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WO2005078100A1 - 薬剤耐性を獲得した癌細胞の検出方法 - Google Patents

薬剤耐性を獲得した癌細胞の検出方法 Download PDF

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WO2005078100A1
WO2005078100A1 PCT/JP2004/001574 JP2004001574W WO2005078100A1 WO 2005078100 A1 WO2005078100 A1 WO 2005078100A1 JP 2004001574 W JP2004001574 W JP 2004001574W WO 2005078100 A1 WO2005078100 A1 WO 2005078100A1
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gene
dna
amplification
cells
drug resistance
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PCT/JP2004/001574
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Johji Inazawa
Kohichiro Yasui
Original Assignee
Bml, Inc.
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Publication date
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Priority to EP04711038A priority patent/EP1715041A4/en
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting a cancer cell that has acquired chromosomal deletion or amplification and has acquired drug resistance to an anticancer drug.
  • Multidrug resistant protein plays an important role.
  • MDRl Multidrug resistant protein
  • MRPl Multidrug resistant protein
  • amplification of the ABCBl (MDRl) or ABCCl (MRPl) gene and consequent overexpression is found in a significant number of drug-resistant cells (Kuwano, ⁇ ⁇ , Uchiumi, ⁇ . 'Hayakawa, H., ⁇ ' ⁇ . 'Wada'M., Izumi'H. And Kohno, K .: The basic and clinical implications of ABC transporters, Y-box-binding protein-1 (YB-l) and angiogenesis-related factors in human malignancies.
  • MDR belongs to a protein having an ATP Binding Cassette (ABC) (referred to as ABC protein), and excretes an amphipathic compound having a molecular weight of about 300 to 2,000 from inside a cell to outside the cell by using the energy of ATP hydrolysis.
  • ABC protein ATP Binding Cassette
  • analysis of primary cancer cells and cancer cell lines using comparative genomic hybridization (CGH) reveals changes in specific regions of the chromosome associated with drug resistance.
  • Pathol. 155, 77-84, 1999; Struski, S., Doco'Fen zy, M., Trussardi, A., Masson'L., Gruson, N., Ulrich, E., Proult, M., Jardillier, JC, Potron, G. and Cornillet-Lefebvre, P .: Identification of chromosomal loci associated with non-P-glycoprotein-mediated multidrug resistance to topoisomerase II inhibitor in lung adenocarcinoma cell line by comparative genomic hybridization. Genes Chromosomes Cancer, 30, 136-142, 2001).
  • the problem to be solved by the present invention is to find a new gene that can detect drug-resistant cancer cells, and to provide an efficient and comprehensive means for detecting drug-resistant cancer cells using the marker. To provide. Disclosure of the invention
  • anticancer drugs that are particularly serious in side effects and frequently administered to cancer patients include camptothecin (CPT), cisplatin (CDDP), etoposide (VP-16), and ryodomycin (ADM).
  • CPT camptothecin
  • CDDP cisplatin
  • VP-16 etoposide
  • ADM ryodomycin
  • the present invention provides, in a test cancer cell, the ABCA3 gene, the ABCB6 gene, the ABCB8 gene, the ABCB10 gene, the ABCC4 gene, the ABCC9 gene, the ABCD3 gene, the ABCD4 gene.
  • the present invention provides a detection method (hereinafter, also referred to as the present detection method) for detecting the acquisition of drug resistance to the anticancer agent in the test cancer cells.
  • camptothecins include camptothecin, DX-8951 developed by Daiichi Pharmaceutical as camptothecin derivatives, 00128 developed by Menali I-Italy, Smith Klein 'Nogitecan hydrochloride developed by Beecham.
  • Ciplatins are also referred to as platinum preparations (containing platinum) and include cisplatin, vinblastine, and carpoplatin.
  • etoposides in addition to etoposide, etoposide derivatives include NK611 (etoposide derivative tablets) developed by Nippon Kayaku.
  • cytosine arabinosides in addition to cytosine arabinoside, gemcitabine, which is a fluorinated derivative thereof, is mentioned as a cytosine arabinoside derivative.
  • ABCD3 gene, ABCD4 gene, ABCE1 gene and ABCF2 gene are all genes encoding ATP Binding Cassette (ABC) transporter proteins.
  • the proteins belonging to the ABC transporter family are involved in the transport of a very wide range of substances, from ions to macromolecular proteins.
  • the ABCB1 (MDR1) gene and the ABCC1 (MRP1) gene are increased by increasing drug efflux from inside the cell. It is known to induce resistance to a number of drugs (Ling, V .: Multidrug resistance: molecular mechanisms ana clinical relevance, Cancer Chemother. Pharmacol., S3-S8, 1997).
  • the ABCll gene is amplified in camptothecin-resistant leukemia strains, and its overexpression is known to induce taxol resistance (Childs, S., Yeh, RL, Hui, D. and Ling,.: Taxol resistance mediated by transfection of the liver-specific sister gene of P-glycoprotein. Cancer Res., 58.4160-4167, 1998).
  • the present invention provides a new group of ten ABC transporter genes (ABCA3 gene, ABCB6 gene, ABCB8 gene, ABCB10 gene, ABCC4 gene, ABCC9 gene).
  • Offspring, ABCD3 gene, ABCD4 gene, ABCE1 gene and ABCF2 gene) were shown to be involved in drug resistance.
  • the ABCA3 gene is amplified and overexpressed rather than the ABCC1 gene. Therefore, it was found that the ABCA3 gene was more likely to be an amplicon (region showing gene amplification) than the ABCC1 gene.
  • the ABCC9 gene is a gene encoding the components of the ATP-sensitive K + channel (Seino, S. ATP-sensitive potassium channels: a model of heteromultimeric potassium channels / receptor assemblies, Annu. Rev. Physiol., 61 , 337-362, 1999).
  • the ABCC9 gene was found to be amplified in etoposide-resistant lung cancer (SK3 / VP16) cells and ovarian cancer (SKOV3 / VP) cells. In the former cells, increased expression of ABCC9 gene was confirmed.
  • amplification of the ABCA3 gene is an indicator of the acquisition of drug resistance to etoposide
  • ABCB6 gene is an indicator of the acquisition of drug resistance to camptothecins
  • amplification of the ABCB8 gene is The amplification of the ABCB10 gene is an index of the acquisition of drug resistance
  • the amplification of the ABCB10 gene is an index of the acquisition of drug resistance to camptothecins
  • the amplification of the ABCC4 gene is the index of the acquisition of drug resistance to cisbratins
  • It is an indicator of drug resistance to adriamycin
  • amplification of the ABCE1 gene is an indicator of drug resistance to camptothecins
  • amplification of the ABCF2 gene is an indicator of drug resistance to cisplatines.
  • the BCL2 family gene which is another gene listed above as a marker for acquiring resistance to an anticancer drug, is a gene that functions to suppress apoptotic death caused by an anticancer drug. It is. Use this action to make cancer cells multidrug resistant Given this, BCL2 is presumed to be a multidrug resistance protein.
  • BCL2 is presumed to be a multidrug resistance protein.
  • Overexpression of specific BCL2 family genes (BCL2, BCLXL, and MCL1 genes), which have anti-apoptotic effects, induces cancer cells to induce resistance to drugs used clinically in cancer cells Power S half IJ (Reed JC Dysregulation of apoptosis in cancer. J. Clin. Oncol "" 7, 2941-2953, 1999).
  • BCL2L2 gene BCL2L10 gene, BCL2L1 gene and BCL2A1 gene
  • BCL2L2 gene can also be used as an index for acquiring drug resistance. That is, amplification of the BCL2L2 gene is an indicator of the acquisition of drug resistance to toptopthecins, cisplatines, ethoxides, or cytosine arabinosides
  • amplification of the BCL2L10 gene is It is an indicator of drug resistance acquisition for rabinosides
  • amplification of the BCL2L1 gene was found to be an indicator of drug resistance acquisition for cantopeptins, cisplatin, etopoxide, or cytosine arabinoside. (Described below).
  • the ABC transporter gene and BCL2 family gene which can be used as markers for acquiring new drug resistance of cancer cells listed above, are independent genes, and In view of the inherent diversity of mutations in cancer cells, furthermore, in the examples of the present specification, there are many cases in which each marker has different drug resistance acquisition of cancer cells as an index. Therefore, it can be said that each of the gene markers listed above has value as an independent gene marker. Conversely, by combining many of these individual gene markers and considering the detection results, exhaustive detection of anticancer drug resistance becomes possible.
  • detection can be performed by combining a known same gene marker to more accurately acquire the resistance of a test cancer cell to an anticancer agent. it can.
  • Examples of the gene markers for acquiring resistance to known anticancer drugs include, for example, ABC transporter genes such as ABCB1 gene, ABCC1 gene and ABCB11 gene; and BCL2 families such as BCL2 gene, MCL1 gene and BCLXL gene.
  • ABC transporter genes such as ABCB1 gene, ABCC1 gene and ABCB11 gene
  • BCL2 families such as BCL2 gene, MCL1 gene and BCLXL gene.
  • Lee's gene; DNA synthesis-related genes such as the DCK1 gene and the TOP1 gene can be exemplified.
  • the genes for the ABC transporter gene and the BCL2 family are as described above.
  • Genes related to DNA synthesis such as DCK1 gene and TOPI gene are the following genes.
  • Cytosine arabinoside (Ara-C) is converted to an active phosphorylated form ( ⁇ - ⁇ -D-arabinofuranosylcytosine 5'-triphosphate) by deoxycytidine kinase (DCK). It exerts a cell killing effect when it is incorporated into DNA. Therefore, it has been reported that reduced DCK enzyme activity induces resistance to Ara-C (Funato, T., Satou'J., Nishiyama, Y "Fujimaki, S., Miura, T., Kaku , M., and Sasaki, T: In vitro leukemia cell models of Ara-C resistance, Leuk. Res., 24, 535-541, 2000. Also in this specification, Ara-C resistant leukemia (K562 / AC) He disclosed that the DCK gene was hemizygous in cells, resulting in reduced DCK ⁇ gene expression and induction of Ara-C resistance.
  • DCK deoxycytidine kinase
  • Topoisomerase (Topo) I and ⁇ II ⁇ allow DNA replication to proceed as expected by doubling single-stranded and double-stranded DNA and separating the DNA strands during replication.
  • Camptothecin (CPT) inhibits Topo I and etoposide (VP-16) inhibits Topo II ⁇ , thereby inhibiting DNA replication. From the findings so far, it has been known that the level of intracellular Topo I and Topo II ⁇ correlates with drug sensitivity.
  • TOP2A gene was lower in the five etoposide-resistant cells than in the parent strain, and the gene copy number on the chromosome was reduced to three copies each.
  • a decrease in the copy number of the TOP1 and TOP2A genes reduces their gene expression, resulting in resistance to camptothecin and etoposide.
  • a decrease in the copy number of the thymidine synthase gene and the dehydropyrimidine dehydrogenase gene induce drug resistance.
  • This detection method can be performed by, for example, the CGH method, flow cytometry method, ELISA method, DNA chip method, and quantitative PCR method, and it is preferable to perform the D'NA chip method or the CGH method. It is particularly preferred to carry out the CGH method.
  • lymphocytes are subjected to flow cytometry using its FITC (Fluorescein isothiocyanate) -labeled CD45 monoclonal antibody.
  • FITC Fluorescein isothiocyanate
  • ABC protein expressed in lymphocytic leukemia cells can be measured using a fluorescent dye-labeled anti-ABC protein antibody such as Cy3. This method is suitable for detecting proteins expressed on the surface of cancer cell membranes.
  • a sandwich ELISA method using ABC protein antibodies is common.
  • one type of anti-ABC protein antibody is immobilized on a plate, a cancer cell extract is added, and the ABC protein bound to the antibody is detected with the other antibody.
  • the other antibody is labeled, Alternatively, the antibody is detected using an alkaline phosphatase-labeled antibody, a peroxidase-labeled antibody, or the like.
  • the method can be applied to any protein expressed in cells by using specific antibodies.
  • the “DNA chip method” is a method for quantifying mRNA expressed in cancer cells.
  • a synthetic oligonucleotide having a part of a gene encoding a group of ABC proteins on a substrate is immobilized (cDNA can also be immobilized).
  • Labeling is carried out when synthesizing cDNA from RNA prepared from cancer cells using reverse transcribase.
  • the expression level of mRNA can be measured by hybridizing the labeled cDNA with the synthetic oligonucleotide on the substrate and scanning the amount of the bound label.
  • the present invention provides a DNA chip that can be used in the DNA chip method, namely, ⁇ ABCA3 gene, ABCB6 gene, ABCB8 gene, ABCB10 gene, ABCC4 gene, ABCC9 gene, ABCD3 gene, ABCD4 gene, ABCE1 gene.
  • the invention also provides a DNA anchoring base on which DNA or synthetic oligonucleotides can be established. (The base material and manufacturing process are the same as those used for the CGH array described later.) Based on the anchoring base).
  • a region containing a specific gene (a gene amplified or deleted by acquiring drug resistance of cancer cells) of a test DNA is amplified by a real-time PCR method, and real-time PCR amplification derived from the test DNA is performed.
  • a region containing a specific gene a gene amplified or deleted by acquiring drug resistance of cancer cells
  • real-time PCR amplification derived from the test DNA is performed.
  • control DNA labeled with different fluorescent dyes and the DNA of a test cancer cell whose detection of drug resistance is to be detected are simultaneously brought into contact on the DNA anchoring substrate and hybridized.
  • This is a method for detecting drug-resistant cancer cells, which quantitatively detects amplification or deletion of a specific region of a test DNA using the fluorescent color obtained by soybean as an indicator.
  • Human DNA to be fixed on the DNA anchoring substrate (the present invention also provides the DNA anchoring substrate) used in these DNA detection methods can be selected according to the detection method to be selected. That is, when the DNA chip method is used as an embodiment of the present detection method, cDNA or a synthetic oligonucleotide may be used. When the CGH method is used, genomic DNA can be used.
  • DNA can be collected and prepared by a conventional method, and in particular, commercially available control DNA can be used.
