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WO2005095591A2 - Neue gene aus biosynthese genclustern zur synthese von aminoglycosid-antibiotika sowie damit herstellbare neue aminoglycosid-antibiotika - Google Patents

Neue gene aus biosynthese genclustern zur synthese von aminoglycosid-antibiotika sowie damit herstellbare neue aminoglycosid-antibiotika Download PDF

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WO2005095591A2
WO2005095591A2 PCT/DE2005/000499 DE2005000499W WO2005095591A2 WO 2005095591 A2 WO2005095591 A2 WO 2005095591A2 DE 2005000499 W DE2005000499 W DE 2005000499W WO 2005095591 A2 WO2005095591 A2 WO 2005095591A2
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WO
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aminoglycoside
streptom
dsm
cell
nucleic acid
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PCT/DE2005/000499
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English (en)
French (fr)
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WO2005095591A3 (de
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Andreas Vente
Wolfgang Piepersberg
Udo Wehmeier
Heike Schmidt-Beissner
Khaled Mohammed Anwar Aboshanab
Katrin Welzel
Original Assignee
Universität Wuppertal
Combinature Biopharm Ag
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Publication date
Application filed by Universität Wuppertal, Combinature Biopharm Ag filed Critical Universität Wuppertal
Publication of WO2005095591A2 publication Critical patent/WO2005095591A2/de
Publication of WO2005095591A3 publication Critical patent/WO2005095591A3/de

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes

Definitions

  • the invention relates to new genes from aminoglycoside-producing microorganisms, new gene clusters which are formed from new and / or known genes of these microorganisms, expression products of these genes, transformation vehicles containing such genes or gene clusters, transformed cells containing such genes or gene clusters, processes for biotechnological production of aminoglycosides, processes for combinatorial biosynthesis of argininoglycoside derivatives, new aminoglycosides, uses of such aminoglycosides and pharmaceutical compositions containing such aminoglycosides.
  • Aminoglycoside antibiotics are substances that kill gram-positive and gram-negative bacteria by interfering with protein synthesis (binding to 30s subunits of the bacterial ribosomes and inhibiting translation or blocking the formation of correct peptide bonds between amino acids). E. coli and Klebsieila in particular may be mentioned as examples of target bacteria. Multi-resistant pathogen strains can also be detected using aminoglycoside antibiotics, which is why aminoglycoside antibiotics are particularly useful as reserve antibiotics for patients with life-threatening infections Find use. This is also indicated by the fact that cross-resistance to other antibiotic groups is rare.
  • biosynthesized aminoglycosides are secondary etabolites of the microorganisms used for the synthesis.
  • the enzymes or enzyme groups relevant for the synthesis are expressed by the genes or gene clusters of the microorganisms.
  • the combination of such genes or gene clusters ultimately determines the specific structure of the aminoglycoside produced.
  • these new derivatives of the naturally produced aminoglycosides can be produced.
  • genes and / or gene clusters a large number of different derivatives can be generated, which in turn can be tested for effectiveness, in particular increased activity compared to known aminoglycosides, and / or reduced side effects in screening processes.
  • the invention is therefore based on the technical problem, means for creating new aminoglycosides, in particular with an improved effect and / or reduced side effects.
  • the invention teaches an isolated protein or peptide containing, in particular consisting of, one of the disclosed amino acid sequences.
  • Proteins or peptides according to the invention can be expressed in a cell for biosynthesis, but it is also possible to import externally generated protein or peptides into a cell carrying out the biosynthesis.
  • the protein or peptide is preferably for a partial synthesis step of the biosynthesis of an aminoglycoside, in particular an aminoglycoside antibiotic, for example selected from the group consisting of "butirosins, gentamicins, neomycins, fortimicins, tobramycin, apramycin, paromomycin, hygromycin B, ribostamycin , Sagamicine, Sisomicine, Kana ycine, Nebramycine, Seldo ycine, Destomycine, Istamycine, Sannamycine, Dacti icine, Sporaricine, Bluensomycine, Ashimycine, Lividomyeine and Spectino ycine "functional.
  • an aminoglycoside antibiotic for example selected from the group consisting of "butirosins, gentamicins, neomycins, fortimicins, tobramycin, apramycin, paromomycin, hygromycin
  • the invention further relates to an isolated nucleic acid, in particular DNA, for example genomic DNA, or RNA, in particular mRNA, coding for a protein or peptide according to the invention.
