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WO2004111269A1 - Method for the real-time quantification of a nucleic acid - Google Patents

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Publication number
WO2004111269A1
WO2004111269A1 PCT/EP2004/006382 EP2004006382W WO2004111269A1 WO 2004111269 A1 WO2004111269 A1 WO 2004111269A1 EP 2004006382 W EP2004006382 W EP 2004006382W WO 2004111269 A1 WO2004111269 A1 WO 2004111269A1
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WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
electrode
probe
nucleic acid
hybridization
membrane
Prior art date
Application number
PCT/EP2004/006382
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German (de)
French (fr)
Inventor
Roland Barten
Hans Kosak
Dirk Kuhlmeier
Jörg HASSMANN
Ludek Havran
Jürgen SCHÜLEIN
Maria KÖBLER
Original Assignee
November Aktiengesellschaft
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by November Aktiengesellschaft filed Critical November Aktiengesellschaft
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Priority to EP04736745A priority patent/EP1673469A1/en
Publication of WO2004111269A1 publication Critical patent/WO2004111269A1/en

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6825—Nucleic acid detection involving sensors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6823—Release of bound markers

Definitions

  • the invention relates to a method for real-time quantification of a nucleic acid by means of a nucleic acid multiplication reaction.
  • the invention further relates to the use of an electrode and a probe for real-time quantification of a nucleic acid.
  • the nucleic acid amplification reaction can be, for example, a polymerase chain reaction (PCR) or a ligase chain reaction (LCR).
  • PCR polymerase chain reaction
  • LCR ligase chain reaction
  • Real-time quantification of a nucleic acid by means of a nucleic acid amplification reaction means methods in which the changing amount of nucleic acid is determined in a reaction mixture during the nucleic acid amplification reaction.
  • the amount of nucleic acid generated in the nucleic acid amplification reaction is usually measured at least once in each cycle of the nucleic acid amplification reaction. Such methods are known in the prior art.
  • At least one primer having an intramolecular hybridization or at least one probe specifically forming a hybridization with the nucleic acid is used.
  • the probe generally consists of nucleic acid.
  • the hybridization in the PCR is canceled or formed.
  • the cancellation or formation of the hybridization is detected by means of the specific fluorescence of fluorophores with which the primers or the probe are labeled.
  • a hairpin primer exhibits intramolecular hybridization on.
  • FRET fluorescence energy transfer
  • the intramolecular hybridization is released after the hairpin primer has been extended. The fluorescence energy transfer can no longer take place.
  • a hairpin probe forms an intramolecular hybridization.
  • two different fluorophores each arranged at distal ends of a DNA strand forming the hairpin probe, are located in the vicinity of one another in such a way that a FRET can take place.
  • the probe can hybridize with a PCR product while dissolving the intramolecular hybridization.
  • the distance between the fluorophores increases so that FRET can no longer take place.
  • the wavelength of the emitted light which can be measured as a measurement signal when a fluorophore is excited changes with the increase in the PCR product formed.
  • PCR uses a probe that can hybridize within the nucleic acid to be amplified during PCR.
  • the probe is labeled with a fluorophore at one end, while the other end has a fluorescence quenching molecule, a so-called fluorescence quencher. After excitation of the fluorophore, its fluorescence is released by the fluorescence quencher.
  • a Taq polymerase hydrolyzes the probe hybridized with the nucleic acid by its exonuclease activity, thus abolishing the hybridization.
  • the fluorophore and the fluorescence quencher are thereby spatially separated from one another and a detectable fluorescence signal is produced.
  • the fluorescence signal correlates with the increase in the PCR product formed.
  • hybridization probes which hybridize adjacent to the nucleic acid to be amplified.
  • the hybridization probes are each labeled with a fluorophore.
  • the fluorophores come so close to one another that FRET can take place. The more PCR product is formed, the more light is emitted by the other fluorophore when one fluorophore is excited and can be detected as a measurement signal.
  • the initial DNA content can be inferred from the measurement signal that can be measured during the PCR.
  • the disadvantage of these methods is that a complex device with optical components for excitation and detection of fluorescence is required to measure the fluorescence.
  • the measuring devices for real-time quantification of a nucleic acid are therefore relatively expensive.
  • a method is known from WO 01/40511 A2 in which a nucleic acid sequence to be detected in a sample is subjected to a amplification reaction, wherein electrochemical measurements are continuously carried out on the sample.
  • the amplification reaction can be carried out in the presence of a specific oligonucleotide probe which contains an electrochemical label.
  • the probe can be immobilized on a carrier, for example on an electrode. It can contain a pair of labels that differ in their redox properties when they are are arranged adjacent.
  • the probe can be degraded by hydrolysis during the amplification reaction, similar to a TaqMan probe, and the label can thereby be released.
  • the released marking thereby changes its distance from the other marking and can thus be distinguished from a non-released marking.
  • the disadvantage here is that the manufacture of the probes is relatively complex.
  • the object of the present invention is to provide an alternative method for real-time quantification and uses for real-time quantification by means of the method, the method being able to be carried out with a less complex measuring device.
  • a method for real-time quantification of a nucleic acid by means of a nucleic acid amplification reaction is provided, at least one probe which specifically forms a hybridization with the nucleic acid or its complementary counter-strand being present, the hybridization being carried out in the presence of the nucleic acid to be detected in the nucleic acid.
  • Reproduction reaction is canceled by enzymatic degradation of the probe, the cancellation of the hybridization is detected electrochemically.
  • the electrochemical detection of the cancellation of the hybridization is carried out preferably at least once in each cycle of the nucleic acid amplification reaction.
  • the hybridization can in principle be canceled in the same way as is known from the prior art: for example, a probe hybridized with the nucleic acid can be hydrolyzed by the activity of a polymerase in the PCR.
  • the probe has at least one electrochemically detectable marking substance, by means of which the electrochemical detection takes place.
  • the labeling substance can be bound to the probe.
  • the labeling substance can also be specific atoms or groups which are built directly into the probe as part of the probe.
  • Electrochemical detection is a direct detection of an electrochemical reaction by deriving an electrical signal at an electrode.
  • the device required for electrochemical detection can be further simplified compared to an indirect detection of an electrochemical reaction, such as, for example, when detecting electrochemiluminescence, because no optical components are required in addition to an electrode.
  • the elimination of the hybridization is detected electrochemically by the degradation products resulting from the enzymatic degradation containing the labeling substance being detected electrochemically.
  • the degradation products can be nucleotides or oligonucleotides consisting of less than 10, preferably less than 5 nucleotides, or the labeling substance itself released by the enzymatic degradation. The access of the intact probe, but not the access of the degradation products of the probe to the electrode, is prevented.
  • the advantage of this measure is that no electrochemical distinction between the intact labeled probe and the degradation products of the probe generated by the nucleic acid amplification reaction has to be made possible. Such a distinction would be, for example the provision of a further substance on the probe is possible, which changes the redox potential of the labeling substance depending on its distance from it. Removing the probe would change the distance between the substance and the probe. Such measures are not necessary in the method according to the invention. As a result, probes of relatively simple construction can be used.
  • the labeling substance can be, for example, fluorophores with specific electrochemical properties.
  • the nucleic acid multiplication reaction is preferably a polymerase chain reaction (PCR).
  • the degradation can take place through the activity of a nuclease, in particular a DNA polymerase with exonuclease activity used for the amplification in the PCR.
  • the labeling substance can be redox-active.
  • the labeling substance can be an osmium complex, a nanogold particle, a cysteine, ferrocenyl, daunomycin, benzoquinone, naphthoquinone, anthraquinone or p-aminophenol group, a dye, in particular indophenol, thiazine or phenazine, or a Fluorescent dye, in particular 6-FAM, HEX, TET, Cy3, Cy5, IRDye TM 700, IRDye IM 800, Biodipy, Flourescein, Joe, Rox, TAMRA or Texas Red, or a fluorescence quencher.
  • the probes used for the known methods based on fluorescence measurements can mostly be used directly for the method according to the invention.
  • the probes can e.g. B. be marked with a fluorophore, two fluorophores or a fluorophore and a fluorescence quencher.
  • the fluorophore and the fluorescence quencher can each act as a labeling substance.
  • Access of the intact probe to the electrode can be prevented by separating the electrode from the probe by means of a membrane or electrode coating preventing the probe from accessing the electrode, the membrane or the electrode coating being continuous for degradation products of the probe, in particular for the marking substance is.
  • the degradation products can arise from the probe during its degradation through the activity of a polymerase.
  • a signal can only be generated if the probe is dismantled and thus the degradation products of the probe can penetrate the membrane or electrode coating.
  • the degradation products can have the marking substance.
  • the degradation product can also be the marking substance itself.
  • Another advantage of providing the membrane or electrode coating is that it can prevent the reagents required for the nucleic acid amplification reaction, such as. B. the DNA polymerase, reach the electrode. This can ensure that these reagents are not inactivated by oxidative or reductive processes. Furthermore, it can be avoided that disruptive electrochemical signals are generated by these reagents.
  • Access of the intact probe to the electrode can also be prevented by the probe being located at a location remote from the electrode, e.g. B. a wall of a vessel in which the inventive method is carried out, or is immobilized on a particle.
  • the probe immobilized on particles can e.g. B. also thereby be prevented that the particles are magnetic particles which are removed from the electrode by application of a magnetic field.
  • the particles can interact with the membrane or electrode coating in that the membrane or electrode coating prevents the passage of the particles through the membrane or electrode coating and thereby prevents the probe from accessing the electrode.
  • the electrode coating can be formed from polyacrylamide or polyvinylpyrrolidone. This enables the electrode coating to be produced easily, for example by means of spin coating or by immersing the electrode in an acrylamide solution.
  • the polymerization can be triggered electrochemically by applying an electrical potential to the electrode.
  • the density of the electrode coating and thus its permeability can be determined by the acrylamide concentration, the concentration of a crosslinking agent, such as bisacrylamide, and the duration of the polymerization.
  • the electrode is preferably connected to the membrane, in particular a dialysis membrane.
  • the membrane or the electrode coating can completely or partially surround the electrode. Such an electrode facilitates the implementation of the method.