  • the CGH method is performed using BAC (Bacterial Artificial Chromosome) DNA, YAG (Yeast Artificial Chromosome) DNA, or PAC DNA (Phage Artificial Chromosome) DNA having a specific genomic DNA region.
  • BAC Bacterial Artificial Chromosome
  • YAG Yeast Artificial Chromosome
  • PAC DNA Portion Artificial Chromosome
  • BAC DNA YAC DNA
  • PAC DNA PAC DNA
  • BACDNA or the like that can be used in the present invention may be selected from a gene library obtained by incorporating a genome to be used, or may be selected from a commercially available gene library by a conventional method.
  • the BAC DNA or PAC DNA to be selected for each purpose will be described later.
  • the host into which the selected clone has been integrated can be cultured to purify BACDNA or the like.
  • BACDNA or the like usually obtained in this manner is small in order to produce a large number of genomic DNA anchoring bases and put them to practical use, so it is necessary to obtain the DNA as a gene amplification product. Also called “infinite use”).
  • BACDNA and the like are first digested with a 4-base recognition enzyme, for example, Rsal, Dpnl, Haelll, etc., and then an adapter is added to perform ligation.
  • the adapter 1 is an oligonucleotide consisting of 10 to 30 bases, preferably 15 to 25 bases, and the two strands have a complementary sequence.
  • the 3′-end of the side forming the blunt end The oligonucleotide needs to be phosphorylated.
  • a primer having the same sequence portion as one of the oligonucleotides of the adapter using a primer having the same sequence portion as one of the oligonucleotides of the adapter,
  • Amplified by the PCR (Polymerase Chain Reaction) method and can be inexhaustible.
  • an aminated oligonucleotide having 50 to 70 bases characteristic of each BAC DNA or the like can be used as a detection probe.
  • Base By fixing the inexhaustible BAC DNA and the like (genomic DNA, cDNA, and synthetic oligonucleotides in other aspects as well) on a substrate, preferably on a solid substrate, the desired DNA fixation is achieved.
  • Base can be manufactured.
  • the solid substrate examples include glass, plastic, membrane, and three-dimensional arrays, and a glass substrate such as slide glass is preferable.
  • a glass substrate such as slide glass
  • the DNA concentration spots on a substrate is preferably lOpg / ⁇ 5 ⁇ ⁇ / ⁇ 1, more preferably lng / ⁇ to 200 ng / ⁇ .
  • the amount to be spotted is preferably from lnl to 1 ⁇ l, more preferably from 10 nl to 100 nl.
  • the size and shape of each spot fixed to the base are not particularly limited. For example, the size may be 0.01 to lram in diameter, and the shape as viewed from above may be circular to elliptical.
  • the thickness of the dried spot is not particularly limited, but is 1 to 100 ⁇ . Further, the number of spots is not particularly limited, but is preferably 10 to 50,000, more preferably 100 to 5,000 per substrate used.
  • the preparation of dried spots is carried out, for example, by placing BAC DNA or the like inexhaustible using a spotter (the same applies to genomic DNA, cDNA and synthetic oligonucleotides in other aspects) on a substrate, After forming the spot, it can be manufactured by drying the spot.
  • a spotter the same applies to genomic DNA, cDNA and synthetic oligonucleotides in other aspects
  • Ink jet printers, pin array printers, and bubble jet printers can be used as spotters, but it is preferable to use an ink jet printer.
  • a high throughput ink jet dispensing system SQ series of Cartesian Technologies (USA) can be used.
  • Base By fixing the inexhaustible BAC DNA and the like (genomic DNA, cDNA, and synthetic oligonucleotides in other aspects as well) on a substrate, preferably on a solid substrate, the desired DNA fixation is achieved.
  • Base can be manufactured.
  • fragments such as genomic DNA in a specific region are preferably fixed comprehensively to the fixation base, and control genomic DNA or the like (labeled with normal cells or normal tissue) labeled with different fluorescent dyes, respectively.
  • Genomic DNA) and test genomic DNA are simultaneously contacted and fluorescent color is obtained. This is a detection method for quantitatively detecting amplification or deletion of a specific region such as a test genomic DNA, using as an index.
  • a commercially available product such as human genomic DNA can be used, and can also be extracted from plasma collected from a healthy person by an ordinary method. It is also possible to follow a normal method from a normal tissue of a cancer patient.
  • Control genomic DNA, etc. (genomic DNA of normal cells or normal tissues, etc.) and test genomic DNA, etc. (genomic DNA of cancer cells, cancer tissues, etc., for which detection of drug resistance is detected) are different from each other Fluorescent dyes, such as Cy3 and Cy5, can be labeled by a conventional method (for example, a nick translation method using dCTP). Labeled kits that perform the nick translation method using dCT are sold by PanVera (Japanese agent: Takara Shuzo Co., Ltd.), Invitrogen (CA, USA), and others.
  • the labeled DNA is hybridized with the DNA printed on the CGH array, it is more preferable to add Cot_lDNA, formamide, Dextran Sulfate, SSC (150 mM NaCl / 15 mM Sodium Citrate), yeast t-RNA, and SDS (Sodium Deoxysulfate). Further, it is preferable that the solution containing the labeled DNA is denatured by heat and added.
  • a container to be hybridized it is possible to put on a platform with a mouth-locking function, and it is more preferable to use a container that can be evenly contacted on the fixing base using a small amount of a solution, for example, a hybridman.
  • the temperature of the hybridization is preferably from 30 to 70 ° C, more preferably from 38 to 45 ° C.
  • the hybridization time is preferably from 12 to 200 hours, more preferably from 40 to 80 hours.
  • Washing of the fixing substrate can be performed at room temperature using formamide, SSC solution, or the like. Washing of this fixation base is an important step to eliminate non-specific signals as much as possible.After washing at room temperature, it is washed at 40 to 60 ° C with the same washing solution, and SSC- Wash at 50 ° C in a solution containing SDS, leave in a solution containing phosphate buffer / NP-40, and finally shake in a solution containing SSC. More preferred.
  • a scanner can be used in order to grasp the content of the generation of fluorescence in the hybridized fixed fixing substrate.
  • a scanner for example, GenePix 4000B (Amersham Biosciences KK, Tokyo) and the like can be mentioned.
  • the control genomic DNA is labeled with Cy5 and the genomic DNA derived from the test cancer cell is labeled with Cy3, the average of the fluorescence intensity of Cy3 and the average of the fluorescence intensity of Cy5 on the fixation base are the same. It is preferable to capture the water. Further, it is preferable that the ratio of Cy3 / Cy5 be determined on each BAC DNA (each pixel) and displayed by the value of Log 2 Ratio.
  • FIG. 1 is a photograph showing the results of gene amplification and deletion analysis by fluorescence in situ hybridization using metaphase chromosomes of the following cell lines.
  • A Human colon cancer cell line HT-29
  • B Etoposide-resistant human colon cancer cell line HT-29 / ETP
  • C Human ovarian cancer cell line SKOV3,
  • D Etoposide-resistant human ovarian cancer Cells SKOV3 / VP strain
  • E human leukemia K562 strain
  • F cytosine arabinoside resistant human leukemia K562 / AC strain
  • G human colon cancer cell HT-29 strain
  • H camptothecin resistant Human colon cancer cell line HT-29 / CPT
  • SKOV3 / VP cells green fluorescence derived from the BCL2L2 gene was detected in six places, and red fluorescence derived from the HNF3A gene was detected in four places (D).
  • K562 cells one green fluorescence derived from the DCKII gene was detected (E).
  • K562 / AC cells one place of green fluorescence derived from DCK ⁇ gene was detected (F).
  • Five green fluorescences derived from TOP 1 were detected in HT-29 cells (G).
  • HT-29 / CPT cells two green fluorescences derived from TOP I were detected (H).
  • ABCA3 gene (ABC family gene) RP 11-304L19
  • ABCC 1 gene (ABC family gene) RP11-516F7
  • BCL2L2 gene (BCL2 family gene) RP 11-124D2
  • DCK gene (doxycytidine kinase gene) RP 11-499N1
  • TOP 1 gene topoisomerase gene
  • the map of the amplicon (region showing gene amplification) on the chromosome of HT-29 / ETP cells is located at 16p12-p13, where the ABCA3 gene and the ABCC1 (MRP1) gene are adjacent (1).
  • the amplicon on the SKOV3 / VP cell chromosome is at 14qll-q21 and contains the BCL2L gene and HNF3A gene (J).
  • Fluorescence in situ hybridization (FISH: Fluorescence in situ hybridization) Pama Yasui, K., Imoto, I., Fukuda, ⁇ ., Pimkaliaokham, A., Yang, ZQ, Naruto, T., Shimada, Y., Nakamura, Y., and Inazawa ' ⁇ Identification of target genes within an amplicon at 14ql2-ql3 in esophageal squamous cell carcinoma. Genes Chromosomes Cancer, 32, 112-118, 2001.
  • FISH FISH was performed using BAC and PAC (labeled their numbers) as labeled probes, and etoposide resistant colon cancer (HT-29 / ETP) cells and etoposide resistant ovarian cancer (SKOV3 / VP)
  • the detection site on the chromosome of the cell is indicated by ⁇ in the figure.
  • the results were used to determine the localization site on the chromosome, the STS (sequence-tagged ite) present in the region, the names of the BAC and PAC clones covering the region, and the HT-29 using these BACs and PACs as probes.
  • the amplification of this chromosome region in / ETP cells was represented by the average number of copies.
  • FIG. 2 is a drawing showing overexpression of ABCA3 gene, ABCC1 (MPR1) gene, BCL2L2 gene and ABCC9 gene in a drug-resistant cell line.
  • Two poly (A) RNAs were prepared from these two types of cells, Northern blot was performed by a conventional method, and the expression levels of the two types of genes were measured.
  • IMAGE clones 179576 and 2205297 (Incyte Genomics, Palo Alto, CA) were used as probes for detecting the ABCA3 gene and ABCC1 (MRP1) gene, respectively.
  • GAPDH Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
  • 2 g of poly (A) RNA was prepared from these two types of cells, and Northern blotting was performed using a conventional method to measure the expression level of the BCL2L2 gene.
  • Two types of primers are used to detect BCL2L2 gene
  • the GAPDH gene probe was used as a standard to correct for errors between samples.
  • ABCC9 gene mRNA was quantified using amplification at 13q34 in hepatocellular carcinomas, Hepatology, 35, 1476-1484, 2002). To normalize the difference between samples, the ratio of the expression levels of ABCC9 gene and control gene (GAPDH) was determined, and the ratio in SK3 cells (ABCC9 expression level / GAPDH expression level) was set to 1, and ABCC9 gene in each cell was determined. The relative ratio of the expression levels is shown.
  • FIG. 3 is a diagram showing the expression of the BCL2 family gene in a drug-resistant cell line as compared to the parent line.
  • the ratio of the expression level of the control gene (GAPDH) to the target gene was determined. Assuming that the ratio of the parent strain of each drug-resistant cell is 1, the ratio of the expression level in each drug-resistant cell is shown. gene The expression level was measured by real-time reverse transcription PCR.
  • the left column shows the name of drug-resistant cancer cells
  • the upper column of each bar graph shows the name of the gene examined
  • the lower column shows the expression level of the gene shown in the upper column as compared with the parent strain.
  • FIG. 4 is a drawing showing the relationship between caspase activity, BCL2 family gene expression and etoposide resistance.
  • SKOV3 cells and SKOV3 / VP cells 100 ⁇ ⁇ / ⁇ 1 of VP'16, VP- 16 and caspase inhibitor
  • the cells were cultured for 24 hours in the presence of Z-VAD-FME or medium (control) alone.
  • the cells are lysed using a lysis buffer, centrifuged at 4 ° C for 15,000 x 20 minutes, and the supernatant (containing 100 ⁇ l protein) together with a substrate for measuring caspase activity (Ac-DEVD-pNA) is used. After incubation at 4 ° C for 4 hours, the activity was determined by measuring the absorbance at 405 nm.
  • (B) shows the expression level of BGL2L2 mRNA in SKOV3 / VP cells treated with the BCL2L2 antisense oligonucleotide.
  • SKOV3 / VP cells were untreated, treated with a transfection reagent oligolipectamine, and BCL2L2 antisense oligonucleotides having a phosphorothioate skeleton (sequences from positions 2374 to 2394 of BCL2L2 cDNA:
  • RNA was extracted, and the amount of BCL2L2 mRNA was measured by real-time reverse transcription PCR.
  • BCL2L2 antisense oligonucleotides having a phosphorothioate backbone are treated with oligofuctamine to obtain control oligonucleotides having a phosphorothioate backbone with a transfection and scramble sequence. Transfection by ctamine treatment and under untreated conditions
  • the SKOV3 / VP3 cells were treated, and after 24 hours, the cells were cultured for 48 hours in the presence of VP-16 at each concentration shown in the figure.
  • the viability of SKOV3 / VP3 cells was measured 72 hours after transfection using the Cell-Counting Kit-8 (Dojindo Laboratories, Kumamoto) according to the tetrazolium attus method. The viability was expressed in%, and the% was determined by dividing the absorbance measured under the above treatment conditions by the absorbance measured under the conditions of no and no treatment with VP-16. Each value is the average of 5 experiments, and the value is shown as the average soil SD on each plot.
  • Example 1 Changes in specific genomic DNA region specifically observed in drug-resistant cancer cells
  • the Subtractive CGH method compares and subtracts the copy number of the genome of the parent strain from the genome of the drug-resistant cell derived therefrom. This is a method to quantitatively calculate the degree of gene amplification and deletion.
  • Table 1 shows the changes in gene amplification and deletion found in 23 types of drug-resistant cancer cells compared to the parent strain using this method.
  • CPT Camptothecin
  • CDDP Cisplatin
  • ADM Adriamycin
  • VP-16 Etoposide
  • Ara-C Cytosinarabinoside
  • HT-29 colon cancer cells
  • A549 lung cancer cells
  • SK3 lung cancer cells
  • St-4 gastric cancer cells
  • A2780 Ovarian cancer cells
  • SKOV3 Ovarian cancer cells
  • KK47 Bladder cancer cells
  • T24 Bladder cancer cells
  • chromosome 2q23-q34 region of camptothecin-resistant lung cancer A549 / CPT
  • chromosome 4p of cisplatin-resistant bladder cancer T24 / DDP10
  • etoposide-resistant lung cancer SK3 / VP 16
  • Chromosome 7q21-q22 region and chromosome 15q21-q24 region of cytosine arabinoside resistant leukemia K562 / AC
  • the copy number of both genes was 3 copies, which was lower (Fig. 1A and B). This result indicates that the parent strain is more sensitive to etoposide than the resistant strain.
