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WO2005078119A1 - 核内レセプターのアゴニスト・アンタゴニスト検出用プローブとそれを用いた核内レセプターに対するアゴニストおよびアンタゴニストのスクリーニング方法 - Google Patents

核内レセプターのアゴニスト・アンタゴニスト検出用プローブとそれを用いた核内レセプターに対するアゴニストおよびアンタゴニストのスクリーニング方法 Download PDF

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WO2005078119A1
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agonist
probe
receptor
detecting
gonist
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PCT/JP2005/002660
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French (fr)
Inventor
Yoshio Umezawa
Moritoshi Sato
Original Assignee
Japan Science And Technology Agency
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Publication date
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    • G01N2021/6439—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks

Definitions

  • the invention of this application relates to a probe for detecting an agonist / anonymous gonist in a nuclear receptor. More specifically, the invention of this application relates to a probe for detecting and quantifying an agonist and an antagonist for a nuclear receptor with high selectivity, and to a method for screening an agonist and a Z or angonist for a nuclear receptor using the probe. It is. Background art
  • Steroid hormones such as estrogen, progesterone, androgen, darcocorticoid, and mineralocorticoid, and fat-soluble signal molecules such as thyroid hormone and retinoic acid control the growth and differentiation of target tissues (cells), ontogenesis, psychiatric activity, etc. It has been shown that it is deeply involved in the life activities of higher animals in general, and is also involved in the onset and deterioration of many diseases. It is also known that there are specific receptors for these fat-soluble signal molecules in the nucleus, and these receptors are collectively referred to as nuclear receptors. Is formed.
  • Such a nuclear receptor is a ligand-dependent transcription factor, and specifically binds to the lipophilic signal molecule described above, and is transcribed by recognizing and binding to a response element on the promoter of the target gene. It is known to exert a promoting effect.
  • Non-Patent Document 1 estrogens that cause the growth, development, and maintenance of many reproductive tissues are Patent Document 1), exerts physiological and pharmacological effects by binding to estrogen receptor Yuichi (ER) (Non-Patent Documents 2 and 3).
  • ER estrogen receptor Yuichi
  • SRC-1 steroid receptor co-activator 1
  • SRC-1 belongs to the P160 nuclear hormone receptor co-activator family and assists ER activation when ER forms a complex with agonist. It interacts with the factor-binding domain to induce the transcriptional activity of ER, but this phenomenon may not occur when no agonist is present or when the ER is bound to an angina gonist. It has been clarified (Non-Patent Document 4).
  • the agonist induces a change in the higher-order structure of the ER, whereby a coactivator-binding domain is formed on the ER, and the binding of the coactivator to the ER is promoted and stabilized.
  • the binding of the ER and the agonist is reciprocally stabilized by the binding of the ER and the coactivator, and the dissociation rate of the agonist from the ER is significantly reduced (Non-Patent Document 5).
  • Non-Patent Documents 6 to 9 Exposure of wildlife and humans to such estrogenic chemicals relatively early in development can lead to abnormal reproductive organs, reduced genital weight, reduced sperm count and quality.
  • Non-Patent Documents 10 to 12 Exposure of wildlife and humans to such estrogenic chemicals relatively early in development can lead to abnormal reproductive organs, reduced genital weight, reduced sperm count and quality.
  • Non-Patent Documents 10 to 12 the presence and effects of endocrine disrupters have been clarified for fat-soluble signal molecules other than estrogen.
  • Non-Patent Documents 7, 13 to 16 Non-Patent Documents 7, 13 to 16
  • the test substance displaces the labeled ligand (typically radioactive 17/3 estradiol (E2)) attached to the ER.
  • E2 typically radioactive 17/3 estradiol
  • Such methods allow for large-scale screening of endocrine disruptors, but because, for example, the binding of a substance to the receptor does not necessarily result in transcriptional activity, as in the case of an anthony gonist, The problem was that it was not possible to tell whether the test substance acted as an agonist or an antagonist.
  • Non-Patent Document 17 fluorescent polarization-coupled Assy
  • Non-Patent Document 18 electrochemical bonding-Assy
  • Non-Patent Document 19 surface plasmon resonance biosensor technology
  • an E-screening method using MCF-7 cells or T47D cells is known as a cell proliferation assay for analyzing the ability of a chemical substance to stimulate proliferation of estrogen-sensitive cells (Non-Patent Document 20).
  • the reporter gene Atsusei for yeast and mammalian cells has been proposed. It is known as a very useful method for specifying substances having estrogenic activity.
  • the E-screening method and the reporter gene attestation method can distinguish between agonists and angoniists, but it takes about one day from the addition of a ligand to a medium containing mammalian cells or yeast to obtain results. There was a problem. Therefore, there is no known simple method for screening agonists and antagonists for estrogen and other nuclear receptors at high speed and with high selectivity.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Application No. 200-3—1 4 5 4 6
  • Patent Document 2 Japanese Patent Application No. 200-3—3 0 1 2 5 9
  • Non-Patent Document 1 Ciocc D.R. and Roig, L.M.V.Endocr. Rev. 1995, 16, 35 -62.
  • Non-Patent Document 2 Tsai, M.J. and 0 "Mailey, B.W.Annu. Rev. BiocheE 1994, 63, 451-486.
  • Non-patent document 3 Nilsson, S. et al. Physiological Rev. 2001, 81, 1535-1565.
  • Non-patent document 4 McKenna, N. J. et al. Endocr. Rev. 1999, 20, 321-344.
  • Non Patent Literature 5 Gee, A. C. et al. Mol. Endocrinol. 1999, 13, 1912-1923.
  • Non Patent Literature 6 Korach, K. S. Endocrinology 1993, 132, 2277-2278.
  • Non-Patent Document 7 Shelby, MD.et al.Environ.Health Perspect. 1996, 104,
  • Non-patent document 8 Oosterkamp, AJ et al. Anal. CheE 1997, 16, 545-553.
  • Non-patent document 9 Clarschein, C .; Soto, AJ Steroid BiocheE Mol. Bio 1. 1998, 65, 143-150.
  • Non-Patent Document 10 Colborn T. Environ. Heal th Perspect. 1995, 103, 135-136.
  • Non-Patent Document 11 Neubert, D., Regul. Toxicol. Pharmacol. 1997, 26, 9-29.
  • Reference 1 2 Das ton, GP et al. Reprod. Toxicol. 1997, 11, 465-481.
  • Non-patent Reference 13 Salomonsson, M. et al. J. Steroid BiocheE Mol. Biol. 1994, 50, 313. -318.
  • Non-Patent Document 14 Kuiper, G.G.J.M. et al. Endocrinology 1997, 138, 863-870.
  • Non-Patent Document 15 Tabir, T. et al. Eur. J. BiocheE 1999, 262, 240-245.
  • Non-Patent Document 16 Blair, RM et al. Toxicol. Sci. 2000, 54, 138-155.
  • Non-Patent Document 17 Bolger, R. et al. Environ.Health Perspect. 1998, 106, 5 51-557.
  • Non-Patent Document 18 Kuramitz, H. et al. Anal. Chem. 2002, 74, 533-538.
  • Non-Patent Document 19 Usami, M. et al. J. Steroid Biochem Mol. Biol. 2002, 81 47-55.
  • Non-Patent Document 20 Soto, A. M. et al. Environ. Health Perspect. 1995, 103 (Suppl. 7), 113- -122.
  • Non-Patent Document 21 Bronstein, I. et al. J. Anal. Bioche 1994, 219, 169-18 1.
  • Non-Patent Document 22 Gaido, K. W. et al. Toxicol. Appl. Pharmcol. 1997, 143, 205-213.
  • Non-Patent Document 23 Herry, D. M. et al. Nature 1997, 387, 733-736.
  • Non-Patent Document 26 Ueda E et al. J. Immunol Methods. 2003, 279 (1-2), 209-
  • Non-Patent Document 27 Pollock, B.A .; Heim, R. Cell Biol, 1999, 9, 57-60.
  • Non-Patent Document 28 Mochizuki, N. et al. Nature 2001, 411, 1065-1068.
  • Non-patent document 30 Sasaki, K. et al. J. Biol. Chen 2003, 278, 30945-30951.
  • Non-patent document 31 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77; 7380-7384, 1980
  • Non-Patent Document 32 Brzozowski, A. M. et al. Nature 1997, 389, 753-758.
  • Non-Patent Document 33 Shiau, A.K. et al. Cell 1998, 95, 927-937.
  • Non-Patent Document 34 Rout ledge, E. J. et al. J. Biol. Chen 2000, 275, 35986-
  • Non-Patent Document 35 Fang. R et al. CheE Res. Toxicol. 2001, 14, 280-294.
  • Non-Patent Document 36 Jordan, VC et al. Cancer Res. 2001, 61, 6619-6623.
  • the invention of this application solves the above-mentioned problems.
  • a ligand recognition site including a ligand binding domain of a nuclear receptor, and an activation aid in the nuclear receptor primary ligand binding domain.
  • a binding response site containing a peptide chain that specifically binds to the factor binding domain is linked via a flexible linker.
  • the present invention provides a probe for detecting an agonist / anonymous gonist of an intranuclear receive, characterized in that two partial positions capable of detecting approach to each other are connected to each other.
  • the invention of the present application is characterized in that, when the ligand recognition site is dalcocorticoid receptor, oestrogen receptor, progesterone receptor, peroxisome proliferator-activated receptor, androgen receptor, thyroid A probe for detecting an agonist / anginist gonist, which comprises a ligand binding domain of any nuclear receptor selected from the group consisting of a hormone receptor, a retinoic acid receptor, a vitamin D receptor, and an orphan receptor; Third, a probe for detecting agonists and angonists whose ligand recognition site is the estrogen receptor alpha-ligand binding domain, the peroxisome proliferator-activated receptor beta ligand-binding domain, or the orchid gene receptor-ubiquitin ligand binding domain. I will provide a.
  • the invention of this application provides a probe for detecting an agonist antagonist whose binding response site is a nuclear receptor interaction domain peptide of steroid receptor coactivator 1, and a fifth binding agent
  • a probe for detecting agonist / angina gonist whose response site contains the motif of SEQ ID NO: 1 and, sixthly, two marker sites that can detect the proximity of each other are yellow fluorescent protein and cyan fluorescent protein.
  • the invention of this application is directed to a method for screening an agonist against a nuclear receptor, wherein the probe for detecting an agonist and an agonist is used together with an agonist candidate substance,
  • An agonist screening method for measuring a change in signal in the absence and presence of a substance Eighth, a agonist that introduces a polynucleotide that expresses any of the agonist's probe for detecting an agonite into a cell and coexists the probe and the agonist candidate substance in the cell.
  • the screening method comprises the steps of: introducing a polynucleotide that expresses any of the above-mentioned probes for detecting agonist / angiagonite into cells; and generating a non-human animal totipotent cell by ontogenesis.
  • the invention of the present application provides, in a tenth aspect, a method for screening an antagonist that binds to a nuclear receptor and exhibits an antagonistic effect, in the presence of a known agonist.
  • Any one of the above agonist antagonist detection probes and an excess amount of an angianist candidate substance are allowed to coexist, and the angyo gonist screen for measuring the change in signal in the absence and presence of the angianist candidate substance —
  • a polynucleotide that expresses any of the above-mentioned agonist / angigonist detection probes is introduced into a cell, and the probe, a known agonist, and an angelic gonist candidate are introduced into the cell.
  • a method for screening an agonist in which a substance coexists is as follows. By introducing a lobe-expressing polynucleotide into cells and ontogenizing a non-human animal totipotent cell, the probe and a known agonist and anthony gonist can be expressed in all cells of this animal or its progeny. To provide a screening method for an angst gonist in which candidate substances coexist.
  • the invention of the present application provides a method for producing a nonhuman animal totipotent cell by introducing into a cell a polynucleotide that expresses any of the above-mentioned agonist-antagonist detection probes.
  • the resulting non-human animal or progeny thereof is also provided.
  • FIG. 1 is a schematic diagram illustrating the configuration and operation of an agonist / angigonist detection probe according to the present invention.
  • FIG. 2A is a schematic diagram showing the configurations of an astrogen receptor and an angiogonist detection probe and a mutant probe of an estrogen receptor produced in an example of the present invention (a: probe, b: mutation).
  • FIG. 2B is a schematic diagram showing the configuration of a probe for detecting agonist / antagonist of a peroxisome proliferator-activated receptor and a mutant probe
  • FIG. 2C is an agonist of Androgen Recept.
  • ⁇ Schematic diagrams showing the configurations of a probe for detecting an antagonist and a mutant probe (a: probe, b: mutant probe).
  • FIG. 3A is a cell image showing the time-dependent change in FRET change when the probe-expressed CH0-K1 cells were stimulated with 100 nE2 in the examples of the present invention
  • FIG. 15 is a cell image showing a time-dependent change in FRET change when -15 cells were stimulated with 100 nM DHT. Note that the fluorescence intensity ratio at 480/535 nm is shown as a pseudo color image.
  • FIG. 4A is a diagram showing a time-dependent change in FRET change when CH0-K1 cells expressing the probe were stimulated with 100 nM E2 in the example of the present invention (a: after addition of E2, b : E2 not added, c: E2 stimulation of CH0-K1 cells expressing the mutant probe),
  • Figure 4 B is stimulated in the embodiment of the present invention, a CH0-K1 cells expressing the probe 15d-PGJ 2 shows the FRET changes upon the (a: aging, b: 15d-PGJ 2 levels and relationship between the values of the fluorescence intensity of ratio change (response curve)),
  • FIG 4 C the embodiments of the present invention
  • Figure 7 shows the FRET changes when the probe-expressed CH0-K1 cells were stimulated with pioglitazone (a: time course, b: the relationship between the pioglitazone concentration and the change in the fluorescence intensity ratio (reaction).
  • FIG. 4D shows the change in FRET when the probe-expressed CH0-K1 cells were stimulated with 100 nM DHT in the example of the present invention.
  • a DHT After the addition, b:: DHT not added, c DHT stimulation of the PK-15 cells expressing the mutated probe).
  • FIG.5A shows the results of expressing the probe in CH0-K1 cells and adding the DES, Gen, Bis-A, and NP to the concentration and the light intensity ratio when exogenous estrogen was added in the example of the present invention.
  • FIG. 5B shows the relationship (response curve).
  • FIG. 7 is a graph showing the relationship (reaction curve) between the concentration and the change in the fluorescence intensity ratio when DHT, testosterone, progesterone, and cortisol were added when a probe was developed.
  • FIG. 5A shows the results of expressing the probe in CH0-K1 cells and adding the DES, Gen, Bis-A, and NP to the concentration and the light intensity ratio when exogenous estrogen was added in the example of the present invention.