  • the invention further comprises an isolated transformation vehicle, in particular a plasmid or cosmid, containing a nucleic acid according to the invention.
  • a transformation vehicle in particular a plasmid or cosmid
  • the transformation vehicle can additionally contain at least one regulatory nucleic acid sequence, the nucleic acid being under the control of the regulatory nucleic acid sequence, in particular a promoter.
  • one or more regulatory sequences can be set up with the proviso that a plurality of nucleic acids, in particular a gene cluster or part of a gene cluster, are controlled.
  • Suitable cells are preferably selected from the group consisting of "Bacillus circulans, in particular NRRL B3312, Micromonospora echinosporea, in particular DSM 43036, Streptom. Kana yceticus, in particular DSM 40500, Streptom. Fradiae, in particular DSM 2458, Micromonospora olicasterspora, in particular DSM 43868, Streptom . tenbrarius, in particular DSM 40477, Streptom. rimosus ssp. paromomycinus, in particular ATCC 2455, Streprom. hygroscopicus ssp. hygroscopicus, in particular DSM 40578, Streprom.
  • ribosidificus in particular ATCC 21294, Micromonospora spec., in particular DSM 439pora inyoensis, in particular NRRL 3292, Streptoaloteichus hindustanus, in particular DSM 44523, Streptom. hofunensis sp. nov, Streptom. rimofaciens, in particular ATCC 21066, Streptom. ten imariensis, in particular ATCC 31603, Streptom.
  • sannaensis in particular IFO 14239, Dacium tylospor matsuzakiense, in particular DSM 43810, Saccharopolyspora hirsuta, in particular ATCC 20501, St reptom. griseus N2-3-11, especially ATCC 23345, streptom. glaucescens GLA.O, especially ETH 22794, streptom. blu- ensis, especially DSM 40564, streptom. griseus FT3-4, streptom. flavopersicus, particularly NRLL 2820 A.
  • Table I summarizes the antibiotics that can be produced by these strains.
  • one the cell according to the invention is a mutant of the above strains generated with a transformation vehicle according to the invention and that the antibiotic which can be produced therewith is derivatized.
  • the invention also includes aminoglycosides, in particular aminoglycoside antibiotics, which can be obtained by cultivating a cell according to the invention and, after cultivation, isolating the aminoglycoside from the cell and / or from the culture supernatant.
  • An aminoglycoside according to the invention is suitable for producing a pharmaceutical composition for the treatment of bacterial or viral infections, in particular infections with gram-negative bacteria, for example with E. coli or Klebsiella. The biosynthesis can be mutated in such a way that the new
  • Aminoglycoside antibiotic has an improved effectiveness over known active ingredients. However, it is also possible for an amine ⁇ glycoside antibiotic according to the invention to be used “only” as a replacement therapy for resistance to a known active ingredient. The advantage then lies in the fact that therapy is only possible again using the active substance according to the invention. However, new aminoglycoside antibiotics with reduced side effects are also particularly desirable.
  • the invention further relates to a pharmaceutical composition containing an aminoglycoside according to the invention or several such aminoglycosides in a physiologically effective dose. It can also contain pharmaceutical auxiliaries and / or carriers.
  • the pharmaceutical preparation of a pharmaceutical composition according to the invention can be carried out in a manner customary in the art. Counterions for ionic compounds are, for example Na + , K + , Li + or cyclohexylammonium in question.
  • Suitable solid or liquid pharmaceutical preparation forms are, for example, granules, powders, dragees, tablets, (micro) capsules, suppositories, syrups, juices, suspensions, emulsions, drops or solutions for injection (IV, IP, IM, SC) or nebulization (Aerosols), transdermal systems, as well as preparations with protracted release of active substances, in the manufacture of which conventional auxiliaries such as carriers, explosives, binders, coating agents, swelling agents, lubricants or lubricants, flavors, sweeteners and solubilizers are used.
  • auxiliaries such as carriers, explosives, binders, coating agents, swelling agents, lubricants or lubricants, flavors, sweeteners and solubilizers are used.
  • a pharmaceutical composition of the invention is producible, that at least one active ingredient used according to the invention is mixed in a defined dose with a pharmaceutically suitable and physiologically tolerated carrier and possibly further suitable active compounds, additives or auxiliaries with a defined 'inhibitor dose and prepared into the desired presentation.
  • a pharmaceutical composition according to the invention is preferably galenically prepared for oral or parenteral administration.