  • the electrode can be a carbon electrode, in particular a screen print, pencil, a glassy carbon, a pyrolitic graphite or a plastic composite electrode, preferably a polycarbonate electrode containing graphite.
  • the screen print electrode is an electrode manufactured using the screen printing process.
  • a conventional pencil lead can be used as the pencil electrode.
  • the polycarbonate electrode containing graphite is also referred to as a polycarbonate / graphite electrode.
  • the manufacture of carbon electrodes can be made very inexpensively the. It is thus possible, for example, to produce specially coated electrodes for single use. As a result, the reproducibility of the method can be increased, since subsequent measurements are not influenced by a previous measurement by residues remaining on the electrodes.
  • the conditions under which the nucleic acid amplification reaction takes place can be harmful to the electrode or the electrode coating or the membrane, in particular in the case of a PCR, for example as a result of the cyclical temperature fluctuations. It is therefore advantageous if the electrode is brought into contact with a solution in which the nucleic acid amplification reaction takes place essentially only during the electrochemical detection, in particular at a defined temperature.
  • the temperature can be a temperature occurring in the nucleic acid amplification reaction.
  • the electrode can only be brought into contact with the solution at the same temperature in each cycle of the nucleic acid amplification reaction. This can prevent the measurement from being affected by damage to the electrode.
  • the electrode for real-time quantification of a nucleic acid by means of a method according to the invention.
  • the electrode can have a membrane or electrode coating preventing the probe from accessing a probe which specifically forms a hybridization and which forms an electrochemically detectable marking substance with the nucleic acid or its complementary counter-strand.
  • the membrane is connected to the electrode.
  • the membrane or the electrode coating is continuous for the degradation products of the probe containing the marking substance.
  • the probe's degradation products can contain nucleotides from less than 10 preferably less than 5 nucleotides consisting of oligonucleotides or the electrochemically detectable labeling substance of the probe released by enzymatic degradation.
  • the invention provides for the use of a probe that specifically forms a hybridization with a nucleic acid or its complementary counter-strand for real-time quantification of the nucleic acid by means of a method according to the invention, the probe being labeled with a fluorophore or two fluorophores or one fluorophore and a fluorescence quencher is.
  • La-c a schematic representation of a method according to the invention, in which a probe provided with an electrochemical marker is hydrolyzed by the exonuclease activity of a polymerase,
  • 3a-f show a schematic representation of a method according to the invention with a probe which has immobilized electrochemical marking substances at a point remote from an electrode.
  • a probe 18 binds specifically to the nucleic acid 10 to be quantified.
  • the nucleic acid 10 is amplified by means of the primers 14 and 12 in a PCR with the aid of the DNA polymerase 16 which has an exonuclease activity.
  • 1b schematically represents the extension of the first primer 12 by the activity of the DNA polymerase 16. If the DNA polymerase 16 encounters the probe 18 hybridized with the nucleic acid 10 when the first primer 12 is extended, it degrades it enzymatically.
  • the resulting nucleotides 21, 22, 24, 26 and 28 detach from the nucleic acid 10 and can diffuse to an electrode 30 shown in FIG. 1c.
  • the electrode 30 is protected from direct access by the probe 18 by means of an electrode coating 32.
  • the nucleotide 21 which has the marking substance 20 or the split-off marking substance 20 alone can penetrate the electrode coating 32.
  • the marking substance 20 can be detected on the electrode 30 on the basis of its electrochemical properties.
  • Coated electrodes 30 were used to determine the measurement results shown in FIGS. 2a and 2b.
  • Thin-layer gold electrodes were used to produce the coated electrodes 30. These consisted of polypropylene foil, on which 200 nm gold was sputtered in a vacuum evaporation system.
  • the thin-film gold electrodes were coated with the polymer PVP K90. PVP K90 and all other chemicals mentioned below were obtained from Fluka, Industriestrasse 25, CH-9471 Buchs SG, Switzerland, unless otherwise stated. The coating was carried out as follows:
  • the PVP K90 solution was mixed with the DIAS solution in a ratio of 1: 2, so that a coating solution with the following final concentrations was present: 2.5% (w / v) PVP K90 and 1.5% (w / v) DIAS;
  • the thin-layer gold electrodes were applied to a sample plate of a spin coating device and cleaned first with isopropanol and then with deionized water;
  • the aminosilane solution was applied to the electrodes and the sample plate was rotated for 1 min at 6000 revolutions / min;
  • the coating solution was applied to the electrode and the sample plate was rotated for 1 min at 6000 revolutions / min;
  • the electrodes were irradiated with UV light for 2 min;
  • the thickness of the resulting polymer layer was estimated using "surface enhanced reflection". For this purpose, a 20 nm thick gold cluster layer was sputtered onto the polymer layer.
  • the resulting color of the gold cluster layer corresponded to a layer thickness of the polymer of 300 to 400 nm.
  • a ferrocene group (FC) was coupled at the 5 'end to a 23 nucleotide long oligonucleotide with the sequence SEQ ID NO: 1 in accordance with the attached sequence listing.
  • the ferrocene group should serve as an electrochemical marker in the subsequent experiment.
  • the coupling of the ferrocene group to the oligonucleotide was carried out as follows:
  • a solution of 100 ⁇ mol / 1 of the oligonucleotide with the sequence SEQ ID NO: 1 was prepared in deionized water in accordance with the sequence protocol attached. 5 ⁇ 2 ⁇ l of the solution of the activated ferrocene carboxylic acid NHS ester were added in succession to 200 ⁇ l of the solution of the oligonucleotide and incubated for 5 hours at room temperature in a thermoshaker at 500 revolutions / min. Then 1 ml Butanol was added to the reaction mixture at room temperature, mixed thoroughly, centrifuged off the precipitated oligonucleotide and the supernatant removed. The process was repeated four times.
  • oligonucleotide was dissolved in 200 ⁇ l 0.1 mol / 1 potassium phosphate buffer, pH 7.0 (KKP).
  • the "nucleobond" ion exchange column from MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG, Valencienner Strasse 11, 52355 Düren, Germany, was used to separate the oligonucleotide with the ferrocene group (oligo-2-Fc) coupled to it from the remaining oligonucleotide.
  • the column was first equilibrated with KPP.
  • the oligonucleotide dissolved in 200 ⁇ l KPP was applied to the column. Then 1 ml of KPP was applied to the column 5 times in succession.
  • Bound DNA was eluted with 0.1 mol / 1 sodium carbonate buffer, pH 11.2 (Na 2 CO 3 buffer). For this purpose, 1 ml Na 2 CO 3 buffer was applied to the column 5 times in succession. The solution dripping out of the column was collected in fractions. The DNA content of the fractions was determined photometrically. The oligo-2-Fc was precipitated using butanol and taken up in 20 mmol / 1 Tris-HCl, 100 mmol / 1 KCl, 1 mmol / 1 MgCl 2 , pH 7.4 (measuring buffer).
  • coated and uncoated electrodes were characterized electrochemically using differential pulse voltammetry.
  • electrodes were incubated in measuring buffers and measured using DPV.
  • oligo-2-Fc was added in a final concentration of 50 ⁇ mol / 1 and the DPV measurement was repeated.
  • the measurement buffer with Oligo-2-Fc was then removed and replaced with the measurement buffer.
  • the measuring buffer FcCOOH was added in a final concentration of 50 ⁇ mol / 1 and a further DPV measurement was carried out.
  • FIG. 2a and 2b show the results of DPV measurements carried out in each case by means of an uncoated (FIG. 2a) and the coated gold electrode (FIG. 2b).
  • the DPV measurements were evaluated using the AUTOLAB software GPES from Eco Chemie BV, Kanaalweg 29 G, 3526 KM Utrecht, The Netherlands. The measurement results have been background-adjusted using the "Moving Average" function.
  • the impermeability of the coating to the majority of the oligonucleotides is shown by the fact that the peak caused by the ferrocene group on the oligo-2-Fc is significantly lower in the coated electrode compared to the uncoated electrode.
  • the impermeability of the coating to the oligonucleotide could be increased further by increasing the concentration of the polymer used to produce the coating or the thickness of the coating.
  • the permeability of the coating for low molecular weight substances is shown by the fact that FcCOOH causes a clear peak in both the coated and the uncoated electrode.
  • the probe 18 is immobilized on a carrier 34.
  • the double-stranded nucleic acid 8, 10 has been denatured, the single-stranded nucleic acid 10 hybridizes with the immobilized probe 18 (FIG. 3b).
  • the primer 12 attaches to the nucleic acid 10 (FIG. 3c) and is extended by the DNA polymerase 16 (FIG. 3d).
  • the exonuclease activity of the polymerase 16 degrades the probe 18 and the labeling substances 20 or nucleotides containing the labeling substance 20 are released (FIG. 3e).
  • the released marking substances 20 can then diffuse to electrode 30 and be detected there electrochemically (FIG. 3f).

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Abstract

The invention relates to a method for the real-time quantification of a nucleic acid (10) by means of a nucleic acid duplicating reaction in the presence of at least one probe (18) that specifically hybridizes with said nucleic acid (10) or the complementary counter-strand (8) thereof. Hybridization is canceled by means of enzymatic degradation of the probe (18) if the nucleic acid that is to be detected is present during the nucleic acid duplicating reaction, canceling of the hybridization process being detected in an electrochemical manner. Said probe (18) comprises at least one electrochemically detectable marker (20) by means of which electrochemical detection occurs, said electrochemical detection being direct proof of an electrochemical reaction by discharging an electrical signal on an electrode. The intact probe (18) is prevented from accessing the electrode (30) while the degradation products of the probe (18) are not.

Description

Verfahren zum. Echtzeit-Quantifizieren einer NukleinsäureProcess for. Real time quantification of a nucleic acid
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Echtzeit-Quantifi- zieren einer Nukleinsäure mittels einer Nukleinsäure-Verviel- fältigungsreaktion. Weiterhin betrifft die Erfindung die Verwendung einer Elektrode und einer Sonde zum Echtzeit-Quanti- fizieren einer Nukleinsäure.The invention relates to a method for real-time quantification of a nucleic acid by means of a nucleic acid multiplication reaction. The invention further relates to the use of an electrode and a probe for real-time quantification of a nucleic acid.