  • FIG. 5B shows the relationship (response curve).
  • FIG. 7 is a graph showing the relationship (reaction curve) between the concentration and the change in the fluorescence intensity ratio when DHT, testosterone, progesterone, and cortisol were added when a
  • FIG. 6 shows the change in FRET response when CH0-K1 cells expressing the probe were stimulated with E2, ICI 182,780, and 0HT (each at 1.0 zM) in the example of the present invention (a : 1.0 ti E2, b: 1.0 M ICI 182,780, c: 1.0 M 0 HT, d: 1.0 M ICI 182, 780 / 1.0 z E2, e: 1.0 zM ICI 182, 780/10 ⁇ E2, f: 1.0 M ICI 182, 780/100 // M E2, g: 1.0 ⁇ OHT / 1.0 M E2, h: 1.0 / x OHT / 10 uM E2, i: 1.0 OHT / 100 M E2).
  • FIG. 7 is a diagram showing changes in FRET response when CH0-K1 cells expressing the probe were stimulated with 10 BADGE.
  • FIG. 8 shows that, in the examples of the present invention, PK-15 cells expressing the probe were prepared by using only DHTC (1.0 nM, 10 n, 100 n) + flutamide or procymidone (10 ⁇ m each) and flutamide (100 nM) alone.
  • FIG. 7 shows changes in FRET response when stimulated with only procymidone (100 nM) and only DHT (1.0 n, 10 n, 100 nM).
  • FIG.9A shows the change in FRET response when probe-expressed PK-15 cells were stimulated with 1.0 flutamide
  • FIG.9B shows the results when stimulated with 100 nM testosterone + 10 flutamide.
  • FIG. 4 is a diagram showing changes in FRET response.
  • ERa-LBD A ligand recognition site
  • AR-LBD 2C ligand recognition site
  • the probe of the invention of the present application for detecting an agonist's gonist is composed of at least four sites each having a different function.
  • the probe for detecting the agonist / anonymous gonist (1) has at least:
  • a ligand recognition site (2) containing a ligand binding domain of a nuclear receptor hereinafter referred to as NR-LBD;
  • the probe (1) for detecting the agonist / angyo gonist of the invention of the present application has different three-dimensional structures in the presence of the agonist (61) and the presence of the agonist (62), respectively. The difference can be detected as a signal change.
  • the agonist (61) is a probe for detecting agonist 'antagonist.
  • the angyo gonist (62) becomes the ligand similarly to the agonist (61). It recognizes and binds to the ligand binding pocket (21) at the recognition site (2) (Fig. 1B).
  • the conformational change of NR-LBD at the ligand recognition site (2) does not occur, and the activation cofactor binding domain (22) is not formed. Therefore, the binding of the binding response site (3) to the ligand recognition site (2) does not occur, and the three-dimensional structure of the agonist / angonist detection probe (1) does not change. That is, the two marker partial positions (51, 52) remain separated.
  • the ligand recognition site (2) is not particularly limited.
  • darcocorticoid receptor, estrogen receptor, progesterone receptor, androgen receptor, thyroid hormone receptor, retinoic acid receptor, vitamin D receptor, peroxisome proliferator-activated receptor Alternatively, those containing ligand binding domains of various nuclear receptors such as orphan receptor receptor whose ligand is unknown can be applied. Therefore, in the invention of this application, the ligand recognition site (2) means the ligand binding domain itself of the nuclear receptor, the partial structure of the nuclear receptor including the ligand binding domain, and the nuclear receptor itself. To taste.
  • the ligand binding domain of the nuclear receptor may be not only a known one but also a newly revealed one.
  • the probe (1) for detecting agonist / angigonist of the invention of the present application can specifically bind to the coactivator-binding domain (22) formed by the binding of the ligand recognition site (2) and the agonist (61).
  • the binding response site (3) is a ligand Any peptide chain that specifically binds to the coactivator binding domain (22) at the recognition site (2) may be used, and any synthetic or natural peptide chain can be used.
  • steroid receptor coactivator 1 (SRC-1) is known as a coactivator for estrogen receptor, and the nuclear receptor receptor interaction domain is located inside SRC-1.
  • Non-Patent Document 5 a polypeptide having such a motif can be preferably applied as the binding response site (3).
  • SRC-1 itself and SRC-1 activation cofactor peptide SEQ ID NO: 2 (Non-Patent Documents 23 to 25) are exemplified.
  • the ligand recognition site (2) and the binding response site (3) are connected via a flexible linker (4).
  • a linker (4) only needs to have flexibility, and its structure and arrangement are not particularly limited.
  • a polymer chain, a natural or synthetic peptide chain is exemplified.
  • Such a linker (4) connects the ligand recognition site (2) and the binding response site (3) of the probe for detecting agonist / angigonist (1) and allows them to approach and separate.
  • the binding response site (3) to the coactivator binding domain (22) formed at the ligand recognition site (2) can be bound and removed.
  • two marker sites (51, 52) capable of detecting proximity to each other are used as sites for signaling the binding to the agonist (61). Are connected. At this time, the two marker sites (51, 52) are responsible for the change in the three-dimensional structure of the probe (1) for detecting agonist and angelic gonist caused by the binding of the ligand recognition site (2) and the binding response site (3). In response, it must accurately indicate the signal change.
  • Non-Patent Document 1 Renilla ciferase complementation method
  • Non-Patent Document 26 a method using a 3-galactosidase complementation method
  • Patent Document 2 a method using a single-color fluorescent probe
  • FRET fluorescence resonance energy transfer
  • two marker sites 51, 52 capable of detecting proximity to each other are used as sites that can detect the results of molecular recognition.
  • Ligand Recognition Site / Linker / Binding Response Site One at each end of the fusion structure.
  • Examples of such a marker site include a combination of a chromophore containing the polypeptide at the N-terminal side of Renilla luciferase and a chromophore containing the remaining C-terminal polypeptide of Renilla luciferase, Combination of a fragment containing the N-terminal polypeptide of / 3-galactosidase and a fragment containing the remaining C-terminal polypeptide of 0-galactosidase, blue shift mutation of green fluorescent protein (GFP) Examples include a combination of cyan fluorescent protein (CFP), which is a protein, and yellow fluorescent protein (YFP), which is a red shift mutant protein of GFP.
  • CFP cyan fluorescent protein
  • YFP yellow fluorescent protein
  • CFP acts as a donor for FRET and YFP acts as an receptor for FRET, and responds promptly to changes in the three-dimensional structure of the probe.
  • the donor Zaxep may bind to either the ligand recognition site (2) or the binding response site (3).
  • CFP can be linked to the N-terminus of the binding response site (3) and YFP can be linked to the C-terminus of the ligand recognition site (2).
  • the connection positions of CFP and YFP may be reversed.
  • the marker sites (51, 52) respectively recognize ligands via appropriate linkers (71, 72). It may be linked to the site (2) or the binding response site (3), or may be directly linked.
  • the probe for detecting the agonist antagonist of the invention of the present application As described above, the probe for detecting the agonist antagonist of the invention of the present application
  • the agonist (61) recognizes and binds to the ligand binding pocket (21) of the ligand recognition site (2). This causes a change in the three-dimensional structure of the ligand recognition site (2), forming the coactivator binding domain (22). Then, the binding response site (3) linked to the ligand recognition site (2) via the flexible linker (4) recognizes and binds to the coactivator binding domain (22). This brings the two marker sites (51, 52) into close proximity, which causes a signal change, such as emission or fluorescence, intensity or wavelength change.
  • a signal change such as emission or fluorescence, intensity or wavelength change.
  • a probe (1) for detecting agonist / angyo gonist is added to a sample (urine, blood, etc.) collected from the patient's body, measurement is performed, and the signal change is compared with that of a control (blank). Compared to those, it is possible to determine whether there is an agonist for a particular nuclear receptor.
  • a chromophore (provisionally 51) acting as a donor is irradiated with an excitation wavelength, and the chromophore (51)
  • the fluorescence intensity of the blank is measured, the fluorescence intensity is lower than that of the blank if an agonist is present.
  • the chromophore that acts as a donor is irradiated with the excitation wavelength, and the chromophore that acts as an AXEP
  • the agonist (61) can be quantified by previously calibrating the relationship between the fluorescence intensity and the amount (concentration) of the agonist (61).
  • the invention of this application also provides a method for screening an agonist using the probe (1) for detecting an agonist / angiagonist described above.
  • the agonist can be screened by coexisting the agonist / antagonist detection probe (1) with the agonist candidate substance and measuring a change in signal. If the candidate substance acts as an agonist, the two marker sites (51, 52) come into close proximity by the mechanism described above, and a change in signal is observed. It is. On the other hand, if the candidate substance does not act as an agonist, no such signal change is observed.
  • the use of the agonist 'antagonist detection probe (1) of the present invention makes it possible to measure the strength of the screened candidate substance as an agonist.
  • the binding of the agonist (61) to the ligand recognition site (2) causes the binding of the binding response site (3) to the coactivator binding domain (22).
  • the binding strength between the second strike (61) and the ligand recognition site (2) is strong, the binding between the coactivator binding domain (22) and the binding response site (3) is stabilized, and the action simultaneously causes the agonist ( The binding between 61) and the ligand recognition site (2) is also stabilized. Therefore, the ligand recognition site of agonist (61)
  • the dissociation rate from (2) decreases, and the reaction equilibrium shifts toward agonist bond formation. Therefore, for example, in the above example in which the two marker sites (51, 52) were CFP and YFP, the change in fluorescence intensity over time after the addition of agonist (61) was measured. To be observed. On the other hand, the ligand recognition site of agonist (61)
  • the binding strength to (2) is weak, the binding between the coactivator binding domain (22) and the binding response site (3) is not sufficiently stabilized, and as a result, the agonist (61) and the ligand recognition site are affected.
  • the bond of (2) is also easily dissociated. That is, the reaction equilibrium is maintained or the agonist dissociates. Therefore, in the above example, when the change with time of the fluorescence intensity after the addition of the agonist (61) is measured, even if the change rate of the fluorescence intensity temporarily increases, it decreases with time. Is observed.
  • the invention of the present application also provides a method for screening an agonist by using the probe (1) for detecting an agonist antagonist.
  • a known agonist such as an endogenous agonist
  • an agonist-antagonist detection probe (1) is allowed to coexist with an excessive amount of an antagonist candidate substance.
  • the agonist and the ligand recognition site (2) bind to form two marker sites (51, 52). Comes close and a signal is detected.
  • the candidate when an excess amount of an antagonist is present, if the candidate exhibits an antagonistic activity, it can be detected by the ligand-binding domain (22) of the ligand recognition site (2) in the probe (1). ) Are recognized and selectively combined. Therefore, such signals gradually decrease.
  • the antagonist candidate substance does not show an antagonistic action, the binding between the agonist and the ligand recognition site (2) in the agonist-antagonist detection probe (1) is maintained, and the two marker sites ( 51, 52) stays close to each other. Therefore, the signal, for example, the fluorescence intensity in the absence of the angiotense candidate substance is measured in advance, and the result is compared with the fluorescence intensity in the coexistence of the excess amount of the angiotense candidate substance. It can be accurately determined whether or not it acts as an antagonist.
  • the excitation wavelength is applied to the chromophore (provisionally 51) acting as a donor
  • the fluorescence intensity of the chromophore (51) is measured, the fluorescence intensity is increased in the presence of the agonite as compared with the absence (that is, the presence of only a known agonist).
  • the chromophore acting as a donor (tentatively denoted as 51) was irradiated with the excitation wavelength, and the fluorescence intensity of the chromophore (52 in this case) acting as an exciter was measured. In some cases, a decrease in the fluorescence intensity is observed in the presence of the gonist.
  • the method of coexisting the agonist / angi gonist detection probe (1) with the agonist, the agonist candidate substance, the angyu gonist candidate substance, etc. is limited. Instead, various methods are conceivable. For example, in a sample solution, a probe (1) for detecting agonists and ghosts and a candidate agonist, or a known agonist A method of coexisting a nisint / excess amount of an angiosperm gonist candidate substance. With such a method, agonists can be detected, quantified and screened in vitro.
  • a method for detecting an agonist / antagonist in a cell (1) is carried out by introducing an expression vector incorporating the probe for detecting an agonist / angiocyte (1) into each cultured cell.
  • agonist candidate substances or antagonist candidate substances can coexist.
  • a plasmid vector for animal cell expression is preferably used.
  • known methods such as an electroporation method, a calcium phosphate method, a ribosome method, and a DEAE dextran method can be employed.
  • the method of introducing an expression vector into which a probe for detecting an agonist / antagonist (1) is incorporated into a cell involves stimulating the cell with a candidate agonist, a known agonist, or a candidate for angonist.
  • agonists and angelic gonists can be screened in vivo without destroying cells.
  • a polynucleotide expressing the agonist / angigonist detection probe (1) is introduced into cells, and non-human animal totipotent cells are individually generated, whereby agonist / angiogen cells are expressed in all cells.
  • a transgenic non-human animal in which the probe for detecting angios gonist (1) is present can be obtained.
  • the transgenic non-human animal can be prepared according to a known preparation method (for example, Non-Patent Document 31).
  • Such a transgenic non-human animal has a probe for detecting agonist / angigonist (1) in all body cells, and has an endogenous probe (1) for detecting agonist 'antagonist in the body. Agonists can coexist.
  • the probe (1) for detecting agonist / antagonists and the candidate agonist and agonist can be introduced into the body.
  • Candidate substances can be coexistent, and by measuring signal changes in cells and tissues, it is possible to screen for various substances, as well as drugs, endocrine disruptors, or candidates for these substances. Shadows on life activities and diseases caused by substances It will also be possible to investigate the effects and effects. Furthermore, by using such a transgenic non-human animal, it becomes possible to visualize and analyze in vivo dynamics such as the timing and conditions under which endogenous agonists are secreted.
  • the agonist and the candidate substance to be screened may be natural substances, genistin (hereinafter Gen; plant estrogens), getylstilbestrol. (Hereinafter referred to as DES; stilbene), synthetic substances such as bisphenol A (hereinafter referred to as Bis-A; diphenolic substance), nonylphenol (hereinafter referred to as NP; alkylphenol), and 15-deoxy-A 12 '"-prostaglandin J 2 (15d-PGJ 2 ), testosterone, 5 ⁇ -dihydrotestosterone (5HT-DHT), and the like.
  • Examples include, but are not limited to, -hydroxytainoxifeii (0HT), ICI 182,780, fluoxamide, cyproterone acetate (CPA), and the like.