  • Example 1 Butirosin Cluster List 1 describes amino acid sequences of the butirosin biosynthesis gene cluster, including the functions of the individual genes.
  • Gentamicin Cluster List 2 describes amino acid sequences of the gentamicin biosynthesis gene cluster, including the functions of the individual genes.
  • Kanamycin Cluster List 3 describes amino acid sequences of the kanamycin biosynthesis gene cluster, including the functions of the individual genes.
  • Neomycin Cluster List 4 describes amino acid sequences of the Neumycin biosynthesis gene cluster, including the functions of the individual genes.
  • Example 5 Fortimicin Cluster List 5 describes amino acid sequences of the fortimicin biosynthesis gene cluster, including the functions of the individual genes.
  • Example 6 Tobramycin / Apramycin Cluster Lists 6 and 12 describe amino acid sequences of the tobramycin / apramycin biosynthesis gene cluster, including the functions of the individual genes.
  • Example 7 Paromomycin Cluster Lists 7 and 11 describe amino acid sequences of the paromomycin biosynthesis gene cluster, including the functions of the individual genes.
  • Hygromycin B Cluster List 8 describes amino acid sequences of the hygromycin B biosynthesis gene cluster, including the functions of the individual genes.
  • Example 9 Ribostamycin Cluster List 9 describes amino acid sequences of the ribostamycin biosynthesis gene cluster, including the functions of the individual genes.
  • Lividomycin Cluster List 10 describes amino acid sequences of the lividomycin biosynthesis gene cluster, including the functions of the individual genes.
  • Example 11 Istamycin Cluster List 13 describes amino acid sequences of the istamycin biosynthesis gene cluster, including the functions of the individual genes.
  • Example 12 Apramycin Cluster List 14 describes amino acid sequences of the apramycin biosynthesis gene cluster, including the functions of the individual genes. Table I
  • Micromonospora M.
  • DSM 43036 Gentamicin echinospora M. spec.
  • DSM 43912 Sagamicin M. inyoensis NRRL 3292 Sisomicin

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Abstract

Die Erfindung betrifft neue Gene aus Aminoglycosid­produzierenden Mikroorganismen, neue Genkluster, welche aus neuen und/oder bekannten Genen dieser Mikroorganismen gebildet sind, Expressionsprodukte dieser Gene, Transformationsvehikel enthaltend solche Gene oder Gencluster, transformierte Zellen enthaltend solche Gene oder Denklus­ter, Verfahren zur biotechnologischen Herstellung von Ami­noglycosiden, Verfahren zur kombinatorischen Biosynthese von Aminoglycosidderivaten, neue Aminoglycoside, Ver­wendungen solcher Aminoglycoside und pharmazeutische Zusammensetzungen enthalten solche Aminoglycoside.

Description

Neue Gene aus Biosynthese Genclustern zur Synthese von Aminoglycosid-Antibiotika sowie damit herstellbare neue Aminoglycosid-Antibiotika
Gebiet der Erfindung.
Die Erfindung betrifft neue Gene aus Aminoglycosid- produzierenden Mikroorganismen, neue Gencluster, welche aus neuen und/oder bekannten Genen dieser Mikroorganismen gebildet sind, Expressionsprodukte dieser Gene, Transformationsvehikel enthaltend solche Gene oder Gencluster, transformierte Zellen enthaltend solche Gene oder Genklus- ter, Verfahren zur biotechnologischen Herstellung von Ami- noglycosiden, Verfahren zur kombinatorischen Biosynthese von Arciinoglycosidderivaten, neue Aminoglycoside, Verwendungen solcher Aminoglycoside und pharmazeutische Zusammensetzungen enthaltend solche Aminoglycoside.
Hintergrund der Erfindung und Stand der Technik
Aminoglycosid-Antibiotika sind Substanzen, die durch Eingriff in die Proteinsynthese (Bindung an 30s Unterein- heiten der bakteriellen Ribosomen und Inhibierung der Translation oder Blockierung der Bildung von korrekten Peptidbindung zwischen Aminosäuren) auf grampositive und gramnegative Bakterien abtötend wirken. Beispielhaft für Zielbakterien seien insbesondere E. coli und Klebsieila genannt. Mittels Aminoglycosid-Antibiotika können auch multiresistente Erregerstämme erfasst werden, weshalb Aminoglycosid-Antibiotika insbesondere auch als Reserveantibiotika für Patienten mit lebensgefährlichen Infektionen Verwendung- finden. Dies ist auch damit indiziert, dass Kreuzresistenzen zu anderen Antibiotikagruppen selten sind.
