d6 (DMSO-d6) référencé à 2,50 ppm : 0,91 (t, J = 7,5 Hz, 3H) ; 1,22 (d, J = 6,5 Hz, 6H) ; 1,63 (m, 2H) ; 2,47 (t partiellement masqué, J = 7,5 Hz, 2H) ; 3,07 (m, 2H) ; de 3,20 à 3.37 (m masqué, 1H) ; 3,41 (m, 2H) ; 6,72 (d large, J = 9,0 Hz, 2H) ; 6,94 (t large, J = 6,0 Hz, 1H) ; 7,02 (dd, J = 2,5 et 8,5 Hz, 1H) ; 7,53 (d large, J = 9,0 Hz, 2H) ; 7,66 (d, J = 8,5 Hz, 1H) ; 7,69 (d, J = 2,5 Hz, 1H) ; 8,32 (m étalé, 2H) ; 12,4 (s large, 1 H) .
Intermédiaire 74 - Préparation du 4-Fluoro-benzenesulfonic acid 2-iso- butyrylamino-benzothiazol-6-yl ester
Figure imgf000069_0001
Selon la méthode de l'intermédiaire 70, l'intermédiaire 74 est synthétisé en utilisant l'isobutyric acid. 75 mg de 4-Fluoro-benzenesulfonic acid 2- isobutyrylamino-benzothiazol-6-yl ester sont obtenus avec un rendement de
17 %.
RMN : Spectre RMN 1H à 300 MHz sur spectromètre BRUKER AVANCE DPX-300 avec les déplacements chimiques (δ en ppm) - dans le solvant diméthylsulfoxide - d6 (DMSO-d6) référencé à 2,50 ppm :
1.14 (d. J = 7.0 Hz, 6H) : 2,79 (m, 1H) ; 7,02 (dd, J = 2,5 et 8,5 Hz, 1H) :
7,51 (t large, J = 9,0 Hz, 2H) : 7,68 (d, J = 8,5 Hz, 1H) : 7,79 (d, J = 2,5 Hz,
1 H) ; 7,93 (dd large. J = 5,5 et 9,0 Hz, 2H) : 12,4 (s large, 1 H) .
Exemple 75 - Préparation du 4-(2-lsopropylamino-ethylamino)- benzenesulfonic acid 2-isobutyrylamino-benzothiazol-6-yl ester: compound with trifluoro-acetic acid
Figure imgf000069_0002
Selon la méthode de l'exemple 71, l'exemple 75 est obtenu en utilisant l'intermédiaire 74 avec la N-isopropylethylenediamine. 49 mg de 4-(2- lsopropylamino-ethylamino)-benzenesulfonic acid 2-isobutyτylamino- benzothiazol-6-yl ester; compound with trifluoro-acetic acid sont obtenus avec un rendement de 44 %. RMN : Spectre RMN 1H à 300 MHz sur spectromètre BRUKER AVANCE DPX-300 avec les déplacements chimiques (δ en ppm) - dans le solvant diméthylsulfoxide - d6 (DMSO-d6) référencé à 2,50 ppm : 1,14 (d, J = 6,5 Hz, 6H) ; 1,22 (d, J = 6,5 Hz, 6H) ; 2,79 (m, 1H) ; 3,07 (m, 2H) ; de 3,25 à 3.37 (m masqué, 1 H) ; 3,41 (m, 2H) ; 6,72 (d large, J = 9,0 Hz, 2H) ; 6,93 (t large, J = 6,0 Hz, 1H) ; 7,03 (dd, J = 2,5 et 8,5 Hz, 1H) ; 7,53 (d large, J = 9,0 Hz, 2H) ; de 7,64 à 7,70 (m, 2H) ; 8,30 (m étalé, 2H) ; 12,4 (s large, 1 H) .
Intermédiaire 76 - Préparation du 4-Fluoro-benzenesulfonic acid 2- (cyclobutanecarbonyl-amino)-benzothiazol-6-yl ester
Figure imgf000070_0001
Selon la méthode de l'intermédiaire 70, l'intermédiaire 76 est synthétisé en utilisant le cyclobutanecarboxylic acid. 185 mg de 4-Fluoro-benzenesulfonic acid 2-(cyclobutanecarbonyl-amino)-benzothiazol-6-yl ester sont obtenus avec un rendement de 40 %.
Exemple 77 - Préparation du 4-(2-lsopropylamino-ethylamino)-benzene- sulfonic acid 2-(cyclobutanecarbonyl-amino)-benzothiazol-6-yl ester; compound with trifluoro-acetic acid
Figure imgf000071_0001
Selon la méthode de l'exemple 71 , l'exemple 77 est obtenu en utilisant l'intermédiaire 76 avec la N-isopropylethylenediamine. 41 mg de 4-(2- lsόpropylarnino-ethylamino)-benzenesulfonic acid 2-(cyclobutanecarbonyl- amino)-benzothiazol-6-yl ester; compound with trifluoro-acetic acid sont obtenus avec un rendement de 37 %. RMN : Spectre RMN 1H à 300 MHz sur spectromètre BRUKER AVANCE DPX-300 avec les déplacements chimiques (δ en ppm) - dans le solvant diméthylsulfoxide - d6 (DMSO-d6) référencé à 2,50 ppm : 1,22 (d, J = 6,5 Hz, 6H) ; 1,84 (m, 1 H) ; 1 ,99 (m, 1H) ; de 2,10 à 2,30 (m, 4H) ; 3,07 (m, 2H) ; de 3,20 à 3.47 (m masqué, 4H) ; 6,72 (d large, J = 9,0 Hz, 2H) ; 6,97 (t large, J = 6,0 Hz, 1H) ; 7,01 (dd, J = 2,5 et 8,5 Hz, 1 H) ; 7,53 (d large, J = 9,0 Hz, 2H) ; 7,67 (d, J = 8,5 Hz, 1H) ; 7,69 (d, J = 2,5 Hz, 1H) ; de 8,27 à 8,44 (m étalé, 2H) ; 12,3 (s large, 1H) .
