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WO2004026311A2 - Utilisation d’inhibiteurs specifiques de tyrosine kinases pour l’immunomodulation - Google Patents

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WO2004026311A2
WO2004026311A2 PCT/FR2003/002744 FR0302744W WO2004026311A2 WO 2004026311 A2 WO2004026311 A2 WO 2004026311A2 FR 0302744 W FR0302744 W FR 0302744W WO 2004026311 A2 WO2004026311 A2 WO 2004026311A2
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WO
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cells
sti571
inhibitor
tyrosine kinase
abl
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PCT/FR2003/002744
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WO2004026311A3 (fr
Inventor
Laurence Zitvogel
Christian Auclair
Thomas Tursz
Original Assignee
Institut Gustave Roussy (Igr)
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Publication date
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    • A61P37/02—Immunomodulators

Definitions

  • the invention relates to the use of tyrosine kinase inhibitors for immunomodulation, in particular for regulating the activity of immune cells in patients. It relates more particularly to the use of specific tyrosine kinase inhibitors for the preparation of a composition intended for the prevention or treatment of viral infections, sensitive NK tumors, immune diseases and / or septic shock in a mammal .
  • the inhibitors concerned are more particularly inhibitors of tyrosine kinases c-abl (bcr / abl), c-kit and / or tyrosine kinase associated with the PDGF receptor.
  • the invention also describes compositions comprising such an inhibitor, in combination with other active agents, in particular agents capable of potentiating the effect of the inhibitor.
  • the invention can be used preventively or curatively, in vivo or ex vivo.
  • Tyrosine kinases are key enzymes for the positive control of cell multiplication. Frequently, mutations of proto-oncogenes to oncogenes are due precisely to mutations in the kinase domain making the tyrosine kinase activity constitutive and unregulated. This is notoriously the case in Chronic Myeloid Leukemia (CML), where translocation (9; 22) results in the expression of a bcr-abl fusion protein which has a permanent tyrosine kinase activity. It has been clearly demonstrated that this constitutive tyrosine kinase activity is the primum movens of CML.
  • CML Chronic Myeloid Leukemia
  • GIST gastrointestinal stromal tumors
  • tumors originating from the interstitial cell of Cajal CD34 +, c-kit +, desmin-, S-100-
  • mutations in the proto-oncogene c-kit 21-88 % point mutations or deletions in the juxtamembrane domain -exon 11> exon 9 or 13-
  • Hirota S Science 279 (1998) 577,
  • STI571 (Novartis), also known as Gleevec, Glivec or Imatinib Mesylate.
  • STI571 (STI for “Signal Transduction Inhibitor”) is a selective inhibitor compound for certain protein tyrosine kinases: PDGF receptor, ABL tyrosine kinases (p210, p185, p190) and c-kit (CD117, SCF receptor) (Buchdunger E , J Pharmacol Exp Ther 295 (2000) 139; Druker BJ, Nat Med. 2 (1996) 561; Heinrich MC, Blood 96 (2000) 925). This compound would act on the mechanisms of signal transduction.
  • STI571 is indicated for the treatment of Chronic Myeloid Leukemia (CML) with a Philadelphia chromosome positive in blast crisis, accelerated phase or chronic phase, in particular in patients who are intolerant, refractory to or have failed interferon alfa therapy.
  • CML Chronic Myeloid Leukemia
  • STI571 works by blocking the binding of ATP to the tyrosine kinase bcr / abl, thereby inhibiting its phosphorylation activity of the main substrate CRKL. This inhibitory action is based on competition with ATP at the level of the protein binding pocket with the latter.
  • Kit is a growth factor receptor, a ligand of which is the “Stem Cell Factor” (SCF) or Steel factor, and has a crucial role in the multiplication of the differentiation of early hematopoietic precursors.
  • SCF Stem Cell Factor
  • the present application results from the demonstration of particularly remarkable and unexpected immunomodulatory properties of tyrosine kinase inhibitors.
  • the present application shows in particular that, surprisingly, specific tyrosine kinase inhibitors, such as STI571, are capable of acting on the activity of dendritic cells, and of modifying their properties.
  • the invention shows in particular that such compounds make it possible to modulate the activity of immature dendritic cells to induce the activation of NK cells, in vitro and in vivo.
  • the invention also shows that such compounds are also capable of inhibiting the maturation of dendritic cells induced by LPS and, therefore, of limiting the inflammatory response.
  • This activity is also very surprising since it is effective on cells which do not necessarily have a mutation in a receptor associated with a tyrosine kinase. This activity is also surprising due to its amplitude, since, as illustrated in the examples, the in vivo use of such compounds makes it possible to activate NK cells in 30 to 56% of patients with GIST.
  • the demonstration of the immunomodulatory properties of these specific inhibitors opens up new therapeutic applications not previously envisaged for these compounds, and also makes it possible to potentiate or optimize their properties.
  • the new biological properties of these inhibitors make it possible, for the first time, to envisage their use to treat multiple cancers sensitive to NK, cancers which have become secondarily resistant to STI571, to treat cancers which do not contain the c mutation -abl, c-kit or PDGF-R, to treat infectious diseases or reduce inflammation.
  • the invention also makes it possible to strongly potentiate the therapeutic effect of these compounds by combining them, for example, with growth factors of dendritic cells.
  • the present invention therefore offers new effective approaches in the treatment of cancers, infectious or immune diseases, based on an original and effective modulation of the immune response.
  • a first object of the invention thus resides in the use of a specific tyrosine kinase inhibitor for modulating the activity of dendritic cells in vivo, ex vivo or in vitro, in particular in the use of a tyrosine kinase inhibitor c-abl, bcr / abl, c-kit and / or tyrosine kinase associated with the PDGF receptor, for the preparation of a composition intended to modulate the activity of dendritic cells in a mammal.
  • Another object of the invention lies in the use of a specific tyrosine kinase inhibitor to stimulate the activity of NK cells in vivo, in vitro or ex vivo.
  • Another object of the invention lies in the use of a specific tyrosine kinase inhibitor for the prophylactic or curative treatment of tumors or viral infections, in particular of sensitive NK tumors.
  • Another object of the invention lies in the use of a specific tyrosine kinase inhibitor to increase NK activity in patients suffering from cancer or viral infection.
  • Another object of the invention lies in the use of a specific tyrosine kinase inhibitor to reduce the inflammatory response, in particular in subjects suffering from chronic inflammatory pathologies or autoimmune diseases.
  • Another object of the invention lies in the use of a specific tyrosine kinase inhibitor to promote GVL during allogenic transplants.
  • the invention also relates to methods of prophylactic or curative treatment of cancerous, infectious, immune or inflammatory pathologies, comprising the administration to a patient (i) of a specific tyrosine kinase inhibitor, alone or in combination with one or more other active ingredients, or (ii) dendritic cells (preferably autologous) treated with such a compound.
  • the invention also relates to a method for modulating the activity of dendritic cells in a patient, comprising administering to said patient an effective amount of a specific tyrosine kinase inhibitor.
  • the invention also relates to a method for stimulating the activity of NK cells in a patient, comprising administering to said patient an effective amount of a specific tyrosine kinase inhibitor or of dendritic cells treated with such an inhibitor.
  • the tyrosine kinase inhibitor can be used alone or, preferably, combined with a potentiating agent.
  • the invention also relates to a composition comprising a specific tyrosine kinase inhibitor and a potentiating agent, preferably chosen from a growth factor for dendritic cells and a (co-) stimulation factor for NK cells.
  • composition comprising dendritic cells, in particular immature cells, treated with a specific tyrosine kinase inhibitor. It also relates to a therapeutic association between a specific tyrosine kinase inhibitor and a potentiating agent, preferably chosen from a growth factor for dendritic cells and a (co-) stimulation factor for NK cells, for separate use, simultaneous or spaced over time.
  • kits comprising a specific tyrosine kinase inhibitor and an agent stimulating the production of dendritic cells.
  • the invention can be used in the fields of immunology, immunotherapy or medical biotechnology. As indicated below, the use of these inhibitors as immunomodulatory agents is varied. They find applications both in vitro, ex vivo and in vivo, to control the activity of dendritic cells or NK cells, to regulate the immune or inflammatory response in different pathological contexts.
  • the invention can be used in all mammals, in particular in humans, even if use in animals is also possible.
  • treatment refers to preventive or curative treatment.
  • specific tyrosine kinase inhibitors as immunomodulators.
  • specific tyrosine kinase inhibitors is understood to mean compounds capable of preferentially inhibiting the activity of tyrosine kinases c-abl, bcr / abl, c-kit and / or tyrosine kinase associated with the receptor for PDGF.
  • the inhibition can be partial or total. They may be compounds capable of inhibiting the activity of the mutated form of the tyrosine kinases identified above, and in particular the mutated form which is constitutively active, or else of inhibiting the non-mutated or overexpressed form in cells. "Normal no transformed "like dendritic cells. The compounds are preferably without direct substantial effect on other tyrosine kinases.
  • the preferred inhibitor compounds of the invention are chemical molecules of the family of pyrimidines, such as the compounds described in patent applications No. WO01 / 64200, WO99 / 03854, EP 0564 409 and US 6,258,812. It can also be the pyrido [2-3 ⁇ ] -pyrimidine compounds described by Wisniewski D. et al. (Cancer. Res. 62 (2002) 4244).
  • a preferred inhibitor is a compound of the family of 2-phenylaminopyrimidines, such as compound STI571 or any derivative or analog thereof.
  • STI571 is a specific inhibitor of the protein tyrosine kinases mentioned above, without substantial effect on the EGF receptor, FLT 1 and FLT3.
  • the half-life of STI571 is 16 hours in humans, and this compound is metabolized by cytochrome P450 (CYP3A4, CYP2D6). This compound is generally well tolerated by humans.