  • the agonist / antagonist detection probes according to the first to sixth inventions, when the agonist binds to the ligand binding domain of the nuclear receptor Yuichi, Then, the three-dimensional structure of the nuclear receptor ligand-binding domain changes, and the coactivator-binding domain is formed. At this time, the binding response site linked to the ligand recognition site via the flexible linker recognizes and binds to the activation cofactor binding domain. As a result, the fusion structure, that is, the two marker sites linked to both ends of the [ligand recognition site Z linker-Z binding response site] approach and the signal can be detected.
  • the probe for detecting agonist 'antagonists and the agonist candidate substance are allowed to coexist, and the change in the signal in the absence and presence of the agonist candidate substance is measured. It can be screened whether a substance acts as an agonist for nuclear receptors.
  • the candidate substance acts as an agonist by introducing a polynucleotide expressing a probe for detecting an agonist antagonist into a cell and allowing the probe and the agonist candidate substance to coexist in the cell.
  • a polynucleotide expressing a probe for detecting an agonist antagonist is introduced into a cell, and a nonhuman animal totipotent cell is ontogenously generated.
  • the probe and agonist candidate substance can coexist in all the cells of the invention). This makes it possible to determine whether the candidate substance acts as an agonist against nuclear receptors, and to monitor the effects and effects of the substance on the life activities and diseases of this non-human animal. Become. Using such a non-human animal, it is also possible to visualize and analyze the in vivo kinetics of the endogenous agonist (eg, estrogen) in the nuclear receptor, such as the timing and conditions of secretion.
  • the endogenous agonist eg, estrogen
  • an agonist's probe for detection of an agonite and an excess amount of the antagonist candidate substance are allowed to coexist, and in the absence of the agonite gonist candidate substance, By measuring the change of the signal in the presence of the coexistence, it is possible to simply and accurately determine whether or not the candidate substance acts as an angst against the nuclear receptor.
  • a polynucleotide expressing a probe for detecting agonist's gonist is introduced into a cell, and the probe and a known agonist are introduced into the cell.
  • a polynucleotide expressing a probe for detecting agonist / angiagonist is introduced into cells, and a non-human animal totipotent cell is ontogenously generated, whereby the animal or a progeny thereof is obtained.
  • the probe, the known agonist, and the candidate gonist can be made to coexist in all the cells. This makes it possible to determine whether or not the candidate substance acts as an anthrone gonist against nuclear receptors, and to monitor the effects and effects of the anthrone gonist on the life activities and diseases of this non-human animal. It is also possible to do.
  • FCS fetal calf serum
  • HBSS Hank's balanced electrolyte
  • Lipofectamine 2000 reagent purchased from Life Technologies (Rockville, MD).
  • Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DEM), Trypsin-EDTA, E2, DES, 0HT, Gen were purchased from Sigma Chemicals Co. (St. Louis, MO).
  • Anti-GFP antibody was obtained from Clontech (Palo Alto, CA).
  • the hERacDNA plasmid was purchased from American Type Culture Collection (ATCC, VA, USA).
  • the mammalian expression vector PCDNA3.1 (+) was obtained from Invitrogen Co. (Carlbad, CA).
  • Bis-A, NP, ICI 182, 780 were obtained from WAKO Pure Chemicals Industries Ltd (Osaka, Japan).
  • EYFP (SEQ ID NO: 4) (1-238aa), human estrogen receptor aLBD (SEQ ID NO: 5) (305-550aa) (hereinafter referred to as Era-LBD), flexible linker (GGNGG) (SEQ ID NO: 6) And a steroid receptor cofactor 1 NR box II (SEQ ID NO: 2) (68 7-697aa) fragment cDNA are produced, and the Kozak sequence (indicated as Kz in the figure) and restriction sites are ligated. The structure shown in 2 ⁇ was constructed.
  • the co-activator peptide of steroid receptor co-activator 1 (SRC-1) (SEQ ID NO: 2) (Non-Patent Documents 23 to 25) was converted to a short mobile linker (SEQ ID NO: 25).
  • the fusion protein is linked to the ERaLBD via the 3), and this fusion protein is used to detect an agonist / angigonist probe sandwiched between fluorescent proteins having two different fluorescence wavelengths, namely, CFP (donor) and YFP (axceptor). Obtained.
  • the sequence of the PCR fragment was determined using an ABI310 Genetic Analyzer.
  • This cDNA was inserted into the Hindlll and Xhol sites of the mammalian expression vector pcDNA3.1 (+).
  • Plasmids were constructed in substantially the same procedure as in (A) Estrogen Recept. That is, by standard polymerase chain reaction (PCR), ECFP (SEQ ID NO: 3) (1-238aa), EYFP (SEQ ID NO: 4) U-238aa), peroxisome proliferator-activated receptor rLBD (SEQ ID NO: 8) (235- 505aa) (hereinafter referred to as PPARr-LBD), a flexible linker (GGNGG) 6 (SEQ ID NO: 9), and a fragment of a steroid receptor activating cofactor 1 N box II (SEQ ID NO: 2) (687-697aa) Produce cDM Then, the Kozak sequence (denoted by Kz in the figure) and the restriction site were connected to construct the structure shown in Fig. 2 ⁇ .
  • a co-activator peptide of steroid receptor-1 coactivator 1 (SRC-1) (SEQ ID NO: 2) (Non-patent Documents 23 to 25) was synthesized from a short mobile linker (SEQ ID NO: 3).
  • SRC-1 steroid receptor-1 coactivator 1
  • SEQ ID NO: 2 Non-patent Documents 23 to 25
  • SEQ ID NO: 3 short mobile linker
  • the sequence of the PCR fragment was determined using ABI310 Genetic Analyzer-1.
  • This cDM was inserted into the Hindlll and Xhol sites of the mammalian expression vector PCDNA3.1 (+).
  • Plasmids were constructed in substantially the same procedure as in (A) estrogen receptor and (B) peroxisome growth factor activation. That is, ECFP (SEQ ID NO: 3) (group 238aa) and EYFP were analyzed by standard polymerase chain reaction (PCR).
  • SEQ ID NO: 4 (l-238aa), human androgen receptor Yuichi LBD (SEQ ID NO: 10) (672-910aa) (hereinafter referred to as A-LBD), flexible linker (GGNGG) 3 (SEQ ID NO: 11 1) and steroid receptor coactivator 1 NR box II (SEQ ID NO: 2) (68 7-697aa) fragment cDNA were produced, and the Kozak sequence (denoted as Kz in the figure) was ligated to the restriction site. Thus, the configuration shown in FIG. 2C was constructed.
  • a co-activator peptide of steroid receptor co-activator 1 (SRC-1) (SEQ ID NO: 2) (Non-patent Documents 23 to 25) was synthesized from a short mobile linker (SEQ ID NO: 2). 3) The fusion protein is linked to AR-LBD via), and this fusion protein is sandwiched between fluorescent proteins with two different fluorescence wavelengths, namely, CFP (donor) and YFP (Axep Yuichi). Probe was obtained.
  • the sequence of the PCR fragment was determined using ABI310 Genetic Analyzer-1. This cDNA was inserted into the Hindlll and Xol sites of the mammalian expression vector pcDNA3.1 (+).
  • Each cell was grown in Ham's F-12 medium supplemented with 10 fetal fetal serum (FCS), as well as in Dali Reb with 10% FCS, 1.0% sodium pyruvate, and 0.1 mM non-essential amino acids. in co-modified Eagle's medium, each 53 ⁇ 4 C0 2 under, were cultured in 37 ⁇ . Transfection of cells was performed in the presence of Lipofectamine 2000 reagent in a glass bottom dish using the probe-containing expression vector PCDNA3.1 (+).
  • the cells used were estrogen receptor agonist / angi gonist detection probes for Chinese eight-muster ovary (CH0-K1) cells and peroxisome proliferator-activated receptor agonist / angi gonist detection probes.
  • CH0-K1 cells Chinese eight-muster ovary
  • PK-15 cells pig kidney cells were used as a probe for detecting androgen receptor Yuichi's agonist antagonist.
  • a cell lysate (CHO-K1 or PK-15) transfected with the expression vector pcDNA3.1 (+>) encoding each of the probes shown in FIGS.
  • the sample was subjected to SDS-PAGE by acrylamide gel electrophoresis, and transferred onto a nitrocellulose membrane by electrophoresis.
  • This membrane was first labeled with an anti-GFP antibody (diluted 1: 500 with a TBST solution containing 1 skim milk (composition: 50 mM Tris-HC1 pH & 0, 150 mM NaCK 0.05% Tween 20)), and then labeled with alkaline phosphatase. Visualization was performed using an anti-Peacock antibody (diluted 1: 500 with TBST solution containing 1-skim milk).
  • the expression level of the protein was determined by an image analyzer (LAS-1000 plus, Fujifilm CO., Tokyo, Japan).
  • the exposure time at the time of excitation of the 440 person 10 thigh was 100 ms. Fluorescence images were obtained using a 40X oil immersion objective (Carl Zeiss, Jena, Germany) through a filter at 480 ⁇ 15 nm and 535 ⁇ 12.5 nm.
  • Probe for detecting estrogen receptor agonist / antagonist (1-1) Using estradiol (E2), which is known to have the strongest activity among estrogens, as an agonist, the probe responds to agonist stimulation. evaluated.
  • FIG. 3A shows the cell images before and after E2 stimulation.
  • the fluorescence intensity ratio of 480/535 dishes is shown as a pseudo-color image.
  • the change in FRET results in the binding response site (LXX) to the ligand recognition site (ERaLBD) in the probe for agonist / antagonist detection. (LL motif).
  • Non-Patent Document 5 As previously reported (Non-Patent Document 5, 23-25), it was confirmed that the hydrophobic leucine residue of the LXXLL motif plays an important role in the interaction of ERaLBD with the activation cofactor binding domain. Was done.
  • Helix 12 is located above the ligand binding pocket, forming a hydrophobic groove that allows for the uptake and interaction of the hydrophobic LX XLL motif. These grooves are also stabilized by the van der Waals contact that occurs between the side chains of the three leucine residues of the LXXLL motif and the Met 543, Lys 362, and Glu 542 residues of the ERaLBD side chain. (Non-Patent Document 33).
  • FIG. 4C-b shows the relationship between the concentration of pioglitazone and the value of the change in the fluorescence intensity ratio (reaction curve).
  • FIG. 3B shows cell images before and after DHT stimulation.
  • the fluorescence intensity ratio of 480/535 dishes is shown as a pseudo color image.
  • LXXLL A mutant probe was prepared by replacing all hydrophobic leucine (L) residues of the motif with alanine (A) residues (SEQ ID NO: 7) (FIG. 2B-b). As shown in Fig. 4D-c, no significant change in the CFP / YFP fluorescence intensity ratio due to DHT stimulation was observed in PK-15 cells expressing the mutant probe.
  • the concentration of substance ranged from 1.0X10- 4 M of 1.0X10- 11 M.
  • Figure 5A shows the relationship (reaction curve) between the concentration of each substance and the value of the change in fluorescence intensity ratio. From Figure 5A, where the EC 50 for each substance was determined value (reaction of the ligand recognition site (ERaLBD) and binding-responsive site (LXXL L motif) substance concentration required to place 50 3 ⁇ 4), E2, DES, Gen, for NP and Bis- a, respectively 0.8X10- 8 M, 1.3X10 "8 M , 6.5X10- 8 M, 0.26X10- * M, to obtain a 0.42X10- 6 M. These EC 5 () value, This was converted into relative uptake ability (R RA; Non-Patent Document 34), and the relative ability of each substance to promote the uptake of the binding response site into the ligand recognition site was compared.
  • R RA relative uptake ability
  • RRA was calculated by the following equation.
  • the R value of the estrogen E2 used in Example 1 was arbitrarily set to 100.
  • the R values for E2, DES, Gen, NP, and Bis-A were obtained as 100, 60, 12, 3.0, and 1.9, respectively. Therefore, it was revealed that the ability of these substances to promote the incorporation of the binding response site into the ligand recognition site is E2> DES> Gen> NP> Bis-A. From the above, the difference in the FRET response of each substance is due to the fact that the foreign agonist changes the three-dimensional structure of the ER aLBD in the probe in a ligand-specific manner so that the LXXLL motif can be incorporated. confirmed.
  • Non-patent Document 4 Non-patent Document 4
  • Non-Patent Documents 24, 25, 35, 36 Routleddge et al. Used the GST pull-down assay to identify each of the above substances. For, the ability to promote the association of ER (with the coactivator protein) was sought, and similar results were obtained (Non-Patent Document 34).
  • Probe for detection of agonist and agonite of androgen receptor Yuichi A probe was expressed in PK-15 cells, and the androgen agonists DHT, androgen antagonists testosterone, progesterone, and cortisol were identified as androgens. The ability to elicit like activity was evaluated.
  • the concentration of these substances showed l.OXlO "4 ranged from 1.0X10- 11 M from M.
  • Figure 5 B to the relationship between the values of the concentration and the fluorescence intensity ratio change of each substance (the response curve). From Figure 5B, the EC5 () (substance concentration required for a 50% reaction between the ligand recognition site (AR-LBD) and the binding response site (LXXLL motif) to occur) for each substance was determined. for Teron and progesterone, respectively obtained 1. 1X10- 9 M, 1.7X10- 8 M , the 4.7X10- 7 M, showed no reaction for cortisol.
  • the change in FRET showed the same degree as the change in FRET of DHT by providing a testosterone concentration 10 times that of DHT.
  • progesterone did not show the same degree of change in FRET as DHT or testosterone at higher concentrations.
  • 1.0 xM ICI 182,780 was added to three different glass bottom dishes containing the probe-expressed CH0-K1 cells and incubated for 15 minutes at room temperature. Thereafter, without washing and removing ICI 182, 780, 1.0 ⁇ m, 10 iiM, and 100 M of E2 were added to the first, second, and third petri dishes, respectively, and changes in FRET response were monitored.
  • E2 (agonist) promotes the interaction between the ligand recognition site (ERaLBD) and the binding response site (LXXLL motif) in the probe in living cells, but is not associated with ICI 182, 780 and 01 «: (Antagonist) was confirmed to inhibit such an interaction. Furthermore, it was shown that the inhibition of the interaction by angonist did not completely recover even if the concentration of the agonist was increased 100 times.
  • the conformational change of the ligand binding domain is induced, and at the same time, H12 is placed on the ligand binding pocket, exposing the coactivator binding domain on the ligand binding domain surface.
  • Angiogonists prevent helix 12 from adopting the proper conformation by exerting a direct steric effect between the basic bulky side chain and helix 12.
  • the coactivator binding domain is not correctly formed and ligand binding occurs.
  • the binding domain (ERaLBD in the above example) cannot interact with the nuclear receptor interaction domain of the coactivator (the LXXLL motif in the above example).
  • the probe-expressed CH0-K1 cells were stimulated with 10 M of bisphenol A diglycidyl ether (BADG E), a peroxisome proliferator-activated receptor antagonist, to monitor changes in FRET response.