Intermédiaire 78: Préparation du 4-Fluoro-benzenesulfonic acid 2- butyrylamino-benzothiazol-6-yl ester.
Figure imgf000071_0002
Dans un ballon de 20 ml, muni d'un barreau aimanté, une solution de 4- Fluoro-benzenesulfonic acid 2-amino-benzothiazol-6-yl ester (intermédiaire 16) (359 mg, 1.107 mmol), d'acide butyrique (146 mg, 1.66 mmol), d'HATU (631 mg, 1.66 mmol), de N,N-diisopropylethylamine (0.286 ml, 1.66 mmol) dans 5.5 ml de diméthylformamide est agitée 8 heures à 60°C puis abandonnée une nuit à température ambiante. Le milieu reactionnel est extrait à l'acétate d'éthyle, lavé à l'eau puis avec une solution d'acide chlorhydrique 0.1 N. La phase organique est séchée sur sulfate de magnésium, filtrée puis évaporée à sec. Le résidu obtenu (567 mg solide jaune pâle) est purifié par chromatographie sur cartouche de silice Biotage 40 g en éluant avec un mélange toluène-isopropanol 9 : 1. Après évaporation du solvant, 239 mg de 4-Fluoro-benzenesulfonic acid 2-butyrylamino- benzothiazol-6-yl ester sont obtenus (solide blanc) avec un rendement de 55 %. Masse :
LC/MS : m/z 395 : [M+H]+ , m/z 393 : [M-H]"
Spectre RMN 1 H à 400 MHz avec les déplacements chimiques (δ en ppm) - dans le solvant diméthylsulfoxide - d6 (DMSO-d6) référencé à 2,50 ppm : 0,9ns 1 (t, J = 7,5 Hz, 3H) ; 1 ,64 (m, 2H) ; 2,47 (t partiellement masqué, J = 7,5 Hz, 2H) ; 7,01 (dd, J = 2,5 et 8,5 Hz, 1 H) ; 7,51 (t large, J = 9,0 Hz, 2H) ; 7,68 (d, J = 8,5 Hz, 1 H) ; 7,79 (d, J = 2,5 Hz, 1 H) ; 7,93 (dd, J = 6,0 et 9,0 Hz, 2H) ; 12,4 (s large, 1 H).
Exemple 79 : Préparation du 4-(2-Diisopropylamino-ethylamino)- benzenesulfonic acid 2-butyrylamino-benzothiazol-6-yl ester chlorhydrate.
Figure imgf000072_0001
Dans un vial de 5 ml pour micro-ondes muni d'un barreau aimanté, une solution de 4-Fluoro-benzenesulfonic acid 2-butyrylamino-benzothiazol-6-yl ester (intermédiaire 78) (100 mg, 0.2 mmole), de N,N- diisopropyléthylènediamine (185 μl, 1.01 mmol) dans 3ml de N- methylpyrrolidone est chauffée 10 min à 150°C au micro-ondes. Le milieu reactionnel est extrait à l'acétate d'éthyle, lavé à l'eau. La phase organique est séchée sur sulfate de magnésium, filtrée puis évaporée à sec. Le résidu obtenu est purifié par chromatographie sur silice Merck (40-63 μm). Après évaporation du solvant 41 mg d'huile incolore (cristallise à sec) sont obtenues. Le produit est dissous dans un minimum d'acétate d'éthyle puis ajoute de l'acide chlorhydrique 4 N en solution dans le dioxanne. Il y a précipitation du milieu qui est concentré, repris à l'eau puis filtré sur filtre Milex 45 μm. La solution précipite, 31 mg (rendement 28 %) de 4-(2- Diisopropylamino-ethylamino)-benzenesulfonic acid 2-butyrylamino- benzothiazol-6-yl ester chlorhydrate sont obtenues après essorage puis séchage sous vide à 40°C. Masse • IE : m/z 114 : (C3H7)2NCH2+ (pic de base) Absence de l'ion moléculaire. • IC: m/z 519 [M+H]+(pic de base). . LC/MS : m/z 519 [M+Hf, m/z 517 : [M-H] "
Spectre RMN 1H à 300 MHz avec les déplacements chimiques (δ en ppm) - dans le solvant diméthylsulfoxide - d6 (DMSO-d6) référencé à 2,50 ppm : 0,91 (t, J = 7,5 Hz, 3H) ; de 1 ,20 à 1,32 (m large, 12 H) ; 1,63 (m, 2H) ; de 2,42 à 2,55 (t partiellement masqué, J = 7,5 Hz, 2H) ; 3,19 (m, 2H) ; 3,51 (m, 2H) ; 3,69 (m étalé, 2H) ; 6,72 (d large, J = 9,0 Hz, 2H) ; 6,97 (t large, J = 6,0 Hz, 1H) ; 7,02 (dd, J = 2,5 et 8,5 Hz, 1H) ; 7,53 (d large, J = 9,0 Hz, 2H) ; de 7,63 à 7,69 (m, 2H) ; 8,78 (m étalé, 1H) ; 12,4 (s large, 1H) .