  • inhibitors of tyrosine kinases can be used within the scope of the invention, although preference is given to those having selective activity for tyrosine kinases c-abl, bcr / abl, c-kit and / or associated with the receptor of the PDGF. Likewise, inhibitors can be identified or selected in vitro or in cellular tests, by measuring the binding or the activity of test compounds on the isolated tyrosine kinase or a cell containing it.
  • an inhibitor is the compound AB1003 or any derivative (eg, by substitution) thereof, as described in application No. US60 / 400064.
  • the formula of the compound AB1003 [2- (2-methyl-5-amino) phenyl-4- (3-pyridyl) -thiazole] is shown below:
  • DC-Activated Killer Activation of NK Cells - Production of DAK (“DC-Activated Killer”) cells and therapeutic effects
  • a particular object of the invention resides in the use of a specific tyrosine kinase inhibitor for the preparation of a composition intended to activate the NK cells of a subject.
  • the invention indeed shows that such compounds are capable of increasing the NK function in patients, in vivo, leading to a powerful anti-tumor or anti-infectious action.
  • the invention shows that this increase is linked to a modulation of dendritic cells, giving them the ability to activate NK cells.
  • NK cells Natural killer cells
  • NK cells are a population of lymphocytes that represent a very early line of defense against viruses and tumor cells. NK cells can be characterized by the presence of the CD56 and CD16 markers, and by the absence of the CD3 marker. NK cells have in particular been implicated in non-antigenic immunity of antigens, for the prevention of the establishment of primary or metastatic tumors in the immunocompetent or immunosuppressed host. NK cells in particular seem to have a key role against tumor cells or MHC class I negative variants. The role of NK cells in anti-tumor immunosurveillance has been widely documented, in mice (Diefenbach, Nature 413 (2001) 165) as in humans (A. Velardi, Science 2002).
  • NK cells The role of NK cells in the prevention of viral infections is also well documented, especially for viruses of the Herpes group Viridae (C. Biron, N. Eng. J. Med. 320 (1989) 1731; Welsch et al., J. Exp. Med. 2001).
  • NK cells Due to their non-specific cytotoxic antigen properties and their efficiency, NK cells therefore constitute a population of effector cells which is particularly interesting for the development of adoptive immunotherapy approaches for cancers or infectious diseases.
  • the administration of NK cells associated with low doses of IL-2 has given promising results in the adjuvant situation.
  • NK cells have also been used for the experimental treatment of different types of tumors and certain clinical studies have been initiated (Kuppen et al. Int. J. Cancer. 56 (1994) 574; Lister et al., Clin. Cancer Res. 1 (1995) 607; Rosenberg et al., N. Engl. J. Med. 316 (1987) 889).
  • NK cells have also been shown to promote GVL in allogeneic marrow transplants.
  • these cells can also be used in vitro for the non-specific lysis of cells which do not express MHC class-1 molecules and, more generally, of any cell sensitive to NK cells.
  • NK cells can be activated by cytokines in vitro or in systemic administration in vivo (IL-2, IL-12, IFN type I or II, IL-15 in combination or not with 1L-1b, IL-18, IL- 21 or chemokines).
  • IL-2, IL-12, IFN type I or II, IL-15 in combination or not with 1L-1b, IL-18, IL- 21 or chemokines.
  • the pathophysiological role of these cytokines for NK activation in vivo has never been demonstrated.
  • the clinical application of cytokines is limited, in particular because of the costs of preparation of the latter, the toxic nature of many of them, which cannot be used in in vivo applications, or else the non-specific character.
  • the "natural killing" function is often impaired in patients with tumors, the possibility of harvesting these cells for activation ex vivo can be considerably reduced.
  • CD dendritic cells
  • tyrosine kinase inhibitors induce in vivo or in vitro, a phenotypic modification of the dendritic cells which gives them the power to activate NK cells.
  • the inventors have in particular demonstrated that the administration to a mammal of a specific tyrosine kinase inhibitor induces a very pronounced increase in the function and activity of NK cells. They also observed that tyrosine kinase inhibitors, of the STI571 type, are capable of activating the NK functions in patients carrying GIST.
  • NK cells are activated in 30 to 56% of patients and these biological data for activation of NK seem to correlate with the clinical responses obtained with STI571 (with, in particular, no primary resistance to STI571 in biological responders).
  • the present invention thus relates to the use of a specific tyrosine kinase inhibitor for the preparation of a composition intended to increase NK activity in patients with cancer or infection (viral, bacterial or parasitic).
  • a particular object of the invention lies in the use of a specific inhibitor of tyrosine kinase c-abl, bcr / abl, c-kit and / or associated with the PDGF receptor for the preparation of a composition intended for prevention or the treatment of infections, especially viral.
  • Another particular object of the invention lies in the use of a specific inhibitor of tyrosine kinase c-abl, bcr / abl, c-kit and / or associated with the PDGF receptor for the preparation of a composition intended for the prevention or treatment of sensitive NK tumors not linked to a constitutive mutation in a tyrosine kinase, or resistant to STI571.
  • a specific tyrosine kinase inhibitor for the preparation of a composition intended to induce in a mammal a phenotypic modification of dendritic cells and to enable or increase the activation of NK cells.
  • It also relates to a method for inducing a phenotypic modification of the dendritic cells and / or for activating the NK cells, comprising bringing into contact in vitro, in vivo or ex vivo dendritic cells, alone or co-cultivated with NK cells, with a tyrosine kinase inhibitor c-abl, bcr / abl, c-kit and / or associated with the PDGF receptor.
  • the invention also relates to a method of preventive or curative treatment of a patient suffering from cancer or a viral infection, comprising the administration of an amount of specific inhibitor of tyrosine kinase effective for activating NK function in the patient.
  • the invention further relates to a method for activating NK cells in a subject, comprising administering to the subject a tyrosine kinase inhibitor.
  • a tyrosine kinase inhibitor c-abl, bcr / abl, c-kit and / or tyrosine kinase associated with the PDGF receptor.
  • the subject is preferably a human being but it can also be an animal.
  • the invention can also be used to increase the survival of NK lymphocyte populations, in vitro, ex vivo or in vivo, as well as to increase, if necessary, the proliferation of NK lymphocyte subpopulation (s).
  • the specific tyrosine kinase inhibitor can be used alone.
  • the inhibitor is used in combination with another active agent.
  • This active agent may be of various natures, but it is preferably an agent potentiating the action of the inhibitor, such as in particular a growth factor of dendritic cells or a (co-) stimulation factor of NK cells.
  • the invention shows that specific inhibitors of tyrosine kinase can make it possible to stimulate the NK function in vivo in subjects, and that this stimulation involves a phenotypic modification of the dendritic cells.
  • a more powerful biological effect can therefore be obtained.
  • a growth factor for dendritic cells and an inhibitor according to the invention it is possible to produce a stimulation of the NK functions sufficient to obtain a therapeutic effect, even with respect to pathological cells resistant to action of the inhibitor alone.
  • an inhibitor as defined above is therefore used in combination with a potentiating agent.
  • the term “combination” indicates that the two agents can be used simultaneously or spaced over time, as long as their biological effects are combined in vivo.
  • the agents can therefore be packaged simultaneously or separately, and administered concomitantly or over time.
  • the potentiating agent is capable of amplifying the dendritic cells, that is to say of increasing their differentiation, their growth or their activity. It is preferably a growth factor for dendritic cells, advantageously chosen from Flt3Ligand (“Flt3L”) described by Lyman SD et al. (Blood 83 (1994) 2795-2801) and by Maraskovsky E.
  • GM-CSF interleukin-4
  • interleukin-13 interleukin-13 and their derivatives or analogs. It may especially be progenipoietin (ProGP4, fusion molecule between G-CSF and Flt3L), a GM-CSF / IL-4 fusion, etc.
  • This agent can be used simultaneously or offset in time with respect to the tyrosine kinase inhibitor.
  • the potentiating agent is a co-stimulation factor for NK cells, and in particular any lymphokine or cytokine capable of activating or promoting the activation of NK cells. Mention may be made, for example, of IL-2, IL-12, IL-15, type I interferon, etc.
  • an inhibitor as defined above is used in combination with a dendritic cell growth factor and / or an NK cell co-stimulation factor.
  • a particularly preferred combination includes the inhibitor and Flt3L (or a variant or analog thereof).
  • compositions comprising a specific tyrosine kinase inhibitor as defined above and a potentiating agent, preferably chosen from a dendritic cell growth factor and a co factor -stimulation of NK cells.
  • the potentiating agent is chosen on a specific basis from cytokines or lymphokines activating NK cells or from Fit 3L, GM-CSF, IL-4, IL-13 and their derivatives or analogs (ProGP4, GM / IL-4).
  • the compositions according to the invention can naturally also comprise any pharmaceutically acceptable vehicle or excipient, such as isotonic solutes, buffered saline solutions, stabilizing agents, etc.
  • compositions and methods of the invention are numerous, due to the broad spectrum of action of NK cells. They preferably include the prophylactic or curative treatment of various pathologies such as cancers or infectious diseases, in particular of viral origin or resulting from other pathogens, and congenital NK or related immunodeficiencies (immune deficiencies leading to a mutation in the IFN ⁇ gene -R, IL- 12R ).
  • compositions or methods according to the invention can in particular be used to delay or suppress the growth of tumors, induce a regression in the size of the tumors, slow down or prevent the formation of metastases, etc. ., in particular tumors weakly expressing MHC class I molecules or having ligands for receptors activating NK or other pathological cells. They also make it possible to prevent the establishment of primary or metastatic tumors in an immunocompetent or immunosuppressed mammal for T lymphocyte functions.
  • the invention can be used to prevent or treat any sensitive NK tumor, in particular those chosen from carcinomas, melanomas, leukemias, lymphomas and sarcomas.