  • the minimum chromosomal region of the chromosome where the ABCA3 gene amplified in etoposide-resistant colon cancer (HT-29 / ETP) cells is located contains BAC clone number RP11-334D3 marker D16S525): It was identified during RP11-95P2 (including the marker SHGC-11838) (FIG. 11).
  • the number of copies of ABCB1 gene localized on chromosome 7q21 determined by FISH was 11 copies in etoposide-resistant lung cancer (SK3 / VP16) cells, which was significantly higher than that of 3 copies in parental cells. .
  • the number of copies of the ABCC9 gene located at chromosome 12p l2.1 determined by FISH was 5 copies for etoposide-resistant lung cancer (SK3 / VP16) cells and etoposide-resistant ovarian cancer (SKOV3 / VP) cells. It is significantly higher than 2 copies. Next, it was considered that amplification of these genes would induce high expression of the mRNA.
  • the expression was increased 10.6-fold and the ABCC1 gene expression was increased 2.6-fold (Fig. 2A).
  • the results show that both genes are located in the chromosome 16pl2-13 region, but the ABCA3 gene is a more important gene that confers etoposide resistance than the ABCC1 gene.
  • ABCB1 gene expression was 3.3 times higher in etoposide-resistant lung cancer (SK3 / VP16) cells than in parental cells (SK3).
  • ABCC9 gene expression was 13.3 times higher in SK3 / VP16 cells than in parental cells. On the other hand, it showed only 1.6-fold expression in etoposide-resistant ovarian cancer (SKOV3 / VP) cells compared to its parent cell (SKOV3) (Fig. 2C). Therefore, it is suggested that the ABC transporter gene involved in drug resistance differs depending on the cell type. In order to analyze drug resistance, it is necessary to comprehensively analyze a wide range of ABC transporter gene groups. [Example 3] _____________________________________ both amplification of the gene which codes anti-apoptosis protein belonging to BCL2
  • BCL2 gene BCL2LKBCLXL gene
  • BCL2L2 (BCLW) gene BCL2A1 gene
  • MCL1 ⁇ gene and BCL2L10 gene belong to the BCL2 family and are regulatory proteins that have anti-apoptotic action.
  • the 14qll-q21 region was amplified, and the copy number of the BCL1L2 gene located in chromosome 14qll.2-ql2 determined by FISH was 6 copies (Fig. 1, C and D).
  • the HNF3A gene a Hepatocyte nuclear factor 3 family gene, is mapped to chromosome 14ql2, and is found on the chromosome 14ql2-ql3 of Esophageal squamous cell carcinomas, which is ik ife, as an amplicon that induces the width of this region. It has been done. In the etoposide-resistant ovarian cancer cells, the number of copies of the HNF3A gene determined by FISH was 4 copies (Fig. 1D). The BCL2L2 gene is located in a region highly likely as an amplicon in the chromosome 14qll-q21 region in the etoposide-resistant cell line SKOV3 / VP cells.
  • an amplicon containing the BCL2L2 gene exists between markers D14S879 (BAC clone RP11-146E13) and SHGO10164 (BAC clone RP11-144C18) (Fig. 1J).
  • the expression of the BCL2L2 gene was examined by the Northern blot method, the gene expression of SKOV3 / VP cells was 3.3 times higher than that of the parent strain (Fig. 2B).
  • the expression of the six BCL2 family genes was compared between the two drug-resistant cells (Fig. 3). BCL2 gene expression was more than twice as high as that of the parent strain in four drug-resistant cells.
  • BCL2L1 (BCLXL) gene expression is in one drug-resistant cancer cell
  • BCL2L2 gene expression is in three drug-resistant cancer cells
  • MCL1 gene expression is BCL2A1 gene in one drug-resistant cancer cell Expression is in one type of drug-resistant cancer cells
  • BCL2L10 gene expression is more than twice as high in each of five types of drug-resistant cancer cells as compared to the parent strain Expression was shown ( Figure 2B and Figure 3).
  • the MCL1 gene was expressed in camptothecin-resistant colon cancer HT-29 / CPT cells, and the BCL2L10 gene was expressed in cytosine arabinoside-resistant leukemia K562 / AC cells', with high expression in proportion to their gene amplification (Table 2 and ( Figure 3). Therefore, it was found that high expression of the BCL2 family gene induces anticancer drug resistance, and analysis of the gene amplification was found to be important in examining drug resistance performance.
  • the effect of VP-16 was examined under conditions in which cells were treated with an antisense oligonucleotide of BCL2L2 and BCL2L2 gene expression was suppressed.
  • the addition of the transfection reagent (Oligofectamine) alone and the BCL2L2 sense oligonucleotide (the control oligonucleotide of the scrambled sequence) had no effect, but the addition of the BCL2L2 antisense oligonucleotide reduced the expression of the BCL2L2 gene (Fig. 4).
  • the sensitivity of SKOV3 / VP cells to etoposide (VP-16) was increased (Fig. 4C). Therefore, it can be said that amplification of the BCL2 family gene reduces caspase activity and induces anticancer drug resistance.
  • Cytosine arabinoside-resistant leukemia K562 / AC cells lack the chromosome 4q region where the deoxycytidine kinase (DGK) gene is located, and camptothecin-resistant colon cancer HT-29 / CPT cells have topoisomerase 1 (TOP1) Lacks chromosome 20q that is localized.
  • TOP1 topoisomerase 1
  • the region of chromosome 17q21-22 where TOP2A is localized is not amplified or deleted in five types of etoposide (VP-16) resistant cells (Table 1). Cytosine arabinoside
  • the DNA copy number indicates the copy number of the resistant strain (the copy number of the parent strain).
  • DCK Deoxycytidine kinase gene
  • TOP1 Topoisomerase 1 gene
  • TOP 2 A Topoisomerase 2A gene
  • cytosine arabinoside resistant leukemia (K562 / AC) cells had one copy of DCK gene determined by FISH method. This indicates one pair of deletions in the two pairs of genes in Ara-C resistant cells ( Figures 1E and F).
  • DCK gene expression was clearly detected in human leukemia K562 cells, but not in cytosine-arabinoside-resistant leukemia K562 / AC cells.
  • Colon cancer HT-29 cells have 5 copies of the TOP1 gene, but camptothecin-resistant colon cancer HT-29 / CPT cells have 2 copies, which is markedly reduced (Figs. 1G and H).
  • TOPI TOPI-resistant gastric cancer
  • St-4 / CPT camptothecin-resistant gastric cancer
  • all three camptothecin-resistant cell lines had less than 3 copies.
  • TOP2A gene copy number is reduced in camptothecin-resistant colorectal cancer HT-29 / ETP cells and etoposide-resistant leukemia (K562 / etop20 and K562 / etop80) cells compared to their parental strains, and TOP2A gene expression is 5 types It decreased in all etoposide-resistant cell lines.
  • ABCA3 gene, ABCB1 gene, ABCB6 gene, ABCB8 gene, ABCB10 gene, ABCB11 gene, ABCC1 gene, ABCC4 gene, ABCC9 gene, ABCD3 gene, ABCD4 gene, ABCE1 belonging to ABC transporter family Gene and ABCF2 gene are BAC clone, RP11-304L19, RP11-212B1, RP11-803J6, RP11-606P1, RP4-613A2, RP11-704B8, RP11-516F7, RP11-124D15, RP11-729I10, RP11-272P3, Contained in RP5-919J22, RP11-543H9 and RP4-548D19.
  • the BCL2L2 gene, MCL1 gene and BCL2L10 gene belonging to the BCL2 family are included in the BAC clones RP11-124D2, RP11-243G22 and RP11-337B11, respectively.