Exemple 80 : Préparation du 4-(2-Hydroxy-2-methyl-propylamino)- benzenesulfonic acid 2-butyrylamino-benzothiazol-6-yl ester chlorhydrate.
Figure imgf000074_0001
o Dans un vial de 5 ml pour micro-ondes muni d'un barreau aimanté, une solution de 4-Fluoro-benzenesulfonic acid 2-butyrylamino-benzothiazol-6-yl ester (intermédiaire 78) (135 mg, 0.34 mmole), de 1 -amino-2-methyl-propan- 2-ol (153 mg, 1.718 mmol) dans 3ml de N-méthylpyrrolidone est chauffée
20 min à 150°C au micro-ondes. Le milieu reactionnel est extrait à ('acétate d'éthyle (3*20 ml), lavé à l'eau (4*25 ml). La phase organique est séchée sur sulfate de magnésium, filtrée puis évaporée à sec. Le résidu obtenu est purifié par chromatographie sur silice, colonne AIT 15-35 μm 8 g, en éluant avec un mélange acétate d'ethyle/cyclohexane 9 : 1. Après évaporation du solvant 55 mg de solide incolore sont obtenues. Le produit est dissous dans un minimum de dioxanne, on ajoute de l'acide chlorhydrique 4 N en solution dans le dioxanne. Le précipité obtenu est essoré, lavé avec du dioxanne puis séché sous vide à 40°C, conduisant à 42 mg de 4-(2-Hydroxy-2-methyl- propylamino)-benzenesulfonic acid 2-butyrylamino-benzothiazol-6-yl ester chlorhydrate soit un rendement de 25 %. Masse • IE: m/z 463 : [M+] , m/z 228 : [M+]- SO2PhNHCH2C3H7O • IC : m/z 464 : [M+H]+ . LC/MS : m/z 464 : [M+H]+ , m/z 462 : [M-H]"
Spectre RMN 1H à 400 MHz (δ en ppm) - dans le solvant diméthylsulfoxide - d6 (DMSO-d6) référencé à 2,50 ppm : 0,93 (t, J = 7,5 Hz, 3H) ; 1,15 (s, 6H) ;
1 ,66 (m, 2H) ; de 2,46 à 2,59 (m partiellement masqué, 2H) ; 3,04 (s, 2H) ;
6,76 (d large, J = 9,0 Hz, 2H) ; 6,98 (dd, J = 2,5 et 8,5 Hz, 1H) ; 7,42 (d large, J = 9,0 Hz, 2H) ; 7,66 (d, J = 8,5 Hz, 1H) ; 7,70 (d, J = 2,5 Hz, 1H) ; 12,4 (s large, 1 H). Intermédiaire 81 : Préparation du 4-(2-Hydroxy-2-methyl-propylamino)- benzenesulfonic acid 2-tert-butoxycarbonylamino-benzothiazol-6-yl ester
Figure imgf000075_0001
Une solution de 4-Fluoro-benzenesulfonic acid 2-tert-butoxycarbonylamino- benzothiazol-6-yl ester (intermédiaire 15) (300 mg, 0.707 mmol), de carbonate de césium (230 mg, 0.707 mmol), de 1-Amino-2-methyl-propan-2- ol (126 mg, 1.414 mmol) dans 5 ml de dimthylsulfoxide est mise sous agitation à 80°C pendant 72 heures. Le milieu reactionnel est additionné d'eau et extrait 3 fois par de l'acétate d'éthyle. La phase organique est lavée par une solution saturée de chlorure de sodium, puis séchée sur sulfate de magnésium et enfin évaporé à sec conduisant à 290 mg de 4-(2-Hydroxy-2- methyl-propylamino)-benzenesulfonic acid 2-tert-butoxycarbonylamino-benzo- thiazol-6-yl ester avec un rendement de 83 %.
Intermédiaire 82 : Préparation du 4-(2-Hydroxy-2-methyl-propylamino)- benzenesulfonic acid 2-amino-benzothiazol-6-yl ester ; compound with trifluoroacétic acid
Figure imgf000075_0002
Une solution de 4-(2-Hydroxy-2-methyl-propylamino)-benzenesulfonic acid 2- tert-butoxycarbonylamino-benzothiazol-6-yl ester (intermédiaire 81) (170 mg, 0.344 mmol), d'acide trifluoroacétique (14.9g, 130.7 mmol) dans 10 ml de dichlorométhane et 100 μl d'eau est mise sous agitation pendant 2 heures à température ambiante. Le milieu reactionnel est évaporé à sec, repris dans de l'acétate d'éthyle et lavé à l'eau, puis par une solution saturée de chlorure de sodium. Séchage sur sulfate de magnésium et concentration à sec de la phase organique conduisant à 13Ô mg de 4-(2-Hydroxy-2-methyl- propylamino)-benzenesulfonic acid 2-amino-benzothiazol-6-yl ester ; compound with trifluoroacétic acid avec un rendement de 96 %.