  • the invention is particularly suitable for the preventive or curative treatment of melanomas, kidney cancer, sarcomas of the digestive tract, chronic myeloid leukemia (CML) and neuroblastomas.
  • CML chronic myeloid leukemia
  • the invention makes it possible to improve the therapeutic efficiency by using combination therapy with a potentiating agent, as mentioned above.
  • the invention specifically relates to the use of a tyrosine kinase inhibitor as defined above, in combination with a potentiating agent, for the preparation of a composition intended for the prophylactic or curative treatment of CML or from GIST. It also relates to a corresponding processing method.
  • the invention also relates to the use of a tyrosine kinase inhibitor as defined above, in combination with a potentiating agent, for the preparation of a composition intended for the prophylactic or curative treatment of a tumor resistant to STI571. It also relates to a corresponding processing method.
  • the invention can be used for the prophylactic or curative treatment in particular a viral infection caused by a virus of the group of Herpes Viridae (Herpes virus type 1 or 2, Epstein-Barr virus , cytomegalovirus, Kaposi sarcoma virus, HSV-6, etc.), HIV, Vaccinia virus, MVM, ECMV or Papilloma Virus. It can also be used to treat microbial or parasitic infections.
  • Herpes Viridae Herpes virus type 1 or 2, Epstein-Barr virus , cytomegalovirus, Kaposi sarcoma virus, HSV-6, etc.
  • HIV Vaccinia virus
  • MVM e.g., ECMV or Papilloma Virus
  • ECMV Papilloma Virus
  • the invention can also be implemented using a population of dendritic cells treated ex vivo with a tyrosine kinase inhibitor as defined above.
  • the injection of dendritic cells thus treated preferably autologous, also makes it possible to induce an activation of the NK function of a subject.
  • the invention also relates to a composition comprising dendritic cells treated with a tyrosine kinase inhibitor as mentioned above. It also relates to a composition comprising a tyrosine kinase inhibitor as defined above and dendritic cells and / or NK cells. According to a particular aspect of the invention, the composition comprises a tyrosine kinase inhibitor as defined above and dendritic cells.
  • the composition comprises a tyrosine kinase inhibitor as defined above, dendritic cells and NK cells.
  • It also relates to a process for preparing or treating in vitro or ex vivo dendritic cells, comprising contacting dendritic cells (or their precursors) in the presence of a specific tyrosine kinase inhibitor.
  • the cells obtained can be collected and packaged for immediate or future use.
  • the dendritic cells are typically treated by incubation in the presence of the inhibitor, for example in the presence of STI571, at a rate of approximately 10 ⁇ to 10 8 8 molar. It is preferred to use immature dendritic cells.
  • human CD34 + dendritic cells are placed in the presence of SCF, Flt3L, GM-CSF and TNF ⁇ for approximately 7 to 15 days (preferably 12 days), then in the presence of STI571 for approximately 12 to 48 hours (preferably Around 24h). It is understood that the precise conditions can be adapted by a person skilled in the art.
  • the cells thus obtained have the capacity to activate NK cells, and can be conditioned for their therapeutic use, or used to activate NK cells in vitro or ex vivo, in particular by co-culture.
  • optimal activation of NK cells is observed for example after co-culture for a period of between 20 to 48 hours approximately.
  • the co-culture ratio is ideally one dendritic cell for approximately 25 to 125 NK cells.
  • the invention can be implemented in any device suitable for cell culture, preferably under sterile conditions. These can in particular be plates, culture dishes, flasks, flasks, pockets, etc.
  • the culture or co-culture is also carried out in any medium suitable for the culture of dendritic cells and / or NK cells. More generally, these may be commercially available culture media for the cultivation of mammalian cells, such as for example RPMI medium, DMEM medium, IMDM medium or GBEA media (AIMV, X-VIVO), etc.
  • the activation of NK cells is carried out by in vitro or ex vivo coculture of immature dendritic cells with NK cells, in the presence of an inhibitor of c-abl, bcr / abl, c-kit and tyrosine kinases. / or tyrosine kinase associated with the PDGF receptor.
  • the activation of NK cells is carried out by in vitro or ex vivo treatment of immature dendritic cells in the presence of an inhibitor of tyrosine kinases c-abl, bcr / abl, c - kit and / or tyrosine kinase associated with the PDGF receptor, then co-culture of the dendritic cells thus obtained with NK cells.
  • the activation of NK cells is carried out by in vitro or ex vivo treatment of immature dendritic cells in the presence of an inhibitor of c-abl, bcr / abl, c-kit and tyrosine kinases. / or tyrosine kinase associated with the PDGF receptor, then administration of the dendritic cells thus obtained to a subject.
  • NK cells or the dendritic cells When the NK cells or the dendritic cells have thus been activated, it is possible either to separate the NK cells from the dendritic cells, or to harvest the NK / CD cell co-culture directly.
  • activation of NK cells within the meaning of the invention more particularly designates the early upregulation of CD69, especially on the CD56 bnght population of NKs (that which spreads in GIST patients treated with STI571), l increase in IFN ⁇ production and / or cytotoxic activity of NK cells. These three parameters can be easily measured according to techniques known to those skilled in the art.
  • the term “activated” NK cells denotes, within the meaning of the invention, NK cells exhibiting at least one of the properties mentioned above. It is also possible to detect an NK activation by the capacity of these cells to release for a prolonged period of high levels of IFN ⁇ in the presence of "immature CD" and, possibly, in the presence of LPS.
  • the cell populations are preferably autologous, that is to say from the same organism. They can also be made up of allogenic cells. In addition, it can also be dendritic cells sensitized to one or more antigens or, on the contrary, “naive” cells.
  • These compositions advantageously consist of isolated cell populations, that is to say that each of the cell populations is composed of at least 10%, preferably at least 30%, in particular at least 50% of the corresponding cell type (NK or dendritic ).
  • compositions can be packaged in any suitable device such as bags, vials, ampoules, syringes, vials, etc., and can be stored (in the cold) or used extemporaneously, as described below.
  • these compositions comprise from 10 4 to 10 9 treated dendritic cells, preferably from 10 5 to 10 8 approximately.
  • the administration of the inhibitor or of the cells can be carried out by any technique and any known route, and in particular by injection or oral administration. It may for example be a subcutaneous, systemic (intravenous, intraarterial, intraperitoneal) or intramuscular injection. When possible, the inhibitor is advantageously administered orally.
  • the injection is preferably a local or regional injection, in particular an injection at the site or close to the site to be treated, in particular close to a tumor.
  • the injections are generally carried out on the basis of doses of cells which can range from 10 4 to 10 9 dendritic cells, preferably between 10 5 and 10 7 included. It is possible to passively transfer dendritic cells by repeated administrations, for example 1 to 2 administrations per week for several months.
  • the inhibitor compound can be administered at various doses, for example between 200 and 800 mg per os / day, preferably between 400 mg and 600 mg per os / day, in particular in the event of association with a potentiating agent (for example Flt3L se 10-50 ⁇ g / kg for 10-20 days).
  • a potentiating agent for example Flt3L se 10-50 ⁇ g / kg for 10-20 days.
  • the use of the inhibitor in vitro or ex vivo on dendritic cells before passive transfer is preferably carried out at a dose of 10 "6 M or 10 " 8 M. Repeated administrations are of course possible.
  • the administration protocol can be adapted by those skilled in the art according to the situations (preventive, curative, isolated tumors, metastases, significant or localized infection, etc.).
  • This immunomodulatory property of the inhibitors makes it possible to envisage a negative modulation of the inflammatory response or of the immune response in different pathological contexts. Indeed, the maturation of dendritic cells actively participates in the development of the inflammatory reaction, and the possibility of controlling this property therefore offers new therapeutic approaches in the treatment or control of inflammation.
  • the invention therefore relates to a method for preventing or inhibiting the maturation of dendritic cells, in particular that induced by a toxin such as LPS, comprising bringing the cells into contact in vitro, ex vivo or in vivo. dendritics with a tyrosine kinase inhibitor c-abl, bcr / abl, c-kit and / or tyrosine kinase associated with the PDGF receptor.
  • a toxin such as LPS
  • the invention also relates to the use of a specific tyrosine kinase inhibitor as defined above for the preventive or curative treatment of immune and / or inflammatory diseases in a mammal.
  • the invention also relates to the use of a specific tyrosine kinase inhibitor as defined above for the preparation of a composition intended for the treatment of inflammatory pathologies, in particular chronic, such as atherosclerosis, Crohn's disease, asthma (chronic), rheumatoid arthritis, dermatitis (chronic), septic or endotoxin shock, etc.
  • a specific tyrosine kinase inhibitor as defined above for the preparation of a composition intended for the treatment of inflammatory pathologies, in particular chronic, such as atherosclerosis, Crohn's disease, asthma (chronic), rheumatoid arthritis, dermatitis (chronic), septic or endotoxin shock, etc.
  • treatment also includes a reduction in the inflammatory response, even partial and / or temporary, leading to an improvement in the quality of life of the patients.
  • the invention also relates to the use of a specific tyrosine kinase inhibitor as defined above for the preparation of a composition intended for the treatment of autoimmune pathologies.
  • the invention also relates to the use of a specific tyrosine kinase inhibitor as defined above for the preparation of a composition intended for allogenic grafting.
  • the invention is particularly suitable for improving allogeneic marrow transplants.
  • GVL activity (“graft versus Leukemia”)
  • the inhibitor also makes it possible to reduce GVHD ("Graft Versus Host Disease") and thus improve safety of treatment.
  • the invention can therefore be used advantageously to treat a host receiving a non-compatible allogeneic marrow graft, HLA.
  • the invention can also be used to prevent or treat congenital immune diseases, such as a deficiency in the receptor for IL-12, a deficiency in the receptor for IFN ⁇ , a deficiency in the gamma chain (IL-2R ⁇ ) common cytokine receptors (SCID syndrome).