  • BADG E bisphenol A diglycidyl ether
  • Probe for detecting androgen receptor agonist 'antagonist (3-1) PK-15 cells expressing the probe were converted to DHT (1.0 nM, 10 ⁇ and 10 ⁇ ).
  • DHT stimulation caused a significant increase in FRET in a concentration-dependent manner, whereas flutamide and procymidone ( ⁇ , respectively) did not significantly increase FRET.
  • DHT + flutamide and DHT + procymidone increased in a dose-dependent manner.
  • PK-15 cells expressing the probe were stimulated with Fluuamide (1.0 ⁇ ) alone and stimulated by Flutamide (10 ⁇ ⁇ ) + testosterone (100 nM) to respond to FRET. Changes were also monitored. In the case of Fluyumid (1.0) + testosterone (100 nM), first, testosterone was added, and then flutamide was added before and after reaching the plateau.
  • the present invention provides a probe for detecting agonist and agonite, which can selectively detect and quantify an agonist II antagonist for nuclear receptor.
  • an agonist / antagonist detection probe By using such an agonist / antagonist detection probe, it is possible to quickly and accurately determine whether a specific substance acts as an agonist or an antagonist for the nuclear receptor. become.
  • a high-performance screening method for drugs for endocrine disruptors and specific diseases By using such an agonist / antagonist detection probe, it is possible to quickly and accurately determine whether a specific substance acts as an agonist or an antagonist for the nuclear receptor. become.

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Abstract

少なくとも、核内レセプターのリガンド結合ドメインを含むリガンド認識部位と、該核内レセプターリガンド結合ドメインにおける活性化補助因子結合ドメインに特異的に結合するペプチド鎖を含む結合応答部位が、屈曲性のリンカーを介して連結されており、この[リガンド認識部位/リンカー/結合応答部位]融合構造の両末端に、互いの接近が検出可能な二つのマーカー部位が各々連結されていることを特徴とする核内レセプターのアゴニスト・アンタゴニスト検出用プローブとする。

Description

明 細 書 核内レセプターのァゴニスト ·アンタゴニスト検出用プローブとそれを用いた 核内レセプ夕一に対するァゴニストおよびアンタゴニストのスクリーニング方法 技術分野
この出願の発明は、 核内レセプ夕一のァゴニスト ·アン夕ゴニスト検出用プロ —ブに関するものである。 さらに詳しくは、 この出願の発明は、 核内レセプター に対するァゴニストとアンタゴニストを選択性高く検出、 定量するためプローブ と、 それを用いた核内レセプターに対するァゴニストおよび Zまたはアン夕ゴニ ストのスクリーニング方法に関するものである。 背景技術
エストロゲン、 プロゲステロン、 アンドロゲン、 ダルココルチコイド、 ミネラ ルコルチコイドなどのステロイドホルモンや、 甲状腺ホルモン、 レチノイン酸等 の脂溶性シグナル分子は、 標的組織 （細胞） の増殖 ·分化の制御、 個体発生、 精 神活動等、 高等動物の生命活動全般に深く関わるとともに、 多くの疾患の発症や 悪化にも関与していることが明らかになつている。 また、 核内には、 これらの脂 溶性シグナル分子に対する特異的なレセプ夕一が存在することが知られており、 これらのレセプ夕一群は核内レセプターと総称され、 一つの遺伝子スーパーファ ミリ一を形成している。
このような核内レセプ夕一は、 リガンド依存性転写因子であり、 前記の脂溶性 シグナル分子と特異的に結合し、 標的遺伝子のプロモー夕一上の応答配列を認識 して結合することにより転写促進作用を発揮することが知られている。
また、 最近の核内レセプターの研究により、 核内レセプ夕一の転写制御機構に おいてはリガンドだけでなく、 転写を各々正負に制御する活性化補助因子の機能 が重要な役割を果たすことが明らかになつている。
例えば、 多くの生殖組織の成長、 発達、 維持の原因となるエストロゲンは （非 特許文献 1 )、 エストロゲンレセプ夕一 （ER) に結合することにより、 生理学的 ならびに薬理学的効果を発揮する（非特許文献 2および 3 )。一方、ステロイドレ セプ夕一活性化補助因子 1 (SRC-1) は P160核内ホルモンレセプ夕一活性化補助 因子ファミリーに属し、 ERがァゴニストと複合体を形成した場合に、 ERの活性 化補助因子結合ドメインと相互作用して ERの転写活性を誘起するようになるが、 ァゴニス卜が存在しない場合や ERがアン夕ゴニストと結合している場合にはこ のような現象が生じないことが明らかにされている （非特許文献 4)。 このとき、 ァゴニストは ERの高次構造の変化を誘導し、 これにより ER上に活性化補助因子 結合ドメィンが形成され、 ERへの活性化補助因子の結合が促進および安定化され る。 同時に ERと活性化補助因子の結合により、 ERとァゴニストの結合が相互的 に安定化され、 ァゴニストの ERからの解離速度が顕著に低下する （非特許文献 5 )。
ところで、 従来より、 天然エストロゲンに対して構造的類似性をほとんど有さ ない多くの合成化学物質が、 ERと結合し、 生体内での天然エストロゲン活性を模 倣または阻害する内分泌攪乱物質として作用することが報告されている （非特許 文献 6〜 9 )。野生動物やヒトが発達の比較的初期にこのようなエストロゲン性化 学物質に曝露された場合には、 生殖器官の異常、 生殖器重量の減少、 精子の数的 減少や質低下が生じることが知られている（非特許文献 1 0〜1 2 )。同様に、ェ ストロゲン以外の脂溶性シグナル分子に関しても、 内分泌攪乱物質の存在や影響 が明らかにされている。
そこで、 ERに対する物質の結合性を試験する方法について多くの研究が進めら れている （非特許文献 7、 1 3〜1 6 ) が、 これら従来の結合試験方法は、 いず れも競合反応に基づくものであり、 通常、 試験物質が ERに結合された標識リガ ンド（一般的には、放射性 17 /3エストラジオール（E2))を置換するものである。 このような方法では、内分泌攪乱物質の大規模なスクリーニングが可能であるが、 例えば、 アン夕ゴニストの場合のように、 レセプターに対する物質の結合が必ず しも転写活性を起こすとは限らないため、 試験物質がァゴニストとして作用する のか、 アンタゴニストとして作用するのかを区別できないという問題があった。 また、 これら従来の試験方法は、 水溶性の低い物質の結合親和性を調べるには 不向きであるという問題もあった。 きらに、 生理学的条件より低い温度でのイン キュベーションが必要である上、 測定前に数回の洗浄を行うことにより遊離の放 射性標識分子を除去する必要があり、 これらの操作よつて ERとリガンドの反応 平衡が乱される場合があるという問題もあった。
最近になって蛍光偏光結合アツセィ（非特許文献 1 7 )、電気化学的結合アツセ ィ（非特許文献 1 8 )、表面プラズモン共鳴バイオセンサー技術（非特許文献 1 9 ) などの放射性同位元素を使用しない新しい in vitro結合アツセィ法も提案され ているが、 これらもエストロゲンに対するァゴニス卜とアンタゴニストを区別で きない。 また、 レセプ夕一結合アツセィは大量の精製レセプター蛋白質を必要と する。
さらに、 化学物質のエス卜ロゲン感受性細胞に対する増殖刺激能力を分析する 細胞増殖ァッセィとして、 MCF-7細胞や T47D細胞を用いる E-スクリ一二ング法 が知られている（非特許文献 2 0 )。また、 ある化学物質による細胞培養中のレポ —夕一遺伝子作成物に対する転写刺激能を分析する手法としては、 酵母や哺乳類 細胞を対象とするレポーター遺伝子アツセィ （非特許文献 2 1、 2 2 ) が、 エス 卜ロゲン活性を有する物質を特定するための非常に有用な方法として知られてい る。 これら E-スクリーニング法とレポーター遺伝子アツセィ法では、 ァゴニスト とアン夕ゴニストを区別することができるが、 哺乳類細胞や酵母を含む培地にリ ガンドを添加してから結果を得るまでに約 1日かかるという問題があった。 したがって、 エストロゲンを初めとする核内レセプ夕一に対するァゴニストや ァンタゴニストを高速で、 選択性高くスクリ一二ングできる簡便な方法は知られ ていなかったのが実情である。
そこで、この出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであり、 従来技術の問題点を解消し、 核内レセプターに対するァゴニストゃアン夕ゴニス トを高選択的にスクリ一ニングするための簡便で精度高い方法を提供することを 課題としている。 文献
特許文献 1 ：特願 2 0 0 3— 1 4 5 4 6 6号
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さらに、 この出願の発明は、 第 4には、 結合応答部位がステロイドレセプター 活性化補助因子 1の核内レセプター相互作用ドメインぺプチドであるァゴニス ト ·アンタゴニスト検出用プローブを、 第 5には、 結合応答部位が配列番号 1の モチーフを含むものであるァゴニスト ·アン夕ゴニスト検出用プローブを、 そし て、 第 6には、 互いの接近が検出可能な二つのマーカー部位が黄色蛍光タンパク 質とシアン蛍光タンパク質であるァゴニスト ·アンタゴニスト検出用プローブを 提供する。
この出願の発明は、 第 7には、 核内レセプターに対するァゴニストをスクリー ニングするための方法であって、 前記いずれかのァゴニスト ·アン夕ゴニスト検 出用プローブとァゴニスト候補物質を共存させ、 ァゴニスト候補物質非存在下お よび存在下におけるシグナルの変化を測定するァゴニストのスクリーニング方法 を、 また、 第 8には、 前記いずれかのァゴニスト 'アン夕ゴニスト検出用プロ一 ブを発現するポリヌクレオチドを細胞内に導入し、 細胞内で該プローブとァゴニ スト候補物質を共存させるァゴニストのスクリーニング方法を、 第 9には、 前記 いずれかのァゴニスト ·アン夕ゴニス卜検出用プローブを発現するポリヌクレオ チドを細胞内に導入し、 非ヒ卜動物全能性細胞を個体発生することによって、 こ の動物またはその子孫動物の全細胞において、 該プローブとァゴニスト候補物質 を共存させるァゴニストのスクリーニング方法を提供する。
また、 さらに、 この出願の発明は、 第 1 0には、 核内レセプターに結合し、 拮 抗作用を示すアンタゴニストをスクリ一ニングするための方法であつて、 既知の ァゴニス卜の存在下で、 前記いずれかのァゴニスト ·アンタゴニスト検出用プロ —ブと過剰量のアン夕ゴニスト候補物質を共存させ、 アン夕ゴニス卜候補物質非 存在下および存在下におけるシグナルの変化を測定するアン夕ゴニストのスクリ —ニング方法を、 第 1 1には、 前記いずれかのァゴニスト ·アン夕ゴニスト検出 用プローブを発現するポリヌクレオチドを細胞内に導入し、 細胞内で、 該プロー ブと既知のァゴニストとアン夕ゴニスト候補物質を共存させるアン夕ゴニス卜の スクリーニング方法を、 第 1 2には、 前記いずれかのァゴニスト 'アンタゴニス ト検出用プローブを発現するポリヌクレオチドを細胞内に導入し、 非ヒト動物全 能性細胞を個体発生することによって、 この動物またはその子孫動物の全細胞に おいて、 該プローブと既知のァゴニストとアン夕ゴニスト候補物質を共存させる アン夕ゴニス卜のスクリ一ニング方法を提供する。
そして、 第 1 3には、 この出願の発明は、 前記いずれかのァゴニスト ·アン夕 ゴニスト検出用プローブを発現するポリヌクレオチドを細胞内に導入し、 非ヒト 動物全能性細胞を個体発生することによって得られる非ヒト動物またはその子孫 動物をも提供する。 図面の簡単な説明
図 1は、 この発明のァゴニスト ·アン夕ゴニスト検出用プローブの構成および 作用を例示した概略摸式図である。 図 2 Aは、 この発明の実施例において作製された、 エス卜ロゲンレセプ夕一の ァゴニスト ·アン夕ゴニスト検出用プローブおよび変異プローブの構成を示した 概略模式図であり （a：プローブ、 b：変異プローブ)、 図 2 Bは、 ペルォキシソ ーム増殖因子活性化レセプターのァゴニスト ·アンタゴニスト検出用プローブお よび変異プローブの構成を示した概略模式図であり、 図 2 Cは、 アンドロゲンレ セプ夕一のァゴニスト ·アンタゴニスト検出用プローブおよび変異プローブの構 成を示した概略模式図であり （a：プローブ、 b：変異プローブ） である。
図 3 Aは、 この発明の実施例において、 プローブを発現させた CH0-K1細胞を 1 00 n E2で刺激した際の FRET変化の経時変化を示した細胞画像であり、 図 3 B は、 PK-15細胞を 100 nM DHTで刺激した際の FRET変化の経時変化を示した細胞 画像である。なお、 480/535 nmの蛍光強度比が疑似カラ一画像として示されてい る。