LC/MS : [M+H]+=394.06, temps de rétention = 2.90 min. Intermédiaire 83 : Préparation du 4-(2-{6-[4-(2-Hydroxy-2-methyl- propylamino)-benzenesulfonyloxy]-benzothiazol-2-ylcarbamoyl}-ethyl)-piperi- dine -1 -carboxylic acid tert-butyl ester
Figure imgf000076_0001
Une solution de 1-Boc-piper acid ( 176 mg, 0.686 mmol), d'HBTU (260 mg, 0.686 mmol), de N,N-diidopropylethylamine (185 mg, 1.435 mmol) dans 10 ml de diméthylformamide est mise sous agitation pendant 10 min. Le 4-(2-Hydroxy-2-methyl-propylamino)-benzenesulfonic acid 2-amino-benzothiazol-6-yl ester ; compound with trifluoroacétic acid (intermédiaire 82) (130 mg, 0.33 mmol) est ajouté au milieu reactionnel mis sous agitation pendant 48 heures à température ambiante. Le milieu reactionnel est additionné d'eau, puis extrait trois fois par de l'acétate d'éthyle. La phase organique est séchée sur sulfate de magnésium, puis concentrée à sec. Le résidu sec est purifié en chromatographie phase inverse sur une colonne C18 Dynamax 300 x 20 mm, par un gradient en 5 minutes de 5 à 40 % d'acétonitrile dans l'eau additionnée de 0.07 % d'acide trifluoroacétique, puis de 40 à 80 % en 30 minutes. Les fractions contenant le produit sont évaporées à sec conduisant à 111 mg de 4-(2-{6-[4-(2-Hydroxy- 2-methyl-propylamino)-benzenesulfonyloxy]-benzothiazol-2-ylcarbamoyI}- ethyl)-piperi-dine -1 -carboxylic acid tert-butyl ester avec un rendement de 51 %.
LC/MS : [M+H]+=633.00, temps de rétention : 3.94 min.
Exemple 84 : Préparation du 4-(2-Hydroxy-2-methyl-propylamino)- benzenesulfonic acid 2-(3-piperidin-4-yl-propionylamino)-benzothiazol-6-yl ester chlorhydrate
Figure imgf000077_0001
Une solution de 4-(2-{6-[4-(2-Hydroxy-2-methyl-propylamino)-benzene- sulfonyloxy]-benzothiazol-2-ylcarbamoyl}-ethyl)-piperidine-1-carboxylic acid tert-butyl ester (110 mg, 0.173 mmol) dans 8 ml de dioxanne et 8 ml de dioxanne /HCI, 4N est mise sous agitation pendant une nuit à température ambiante. Le précipité formé est filtré, solubilisé dans du methanol, puis évaporé à sec. Le résidu est lavé par de l'éther éthylique conduisant à 103 mg de 4-(2-Hydroxy-2-methyl-propylamino)-benzenesulfonic acid 2-(3- piperidin-4-yl-propionylamino)-benzothiazol-6-yl ester chlorhydrate avec un rendement de 95 %.
LC/MS (méthode A1) : [M+H]+=533.04, temps de rétention = 2.66 min. RMN : Spectre RMN 1H à 300 MHz sur spectromètre BRUKER AVANCE DPX-300 avec les déplacements chimiques (D en ppm) - dans le solvant diméthylsulfoxide - d6 (DMSO-d6) référencé à 2,50 ppm : Pour 80 % du mélange, nous avons :
1 ,13 (s, 6H) ; de 1 ,22 à 1,40 (m, 2H) ; de 1,42 à 1,65 (m, 3H) ; de 1,75 à 1,85 (m, 2H) ; de 2,40 à 2,58 (m partiellement masqué, 2H) ; de 2,75 à 2,90 (m, 2H) ; 3,02 (s, 2H) ; de 3,15 à 3,30 (m, 2H) ; 6,73 (d large, J = 9,0 Hz, 2H) ; 6,97 (dd, J = 2,5 et 8,5 Hz, 1H) ; 7,41 (d large, J = 9,0 Hz, 2H) ; 7,65 (d, J = 8,5 Hz, 1H) ; 7,70 (d, J = 2,5 Hz, 1 H) ; de 8,32 à 8,53 (m étalé, 1 H) ; de 8,65 à 8,80 (m étalé, 1 H) ; 12,4 (s large, 1 H) .