Bei der Nukleinsäure-Vervielfältigungsreaktion kann es sich beispielsweise um eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) oder eine Ligase-Kettenreaktion (LCR) handeln. Bei einer Nuklein- säure-Vervielfältigungsreaktion erfolgt im Allgemeinen ein zyklisches Durchlaufen definierter erhöhter Temperaturschritte. Unter Echtzeit-Quantifizieren einer Nukleinsäure mittels einer Nukleinsäure-Vervielfältigungsreaktion werden Verfahren verstanden, bei denen während der Nukleinsäure-Verfältigungsreaktion in einem Reaktionsansatz die sich ändernde Menge der Nukleinsäure bestimmt wird. Dabei wird üblicherweise in jedem Zyklus der Nukleinsäure-Vervielfältigungsreaktion mindestens einmal die Menge der bei der Nukleinsäure-Vervielfältigungsreaktion erzeugten Nukleinsäure gemessen. Im Stand der Technik sind solche Verfahren bekannt. Dabei wird mindestens ein eine intramolekulare Hybridisierung aufweisender Primer oder mindestens eine mit der Nukleinsäure spezifisch eine Hybridisierung ausbildende Sonde eingesetzt. Die Sonde besteht im Allgemeinen aus Nukleinsäure. Bei den Verfahren wird die Hybridisierung bei der PCR aufgehoben oder gebildet. Das Aufheben oder Bilden der Hybridisierung wird mittels der spezifischen Fluoreszenz von Fluorophoren nachgewiesen, mit denen die Primer oder die Sonde markiert sind. Es sind, z. B. aus Didenko V.V. , BioTechniques Band 31 Nr. 5 (2001), Seiten 1106 bis 1121, die folgenden Prinzipien bekannt:The nucleic acid amplification reaction can be, for example, a polymerase chain reaction (PCR) or a ligase chain reaction (LCR). In the case of a nucleic acid multiplication reaction, there is generally a cyclical run through defined elevated temperature steps. Real-time quantification of a nucleic acid by means of a nucleic acid amplification reaction means methods in which the changing amount of nucleic acid is determined in a reaction mixture during the nucleic acid amplification reaction. The amount of nucleic acid generated in the nucleic acid amplification reaction is usually measured at least once in each cycle of the nucleic acid amplification reaction. Such methods are known in the prior art. At least one primer having an intramolecular hybridization or at least one probe specifically forming a hybridization with the nucleic acid is used. The probe generally consists of nucleic acid. In the methods, the hybridization in the PCR is canceled or formed. The cancellation or formation of the hybridization is detected by means of the specific fluorescence of fluorophores with which the primers or the probe are labeled. There are e.g. B. from Didenko V.V. , BioTechniques Volume 31 No. 5 (2001), pages 1106 to 1121, the following principles are known:
- Durchführen einer PCR in Gegenwart von "Hairpin-Primern" . Ein Hairpin-Primer weist eine intramolekulare Hybridisierung auf. Dadurch befinden sich zwei an entfernten Enden des Hair- pin-Primer-DNA-Strangs angeordnete unterschiedliche Fluoro- phore so in Nachbarschaft zueinander, dass ein Fluoreszenz- Energietransfer (FRET) stattfinden kann. Bei der PCR löst sich nach der Verlängerung des Hairpin-Primers die intramolekulare Hybridiεierung. Der Fluoreszenz-Energietransfer kann nicht mehr stattfinden. Mit zunehmender Bildung eines PCR- Produkts wird bei Anregung des einen Fluorophors Licht von diesem statt von dem anderen Fluorophor emittiert. Dadurch ändert sich die Wellenlänge des als Messsignal messbaren emittierten Lichts.- Performing a PCR in the presence of "hairpin primers". A hairpin primer exhibits intramolecular hybridization on. As a result, two different fluorophores arranged at distant ends of the hairpin primer DNA strand are located in the vicinity of one another in such a way that fluorescence energy transfer (FRET) can take place. In PCR, the intramolecular hybridization is released after the hairpin primer has been extended. The fluorescence energy transfer can no longer take place. With the increasing formation of a PCR product, when one fluorophore is excited, light is emitted by this instead of the other fluorophore. This changes the wavelength of the emitted light that can be measured as a measurement signal.
Durchführung einer PCR in Gegenwart von "Hairpin-Sonden" . Eine Hairpin-Sonde bildet eine intramolekulare Hybridisierung aus. Dadurch befinden sich zwei jeweils an entfernten Enden eines die Hairpin-Sonde bildenden DNA-Strangs angeordnete unterschiedliche Fluorophore so in Nachbarschaft zueinander, dass ein FRET stattfinden kann. Die Sonde kann unter Auflösung der intramolekularen Hybridisierung mit einem PCR-Pro- dukt hybridisieren. Dabei vergrößert sich der Abstand zwischen den Fluorophoren so, dass kein FRET mehr stattfinden kann. Die Wellenlänge des bei Anregung des einen Fluorophors als Messsignal messbaren emittierten Lichts ändert sich mit der Zunahme an gebildetem PCR-Produkt.Carrying out a PCR in the presence of "hairpin probes". A hairpin probe forms an intramolecular hybridization. As a result, two different fluorophores, each arranged at distal ends of a DNA strand forming the hairpin probe, are located in the vicinity of one another in such a way that a FRET can take place. The probe can hybridize with a PCR product while dissolving the intramolecular hybridization. The distance between the fluorophores increases so that FRET can no longer take place. The wavelength of the emitted light which can be measured as a measurement signal when a fluorophore is excited changes with the increase in the PCR product formed.
TaqMan-Prinzip : Bei der PCR wird eine Sonde eingesetzt, die innerhalb der bei der PCR zu amplifizierenden Nukleinsäure hybridisieren kann. Die Sonde ist an einem Ende mit einem Fluorophor markiert, während das andere Ende ein Fluoreszenzlöschendes Molekül, einen so genannten Fluoreszenz-Quencher , aufweist. Nach Anregung des Fluorophors wird dessen Fluoreszenz vom Fluoreszenz-Quencher gelöst. Während der DNA-Synthese bei der PCR hydrolysiert eine Taq-Polymerase die mit der Nukleinsäure hybridisierte Sonde durch ihre Exonuklease- Aktivität und hebt so die Hybridisierung auf. Das Fluorophor und der Fluoreszenz-Quencher werden dadurch räumlich voneinander getrennt und es entsteht ein detektierbares Fluoreszenzsignal. Das Fluoreszenzsignal korreliert mit der Zunahme an gebildetem PCR-Produkt.TaqMan principle: PCR uses a probe that can hybridize within the nucleic acid to be amplified during PCR. The probe is labeled with a fluorophore at one end, while the other end has a fluorescence quenching molecule, a so-called fluorescence quencher. After excitation of the fluorophore, its fluorescence is released by the fluorescence quencher. During DNA synthesis during PCR, a Taq polymerase hydrolyzes the probe hybridized with the nucleic acid by its exonuclease activity, thus abolishing the hybridization. The fluorophore and the fluorescence quencher are thereby spatially separated from one another and a detectable fluorescence signal is produced. The fluorescence signal correlates with the increase in the PCR product formed.
- Durchführen einer PCR in Gegenwart von zwei Hybridisie- rungssonden, welche auf der zu amplifizierenden Nukleinsäure benachbart hybridisieren. Die Hybridisierungssonden sind jeweils mit einem Fluorophor markiert. Die Fluorophore kommen im Falle der Hybridisierung beider Sonden so in Nachbarschaft zueinander, dass ein FRET stattfinden kann. Je mehr PCR-Pro- dukt gebildet wird, desto mehr Licht wird bei der Anregung des einen Fluorophors vom anderen Fluorophor emittiert und kann als Messsignal erfasst werden.- Performing a PCR in the presence of two hybridization probes, which hybridize adjacent to the nucleic acid to be amplified. The hybridization probes are each labeled with a fluorophore. In the case of hybridization of the two probes, the fluorophores come so close to one another that FRET can take place. The more PCR product is formed, the more light is emitted by the other fluorophore when one fluorophore is excited and can be detected as a measurement signal.
Bei allen genannten Verfahren kann aus dem während der PCR messbaren Messsignal auf den Anfangsgehalt an DNA geschlossen werden .In all the methods mentioned, the initial DNA content can be inferred from the measurement signal that can be measured during the PCR.
Nachteilig ist bei diesen Verfahren, dass zum Messen der Fluoreszenz eine aufwändige Vorrichtung mit optischen Komponenten zur Anregung und Detektion von Fluoreszenz erforderlich ist. Die Messgeräte zum Echtzeit-Quantifizieren einer Nukleinsäure sind daher verhältnismäßig teuer.The disadvantage of these methods is that a complex device with optical components for excitation and detection of fluorescence is required to measure the fluorescence. The measuring devices for real-time quantification of a nucleic acid are therefore relatively expensive.
Aus der WO 01/40511 A2 ist ein Verfahren bekannt, bei dem eine nachzuweisende Nukleinsäuresequenz in einer Probe einer Vervielfältigungsreaktion unterworfen wird, wobei kontinuierlich elektrochemische Messungen an der Probe vorgenommen werden. Die Vervielfältigungsreaktion kann in Gegenwart einer spezifischen Oligonukleotidsonde durchgeführt werden, welche eine elektrochemische Markierung enthält. Die Sonde kann auf einem Träger, beispielsweise auf einer Elektrode, immobilisiert sein. Sie kann ein Paar von Markierungen enthalten, die sich in ihren Redoxeigenschaften unterscheiden, wenn sie be- nachbart angeordnet sind. Die Sonde kann durch eine Hydrolyse während der Vervielfältigungsreaktion, ähnlich einer TaqMan- Sonde, abgebaut und die Markierung dadurch freigesetzt werden. Die freigesetzte Markierung ändert dadurch ihren Abstand zu der anderen Markierung und kann dadurch von einer nicht freigesetzten Markierung unterschieden werden. Nachteilig ist dabei, dass die Herstellung der Sonden verhältnismäßig aufwändig ist.A method is known from WO 01/40511 A2 in which a nucleic acid sequence to be detected in a sample is subjected to a amplification reaction, wherein electrochemical measurements are continuously carried out on the sample. The amplification reaction can be carried out in the presence of a specific oligonucleotide probe which contains an electrochemical label. The probe can be immobilized on a carrier, for example on an electrode. It can contain a pair of labels that differ in their redox properties when they are are arranged adjacent. The probe can be degraded by hydrolysis during the amplification reaction, similar to a TaqMan probe, and the label can thereby be released. The released marking thereby changes its distance from the other marking and can thus be distinguished from a non-released marking. The disadvantage here is that the manufacture of the probes is relatively complex.