図 4 Aは、 この発明の実施例において、 プローブを発現させた CH0-K1細胞を 1 00 nM E2で刺激した際の FRET変化の経時変化を示した図であり（ a :E2添加後、 b ： E2未添加、 c ：変異プローブを発現させた CH0-K1細胞の E2刺激)、 図 4 B は、 この発明の実施例において、 プローブを発現させた CH0-K1細胞を 15d-PGJ2 で刺激した際の FRET変化を示した図（a：経時変化、 b： 15d-PGJ2濃度と蛍光強 度比変化の値の関係（反応曲線)）であり、図 4 Cは、この発明の実施例において、 プローブを発現させた CH0- K1細胞を piogl i tazoneで刺激した際の FRET変化を 示した図（a：経時変化、 b： piogl i tazone濃度と蛍光強度比変化の値の関係（反 応曲線)）であり、 図 4 Dは、 この発明の実施例において、 プローブを発現させた CH0- K1細胞を 100 nM DHTで刺激した際の FRET変化の経時変化を示した図であり ( a： DHT添加後、 b ： DHT未添加、 c ：変異プローブを発現させた PK- 15細胞 の DHT刺激） である。
図 5 Aは、 この発明の実施例において、 CH0-K1細胞内でプローブを発現させ、 DES、 Gen, Bis- Aおよび NPの外来性エストロゲン添加した際の濃度と货光強度比 変化の値の関係 （反応曲線） を示した図であり、 図 5 Bは、 PK-15細胞内でプロ ーブを発現させ、 DHT、 テストテロン、 プロジェステロンおよびコルチゾールを 添加した際の濃度と蛍光強度比変化の値の関係 （反応曲線） を示した図である。 図 6は、 この発明の実施例において、 プローブを発現させた CH0-K1細胞を、 E 2、 ICI 182,780、 および 0HT (それぞれ 1.0 zM) により刺激した際の FRET応答 の変化を示した図 （a： 1.0 ti E2、 b： 1.0 M ICI 182,780、 c ： 1.0 M 0 HT、 d : 1.0 M ICI 182, 780/1.0 z E2、 e : 1.0 zM ICI 182, 780/10 μ E 2、 f : 1.0 M ICI 182, 780/100 //M E2、 g : 1.0 Μ OHT/1.0 M E2、 h： 1. 0 /x OHT/10 uM E2、 i : 1.0 OHT/100 M E2) である。
図 7は、 プローブを発現させた CH0-K1細胞を、 10 の BADGEにより刺激し た際の FRET応答の変化を示した図である。
図 8は、 この発明の実施例において、 プローブを発現させた PK-15細胞を、 DH TC1.0 nM、 10 n 、 100 n )+フルタミドもしくはプロシミドン（それぞれ 10 χΜ)、 フルタミド （100 nM) のみ、 プロシミドン（100 nM)のみ、 DHT (1.0 n 、 10 n 、 100 nM) のみにより刺激した際の FRET応答の変化を示した図である。
図 9Aは、 プローブを発現させた PK- 15細胞を、 1.0 フルタミドにより剌 激した際の FRET応答の変化を示した図であり、 図 9Bは、 100 nMテストテロン + 10 フルタミドにより刺激した際の FRET応答の変化を示した図である。
なお、 図中の符号は、 次のものを示す。
A ァゴニスト共存下
B アンタゴニスト共存下
1 ァゴニスト ·アンタゴニスト検出用プローブ
2 A リガンド認識部位 （ERa-LBD)
2B リガンド認識部位 （PPA r- LBD)
2C リガンド認識部位 (AR-LBD)
3 結合応答部位 (SRC-1 NR boxll)
4 リンカー
51 マーカー部位 (CFP)
52 マーカ一部位 (YFP) 61 ァゴニス卜
62 アン夕ゴニス卜
71 リンカ一
72 リンカー 発明を実施するための最良の形態
この出願の発明のァゴニスト 'アン夕ゴニスト検出用プローブは、少なくとも、 各々異なる機能を有する 4つの部位からなるものである。 つまり、 図 1に示され るように、 このァゴニスト ·アン夕ゴニスト検出用プローブ （1) は、 少なくと ち：
•核内レセプターのリガンド結合ドメイン （以下、 NR-LBDと記載する） を含むリ ガンド認識部位 （2) と、
•NR-LBDの活性化補助因子結合ドメイン （22) に特異的に結合できるペプチド鎖 を含む結合応答部位 (3) と、
•リガンド認識部位 （2) と結合応答部位 (3) を連結する屈曲性のリンカ一 （4) と、
•リガンド認識部位 （2) へのァゴニスト （61) の結合により互いが近接した際 に、 検出可能なシグナルを発する二つのマーカー部位 （51、 52)、
からなるものである。
この出願の発明のァゴニスト ·アン夕ゴニスト検出用プローブ （1) は、 ァゴ 二スト （61) との共存下およびアン夕ゴニスト （62) との共存下で、 各々異なる 立体構造をとり、 その差異をシグナル変化として検出することのできるものであ る。
ァゴニスト ·アン夕ゴニスト検出用プローブ （1) がァゴニスト （61) と共存 する場合には、 ァゴニスト （61) がァゴニスト 'アンタゴニスト検出用プローブ
(1) におけるリガンド認識部位 (2) のリガンド結合ポケット （21) を認識し、 そこに結合する （図 1 A— a )。 このとき、 NR-LBDの立体構造が変化し、 リガン ド認識部位 (2) に活性化補助因子結合ドメイン （22) が形成される。 続いて、 結合応答部位 (3) が、 この活性化補助因子結合ドメイン （22) を認識し、 リン カー （4) が屈曲することにより結合応答部位 (3) と活性化補助因子結合ドメィ ン （22) の結合が起こる （図 l A_ b)。 これにより、 ァゴニスト 'アン夕ゴニ スト検出用プローブ （1) の立体構造が変化し、 二つのマ一力一部位 （51、 52) が近接する。
一方、 この出願の発明のァゴニスト ·アン夕ゴニスト検出用プローブ （1) が アンタゴニスト （62) と共存する場合には、 アン夕ゴニスト （62) は、 ァゴニス ト （61) の場合と同様に、 リガンド認識部位 (2) におけるリガンド結合ポケッ ト （21) を認識して結合する （図 1 B)。 しかし、 このとき、 リガンド認識部位 (2) における NR-LBDの立体構造変化は起こらず、 活性化補助因子結合ドメイン (22) も形成されない。 したがって、 結合応答部位 (3) のリガンド認識部位（2) への結合は起こらず、 ァゴニスト ·アン夕ゴニスト検出用プローブ （1) の立体 構造も変化しない。 すなわち、 二つのマーカ一部位 （51、 52) は離れたままとな る。
このようなァゴニスト ·アン夕ゴニスト検出用プローブ （1) において、 リガ ンド認識部位 (2) は、 とくに限定されない。 例えば、 ダルココルチコイドレセ プ夕一、 エストロゲンレセプ夕一、 プロゲステロンレセプ夕一、 アンドロゲンレ セプ夕一、 甲状腺ホルモンレセプター、 レチノイン酸レセプ夕一、 ビタミン Dレ セプ夕一、 ペルォキシゾーム増殖因子活性化レセプ夕一、 あるいはリガンドが不 明なォーファンレセプ夕一等、 各種の核内レセプターのリガンド結合ドメインを 含むものが適用できる。 したがって、 この出願の発明において、 リガンド認識部 位 （2) とは、 核内レセプターのリガンド結合ドメインそのもの、 リガンド結合 ドメインを含む核内レセプ夕一の部分構造、 および核内レセプ夕一そのものを意 味する。 もちろん、 核内レセプ夕一のリガンド結合ドメインは、 公知のものだけ でなく、 新たに明らかになったものであってもよい。
この出願の発明のァゴニスト ·アン夕ゴニスト検出用プローブ（1) において、 リガンド認識部位 (2) とァゴニスト （61) の結合により形成される活性化補助 因子結合ドメイン （22) に特異的に結合できる結合応答部位 （3) は、 リガンド 認識部位 （2) における活性化補助因子結合ドメイン （22) に特異的に結合する ペプチド鎖を含むものであればよく、 合成および天然のあらゆるペプチド鎖を用 いることができる。 例えば、 エストロゲンレセプ夕一に対する活性化補助因子と しては、 ステロイド受容体活性化補助因子 1 (SRC-1) が知られており、 SRC- 1内 部には核内レセプ夕一相互作用ドメインが存在し、 これは等間隔に存在する LXX LLモチーフ （配列番号 1 ) または NRボックスと呼ばれるロイシン豊富なシグネ チヤ一モチーフの保存性コピー 3個により構成されている。 このようなモチーフ は、 エストロゲンレセプターに対する SRC-1の相互作用を媒介するために重要で あることが知られている （非特許文献 5、 2 3〜2 5 ) ことから、 リガンド認識 部位 （2) をエストロゲンレセブターのリガンド結合ドメインを含むものとする 場合には、 このようなモチーフを有するポリペプチドが結合応答部位 (3) とし て好ましく適用できる。 さらに、 SRC- 1そのものや、 SRC-1の活性化補助因子べ プチド （配列番号 2 ) (非特許文献 2 3〜2 5 ) が例示される。
これらリガンド認識部位 （2) と結合応答部位 (3) は、 屈曲性のリンカ一 （4) を介して連結されている。 このようなリンカ一 （4) は、 屈曲性を有するもので あればよく、 その構造や配列はとくに限定されない。 例えば、 高分子鎖、 天然ま たは合成のペプチド鎖が例示される。 このようなリンカ一 （4) により、 ァゴニ スト ·アン夕ゴニスト検出用プローブ （1) のリガンド認識部位 （2) と結合応答 部位（3)が連結されるとともに、両者が近づいたり離れたりできるようになり、 リガンド認識部位 (2) に形成された活性化補助因子結合ドメイン （22) への結 合応答部位 (3) の結合 ·脱離が可能となる。
この出願の発明のァゴニスト ·アンタゴニスト検出用プローブ （1) では、 ァ ゴニス卜 （61) との結合をシグナル発信する部位として、 互いの近接が検出可能 な二つのマ一カー部位 （51、 52) が連結されている。 このとき、 二つのマーカー 部位 （51、 52) は、 リガンド認識部位 (2) と結合応答部位 （3) の結合により生 じるァゴニスト ·アン夕ゴニスト検出用プローブ （1) の立体構造の変化に応答 して、 精度高くシグナル変化を示すものでなければならない。 このようなシグナ ル変化を示すものとしては、 レニラルシフェラ一ゼ補完法によるもの （特許文献 1 )、 3—ガラクトシダーゼ補完法によるもの （非特許文献 2 6 )、 単色蛍光プロ ーブによるもの （特許文献 2 ) などが例示される。 生化学の分野においては、 一 般的に種々の蛍光発色団も用いられるが、 立体構造の変化に敏速に応答するもの としては、 蛍光共鳴エネルギー移動 （以下、 FRET) (非特許文献 2 7〜3 0 ) の 生起により色調に変化を来たすものが知られている。
したがって、この出願の発明のァゴニスト ·アンタゴニスト検出用プローブ（1) においては、 分子認識の結果を検出可能とする部位として、 互いの近接が検出可 能な二つのマーカー部位 （51、 52) が、 [リガンド認識部位/リンカ一/結合応 答部位] 融合構造の両末端に一つずつ連結されている。 このようなマーカー部位 としては、 レニラルシフェラ一ゼの N—末端側のポリペプチドを含む発色団と、 レニラルシフェラ一ゼの残る C—末端側のポリペプチドを含む発色団の組み合わ せや、 /3—ガラクトシダーゼの N -末端側のポリぺプチドを含むフラグメントと、 0—ガラクトシダーゼの残る C—末端側のポリぺプチドを含むフラグメントの組 み合わせ、 緑色蛍光タンパク質 （GFP) のブル一シフト変異タンパク質であるシ アン蛍光タンパク質 （CFP) と GFPのレッドシフト変異タンパク質である黄色蛍 光タンパク質 （YFP) の組み合わせ等が例示される。
とくに、 CFPと YFPの組み合わせによれば、 CFPが FRETのドナーとして、 YFP が FRETのァクセプタ一として作用し、 プローブの立体構造の変化に敏速に応答 することから、 好ましい。 このとき、 ドナ一 Zァクセプ夕一は、 リガンド認識部 位 （2) および結合応答部位 （3) のどちらに結合していてもよい。 例えば、 図 2 A-aや図 2 C-aに示されるように、 結合応答部位 (3) の N-末端に CFPを、 リ ガンド認識部位 (2) の C-末端に YFPを連結できる。 もちろん、 CFPと YFPの連 結位置は反対であってもよい。
なお、 以上のとおりのこの出願の発明のァゴニスト ·アン夕ゴニスト検出用プ ローブ（1) において、 マーカー部位 （51、 52) は、 各々、 適当なリンカ一 （71、 72) を介してリガンド認識部位 （2) や結合応答部位 （3) に連結されていてもよ いし、 直接連結されていてもよい。
以上のとおりのァゴニスト ·アン夕ゴニスト検出用プローブ （1) を用いてァ ゴニスト （61) やアン夕ゴニスト （62) を検出、 定量、 およびスクリーニングす ることが可能となる。
前記のとおり、 この出願の発明のァゴニスト ·アンタゴニスト検出用プローブ
(1) をァゴニストと共存させると、 ァゴニスト （61) がリガンド認識部位 （2) のリガンド結合ポケット （21) を認識し、 結合する。 これにより、 リガンド認識 部位 (2) の立体構造に変化が生じ、 活性化補助因子結合ドメイン （22) が形成 される。 すると、 リガンド認識部位 （2) に屈曲性リンカ一 （4) を介して連結さ れた結合応答部位 (3) がこの活性化補助因子結合ドメイン （22) を認識し、 結 合する。 これにより、 二つのマーカー部位 （51、 52) が近接し、 それによりシグ ナル変化、 例えば、 発光や蛍光の生起、 強度や波長の変化等が生じる。
そこで、 例えば、 患者の体内から採取された試料 （尿、 血液など） に、 ァゴニ スト ·アン夕ゴニスト検出用プローブ （1) を添加し、 測定を行い、 そのシグナ ル変化を対照 （ブランク） のものと比較すれば、 特定の核内レセプターに対する ァゴニストが存在するか否かを判断することが可能となる。 すなわち、 例えば、 二つのマーカー部位 （51、 52) が前記の CFPと YFPの場合には、 ドナーとして作 用する発色団 （仮に 51とする） に励起波長を照射し、 該発色団 （51) の蛍光強 度を測定した場合、 ァゴニス卜が存在すれば蛍光強度がブランクのそれよりも低 下する。 逆に、 二つの蛍光発色団 （51、 52) のうち、 ドナーとして作用する発色 団 （仮に 51とする） に励起波長を照射し、 ァクセプ夕一として作用する発色団
(この場合 52) の蛍光強度を測定した場合には、 蛍光強度はブランクのそれより も増大する。 また、 蛍光強度とァゴニス卜 （61) 量 （濃度） の関係を予め検量す ることにより、 ァゴニスト （61) を定量することもできる。