IR : KBr
3405; 2971; 1725; 1597; 1539; 1470; 1365; 1161; 1094; 915; 856; 748 et 578 cm"1 Exemple 85 - Préparation du 5-Pyridin-2-yl-thiophene-2-sulfonic acid 2- (cyclopropanecarbonyl-amino)-benzothiazol-6-yl ester
Figure imgf000078_0001
Une solution de cyclopropanecarboxylic acid (6-hydroxy-benzothiazol-2-yl)- amide (intermédiaire 6) (60 mg, 0.256 mmol), de pyridine (80 μl, 0.991 mmol), de 4-dimethylaminopyridine (3 mg, 0.025 mmol), et de 5-(2-pyridyl)thiophene- 2-sulfonyl chloride (99 mg, 0.384 mmol) dans 2 ml d'acétone est mise sous agitation pendant 24 heures à 40 °C. Le milieu reactionnel est concentré à sec et repris dans 2 ml de DMSO et purifié en 4 fois par LC/MS préparative (méthode B) conduisant à 10 mg de 5-Pyridin-2-yl-thiophene-2-sulfonic acid 2-(cyclopropanecarbonyl-amino)-benzothiazol-6-yl ester. RMN : Spectre RMN 1H à 300 MHz sur spectromètre BRUKER AVANCE DPX-300 avec les déplacements chimiques (δ en ppm) - dans le solvant diméthylsulfoxide - d6 (DMSO-d6) référencé à 2,50 ppm :
De 0,98 à 1,10 (m, 4H) ; 1,90 (m, 1H) ; 7,15 (d large, J = 8,5 Hz, 1H) ; de 7,30 à 7,38 (m, 2H) ; 7,61 (d, J = 4,0 Hz, 1H) ; 7,67 (s large, 1H) ; 7,77 (d, J = 4,0 Hz, 1H) ; 7,87 (t large, J = 8,0 Hz, 1H) . ; 7,99 (d large, J = 8,0 Hz, 1H) ; 8,55 (d large, J = 5,0 Hz, 1H) ; 13,5 (m étalé, 1H) . MS : IE m/z=457 M+" m/z=389 (M - C4H40)+- m/z=325 (m/z=389 - SO2)+- m/z=69 C4H5O+ pic de base
Exemple 87 - Préparation du 4-(1-oxyl-2,2,6,6-tetramethyl-piperidin-4- ylamino)-benzenesulfonic acid 2-(cyclopropanecarbonylamino)-benzothiazol- 6-yl ester
Figure imgf000079_0001
Une solution de 4-Fluoro-benzenesulfonic acid 2-(cyclopropane-carbonyl- amino)-benzothiazol-6-yl ester (exemple 7) (0.352 mmol, 138 mg), de 4-amino-TEMPO (0.387 mmol, 66 mg), de carbonate de césium (0.352 mmol, 114 mg) dans 3.5 ml de dimethylsulfoxyde est chauffée sous agitation pendant 24 heures. Du 4-amino-TEMPO sont ajoutés en deux fois (2 fois 66 mg) au bout de 24 et 48 heures. Au bout de 48 heures, la réaction est mise à température ambiante pendant 48 heures. La solution est ensuite diluée avec de l'eau, extraite par de l'acétate d'éthyle, lavée par une solution saturée de chlorure de sodium et séchée sur sulfate de sodium, puis évaporée à sec, conduisant à 258 mg de produit brut. Celui-ci est purifié par chromatographie flash sur une cartouche de 5 g de silice. Les éluants utilisés sont respectivement le dichlorométhane, puis le dichlorométhane avec 1 % de methanol ammoniacal 0.01 % à 7M. 28 mg de du 4-(1-oxyl-2,2,6,6- tetramethyl-piperidin-4-ylamino)-benzenesulfonic acid 2-(cyclopropane- carbonylamino)-benzothiazol-6-yl ester sont obtenus avec un rendement de 14 %.
MS : ES m/z≈544 MH+ pic de base
IR : KBr 3388; 3252; 2925; 1686; 1598; 1546; 1451; 1327; 1266; 1167; 1094; 907; 852 et 747 cm"1
Intermédiaire 88 : Synthèse du 4-[2-(Bis-benzyloxy-phosphoryloxy)-2-methyl~ propylamino]-benzenesulfonic acid 2-(cyclopropanecarbonyl-amino)-benzo- thiazol-6-yl ester
Figure imgf000080_0001
Une solution de 4-(2-hydroxy-2-methyl-propylamino)-benzene-sulfonic 2- (cyclopropanecarbonylamino)-benzothiazol-6-yl ester (exemple 11 )
(0.855 mmol, 394 mg), de 1H-tetrazole (2.563 mmol, 179 mg), de dibenzyl diisopropyl phosphoramidite (1.70 mmol, 590 mg) dans 6.4 ml de dichlorométhane est mis sous agitation à température ambiante pendant 2 heures. Le milieu reactionnel est refroidi à 7°C et une solution de 3- chloroperoxybenzoic acid (1.025 mmol, 252 mg) dans 1.2 ml de dichlorométhane est ajoutée lentement. Le milieu reactionnel est mis sous agitation pendant une nuit.
10 ml d'une solution de sodium metabisulfite 1M est ajoutée. La phase organique est ensuite lavée par 10 ml d'une solution de sodium metabisulfite 1M , par 2 fois 10 ml d'une solution saturée de bicarbonate de sodium, puis par 10 ml d'une solution saturée de chlorure de sodium.
La phase organique est lavée sur sulfate de magnésium, filtrée et concentrée à sec. Le résidu sec obtenu est solubilisé dans du dichlorométhane, puis purifié sur cartouche flsh Interchim contenant 50 g de silice de porosité 15- 35 μm par un gradient de 20 à 50 % d'acétate d'éthyle dans le cyclohexane. Après évaporation du solvant des fractions contenant le produit attendu, 419 mg de 4-[2-(Bis-benzyloxy-phosphoryloxy)-2-methyl-propylamino]- benzene-sulfonic acid 2-(cyclopropane carbonyl-amino)-benzothiazol-6-yl ester sont obtenus avec un rendement de 68 %.
LC/MS (méthode A1) : [M+H]+=722.13, temps de rétention : 4.13 min. Exemple 89 : Synthèse du 4-(2-Methyl-2-phosphonooxy-propylamino)- benzenesulfonic acid 2-(cyclopropanecarbonyl-amino)-benzothiazol-6-yl ester
Figure imgf000081_0001
A une solution de 4-[2-(Bis-benzyloxy-phosphoryloxy)-2-methyl-propylamino]- benzene-sulfonic acid 2-(cyclopropane carbonyl-amino)-benzothiazol-6-yl ester (intermédiare 88) (0.441 mmol, 318 mg), de formiate d'ammonium (4.41 mmol, 278 mg) dans 15 ml d'éthanol est ajouté 300 mg de palladium sur charbon à 10 %.