Aus Torimura M. et al . , Analytical Sciences, Januar 2001, Band 17, Seiten 155 bis 160 ist es bekannt, dass Fluoreszenzfarbstoffe elektrochemisch messbare Eigenschaften aufweisen können .From Torimura M. et al. , Analytical Sciences, January 2001, Volume 17, pages 155 to 160, it is known that fluorescent dyes can have electrochemically measurable properties.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein alternatives Verfahren zum Echtzeit-Quantifizieren und Verwendungen zum Echtzeit-Quantifizieren mittels des Verfahrens bereitzustellen, wobei das Verfahren mit einer weniger aufwändigen Messvorrichtung durchführbar ist.The object of the present invention is to provide an alternative method for real-time quantification and uses for real-time quantification by means of the method, the method being able to be carried out with a less complex measuring device.
Diese Aufgabe wird durch die Merkmale der Patentansprüche 1, 13 und 15 gelöst. Zweckmäßige Ausgestaltungen ergeben sich aus den Merkmalen der Ansprüche 2 bis 12 und 14.This object is solved by the features of claims 1, 13 and 15. Appropriate configurations result from the features of claims 2 to 12 and 14.
Erfindungsgemäß ist ein Verfahren zum Echtzeit-Quantifizieren einer Nukleinsäure mittels einer Nukleinsäure-Vervielfälti- gungsreaktion vorgesehen, wobei dabei mindestens eine mit der Nukleinsäure oder deren komplementären Gegenstrang spezifisch eine Hybridisierung ausbildende Sonde anwesend ist, wobei die Hybridisierung bei Anwesenheit der nachzuweisenden Nukleinsäure bei der Nukleinsäure-Vervielfältigungsreaktion durch enzymatischen Abbau der Sonde aufgehoben wird, wobei das Aufheben der Hybridisierung elektrochemisch nachgewiesen wird. Beim erfindungsgemäßen Echtzeit-Quantifizieren erfolgt das elektrochemische Nachweisen des Aufhebens der Hybridisierung vorzugsweise mindestens einmal in jedem Zyklus der Nuklein- säure-Vervielfältigungsreaktion. Das Aufheben der Hybridisierung kann dabei grundsätzlich in gleicher Weise erfolgen, wie es aus dem Stand der Technik bekannt ist: Beispielsweise kann eine mit der Nukleinsäure hybridisierte Sonde durch die Aktivität einer Polymerase bei der PCR hydrolysiert werden. Die Sonde weist mindestens eine elektrochemisch nachweisbare Markierungssubstanz auf, mittels welcher das elektrochemische Nachweisen erfolgt. Die MarkierungsSubstanz kann dabei an die Sonde gebunden sein. Es kann sich bei der Markierungssubstanz aber auch um bestimmte Atome oder Gruppen handeln, welche direkt als Bestandteil der Sonde in die Sonde eingebaut sind.According to the invention, a method for real-time quantification of a nucleic acid by means of a nucleic acid amplification reaction is provided, at least one probe which specifically forms a hybridization with the nucleic acid or its complementary counter-strand being present, the hybridization being carried out in the presence of the nucleic acid to be detected in the nucleic acid. Reproduction reaction is canceled by enzymatic degradation of the probe, the cancellation of the hybridization is detected electrochemically. In real-time quantification according to the invention, the electrochemical detection of the cancellation of the hybridization is carried out preferably at least once in each cycle of the nucleic acid amplification reaction. The hybridization can in principle be canceled in the same way as is known from the prior art: for example, a probe hybridized with the nucleic acid can be hydrolyzed by the activity of a polymerase in the PCR. The probe has at least one electrochemically detectable marking substance, by means of which the electrochemical detection takes place. The labeling substance can be bound to the probe. However, the labeling substance can also be specific atoms or groups which are built directly into the probe as part of the probe.
Der elektrochemische Nachweis ist ein direkter Nachweis einer elektrochemischen Reaktion durch Ableiten eines elektrischen Signals an einer Elektrode. Dadurch kann gegenüber einem indirekten Nachweis einer elektrochemischen Reaktion, wie beispielsweise beim Nachweis einer Elektrochemilumineszenz, die zum elektrochemischen Nachweis erforderliche Vorrichtung weiter vereinfacht werden, weil neben einer Elektrode keine optischen Komponenten erforderlich sind. Das Aufheben der Hybridisierung wird elektrochemisch nachgewiesen, indem die durch den enzymatischen Abbau entstehenden die Markierungssubstanz enthaltenden Abbauprodukte elektrochemisch nachgewiesen werden. Bei den Abbauprodukten kann es sich um Nukleotide oder um aus weniger als 10, vorzugsweise weniger als 5, Nukleotiden bestehende Oligonukleotide oder die durch den enzymatischen Abbau freigesetzte Markierungssubstanz selbst handeln. Der Zugang der intakten Sonde, nicht aber der Zugang der Abbauprodukte der Sonde zur Elektrode wird verhindert . Der Vorteil dieser Maßnahme besteht darin, dass keine elektrochemische Unterscheidung zwischen der intakten markierten Sonde und der durch die Nukleinsäure-Vervielfältigungsreak- tion erzeugten Abbauprodukte der Sonde ermöglicht werden muss. Eine solche Unterscheidung wäre beispielsweise durch das Vorsehen einer weiteren Substanz an der Sonde möglich, welche das Redox-Potenzial der MarkierungsSubstanz in Abhängigkeit von ihrem Abstand dazu verändert. Durch den Abbau der Sonde würde sich der Abstand zwischen der Substanz und der Sonde ändern. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren sind solche Maßnahmen nicht erforderlich. Dadurch können verhältnismäßig einfach konstruierte Sonden verwendet werden. Bei der Markierungssubstanz kann es sich beispielsweise um spezifische elektrochemische Eigenschaften aufweisende Fluorophore handeln. Vorzugsweise handelt es sich bei der Nukleinsäure-Ver- vielfältigungsreaktion um eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) .Electrochemical detection is a direct detection of an electrochemical reaction by deriving an electrical signal at an electrode. As a result, the device required for electrochemical detection can be further simplified compared to an indirect detection of an electrochemical reaction, such as, for example, when detecting electrochemiluminescence, because no optical components are required in addition to an electrode. The elimination of the hybridization is detected electrochemically by the degradation products resulting from the enzymatic degradation containing the labeling substance being detected electrochemically. The degradation products can be nucleotides or oligonucleotides consisting of less than 10, preferably less than 5 nucleotides, or the labeling substance itself released by the enzymatic degradation. The access of the intact probe, but not the access of the degradation products of the probe to the electrode, is prevented. The advantage of this measure is that no electrochemical distinction between the intact labeled probe and the degradation products of the probe generated by the nucleic acid amplification reaction has to be made possible. Such a distinction would be, for example the provision of a further substance on the probe is possible, which changes the redox potential of the labeling substance depending on its distance from it. Removing the probe would change the distance between the substance and the probe. Such measures are not necessary in the method according to the invention. As a result, probes of relatively simple construction can be used. The labeling substance can be, for example, fluorophores with specific electrochemical properties. The nucleic acid multiplication reaction is preferably a polymerase chain reaction (PCR).
Der Abbau kann durch die Aktivität einer Nuklease, insbesondere einer zur Amplifikation bei der PCR verwendeten DNA- Polymerase mit Exonuklease-Aktivität , erfolgen.The degradation can take place through the activity of a nuclease, in particular a DNA polymerase with exonuclease activity used for the amplification in the PCR.
Die MarkierungsSubstanz kann Redox-aktiv sein. Die Markierungssubstanz kann ein Osmium-Komplex, ein Nanogold-Partikel , eine Cystein-, Ferrocenyl-, Daunomyzin-, Benzochinon-, Naphthochinon- , Anthrachinon- oder p-Aminophenol-Gruppe, ein Farbstoff, insbesondere Indophenol, Thiazin oder Phenazin, oder ein Fluoreszenzfarbstoff, insbesondere 6-FAM, HEX, TET, Cy3, Cy5, IRDye™700, IRDyeIM800, Biodipy, Flourescein, Joe, Rox, TAMRA oder Texas Red, oder ein Fluoreszenz-Quencher sein. Interessanterweise weisen die meisten Fluorophore und Fluoreszenz-Quencher eine elektrochemisch messbare Eigenschaft auf. Somit können die für die bekannten auf Fluoreszenzmessungen beruhenden Verfahren verwendeten Sonden meist direkt für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden. Die Sonden können z. B. mit einem Fluorophor, zwei Fluoropho- ren oder einem Fluorophor und einem Fluoreszenz-Quencher markiert sein. Das Fluorophor und der Fluoreszenz-Quencher kann dabei jeweils als Markierungssubstanz fungieren. Der Zugang der intakten Sonde zur Elektrode kann dadurch verhindert werden, dass die Elektrode von der Sonde durch eine den Zugang der Sonde zur Elektrode verhindernden Membran oder Elektrodenbeschichtung getrennt ist, wobei die Membran oder die Elektrodenbeschichtung für Abbauprodukte der Sonde, insbesondere für die Markierungssubstanz, durchgängig ist. Die Abbauprodukte können aus der Sonde bei deren Abbau durch die Aktivität einer Polymerase entstehen. Ein Signal kann nur entstehen, wenn die Sonde abgebaut wird und somit die Abbauprodukte der Sonde die Membran oder Elektrodenbeschichtung durchdringen können. Bei einer eine Markierungssubstanz aufweisenden Sonde können die Abbauprodukte die Markierungssubstanz aufweisen. Das Abbauprodukt kann auch die Markierungssubstanz selbst sein. Ein Vorteil des Vorsehens der Membran oder Elektrodenbeschichtung besteht auch darin, dass dadurch verhindert werden kann, dass für die Nukleinsäure-Vervielfäl- tigungsreaktion erforderliche Reagenzien, wie z. B. die DNA- Polymerase, zur Elektrode gelangen. Dadurch kann gewährleistet werden, dass diese Reagenzien nicht durch oxidative oder reduktive Prozesse inaktiviert werden. Weiterhin kann dadurch vermieden werden, dass störende elektrochemische Signale durch diese Reagenzien erzeugt werden.The labeling substance can be redox-active. The labeling substance can be an osmium complex, a nanogold particle, a cysteine, ferrocenyl, daunomycin, benzoquinone, naphthoquinone, anthraquinone or p-aminophenol group, a dye, in particular indophenol, thiazine or phenazine, or a Fluorescent dye, in particular 6-FAM, HEX, TET, Cy3, Cy5, IRDye ™ 700, IRDye IM 800, Biodipy, Flourescein, Joe, Rox, TAMRA or Texas Red, or a fluorescence quencher. Interestingly, most fluorophores and fluorescence quenchers have an electrochemically measurable property. Thus, the probes used for the known methods based on fluorescence measurements can mostly be used directly for the method according to the invention. The probes can e.g. B. be marked with a fluorophore, two fluorophores or a fluorophore and a fluorescence quencher. The fluorophore and the fluorescence quencher can each act as a labeling substance. Access of the intact probe to the electrode can be prevented by separating the electrode from the probe by means of a membrane or electrode coating preventing the probe from accessing the electrode, the membrane or the electrode coating being continuous for degradation products of the probe, in particular for the marking substance is. The degradation products can arise from the probe during its degradation through the activity of a polymerase. A signal can only be generated if the probe is dismantled and thus the degradation products of the probe can penetrate the membrane or electrode coating. In the case of a probe having a marking substance, the degradation products can have the marking substance. The degradation product can also be the marking substance itself. Another advantage of providing the membrane or electrode coating is that it can prevent the reagents required for the nucleic acid amplification reaction, such as. B. the DNA polymerase, reach the electrode. This can ensure that these reagents are not inactivated by oxidative or reductive processes. Furthermore, it can be avoided that disruptive electrochemical signals are generated by these reagents.