さらに、 この出願の発明では、 前記のァゴニスト ·アン夕ゴニスト検出用プロ —ブ（1) を用いたァゴニストのスクリーニング方法をも提供する。具体的には、 ァゴニスト ·アンタゴニスト検出用プローブ （1) とァゴニスト候補物質を共存 させ、 シグナルの変化を測定することにより、 ァゴニストをスクリーニングする ことができる。 候補物質がァゴニス卜として作用するものであれば、 前記のとお りの機構により二つのマーカー部位 （51、 52) が近接し、 シグナルの変化が見ら れる。 一方、 候補物質がァゴニストとして作用しない場合には、 このようなシグ ナルの変化は見られない。
また、 この出願の発明のァゴニスト 'アンタゴニスト検出用プローブ （1) を 用いれば、 スクリーニングされた候補物質のァゴニス卜としての強度を測定する ことも可能になる。 前記のとおり、 ァゴニス卜 （61) がリガンド認識部位 （2) に結合することにより、 結合応答部位 （3) と活性化補助因子結合ドメイン （22) の結合が生じるが、 このとき、 該ァゴ二スト （61) とリガンド認識部位 （2) の 結合力が強い場合には、 活性化補助因子結合ドメイン （22) と結合応答部位 （3) の結合が安定化され、 その作用により同時にァゴニスト （61) とリガンド認識部 位 （2) の結合も安定化する。 そのため、 ァゴニスト （61) のリガンド認識部位
(2) からの解離速度が低下し、 反応平衡がァゴニスト結合形成方向にシフトす る。 したがって、 例えば、 二つのマーカー部位 （51、 52) を CFPと YFPとした前 記の例では、 ァゴニス卜 （61) 添加時からの蛍光強度の経時変化を測定すれば、 蛍光強度変化の増大が観察される。 一方、 ァゴニスト （61) のリガンド認識部位
(2) に対する結合力が弱い場合には、 活性化補助因子結合ドメイン （22) と結 合応答部位 (3) の結合が十分に安定化されず、 その影響でァゴニスト （61) と リガンド認識部位 (2) の結合も解離し易いものとなる。 すなわち、 反応平衡が 維持されるか、 ァゴニスト解離方向にシフトする。 したがって、 前記の例では、 ァゴニスト （61) 添加時からの蛍光強度の経時変化を測定した場合には、 蛍光強 度の変化率が一時的に大きくなつても、 時間の経過とともに小さくなつていくこ とが観察される。
なお、 以上のとおりのァゴニストのスクリーニング方法では、 高い測定精度を 維持するために、 スクリーニングの対照となる候補物質以外にァゴニス卜やアン タゴニストが存在しないものとすることが望ましい。
この出願の発明では、 また、 前記のァゴニスト ·アンタゴニスト検出用プロ一 ブ （1) を用いてアン夕ゴニストをスクリーニングする方法をも提供する。 具体 的には、 内在性ァゴニスト等の既知のァゴニストの存在下で、 ァゴニスト 'アン タゴニスト検出用プローブ （1) と、 過剰量のアンタゴニスト候補物質を共存さ せ、 シグナルの変化を測定することによりアン夕ゴニストをスクリーニングする ことができる。 このとき、 既知のァゴニストとァゴニス卜 'アン夕ゴニスト検出 用プローブ （1) のみが存在する状態では、 ァゴニストとリガンド認識部位 (2) が結合することにより、 二つのマーカ一部位 （51、 52) が近接し、 シグナルが検 出される。 しかし、 過剰量のアン夕ゴニスト候補物質が共存する場合には、 候補 物質が拮抗作用を示せばこれがァゴニスト ·アン夕ゴニスト検出用プローブ （1) におけるリガンド認識部位 （2) のリガンド結合ドメイン （22) を認識し、 選択 的に結合するようになる。 したがって、 このようなシグナルは徐々に減少する。 一方、 アン夕ゴニスト候補物質が拮抗作用を示さない場合には、 ァゴニスト -ァ ンタゴ二スト検出用プローブ （1) におけるァゴニストとリガンド認識部位 （2) との結合が維持され、二つのマーカー部位（51、 52)が近接した状態が持続する。 そこで、 予めアン夕ゴニスト候補物質非共存下でのシグナル、 例えば蛍光強度を 測定し、 その結果を過剰量のアン夕ゴニスト候補物質の共存下での蛍光強度と比 較すれば、 該候補物質がアンタゴニストとして作用するか否かが正確に判断でき る。
具体的には、 二つのマーカ一部位 （51、 52) を、 近接することにより FRETを 生じる蛍光発色団とした場合、 ドナーとして作用する発色団 （仮に 51とする） に励起波長を照射し、 該発色団 （51) の蛍光強度を測定した場合、 アン夕ゴニス ト共存下では、 非共存下 （つまり、 既知のァゴニストのみ存在下） に比べて蛍光 強度が増大する。 逆に、 二つの蛍光発色団のうち、 ドナーとして作用する発色団 (仮に 51とする）に励起波長を照射し、ァクセプ夕一として作用する発色団（こ の場合 52) の蛍光強度を測定した場合には、 アン夕ゴニスト共存下では、 蛍光強 度の低下が見られる。
以上のとおりのァゴニストのスクリーニング方法およびアン夕ゴニストのスク リーニング方法において、 ァゴニスト ·アン夕ゴニスト検出用プローブ（1) を、 ァゴニスト、 ァゴニスト候補物質、 アン夕ゴニスト候補物質等と共存させる方法 は限定されず、 様々な方法が考えられる。 例えば、 試料溶液中でァゴニスト ·ァ ン夕ゴ二スト検出用プローブ （1) とァゴニスト候補物質、 もしくは既知のァゴ ニス卜/過剰量のアン夕ゴニスト候補物質を共存させる方法が挙げられる。 この ような方法では、ァゴニス卜を in vitroで検出 '定量、スクリーニングできる。 また、 この出願の発明のスクリーニング方法では、 ァゴニスト ·アン夕ゴニス 卜検出用プローブ （1) を組み込んだ発現ベクターを個々の培養細胞に導入する 方法により、 細胞内でァゴニスト ·アンタゴニスト検出用プローブ （1) とァゴ ニスト候補物質やアンタゴニスト候補物質を共存させることができる。 発現べク ターとしては、 動物細胞発現用のプラスミドベクタ一が好ましく用いられる。 こ のようなプラスミドベクタ一を細胞に導入する方法としては、 電気穿孔法、 リン 酸化カルシウム法、 リボソーム法、 DEAEデキストラン法等の公知の方法を採用す ることができる。 このように、 ァゴニスト ·アンタゴニスト検出用プローブ （1) を組み込んだ発現べクタ一を細胞に導入する方法では、 細胞をァゴニス卜候補物 質、 既知のァゴニスト、 アン夕ゴニスト候補物質等で刺激することにより、 細胞 を破壊することなく、 ァゴニストやアン夕ゴニス卜を in vivoでスクリーニング できる。
さらに、 この出願の発明では、ァゴニスト ·アン夕ゴニスト検出用プローブ（1) を発現するポリヌクレオチドを細胞内に導入し、 非ヒト動物全能性細胞を個体発 生することによって、 全細胞においてァゴニスト ·アン夕ゴニスト検出用プロ一 ブ （1) が存在しているトランスジエニック非ヒト動物が得られる。 トランスジ エニック非ヒト動物は、 公知の作成法 （例えば、 非特許文献 3 1 ) に従って作製 することができる。 このようなトランスジエニック非ヒト動物は、 すべての体細 胞にァゴニスト ·アン夕ゴニスト検出用プローブ （1) を保有しており、 体内に おいてァゴニスト 'アンタゴニスト検出用プローブ （1) と内在性のァゴニスト を共存させることができる。 また、 このような非ヒト動物の体内に医薬品や内分 泌攪乱物質などの検査物質や候補物質を導入することにより、 体内で、 ァゴニス ト ·アンタゴニスト検出用プローブ （1) とァゴニスト候補物質やアン夕ゴニス ト候補物質を共存させることができ、 細胞および組織におけるシグナル変化を測 定することにより、 様々な物質のスクリーニングを行うことが可能となる上、 医 薬品、 内分泌攪乱物質、 あるいはこれらの候補物質による生命活動や疾患への影 響や効果を調査することも可能となる。 さらに、 このようなトランスジエニック 非ヒト動物を用いることにより、 内在性ァゴニス卜が分泌される時期や条件等の 生体内動態を可視化分析することも可能となる。
なお、 以上のとおりのスクリーニング方法において、 スクリーニングの対象と なるァゴニストやその候補物質は、天然物質であってもよいし、ゲニスティン（以 下 Genとする；植物エス卜ロゲン)、 ジェチルスチルベストロール （以下 DESと する；スチルベン）、 ビスフエノール A (以下 Bis- Aとする；二フエノール性物 質)、 ノニルフエノール （以下 NPとする；アルキルフエノール） 等の合成物質、 また、 15-deoxy-A 12' "-prostaglandin J2 (15d-PGJ2)、 テストステロン、 5 α -ジ ヒドロテストステロン （5 α- dihydrotestosterone； DHT) 等であってもよい。 ま た、 アン夕ゴニストやその候補物質は、 4-hydroxytainoxifeii (0HT)、 ICI 182, 78 0、 フル夕ミド、 酢酸シプロテロン （cyproterone acetate； CPA) 等が例示され るが、 これらに限定されない。
そして、 上記のとおりのこの出願の発明の効果についてまとめると、 第 1〜6 の発明であるァゴニスト ·アンタゴニスト検出用プローブでは、 ァゴニス卜が核 内レセプ夕一のリガンド結合ドメインに結合した場合には、 核内レセプターリガ ンド結合ドメインの立体構造が変化し、 活性化補助因子結合ドメインが形成され る。 このとき、 屈曲性のリンカ一を介してリガンド認識部位に連結されている結 合応答部位が、 この活性化補助因子結合ドメインを認識し、 結合する。 これによ り、 融合構造、 すなわち [リガンド認識部位 Zリンカ一 Z結合応答部位] の両末 端に連結された二つのマーカー部位が近づきシグナルが検出可能となる。 一方、 このようなァゴニスト ·アン夕ゴニスト検出用プローブでは、 核内レセプ夕一の リガンド結合ドメインにアンタゴニストが結合した場合には、 核内レセプターリ ガンド結合ドメインの立体構造変化は起こらず、 活性化補助因子結合ドメインも 形成されない。 そのため、 前記融合構造の両末端に連結された二つのマ一力一部 位は離れたままとなり、 検出可能なシグナルを発しない。 したがって、 このよう なァゴニスト ·アン夕ゴニスト検出用プローブを使用することにより、 該核内レ セブタ一に対するァゴニストゃアン夕ゴニストを選択的に検出、 定量できるよう になる。 また、 特定の物質が、 該核内レセプターに対するァゴニストとして作用 するか、 アンタゴニストとして作用するかを、 迅速に、 精度高く判定することが 可能になる。
また、 第 7の発明では、 ァゴニスト 'アンタゴニスト検出用プローブとァゴニ スト候補物質を共存させ、 ァゴニスト候補物質非存在下および存在下におけるシ グナルの変化を測定することにより、 簡便に、 精度高く該候補物質が核内レセプ タ一に対するァゴニストとして作用するか否かをスクリーニングできる。
さらに、 第 8の発明では、 ァゴニスト ·アンタゴニスト検出用プローブを発現 するポリヌクレオチドを細胞内に導入し、 細胞内で該プローブとァゴニス卜候補 物質を共存させることにより、 候補物質がァゴニス卜として作用するか否かを i n vivoで判別すること
が可能となる。
第 9の発明では、 ァゴニスト ·アンタゴニスト検出用プローブを発現するポリ ヌクレオチドを細胞内に導入し、 非ヒト動物全能性細胞を個体発生することによ つて、 この動物またはその子孫動物 （前記第 1 3の発明） の全細胞において、 該 プローブとァゴニスト候補物質を共存させることができる。 これにより、 該候補 物質が核内レセプ夕一に対するァゴニストとして作用するか否かを判別できると ともに、 この非ヒト動物の生命活動や疾患に対する該物質の影響や効果をモニタ 一することが可能となる。 また、 このような非ヒト動物を用いて、 核内レセプ夕 一の内在性ァゴニスト （例えばエストロゲン） が分泌される時期や条件等の生体 内動態を可視化分析することも可能となる。
さらに、 第 1 0の発明では、 既知のァゴニストの存在下で、 ァゴニスト 'アン 夕ゴニスト検出用プローブと、 過剰量のアン夕ゴニスト候補物質を共存させ、 ァ ン夕ゴニス卜候補物質非共存下および共存下におけるシグナルの変化を測定する ことにより、 簡便に、 精度高く、 該候補物質が核内レセプ夕一に対するアン夕ゴ 二ストとして作用するか否かをスクリ一二ングできる。
また、 第 1 1の発明では、 ァゴニスト 'アン夕ゴニスト検出用プローブを発現 するポリヌクレオチドを細胞内に導入し、 細胞内で、 プローブ、 既知のァゴニス ト、 および候補物質を共存させることにより、 候補物質がアン夕ゴニストとして 作用するか否かを in vivoで判別することが可能となる。
さらに、 第 1 2の発明では、 ァゴニスト ·アン夕ゴニスト検出用プローブを発 現するポリヌクレオチドを細胞内に導入し、 非ヒト動物全能性細胞を個体発生す ることによって、 この動物またはその子孫動物 （第 1 3の発明） の全細胞におい てプローブと既知のァゴニストとアン夕ゴニスト候補物質を共存させることがで きる。 これにより、 該候補物質が核内レセプ夕一に対するアン夕ゴニストとして 作用するか否かを判別できると共に、 この非ヒト動物の生命活動や疾患に対する ァン夕ゴニスト候補物質の影響や効果をモニタ一することも可能となる。
以下、 実施例を示し、 この発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。 もちろん、 この発明は以下の例に限定されるものではなく、 細部については様々 な態様が可能であることは言うまでもない。 実施例
ぐ準備 >
( 1 ) 材料
Ham' s F- 12培地、 ゥシ胎児血清 （FCS)、 Hank' sバランス電解液 （HBSS)、 およ びリポフエクタミン 2000試薬は Life Technologies (Rockvi lle, MD) より購入 した。
ダルベッコ修飾イーグル培地 （D EM)、 トリプシン一 EDTA、 E2、 DES、 0HT、 Gen は Sigma Chemicals Co. (St. Louis, M0) より購入した。
抗 GFP抗体は Clontech (Palo Alto, CA) より入手した。
クロ一ニング用酵素は全て Takara Biomedical (東京、 日本） から入手した。 hERacDNAプラスミドは American Type Cul ture Col lect ion (ATCC, VA, USA) より購入した。
哺乳類発現ベクター PCDNA3. 1 (+)は Invitrogen Co. (Carlbad, CA)より入手し た。 Bis-A、 NP、 ICI 182, 780は WAKO Pure Chemicals Industries Ltd (大阪、 日 本） より入手した。
その他の試薬は分析試薬グレード品を使用した。