Le milieu reactionnel est mis sous agitation au reflux pendant une nuit. Une analyse LC/MS indique qu'il reste du produit monobenzyle. 280 mg
(4.41 mmol) de formiate d'ammonium et 100 mg de palladium sur charbon à
10 % sont ajoutés au milieu reactionnel chauffé au reflux pendant 6 heures.
Le milieu réactinnel est filtré, puis concentré. L'huile obtenue est remise en réaction avec 278 mg de formiate d'ammonium (4.41 mmol) et 300 mg de palladium sur charbon à 10 % dans 15 ml d'éthanol. Le milieu reactionnel est mis sous agitation et chauffé au reflux pendant 1H20. Le milieu reactionnel est filtré et concentré à sec. Le résidu obtenu est purifié par LC/Ms préparative (méthode B) conduisant à 6.2 mg de 4-(2-Methyl-2- phosphonooxy-propylamino)-benzenesulfonic acid 2-(cyclopropanecarbonyl- amino)-benzothiazol-6-yl ester avec un rendement de 3 %.
RMN : Spectre RMN 1H à 300 MHz sur spectromètre BRUKER AVANCE DPX-300 avec les déplacements chimiques (δ en ppm) - dans le solvant diméthylsulfoxide - d6 (DMSO-d6) référencé à 2,50 ppm :
De 0,90 à 1,01 (m, 4H) ; 1,41 (s, 6H) ; 2,00 (m, 1H) ; de 3,10 à 3,50 (m masqué, 2H) ; 6,75 (d large, J = 9,0 Hz, 2H) ; 6,89 (t large, J = 6,0 Hz, 1H) ; 7,97 (dd, J = 2,5 et 8,5 Hz, 1H) ; 7,43 (d large, J = 9,0 Hz, 2H) ; 7,66 (d, J = 8,5 Hz, 1H) ; 7,70 (d, J = 2,5 Hz, 1H) ; 12,7 (s large, 1 H) .
Protocoles expérimentaux sur les tests biochimiques 1 Protocole CDK2/cycline E : Purification du complexe CDK2/CyclineE-(His)6 par IMAC (Immobilized Métal Affinity Chromatography) : Deux baculovirus recombinants portant les séquences humaines codant respectivement pour CDK2 et la CyclineE (cette dernière comportant un tag hexa-histidine en C terminal) sont utilisés pour co-infecter des cellules d'insecte Sf21. Deux à trois jours après le début de la co-infection, les cellules sont récoltées par centrifugation, puis conservées à -→*0°C jusqu'à leur utilisation. Après décongélation et lyse mécanique des cellules, le complexe présent dans le surnageant de lyse est purifié par chromatographie d'affinité sur Nickel (IMAC), et conservé à -80°C.
Essai Flashplate CDK2/CvclinE en format 96 puits.
Un format en plaques 96 puits coatés à la streptavidine est utilisé pour tester l'activité des composés sur l'activité kinase de CDK2/Cycline E. Pour réaliser cet essai, le substrat peptidique biotynilé, fragment de la protéine pRb, (biotinyl-SACPLNLPLQNNHTAADMYLSPVRSPKKKGSTTR- OH) est solubilisé à la concentration de 1 mM dans du tampon kinase (HEPES/ NaOH 50 mM, NaCI 1 mM, MgCI2 5 mM, pH 7.5) afin de constituer une solution-stock conservée à -20°C sous forme d'aliquots de 110 μl. Le jour de l'expérience, un aliquot de cette solution est décongelé et dilué dans du tampon kinase contenant 1 mM de Dithiothréitol, ajouté au tampon extemporanement, afin d'obtenir une concentration de 14.3 μM. 70 μl de cette solution sont ajoutés dans chaque puits de la Flashplate afin d'obtenir une concentration finale en substrat de 10 μM lors de la réaction enzymatique conduite dans un volume final du milieu reactionnel de 100 μl (cf. ci-après). Des dilutions intermédiaires d'inhibiteurs (produits de l'invention) à différentes concentrations sont préparées dans le DMSO à partir de solutions stock à 10 mM dans des tubes séparés. On réalise ainsi des dilutions à 1000 μM, 333.3 μM, 111.1 μM, 37.03 μM, 12.35 μM, 4.11 μM et 1.37 μM. Un μl de chacune de ces solutions (ou 1 μl de DMSO pour les contrôles) est transferré dans les puits de la plaque de test. Dans chaque puits, sont ensuite ajoutés 19 μl d'une solution d'un mélange d'adénosinetriphosphate (ATP) et d'ATPy33P dans le tampon kinase à la concentration de 5,26 μM d'ATP total et de 52,6 μCi/ml de 33P. La réaction enzymatique est déclenchée par addition de 10 μl par puits d 'une solution de CDK2/Cycline E à 200 nM dans le tampon kinase contenant 1 mM de dithiothréitol (ou 10 μl de tampon kinase contenant 1 mM de dithiothréitol pour les blancs réactionnels). Après addition de chacun des réactifs, le volume final de chaque puits est de 100μl, la concentration finale de substrat est de 10 μM, les concentrations finales en inhibiteurs sont de10 μM, 3,33 μM, 1,11 μM, 0,37 μM, 0,123 μM, 0,041 μM et 0,014 μM (selon la concentration de la dilution intermédiaire), la concentration finale en ATP est de 1 μM, la quantité finale de 33P est de 1 μCi/puits, la concentration finale de complexe CDK2/Cycline E est de 20 nM. Après l'addition de tous les réactifs, la plaque de test incubée à 30 °C sous agitation orbitale à 650 rpm.