Bei biosynthetisierten Aminoglycosiden handelt es sich prinzipiell um Sekundär etabolite der für die Synthese eingesetzten Mikroorganismen. Die für die Synthese relevanten Enzyme bzw. Enzymgruppen werden von den Genen bzw. Genclustern der Mikroorganismen exprimiert. Die Kombina- tion solcher Gene bzw. Gencluster bestimmt letztendlich die spezifische Struktur des erzeugten Aminoglycosids . Durch unterscheidliche Kombination der Gene bzw. Gencluster in gentechnologisch modifizierten Mikroorganismen können diese neue Derivate der natürlicherweise hergestellten Aminoglycoside hergestellt werden. Durch Kombinatorik der Gene und/oder Gencluster können eine Vielzahl von unterschiedlichen Derivaten erzeugt werden, welche wiederum in Screeningverfahren auf Wirksamkeit, insbesondere erhöhte Wirksamkeit gegenüber bekannten Aminoglycosiden, und/oder reduzierte Nebenwirkungen, getestet werden können.
Hinsichtlich bekannter Aminoglycosid-Antibiotika werden zunehmend Resistenzen bekannt. Zur Bekämpfung von solchen resistenten Erregern ist es wünschenswert, neue Aminogly- cosid Derivate zu finden, welche gegen die resistenten Erreger wirksam sind.
Technisches Problem der Erfindung
Der Erfindung liegt daher das technische Problem zu Grunde, Mittel zur Schaffung von neuen Aminoglycosiden, insbesondere mit verbesserter Wirkung und/oder verringerten Nebenwirkungen, zur Verfügung zu stellen.
Grundzüge der Erfindung und Ausführungsformen.
Zur Lösung dieses technischen Problems lehrt die Erfindung ein isoliertes Protein oder Peptid enthaltend, insbesondere bestehend aus, einer der offenbarten Aminosäurense- guenzen. Erfindungsgemäße Proteine oder Peptide können in einer Zelle zur Biosynthese exprimiert werden, es ist jedoch auch ein Import extern erzeugten Proteins oder Pep- tids in eine die Biosynthese ausführende Zelle möglich.
Das Protein oder Peptid ist vorzugsweise für einen Teilsyntheseschritt der Biosynthese eines Aminoglycosids, insbesondere eines Aminoglycosid-Antibiotikums, beispielsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus "Butirosine, Gentamicine, Neomycine, Fortimicine, Tobramy- eine, Apramycine, Paromomycine, Hygromycine B, Ribostamy- cine, Sagamicine, Sisomicine, Kana ycine, Nebramycine, Seldo ycine, Destomycine, Istamycine, Sannamycine, Dac- ti icine, Sporaricine, Bluensomycine, Ashimycine, Livido- myeine und Spectino ycine" fun tional.
Die Erfindung betrifft weiterhin eine isolierte Nuklein- säure, insbesondere DNA, beispielsweise genomische DNA, oder RNA, insbesondere mRNA, codierend für ein erfindungs- gemäßes Protein oder Peptid.
Die Erfindung umfasst weiterhin ein isoliertes Transformationsvehikel , insbesondere Plasmid oder Cosmid, enthaltend eine erfindungsgemäße Nukleinsäure . Es kann eine Mehrzahl , insbesondere 1 bis 50, verscheidener erfindungsgemäßer Nukleinsäuren enthalten. Dabei wird es sich insbesondere empfehlen, wenn durch die Mehrzahl der Nukleinsäuren ein Biosynthesecluster oder ein Teil eines Biosyntheseclusters für ein Aminoglycosid, insbesondere ein Aminoglycosid- Antibiotikum, gebildet ist. Das Transformationsvehikel kann zusätzlich zumindest eine regulatorische Nuklein- säuresequenz enthalten, wobei die Nukleinsäure unter der Kontrolle der regulatorischen Nukleinsäureseguenz, insbe- sondere eines Promotors, steht. Selbstverständlich können ein oder mehrere regulatorische Sequenzen mit der Maßgabe eingerichtet sein, dass eine Mehrzahl von Nukleinsäuren, insbesondere ein Gencluster oder ein Teil eines Genclus- ters kontrolliert werden.