( 2 ) プラスミド構築
(A) エストロゲンレセプターのァゴニスト ·アンタゴニスト検出用プローブ 標準的なポリメラ一ゼ連鎖反応 （PCR) により ECFP (配列番号 3 ) (l-238aa)、
EYFP (配列番号 4 ) (1- 238aa)、 ヒトエストロゲンレセブター aLBD (配列番号 5 ) (305-550aa) (以下、 Er a-LBDとする）、屈曲性リンカ一（GGNGG) (配列番号 6 )、 およびステロイドレセプ夕一活性化補助因子 1 NRボックス II (配列番号 2 ) (68 7-697aa) のフラグメント cDNAを産生し、 Kozak配列 （図中で Kzと表記） と制限 部位を連結して図 2 Αに示される構成を構築した。
これより、 ステロイドレセプ夕一活性化補助因子 1 (SRC-1) の活性化補助因子 ペプチド （配列番号 2 ) (非特許文献 2 3〜2 5 )が、短い可動性のリンカ一（配 列番号 3 ) を介して ERaLBDに連結され、 この融合蛋白質が 2種類の異なる蛍光 波長を有する蛍光蛋白質、 すなわち CFP (ドナ一） と YFP (ァクセプター） に挟 まれた、 ァゴニスト ·アン夕ゴニスト検出用プローブを得た。
なお、 PCRフラグメントの配列は、 ABI310ジェネティック ·アナライザーを用 いて決定した。
この cDNAを、 哺乳類発現ベクター pcDNA3. 1 (+)の Hindlllと Xhol部位に挿入 した。
(B) ペルォキシソ一ム増殖因子活性化レセプ夕一のァゴニスト ·アンタゴニス ト検出用プローブ
上記 （A) エストロゲンレセプ夕一の場合とほぼ同様の手順で、 プラスミドを 構築した。 すなわち、 標準的なポリメラーゼ連鎖反応 （PCR) により ECFP (配列 番号 3 ) (1- 238aa)、 EYFP (配列番号 4 ) U-238aa)、 ペルォキシゾーム増殖因子 活性化レセプター rLBD (配列番号 8 ) (235-505aa) (以下、 PPARr-LBDとする）、 屈曲性リンカ一 （GGNGG) 6 (配列番号 9 )、 およびステロイドレセプター活性化補 助因子 1 N ボックス II (配列番号 2 ) (687-697aa) のフラグメント cDMを産生 し、 Kozak配列（図中で Kzと表記） と制限部位を連結して図 2 Βに示される構成 を構築した。
これより、 ステロイドレセプタ一活性化補助因子 1 (SRC-1) の活性化補助因子 ペプチド （配列番号 2 ) (非特許文献 2 3〜2 5 )が、 短い可動性のリンカ一（配 列番号 3 ) を介して PPMr-LBDに連結され、 この融合蛋白質が 2種類の異なる 蛍光波長を有する蛍光蛋白質、 すなわち CFP (ドナ一） と YFP (ァクセプター） に挟まれた、 ァゴニスト ·アン夕ゴニスト検出用プローブを得た。
なお、 PCRフラグメントの配列は、 ABI310ジェネティック ·アナライザ一を用 いて決定した。
この cDMを、 哺乳類発現ベクター PCDNA3. 1 (+)の Hindlllと Xhol部位に挿入 した。
(C) アンドロゲンのァゴニスト ·アン夕ゴニスト検出用プローブ
上記 (A) エストロゲンレセプターや （B) ペルォキシソ一ム増殖因子活性化 レセプ夕一の場合とほぼ同様の手順で、 プラスミドを構築した。 すなわち、 標準 的なポリメラ一ゼ連鎖反応 （PCR) により ECFP (配列番号 3 ) (卜 238aa)、 EYFP
(配列番号 4 ) (l-238aa), ヒトアンドロゲンレセプ夕一 LBD (配列番号 1 0 ) (6 72-910aa) (以下、 A -LBDとする）、 屈曲性リンカ一 （GGNGG) 3 (配列番号 1 1 ) およびステロイドレセプ夕一活性化補助因子 1 NRボックス II (配列番号 2 ) (68 7-697aa) のフラグメント cDNAを産生し、 Kozak配列（図中で Kzと表記） と制限 部位を連結して図 2 Cに示される構成を構築した。
これより、 ステロイドレセプ夕一活性化補助因子 1 (SRC-1) の活性化補助因子 ペプチド （配列番号 2 ) (非特許文献 2 3 ~ 2 5 )が、 短い可動性のリンカ一（配 列番号 3 ) を介して AR-LBDに連結され、 この融合蛋白質が 2種類の異なる蛍光 波長を有する蛍光蛋白質、 すなわち CFP (ドナー） と YFP (ァクセプ夕一） に挟 まれた、 ァゴニスト ·アン夕ゴニスト検出用プローブを得た。
なお、 PCRフラグメントの配列は、 ABI310ジェネティック ·アナライザ一を用 いて決定した。 この cDNAを、 哺乳類発現べクタ一 pcDNA3. 1 (+)の Hindlllと X ol部位に挿入 した。
( 3 ) 細胞培養と形質移入
各細胞を、 10 ゥシ胎児血清 （FCS) を添加した Ham' s F-12培地培地、 ならび に 10 % FCS、 1. 0 ピルビン酸ナトリゥム、 0. 1 mM非必須アミノ酸を添加した ダリレべッコ修飾イーグル培地中にて、 それぞれ 5¾ C02下、 37^で培養した。 細胞 の形質移入は、 リポフエクタミン 2000試薬の存在下、 ガラス底シャーレ中で、 プローブを含む発現ベクター PCDNA3. 1 (+)を用いて行った。
なお、 使用した細胞は、 エストロゲンレセプターのァゴニスト ·アン夕ゴニス ト検出用プローブではチャイニーズ八ムスター卵巣 （CH0-K1) 細胞を、 ペルォキ シソーム増殖因子活性化レセプターのァゴニスト ·アン夕ゴニスト検出用プロ一 ブでも CHO- K1細胞を、 アンドロゲンレセプ夕一のァゴニスト ·アンタゴニスト 検出用プローブではブタ腎臓 （PK-15) 細胞を使用した。
細胞は、 形質移入から 12〜24時間後に画像処理可能な状態となった。
( 4 ) 蛋白質発現のィムノブロット分析
図 2 A〜図 2 Cに示される各プローブをェンコ一ドしている発現ベクター pcD NA3. 1 (+>を用いて形質移入した細胞破碎液 （CHO- K1または PK-15) を、 10 ポリ アクリルアミドゲル電気泳動による SDS-PAGEに供し、 電気泳動によりニトロセ ルロース膜上に転写した。
この膜は、 まず抗 GFP抗体 （1 スキムミルク含有 TBST溶液 （組成： 50mM Tris -HC1 pH& 0、 150mM NaCK 0. 05% Tween 20) で 1 :500希釈） を用いて、 続いてァ ルカリホスファタ一ゼ標識抗ゥサギ抗体 （1¾スキムミルク含有 TBST溶液で 1 :50 00希釈） を用いて可視化した。
蛋白質の発現量は、 イメージアナライザ （LAS- 1000 plus, Fuj ifilm CO. , 東 京、 日本） により定量した。
( 5 ) 細胞の画像処理
画像処理に先立ち、 培地を Hank' sバランス電解液に置き換えた。 細胞の画像 処理は CarlZeiss Axiovert 135顕微鏡上で、 MetaFluor (Universal Imaging, W est Chester, PA) でコントロールされた冷却電荷結合素子カメラ MicroMAX (Ro per Scientific Inc. Tucson, AZ) を用いて、 形質移入後 12〜24時間以内に室 温条件で実施した。
440士 10腿励起時の露出時間は、 100 msであった。 蛍光画像の取得は 40X油 浸対物レンズ （Carl Zeiss, Jena, Germany) を用い、 480±15 nmならびに 535 ±12.5 nmのフィルタ一を介して行った。
<実施例 1 > ァゴニスト ·アン夕ゴニスト検出用プローブの応答性評価
(1) エストロゲンレセプターのァゴニスト ·アンタゴニスト検出用プローブ (1 - 1) エストロゲンの中で最も強力な活性を示すことで知られる ェ ストラジオール （E2) をァゴニストとし、 ァゴニスト刺激に対するプローブの応 答性を評価した。
まず、プローブ（図 2A-a)を発現させた CH0- K1細胞を 100 D E2で刺激し、 FRET変化の経時変化を観察した。 図 3 Aに、 E2刺激前と刺激後の細胞画像を示 した。 なお、 図 3 Aにおいては、 480/535皿の蛍光強度比が疑似カラ一画像とし て示されている。
図 3 Aより、 100 nM E2刺激による疑似カラーのブルーシフトが観察された。 これは、 CFP/YFP蛍光強度比の減少 （FRETの増加） を表している。
蛍光強度比の減少は、 E2添加後数秒以内に検出され、 1000秒以内にプラト一 に達した （図 4A- a)。 一方、 E2を添加しないこと以外は同一条件で FRET変化 の経時変化を観察したところ、 有意な変化は見られなかった （図 4A-b)。
(1— 2) 次に、 このような FRETの増加が E2によるリガンド認識部位 （ERa LBD) と結合応答部位（LXXLLモチーフ） の相互作用により引き起こされているこ とを確認するため、 LXXLLモチーフの竦水性ロイシン（L)残基を全てァラニン（A) 残基に置換した （配列番号 7) 変異プローブを作成した （図 2A- b)。
図 4cに示されるように、 変異プローブを発現させた CH0-K1細胞では、 E2刺 激による CFP/YFP蛍光強度比の有意な変化は見られなかった。
したがって、 FRETの変化は、 ァゴニスト刺激の結果、 ァゴニスト ·アンタゴニ スト検出用プローブにおけるリガンド認識部位 (ERaLBD) に結合応答部位 （LXX LLモチーフ） が結合したことによるものであることが確認された。
また、 従来報告されているように （非特許文献 5、 23〜25)、 ERaLBDの活 性化補助因子結合ドメインに対する相互作用に LXXLLモチーフの疎水性ロイシン 残基が重要な役割を果たすことも確認された。
(1— 3) 次に、 E2/ERaLBD複合体の X線結晶解析を行ったところ、 E2は ER aLBDに存在する疎水性リガンド結合ポケット （容積 450A3； E2の分子容 (245 A 3)の約 2倍） で包接されており、 低エネルギー立体構造を取っていることが明ら かになつた （非特許文献 32)。
ヘリックス 12は、 リガンド結合ポケットの上に位置し、 これにより疎水性 LX XLLモチーフの取り込みと相互作用を可能とする疎水性の溝が形成されている。 また、 このような溝は、 LXXLLモチーフの 3つのロイシン残基の側鎖と ERaLBD 側鎖の Met 543、 Lys 362、 Glu 542残基との間に生じるファン'デル ·ワールス 接触により安定化されている （非特許文献 33)。
これより、 プローブにおけるリガンド認識部位 （ERaLBD) と結合応答部位 (L XXLLモチーフ） の相互作用により、 CFPと YFPが近接し、 その結果 FRETが生じ ることが確認された。
(2) ペルォキシゾーム増殖因子活性化レセプ夕一のァゴニス卜 ·アンタゴニス ト検出用プローブ
(2-1) 15-deoxy-A12' "-prostaglandin J2 (15d-PGJ2) を内在性ァゴニスト とし、 ァゴニスト刺激に対するプローブの応答性を評価した。 また、 抗糖尿病薬 のピオグリタゾン （pioglitazone) に対するプローブの応答性も評価した。 まず、 プローブ （図 2B) を発現させた CH0-K1細胞を 10 xM 15d-PGJ2で刺激 し、 FRET変化の経時変化を観察した。
CFP/YFP (480/535 nm) の蛍光強度比の減少 （FRETの増加） は、 15d-PGJ2添加 後 400秒以内に検出され、 1000秒以内にプラトーに達した （図 4B-a)。 また、 図 4 B-bに、 15d-PGJ2の濃度と蛍光強度比変化の値の関係（反応曲線）を示した。
(2-2) また、 上記と同様に、 プローブ （図 2B) を発現させた CH0-K1細 胞を I. O M pioglitazoneで刺激した場合の FRET変化の経時変化も観察した。 CFP/YFP (480/535 nm) の蛍光強度比の減少 （FRETの増加） は、 pioglitazone 添加後 100秒以内に検出され、 100秒を過ぎたあたりからプラト一に達した （図 4 C-a)。 また、 また、 図 4C-bに、 pioglitazoneの濃度と蛍光強度比変化の値 の関係 （反応曲線） を示した。
(3) アンドロゲンレセブ夕一のァゴニスト ·アン夕ゴニスト検出用プローブ (3-1) 5a-dihydrotestosterone (DHT) をァゴニストとし、 ァゴニスト刺 激に対するプローブの応答性を評価した。
まず、プローブ（図 2 C- a)を発現させた PK- 15細胞を 100 nM DHTで刺激し、 FRET変化の経時変化を観察した。 図 3Bに、 DHT刺激前と刺激後の細胞画像を示 した。 なお、 図 3 Bにおいては、 480/535皿の蛍光強度比が疑似カラ一画像とし て示されている。
図 3Bより、 100 nM DHT刺激による疑似カラーのブルーシフトが観察された。 これは、 CFP/YFP蛍光強度比の減少 （FRETの増加） を表している。
蛍光強度比の減少は、 DHT添加後数秒以内に検出され、 1200秒以内にプラトー に達した（図 4D-a)。 一方、 DHTを添加しないこと以外は同一条件で FRET変化 の経時変化を観察したところ、 有意な変化は見られなかった （図 4D-b)。
(3-2) 次に、 このような FRETの増加が、 DHTによるリガンド認識部位 （A R-LBD) と結合応答部位 （LXXLLモチーフ） の相互作用により引き起こされている ことを確認するため、 LXXLLモチーフの疎水性ロイシン （L)残基を全てァラニン (A) 残基に置換した （配列番号 7)、 変異プローブを作成した （図 2B-b)。 図 4 D-cに示されるように、 変異プローブを発現させた PK- 15細胞では、 DHT 刺激による CFP/YFP蛍光強度比の有意な変化は見られなかった。
したがって、 FRETの変化はァゴニスト刺激の結果、上記エストロゲンレセプ夕 —のァゴニスト ·アン夕ゴニスト検出用プローブの結果と同様に、 ァゴニスト · アン夕ゴニスト検出用プローブにおけるリガンド認識部位 （AR- LBD) に結合応答 部位 （LXXLLモチーフ） が結合したことによるものであることが確認された。 <実施例 2> ァゴニスト ·アンタゴニスト検出用プローブを用いた外来性ァゴ 二ストのスクリーニング (1) エストロゲンレセプ夕一のァゴニスト ·アン夕ゴニスト検出用プローブ CH0-K1細胞内でプローブを発現させ、 DES、 Gen, Bis-Aおよび NPの外来性ェ ストロゲンについて、 エス卜ロゲン様活性の誘発能力を評価した。
なお、 物質の濃度は、 1.0X10— 4 Mから 1.0X10-11 Mの範囲とした。