Der Zugang der intakten Sonde zur Elektrode kann auch dadurch verhindert werden, dass die Sonde an einer von der Elektrode entfernten Stelle, z. B. einer Wand eines Gefäßes in dem das erfindungsgemäße Verfahren durchgeführt wird, oder an einem Partikel immobilisiert ist. Dadurch ist es auf einfache Weise möglich zu verhindern, dass die Elektrode mit intakten, vollständigen Sonden in Kontakt kommt, die, z. B. auf Grund der gebundenen MarkierungsSubstanz, ein Signal auslösen würden. Die Abbauprodukte können erst zur Elektrode gelangen, wenn sie durch die Aktivität der Polymerase von der übrigbleibenden immobilisierten Sonde getrennt werden. Der Zugang der an Partikel immobilisierten Sonde kann z. B. auch dadurch ver- hindert werden, dass es sich bei den Partikeln um magnetische Partikel handelt, welche durch Anlegen eines magnetischen Felds von der Elektrode entfernt werden. Weiterhin können die Partikel mit der Membran oder Elektrodenbeschichtung zusammenwirken, indem die Membran oder Elektrodenbeschichtung den Durchgang der Partikel durch die Membran oder Elektrodenbeschichtung und dadurch den Zugang der Sonde zur Elektrode verhindert .Access of the intact probe to the electrode can also be prevented by the probe being located at a location remote from the electrode, e.g. B. a wall of a vessel in which the inventive method is carried out, or is immobilized on a particle. This makes it possible in a simple manner to prevent the electrode from coming into contact with intact, complete probes which, for. B. would trigger a signal due to the bound labeling substance. The degradation products can only reach the electrode if they are separated from the remaining immobilized probe by the activity of the polymerase. Access to the probe immobilized on particles can e.g. B. also thereby be prevented that the particles are magnetic particles which are removed from the electrode by application of a magnetic field. Furthermore, the particles can interact with the membrane or electrode coating in that the membrane or electrode coating prevents the passage of the particles through the membrane or electrode coating and thereby prevents the probe from accessing the electrode.
Die Elektrodenbeschichtung kann aus Polyacrylamid oder PoIy- vinylpyrrolidon gebildet sein. Das ermöglicht eine einfache Herstellung der Elektrodenbeschichtung, beispielsweise mittels Spin-Coating oder durch Eintauchen der Elektrode in eine Acrylamid-Lösung. Die Polymerisation kann elektrochemisch durch das Anlegen eines elektrischen Potenzials an der Elektrode ausgelöst werden. Die Dichte der Elektrodenbeschichtung und damit deren Permeabilität kann durch die Acrylamid-Konzentration, die Konzentration eines Quervernetzers, wie beispielsweise Bisacrylamid, und die Dauer der Polymerisation bestimmt werden. Vorzugsweise ist die Elektrode mit der Membran, insbesondere einer Dialyse-Membran, verbunden. Die Membran oder die Elektrodenbeschichtung kann die Elektrode vollständig oder teilweise umgeben. Eine solche Elektrode erleichtert die Durchführung des Verfahrens.The electrode coating can be formed from polyacrylamide or polyvinylpyrrolidone. This enables the electrode coating to be produced easily, for example by means of spin coating or by immersing the electrode in an acrylamide solution. The polymerization can be triggered electrochemically by applying an electrical potential to the electrode. The density of the electrode coating and thus its permeability can be determined by the acrylamide concentration, the concentration of a crosslinking agent, such as bisacrylamide, and the duration of the polymerization. The electrode is preferably connected to the membrane, in particular a dialysis membrane. The membrane or the electrode coating can completely or partially surround the electrode. Such an electrode facilitates the implementation of the method.
Die Elektrode kann eine Kohlenstoff-Elektrode, insbesondere eine Screen-Print- , Pencil-, eine Glassy-Carbon- , eine Pyro- lytic-Grafit- oder eine Kunststoff-Composit-Elektrode, vorzugsweise eine Grafit enthaltende Polycarbonat-Elektrode, sein. Bei der Screen-Print-Elektrode handelt es sich um eine im Siebdruckverfahren hergestellte Elektrode. Als Pencil- Elektrode kann eine herkömmliche Bleistiftmine verwendet werden. Die Grafit enthaltende Polycarbonat-Elektrode wird auch als Polycarbonat/Grafit-Elektrode bezeichnet. Die Herstellung von Kohlenstoff-Elektroden kann sehr preiswert gestaltet wer- den. Es ist damit möglich, beispielsweise speziell beschichtete Elektroden zum einmaligen Gebrauch herzustellen. Dadurch kann die Reproduzierbarkeit des Verfahrens erhöht werden, da nachfolgende Messungen nicht durch auf den Elektroden verbleibende Reste von einer vorherigen Messung beeinflusst werden.The electrode can be a carbon electrode, in particular a screen print, pencil, a glassy carbon, a pyrolitic graphite or a plastic composite electrode, preferably a polycarbonate electrode containing graphite. The screen print electrode is an electrode manufactured using the screen printing process. A conventional pencil lead can be used as the pencil electrode. The polycarbonate electrode containing graphite is also referred to as a polycarbonate / graphite electrode. The manufacture of carbon electrodes can be made very inexpensively the. It is thus possible, for example, to produce specially coated electrodes for single use. As a result, the reproducibility of the method can be increased, since subsequent measurements are not influenced by a previous measurement by residues remaining on the electrodes.
Die Bedingungen, bei denen die Nukleinsäure-Vervielfälti- gungsreaktion erfolgt, können, insbesondere bei einer PCR, beispielsweise infolge der zyklische Temperaturschwankungen, für die Elektrode oder die Elektrodenbeschichtung oder die Membran schädlich sein. Vorteilhaft ist es daher, wenn die Elektrode im Wesentlichen nur während des elektrochemischen Nachweises, insbesondere bei einer definierten Temperatur, mit einer Lösung in Kontakt gebracht wird, in der die Nukleinsäure-Vervielfältigungsreaktion stattfindet. Die Temperatur kann eine bei der Nukleinsäure-Vervielfältigungsreaktion vorkommende Temperatur sein. Die Elektrode kann in jedem Zyklus der Nukleinsäure-Vervielfältigungsreaktion jeweils immer nur bei der gleichen Temperatur mit der Lösung in Kontakt gebracht werden. Dadurch kann eine Beeinflussung der Messung durch eine Beschädigung der Elektrode vermieden werden.The conditions under which the nucleic acid amplification reaction takes place can be harmful to the electrode or the electrode coating or the membrane, in particular in the case of a PCR, for example as a result of the cyclical temperature fluctuations. It is therefore advantageous if the electrode is brought into contact with a solution in which the nucleic acid amplification reaction takes place essentially only during the electrochemical detection, in particular at a defined temperature. The temperature can be a temperature occurring in the nucleic acid amplification reaction. The electrode can only be brought into contact with the solution at the same temperature in each cycle of the nucleic acid amplification reaction. This can prevent the measurement from being affected by damage to the electrode.
Erfindungsgemäß ist weiterhin die Verwendung einer Elektrode zum Echtzeit-Quantifizieren einer Nukleinsäure mittels eines erfindungsgemäßen Verfahrens vorgesehen. Die Elektrode kann dazu eine den Zugang einer mit der Nukleinsäure oder deren komplementären Gegenstrang spezifisch eine Hybridisierung ausbildenden eine elektrochemisch nachweisbare Markierungssubstanz aufweisenden Sonde zu der Elektrode verhindernde Membran oder Elektrodenbeschichtung aufweisen. Die Membran ist dabei mit der Elektrode verbunden. Die Membran oder die Elektrodenbeschichtung ist für die Markierungssubstanz enthaltende Abbauprodukte der Sonde durchgängig. Die Abbauprodukte der Sonde können Nukleotide, aus weniger als 10, vor- zugsweise weniger als 5, Nukleotiden bestehende Oligonukleo- tide oder die durch enzymatischen Abbau freigesetzte elektrochemisch nachweisbare Markierungssubstanz der Sonde sein.According to the invention, the use of an electrode for real-time quantification of a nucleic acid by means of a method according to the invention is also provided. For this purpose, the electrode can have a membrane or electrode coating preventing the probe from accessing a probe which specifically forms a hybridization and which forms an electrochemically detectable marking substance with the nucleic acid or its complementary counter-strand. The membrane is connected to the electrode. The membrane or the electrode coating is continuous for the degradation products of the probe containing the marking substance. The probe's degradation products can contain nucleotides from less than 10 preferably less than 5 nucleotides consisting of oligonucleotides or the electrochemically detectable labeling substance of the probe released by enzymatic degradation.