  • ligation was performed by adding an adapter.
  • PCR was performed using the sequence of the adapter as a primer, and gene amplification was performed (this amplification step is called exhaustion).
  • Five types of BAC DNA other than the above (RP11-98A20, EP11-252011, RP11'357G3, RP11-196F4 and RP11-736A8) were prepared as control DNA.
  • the inexhaustible DNA was spotted onto triplicate slide glass for aminated oligonucleotide immobilized arrays using an ink jet printer to create a DNA anchoring base.
  • DNA derived from tissues of healthy subjects is labeled with Cy5
  • DNA derived from cancer tissues extracted from cancer patients is labeled with Cy3.
  • the mixture is hybridized on a DNA anchoring substrate, the array is scanned, and the Cy3 / Cy5 intensity ratio is determined after standardizing the Cy3 and Cy5 signals. If the ratio is 2, the region of the genome containing the gene printed on the DNA anchorage base is amplified twice in cancer tissue, and if the ratio is 4, the region is amplified four-fold.
  • Human ABC transporter genes, BCL2 family genes or genes related to DNA synthesis are closely related to anticancer drug resistance. Therefore, according to the present invention, it is possible to determine the resistance of a cancer cell to an anticancer agent by examining the amplification and deletion of these gene regions on the chromosome of the cancer cell. As a result, it is possible to easily diagnose whether cells in the affected area of a cancer patient are resistant to anticancer drugs. This enables appropriate chemotherapy, or order-made medical care, for individual patients, avoids extremely low-response chemotherapy based on the acquisition of anticancer drug resistance, and has unnecessary use of the patient's Quality of Life. The drop can be prevented.

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Abstract

本発明の目的は、薬剤耐性癌細胞を検出可能な新たな遺伝子マーカーを見いだし、かつ、当該マーカーを用いた薬剤耐性癌細胞の効率的かつ網羅的な検出手段を提供することである。本発明では、特に副作用が重篤で、癌患者に投与する頻度が高い制癌剤として、カンプトテシン類、シスプラチン類、エトポシド類、アドリアマイシン（ADM）およびシトシンアラビノシド類の薬剤耐性癌細胞株と親癌細胞株における遺伝子増幅または欠失を解析することにより、癌細胞の薬剤耐性獲得に関連する新たな遺伝子マーカーとして、ABCA3遺伝子、ABCB6遺伝子、ABCB8遺伝子、ABCB１０遺伝子、ABCC４遺伝子、ABCC９遺伝子、ABCD３遺伝子、ABCD４遺伝子、ABCE１遺伝子、ABCF２遺伝子、BCL2L2、BCL2L10、BCL2L1、および、BCL2A1からなる群のABCトランスポーター系遺伝子またはBCL2ファミリー遺伝子から選ばれる１種以上の遺伝子の増幅を検出することにより、当該被験癌細胞における制癌剤に対する薬剤耐性の獲得を検出し得ることを見いだした。

Description

明細書 薬剤耐性を獲得した癌細胞の検出方法 技術分野
本発明は、 染色体の欠失或いは増幅を伴う、 制癌剤に対する薬剤耐性を獲得した癌 細胞の検出方法に関する発明である。 背景技術
これまで、 数多くの制癌剤が癌を治療するために使用されているが、 重篤な副作用 の発生、 並びに反復投与により薬剤の効果の消失ゃ不応答性等が重要な問題となって いる。 それは多くの場合、 制癌剤耐性獲得細胞の出現に由来する。 薬剤耐性は癌細胞 での遺伝子の変化に起因する。 その遺伝子産物は、 薬剤の細胞内への輸送を低下させ る或いは薬剤の細胞内から外への排出を促進させる、 薬剤の不活性化、 薬剤の解毒を 促進させる、 プロ ドラック （前駆体） から活性型への転換を抑制する、 薬剤の標的蛋 白質量の低下或いは活性の低下を誘導する、 DNA修復の活性を増大させる、 アポトー シスの誘導を抑制する こ と等がその理由 と して上げられる （ Harrison,D.J. ： Molecular mechanism of drug resistance in tumours. J. Pathol-, 17o, 7" 12, 199aソ。 癌細胞で上記耐性付与が複数同時に起こる場合もある。
薬剤耐性癌細胞では Multidrug resistant protein (多剤耐性蛋白質： MDR及び MRP) と命名された細胞膜に局在する トランスポーターによる細胞からの薬剤の汲み出しが 重要な役割を果たしている。 例えば、 ABCBl(MDRl)或いは ABCCl(MRP l)遺伝子の 増幅とその結果起こる過剰発現はかなりの数の薬剤耐性細胞に められる （Kuwano, Μ·, Uchiumi, Τ.' Hayakawa,H., Οηο'Μ.' Wada'M., Izumi'H. and Kohno,K. ： The basic and clinical implications of ABC transporters, Y-box-binding protein- 1 (YB- l) and angiogenesis-related factors in human malignancies. Cancer Sci., 94, 9- 14, 2003)。 MDRをコードする遺伝子群の過剰発現を DNAチップで検出する方法、 並びに、 その蛋白質群をそれぞれ特異的な抗体を用いて検出する方法等が薬剤耐性癌 細胞の検出法として用いられている。 MDRは、 ATP Binding Cassette (ABC) を有 する蛋白質 （ABC蛋白質という） に属し、 分子量 300-2,000程度の両親媒性化合物を ATP加水分解のエネルギーを利用して細胞内から細胞外に排出する。 —方、 Comparative genomic hybridization (CGH)を用いてプライマリー癌細胞と 癌細胞株を解析すると、 薬剤耐性と関連するクロモソ一ムの特定領域の変化が見出さ れる。 (Wasenius'V.M.' Jekunen,A., Μοηηί,Ο., Joensuu,H., Aebi'S., Howell,S.B. and Knuutila.S. ： Comparative genomic hybridization analysis of chromosomal changes occurring during development of acquired resistance to cisplatin in human ovarian carcinoma cells. Genes Chromosomes Cancer, 18., 286-291, 1997; Rao,P.H., Houldsworth,J., Palanisamy'N., Murty,V.V.; Reuter,V.E., Motzer,R.J., Bosl,G.J. and Chaganti, R.S. '■ Chromosomal amplification is associated with, cisplatin resistance of human male germ cell tumors. Cancer Res., 58, 4260-4263, 1998； Rooney,P.H.; Stevenson,D.A., Marsh'S" Johnston,P.G., Haites,N.E., Cassidy,J. and McLeod,H.L. ： Comparative genomic hybridization analysis of chromosomal alteration induced by the development of resistance to thymidylate syntase inhibitors. Cancer Ees., 58., 5042-5045, 1998; Leyland- Jones, B., Kelland,L.R., Harrap,K.R. and Hiorns, L.R. : Genomic imbalances associated with acquired resistance to platinum analogues. Am. J. Pathol., 155, 77-84, 1999; Struski,S., Doco'Fenzy,M., Trussardi,A., Masson'L., Gruson,N., Ulrich,E., Proult,M., Jardillier,J.C, Potron,G. and Cornillet-Lefebvre,P. ： Identification of chromosomal loci associated with non-P-glycoprotein-mediated multidrug resistance to topoisomerase II inhibitor in lung adenocarcinoma cell line by comparative genomic hybridization. Genes Chromosomes Cancer, 30， 136- 142, 2001)。
薬剤耐性癌細胞に特徴的なゲノムの增幅並びに欠失は制癌剤耐性に寄与している可 能性が高いと考えられるので、 この領域を同定することは極めて重要である。 しかし ながら、 癌細胞の薬剤応答性は多様であり、 現在までに見いだされている知見では、 薬剤耐性細胞を検出するには十分ではなく、 新たなマーカーを見いだすことが必要で あることは疑いがない。 また、 薬剤耐性癌細胞の解析を系統的に行い、 癌細胞の薬剤 耐性能を効率的かつ網羅的に検查できる方法もまた、 未だ確立されていない。
よって、 本発明が解決すべき課題は、 薬剤耐性癌細胞を検出可能な新たな遺伝子マ 一力一を見いだし、 かつ、 当該マーカーを用いた薬剤耐性癌細胞の効率的かつ網羅的 な検出手段を提供することにある。 発明の開示
本発明者は、 特に副作用が重篤で、 癌患者に投与する頻度が高い制癌剤として、 力 ンプトテシン （CPT) 類、 シスブラチン （CDDP) 類、 エトポシド （VP-16) 類、 了 ドリアマイシン （ADM) およびシトシンァラビノシド （Ara-C) 類の薬剤耐性癌細胞 株と親癌細胞株にお:ける遺伝子増幅または欠失を解析することにより、 癌細胞の薬剤 耐性獲得に関連する新たな遗伝子マーカーを見いだし、 本発明を完成した。
すなわち、本発明は、被験癌細胞における、 AB C A 3 遺伝子、 AB C B 6遺伝子、 AB C B 8 遣伝子、 ABCB 1 0遺伝子、 ABCC 4遺伝子、 ABCC 9遺伝子、 ABCD 3遣伝子、 ABCD 4遺伝子、 ABCE 1遺伝子、 ABCF 2遣伝子、 BCL2L2, BCL2L10, BCL2L1、 および、 BCL2A1からなる群の ABC トランスポーター系遺伝子または BCL2ファミ リー遺伝 子から選ばれる 1種以上の遺伝子の増幅を検出することにより、 当該被験癌細胞にお ける制癌剤に対する薬剤耐性の獲得を検出する検出方法（以下、本検出方法ともいう） を提供する発明である。
( 1 ) 本検出方法
上記に列挙した制癌剤のうち、 「カンプトテシン類」 としては、 カンプトテシンの他 に、 カンプトテシン誘導体として、 第一製薬が開発した DX-8951、 イタリア ' メナリ 一-社が開発した Τ·0128、 イギリス 'スミスクライン ' ビーチャム社が開発した塩酸 ノギテカンが挙げられる。 「シスブラチン類」 は、 白金製剤 （プラチナを含有する） と もいい、 シスプラチン、 ビンブラスチン、 カルポプラチンが挙げられる。 「エトポシド 類」 として、ェトポシドの他に、ェトポシド誘導体として、 日本化薬が開発した NK611 (エトポシド誘導体錠） が挙げられる。 「シトシンァラビノシド類」 として、 シトシン ァラビノシドの他に、 シトシンァラビノシド誘導体として、 そのフッ素化誘導体であ るゲムシタビンが挙げられる。
本検出方法において、 制癌剤に対する耐性獲得のマーカーとして定義される上記に 列挙した遺伝子の中で、 ABCA3 遺伝子、 ABCB6遗伝子、 ABCB8遺伝子、 ABCB 1 0遺伝子、 ABCC 4遣伝子、 ABCC 9遺伝子、 ABCD 3遺伝子、 ABCD 4遺伝子、 ABCE 1遺伝子および ABCF 2遺伝子は、 いずれも ATP Binding Cassette (ABC) トラン スポ一ター系蛋白質をコードする遺伝子である。
ABC トランスポーターファミ リ一に属する蛋白質は、イオンから高分子蛋白質に至 るまで非常に広範囲の物質のトランスポートに関与している。 ABCB 1 (MDR1) 遺伝 子と ABCC 1 (MRP1) 造伝子は細胞内からの薬剤の流出を増大させることにより多 数の薬剤に対する耐性を誘導する こ とが知 られている （ Ling, V. : Multidrug resistance: molecular mechanisms ana clinical relevance, Cancer Chemother. Pharmacol., ， S3-S8, 1997)。 また、 ABCll遺伝子はカンプトテシン耐性白血病株 で増幅しており、 その過剰発現はタキソール耐性を誘導することが知られている ( Childs,S., Yeh,R.L., Hui,D. and Ling, .： Taxol resistance mediated by transfection of the liver-specific sister gene of P-glycoprotein. Cancer Res., 58. 4160-4167, 1998)。