  • congenital immune diseases such as a deficiency in the receptor for IL-12, a deficiency in the receptor for IFN ⁇ , a deficiency in the gamma chain (IL-2R ⁇ ) common cytokine receptors (SCID syndrome).
  • Table 1 Biological correlation between STI571 and activation of NK.
  • NK gamma interferon secretion and cytotoxicity
  • NK cells activated by mature dendritic cells have the ability to secrete gamma interferon. This production of gamma interferon was defined as significant if it was possible to measure more than 100 ⁇ g / ml in the supernatants of cocultures.
  • Patients who meet this criterion are defined as biological responders. A correlation is established between these patients and the clinical efficacy of STI 571. The distribution of patients whose disease progresses under STI 571 is studied as a function of the biological response.
  • Figure 1 Longitudinal monitoring of seven GIST patients on STI571. Acquisition of NK functions.
  • Dendritic cells incubated in the presence of STI 571 are capable of activating NK cells.
  • Human dendritic cells are generated from hematopoietic stem cells, in the presence of GM-CSF and TNF ⁇ , for 12 days. These dendritic cells are then incubated with STI 571 for 24 hours.
  • cytotoxic NK functions are studied by lysis tests using targets marked with chromium 51 and sensitive to NK lysis (K562). In both cases, STI 571 gives dendritic cells the ability to activate NK cells.
  • FIG. 3 Dendritic cells incubated in the presence of STI571 are capable of activating NK cells.
  • STI 571 gives dendritic cells the ability to activate NK cells.
  • Murine dendritic cells derived from bone marrow or spleen are pre-incubated with STI 571 in increasing doses and then cultured with NK cells.
  • the use of STI 571 makes it possible to increase the secretion of gamma interferon by NK cultured in the presence of dendritic cells.
  • the previous experiment is repeated in the presence of a non-specific phosphorylation inhibitor (AG 957) and of STI 571. This experiment reveals that the previous results are specific of STI 571.
  • Figure 4 The STI analog, AB1003, increases the ability of dendritic cells to activate NK cells.
  • Figure 5 In vivo activation of NK by injection of dendritic cells incubated in the presence of STI571.
  • Murine dendritic cells are pre-incubated with ST1571 and then injected subcutaneously into the lower limbs of the mice. The draining nodes are collected and the functions of the NK cells analyzed. after purification.
  • the use of dendritic cells preincubated with STI 571 allows the in vivo activation of NK in the draining ganglion as evidenced by the presence of CD69 on the membrane of the NK studied.
  • Figure 6 In vivo activation of NK by injection of STI571 and a growth factor of dendritic cells.
  • STI 571 is administered by gavage (per os), from D8 to D12. The spleens and livers of the mice are then removed for purification of the NK cells.
  • the functional tests carried out show an activation of the NK cells in the group treated by the association Flt3L + STI, unlike the control groups (mice treated with PBS IP, IL2 IP, PBS IP + gavages of STI 571, Flt3-L IP + gavages of PBS).
  • Panels A and B present the flow cytometry analysis of the presence of CD69 (membrane activation marker) on the surface of NK cells (DX5 +), in the spleen and liver of mice.
  • Panels C and D present the capacities of these NK cells, purified from the spleens of the mice of each group, to secrete gamma interferon after a phase of culture with dendritic cells.
  • Panel E represents the study of the cytotoxic functions of NK cells of these same groups, against a sensitive NK target (YAC1) and according to two effector / target ratios (200/1 and 50/1).
  • FIG. 7 STI571 blocks the maturation of DC by LPS (Fig. 7A) and prevents endotoxin shock in vivo (Fig. 7B).
  • Dendritic cells are generated from bone marrow of C57BL6 mice. These dendritic cells of medullary origin are then tested for their ability to induce proliferation of allogenic lymphocytes (panel A).
  • mice are treated by oral ingestion of STI 571 morning and evening (150 mg / kg).
  • the control groups are treated in the same way, by ingestion of PBS.
  • the mice are administered 1 mg of LPS intraperitoneally. Gavages of mice with STI 571 or PBS are continued for 48 hours.
  • FIG. 8 STI571 prevents the growth in vivo of tumors resistant to the antiproliferative effects of STI571 in vitro.
  • AK7, B16F10, RMA-S, MCA 102 or BAF3p210 cells (which carry the bcr / abl translocation) were incubated for 24 hours with the indicated doses of STI571.
  • the absolute number of surviving cells was determined using a trypan blue exclusion test.
  • the absence of anti-proliferative effect of STI571 on all tumors except for BAF3p210 cells has been confirmed in two independent experiments. The signs of proliferation are apparent.
  • the Wilcoxon test was used to compare the proliferation indexes (* p (0.05).
  • STI571 inhibits, in vivo, the growth of AK7 and MCA102. 3 ⁇ 10 6 AK7 tumor cells and 5 ⁇ 10 5 MCA102 tumor cells were inoculated subcutaneously into the abdominal flank, on day 0. The oral supply of STI571 (150 mg / kg) or PBS (200 ⁇ l) was carried out from day 20 to day 27 and from day 3 to day 10 respectively. The results of an experiment involving 7-9 mice per group appear in this figure. The Wilcoxon test was used to compare the growth kinetics ( * p (0.05)). (VS). The anti-metastatic effects of STI571 against B16F10 are mediated by NK cells.
  • Neutralizing anti-NK1.1 antibodies 300 ⁇ g of Acm PK136 per mouse or normal mouse serum (SNS) was administered intraperitoneally on day -4, -2, 0 and on day +4 to C57BL / 6 mouse.
  • 5 ⁇ 10 5 B16F10 tumor cells were injected into the tail vein on day 0.
  • the oral supply of STI571 (150 mg / kg) or PBS (200 ⁇ l) was made from day +5 to day +11 and the mice were sacrificed to enumerate lung metastases on day +11. The results of an experiment involving 7-9 mice per group appear in this figure.
  • the Kruskal Wallis multiple comparison test was used to compare the number of lung metastases (* p (0.05 between the SNS STI571 and PBS groups; ** p ⁇ 0.05 between the SNS STI571 and anti-NK1.1 mAb groups; PBS versus STI571 is not significantly different in the anti-NK1.1 mAb groups).
  • Figure 9 STI571 stimulates the inhibition of N A cell-dependent R A-S tumor growth in vivo.
  • AK7 tumor cells were inoculated on day 0 into the abdominal flank of C57BL6 mice.
  • Administration of FL started on day +11 when AK7 tumors reached a diameter of 20 ⁇ 20 mm 2 .
  • Administration was continued for 10 days and FL was combined with STI571 the day before discontinuation of administration.
  • STI571 was then maintained for 9 consecutive days (the same doses as in A, B).
  • Each experiment included 5 to 7 mice per group and was repeated twice with similar results. Kruskal Wallis' multiple comparison test was used for statistical analyzes and significant effects are indicated by asterisks.
  • Circulating peripheral lymphocytes are contained in the non-adherent fraction of mononuclear cells of peripheral blood after two hours of adhesion.
  • NK cells were isolated from PBL by negative magnetic selection (MACS, NK cell isolation kit, Miltenyi biotec) using anti-CD3, anti-CD19, anti-CD14, anti-CD36, anti-IgE antibodies coupled to a hapten, then secondary labeling with an anti-hapten antibody coupled to a microbead.
  • the negative fraction was obtained after passing through a MidiMACS magnetic column of the LS + / VS + type (Miltenyi biotec). The purity of the fraction thus depleted is evaluated by flow cytometry. Phenotyping after purification of NK includes anti CD45, anti CD3, anti CD56 antibodies. The purity of the NK CD45 + / CD3- / CD56 + thus selected varies from 85 to 95%.
  • NKs purified by negative selection are placed in culture in 96-well plates (10 5 NK / 100 L / well), bottom U for 48 hours, under 4 conditions: only in RPMI A 'medium [Gibco, 10% serum AB , 1% sodium pyruvate 100mM (Gibco-BRL, France), 0.5% penicillin-streptomycin 10,000IU / mL-10,000g / mL (Gibco-BRL, France) and 1% L-glutamine 200mM (100X, Gibco -BRL, France)].
  • RPMI A 'medium containing 1000 IU / ml of interleukin 2. in coculture with dendritic cells (DC / NK coculture ratio of 1/1, 1/10, 1/25 or 1/125 according to).
  • NK functions cytotoxicity, secretion of IFN ⁇ , positive regulation of CD69
  • the NK functions can be evaluated directly from fresh blood after purification on columns, or preferably after reactivity with allogeneic standardized dendritic cells in the presence or not of LPS 10 ⁇ g / ml .
  • NK cells are used as effectors in a cytotoxicity test against Daudi or K562.
  • the target cells are marked with chromium 51 (100 ⁇ Ci / 10 6 cells) for 1 hour, then washed 2 times. They were then distributed to 2000 cells per well in 96-well bottom V plates.
  • the maximum release of chromium 51 (Cr 51 ) is obtained by the addition of cetrimide (Sigma).
  • the effector cells are distributed according to different effector / target ratios and maintained at 37 ° C. for 4 hours. The supernatants are removed.
  • NK cells secrete interferon (IFN).
  • IFN interferon
  • allogeneic immature dendritic cells put in the presence of NK cells previously activated [by a classic cause (IL-2, IL-12, mature DC) or not (GIST under STI571)] secrete ng of TNFa.
  • the supernatants of the DC / NK cocultures are analyzed in an ELISA assay (Enzyme Linked Immunoabsorbent Assay- kit OptEIA IFN and human TNF ⁇ -Pharmingen).
  • the anti-IFN and anti-TNF ⁇ antibodies are then incubated overnight at 4 ° C. on a 96-well maxisorb plate.