Weiterhin ist erfindungsgemäß die Verwendung einer mit einer Nukleinsäure oder deren komplementären Gegenstrang spezifisch eine Hybridisierung ausbildenden Sonde zur Echtzeit-Quantifizierung der Nukleinsäure mittels eines erfindungsgemäßen Verfahrens vorgesehen, wobei die Sonde mit einem Fluorophor oder zwei Fluorophoren oder einem Fluorophor und einem Fluores- zenz-Quencher markiert ist.Furthermore, the invention provides for the use of a probe that specifically forms a hybridization with a nucleic acid or its complementary counter-strand for real-time quantification of the nucleic acid by means of a method according to the invention, the probe being labeled with a fluorophore or two fluorophores or one fluorophore and a fluorescence quencher is.
Nachfolgend werden Ausführungsbeispiele der Erfindung anhand der Zeichnung erläutert. Es zeigen:Exemplary embodiments of the invention are explained below with reference to the drawing. Show it:
Fig. la - c Eine schematische Darstellung eines erfindungsgemäßen Verfahrens, bei welchem eine mit einem elektrochemischen Markierungsstoff versehene Sonde durch die Exonu- klease-Aktivität einer Polymerase hydrolysiert wird,La-c a schematic representation of a method according to the invention, in which a probe provided with an electrochemical marker is hydrolyzed by the exonuclease activity of a polymerase,
Fig. 2a und b grafische Darstellungen von mittels Differen- zieller Puls-Voltammetrie (DPV) ermittelten Messergebnissen an unbeschichteten (Fig. 2a) und beschichteten (Fig. 2b) Goldelektroden und2a and b graphical representations of measurement results determined by means of differential pulse voltammetry (DPV) on uncoated (FIG. 2a) and coated (FIG. 2b) gold electrodes and
Fig. 3a - f eine schematische Darstellung eines erfindungsgemäßen Verfahrens mit einer an einer von einer Elektrode entfernten Stelle immobilisierten, elektrochemische Markierungssubstanzen aufweisenden Sonde.3a-f show a schematic representation of a method according to the invention with a probe which has immobilized electrochemical marking substances at a point remote from an electrode.
Bei dem in Fig. Ia bis c dargestellten Verfahren bindet eine Sonde 18 spezifisch an die zu quantifizierende Nukleinsäure 10. Die Nukleinsäure 10 wird mittels der Primer 14 und 12 bei einer PCR mit Hilfe der eine Exonuklease-Aktivität aufweisenden DNA-Polymerase 16 amplifiziert . An der Sonde 18 ist eine elektrochemisch nachweisbare MarkierungsSubstanz 20 gebunden. Fig. Ib stellt schematisch das Verlängern des ersten Primers 12 durch die Aktivität der DNA-Polymerase 16 dar. Stößt die DNA-Polymerase 16 beim Verlängern des ersten Primers 12 auf die mit der Nukleinsäure 10 hybridisierte Sonde 18, baut es diese enzymatisch ab. Die dadurch entstehenden Nukleotide 21, 22, 24, 26 und 28 lösen sich von der Nukleinsäure 10 ab und können zu einer in Fig. Ic dargestellten Elektrode 30 diffundieren. Die Elektrode 30 ist durch eine Elektrodenbeschich- tung 32 vor dem direkten Zugang der Sonde 18 geschützt. Das die MarkierungsSubstanz 20 aufweisende Nukleotid 21 oder die abgespaltene MarkierungsSubstanz 20 alleine kann die Elektro- denbeschichtung 32 jedoch durchdringen. Die MarkierungsSubstanz 20 kann auf Grund ihrer elektrochemischen Eigenschaften an der Elektrode 30 nachgewiesen werden.In the method shown in FIGS. 1a to c, a probe 18 binds specifically to the nucleic acid 10 to be quantified. The nucleic acid 10 is amplified by means of the primers 14 and 12 in a PCR with the aid of the DNA polymerase 16 which has an exonuclease activity. There is one on the probe 18 electrochemically detectable marker substance 20 bound. 1b schematically represents the extension of the first primer 12 by the activity of the DNA polymerase 16. If the DNA polymerase 16 encounters the probe 18 hybridized with the nucleic acid 10 when the first primer 12 is extended, it degrades it enzymatically. The resulting nucleotides 21, 22, 24, 26 and 28 detach from the nucleic acid 10 and can diffuse to an electrode 30 shown in FIG. 1c. The electrode 30 is protected from direct access by the probe 18 by means of an electrode coating 32. However, the nucleotide 21 which has the marking substance 20 or the split-off marking substance 20 alone can penetrate the electrode coating 32. The marking substance 20 can be detected on the electrode 30 on the basis of its electrochemical properties.
Für die Ermittlung der in den Figuren 2a und 2b dargestellten Messergebnisse wurden beschichtete Elektroden 30 verwendet. Zur Herstellung der beschichteten Elektroden 30 wurden Dünnschichtgoldelektroden eingesetzt. Diese bestanden aus Polypropylenfolie, auf welche in einer Vakuumbedampfungsanlage 200 nm Gold gesputtert wurde. Die Dünnschichtgoldelektroden wurden mit dem Polymer PVP K90 beschichtet. PVP K90 und alle weiteren im Folgenden genannten Chemikalien wurden von der Firma Fluka, Industriestrasse 25, CH-9471 Buchs SG, Schweiz, bezogen, wenn nichts anderes angegeben ist. Die Beschichtung ist wie folgt durchgeführt worden:Coated electrodes 30 were used to determine the measurement results shown in FIGS. 2a and 2b. Thin-layer gold electrodes were used to produce the coated electrodes 30. These consisted of polypropylene foil, on which 200 nm gold was sputtered in a vacuum evaporation system. The thin-film gold electrodes were coated with the polymer PVP K90. PVP K90 and all other chemicals mentioned below were obtained from Fluka, Industriestrasse 25, CH-9471 Buchs SG, Switzerland, unless otherwise stated. The coating was carried out as follows:
1. Ansetzten der Lösungen:1. Apply the solutions:
- Herstellen einer 10%igen (w/v) Lösung von PVP K90 in entionisiertem Wasser und verdünnen dieser Lösung mit reinem Ethanol im Verhältnis 1:2; Herstellen einer 3%igen (w/v) Lösung des Quervernet- zers 4, 4' -Diazidostilbene-2 , 2 ' -disulfonsäure (DIAS) in entionisiertem Wasser;- Prepare a 10% (w / v) solution of PVP K90 in deionized water and dilute this solution with pure ethanol in the ratio 1: 2; Preparation of a 3% (w / v) solution of the crosslinker 4, 4 '-diazidostilbene-2, 2' -disulfonic acid (DIAS) in deionized water;
Die PVP K90-Lösung wurde mit der DIAS-Lösung im Verhältnis 1:2 gemischt, so dass eine Beschichtungslösung mit folgenden Endkonzentrationen vorlag: 2,5 % (w/v) PVP K90 und 1,5 % (w/v) DIAS;The PVP K90 solution was mixed with the DIAS solution in a ratio of 1: 2, so that a coating solution with the following final concentrations was present: 2.5% (w / v) PVP K90 and 1.5% (w / v) DIAS;
Herstellen einer 5% (v/v) 3-Aminopropyl-methyl- diethoxysilan (Aminosilan) , 90% (v/v) Ethanol und 5% (v/v) entionisiertes Wasser enthaltenden Aminosilan- Lösung;Preparing an aminosilane solution containing 5% (v / v) 3-aminopropyl-methyl-diethoxysilane (aminosilane), 90% (v / v) ethanol and 5% (v / v) deionized water;
2. Spin Coating:2. Spin Coating:
Die Dünnschichtgoldelektroden wurden auf einen Probenteller eines Spin Coating-Geräts aufgebracht und zuerst mit Isopropanol und danach mit entionisiertem Wasser gereinigt;The thin-layer gold electrodes were applied to a sample plate of a spin coating device and cleaned first with isopropanol and then with deionized water;
Zum Beschichten mit Aminosilan wurde die Aminosilan- Lösung auf die Elektroden aufgebracht und der Probenteller für 1 min mit 6000 Umdrehungen/min gedreht;For coating with aminosilane, the aminosilane solution was applied to the electrodes and the sample plate was rotated for 1 min at 6000 revolutions / min;
Backen der Elektroden für 15 min bei 800C;Baking the electrodes for 15 min at 80 ° C.;
Zum Beschichten mit dem Polymer wurde die Beschichtungslösung auf die Elektrode aufgebracht und der Probenteller für 1 min mit 6000 Umdrehungen/min gedreht;For coating with the polymer, the coating solution was applied to the electrode and the sample plate was rotated for 1 min at 6000 revolutions / min;
sofort im Anschluss wurden die Elektroden für 2 min mit UV-Licht bestrahlt; Die Dicke der dabei entstandenen Polymerschicht wurde mit Hilfe von "Oberflächenverstärkter Reflexion" abgeschätzt. Dazu wurde auf die Polymerschicht eine 20 nm dicke Goldcluster- schicht aufgesputtert . Die dabei entstandene Farbe der GoId- clusterschicht entsprach einer Schichtdicke des Polymers von 300 bis 400 nm.immediately afterwards the electrodes were irradiated with UV light for 2 min; The thickness of the resulting polymer layer was estimated using "surface enhanced reflection". For this purpose, a 20 nm thick gold cluster layer was sputtered onto the polymer layer. The resulting color of the gold cluster layer corresponded to a layer thickness of the polymer of 300 to 400 nm.