本発明は、 上記 3種類の遺伝子に加えて、 新たに上記の 10種類の ABC トランスポ 一ター遺伝子群 （ABCA3 遺伝子、 ABCB6遺伝子、 ABCB8遺伝子、 ABCB 1 0遺伝 子、 ABCC 4遺伝子、 ABCC 9遗伝子、 ABCD 3遺伝子、 ABCD 4遺伝子、 ABCE 1遣 伝子および ABCF 2遺伝子） が薬剤耐性に関与することを明らかにした。 例えば、 ェ トポシド耐性ヒ ト大腸癌 （HT-29/ETP) 細胞で増幅しているクロモソーム 16p l2-p l3 の領域では ABCC1遣伝子よりもむしろ ABCA3遺伝子が増幅しかつ過剰発現してお り、従って、 ABCA3遺伝子が ABCC1遺伝子より もアンプリ コン （遺伝子増幅を示す 領域） として可能性が高いことが判明した。 ABCC9遺伝子は ATP-感受性 K+チヤネ ルの構成要素をコー ドする遣伝子である （Seino, S. ATP-sensitive potassium channels: a model of heteromultimeric potassium channel/receptor assemblies, Annu. Rev. Physiol., 61, 337-362, 1999)。 ABCC9遺伝子はェトポシド耐性を示す肺 癌 （ SK3/VP 16) 細胞と卵巣癌 （ SKOV3/VP) 細胞で増幅していることが判明した。 前者の細胞では ABCC9遺伝子の発現上昇が確認された。 その他、 後述するように、 ABC A3 遺伝子の増幅がエ トポシド類に対する薬剤耐性獲得の指標であり、 ABCB6 遺伝子の増幅がカンプトテシン類に対する薬剤耐性獲得の指標であり、 ABCB8 遺伝 子の増幅がシスブラチン類に対する薬剤耐性獲得の指標であり、 ABCB 1 0遺伝子の 増幅が力ンプトテシン類に対する薬剤耐性獲得の指標であり、 ABCC 4遺伝子の増幅 がシスブラチン類に対する薬剤耐性獲得の指標であり、 ABCD 4遺伝子の増幅がアド リ アマイシンに対する薬剤耐性獲得の指標であり、 ABCE 1遗伝子の増幅がカンプト テシン類に対する薬剤耐性獲得の指標であり、 ABCF 2遺伝子の増幅がシスブラチン 類に対する薬剤耐性獲得の指標であることが明らかとなった。
また、 本検出方法において、 制癌剤に対する耐性獲得のマーカーとして定義される 上記に列挙した他の遗伝子である、 BCL2 フアミ リー造伝子は、 制癌剤によるアポト 一シス死を抑制する働きをする遺伝子である。 本作用を利用して癌細胞に多剤耐性を 付与することから、 BCL2 は、 多剤耐性蛋白質と推定される。 抗アポトーシスの作用 を有する、 特定の BCL2ファミ リ一の遺伝子 （BCL2遺伝子、 BCLXL遺伝子、 MCL1 遺伝子） は、 その過剰発現により、 癌細胞に対して臨床的に使用される薬剤に耐性を 誘導すること力 S半 IJ明している (Reed J.C. Dysregulation of apoptosis in cancer. J. Clin. Oncol" Γ7, 2941-2953, 1999)。
本発明では、 上記の他の BCL2 フアミ リーの遺伝子 （BCL2L2 遺伝子、 BCL2L10 遺伝子、 BCL2L1遺伝子および BCL2A1遺伝子） もまた、 薬剤耐性獲得の指標として 用いることが可能であることを見いだした。 すなわち、 BCL2L2遺伝子の増幅が、 力 ントプテシン類、 シスプラチン類、 エ トポキシド類またはシトシンァラビノシド類に 対する薬剤耐性獲得の指標であり、 BCL2L10 遺伝子の増幅が、 カン トプテシン類、 シスブラチン類またはシトシンァラビノシド類に対する薬剤耐性獲得の指標であり、 BCL2L1遺伝子の増幅が、 カン トプテシン類、 シスプラチン類、 エトポキシド類また はシトシンァラビノシド類に対する薬剤耐性獲得の指標であることが明らかとなった (後述する）。
上に列挙した、新規の癌細胞の薬剤耐性獲得のマーカーとして用いることが可能な、 ABC トランスポーター系遣伝子おょぴ BCL2フアミ リー遺伝子は、個々が独立した遺 伝子であり、 かつ、 本来的癌細胞の変異の多様性を鑑み、 さらに本明細書の実施例に おいても、個々のマーカー毎に指標となる癌細胞の薬剤耐性獲得が異なる場合が多い。 よって、 上に列挙した造伝子マーカ つ一つが、 独立した遺伝子マーカーとしての 価値を有するものであるといえる。 また、 逆に、 これらの一つ一つの遣伝子マーカー を多数組み合わせて、 その検出結果を勘案することにより、 網羅的な制癌剤耐性の検 出が可能となる。
また、上記の新規に提供される制癌剤に対する耐性獲得の遺伝子マーカーに加えて、 既知の同遺伝子マーカーを組み合わせて検出を行い、 被験癌細胞の制癌剤に対する耐 性の獲得を、 いっそう的確に行うことができる。
かかる既知の制癌剤に対する耐性獲得の遺伝子マーカーと しては、 例えば、 ABCB1 遺伝子、 ABCC1造伝子、 ABCB11遺伝子等の ABC トランスポーター系造伝子； BCL2 遺伝子、 MCL1遺伝子、 BCLXL遺伝子等の BCL2フア ミ リーの遗伝子； DCK1遺伝 子、 TOP1遺伝子等の D N A合成関連遗伝子を例示することができる。これらのうち、 ABC トランスポーター系遺伝子と BCL2フアミ リーの遣伝子については、上述した通 りである。 DCK1遺伝子、 TOP I遺伝子等の D N A合成関連遺伝子は、 以下のような遺伝子で ある。
シトシンァラビノシド （Ara-C) はデォキシシチジンリン酸化酵素 （DCK) により 活性型リン酸化体 （Ι-β-D-arabinofuranosylcytosine 5'-triphosphate) に変化する。 それが DNAへ取り込まれることにより殺細胞効果を発揮する。 従って、 DCK酵素活 性の低下は Ara-C に対する耐性を誘導するこ とが報告されている （ Funato,T.， Satou'J., Nishiyama, Y" Fujimaki, S., Miura,T., Kaku,M., and Sasaki, T ： In vitro leukemia cell models of Ara-C resistance, Leuk. Res., 24, 535-541, 2000)。 本明細 書においても、 Ara-C耐性白血病 （K562/AC) 細胞では DCK遺伝子が半接合体で、 その結果、 DCK遗伝子発現が減少し、 Ara-C耐性を誘導していることを開示した。
トポイソメラーゼ （Topo) I と Τορο II αは、 1本鎖 DNA並びに 2本鎖 DNAに二 ックを入れ、複製中に DNA鎖を分離させることにより DNA複製を予定通り進行させ る。 カンプトテシン （CPT) は Topo I、 をエトポシド （VP- 16) は Topo II αを阻害す ることにより DNA複製を阻害する。 これまでの知見により、 細胞内 Topo I、 Topo II αのレベルと薬剤感受性が相関することが知られている。 すなわち、 両酵素の濃度が 高いと制癌剤感受性が高く、 その濃度が低いと制癌剤感受性が低いことが知られてい る (Yanase'K., Sugimoto, Y.， Tsukanara, S.， Oh-riara, T.， Andoh,T., and Tsuruo,T.： Identification and characterization of a deletion mutant of DNA topoisomerase I mRNA in a camptothecin-resistant subline of human colon carcinoma, Jap . J. Cancer Res" 91, 551-559, 2000； McLeod, H.L., and Keith, W.N. ： Variation in topoisomerase I gene copy number as a mechanism for intrinsic drug sensitivity" Br. J. Cancer, 74, 508-512, 1996； Withoff,S., Keith,W.N., Knol'A.J" Coutts,J.C, Hoare,S.F., Mulder,N.H., and de Vries,E.G. ： Selection of a subpopulation with fewer DNA topoisomerase II a gene copies in a doxorubicin-resistant cell line panel., Br. J. Cancer, 74, 502-507, 1996; Sugimoto'Y., Tsukahara,S., Oh-hara T.， Isoe, Τ·, and Tsuruo, T ： Decreased expression of DNA topoisomerase I in camptothecin-resistant tumor cell lines as determined by a monoclonal antibody, Cancer Res., 50, 6925-6930, 1990)。 後述するように、 TOP I遺伝子発現のレベルは 3種類のカンプトテシン耐性細胞、 カンプトテシン耐性大腸癌 （HT-29/CPT) 細胞並 ぴにカンプトテシン耐性胃癌 （St-4/CPT) 細胞、 すなわち、 試験した全てのカンプト テシン耐性細胞で低かった。 その理由は、 TOP1 遺伝子コピー数がそれらの親株より 低いためであった。 TOP I遺伝子が局在する染色体 20q の領域の増幅が大腸癌細胞、 胃癌細胞で起こっている こ と が知られている （ Knuutila，S.， Bjorkqvist,A.M., Autio,K., Tarkkanen'M" Wolf, ., Μοηηΐ,Ο., Szymanska, J., Larramendy,M.L., Tapper'J" Pere,H., El-Rifai，W" Hemmer,S., Wasenius,V.M., Vidgren,V., and Zhu,Y. ： DNA copy number amplifications in human neoplasms: review of comparative genomic hybridization studies. Am. J. Pathol., 152, 1107- 1123, 1998) c 実際、 本明細書においても、 TOPI造伝子のコピー数が親株の感受性細胞で有意に多 い、すなわち、 HT-29細胞で 5倍に、 St-4細胞で 6倍に増大していたことを開示した。 また、 カンプトテシン耐性大腸癌 （HT29/CPT) 細胞で、 2対の TOP1遺伝子の 1対 は TOP1欠失体であることを見出した。 その結果、 TOP 1遺伝子発現の低下が直接力 ンプトテシン耐性の原因であることが明らかとなった。
また、 5種類のエトポシド耐性細胞は、 その親株より TOP2A遺伝子発現が低く、 染色体上の遺伝子コピー数は各々 3コピーに減少していた。 従って、 TOP 1 と TOP2A 遺伝子コピー数の減少がそれらの遺伝子発現を減少させ、 力ンプトテシン耐性並びに エトポシド耐性をもたらすと結論付けられる。 さらに、 チミジン合成酵素遺伝子並び にデヒ ドロピリ ミジンデヒ ドロゲナーゼ遺伝子もそれらのコピー数の減少は薬剤耐性 を誘起することが容易に考えられる。
本検出方法は、 例えば、 C G H法、 フローサイ トメ トリー法、 ELISA法、 D N Aチ ップ法、 定量 P C R法により行うことが可能であり、 D' N Aチップ法または C G H法 を行うことが好適であり、 C G H法を行うことが特に好適である。
「フローサイ トメ トリー法」 は、 例えば、 リンパ性白血病細胞で発現している ABC 蛋白質を測定する場合、 まず、 その FITC (Fluoresceinisothiocyanate) 標識 CD 4 5 モノクローナル抗体を用いて、 リ ンパ球をフローサイ トメ トリーにより分取する。 次 に、 Cy3等の蛍光色素標識抗 ABC蛋白質抗体を用いて、 リンパ性白血病細胞で発現 している ABC 蛋白質を測定することができる。 本法は癌細胞膜表面に発現している 蛋白質の検出に適している。
「ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) 法」 は、 例えば、 2種類の抗
ABC蛋白質抗体を使用するサンドィツチ ELISA法が一般的である。 これ以外にも 1 種類の抗 ABC蛋白質を使用する競合法がある。 前者の方法は 1種類の抗 ABC蛋白質 抗体をプレート上に固相し、 癌細胞抽出液を加えて抗体と結合した ABC 蛋白質をも う一方の抗体で検出する方法である。 具体的には、 もう一方の抗体を標識する、 ある いは、 その抗体をアルカリホスファタ一ゼ標識抗体、 ペルォキシダーゼ標識抗体等で 検出する方法である。 本法は特異的抗体を使用することにより、 細胞内で発現するど のよ うな蛋白質にも適用可能である。
「DNAチップ法」 は、 癌細胞で発現している mRNAを定量する方法である。 例え ば、 基盤上に ABC 蛋白質群をコードする遺伝子を一部有する合成オリゴヌク レオチ ドを固定する （ c DNAを固定することもできる）。 癌細胞から調製した RNAをリバ ース トランスク リブターゼにより cDNA を合成する時に標識を行う。 本標識 cDNA と基盤上の合成オリゴヌクレオチドをハイプリダイズさせ、 結合した標識の量をスキ ヤンすることにより mRNA の発現量を測定することができる。 本発明は、 この DN Aチップ法で用いることができる DN Aチップ、 すなわち、 「ABCA3 遺伝子、 ABCB6 遺伝子、 ABCB8遺伝子、 ABCB1 0遺伝子、 ABCC4遺伝子、 ABCC9遺伝子、 ABCD 3遺伝子、 ABCD 4遺伝子、 ABCE1遣伝子、 ABCF2遺伝子、 BCL2L2 遺伝子、 BCL2L10遺伝子、 BCL2L1遺伝子、 および、 BCL2A1遺伝子からなる群の ABC トラ ンスポーター系遺伝子または BCL2ファミ リ一遺伝子から選ばれる 1種以上の遺伝子 を含有する DN A ( c DNAであっても合成オリ ゴヌク レオチドであってもよい）」 を 定着させた DNA定着基盤をも提供する発明である （基盤の素材、 製造工程等は、 後 述する C GHアレイ として用いる DN A定着基盤に準ずる）。
「定量 P CR法」 は、 被験 DNAの特定遺伝子 （癌細胞の薬剤耐性獲得によって増 幅または欠失する遺伝子） を含む領域をリアルタイム P C R法にて増幅させて、 当該 被験 DNA由来のリアルタイム P C R増幅産物とコントロール （健常細胞の DNA由 来の同一の遺伝子増幅用プライマーを用いて同一の条件で P C R法による遺伝子増幅 を行った結果得られた遺伝子増幅産物） の生成物を定量し比較することにより、 当該 特定遺伝子の増幅または欠失を検出する方法である。
( 2 ) C GH (Comparative Genomic Hybridization) 法、 または、 D N Aチップ 法による本検出方法
この態様の本検出方法は、 それぞれ異なる蛍光色素で標識した対照 D N Aと薬剤耐 性の獲得を検出する対象となる被験癌細胞の DN Aを、 上記 DN A定着基盤上におい て同時に接触させてハイプリダイズを行うことにより得られる蛍光色を指標として、 被験 D N Aの特定領域の増幅または欠失を定量的に検出する、 薬剤耐性獲得癌細胞の 検出方法である。
C GH法または DN Aチップ法に用いるヒ ト DN Aの定着基盤 これらの DNA検出法に用いる DNA定着基盤 （本発明は、 当該 DNA定着基盤を も提供する発明である） に定着させるヒ ト DNAは、 選択する検出法に応じて選択す ることが可能である、 すなわち、 本検出方法の態様として、 DN Aチップ法を行う場 合には、 c DNAまたは合成オリゴヌクレオチドが挙げられる。 また、 CGH法を行 う場合には、 ゲノム DNAが挙げられる。
DNAの採取、 調製は、 常法により行うことも可能であり、 特に対照 DNAは市販 品を用いることも可能である。