  • NK cells When NK cells are activated, they can express on their surface the molecule CD69 (lectin type C). In order to evaluate the presence of this activation marker, 5 ⁇ 10 4 to 1 ⁇ 10 5 NK cells are labeled for analysis in flow cytometry.
  • the antibodies used are anti-CD56, anti-CD3, anti CD69. Isotypic controls are performed for each manipulation.
  • Example 1 Demonstration of the activation of NK cells in GIST patients treated with STI571.
  • the blood and the tumors were obtained from the CCPPRB, in GIST phase II patients placed on STI 571.
  • the NK cells were subjected to an incubation with standardized allogeneic immature dendritic cells in the presence or not of 10 ⁇ g / ml LPS.
  • NK cells of GIST patients under STI571 have the capacity to produce IFN ⁇ and to trigger the activation of immature CD (secretion of TNF ⁇ ng / ml) in vitro, on the contrary NK cells from healthy volunteers (VS) or from untreated GIST patients (Table 1, Fig. 1). Such NK activations after coculture with CD are also reflected in lytic capacity.
  • the longitudinal study on 7 patients also clearly shows the acquisition of NK activation after administration of STI571 (Fig. 1).
  • Table 2 The correlation between the immunomodulatory biological effect and the clinical effect of STI571 is illustrated in Table 2, which demonstrates that all the patients responding to the treatment have activated NK cells.
  • STI571 activates the NK functions in the presence of GIST and therefore has an immunomodulatory activity in addition to its functions which inhibit tyrosine kinase activities.
  • dendritic cells are, unlike macrophages, myeloid or lymphoid precursors that are capable of activating NK at rest, we tested the capacities of STI571, administered at 10 "6 M, 10 " 8 M and 10 " 10 M, to modulate this property.
  • CD in vivo makes it possible to modulate the activation of the NK cells of the lymphoid organs (draining nodes if injected subcutaneously, spleen if injected intravenously).
  • the incubation for 24 hours of differentiated CD with STI571 before the injection in vivo makes it possible to potentiate NK recruitment and activation in vivo (percentage of Dx5 + / CD3- cells acquiring CD69) (Fig. 5).
  • mice demonstrate that STI571 increases by a factor of 10-30 the capacity of DCs to induce secretion of IFN ⁇ by NKs at rest in vitro and to activate NKs in vivo.
  • the inventors combined STI571 with Flt3L (hematopoietic growth factor for DC in vivo) in order to test whether this association could lead to the activation of NK cells, and to the eradication of sensitive NK tumors, independently of a c-kit, abl or PDGF receptor mutation.
  • Flt3L hematopoietic growth factor for DC in vivo
  • the NK functions of the livers and spleens of the treated animals were evaluated in various ways (% CD69 on CD3- / Dx5 +, direct lytic activities of livers and spleens on YAC-1, secretion of IFN ⁇ from the lymphoid organs treated in vitro
  • Example 5 The STI571 blocks CD maturation induced by LPS and prevents septic shock
  • Dendritic cells derived from bone marrow (“BM-DC”) from H-2b mice are incubated for 24 hours in the presence of 10 ⁇ g / ml LPS. They thus overexpress L-Ab, CD40, CD80, CD86 in a very significant way. They dramatically stimulate the proliferation of alloreactive total splenocytes (H-2d) at various E: T ratios (MLR type reaction). Co-incubation of STI571 (and not AG957) with BM-DC in concomitant presence of LPS prevents induced LPS maturation and alloproliferations (Figure 7A).
  • NK cells ** The functions of NK cells are evaluated after incubation of CD3- / CD56 + NK cells in peripheral blood with allogeneic immature dendritic cells in the presence or absence of LPS.
  • STI571 exerts a therapeutic effect against NK-sensitive GIST tumors not linked to a constitutive mutation in a tyrosine kinase.
  • GIST tumors are the most common mesenchymal neoplasms of the gastrointestinal tract. Somatic mutations (providing a function) of KIT or PDGFA protooncogenes are present in 92% of GISTs [BP Rubin et al., Cancer Res. 61, 8118 (2001) and MC Heinrich, et al, Science, 299, 708 (2003)].
  • STI571 stabilizes the disease or induces partial responses in 80% of GIST patients [GD Demetri et al., N. Engl. J. Med. 347, 472 (2002)]. However, some GISTs do not respond in vitro to STI571 or become resistant.
  • STI571 Longitudinal studies of GIST patients treated with STI571 have now revealed the therapy-induced increase in the production of IFN ⁇ by NK cells, correlated with an increase in the anti-tumor response. Thus, in a phase II trial, several of the patients responding significantly to STI571 did not present any KIT or PDGFRA mutation (see Table 3). In addition to its anti-tumor activity, STI571 therefore acts indirectly on the host cells expressing KIT outside the tumor. Several tumor models resistant in vitro to the antiproliferative effects of STI571, but sensitive in vivo have thus been identified.
  • melanoma B16F10, RMA-S lymphoma, fibrosarcoma MCA102 and mesothelioma AK7 resist STI571 in vitro (Fig. 8A) but their natural growth in C57BL6 mice is significantly prevented after 8 days of oral treatment using of STI571, both for the subcutaneous expansion of AK7 and MCA102 tumors (Fig. 8B), and for the establishment of metastases B16 of the lung (Fig. 8C).
  • NK cells are critical mediators of the anti-tumor effects of STI571. Tumors refractory to the antiproliferative effects of STI571 in vitro respond to FL + STI571 in vivo in a manner dependent on NK cells.
  • the target mutations are mutations affecting in KIT exons 9, 11, 13, 17 and in PDGFRA exons 12, 14 and 18 (6). ⁇ Patients still alive at the time of the evaluation.

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Abstract

L’invention concerne l’utilisation d’inhibiteurs de tyrosine kinases pour l’immunomodulation, notamment pour réguler l’activité de cellules immunitaires chez des patients. Elle concerne plus particulièrement l’utilisation d’inhibiteurs spécifiques de tyrosine kinases pour la préparation d’une composition destinée à la prévention ou au traitement d’infections virales, de tumeurs NK sensibles, de maladies immunitaires et/ou du choc septique chez un mammifère. Les inhibiteurs concernées sont plus particulièrement des inhibiteurs des tyrosine kinases c-abl (bcr/abl), c-kit et /ou de la tyrosine kinase associée au récepteur du PDGF. L’invention décrit également des compositions comprenant un tel inhibiteur, en combinaison avec d’autres agents actifs, notamment des agents capables de potentialiser l’effet de l’inhibiteur. L’invention est utilisable de manière préventive ou curative, in vivo ou ex-vivo.

Description

UTILISATION D'INHIBITEURS SPECIFIQUES DE TYROSINE KINASES
POUR L'IMMUNOMODULATION.
L'invention concerne l'utilisation d'inhibiteurs de tyrosine kinases pour l'immunomodulation, notamment pour réguler l'activité de cellules immunitaires chez des patients. Elle concerne plus particulièrement l'utilisation d'inhibiteurs spécifiques de tyrosine kinases pour la préparation d'une composition destinée à la prévention ou au traitement d'infections virales, de tumeurs NK sensibles, de maladies immunitaires et/ou du choc septique chez un mammifère. Les inhibiteurs concernés sont plus particulièrement des inhibiteurs des tyrosine kinases c-abl (bcr/abl), c-kit et/ou de la tyrosine kinase associée au récepteur du PDGF. L'invention décrit également des compositions comprenant un tel inhibiteur, en combinaison avec d'autres agents actifs, notamment des agents capables de potentialiser l'effet de l'inhibiteur. L'invention est utilisable de manière préventive ou curative, in vivo ou ex vivo.
Les tyrosine kinases sont des enzymes clés du contrôle positif de la multiplication cellulaire. Fréquemment, des mutations de proto-oncogènes en oncogenes sont dues justement à des mutations du domaine kinase rendant l'activité tyrosine kinase constitutive et non régulable. C'est notoirement le cas dans la Leucémie Myéloïde chronique (LMC), où la translocation (9;22) aboutit à l'expression d'une protéine de fusion bcr-abl qui possède une activité tyrosine kinase permanente. Il a été clairement démontré que cette activité tyrosine kinase constitutive est le primum movens de la LMC.
Dans les tumeurs stromales gastro-intestinales (GIST), tumeurs originaires de la cellule interstitielle de Cajal (CD34+, c-kit+, desmin-, S-100-), des mutations au niveau du proto-oncogène c-kit (21-88% mutations ponctuelles ou délétions au niveau du domaine juxtamembranaire -exon 11>exon 9 ou 13-) sont également responsables de la pathogénie moléculaire (Hirota S, Science 279 (1998) 577, Miettinen M, Human Pathol 30 (1999) 1213). Ces mutations entraînent l'activation constitutive de c-kit, indépendante du ligand SCF.
Compte tenu du rôle des tyrosine kinases dans le contrôle de la multiplication cellulaire, et de la mise en évidence de cancers liés à la présence d'une mutation dans ces protéines, il a été proposé d'utiliser des inhibiteurs spécifiques de ces enzymes dans le traitement de ces cancers particuliers. Notamment, il a été proposé d'utiliser des inhibiteurs spécifiques des tyrosine kinases c-kit ou c-abl pour traiter les tumeurs présentant une mutation dans les gènes correspondants (CML, GIST).
L'inhibiteur le mieux caractérisé est le STI571 (Novartis), également désigné Gleevec, Glivec ou Imatinib Mesylate. Le STI571 (STI pour « Signal Transduction Inhibitor ») est un composé inhibiteur sélectif de certaines protéines tyrosine kinases : récepteur du PDGF, ABL tyrosine kinases (p210, p185, p190) et c-kit (CD117, récepteur du SCF) (Buchdunger E, J Pharmacol Exp Ther 295 (2000) 139 ; Druker BJ, Nat Med. 2 (1996) 561 ; Heinrich MC, Blood 96 (2000) 925). Ce composé agirait sur les mécanismes de la transduction du signal.