Die Erfindung betrifft weiterhin eine Zelle enthaltend eine e findungsgemäße Nukleinsäure oder mehrere verschiedene solcher Nukleinsäuren und/oder ein erfindungsgemäßes Protein oder Peptid oder mehrere verschiedene solcher- Proteine oder Peptide, wobei die Zelle optional mit einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure oder mehreren verschiedenen solcher Nukleinsäuren transformiert sein kann. Hierbei kann eine gewünschte Derivatisierung eines natürlicherweise von der Zelle synthetisierten Aminoglyco- sids dadurch erreicht werden, dass in einem Aminoglycosid- synthese Gencluster der Zelle an Stelle oder zusätzlich zu einem natürlichen Gen für einen definierten Teilsyntheseschritt ein hiervon verschiedenes fremdes Gen für einen von dem definierten Teilsyntheseschritt verschiedenen an- dere definierten Teilsyntheseschritt eingeführt ist. Dies kann durch Konstruktion und Einführung des gesamten Amino- glycosidsynthese Genclusters oder Teilen hiervon erfolgen. Es wird gleichsam eine mutierte Biosynthese maßgeschneidert nach Maßgabe der gewünschten Derivatis- ierung. Es ist möglich, ein natürlicherweise enthaltenes Gen codierend für ein Protein oder Peptid, welches für einen Teilsyntheseschritt der Biosynthese eines Aminogly- cosids, insbesondere eines Aminoglycosid-Antibiotikums, funktional ist, zu inhibieren, insbesondere zu deletieren. Dies kann auch für mehrere natürlicherweise enthaltene solche Gene erfolgen.
Geeignete Zellen sind vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus "Bacillus circulans, insbesondere NRRL B3312, Micromonospora echinosporea, insbesondere DSM 43036, Streptom. kana yceticus, insbesondere DSM 40500, Streptom. fradiae, insbesondere DSM 2458, Micromonospora olicasterspora, insbesondere DSM 43868, Streptom. tene- brarius, insbesondere DSM 40477, Streptom. rimosus ssp. paromomycinus , insbesondere ATCC 2455, Streprom. hygro- scopicus ssp. hygroscopicus, insbesondere DSM 40578, Streprom. ribosidificus, insbesondere ATCC 21294, Micromonospora spec . , insbesondere DSM 43912, Micromonospora inyoensis, insbesondere NRRL 3292, Streptoal- loteichus hindustanus, insbesondere DSM 44523, Streptom. hofunensis sp . nov, Streptom. rimofaciens, insbesondere ATCC 21066, Streptom. ten imariensis, insbesondere ATCC 31603, Streptom. sannaensis, insbesondere IFO 14239, Dac- tylosporangium matsuzakiense, insbesondere DSM 43810, Sac- charopolyspora hirsuta, insbesondere ATCC 20501, Streptom. griseus N2-3-11, insbesondere ATCC 23345, Streptom. glaucescens GLA.O, insbesondere ETH 22794, Streptom. blu- ensis, insbesondere DSM 40564, Streptom. griseus FT3-4, Streptom. flavopersicus, insbesondere NRLL 2820 A In der Tabelle I sind die von diesen Stämmen herstellbaren Antibiotika zusammengefasst . Es versteht sich, dass eine erfindungsgemäße Zelle eine mit einem erfindungsgemäßen Transformationsvehikel erzeugte Mutante der vorstehenden Stämme ist und dass das damit erzeugbare Antibiotikum derivatisiert ist. Die Erfindung u fasst auch Aminoglycoside, insbesondere Aminoglycosid-Antibiotika, welche dadurch erhältlich sind, dass eine erfindungsgemäße Zelle kultiviert wird, und dass nach Kultivierung das Aminoglycosid aus der Zelle und/oder aus dem Kultivierungsüberstand isoliert wird. Ein er- findungsgemäßes Aminoglycosid ist zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von bakteriellen oder viralen Infektionen, insbesondere von Infektionen mit gramnegativen Bakterien, beispielsweise mit E. coli oder Klebsiella, geeignet. Dabei kann die Biosyn- these dahingehend mutiert sein, dass das neue
Aminoglycosid-Antibiotikum eine verbesserte Wirksamkeit gegenüber bekannten Wirkstoffen aufweist. Es ist aber auch möglich, dass ein erfindungsgemäßes Aminαglycosid-Anti- biotikum "lediglich" als Ersatztherapie bei Resistenz gegen einen bekannten Wirkstoff Verwendung findet. Dann liegt der Vorteil darin, dass mittels des erfindungsgemäßen Wirkstoffes überhaupt erst wieder eine Therapie möglich ist. Besonders ünschenwert sind jedoch auch neue Aminoglycosid-Antibiotika mit reduzierten Nebenwirkungen.