Lorsque l'incubation est terminée, la plaque est lavée trois fois par 300 μl par puits de PBS (Phosphate Buffered Saline, pH=7,4 sans calcium ni magnésium, référence 10010-015, Gibco BRL). L'incorporation de 33P au peptide est quantifiée par comptage par scintillation avec un appareil Packard Topcount.NXT. L'activité inhibïtrice des produits de l'invention est évaluée par mesure de la concentration d'inhibiteur permettant une diminution de l'activité enzymatique de 50 % (CI50). 2 Protocole CDK4/cycline D1 :
Purification du complexe CDK4-HA/Cycline D1-(His)6 par IMAC (Immobilized Métal Affinity Chromatography) :
Deux baculovirus recombinants portant les séquences humaines codant respectivement pour CDK4-HA (fusion C terminale avec le tag Hémaglufinine) et pour la Cycline D1-(His) 6 sont utilisés pour co-infecter des cellules d'insecte S/9. Soixante heures après le début de la co-infection, les cellules sont récoltées par centrifugation, puis congelées à -20°C jusqu'à leur utilisation. Après décongélation dans le tampon A (HEPES 200 mM pH 7.0, NaCI 50 mM, MgCI2 2 mM, imidazole 25 mM, TCEP 1 mM, glycérol 10 % (p/v), NaF 1 mM, Na3VO 1 mM), agitation 1h à 4°C, et centrifugation, le complexe présent dans le surnageant de lyse est purifié par chromatographie d'affinité sur Nickel (IMAC) et conservé à -80°C.
Essai Flashplate CDK4/CvclinD1 en format 96 puits. Un essai en plaque "Flashplate" de 96 puits recouverts de streptavidine est utilisé pour évaluer l'inhibition du complexe kinase CDK4/cycline D1 par les produits de l'invention. Pour réaliser cet essai, le substrat peptidique biotinylé, fragment de la protéine pRb, (Biotinyl-RPPTLSPIPHIPRSPYKFPSSPLR- amide) est solubilisé à la concentration de 2 mM dans du tampon kinase (HEPES/NaOH 50 mM, NaCI 1 mM, MgCI2 5 mM, PH=7,5) afin de constituer une solution stock conservée à -20°C sous forme d'aliquots de 110 μl. Le jour de l'expérience, un aliquot de cette solution est décongelé et dilué dans du tampon kinase contenant 1 mM de dithiothréitol, ajouté extemporanement, de manière à obtenir une concentration finale de peptide de 2.571 μM. Soixante-dix μl de cette solution sont déposés dans chaque puits de la plaque Flashplate afin d'obtenir une concentration finale en substrat de 1.8 μM lors de la réaction enzymatique conduite dans un volume final de 100 μl (cf. ci- après). Des dilutions intermédiaires d'inhibiteurs (produits de l'invention) à différentes concentrations sont préparées dans le DMSO à partir de solutions stock à 10 mM dans des tubes séparés. On réalise ainsi des dilutions à 1000 μM, 333,3 μM, 111,1 μM, 37,03 μM, 12,35 μM, 4,11 μM et 1,37 μM. Un μl de chacune de ces solutions (ou 1 μl de DMSO pour les contrôles) est ensuite transféré dans les puits de la plaque de test. Dans chaque puits, sont ensuite ajoutés 19 μl d'une solution d'un mélange d'adénosinetriphosphate (ATP) et d'ATPγ33P dans le tampon kinase à la concentration de 5,26 μM d'ATP total et de 78.9 μCi/ml de 33P. La réaction enzymatique est déclenchée par l'addition de 10 μl par puits d'une solution de complexe CDK4/Cycline D1 à 250 nM dans le tampon kinase contenant 1 mM de dithiothréitol (ou 10 μl de tampon kinase contenant 1 mM de dithiothréitol pour les blancs réactionnels). A l'issue des différentes additions le volume final dans chaque puits est de 100 μl, la concentration finale de substrat est de 1.8 μM, les concentrations finales en inhibiteurs sont de 10 μM, 3,33 μM, 1,11 μM, 0,37 μM, 0,123 μM, 0,041 μM et 0,014 μM (selon la concentration de la dilution intermédiaire), la concentration finale en ATP est de 1 μM, la quantité finale de 33P est de 1.5μCi/puits, la concentration finale de complexe CDK4/Cycline D1 est de 25 nM. Après l'additions de tous les réactifs, la plaque de test incubée à 30°C sous agitation orbitale à 650 rpm. Après l'incubation, la plaque est lavée trois fois par 300 μl par puits de tampon PBS (Phosphate Buffered Saline, pH=7.4 sans calcium ni magnésium, référence 10010-015, Gibco BRL). L'incorporation de 33P au peptide substrat est mesurée par comptage par scintillation avec un appareil Packard Topcoϋnt.NXT. L'activité inhibitrice des produits de l'invention est évaluée par détermination de la concentration d'inhibiteur provoquant une diminution de 50 % de l'activité enzymatique (IC50).
3. Aurora2
L'effet inhibiteur de composés vis-à-vis de la kinase Aurora2 est déterminé par un test de scintillation par radioactivité. Une enzyme Aurora2 recombinante complète, dont l'extrémité N-terminale a été marquée à l'histidine, a été exprimée dans E. coli et purifiée jusqu'à une qualité proche de l'homogénéité.