本検出方法において特に好適な態様として、 CGH法を、 特定のゲノム DNA領域 を有する BAC (Bacterial Artificial Chromosome ) DNA、 YAG (Yeast Artificial G romosome)D N A, または、 PAC DNA(Phage Artificial Chromosome ) DNAか ら得られる複数種類の遺伝子増幅産物が、 当該遺伝子増幅産物毎に定着している基盤 を用いる態様を挙げることができる。
すなわち、 癌細胞の制癌剤に対する耐性の獲得に伴い、 増幅または欠失しているゲ ノムの領域は巨大である場合も認められる。 このように、 本定着基盤においては、 一 単位と して巨大な遺伝子が反映されているゲノム DNAを定着する必要があり、 かか る必要性を満足することができる程度に、許容される遺伝子の組み込み容量が大きな、 BAC DNA、 YAC DNA、 または、 PAC DNA (以下、 BAC DNA等ともいう） を用い る必要がある。 本発明に用いることができる BACDNA等は、 常法により、 用いるゲ ノムを組み込んで得られる遺伝子ライブラリーから選択してもよいし、 市販されてい る遺伝子ライブラ リーから選択してもよい。 各目的に応じて選択されるべき BAC DNAまたは PAC DNAについては後述する。選択されたクローンが組み込まれた宿主 を培養し、 BACDNA等の精製を行うことができる。
このように通常に得られる BACDNA等は、 ゲノム DN A定着基盤を多数製造して 実用化するには少量であるので、 当該 DNAを遺伝子増幅産物として得る必要がある (この遗伝子増幅行程を「無尽蔵化」 ともいう）。無尽蔵化においては、まず BACDNA 等を、 4塩基認識酵素、 例えば、 Rsal、 Dpnl、 Haelll等で消化した後、 アダプター を加えてライゲーションを行う。 アダプタ一は 10〜30塩基、 好適には 15~25塩基か らなるオリ ゴヌク レオチドで、 2本鎖は相補的配列を有し、 アニーリング後、 平滑末 端を形成する側の 3 '—末端のオリゴヌクレオチドをリン酸化する必要がある。次に、 アダプターの一方のオリゴヌク レオチドと同一配列部分を有するプライマーを用いて、
PCR (Polymerase Chain Reaction) 法により増幅し、 無尽蔵化することができる。 一方、 各 BAC DNA等に特徴的な 50〜70塩基のアミノ化オリ ゴヌクレオチドを、 検 出用プローブと して用いることもできる。
このようにして無尽蔵化した BAC DNA等 （これ以外の態様のゲノム D N A、 c D N A、 合成オリ ゴヌクレオチドでも同様） を基盤上、 好適には固体基盤上に定着させ ることにより、 所望する D N A定着基盤を製造することができる。
固体基盤としては、 ガラス、 プラスチック、 メンプレン、 3次元ァレイ等があげられ、 スライ ドガラス等のガラス基板が好ましい。 ガラス等の固体基盤は、 ポリ - L-リジン、 アミノシラン、 金 ' アルミニウム等の凝着により基盤をコートすることがより好まし い。
上記の無尽蔵化した DNA (これ以外の態様のゲノム D N A、 c D N A、 合成オリ ゴ ヌクレオチドでも同様） を基盤上にスポッ トする濃度は、 好ましくは lOpg/μΙ〜5 με/μ1, より好ましくは lng/μΐ〜200 ng/μΐである。 スポッ トする量は好ましくは lnl 〜1μ1、 より好ましくは 10nl〜100nl である。 また、 基盤に定着させる個々のスポッ トの大きさ及び形状は、 特に限定されないが、 例えば、 大きさは直径 0.01〜lram で あり得、 上面から見た形状は円形〜楕円形であり得る。 乾燥スポッ トの厚みは、 特に 制限はないが、 1〜100μπι である。 さらに、 スポッ トの個数は、 特に制限はないが、 使用する基盤あたり 10〜50,000個、 より好ましくは 100〜5，000個である。 それぞれ の DNAは Singular力 ら Quadruplicateの範囲でスポッ トするが、 Duplicate或いは Triplicateにスポッ トすることが好ましい。
乾燥スポッ トの調製は、例えば、スポッターを用いて無尽蔵化した BAC DNA等（こ れ以外の態様のゲノム D N A、 c D N A、 合成オリゴヌクレオチドでも同様） を基盤 上にたらして、 複数のスポッ トを形成した後、 スポッ トを乾燥することにより製造す ることができる。 スポッターとしてインクジエ ト式プリ ンター、 ピンアレイ式プリン ター、 バブルジェッ ト式プリンターが使用できるが、 インクジェッ ト式プリンターを 使用することが好ましい。 例えば、 Cartesian Technologies社 （米） のハイスループ ッ ト インクジェッ ト分注システム SQシリ一ズ等を使用できる。
このようにして無尽蔵化した BAC DNA等 （これ以外の態様のゲノム D N A、 c D N A、 合成オリ ゴヌクレオチドでも同様） を基盤上、 好適には固体基盤上に定着させ ることにより、 所望する D N A定着基盤を製造することができる。
検出の態様
上述した D N A定着基盤を用いて、 被験 D N Aの特定領域の増幅または欠失を定量 的に検出する場合、 特定領域のゲノム D N A等の断片が、 好適には網羅的に定着して いる本定着基盤に、 それぞれ異なる蛍光色素で標識した対照ゲノム D N A等 （正常細 胞または正常組織のゲノム D N A等） と被験ゲノム D N A等 （薬剤耐性を獲得してい るか否かを検出する対象となる癌細胞または癌組織のゲノム D N A等） を同時に接触 させてハイブリダィズを行うことにより得られる蛍光色を指標として、 被験ゲノム D N A等の特定領域の増幅または欠失を定量的に検出する検出方法である。
被験ゲノム D N A等の特定領域の増幅または欠失を定量的または定性的に検出する ことにより、 被験癌細胞の制癌剤に対する耐性の獲得の有無、 耐性の種類等を明らか にすることができる。
ヒ トゲノム DNA等は市販品を使用することが可能であり、 健常人から採血した血 漿より、 常法により抽出することもできる。 また、 癌患者本人の正常組織から常法に 従い得ることも可能である。
対照ゲノム D N A等 （正常細胞または正常組織のゲノム D N A等） と被験ゲノム D N A等 （薬剤耐性を獲得しているか否かを検出する対象となる癌細胞または癌組織の ゲノム D N A等） は、 それぞれ異なる蛍光色素、 例えば、 Cy3 と Cy5等、 を常法 （例 えば、 dCTP を用いたニック トランスレーション法） により標識することができる。 この dCT を用いたニック トランスレーション法を行う標識キッ トは、 PanVera社（日 本代理店： 宝酒造株式会社）、 Invitrogen社 （CA、 USA) 等で販売されている。 標識 DNAを CGHアレイにプリントした DNAとハイプリダイズする時には Cot_lDNA、 ホルムアミ ド、 Dextran Sulfate, SSC ( 150mM NaCl/15mM Sodium Citrate)、 Yeast t-RNA、 SDS (Sodium Deoxysulfate)を加えることがより好ましい。 また、 標識 DNA を含む溶液を熱変性させて加えることが好ましい。 ハイブリダイズする容器として、 口ッキング機能付プラッ トフオームに乗せることが可能であり、 少量の溶液を用いて 本定着基盤上でまんべんなく接触できる容器、 例えば、 ハイブリマンを用いることが より好ましい。 ハイプリダイゼーシヨ ンの温度は 3 0〜 7 0 °Cが好適であり、 3 8〜 4 5 °Cがより好適である。ハイブリダイズの時間は、 1 2〜 2 0 0時間が好適であり、 4 0〜 8 0時間がより好適である。 本定着基盤の洗浄はホルムアミ ド、 S S C溶液等 を用いて室温で行うことができる。 この本定着基盤の洗浄は、 非特異的シグナルをで きるだけなくすために重要なステップであり、 室温で洗浄後、 同洗浄液を用いて 4 0 〜 6 0 °Cで洗浄し、 さらに、 SSC-SDS を含む溶液中 5 0 °Cで洗浄を行い、 リン酸パ ッファー/ NP-40を含む溶液に静置し、最後に S S Cを含む溶液中で振と うすることが より好ましい。
また、 本検出方法において、 ハイブリダィズを行った本定着基盤における蛍光の発 生の内容を把握するためには、 例えば、 スキャナーを用いることができる。 当該スキ ャナ一としては、 例えば、 GenePix 4000B (Amersham Biosciences K.K.、 東京）等を 挙げることができる。 結果の解析は、 例えば、 対照ゲノム DNAを Cy 5で、 被験癌細 胞由来のゲノム DNAを Cy 3で標識する場合、本定着基盤上の Cy3蛍光強度の平均と Cy5蛍光強度の平均を同じ値に捕正することが好適である。 さらに、各 BAC DNA (各 ピクセル）上で Cy3/Cy5の Ratioを求め Log2Ratioの値で表示することが好適である。 当該蛍光の強度比 （肉眼的には蛍光色） を指標とすることにより、 被験癌細胞から得 られるゲノム D N A検体において、 検出目的とする遺伝子の特定部分の増幅や欠失が 認められるかを定量的 （もちろん定性的にも） に検出することができる。 図面の簡単な説明
図 1 下記細胞株のメタフェーズクロモソームを用いた蛍光 in situハイブリダイ ゼーシヨンによる遺伝子増幅並びに欠失の解析した結果を表す写真である。
(A) ヒ ト大腸癌細胞 HT-29株、 （B) ェトポシド耐性ヒ ト大腸癌細胞 HT-29/ETP 株、 （C) ヒ ト卵巣癌細胞 SKOV3株、 （D) エトポシド耐性ヒ ト卵巣癌細胞 SKOV3/VP 株、 （E) ヒ ト白血病 K562株、 （F) シトシンァラビノシド耐性ヒ ト白血病 K562/AC 株、（G)ヒ ト大腸癌細胞 HT-29株、（H)カンプトテシン耐性ヒ ト大腸癌細胞 HT-29/CPT 株
HT-29細胞は ABCA3遣伝子に由来する緑色蛍光と ABCC l(MRP l)遺伝子に由来す る赤色蛍光が 3ケ所に検出された （A)。 HT-29/ETP細胞では ABCA3遺伝子に由来す る緑色蛍光が全染色体中の 7ケ所に、 ABCC l(MRP l)遺伝子に由来する赤色蛍光が全 染色体中の 5ケ所に検出された （B)。 SKOV3細胞で ABCA3遣伝子に由来する緑色 蛍光は 7 ケ所に、 HNF3A 遺伝子に由来する赤色蛍光は 4 ケ所に検出された （C)。 SKOV3/VP細胞では BCL2L2遺伝子に由来する緑色蛍光は 6ケ所に、 HNF3A遺伝子 に由来する赤色蛍光は 4ケ所に検出された （D)。 K562 細胞では D CK遗伝子に由来 する緑色蛍光が 1ケ所検出された （E)。 K562/AC細胞では DCK遗伝子に由来する緑 色蛍光が 1ケ所検出された （F)。 HT-29細胞では TOP 1に由来する緑色蛍光が 5ケ所 検出された （G)。 HT-29/CPT細胞では TOP I に由来する緑色蛍光が 2ケ所検出され た （H)。 (A) と （B) では ABCA3遺伝子と ABCC1遺伝子が非常に近い部位に局在するた めに、 緑色蛍光と赤色蛍光が重なり黄色を呈している。 蛍光 ώ s ハイブリダィゼ ーションで使用した Bacterial Artificial Chromosome ( BAC) 並びに P i-Artificial Chromosome (PAC) を下記に示した。
遗伝子名 BAC/PAC名
ABCA3遺伝子 （ABCファミ リ一遺伝子） RP 11-304L19
ABCC 1遺伝子 （ABCファミ リ一遺伝子） RP11-516F7
HNF3A遺伝子
(Hepatocyte nuclear factor 3ファ リ ~： Afe子) RP 11-35609
BCL2L2造伝子 （BCL2ファミ リ一遺伝子） RP 11- 124D2
DCK遺伝子 （デォキシシチジンキナーゼ遺伝子） RP 11-499N1
TOP 1遺伝子 （トポイソメラーゼ遺伝子） RP 1- 1J6
. HT-29/ETP 細胞染色体上のアンプリ コン （遺伝子増幅を示す領域） のマップは 16p l2-p l3にあり、 ABCA3遺伝子と ABCC l(MRP l)遺伝子が隣接して存在する （1)。 SKOV3/VP 細胞染色体上のアンプリ コンは 14qll-q21 にあり、 BCL2L 遺伝子と HNF3A造伝子が存在する （J)。
光 in situ ノヽィブリダイゼーション (FISH: Fluorescence in situ hybridization) ίま Yasui,K., Imoto,I., Fukuda, Ϊ., Pimkaliaokham,A., Yang,Z.Q., Naruto,T., Shimada,Y., Nakamura,Y., and Inazawa '■ Identification of target genes within an amplicon at 14ql2-ql3 in esophageal squamous cell carcinoma. Genes Chromosomes Cancer, 32, 112- 118, 2001の方法に従って行った。
(I) と （J) は BAC並びに PAC (それらの番号を記載） を標識プローブに用いて FISH を行い、 エトポシド耐性大腸癌 （HT-29/ETP) 細胞並びにエトポシド耐性卵巣 癌 （SKOV3/VP) 細胞のクロモソーム上での検出部位を→で図中に表示した。 その結 果をクロモソーム上での局在部位、 その領域内に存在する STS ( Sequence-tagged ite)、その領域をカバーする BAC並びに PACクローン名、それらの BAC並びに PAC をプローブに用いて HT-29/ETP 細胞における本クロモソーム領域の増幅を平均コピ 一数で表した。 ABCA3遗伝子、 MRP 1遺伝子、 BCL2L遺伝子、 HNF3A遺伝子が存 在するクロモソームの領域を矢印で示した。 HT-29/ETP細胞並びに SKOV3/VP細胞 の蛍光写真の右上にはプローブに用いた BAC名或いは PAC名を記載した。 図 2 薬剤耐性細胞株における ABCA3遺伝子、 ABCC1 (MPR1) 遺伝子、 BCL2L2 遺伝子及び ABCC9遺伝子の過剰発現を示す図面である。
( A ) HT-29細胞及び ΗΤ-29/ΕΊ 細胞における ABCA3及ぴ ABCC1 (MRP) 遺伝子 発現の Northernブロッ ト法による解析。 これら 2種類の細胞から 2 のポリ (A) RNAを調製し、 常法により Northernブロッ トを行い、 上記 2種類の遗伝 子発現量を測定した。 ABCA3遺伝子及び ABCC1 (MRP1) 遗伝子を検出するた めのプローブとして各々 IMAGEクローン 179576及ぴ 2205297 (Incyte Genomics, Palo Alto, CA) を使用した。 GAPDH (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)遣伝子プローブはサンプル間の誤差を修正するためのスタンダ ードと して使用した。
( B ) SKOV3細胞及び SKOV3/VP細胞における BCL2L2遺伝子発現の Northernプ 口ッ ト法による解析。 これら 2種類の細胞から 2 gのポリ （A) RNAを調製し、 常法を用いて Northernプロッ トを行い、 BCL2L2遺伝子発現量を測定した。 BCL2L2遺伝子を検出するためのプローブは 2種類のプライマー
(Forward:5'-TATAAGCTGAGGCAGAAGGG-3' (配列番号 1 ) と
Reverse:5'-TCAGCACTGTCCTCACTGAT-3' (配列番号 2 ) ) を用いて PCR
(polymerase chain reaction) により増幅し、 調製した。 GAPDH遺伝子プロ ーブはサンプル間の誤差を修正するためのスタンダードとして使用した。
( C ) SK3細胞、 SK3/VP細胞、 並びに SKOV3/VP細胞を用いて ABCC9 mRNAの 発現解析。 これらの細胞より RNAを調製し、 リアルタイム逆転写一 PCR法