An ein 23 Nukleotide langes Oligonukleotid mit der Sequenz SEQ ID NO : 1 gemäß dem anliegenden Sequenzprotokoll wurde am 5 ' -Ende eine Ferrocen-Gruppe (FC) gekoppelt. Die Ferrocen- Gruppe sollte beim nachfolgenden Experiment als elektrochemischer Marker dienen. Die Kopplung der Ferrocen-Gruppe an das Oligonukleotid erfolgte wie folgt:A ferrocene group (FC) was coupled at the 5 'end to a 23 nucleotide long oligonucleotide with the sequence SEQ ID NO: 1 in accordance with the attached sequence listing. The ferrocene group should serve as an electrochemical marker in the subsequent experiment. The coupling of the ferrocene group to the oligonucleotide was carried out as follows:
a) Synthese eines aktivierten Ferrocencarbonsäure-N- Hydroxysuccinimid-Esters :a) Synthesis of an activated ferrocene carboxylic acid N-hydroxysuccinimide ester:
Es wurden jeweils 100 μmol Ferrocencarbonsäure (FcCOOH) (23 mg), N-Hydroxysuccinimid (NHS) (11,5 mg) und Dicyclocarbodii- mid (DCC) (20,6 mg) zusammen in 500 μl Dimethylsufoxid (DMSO) gelöst und für 2 Stunden bei 650C im Thermoschüttler bei 500 Umdrehungen/min inkubiert.In each case 100 μmol ferrocene carboxylic acid (FcCOOH) (23 mg), N-hydroxysuccinimide (NHS) (11.5 mg) and dicyclocarbodiimide (DCC) (20.6 mg) were dissolved together in 500 μl dimethyl sulfoxide (DMSO) and made for Incubated for 2 hours at 65 0 C in a thermal shaker at 500 revolutions / min.
b) Kopplung des aktivierten Ferrocencarbonsäure-NHS-Esters an ein NH2-C6-DNA-Oligonukleotid:b) Coupling of the activated ferrocene carboxylic acid NHS ester to an NH 2 -C 6 DNA oligonucleotide:
Es wurde eine Lösung von 100 μmol/1 des Oligonukleotids mit der Sequenz SEQ ID NO :1 gemäß dem anliegenden Sequenzprotokoll in entionisiertem Wasser hergestellt. Von der Lösung des aktivierten Ferrocencarbonsäure-NHS-Esters wurden 5 x 2 μl nacheinander zu 200 μl der Lösung des Oligonukleotids gegeben und für 5 Stunden bei Raumtemperatur in einem Thermoschüttler bei 500 Umdrehungen/min inkubiert. Anschließend wurde 1 ml Butanol bei Raumtemperatur zu dem Reaktionsgemisch gegeben, gründlich gemischt, ausgefallenes Oligonukleotid abzentrifu- giert und der Überstand entfernt. Der Vorgang wurde vier mal wiederholt. Dann wurde das Oligonukleotid in 200 μl 0,1 mol/1 Kaliumphosphatpuffer, pH 7,0 (KKP) gelöst. Zur Trennung des Oligonukleotids mit daran gekoppelter Ferrocen-Gruppe (Oligo- 2-Fc) von restlichem Oligonukleotid wurde die Ionenaustauschersäule "Nukleobond" der Firma MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG, Valencienner Strasse 11, 52355 Düren, Deutschland, eingesetzt. Die Säule wurde zunächst mit KPP äquilibriert. Das in 200 μl KPP gelöste Oligonukleotid wurde auf die Säule aufgetragen. Anschließend wurde 5 mal nacheinander je 1 ml KPP auf die Säule gegeben. Gebundene DNA wurde mit 0,1 mol/1 Natrium- carbonatpuffer, pH 11,2 (Na2CO3-PUffer) eluiert. Dazu wurde 5 mal nacheinander je 1 ml Na2CO3-PUffer auf die Säule aufgetragen. Die aus der Säule heraustropfende Lösung wurde fraktioniert aufgefangen. Der DNA-Gehalt der Fraktionen wurde photometrisch bestimmt. Das Oligo-2-Fc wurde mittels Butanol gefällt und in 20 mmol/1 Tris-HCl, 100 mmol/1 KCl, 1 mmol/1 MgCl2, pH 7,4 (Messpuffer) aufgenommen.A solution of 100 μmol / 1 of the oligonucleotide with the sequence SEQ ID NO: 1 was prepared in deionized water in accordance with the sequence protocol attached. 5 × 2 μl of the solution of the activated ferrocene carboxylic acid NHS ester were added in succession to 200 μl of the solution of the oligonucleotide and incubated for 5 hours at room temperature in a thermoshaker at 500 revolutions / min. Then 1 ml Butanol was added to the reaction mixture at room temperature, mixed thoroughly, centrifuged off the precipitated oligonucleotide and the supernatant removed. The process was repeated four times. Then the oligonucleotide was dissolved in 200 μl 0.1 mol / 1 potassium phosphate buffer, pH 7.0 (KKP). The "nucleobond" ion exchange column from MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG, Valencienner Strasse 11, 52355 Düren, Germany, was used to separate the oligonucleotide with the ferrocene group (oligo-2-Fc) coupled to it from the remaining oligonucleotide. The column was first equilibrated with KPP. The oligonucleotide dissolved in 200 μl KPP was applied to the column. Then 1 ml of KPP was applied to the column 5 times in succession. Bound DNA was eluted with 0.1 mol / 1 sodium carbonate buffer, pH 11.2 (Na 2 CO 3 buffer). For this purpose, 1 ml Na 2 CO 3 buffer was applied to the column 5 times in succession. The solution dripping out of the column was collected in fractions. The DNA content of the fractions was determined photometrically. The oligo-2-Fc was precipitated using butanol and taken up in 20 mmol / 1 Tris-HCl, 100 mmol / 1 KCl, 1 mmol / 1 MgCl 2 , pH 7.4 (measuring buffer).
Zum Nachweis der Undurchlässigkeit der Elektrodenbeschichtung gegenüber Oligonukleotid-Sonden wurden beschichtete und unbeschichtete Elektroden mittels Differenzieller Puls-Voltamme- trie elektrochemisch charakterisiert. Dazu wurden Elektroden jeweils in Messpuffer inkubiert und mittels DPV vermessen. Anschließend wurde Oligo-2-Fc in einer Endkonzentration von 50 μmol/1 zugefügt und die DPV-Messung wiederholt. Der Messpuffer mit Oligo-2-Fc wurde anschließend entfernt und gegen Messpuffer ausgetauscht. Zum Nachweis der Durchlässigkeit der Beschichtung gegenüber niedermolekularen Stoffen wurde dem Messpuffer FcCOOH in einer Endkonzentration von 50 μmol/1 zugefügt und eine weitere DPV-Messung durchgeführt. Die Figuren 2a und 2b zeigen die Ergebnisse von jeweils mittels einer unbeschichteten (Fig. 2a) und der beschichteten Goldelektrode (Fig. 2b) durchgeführten DPV-Messungen. Die Auswertung der DPV-Messungen erfolgte mittels der AUTOLAB- Software GPES der Firma Eco Chemie B.V., Kanaalweg 29 G, 3526 KM Utrecht, Niederlande. Die Messergebnisse sind mittels der Funktion "Moving Average" hintergrundbereinigt worden.To demonstrate the impermeability of the electrode coating to oligonucleotide probes, coated and uncoated electrodes were characterized electrochemically using differential pulse voltammetry. For this purpose, electrodes were incubated in measuring buffers and measured using DPV. Subsequently, oligo-2-Fc was added in a final concentration of 50 μmol / 1 and the DPV measurement was repeated. The measurement buffer with Oligo-2-Fc was then removed and replaced with the measurement buffer. To demonstrate the permeability of the coating to low-molecular substances, the measuring buffer FcCOOH was added in a final concentration of 50 μmol / 1 and a further DPV measurement was carried out. FIGS. 2a and 2b show the results of DPV measurements carried out in each case by means of an uncoated (FIG. 2a) and the coated gold electrode (FIG. 2b). The DPV measurements were evaluated using the AUTOLAB software GPES from Eco Chemie BV, Kanaalweg 29 G, 3526 KM Utrecht, The Netherlands. The measurement results have been background-adjusted using the "Moving Average" function.
Die Undurchlässigkeit der Beschichtung gegenüber dem größten Teil der Oligonukleotide zeigt sich dadurch, dass der durch die Ferrocen-Gruppe am Oligo-2-Fc verursachte Peak bei der beschichteten Elektrode im Vergleich zu der unbeschichteten Elektrode deutlich niedriger ist. Die Undurchlässigkeit der Beschichtung gegenüber dem Oligonukleotid könnte noch dadurch gesteigert werden, dass die Konzentration des zur Herstellung der Beschichtung eingesetzten Polymers oder die Dicke der Beschichtung erhöht wird. Die Durchlässigkeit der Beschichtung für niedermolekulare Stoffe zeigt sich dadurch, dass FcCOOH sowohl bei der beschichteten als auch bei der unbeschichteten Elektrode einen deutlichen Peak verursacht.The impermeability of the coating to the majority of the oligonucleotides is shown by the fact that the peak caused by the ferrocene group on the oligo-2-Fc is significantly lower in the coated electrode compared to the uncoated electrode. The impermeability of the coating to the oligonucleotide could be increased further by increasing the concentration of the polymer used to produce the coating or the thickness of the coating. The permeability of the coating for low molecular weight substances is shown by the fact that FcCOOH causes a clear peak in both the coated and the uncoated electrode.
Bei der in den Fig. 3a bis f dargestellten Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Sonde 18 an einem Träger 34 immobilisiert. Nach Denaturierung der doppelsträngig vorliegenden Nukleinsäure 8, 10 hybridisiert die einzelsträngige Nukleinsäure 10 mit der immobilisierten Sonde 18 (Fig. 3b) . An der Nukleinsäure 10 lagert sich der Primer 12 an (Fig. 3c) und wird durch die DNA-Polymerase 16 verlängert (Fig. 3d) . Durch die Exonuklease-Aktivität der Polymerase 16 wird die Sonde 18 abgebaut und es werden die MarkierungsSubstanzen 20 oder die Markierungssubstanz 20 enthaltende Nukleotide freigesetzt (Fig. 3e) . Die freigesetzten Markierungssubstanzen 20 können dann zu Elektrode 30 diffundieren und dort elektrochemisch nachgewiesen werden (Fig. 3f) . In the embodiment of the method according to the invention shown in FIGS. 3a to f, the probe 18 is immobilized on a carrier 34. After the double-stranded nucleic acid 8, 10 has been denatured, the single-stranded nucleic acid 10 hybridizes with the immobilized probe 18 (FIG. 3b). The primer 12 attaches to the nucleic acid 10 (FIG. 3c) and is extended by the DNA polymerase 16 (FIG. 3d). The exonuclease activity of the polymerase 16 degrades the probe 18 and the labeling substances 20 or nucleotides containing the labeling substance 20 are released (FIG. 3e). The released marking substances 20 can then diffuse to electrode 30 and be detected there electrochemically (FIG. 3f).