図 5 Aに各物質の濃度と蛍光強度比変化の値の関係 （反応曲線） を示した。 図 5Aから、 各物質の EC50 (リガンド認識部位 (ERaLBD)と結合応答部位 (LXXL Lモチーフ）の反応が 50 ¾起こるために必要な物質濃度）値を求めたところ、 E2、 DES、 Gen, NPおよび Bis- Aについて、 各々 0.8X10-8 M、 1.3X10"8 M, 6.5X10- 8 M、 0.26X10-* M、 0.42X10— 6 Mを得た。 これらの EC5()値を、 相対取り込み能力 （R RA;非特許文献 34) に変換し、 各物質が結合応答部位のリガンド認識部位への 取り込みを促進する相対的能力を比較した。
なお、 RRAは以下の式により算出した。
R = (E2濃度 [50 S!反応] /EDC濃度 [50 %反応]) X100
実施例 1において使用したエス卜ロゲン E2の R 値は任意に 100とした。 E2、 DES、 Gen, NP, Bis-Aの R 値は各々 100、 60、 12、 3.0、 1.9として得られた。 したがって、 これらの物質が、 結合応答部位のリガンド認識部位への取り込み を促進する能力は、 E2>DES>Gen>NP>Bis-Aであることが明らかになった。 以上より、 各物質の FRET応答の違いは、 外来性ァゴニストがプローブ内の ER aLBDの立体構造をリガンド特異的に変化させ、 LXXLLモチーフを取り込めるよ うにする 「強さ J を反映していることが確認された。
E2は ERに結合することにより、 ERの三次構造における立体配座の変化を誘導 する。 このような立体配座の変化により、 ERのリガンド結合ドメインは、 活性化 補助因子を取り込み、 その結果として基本転写機構の構築を媒介するような位置 に配置されるようになる （非特許文献 4、 5)。
しかし、 実際の立体構造変化、 すなわち外来性エストロゲンが誘導する ERに おけるヘリックス 12の再配置は、 各物質の立体的および静電的性質の違いに影 響され、 E2の場合と異なる可能性がある （非特許文献 24、 25、 35、 36)。 なお、 Routleddge et al.は、 GSTプルダウンアツセィを用いて、 前記の各物質 について、 ER (と活性化補助因子蛋白質の会合を促進する能力を求め、 同様の結 果を得ている （非特許文献 34)。
(2) アンドロゲンレセプ夕一のァゴニスト ·アン夕ゴニスト検出用プローブ PK-15細胞内でプローブを発現させ、 アンドロゲンのァゴニス卜である DHT、 アンドロゲンのアンタゴニストであるテストテロン、 プロゲステロンおよびコル チゾールについて、 アンドロゲン様活性の誘発能力を評価した。
なお、 これら物質の濃度は、 l.OXlO"4 Mから 1.0X10— 11 Mの範囲とした。 図 5 Bに各物質の濃度と蛍光強度比変化の値の関係 （反応曲線） を示した。 図 5Bから、 各物質の EC5() (リガンド認識部位 (AR-LBD)と結合応答部位 (LXXLL モチーフ）の反応が 50 %起こるために必要な物質濃度） 値を求めたところ、 DHT、 テストテロンおよびプロゲステロンについては、 各々 1. 1X10— 9 M、 1.7X10— 8 M、 4.7X10— 7 Mを得、 コルチゾールについては反応を示さなかった。
FRET変化は、テス卜テロンの濃度が DHTの 10倍濃度を供することで、 DHTの F RET変化と同じ度合いを示した。 その一方で、 プロゲステロンの場合では、 濃度 を上げても DHTやテストテロンの FRET変化と同じ程度の度合いを示すことはな かった。
図 5 Bに示した結果から、 このような各物質の FRET応答の違いは、 これら各 物質が A -LBDの立体構造をリガンド特異的に変化させるには、 プローブ内の活 性化補助因子を取り込む 「強さ」 に反映していることが確認された。
<実施例 3> ァゴニストとアン夕ゴニストの識別
(1) エストロゲンゲンレセブ夕一のァゴニスト ·アン夕ゴニスト検出用プロ一 ブ
(1-1) プローブを発現させた CH0- K1細胞を、 E2ならびにエストロゲンレ セプターのアン夕ゴニストとして知られている ICI 182, 780および 0HT (それぞ れ 1.0 Μ) により刺激し、 FRET応答の変化をモニターした。
E2刺激により FRETの大幅な増大が見られた （図 6-a) が、 ICI 182， 780と 0 HTでは FRETの顕著な増大は見られなかった （図 6-b、 -c)。
(1 -2) 次に、 E2が、 リガンド認識部位に結合した ICI 182, 780および 0HT を置換する能力を検討した。
プローブを発現させた CH0- K1細胞を含む 3つの異なるガラス底シャーレに、 1. 0 xMの ICI 182, 780を添加し、 室温で 15分間インキュベートした。 その後、 I CI 182, 780を洗浄除去することなく、 1番目、 2番目、 3番目のシャーレにそれ ぞれ 1.0 Μ, 10 iiM、100 Mの E2を添加し、 FRET応答の変化をモニターした。
1.0 の ICI 182, 780が存在する条件で、 1.0 と 10 の E2を添加し た場合には、 FRETの変化は観察されなかったものの （図 6- d、 -e)、 E2の濃度 を 100 とした場合には FRETレベルの変化が見られた （図 6- f)。 しかし、 この変化は 1.0 /χΜの Ε2のみで生じる FRET変化の 40 ¾ほどであった。
同様に、 1.0 χΜの 0HTが存在する条件で 1.0 Μ, 10 Μ, 100 の Ε2を 添加した場合には、 FRET応答の増大は、 それぞれ、 1.0 Mの E2単独で生じる 変化の 40 ¾、 65 %. 90 ϋίであった （図 6-g、 -h, - i)。
以上結果から、 E2 (ァゴ二スト） は、 生細胞中でプローブにおけるリガンド認 識部位 (ERaLBD) と結合応答部位 （LXXLLモチーフ） の相互作用を促進するが、 ICI 182, 780と01«： (アンタゴニスト） はこのような相互作用を阻害することが 確認された。 さらに、 相互作用のアン夕ゴニストによる阻害は、 ァゴニストの濃 度を 100倍高濃度にしても完全に回復しないことが示された。
したがって、 ァゴニスト ·アン夕ゴニスト検出用プローブがァゴニストの存在 下で発信するシグナルが、 アン夕ゴニス卜の共存により妨害されることが確認さ れた。
(1 - 3) 以上の結果を、 ァゴニストとアン夕ゴニストが存在する状態での E RaLBDの X線結晶解析結果 （非特許文献 32および 33) と比較した。
ァゴニストが結合した場合には、 リガンド結合ドメインの立体構造変化が誘導 され、 同時にリガンド結合ポケット上に H12が配置されるため、 リガンド結合ド メイン表面上にある活性化補助因子結合ドメインが曝露される。
一方、 アン夕ゴニストは、 塩基性の嵩高い側鎖とヘリックス 12の間に直接的 な立体効果を及ぼすことにより、 ヘリックス 12が適切な配座を取ることを阻害 する。 そのため、 活性化補助因子結合ドメインが正しく形成されず、 リガンド結 合ドメイン （上記の実施例においては、 ERaLBD) が活性化補助因子の核内レセ プター相互作用ドメイン （上記の実施例においては、 LXXLLモチーフ） と相互作 用できなくなる。
以上より、 ァゴニスト ·アンタゴニスト検出用プローブにおける CFPから YFP へのエネルギー転移は、 ァゴニスト （E2) 存在下では起こるが、 アン夕ゴニスト (ICI 182, 780と01^) の存在下ではブロックされることが示された。
したがって、 ァゴニスト，アン夕ゴニスト検出用プローブを用いて、 各種の候 補物質存在下におけるリガンド認識部位による結合応答部位の取り込み能を測定 することにより、 ァゴニストとアン夕ゴニストを選択的に判別できることが確認 された。
( 2 ) ペルォキシゾーム増殖因子活性化レセプ夕一のァゴニスト ·アン夕ゴニス 卜検出用プローブ
プローブを発現させた CH0-K1細胞を、 ペルォキシゾーム増殖因子活性化レセ プタ一のアンタゴニストである、 ビスフエノール Aジグリシジルェ一テル （BADG E) 10 Mにより刺激し、 FRET応答の変化をモニタ一した。
図 7に示したように、 BADGEを添加しても、 蛍光強度比において大きな変化は なかった。
( 3 ) アンドロゲンレセブターのァゴニスト 'アンタゴニスト検出用プローブ ( 3 - 1 ) プローブを発現させた PK-15細胞を、 DHT (1. 0nM、 10 η および 10
0 ηΜ) ならびにエストロゲンレセプ夕一のアン夕ゴニストであるフルタミドおよ びプロシミドン （procymidone) (それぞれ 10 xM) により刺激し、 FRET応答の 変化をモニタ一した。
図 8に示したように、 DHT刺激により、濃度依存的に FRETの大幅な増大が見ら れたが、 フルタミドおよびプロシミドン （それぞれ ΙΟΟη ) では FRETの顕著な増 大は見られなかった。
そして、 DHT+フルタミドならびに DHT+プロシミドンについては、 DHTの濃度依 存的に増大した。 ( 3— 2 ) また、 プローブを発現させた PK-15細胞を、 フル夕ミド （1. 0 Μ) のみによる刺激およびフルタミド （10 ^Μ) +テストテロン （100 nM) による刺 激の FRET応答の変化についても、 モニターした。 なお、 フル夕ミド （1. 0 ) +テストテロン （100 nM) においては、 まず、 テストテロンを添加し、 次にブラ トーに達する前後のタイミングでフルタミドを添加した。
フル夕ミド （1. 0 Μ) のみによる刺激は、 図 9 Αに示したように、 反応は特 に示さなかった。 一方、 フル夕ミド （10 ) +テストテロン （100 nM) による 刺激は、 テストテロンの添加直後には、 蛍光強度比が減少し、 およそ 3000秒で プラトーに達した。 しかし、 このときにフル夕ミドを添加すると、 蛍光強度比は 増加する傾向を示した。 産業上の利用可能性
以上詳しく説明したとおり、 この発明によって、 核内レセプ夕一に対するァゴ ニストゃアンタゴニストを選択的に検出、 定量できるァゴニスト ·アン夕ゴニス ト検出用プローブが提供される。 このようなァゴニスト ·アンタゴニスト検出用 プローブを用いることにより、 特定の物質が、 該核内レセプ夕一に対するァゴニ ストとして作用するか、 アンタゴニストとして作用するかを、 迅速に、 精度高く 判定することが可能になる。 したがって、 内分泌攪乱物質や特定の疾患に対する 医薬品の高性能スクリ一二ング方法が提供される。

Claims

請求の範囲
1 . 少なくとも、 核内レセプターのリガンド結合ドメインを含むリガンド認識 部位と、 該核内レセプターリガンド結合ドメインにおける活性化補助因子結合ド メインに特異的に結合するべプチド鎖を含む結合応答部位が、 屈曲性のリンカー を介して連結されており、 この [リガンド認識部位/リンカ一 Z結合応答部位] 融合構造の両末端に、 互いの接近が検出可能な二つのマ一カー部位が各々連結さ れていることを特徴とする核内レセブ夕一のァゴニスト ·アン夕ゴニスト検出用 プローブ。
2. リガンド認識部位は、 ダルココルチコイドレセプ夕一、 エストロゲンレセ プ夕一、 プロゲステロンレセプター、 ペルォキシソ一ム増殖因子活性化レセプ夕 一、 アンドロゲンレセプ夕一、 甲状腺ホルモンレセプ夕一、 レチノイン酸レセプ ター、 ビタミン Dレセプ夕一、 およびォ一ファンレセプターからなる群より選択 されるいずれかの核内レセプ夕一のリガンド結合ドメインを含むものである請求 項 1のァゴニスト ·アン夕ゴニスト検出用プローブ。
3. リガンド認識部位は、 エストロゲンレセプ夕一 αリガンド結合ドメイン、 ペルォキシゾーム増殖因子活性化レセプターリガンド結合ドメインまたはアンド ロゲンレセプ夕一リガンド結合ドメインである請求項 1のァゴニスト ·アン夕ゴ 二スト検出用プローブ。
4. 結合応答部位は、 ステロイドレセプ夕一活性化補助因子 1の核内レセプタ —相互作用ドメインペプチドである請求項 3の 7ゴニスト ·アン夕ゴニスト検出 用プローブ。
5. 結合応答部位は、 配列番号 1のモチーフを含むものである請求項 3のァゴ ニスト ·アン夕ゴニスト検出用プローブ。
6. 互いの接近が検出可能な二つのマーカー部位は、 黄色蛍光タンパク質とシ アン蛍光タンパク質である請求項 1ないし 5のいずれかのァゴニスト ·アンタゴ ニスト検出用プローブ。
7. 核内レセプ夕一に対するァゴニストをスクリーニングするための方法であ つて、 請求項 1ないし 6のいずれかのァゴニスト ·アンタゴニスト検出用プロ一 ブとァゴニスト候補物質を共存させ、 ァゴニスト候補物質非存在下および存在下 におけるシグナルの変化を測定するァゴニストのスクリーニング方法。
8 . 請求項 1ないし 6のいずれかのァゴニスト ·アン夕ゴニスト検出用プロ一 ブを発現するポリヌクレオチドを細胞内に導入し、 細胞内で該プローブとァゴニ スト候補物質を共存させる請求項 7のァゴニストのスクリーニング方法。
9 . 請求項 1ないし 6のいずれかのァゴニスト ·アン夕ゴニス卜検出用プロ一 ブを発現するポリヌクレオチドを細胞内に導入し、 非ヒ卜動物全能性細胞を個体 発生することによって、 この動物またはその子孫動物の全細胞において、 該プロ ーブとァゴニスト候補物質を共存させる請求項 7のァゴニストのスクリーニング 方法。
1 0. 核内レセプターに結合し、 拮抗作用を示すアン夕ゴニストをスクリー二 ングするための方法であって、 既知のァゴニストの存在下で、 請求項 1ないし 6 のいずれかのァゴニスト ·アン夕ゴニスト検出用プローブと過剰量のアン夕ゴニ スト候補物質を共存させ、 アン夕ゴニス卜候補物質非存在下および存在下におけ るシグナルの変化を測定するァン夕ゴニス卜のスクリ一ニング方法。
1 1 . 請求項 1ないし 6のいずれかのァゴニスト ·アン夕ゴニスト検出用プロ ーブを発現するポリヌクレオチドを細胞内に導入し、 細胞内で、 該プローブと既 知のァゴニストとアン夕ゴニスト候補物質を共存させる請求項 1 0のアン夕ゴニ ストのスクリーニング方法。
1 2. 請求項 1ないし 6のいずれかのァゴニスト ·アン夕ゴニスト検出用プロ —ブを発現するポリヌクレオチドを細胞内に導入し、 非ヒト動物全能性細胞を個 体発生することによって、 この動物まだはその子孫動物の全細胞において、 該プ ローブと既知のァゴニストとアン夕ゴニスト候補物質を共存させる請求項 1 0の アン夕ゴニストのスクリ一ニング方法。
1 3 . 請求項 1ないし 6のいずれかのァゴニスト ·アン夕ゴニスト検出用プロ ーブを発現するポリヌクレオチドを細胞内に導入し、 非ヒト動物全能性細胞を個 体発生することによって得られる非ヒト動物またはその子孫動物。
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