Le STI571 est indiqué dans le traitement de la Leucémie Myéloïde Chronique (LMC) à chromosome Philadelphie positif en crise blastique, en phase accélérée ou en phase chronique, en particulier chez des patients intolérants, réfractaires ou en échec au traitement par interféron alfa. Dans la LMC, le STI571 agit en bloquant la fixation de l'ATP sur la tyrosine kinase bcr/abl, inhibant ainsi son activité de phosphorylation du substrat principal CRKL. Cette action inhibitrice repose sur une compétition avec l'ATP au niveau de la poche de liaison de la protéine avec ce dernier.
Les phases I et II du STI571 dans les GIST (van Oosterom, Lancet 358 (2001 ) 1421 ; Joensuu H, N Engl. J. Med. 344 (2001 ) 1052) ont aussi montré plus de 50% de réponses cliniques objectives, dont certaines spectaculaires dans leur rapidité d'installation. Contrairement au modèle de la LMC, dans le GIST, on ne connaît pas le site d'action moléculaire du STI571.
Le STI 571 a également démontré in vitro une activité inhibitrice vis-à-vis de tyrosines kinases autres que celles des protéines de la famille abl, notamment vis-à-vis de celles de c-Kit et du PDGF. Kit est un récepteur de facteur de croissance dont un ligand est le « Stem Cell Factor » (SCF) ou facteur Steel, et possède un rôle capital dans la multiplication de la différenciation des précurseurs précoces hématopoïétiques.
La présente demande résulte de la mise en évidence de propriétés immuno- modulatrices particulièrement remarquables et inattendues des inhibiteurs de tyrosine kinases. La présente demande montre en particulier que, de manière surprenante, des inhibiteurs spécifiques de tyrosine kinase, tels le STI571 , sont capables d'agir sur l'activité des cellules dendritiques, et de modifier leurs propriétés. L'invention montre notamment que de tels composés permettent de moduler l'activité des cellules dendritiques immatures pour induire l'activation de cellules NK, in vitro et in vivo. L'invention montre aussi que de tels composés sont également capables d'inhiber la maturation des cellules dendritiques induite par le LPS et, de ce fait, de limiter la réponse inflammatoire. Ces résultats sont totalement inattendus dans la mesure où aucune activité immunomodulatrice pour de tels inhibiteurs n'avait été envisagée antérieurement. Cette activité est également très surprenante puisqu'elle est effective sur des cellules ne présentant pas nécessairement une mutation dans un récepteur associé à une tyrosine kinase. Cette activité est également surprenante de par son amplitude, puisque, comme cela est illustré dans les exemples, l'utilisation in vivo de tels composés permet d'aboutir à une activation des cellules NK chez 30 à 56% des malades atteints de GIST.
La mise en évidence des propriétés immuno-modulatrices de ces inhibiteurs spécifiques ouvre de nouvelles applications thérapeutiques non envisagées jusqu'à présent pour ces composés, et permet également de potentialiser ou optimiser leurs propriétés. En particulier, les nouvelles propriétés biologiques de ces inhibiteurs permettent, pour la première fois, d'envisager leur utilisation pour traiter de multiples cancers sensibles aux NK, des cancers devenus secondairement résistants aux STI571 , de traiter des cancers qui ne comportent pas la mutation c-abl, c-kit ou PDGF-R, de traiter des maladies infectieuses ou de réduire l'inflammation. En montrant l'action des inhibiteurs sur les cellules dendritiques, l'invention permet également de potentialiser fortement l'effet thérapeutique de ces composés en les combinant par exemple à des facteurs de croissance des cellules dendritiques.
La présente invention offre donc de nouvelles approches efficaces dans le traitement de cancers, maladies infectieuses ou immunes, basées sur une modulation originale et efficace de la réponse immune.
Un premier objet de l'invention réside ainsi dans l'utilisation d'un inhibiteur spécifique de tyrosine kinase pour moduler l'activité de cellules dendritiques in vivo, ex vivo ou in vitro, notamment dans l'utilisation d'un inhibiteur des tyrosine kinases c-abl, bcr/abl, c-kit et/ou de la tyrosine kinase associée au récepteur du PDGF, pour la préparation d'une composition destinée à moduler l'activité des cellules dendritiques chez un mammifère.
Un autre objet de l'invention réside dans l'utilisation d'un inhibiteur spécifique de tyrosine kinase pour stimuler l'activité de cellules NK in vivo, in vitro ou ex vivo.
Un autre objet de l'invention réside dans l'utilisation d'un inhibiteur spécifique de tyrosine kinase pour le traitement prophylactique ou curatif de tumeurs ou d'infections virales, notamment de tumeurs NK sensibles.
Un autre objet de l'invention réside dans l'utilisation d'un inhibiteur spécifique de tyrosine kinase pour augmenter l'activité NK chez des patients atteints de cancer ou d'infection virale. Un autre objet de l'invention réside dans l'utilisation d'un inhibiteur spécifique de tyrosine kinase pour réduire la réponse inflammatoire, notamment chez des sujets atteints de pathologies inflammatoires chroniques ou de maladies autoimmunes.
Un autre objet de l'invention réside dans l'utilisation d'un inhibiteur spécifique de tyrosine kinase pour favoriser la GVL lors de greffes allogéniques.
L'invention concerne également des méthodes de traitement prophylactique ou curatif de pathologies cancéreuses, infectieuses, immunes ou inflammatoires, comprenant l'administration à un patient (i) d'un inhibiteur spécifique de tyrosine kinase, seul ou en association avec un ou plusieurs autres principes actifs, ou (ii) de cellules dendritiques (de préférence autologues) traitées avec un tel composé.
L'invention concerne aussi une méthode pour moduler l'activité de cellules dendritiques chez un patient, comprenant l'administration, audit patient, d'une quantité efficace d'un inhibiteur spécifique de tyrosine kinase.
L'invention concerne aussi une méthode pour stimuler l'activité de cellules NK chez un patient, comprenant l'administration, audit patient, d'une quantité efficace d'un inhibiteur spécifique de tyrosine kinase ou de cellules dendritiques traitées par un tel inhibiteur.
L'inhibiteur de tyrosine kinase peut être utilisé seul ou, de préférence, combiné à un agent potentialisant. A cet égard, l'invention concerne également une composition comprenant un inhibiteur spécifique de tyrosine kinases et un agent potentialisant, choisi de préférence parmi un facteur de croissance des cellules dendritiques et un facteur de (co-)stimulation des cellules NK.
Elle concerne également une composition comprenant des cellules dendritiques, notamment immatures, traitées par un inhibiteur spécifique de tyrosine kinase. Elle concerne également une association thérapeutique entre un inhibiteur spécifique de tyrosine kinases et un agent potentialisant, choisi de préférence parmi un facteur de croissance des cellules dendritiques et un facteur de (co- )stimulation des cellules NK, en vue d'une utilisation séparée, simultanée ou espacée dans le temps.
Elle concerne par ailleurs une trousse comprenant un inhibiteur spécifique de tyrosine kinases et un agent stimulant la production de cellules dendritiques.
L'invention peut être utilisée dans les domaines de l'immunologie, l'immunothérapie ou de la biotechnologie médicale. Comme indiqué ci-après, l'utilisation de ces inhibiteurs en tant qu'agents immuno-modulateurs est variée. Ils trouvent des applications à la fois in vitro, ex vivo et in vivo, pour contrôler l'activité des cellules dendritiques ou des cellules NK, pour réguler la réponse immune ou inflammatoire dans différents contextes pathologiques. L'invention est utilisable chez tous les mammifères, en particulier chez l'être humain, même si un usage chez l'animal est également possible. Le terme « traitement » désigne le traitement préventif ou curatif.
Inhibiteurs spécifiques de tyrosine kinase
La présente demande concerne donc l'utilisation d'inhibiteurs spécifiques de tyrosine kinase comme immuno-modulateurs. Au sens de l'invention, on entend par inhibiteurs spécifiques de tyrosine kinase des composés capables d'inhiber préférentiellement l'activité des tyrosine kinases c-abl, bcr/abl, c-kit et/ou de la tyrosine kinase associée au récepteur du PDGF.
L'inhibition peut être partielle ou totale. Il peut s'agir de composés capables d'inhiber l'activité de la forme mutée des tyrosines kinases identifiées ci-dessus, et notamment la forme mutée active de manière constitutive, ou bien d'inhiber la forme non mutée ou surexprimée dans des cellules « normales non transformées » comme les cellules dendritiques. Les composés sont de préférence sans effet substantiel direct sur d'autres tyrosine kinases.
Les composés inhibiteurs préférés de l'invention sont des molécules chimiques de la famille des pyrimidines, tels que les composés décrits dans les demandes ou brevets n° WO01/64200, WO99/03854, EP 0564 409 et US 6,258,812. Il peut également s'agir des composés pyrido[2-3α]-pyrimidine décrits par Wisniewski D. et al. (Cancer. Res. 62 (2002) 4244).
Un inhibiteur préféré est un composé de la famille des 2- phenylaminopyrimidines, tel que le composé STI571 ou tout dérivé ou analogue de celui-ci.
Le STI571 est un inhibiteur spécifique des protéines tyrosine kinases mentionnées ci-avant, sans effet substantiel sur le récepteur de l'EGF, FLT 1 et FLT3. La demi-vie du STI571 est de 16 heures chez l'homme, et ce composé est métabolisé par le cytochrome P450 (CYP3A4, CYP2D6). Ce composé est globalement bien toléré par l'homme.