(Yasui, K.， Arii, S., Zhao,C.， Imoto'L' Ueda, M., Nagai'H.' Emi.'M. and Inazawa J. ： TFDP1, CUL4A and CDC16 identified as targets for
amplification at 13q34 in hepatocellular carcinomas, Hepatology, 35, 1476-1484, 2002) を用いて ABCC9遺伝子 mRNAを定量した。 サンプル間の差 を標準化するために、 ABCC9遺伝子と対照遺伝子 （GAPDH) の発現レベルの 比を求め、 SK3細胞での比 （ABCC9発現量/ GAPDH発現量） を 1 とし、 各細胞 での ABCC9遺伝子発現量の相対比を図示した。
図 3 親株と比較した薬剤耐性細胞株の BCL 2ファミ リー遣伝子の発現を示す図 面である。
各細胞で対照造伝子 （GAPDH) と目的とする造伝子の発現量の比を求めた。 各薬 剤耐性細胞の親株の比を 1 として、 各薬剤耐性細胞での発現量の比を示した。 遺伝子 発現量はリアルタイム逆転写 PCRにより測定した。
左欄には薬剤耐性癌細胞名、 各バーグラフの上欄には検討した遺伝子名、 下欄には 上欄に示した遺伝子の発現量を親株と比較した値で示した。
図 4 カスパーゼ活性並びに BCL2ファミ リ一遺伝子発現とエトポシド耐性との関 係を示す図面である。
( A ) エトポシド （VP- 16) 処理を行った卵巣癌細胞 （SKOV3と SKOV3/VP) の力 スパーゼ活性を示している。
カスパーゼ活性の測定は力口リメ トリ ック CaspACEアツセィシステム (Promega Co., Madison, WI, USA) を用いて説明書に従って行った。 SKOV3 細胞と SKOV3/VP細胞を 100 μδ/πι1の VP'16、 VP- 16 とカスパーゼ阻害剤
Z-VAD-FME：、 或いは培地 （コントロール） だけの存在下で 2 4時間培養した。 細胞をリシスバッファーを用いて溶解し、 4 °Cで 15，000x 20分間遠心分離を 行い、 その上清 （100 μ 蛋白質含有） をカスパーゼ活性測定のための基質 (Ac-DEVD-pNA) と共に 37°Cで 4時間インキュベーションを行い、 405 nmの 吸光度を測定することにより、 その活性を求めた。
( B ) BCL2L2アンチセンスオリゴヌクレオチドで処理をした SKOV3/VP細胞での BGL2L2 mRNAの発現レベルを示している。
SKOV3/VP細胞を無処理、 トランスフエクション試薬であるオリ ゴフエクタ ミン処理、 ホスホロチォエート骨格を有する BCL2L2アンチセンスオリゴヌク レオチド （BCL2L2 cDNAの 2374番から 2394番までの配列 ：
5'-AGCCTACCACCTCCCCTAGAA-3' (配列番号 3 ) ) をオリゴフエクタミン処 理により トランスフエクションした場合、スクランブル配列のホスホロチォエー ト骨格を有するコントロールオリ ゴヌクレオチド （配列 ：
5'-AAGATCCCCTCCACCATCCGA-3' (配列番号 4 ) ) をオリ ゴフエクタミン処 理により トランスフエクシヨンした場合の各々について、 RNAを抽出し、 リア ルタイム逆転写 PCR法により、 BCL2L2 mRNA量を測定した。
( C ) BCL2L2造伝子の発現抑制による SKOV3/VP3細胞のエトポシド VP-16に対 する感受性の増大について示している。
ホスホロチォエート骨格を有する BCL2L2アンチセンスオリ ゴヌクレオチド をオリゴフエクタミン処理により トランスフエクシヨン、スクランブル配列のホ スホロチォエート骨格を有するコントロールオリゴヌク レオチドをォリ ゴフェ クタミン処理により トランスフエクシヨン、 並びに、 無処理の条件で
SKOV3/VP3細胞を処理し、 24時間後に図に示した各濃度の VP - 16存在下で細 胞を 48時間培養した。 SKOV3/VP3細胞の生存率をトランスフエクシヨ ン 72 時間後に Cell-Counting Kit-8 (同仁化学研究所、 熊本） を用いてテトラゾリ ゥ ムアツセィ法により測定した。 生存率を％で表示したが、 ％は上記処理条件下で 測定された吸光度を VP-16無添加 ·無処理の条件下で測定された吸光度で割り 算し求めた。 各々の値は 5回の実験の平均値で、 その値は各プロッ ト上の平均 値土 SDで表示した。 発明を実施するための最良の形態
[実施例 1 ] 薬剤耐性癌細胞に特異的に認められる特定のゲノム DNA領域の変化 Subtr active C GH法は親株のゲノムとそれから誘導した薬剤耐性細胞のゲノム各領域 のコピー数を比較し、 差し引く ことにより遺伝子の増幅の度合いと欠失を定量的に算 出する方法である。 本法を用いて、 親株と比較して 23 種類の薬剤耐性癌細胞で見出 された遺伝子の増幅 ·欠失の変化を表 1に示した。
(表 1 ) 親株の癌細胞とそれから誘導した薬剤耐性癌細胞のゲノムを Subtractive CGH法を用いて検出したクロモソーム異常の領域
No. 細胞株 薬剤名 増幅領域 欠失領域
1 HT-29/CPT CPT lq, 4q24-35 lip, llq23-25, 20p, 20q
2 ΗΤ-29/cDDP CDDP lq31-32, lq42-44, 3p21-26, llpl4- 15, 15qll-21
5p l4- 15
3 HT-29/ADM ADM 6ql6-22, lip, 13q21-22, 7p21-22, 8q23-24, 9q34
14q21-32, 18ql2-21
4 HT-29/ETP VP-16 16p l2- 13 None
5 A549/CPT CPT 2q21-37 9q31-34, llp ll-14, llql4-22, 16q, Xp, Xq
6 St-4/CPT CPT None H
7 St-4/cDDP CDDP None None
8 A2780/cDDP CDDP None Xp, Xq 9 KK47/DDP10 CDDP 5ql4-35,6q24-27, 13q22-34, 5p
14q22-32
10 KK47/DDP20 CDDP 6q21-27, 13q22-34 5p
11 T24/DDP5 CDDP 4p l5-16 13q
12 T24/DDP7 CDDP 4p l4-16 None
13 T24/DDP10 CDDP 3p22-26,3ql3-24,4p,5ql4- 15, 13ql4-34, 15qll-21
7q34-36, 12q23"24
14 U937/clone21 VP- 16 2p21-25 None
15 U937/clone26 VP-16 None None
16 U937/clone41 VP- 16 None None
17 U937/clone49 VP-16 None 18q21
18 U937/UK711 VP- 16 None None
19 K562/AC Ara-C Ip21-31,7q, llp, 15ql4-24,20pl3, 2q,4p,4q,5p, llql3-23
Xp.Xq
20 K562/etop20 VP- 16 16p None
21 K562/etop80 VP- 16 14q21-32, 16p, 16ql2- 13 9p21-24, 12q21-24
22 SK3/VP16 VP- 16 2q36-37,4q21-35,7q21-31 3p, 5p, lOq, 20q
23 SKOV/VP VP- 16 Ipl3-22,5q31-35, llq23-25, 12p, 20ql2- 13
14qll-21, 17p
CPT： カンプトテシン、 CDDP： シスプラチン、 ADM： ァ ドリアマイシン、
VP- 16： エ トポシ ド、 Ara-C ： シ トシ トシンァラビノシ ド
HT-29： 大腸癌細胞、 A549：肺癌細胞、 SK3：肺癌細胞、 St-4： 胃癌細胞、
A2780：卵巣癌細胞、 SKOV3：卵巣癌細胞、 KK47：膀胱癌細胞、 T24：膀胱癌細胞、
K562 : 白血病細胞、 U937 : 白血病細胞
19種類（全細胞種の 83%に相当）の薬剤耐性細胞は DNAコピー数が変化していた。 1細胞の全染色体当たり異常が起こっている箇所は 0から 12 ケ所の範囲であり、 平 均値は 3.7ケ所であった。 遗伝子増幅は 0から 7ケ所の範囲で、 平均値が 2.1ケ所で あった、 欠失は 0から 6ケ所の範囲で、 平均値が 1.6ケ所であった。 遺伝子増幅は 4 細胞 （全細胞種の 17%に相当） で共通してクロモソーム 14qに見出され、 3細胞 （全 細胞種の 13%に相当） で共通してクロモソーム 4p、 6q、 7q、 13q に見出された。 数 コピー以上の増幅がカンプトテシン耐性肺癌 （A549/CPT) 細胞のク ロモソーム 2q23-q34領域に、シスプラチン耐性膀胱癌（T24/DDP 10)細胞のクロモソーム 4pに、 ェトポシド耐性肺癌 （SK3/VP 16) 細胞のクロモソーム 7q21-q22領域に、 シトシンァ ラビノシド耐性白血病（K562/AC)細胞のクロモソーム 15q21-q24領域に検出された。 遺伝子欠失は 4細胞 （全細胞種の 17%に相当） でクロモソーム 5p と lipに、 3細胞
(全細胞種の 13%に相当） でクロモソーム llqと 20qに検出された。 8種類のシスプ ラチン耐性細胞を試験し、共通に認められるクロモソーム增幅の最小領域は 3ρ22·ρ26
(大腸癌 ΗΤ-29/cDDP細胞と膀胱癌 T24/DDP 10細胞）、 4p l5-p l6 (膀胱癌 T24/DDP5、 T24/DDP7 及ぴ T24/DDP 10 細胞）、 及ぴ 5p l5 (大腸癌 ΗΤ-29/cDDP細胞と膀胱癌 T24/DDP10 細胞） であった。 シスプラチン耐性細胞で共通して欠失しているクロモ ソームの領域は、 5p (膀胱癌 KK47/DDP10細胞並びに KK47/DDP20細胞）、 13ql4-q34
(膀胱癌 T24/DDP5及び T24/DDP10細胞）、 及び 15qll-q21 (大腸癌 HT-29/CDDP 並びに膀胱癌 T24/DDP10細胞） であった。 さらに、 1 0種類のエトポシド耐性癌細 胞で 2種類のクロモソーム領域の変化が共通して検出された。 それは、 クロモソーム 16p l2-p l3領域の増幅 （大腸癌 HT-29/ETP細胞、 白血病 K562/etop20細胞及び白血 病 K562etop80細胞） とクロモソーム 20ql2-ql3の領域の欠失 （肺癌 SK3/VP細胞及 び卵巣癌 SKOV3/VP細胞） である。 クロモソーム Ilp ll-p l4領域の欠失は 3種類す ベてのカンプトテシン耐性細胞 （大腸癌 HT-29/CPT、 肺癌 A549/CPT 及び胃癌 St-4/CPT細胞） で共通に認められた。 次に、 これらのクロモソーム領域の増幅並びに 欠失領域に含まれる薬剤耐性と密接に関連する遺伝子群の同定を進めた。
[実施例 2 ] ABC トランスポーター迨伝子の増幅と過剰発現
ABC トランスポーターをコードするヒ ト遺伝子と して 48種類がこれまで知られて レヽる (Dean, M., Hamon, ί. and Chimini, G. ： The human ATP-binding cassette (ABC) transporter superfamily, J. Lipid Res" 42, 1007.1017， 2001)。 ここで試験し た薬剤耐性細胞中では 20種類の ABC トランスポーター遺伝子が増幅していた。 その 中で、 17種類の遺伝子の増幅を FISH法で確認した。
13種類の ABC トランスポーターは親株と比較すると 19種類の薬剤耐性細胞で確 実に増幅していた （表 2 )。 (表 2 ) 親株の癌細胞とそれから誘導した薬剤耐性の癌細胞を比較して後者で ABC トランスポーター遺伝子と Bcl-2ファ ミ リ一遺伝子が増幅している細胞株リス ト
Figure imgf000020_0001
* 耐性株のコピー数 （その親株のコピ 特に、 ABCA3遺伝子、 ABCBl(MDRl) 遺伝子、 ABCC9 (SUR2)遺伝子はコピーナ ンバーで 2コピー以上の増幅が認められた。 CGH 法によりクロモソーム 16pl2-p l3 領域で遺伝子増幅が検出されたェトポシド耐性大腸癌 HT-29/ETP 細胞では、 クロモ ソーム 16pl3.3に局在する ABCA3遺伝子の FISH法で求めたコピー数は 7コピーで、 16p l3.1 に局在する ABCCl(MRPl)遺伝子のそれは 5 コ ピーであった。 一方、 ΗΤ-29/ΕΊ 細胞の親株 （HT-29) では両遺伝子のコピー数は 3コピーで、 より低い値 を示した （図 1 Aと B)。 この結果は親株が耐性株と比較しエトポシドに感受性がより 高いことを示している。 FISH 法を用いて、 エトポシド耐性大腸癌 （HT-29/ETP) 細 胞で増幅された ABCA3遺伝子が局在するクロモソームの最小の染色体領域を BACク ローン番号 RP11-334D3 マーカー D16S525 を含む）と ： RP11-95P2(マーカー SHGC-11838を含む）の間に同定した（図 1 1)。クロモソーム 7q21に局在する ABCB1 遣伝子の FISH 法で求めたコピー数はエトポシド耐性肺癌 （SK3/VP16) 細胞では 1 1コピーであり、 親細胞の 3コピーと比較すると顕著に高い値であった。 クロモソー ム 12p l2.1に局在する ABCC9遺伝子の FISH法で求めたコピー数はェ トポシド耐性 肺癌 （SK3/VP16) 細胞とエトポシド耐性卵巣癌 （SKOV3/VP) 細胞では 5コピーで あり、 親株の 2コピーより有意に高い値である。 次に、 これらの遣伝子の増幅はその mRNAの高発現を誘導すると考えられるので、 その確認をおこなった。 親株並びにそ の親株より得られた薬剤耐性細胞から RNAを抽出し、 Northernプロッティングを行 うと親株の大腸癌 HT-29細胞と比較して、ェトポシド耐性 HT-29/ETP細胞は ABCA3 遗伝子発現が 10.6倍、 ABCC1遺伝子発現が 2.6倍増大していた（図 2 A)。 この結果よ り両遺伝子はクロモソーム 16p l2-13領域に存在するが、 ABCA3遣伝子は ABCC1遺 伝子よりもよりエトポシド耐性を付与するより重要な遺伝子である。 ABCB1 遺伝子 発現はェトポシド耐性肺癌 （SK3/VP16) 細胞では親細胞 （SK3) より も 3.3倍高い発 現を示した。 ABCC9遺伝子発現は SK3/VP16細胞では親細胞より も 13.3倍高い発現 を示した。 一方、 それはエ トポシド耐性卵巣癌 （SKOV3/VP) 細胞ではその親細胞 (SKOV3) と比較して 1.6倍の発現を示すのみであった （図 2 C)。 従って、 細胞種に より薬剤耐性に関与する ABC トランスポーター遺伝子が異なることが示唆される。 薬剤耐性を解析するためには、 広範囲の ABC トランスポーター遺伝子群を網羅的に 解析することが必要となる。 [実施例 3 ] BCL 2ファミ リ一に属する抗アポト一シス蛋白質をコードする遺伝子の _ 増幅と高発現
BCL2遺伝子、 BCL2LKBCLXL) 遺伝子、 BCL2L2 (BCLW) 遺伝子、 BCL2A1遣 伝子、 MCL1迨伝子及び BCL2L10遣伝子の各遺伝子群は BCL 2ファミ リ一に属し、 抗アポトーシスの作用を有する制御蛋白質である （Gross, A., McDonnell, J.M., and orsmeyer, S.J.: BCL-2 family members and the mitochondria m apoptosis, Genes
Dev. 13, 1899-1911, 1999)。
BCL2LKBCLXL) 遺伝子を除く 5種類の遺伝子は薬剤耐性細胞で遺伝子増幅が認 められた。 FISH を用いた解析で、 それぞれの親株と比較して、 エトポシド耐性卵巣 癌 （SKOV3/VP) 細胞では BCL2L2 造伝子の増幅、 カンプトテシン耐性大腸癌