Le fragment C-terminal (Q1687-H2101) d'une NuMA (protéine Nucléaire qui s'associe avec l'Appareil Mitotique) exprimé dans E. coli, et dont l'extrémité N-terminale a été marquée à l'histidine, a été purifié par chromatographie au nickel chélate et utilisé comme substrat dans le test de la kinase Aurora2.
L'activité kinase d'Aurora2 est mesurée par scintillation en microplaque saturée avec du nickel chélate (New England Nuclear, modèle SMP107). Chaque puits contient 100 μl de la solution suivante : 0.02 μM d'Aurora2 ; 0.5 μM de substrat NuMA ; 1 μM d'ATP additionné de 0.5 μCi d'ATP-[33P]. Les solutions sont incubées pendant 45 minutes à 37°C. Le tampon du test est ensuite éliminé et les puits sont rincés deux fois avec 300 μl de tampon kinase. La radioactivité est mesurée dans chaque puits à l'aide d'un appareil Packard Model Top Count NXT. Le bruit de fond est mesuré double exemplaire dans des puits contenant de l'ATP radioactif seul contenant de la kinase tamponnée traitée de la même manière que les autres échantillons. L'activité du contrôle est effectuée en mesurant en double exemplaire la radioactivité dans le mélange complet du test (ATP, Aurora2 et le substrat NuMA), en l'absence de composé test.
L'inhibition de l'activité de Aurora2 avec un composé de l'invention est exprimée en pourcentage d'inhibition de l'activité de contrôle en l'absence de composé test. De la staurosporine est ajoutée dans chaque plaque comme contrôle d'inhibition.
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Claims

REVENDICATIONS
1 - Composés répondent à la formule générale (I) suivante :
Figure imgf000097_0001
dans laquelle • X représente un groupe choisi parmi une liaison covalente, (CH2)n, avec n égal à 1 ou 2 • Ar représente un groupe aryle ou hétéroaryle; ce groupe est éventuellement substitué par un groupe choisi parmi les groupes alkyles, halogènes, NR1R2 (Ri et R2 étant choisis parmi les groupes hydrogène, alkyles, cycloalkyles ou ensemble peuvent former un radical hétérocyclique ou hétéroaryle, ces groupes étant eux même éventuellement substitués), Sθ2alkyl, Salkyl, alkoxy, hétéroaryles, ou aryles • R représente un groupe choisi parmi l'hydrogène, un groupe alkyle, cycloalkyle, hétérocycloalkyle, aryle, hétéroaryle, alkoxy, cycloaikoxy, heterocycloaikoxy, amino; R peut être éventuellement substitué par un ou plusieurs groupes choisis parmi les mêmes radicaux que ceux définis pour R.
2 - Composés selon la revendication 1 caractérisés en ce que les éventuels substituants des groupes Ri et R2 sont choisis parmi les groupes hydroxy, hétéroaryles, cycloalkyle, aminoalkyles.
3 - Composés selon la revendication 1 caractérisés en ce que les groupes alkyles sont des chaînes droites ou ramifiées contenant 1 à 10 atomes de carbone. 4 - Composés selon la revendication 1 caractérisés en ce que les groupes cycloalkyle sont des chaînes alkyles cycliques contenant 3 à 10 atomes de carbone. 5 - Composés selon la revendication 1 caractérisés en ce que les groupes hétérocycloalkyles sont des chaînes alkyles cycliques contenant 3 à 10 atomes de carbone et contenant au moins un hétéroatome choisis parmi O, N ou S. 6 - Composés selon la revendication 1 caractérisés en ce que dans les groupes NR1R2 l'un des groupes Ri ou R2 est un atome d'hydrogène.
7 - Composés selon les revendications 1 à 6 caractérisés en ce que tous les groupes R, Ri et R2 sont éventuellement substitués par un groupe alkyle, cycloalkyle, hétérocycloalkyle, hétéroaryle, aryle, amino, hydroxy, alkoxy ou halogène.
8 - Composés selon la revendication 1 caractérisés en ce que les radicaux aryle et hétéroaryle sont choisis parmi les radicaux monocycliques comportant éventuellement un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi O, N et S ou les radicaux fusionnés à un autre cycle comportant 5 ou 6 chaînons et éventuellement un à trois hétéroatomes choisis parmi O, N et S.
9 - Composés selon la revendication 1 caractérisés en ce que les radicaux aryles ou hétéroaryles sont choisis parmi les groupes phényle, pyridyle, pyrimidine, triazinyle, pyrrolyle, imidazolyle, thiazolyle, furyle, thiényle, indolyle, azaindazolyle, isobenzofuranyle, isobenzothiényle benzoxazolyle, benzothiazolyle, arylvinylene, arylamido, arylcarboxamide, aralkylamine, quinoléyle, isoquinoléyle, cinnolyle, quinazolyle, naphtyridyle, triazolyle ou tétrazolyle.
10 - Composés selon la revendication 9 caractérisés en ce que les groupes aryle et hétéroaryle sont choisis pami les groupes phényle, thiényle, pyrazolyle, imidazolyle éventuellement substitué.
11 - Composés selon la revendication 10 caractérisés en ce que le groupe phényl est substitué par un groupe choisi pami les groupes amino et les halogènes, en particulier le chlore et le fluor.
12 - Composés selon la revendication 11 caractérisés en ce que les groupes aryles sont choisis parmi les di et trifluorophenyles et les monoalkylamino phenyles. 13 - Composés selon la revendication 1 caractérisé en ce X représente une liaison covalente. 14 - Composés selon la revendication 1 caractérisés en ce que R représente un radical cycloalkyle.
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