D'autres inhibiteurs spécifiques des tyrosine kinases peuvent être utilisés dans le cadre de l'invention, même si on préfère ceux ayant une activité sélective pour les tyrosine kinases c-abl, bcr/abl, c-kit et/ou associée au récepteur du PDGF. De même, des inhibiteurs peuvent être identifiés ou sélectionnés in vitro ou en tests cellulaires, en mesurant la liaison ou l'activité de composés test sur la tyrosine kinase isolée ou une cellule la contenant.
Un autre exemple d'inhibiteur est le composé AB1003 ou tout dérivé (e.g., par substitution) de celui-ci, tels que décrits dans la demande n° US60/400064. La formule du composé AB1003 [2-(2-méthyl-5-amino)phényl-4-(3-pyridyl)-thiazole] est représentée ci-dessous :
Figure imgf000009_0001
Activation des Cellules NK - Production de cellules DAK (« DC-Activated Killer ») et effets thérapeutiques
Un objet particulier de l'invention réside dans l'utilisation d'un inhibiteur spécifique de tyrosine kinase pour la préparation d'une composition destinée à activer les cellules NK d'un sujet. L'invention montre en effet que de tels composés sont capables d'augmenter la fonction NK chez des patients, in vivo, conduisant à une action anti-tumorale ou anti-infectieuse puissante. L'invention montre que cette augmentation est liée à une modulation des cellules dendritiques, leur conférant la capacité d'activer les cellules NK.
Les cellules tueuses naturelles (« cellules NK ») sont une population de lymphocytes qui représentent une ligne de défense très précoce contre les virus et les cellules tumorales. Les cellules NK peuvent être caractérisées par la présence des marqueurs CD56 et CD16, et par l'absence du marqueur CD3. Les cellules NK ont notamment été impliquées dans l'immunité anti-tumorale non spécifique d'antigènes, pour la prévention d'établissement de tumeurs primitives ou métastatiques chez l'hôte immunocompétent ou immunosupprimé. Les cellules NK semblent en particulier avoir un rôle clef contre les cellules tumorales ou les variants CMH classe I négatifs. Le rôle des cellules NK dans l'immunosurveillance anti-tumorale a été largement documenté, chez la souris (Diefenbach, Nature 413 (2001 ) 165) comme chez l'homme (A. Velardi, Science 2002). Le rôle des cellules NK dans la prévention des infections virales est également très documenté, notamment pour les virus du groupe des Herpès Viridae (C. Biron, N.Engl.J.Med. 320 (1989) 1731 ; Welsch et al., J. Exp. Med. 2001).
En raison de leurs propriétés cytotoxiques non-spécifiques d'antigène et de leur efficacité, les cellules NK constituent donc une population de cellules effectrices particulièrement intéressante pour le développement d'approches d'immunothérapie adoptive des cancers ou des maladies infectieuses. A cet égard, dans certaines indications comme les patients porteurs de lymphomes malins intensifiés, l'administration de cellules NK associées à de faibles doses d'IL-2 a donné des résultats prometteurs en situation adjuvante. Les cellules NK ont également été utilisées pour le traitement expérimental de différents types de tumeurs et certaines études cliniques ont été initiées (Kuppen et al. Int. J. Cancer. 56 (1994) 574 ; Lister et al., Clin. Cancer Res. 1 (1995) 607 ; Rosenberg et al., N. Engl. J. Med. 316 (1987) 889). Il a également été montré que les cellules NK favorisent la GVL dans les greffes de moelle allogénique. En outre, ces cellules peuvent également être utilisées in vitro pour la lyse non spécifique de cellules n'exprimant pas de molécules du CMH de classe-l et, plus généralement, de toute cellule sensible aux cellules NK.
La possibilité d'activer in vivo les cellules NK d'un patient offre donc de multiples avantages et applications thérapeutiques.
Les méthodologies d'activation des cellules NK décrites dans l'art antérieur sont essentiellement dépendantes de l'utilisation de cytokines. Les cellules NK sont activables par des cytokines in vitro ou en administration systémique in vivo (IL- 2, IL-12, IFN type I ou II, IL-15 en association ou non avec 1L-1 b, IL-18, IL-21 ou des chemokines). Cependant, le rôle physiopathologique de ces cytokines pour l'activation NK in vivo n'a jamais été démontré. De plus, l'application clinique des cytokines est limitée, notamment en raison des coûts de préparation de ces dernières, du caractère toxique de nombre d'entre elles, qui ne peuvent être utilisées dans des applications in vivo, ou encore du caractère non spécifique de nombreuses cytokines, dont l'emploi in vivo risque de s'accompagner de nombreux effets indésirables. En outre, la fonction « natural killing » étant souvent altérée chez les patients porteurs de tumeurs, la possibilité de prélever ces cellules en vue de leur activation ex vivo peut être considérablement réduite.
Les inventeurs ont précédemment démontré que les cellules dendritiques (CD) étaient des cellules électivement capables d'activer les cellules NK in vitro et in vivo, conduisant à des effets anti-tumoraux (WO99/45102, Fernandez et al. Eur. Cyt. Net. 13 (2002) 17-27 ; Zitvogel L . JEM 195 (2002) F9-14).
Les inventeurs ont maintenant découvert que, de manière surprenante, les inhibiteurs spécifiques de Tyrosine Kinases, tels le STI571 , induisent in vivo ou in vitro, une modification phénotypique des cellules dendritiques qui leur confère le pouvoir d'activer des cellules NK. Dans ce cadre, les inventeurs ont notamment mis en évidence que l'administration à un mammifère d'un inhibiteur spécifique de tyrosine kinase induit une augmentation très prononcée de la fonction et de l'activité des cellules NK. Ils ont par ailleurs observé que des inhibiteurs de tyrosine kinases, de type STI571 , sont capables d'activer les fonctions NK chez des patients porteurs de GIST. Ainsi, chez des patients GIST traités par le STI571 , les cellules NK sont activées chez 30 à 56% des patients et ces données biologiques d'activation des NK semblent corréler avec les réponses cliniques obtenues sous STI571 (avec notamment, aucune résistance primaire au STI571 chez les répondeurs biologiques). Ces résultats démontrent donc, in vivo, chez l'homme, que des inhibiteurs de tyrosine kinases, tels que le STI571 , présentent des activités immunomodulatrices en plus de leurs fonctions inhibitrices des activités tyrosine kinase déjà décrites.
Ces résultats permettent donc d'élargir les applications thérapeutiques de ces molécules et d'optimiser leurs effets.
La présente invention concerne ainsi l'utilisation d'un inhibiteur spécifique de tyrosine kinase pour la préparation d'une composition destinée à augmenter l'activité NK chez des patients atteints de cancer ou d'infection (virale, bactérienne ou parasitaire).
Un objet particulier de l'invention réside dans l'utilisation d'un inhibiteur spécifique de tyrosine kinase c-abl, bcr/abl, c-kit et/ou associée au récepteur du PDGF pour la préparation d'une composition destinée à la prévention ou au traitement des infections, notamment virales.
Un autre objet particulier de l'invention réside dans l'utilisation d'un inhibiteur spécifique de tyrosine kinase c-abl, bcr/abl, c-kit et/ou associée au récepteur du PDGF pour la préparation d'une composition destinée à la prévention ou au traitement des tumeurs NK sensibles non liées à une mutation constitutive dans une tyrosine kinase, ou résistantes au STI571.
Elle concerne également l'utilisation d'un inhibiteur spécifique de tyrosine kinase pour la préparation d'une composition destinée à induire chez un mammifère une modification phénotypique des cellules dendritiques et permettre ou augmenter l'activation des cellules NK.
Elle concerne par ailleurs une méthode pour induire une modification phénotypique des cellules dendritiques et/ou pour activer les cellules NK, comprenant la mise en contact in vitro, in vivo ou ex vivo de cellules dendritiques, seules ou co-cultivées avec des cellules NK, avec un inhibiteur de tyrosine kinase c-abl, bcr/abl, c-kit et/ou associée au récepteur du PDGF.
L'invention concerne également une méthode de traitement préventif ou curatif d'un patient atteint d'un cancer ou d'une infection virale, comprenant l'administration d'une quantité d'inhibiteur spécifique de tyrosine kinase efficace pour activer la fonction NK chez le patient.
L'invention concerne par ailleurs une méthode pour activer les cellules NK chez un sujet, comprenant l'administration au sujet d'un inhibiteur de tyrosine kinases c-abl, bcr/abl, c-kit et/ou de la tyrosine kinase associée au récepteur du PDGF. Le sujet est de préférence un être humain mais il peut également s'agir d'un animal.
L'invention peut être utilisée également pour augmenter la survie de populations lymphocytaires NK, in vitro, ex vivo ou in vivo, ainsi que pour augmenter, le cas échéant, la prolifération de sous-population(s) lymphocytaire(s) NK.
Pour la mise en œuvre de l'invention, l'inhibiteur spécifique de tyrosine kinase peut être utilisé seul. Néanmoins, dans une variante préférée et particulièrement efficace, l'inhibiteur est utilisé de façon combinée à un autre agent actif. Cet agent actif peut être de natures diverses, mais il s'agit préférentiellement d'un agent potentialisant l'action de l'inhibiteur, comme notamment un facteur de croissance des cellules dendritiques ou un facteur de (co-)stimulation des cellules NK. En effet, l'invention montre que des inhibiteurs spécifiques de tyrosine kinase peuvent permettre de stimuler in vivo la fonction NK chez des sujets, et que cette stimulation implique une modification phénotypique des cellules dendritiques. En combinant plusieurs agents actifs sur la production, sur la modification des cellules dendritiques et/ou sur l'activation des NK, un effet biologique plus puissant peut donc être obtenu. En particulier, en combinant un facteur de croissance des cellules dendritiques et un inhibiteur selon l'invention, il est possible de produire une stimulation des fonctions NK suffisante pour obtenir un effet thérapeutique, même vis-à-vis de cellules pathologiques résistantes à l'action de l'inhibiteur seul.