Die Erfindung betrifft des Weiteren eine pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend ein erfindungsgemäßes Aminoglycosid oder mehrere solcher Aminoglycoside in physiologisch wirksamer Dosis. Zusätzlich enthalten können sein ga- lenische Hilfs- und/oder Trägerstoffe. Die galenische Herrichtung einer erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung kann in fachüblicher Weise erfolgen. Als Gegenionen für ionische Verbindungen kommen beispielsweise Na+, K+, Li+ oder Cyclohexylammonium in Frage. Geeignete feste oder flüssige galenische Zubereitungsformen sind beispielsweise Granulate, Pulver, Dragees, Tabletten, (Mikro-) Kapseln, Suppositorien, Sirupe, Säfte, Suspen- sionen, Emulsionen, Tropfen oder Lösungen zur Injektion (i.V., i.p., i.m., s.c.) oder Vernebelung (Aerosole), transdermale Systeme, sowie Präparate mit protrahierter Wirkstoff-Freigabe, bei deren Herstellung übliche Hilfsmittel wie Trägerstoffe, Spreng-, Binde-, Überzugs-, Quellungs-, Gleit- oder Schmiermittel, Geschmacksstoffe, Süßungsmittel und Lösungsvermittler, Verwendung finden. Als Hilfsstoffe sei Magnesiumcarbonat, Titandioxid, Lac- tose, Mannit und andere Zucker, Talcum, Milcheiweiß, Gelatine, Stärke, Zellulose und ihre Derivate, tierische und pflanzliche Öle wie Lebertran, Sonnenblumen-, Erdnuss- oder Sesa öl, Polyethylenglycole und Lösungsmittel, wie etwa steriles Wasser und ein- oder mehrwertige Alkohole, beispielsweise Glycerin, genannt. Eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung ist dadurch herstellbar, dass mindestens ein erfindungsgemäß verwendeter Wirkstoff in definierter Dosis mit einem pharmazeutisch geeigneten und physiologisch verträglichen Träger und ggf. weiteren geeigneten Wirk-, Zusatz- oder Hilfsstoffen mit definierter 'Inhibitordosis gemischt und zu der gewünschten Darreichungsform hergerichtet ist. Vorzugsweise ist eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung galenisch hergerichtet zur oralen oder parenteralen Gabe.
Im folgenden wird die Erfindung durch ausführliche Beschreibung von besonderen Ausführungsformen erläutert.
In diesen Ausführungsformen können einzelne Merkmale der Erfindung allein oder in Kombination mit anderen Merkmalen verwirklicht sein. Die beschriebenen besonderen Ausführungsformen dienen lediglich zur Erläuterung und zum besseren Verständnis der Erfindung und sind in keiner Weise einschränkend zu verstehen.
Beispiel 1: Butirosin Cluster Liste 1 beschreibt Aminosäuresequenzen des Butirosin Biosynthese Genclusters, einschließlich der Funktionen der einzelnen Gene.
Beispiel 2: Gentamicin Cluster Liste 2 beschreibt Aminosäuresequenzen des Gentamicin Biosynthese Genclusters, einschließlich der Funktionen der einzelnen Gene.
Beispiel 3 : Kanamycin Cluster Liste 3 beschreibt Aminosäuresequenzen des Kanamycin Biosynthese Genclusters, einschließlich der Funktionen der einzelnen Gene.
Beispiel 4: Neomycin Cluster Liste 4 beschreibt Aminosäuresequenzen des Neumycin Biosynthese Genclusters, einschließlich der Funktionen der einzelnen Gene.
Beispiel 5: Fortimicin Cluster Liste 5 beschreibt Aminosäuresequenzen des Fortimicin Biosynthese Genclusters, einschließlich der Funktionen der einzelnen Gene.
Beispiel 6: Tobramycin/Apramycin Cluster Die Listen 6 und 12 beschreiben Aminosäuresequenzen des Tobramycin/Apramycin Biosynthese Genclusters, einschließlich der Funktionen der einzelnen Gene. Beispiel 7 : Paromomycin Cluster Listen 7 und 11 beschreiben Aminosäuresequenzen des Paromomycin Biosynthese Genclusters, einschließlich der Funktionen der einzelnen Gene.