Claims

Patentansprüche claims
1. Verfahren zum Echtzeit-Quantifizieren einer Nukleinsäure (10) mittels einer Nukleinsäure-Vervielfältigungsreaktion, wobei dabei mindestens eine mit der Nukleinsäure (10) oder deren komplementären Gegenstrang (8) spezifisch eine Hybridisierung ausbildende Sonde (18) anwesend ist, wobei die Hybridisierung bei Anwesenheit der nachzuweisenden Nukleinsäure bei der Nukleinsäure-Vervielfältigungsreaktion durch enzyma- tischen Abbau der Sonde (18) aufgehoben wird, wobei das Aufheben der Hybridisierung elektrochemisch nachgewiesen wird, wobei die Sonde (18) mindestens eine elektrochemisch nachweisbare Markierungssubstanz (20) aufweist, mittels welcher das elektrochemische Nachweisen erfolgt, wobei der elektrochemische Nachweis ein direkter Nachweis einer elektrochemischen Reaktion durch Ableiten eines elektrischen Signals an einer Elektrode ist, wobei der Zugang der intakten Sonde (18) , nicht aber der Zugang der Abbauprodukte der Sonde (18) zur Elektrode (30) verhindert wird.1. A method for real-time quantification of a nucleic acid (10) by means of a nucleic acid amplification reaction, at least one probe (18) specifically forming a hybridization with the nucleic acid (10) or its complementary counter-strand (8) being present, the hybridization being present The presence of the nucleic acid to be detected in the nucleic acid amplification reaction is canceled by enzymatic degradation of the probe (18), the cancellation of the hybridization being detected electrochemically, the probe (18) having at least one electrochemically detectable marking substance (20) by means of which the electrochemical detection takes place, the electrochemical detection being a direct detection of an electrochemical reaction by deriving an electrical signal at an electrode, the access of the intact probe (18) but not the access of the degradation products of the probe (18) to the electrode (30) is prevented.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Nukleinsäure-Vervielfältigungsreaktion eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist.2. The method of claim 1, wherein the nucleic acid amplification reaction is a polymerase chain reaction (PCR).
3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der enzymatische Abbau durch eine Nuklease, insbesondere eine DNA-Polymerase mit Exonuklease-Aktivität , erfolgt.3. The method according to any one of the preceding claims, wherein the enzymatic degradation by a nuclease, in particular a DNA polymerase with exonuclease activity, takes place.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die durch den enzymatischen Abbau entstehenden die Markierungssubstanz enthaltenden Abbauprodukte, insbesondere Nukleotide (21, 22, 24, 26, 28) oder aus weniger als 10, vorzugsweise weniger als 5, Nukleotiden bestehende Oligonukleo- tide oder die durch den enzymatischen Abbau freigesetzte Mar- kierungssubstanz (20) selbst, elektrochemisch nachgewiesen werden.4. The method according to any one of the preceding claims, wherein the degradation products containing the labeling substance, particularly nucleotides (21, 22, 24, 26, 28) or oligonucleotides consisting of less than 10, preferably less than 5, resulting from the enzymatic degradation or the march released by the enzymatic degradation Kierungssubstanz (20) itself, electrochemically detected.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Markierungssubstanz (20) Redox-aktiv ist.5. The method according to any one of the preceding claims, wherein the marking substance (20) is redox-active.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Markierungssubstanz (20) ein Osmium-Komplex, ein Nano- gold-Partikel, eine Cystein- , Ferrocenyl-, Daunomyzin-, Ben- zochinon- , Naphthochinon- , Anthrachinon- oder p-Aminophenol- Gruppe, ein Farbstoff, insbesondere Indophenol, Thiazin oder Phenazin, oder ein Fluoreszenzfarbstoff, insbesondere 6-FAM, HEX, TET, Cy3, Cy5, IRDye™700, IRDye™800, Biodipy, Flou- rescein, Joe, Rox, TAMRA oder Texas Red, oder ein Fluores- zenz-Quencher ist.6. The method according to any one of the preceding claims, wherein the marking substance (20) is an osmium complex, a nano-gold particle, a cysteine, ferrocenyl, daunomycin, benzoquinone, naphthoquinone, anthraquinone or p- Aminophenol group, a dye, in particular indophenol, thiazine or phenazine, or a fluorescent dye, in particular 6-FAM, HEX, TET, Cy3, Cy5, IRDye ™ 700, IRDye ™ 800, Biodipy, Florescein, Joe, Rox, TAMRA or Texas Red, or a fluorescence quencher.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Zugang der intakten Sonde (18) zur Elektrode (30) dadurch verhindert wird, dass die Elektrode (30) von der Sonde (18) durch eine den Zugang der Sonde (18) zur Elektrode (30) verhindernden Membran oder Elektrodenbeschichtung (32) getrennt ist, wobei die Membran oder die Elektrodenbeschichtung (32) für Abbauprodukte (21, 22, 24, 26, 28) der Sonde durchgängig ist.7. The method according to any one of the preceding claims, wherein access of the intact probe (18) to the electrode (30) is prevented by the electrode (30) from the probe (18) through an access of the probe (18) to the electrode (30) preventing membrane or electrode coating (32) is separated, the membrane or electrode coating (32) for degradation products (21, 22, 24, 26, 28) of the probe being continuous.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Zugang der intakten Sonde (18) zur Elektrode (30) dadurch verhindert wird, dass die Sonde (18) an einer von der Elektrode entfernten Stelle oder an einem Partikel immobilisiert ist.8. The method according to any one of the preceding claims, wherein the access of the intact probe (18) to the electrode (30) is prevented by the probe (18) being immobilized at a location remote from the electrode or on a particle.
9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, wobei die Elektrodenbeschichtung (32) aus Polyacrylamid oder Polyvinylpyrrolidon gebildet ist. 9. The method according to claim 7 or 8, wherein the electrode coating (32) is formed from polyacrylamide or polyvinylpyrrolidone.
10. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, wobei die Elektrode (30) mit der Membran verbunden ist.10. The method according to claim 7 or 8, wherein the electrode (30) is connected to the membrane.
11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Elektrode (30) eine Kohlenstoff-Elektrode, insbesondere eine Screen-Print- , eine Pencil-, eine Glassy-Carbon- , eine Pyrolytic-Grafit- oder eine Kunststoff-Composit-Elektrode, vorzugsweise eine Grafit enthaltende Polycarbonat-Elektrode, ist.11. The method according to any one of the preceding claims, wherein the electrode (30) is a carbon electrode, in particular a screen print, a pencil, a glassy carbon, a pyrolytic graphite or a plastic composite electrode, preferably a graphite-containing polycarbonate electrode.
12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Elektrode (30) im Wesentlichen nur während des elektrochemischen Nachweises, insbesondere bei einer definierten Temperatur, mit einer Lösung, in welcher die Nukleinsäure- Vervielfältigungsreaktion erfolgt, in Kontakt gebracht wird.12. The method according to any one of the preceding claims, wherein the electrode (30) is brought into contact with a solution in which the nucleic acid amplification reaction takes place essentially only during the electrochemical detection, in particular at a defined temperature.
13. Verwendung einer Elektrode (30) zum Echtzeit-Quantifizieren einer Nukleinsäure (10) mittels eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 12.13. Use of an electrode (30) for real-time quantification of a nucleic acid (10) by means of a method according to one of claims 1 to 12.
14. Verwendung nach Anspruch 13, wobei die Elektrode (30) eine Membran oder Elektrodenbeschichtung (32) aufweist, welche den Zugang einer mit der Nukleinsäure (10) oder deren komplementären Gegenstrang (8) spezifisch eine Hybridisierung ausbildenden eine elektrochemisch nachweisbare Markierungssubstanz aufweisenden Sonde (18) zur Elektrode (30) verhindert, wobei die Membran oder Elektrodenbeschichtung (32) für die Markierungssubstanz enthaltende Abbauprodukte (21, 22, 24, 26, 28) der Sonde (18), insbesondere Nukleotide (21, 22, 24, 26, 28) oder aus weniger als 10, vorzugsweise weniger als 5 Nukleotiden bestehenden Oligonukleotide oder die durch en- zymatischen Abbau freigesetzte elektrochemisch nachweisbare Markierungssubstanz (20) der Sonde (18), durchgängig ist. 14. Use according to claim 13, wherein the electrode (30) has a membrane or electrode coating (32) which provides access to a probe which has an electrochemically detectable marking substance and which specifically forms a hybridization with the nucleic acid (10) or its complementary counter-strand (8). 18) to the electrode (30), the membrane or electrode coating (32) for the degradation products (21, 22, 24, 26, 28) of the probe (18) containing the marking substance, in particular nucleotides (21, 22, 24, 26, 28) or oligonucleotides consisting of less than 10, preferably less than 5 nucleotides or the electrochemically detectable labeling substance (20) of the probe (18) released by enzymatic degradation.
15. Verwendung einer mit einer Nukleinsäure (10) oder deren komplementären Gegenstrang (8) spezifisch eine Hybridisierung ausbildenden Sonde (18) zum Echtzeit-Quantifizieren der Nukleinsäure (10) mittels eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei die Sonde (18) mit einem Fluorophor markiert ist. 15. Use of a probe (18) specifically forming a hybridization with a nucleic acid (10) or its complementary counter-strand (8) for real-time quantification of the nucleic acid (10) by means of a method according to one of claims 1 to 12, wherein the probe (18 ) is marked with a fluorophore.
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