(HT-29/CPT) 細胞では MCL1 遺伝子の増幅、 シトシンァラビノシ ド耐性白血病
(K562/AC) 細胞では BCL2L10遣伝子の増幅が起こっていた （表 2 )。 この場合、 ェ トポシド耐性卵巣癌 （SKOV3/VP) 細胞ではその親細胞と比較して、 クロモソーム
14qll-q21の領域が増幅しており、 クロモソーム 14qll.2-ql2に局在する BCL1L2遺 伝子の FISH法により求めたコピー数は 6コピーであった （図 1、 C と D)。
Hepatocyte nuclear factor 3ファミ リ一遺伝子である HNF3A遺伝子はクロモソー ム 14ql2にマップされ、 食: ik ifeである Esophageal squamous cell carcinomasのクロ モソーム 14ql2-ql3上にこの領域の增幅を誘起するアンプリコンとして見出されてい る。 ェトポシド耐性卵巣癌細胞で、 HNF3A遺伝子の FISH法で求めたコピー数は 4 コピーであった（図 1 D)。 BCL2L2遺伝子はェトポシド耐性細胞株 SKOV3/VP細胞に おいてクロモソーム 14qll-q21領域でのアンプリコンとして可能性の高い領域に存在 している。 さらに、 BCL2L2 遺伝子を含むアンプリ コンはマーカー D14S879 (BAC クローン RP11- 146E13) と SHGO l0164(BACクローン RP11-144C18)の間に存在す る（図 1 J)。 Northernブロッ ト法により BCL2L2遺伝子の発現を検討した所、 親株と 比較して SKOV3/VP細胞ではその遣伝子発現は 3.3倍に増大していた （図 2 B)。 次に、上記 6種類の BCL 2ファミ リ一遺伝子発現を 2 2種類の薬剤耐性細胞で比較 した （図 3 )。 BCL2遺伝子発現は 4種類の薬剤耐性細胞で親株と比較して 2倍以上の 高レベル発現を示した。 同様に BCL2L1(BCLXL)遺伝子発現は 1種類の薬剤耐性癌細 胞で、 BCL2L2遺伝子発現は 3種類の薬剤耐性癌細胞で、 MCL1遣伝子発現は 1種類 の薬剤耐性癌細胞で BCL2A1遣伝子発現は 1種類の薬剤耐性癌細胞で、 BCL2L10遣 伝子発現は 5種類の薬剤耐性癌細胞でそれぞれの親株と比較して 2倍以上の高レベル 発現を示した（図 2 B と図 3 )。
MCL1遺伝子はカンプトテシン耐性大腸癌 HT-29/CPT細胞で、 BCL2L10遺伝子は シトシンァラビノシド耐性白血病 K562/AC 細胞で'、 それらの遺伝子増幅に比例して 高い発現をしていた （表 2と図 3 )。 従って、 BCL2ファミ リ一遺伝子の高発現は制癌 剤耐性を誘導することが判明し、 その遺伝子増幅の解析は薬剤耐性能を検査上で重要 であることが判明した。
[実施例 4 ] エトポシド（VP-16) により誘導されたアポトーシスに対する BCL2L2 の影響
制癌剤によるアポトーシスの誘導に対する BCL2L2遺伝子発現の影響を検討した。 ヒ ト卵巣癌 SKOV3 細胞とェトポシド耐性卵巣癌 SKOV3/VP 細胞を 100 μ§/πι1 の VP-16存在下で 24時間培養し、 caspase-3の活性化に伴うアポトーシスを測定した。 その結果、 カスパーゼ活性は親株と比較するとエトポシド耐性 SKOV3/VP 細胞では 約 1/2に低下した （図 4 A)。 次に、 BCL2L2遺伝子の役割を解析するために、 BCL2L2 のアンチセンスオリゴヌクレオチドで細胞を処理し、 BCL2L2遺伝子発現を抑制した 条件で VP-16の影響を検討した。 トランスフエクション試薬（Oligofectamine)単独、 BCL2L2のセンスオリ ゴヌクレオチド （スクランブル配列のコントロールオリ ゴヌク レオチド） は影響しないが、 BCL2L2のアンチセンスオリ ゴヌクレオチドを添加する と BCL2L2遣伝子発現が低下した （図 4 B)。 この条件で SKOV3/VP細胞のエトポシ ド （VP-16) に対する感受性が増大した （図 4 C)。 従って、 BCL2 ファミ リー遺伝子 の増幅がカスパーゼ活性を低下させ、 制癌剤耐性を誘導しているといえる。
[実施例 5 ] DCK、 TOPI, TOP2Aの遺伝子コピー数と発現レベル
シ トシンァラビノシド耐性白血病 K562/AC 細胞はデォキシシチジンキナーゼ (DGK) 遺伝子が局在するクロモソーム 4q の領域を欠失、 カンプトテシン耐性大腸 癌 HT-29/CPT細胞はトポイソメラーゼ 1 (TOP1) が局在するクロモソーム 20qを欠 失する。 一方、 TOP2Aが局在するクロモソーム 17q21-22の領域は 5種類のェトポシ ド （VP- 16) 耐性細胞では増幅 '欠失は認められない （表 1 )。 シトシンァラビノシド
(Ara-C)、 カンプトテシン （CFT) 及びエトポシド （VP-16) 耐性細胞で、 FISH 法 を用いて DCK遺伝子、 TOP1造伝子、 TOP2A遺伝子のコピー数を求め、 リアルタイ ム逆転写-： PCR法によりそれらの発現レベルを測定した （表 3 )。 (表 3 ) シトシンァラビノシド耐性株での DCK遺伝子、 カンプトテシン耐性株での TOP1遺伝子、 並びに、 エトポシド耐性株での TOP2A遗伝子のコピー数とそれら遣 伝子の発現レベル
Figure imgf000024_0001
* DNAコピー数は耐性株でのコピー数 （親株でのコピー数） を示した。
** ターゲッ ト遺伝子と対照遺伝子 （GAPDH) の発現量の比を求め、 各薬剤耐性 細胞の親株の値を 1 としそれに対する比で表した。
(略号） DCK： デォキシシチジンキナーゼ遣伝子
TOP1： トポイソメラーゼ 1遺伝子
TOP 2 A： トポイソメラーゼ 2 A遺伝子 親株と比較してシトシンァラビノシド耐性白血病 （K562/AC) 細胞は DCK遺伝子 の FISH法により求めたコピー数は 1コピーであった。 これは Ara-C耐性細胞におけ る 2対の遺伝子中で 1対の欠失を示している（図 1 E と F)。 DCK造伝子の発現はヒ ト 白血病 K562 細胞で明らかに検出されたが、 シ トシンァラ ビノシ ド耐性白血病 K562/AC細胞では検出されなかった。 大腸癌 HT-29細胞は TOP1遺伝子を 5コピー 有しているが、 カンプトテシン耐性大腸癌 HT-29/CPT 細胞では 2コピーであり、 顕 著に低下していた （図 1 G と H)。 同様に、 親株胃癌 （St-4) 細胞では TOPI のコピ 一数は 6コピーであつたが、 カンプトテシン耐性胃癌 （St-4/CPT) 細胞では 3コピー に減少し、 3種類のカンプトテシン耐性細胞株ではすべて 3コピー以下に減少してい た。 TOP2A 遺伝子のコピー数はそれぞれの親株と比較して、 カンプトテシン耐性大 腸癌 HT-29/ETP細胞、 ェトポシド耐性白血病 （K562/etop20及び K562/etop80) 細 胞で減少し、 TOP2A 遺伝子発現は 5種類すベてのェトポシド耐性細胞株で低下して いた。
従って、 DCK遺伝子、 TOP1遺伝子及び TOP 2 A遺伝子のコピー数の減少は制癌 剤の耐性と密接に関係しており、 クロムソームのこれらの遺伝子の増幅並びに欠失を 解析することは癌細胞の制癌剤耐性能を検査する上で極めて重要である。 [実施例 6 ] 癌細胞及び癌組織の薬剤耐性能を診断する CGHァレイの作成
ABC トランスポーターファミ リ一に属する ABCA3遺伝子、 ABCB1遺伝子、 ABCB6 遺伝子、 ABCB8遺伝子、 ABCB 1 0遺伝子、 ABCB 1 1遺伝子、 ABCC1遺伝子、 ABCC 4遺伝子、 ABCC 9遺伝子、 ABCD3 遺伝子、 ABCD 4遺伝子、 ABCE 1遺伝子及び ABCF 2遺伝子はそれぞれ BACクローン、 RP11-304L19、RP11-212B1、RP11-803J6、 RP11-606P1, RP4-613A2, RP11-704B8, RP11-516F7, RP11-124D15, RP11-729I10, RP11-272P3, RP5-919J22, RP11-543H9 及び RP4-548D19 に含まれている。 BCL 2ファミ リ一に属する BCL2L2遺伝子、 MCL1遺伝子及び BCL2L10遺伝子はそれぞ れ BACクローン、 RP11-124D2、 RP11-243G22及ぴ RP11-337B11に含まれる。 これ らの BAC DNAを 4塩基認識酵素 Rsalで消化した後アダプタ一を加えてライゲーシ ヨンを行った。 その後、 アダプターの配列をプライマーに用いて PCR を行い、 遣伝 子増幅を行った （この増幅工程を無尽蔵化と言う）。 コントロール DNAとして、 上記 以外の 5種類の BAC DNA (RP11-98A20、 EP11-252011, RP11'357G3、 RP11-196F4 及び RP11-736A8) を無尽蔵化して調製した。
無尽蔵化した DNA をインクジエツ ト式プリンターを用いてアミノ化オリゴヌクレ ォチド固定化ァレイ用スライ ドグラスに Triplicate にスポッ トすることにより DNA 定着基盤を作成した。
健常者組織に由来する DNAを Cy5で標識し、 癌患者より摘出した癌組織に由来す る DNAを Cy3で標識する。 その混液を DNA定着基盤上でハイプリダイゼーション を行い、 そのアレイをスキャンし、 Cy3のシグナルと Cy5のシグナルを標準化した後 Cy3/Cy5の強度比を求める。 その比が 2であれば DNA定着基盤にプリントした ¾伝 子を含むゲノムの領域が癌組織で 2倍に増幅、 その比が 4であれば 4倍に増幅してい ることを示す。 産業上の利用可能性
ヒ ト ABC トランスポーター系遺伝子、 BCL2フアミ リー遺伝子または D N A合成関 連遺伝子群は、 制癌剤耐性に密接に関連している。 従って、 本発明により、 癌細胞の 染色体上でのこれらの遺伝子領域の増幅及ぴ欠失を調べることにより、 癌細胞の制癌 剤耐性を判定することが可能である。 その結果、 癌患者の患部の細胞が制癌剤耐性か どうか容易に診断することが可能である。 これは患者個人に適切な化学療法即ちォー ダーメイ ド医療を可能にし、 制癌剤耐性能獲得に基づく奏効率の極めて低い化学療法 を避けることが可能であり、 かつ、 患者の Quality of Lifeの無用な低下を防ぐことが できる。

Claims

請求の範囲
1 . 被験癌細胞における、 ABCA3 遺伝子、 ABCB6遺伝子、 ABCB8遺伝子、 ABCB 1 0遣伝子、 ABCC 4遺伝子、 ABCC 9遺伝子、 ABCD 3遺伝子、 ABCD 4遺伝子、 ABCE 1遺伝子、 ABCF 2遺伝子、 BCL2L2、 BCL2L10、 BCL2L1、および、 BCL2A1 からなる群の ABC トランスポーター系遺伝子または BCL2 ファミ リ一造伝子か ら選ばれる 1種以上の遺伝子の増幅を検出することにより、 当該被験癌細胞にお ける制癌剤に対する薬剤耐性の獲得を検出する、 検出方法。
2 . ABC A3 遺伝子の増幅がエ トポシ ド類に対する薬剤耐性獲得の指標であり、 ABCB6 遺伝子の増幅がカンプトテシン類に対する薬剤耐性獲得の指標であり、
ABCB8 遺伝子の増幅がシスブラチン類に対する薬剤耐性獲得の指標であり、 ABCB 1 0遺伝子の増幅がカンプトテシン類に対する薬剤耐性獲得の指標であり、 ABCC 4遺伝子の増幅がシスブラチン類に対する薬剤耐性獲得の指標であり、 ABCC 9遺伝子の増幅がェ トポシ ド類に対する薬剤耐性獲得の指標であり、 ABCD 3遺伝子の増幅がェ トポシ ド類に対する薬剤耐性獲得の指標であり、
ABCD 4遺伝子の増幅がァドリアマイシンに対する薬剤耐性獲得の指標であり、 ABCE 1遺伝子の増幅が力ンプトテシン類に対する薬剤耐性獲得の指標であり、 ABCF 2遺伝子の増幅がシスブラチン類に対する薬剤耐性獲得の指標であり、 BCL2L2遺伝子の増幅が、 カントプテシン類、 シスプラチン類、 エトポキシド類 またはシトシンァラビノシド類に対する薬剤耐性獲得の指標であり、 BCL2L10 遺伝子の増幅が、 カントプテシン類、 シスプラチン類またはシトシンァラビノシ ド類に対する薬剤耐性獲得の指標であり、 BCL2L1遺伝子の増幅が、 カントプテ シン類、 シスプラチン類、 エトポシド類またはシトシンァラビノシド類に対する 薬剤耐性獲得の指標である、 請求項 1記載の検出方法。
3 . 検出方法を、 C G H法、 フローサイ トメ トリー法、 ELISA法、 D N Aチップ法、 または、 定量 P C R法により行う、 請求項 1または 2の検出方法。
4 . 検出方法を C G H法または D N Aチップ法により行う、 請求項 1または 2記載の 検出方法。
5 . C G H法または D N Aチップ法に用いる基盤が、 ABCA3遗伝子、 ABCB6遺伝子、 ABCB8遣伝子、 ABCB 1 0遺伝子、 ABCC 4遣伝子、 ABCC 9遺伝子、 ABCD 3 遺伝子、 ABCD 4遺伝子、 ABCE 1造伝子、 ABCF 2遺伝子、 BCL2L2遺伝子、 BCL2L10遺伝子、 BCL2L1遺伝子、 および、 BCL2A1遺伝子からなる群の ABCト ランスポーター系遺伝子または BCL2ファミ リー遺伝子から選ばれる 1種以上の 遺伝子を含有する DN Aの定着基盤である、 請求項 4記載の検出方法。
6. 上記 DN Aの定着基盤が、 さらに、 ABCB1 遺伝子、 ABCC1 遺伝子、 ABCB11 遗伝子、 BCL2遺伝子、 MCL1遺伝子、 BCLXL遺伝子、 DCK1遺伝子、 TOP1遣 伝子、および、 TOP2A遺伝子からなる群の ABC トランスポーター系遗伝子、 BCL2 ファミ リ一遺伝子または DNA合成関連遺伝子から選ばれる 1種以上の遺伝子を 含有する DN A定着基盤である、 請求項 5記載の検出方法。
7. それぞれ異なる蛍光色素で標識した対照 DNAと薬剤耐性の獲得を検出する対象 となる被験癌細胞の D N Aを、 上記 DN A定着基盤上において同時に接触させて ハイプリダイズを行う ことにより得られる蛍光色を指標として、 被験 DNAの特 定領域の増幅または欠失を定量的に検出する、 請求項 4〜 6のいずれかに記載の 薬剤耐性獲得癌細胞の検出方法。
8. 上記 DN A定着基盤に定着される DNAと被験 DN Aと対照 D NAが、 ゲノム D NAである、 請求項 7記載の薬剤耐性獲得癌細胞の検出方法。
9. ABCA3 遺伝子、 ABCB6遺伝子、 ABCB8遺伝子、 ABCB 1 0遺伝子、 ABCC4 遺伝子、 ABCC 9遣伝子、 ABCD 3造伝子、 ABCD 4遺伝子、 ABCE 1遺伝子、 ABCF 2遺伝子、 BCL2L2遺伝子、 BCL2L10遺伝子、 BCL2L1遗伝子、および、 BCL2A1 遺伝子からなる群の ABC トランスポーター系遣伝子または BCL2ファミ リ一造 伝子から選ばれる 1種以上の遣伝子を含有する DNAが定着している、 DNAの 定着基盤。
1 0. さらに、 ABCB1遺伝子、 ABCC1 遺伝子、 ABCB11 遺伝子、 BCL2 遺伝子、 MCL1遺伝子、 BCLXL遺伝子、 DCK1遺伝子、 TOP1遺伝子、 および、 TOP2A 遣伝子からなる群の ABC トランスポーター系遺伝子、 BCL2フアミ リー遗伝子ま たは DN A合成関連遺伝子から選ばれる 1種以上の遣伝子を含有する複数種類の
DNAが定着している、 請求項 8記載の DNAの定着基盤。
1 1. 基盤に定着させる複数種類の DNAが、 ゲノム DNA、 c DNA, または、 合 成オリゴヌクレオチドである、 請求項 9または 10記載の DNAの定着基盤。
1 2.複数種類の D N Aがゲノム D N Aであり、かつ、当該ゲノム D N Aが、 BAC DNA、 YACDNA、 または、 PAC DNAの遣伝子増幅産物である、 請求項 1 1記載の DN
Aの定着基盤。
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