Beispiel 8: Hygromycin B Cluster Liste 8 beschreibt Aminosäuresequenzen des Hygromycin B Biosynthese Genclusters, einschließlich der Funk- tionen der einzelnen Gene.
Beispiel 9: Ribostamycin Cluster Liste 9 beschreibt Aminosäuresequenzen des Ribostamycin Biosynthese Genclusters, einschließlich der Funktionen der einzelnen Gene.
Beispiel 10: Lividomycin Cluster Liste 10 beschreibt Aminosäuresequenzen des Lividomycin Biosynthese Genclusters, einschließlich der Funk- tionen der einzelnen Gene.
Beispiel 11: Istamycin Cluster Liste 13 beschreibt Aminosäuresequenzen des Istamycin Biosynthese Genclusters, einschließlich der Funktionen der einzelnen Gene.
Beispiel 12 : Apramycin Cluster Liste 14 beschreibt Aminosäuresequenzen des Apramycin Biosynthese Genclusters, einschließlich der Funktionen der einzelnen Gene. Tabelle I
Produzentenstamm Stammnrmmer Produziertes A inoglykosid- Antibiotüaim
Bacillus (B.) circulans KRRL B3312 Butirosin Streptomyces (S.) ribosidificus ATCC 21294 Ribostamycin S.fradiae DSM 40063 Neomycin S. rimosus ssp. paromomycinus ATCC 2455 Paromomycin
Micromonospora (M.) DSM 43036 Gentamicin echinospora M. spec. DSM 43912 Sagamicin M. inyoensis NRRL 3292 Sisomicin
S. kanamyceticus DSM 40500 Kanamycrn S, tenebraήus DSM 40477 Apramycin/Nebramycin Streptoälloteichus hindustanus DSM 44523 Apramycin/Tobramycin S. hofunensis sp. nov. Seldorn cin
S. hygroscopicus ssp. DSM 4057S Hygromycin B hygroscopicus S. rimofaciens ATCC 21066 Destomycin
M. olivasterospora DSM 43868 Fortimicin A S. tenjimariensis ATCC 31603 Istamycin S. sannaensis IFO 14239 S-iiiαamycin Dactylosporangium matsuzakiense DSM 43810 Dactimicin Saccharopolyspora hirsuta ATCC 20501 Sporaricin
S. griseus N2-3-11 ATCC 23345 Streptomycin S. glaucescens GLA.O ETH 22794 Streptomycin S. bluensis DSM 40564 Bluensomyciα S. griseus FT3-4 Asrώiiycin S. flavopersicus NRRL 2820 Spectinornycin.

Claims

Patentansprüche
1. Isoliertes Protein oder Peptid enthaltend, insbeson- dere bestehend aus, einer der offenbarten Aminosäurensequenzen .
2. Protein oder Peptid nach Anspruch 1, wobei das Pro- tein oder Peptid für einen Teilsyntheseschritt der Biosynthese eines Aminoglycosids, insbesondere eines A inoglycosid-Antibiotikums, beispielsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus "Butirosine, Gentamicine, Neomycine, Fortimicine, Tobramycine, Apramycine, Paromomycine, Hygromycine B, Ribostamy- cine, Sagamicine, Sisomicine, Kanamycine, Nebramy- cine, Seldomycine, Destomycine, Istamycine, Sannamycine, Dactimicine, Sporaricine, Bluensomycine, Ashi ycine, Lividomycine und Spectinomycine" funk- tional ist.
3. Isolierte Nukleinsäure, insbesondere DNA, beispielsweise genomische DNA, oder RNA, insbesondere mRNA, codierend für ein Protein oder Peptid gemäß Anspruch 1 oder 2.
4. Isoliertes Transformationsvehikel, insbesondere Pias- mid oder Cosmid, enthaltend eine Nukleinsäure nach Anspruch 3.
5. Isoliertes Transformationsvehikel nach Anspruch 4, enthaltend eine Mehrzahl, insbesondere 1 bis 50, ver- scheidener Nukleinsäuren.
6. Isoliertes Transformationsvehikel nach Anspruch 4 oder 5, zusätzlich enthaltend zumindest eine regulatorische Nukleinsäuresequenz, wobei die Nukleinsäure unter der Kontrolle der regulatorischen Nukleinsäure- sequenz, insbesondere eines Promotors, steht.
7. Zelle enthaltend eine Nukleinsäure oder mehrere verschiedene Nukleinsäuren nach Anspruch 3 und/oder ein Protein oder Peptid oder mehrere verschiedene Proteine oder Peptide nach Anspruch 1 oder 2 , welche optional mit einer Nukleinsäure oder mehreren verschiedenen Nukleinsäuren nach Anspruch 3 transformiert ist.
Zelle nach Anspruch 7, welche erhältlich ist durch Transformation mit einem Transformationsvehikel nach einem der Ansprüche 4 bis 6.
9. Zelle nach Anspruch 7 oder 8, wobei ein natürlicherweise enthaltenes Gen codierend für ein Protein oder Peptid, welches für einen Teilsyntheseschritt der Biosynthese eines Aminoglycosids, insbesondere eines A inoglycosid-Antibiotikums, funktional ist, inhibiert, insbesondere deletiert, ist, oder wobei mehrere natürlicherweise enthaltene solche Gene inhibiert, insbesondere deletiert, sind.
10. Zelle nach einem der Ansprüche 7 bis 9, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus "Bacillus circulans, insbesondere NRRL B3312, Micromonospora echinosporea, insbesondere DSM 43036, Streptom. kanamyceticus, insbesondere DSM 40500, Streptom. fradiae, insbesondere DSM 2458, Micromonospora olicasterspora, insbesondere DSM 43868, Streptom. tenebrarius, insbesondere DSM 40477, Streptom. rimosus ssp. paromomycinus, insbesondere ATCC 2455, Streprom. hygroscopicus ssp. hygroscopicus, insbesondere DSM 40578, Streprom. ribosidificus, insbesondere ATCC 21294, Micromonospora spec, insbesondere DSM 43912, Micromonospora inyoensis, insbesondere NRRL 3292, Streptoalloteichus hindustanus, insbesondere DSM 44523, Streptom. hofunensis sp. nov, Streptom. rimofaciens, insbeson- dere ATCC 21066, Streptom. tenj imariensis, insbesondere ATCC 31603, Streptom. sannaensis, insbesondere IFO 14239, Dactylosporangium matsuzakiense, insbesondere DSM 43810, Saccharopolyspora hirsuta, insbesondere ATCC 20501, Streptom. griseus N2-3-11, insbesondere ATCC 23345, Streptom. glaucescens GLA.O, insbesondere ETH 22794, Streptom. bluensis, insbesondere DSM 40564, Streptom. griseus FT3-4, Streptom. flavopersicus, insbesondere NRLL 2820".
11. Verfahren zur Herstellung einer Zelle nach einem der Ansprüche 7 bis 10, wobei die Zelle mit einem Tranformationsvehikel nach einem der Ansprüche 4 bis 6 transformiert wird.
12. Aminoglycosid, insbesondere Aminoglycosid- Antibiotikum, dadurch erhältlich, dass eine Zelle nach einem der Ansprüche 7 bis 10 kultiviert wird, und dass nach Kultivierung das Aminoglycosid aus der Zelle und/oder aus dem Kultivierungsüberstand isoliert wird.
13. Verfahren zur Herstellung eines Aminoglycosids, insbesondere eine Aminoglycosid-Antibiotikums, wobei eine Zelle nach einem der Ansprüche 7 bis 10 kultiviert wird, und wobei nach Kultivierung das Aminoglycosid aus der Zelle und/oder aus dem Kultivierungsüberstand isoliert wird.
14. Verwendung eines Aminoglycosids nach Anspruch 12 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von bakteriellen oder viralen Infektionen, insbesondere von Infektionen mit gramposi- tiven oder gramnegativen Bakterien, beispielsweise mit E. coli oder Klebsiella.
15. Pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend ein Amino- glycosid oder mehrere Aminoglycoside nach Anspruch 12 in physiologisch wirksamer Dosis.
16. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 15, zusätzlich enthalten galenische Hilfs- und/oder Trägerstoffe.
17. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 15 oder 16, galenisch hergerichtet zur oralen oder parenter- alen Gabe.
18. Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 15 bis 17, wobei ein Aminoglycosid oder mehrere Aminoglycoside nach Anspruch 12 in physiologisch wirksamer Dosis mit galenischen Hilfs- und/oder Trägerstoffen gemischt und galenisch hergerichtet, insbesondere zur oralen oder parenteralen Gabe, werden.
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