Dans une variante préférée de l'invention, on utilise donc un inhibiteur tel que défini ci-dessus en combinaison avec un agent potentialisant. Le terme « combinaison » indique que les deux agents peuvent être utilisés de manière simultanée ou espacée dans le temps, dans la mesure où leurs effets biologiques sont combinés in vivo. Les agents peuvent donc être conditionnés simultanément ou de manière séparée, et administrés de manière concomitante ou décalée dans le temps. Dans un premier mode de réalisation, l'agent potentialisant est capable d'amplifier les cellules dendritiques, c'est-à-dire d'augmenter leur différentiation, leur croissance ou leur activité. Il s'agit préférentiellement d'un facteur de croissance des cellules dendritiques, avantageusement choisi parmi le Flt3Ligand (« Flt3L ») décrit par Lyman S.D. et al. (Blood 83 (1994) 2795-2801) et par Maraskovsky E. et al. (J. Exp. Med. 184 (1996) 1953-1962), le GM-CSF, l'interleukine-4, l'interleukine-13 et leurs dérivés ou analogues. Il peut s'agir notamment de la progénipoiétine (ProGP4, molécule de fusion entre le G-CSF et le Flt3L), d'une fusion GM-CSF/IL-4, etc. Cet agent peut être utilisé de façon simultanée ou décalée dans le temps par rapport à l'inhibiteur des tyrosines kinases.
Dans un autre mode de réalisation, l'agent potentialisant est un facteur de co- stimulation des cellules NK, et notamment toute lymphokine ou cytokine susceptible d'activer ou de favoriser l'activation des cellules NK. On peut citer par exemple l'IL-2, l'IL-12, l'IL-15, l'interféron de type I, etc.
Dans un mode de réalisation particulier, on utilise un inhibiteur tel que défini ci- dessus en combinaison avec un facteur de croissance des cellules dendritiques et/ou un facteur de co-stimulation des cellules NK. Une combinaison particulièrement préférée comprend l'inhibiteur et le Flt3L (ou un variant ou analogue de celui-ci).
A cet égard, un autre objet de l'invention réside également dans une composition comprenant un inhibiteur spécifique de tyrosine kinase tel que défini ci-dessus et un agent potentialisant, choisi de préférence parmi un facteur de croissance des cellules dendritiques et un facteur de co-stimulation des cellules NK. L'agent potentialisant est choisi à titre spécifique parmi les cytokines ou lymphokines activant les cellules NK ou parmi le Fit 3L, le GM- CSF, l'IL-4, l'IL-13 et leurs dérivés ou analogues (ProGP4, GM/IL-4). Les compositions selon l'invention peuvent naturellement comprendre en outre tout véhicule ou excipient acceptable sur le plan pharmaceutique, tel que des solutés isotoniques, tamponnés des solutions salines, agents stabilisants, etc.
Les applications des compositions et méthodes de l'invention sont nombreuses, de par le spectre d'action large des cellules NK. Elles incluent préférentiellement le traitement prophylactique ou curatif de différentes pathologies telles que les cancers ou les maladies infectieuses, notamment d'origine virale ou résultant d'autres pathogènes, et les immunodéficiences congénitales NK ou apparentées (déficits immunitaires conduisant à une mutation dans le gène IFNγ-R, IL- 12R...).
Pour les applications dans le domaine du traitement des cancers, les compositions ou méthodes selon l'invention sont en particulier utilisables pour retarder ou supprimer la croissance de tumeurs, induire une régression de la taille des tumeurs, ralentir ou prévenir la formation de métastases, etc., notamment des tumeurs exprimant faiblement des molécules de classe I du CMH ou possédant des ligands pour des récepteurs activateurs de NK ou d'autres cellules pathologiques. Elles permettent également de prévenir l'établissement de tumeurs primitives ou metastatiques chez un mammifère immunocompétent ou immunosupprimé pour les fonctions lymphocytaires T.
L'invention peut être utilisée pour prévenir ou traiter toute tumeur NK sensible, notamment celles choisies parmi les carcinomes, les mélanomes, les leucémies, les lymphomes et les sarcomes. L'invention est particulièrement adaptée au traitement préventif ou curatif des mélanomes, du cancer du rein, des sarcomes du tube digestif, de la leucémie myéloïde chronique (LMC) et des neuroblastomes.
II s'agit plus particulièrement du traitement préventif de cancers ne présentant pas de mutation dans une tyrosine kinase, ou présentant une mutation non constitutive, ou de tumeurs résistantes in vitro au STI571. Dans le cas de tumeurs NK sensibles présentant une mutation dans une tyrosine kinase, l'invention permet d'améliorer l'efficacité thérapeutique en utilisant une thérapie de combinaison avec un agent potentialisant, tel que mentionné ci-avant.
A cet égard, l'invention concerne spécifiquement l'utilisation d'un inhibiteur de tyrosine kinase tel que défini ci-avant, en combinaison avec un agent potentialisant, pour la préparation d'une composition destinée au traitement prophylactique ou curatif de la LMC ou du GIST. Elle concerne également une méthode de traitement correspondante.
L'invention concerne également l'utilisation d'un inhibiteur de tyrosine kinase tel que défini ci-avant, en combinaison avec un agent potentialisant, pour la préparation d'une composition destinée au traitement prophylactique ou curatif d'une tumeur résistante au STI571. Elle concerne également une méthode de traitement correspondante.
Dans le domaine des pathologies infectieuses, l'invention peut être utilisée pour le traitement prophylactique ou curatif en particulier une infection virale causée par un virus du groupe des Herpès Viridae (l'Herpès virus type 1 ou 2, le virus d'Epstein-Barr, le cytomegalovirus, le Kaposi sarcoma-virus, HSV-6, etc.), le VIH, le Vaccinia virus, le MVM, l'ECMV ou le Papilloma Virus. Elle peut également être utilisée pour traiter des infections microbiennes ou parasitaires.
L'invention peut également être mise en œuvre en utilisant une population de cellules dendritiques traitées ex vivo par un inhibiteur de tyrosine kinase tel que défini ci-avant. L'injection de cellules dendritiques ainsi traitées, de préférence autologues, permet également d'induire une activation de la fonction NK d'un sujet.
Dans ce contexte, l'invention concerne également une composition comprenant des cellules dendritiques traitées par un inhibiteur des tyrosines kinases telles que mentionnées précédemment. Elle concerne également une composition comprenant un inhibiteur de tyrosine kinase tel que défini précédemment et des cellules dendritiques et/ou des cellules NK. Selon un aspect particulier de l'invention, la composition comprend un inhibiteur de tyrosine kinase tel que défini précédemment et des cellules dendritiques.
Selon un autre aspect, la composition comprend un inhibiteur de tyrosine kinase tel que défini précédemment, des cellules dendritiques et des cellules NK.
Elle concerne également un procédé de préparation ou de traitement in vitro ou ex vivo de cellules dendritiques, comprenant la mise en contact de cellules dendritiques (ou de leurs précurseurs) en présence d'un inhibiteur spécifique de tyrosine kinase. Les cellules obtenues peuvent être collectées et conditionnées en vue d'une utilisation immédiate ou future.
Les cellules dendritiques sont typiquement traitées par incubation en présence de l'inhibiteur, par exemple en présence de STI571 , à raison de 10"δ à 10"8 molaire environ. On préfère utiliser des cellules dendritiques non matures. De manière préférée, des cellules dendritiques humaines CD34+ sont mises en présence de SCF, Flt3L, GM-CSF et TNFα pendant 7 à 15 jours environ (de préférence 12 jours), puis en présence de STI571 pendant 12 à 48 heures environ (de préférence 24h environ). Il est entendu que les conditions précises peuvent être adaptées par l'homme du métier. Les cellules ainsi obtenues présentent la capacité d'activer les cellules NK, et peuvent être conditionnées en vue de leur utilisation thérapeutique, ou utilisées pour activer des cellules NK in vitro ou ex vivo, notamment par co-culture. Dans ce contexte, une activation optimale des cellules NK est observée par exemple après co-culture pendant une période comprise entre 20 à 48 heures environ. Le ratio de co-culture est idéalement d'une cellule dendritique pour 25 à 125 cellules NK environ.
Pour une utilisation in vitro ou ex vivo, l'invention peut être mise en œuvre dans tout dispositif approprié à la culture cellulaire, de préférence en conditions stériles. Il peut s'agir notamment de plaques, boites de culture, flasques, fioles, poches, etc. La culture ou la co-culture est par ailleurs réalisée dans tout milieu adapté à la culture des cellules dendritiques et/ou des cellules NK. Il peut s'agir plus généralement de milieux de culture disponibles dans le commerce pour la culture de cellules de mammifères, tels que par exemple le milieu RPMI, le milieu DMEM, le milieu IMDM ou des milieux GBEA (AIMV, X-VIVO), etc.
Dans une variante particulière, l'activation des cellules NK est réalisée par coculture in vitro ou ex vivo de cellules dendritiques immatures avec des cellules NK, en présence d'un inhibiteur des tyrosine kinases c-abl, bcr/abl, c-kit et/ou de la tyrosine kinase associée au récepteur du PDGF.
Dans un autre mode de réalisation particulier de l'invention, l'activation des cellules NK est réalisée par traitement in vitro ou ex vivo de cellules dendritiques immatures en présence d'un inhibiteur des tyrosine kinases c-abl, bcr/abl, de c- kit et/ou de la tyrosine kinase associée au récepteur du PDGF, puis co-culture des cellules dendritiques ainsi obtenues avec des cellules NK.
Dans un autre mode de l'invention, l'activation des cellules NK est réalisée par traitement in vitro ou ex vivo de cellules dendritiques immatures en présence d'un inhibiteur des tyrosine kinases c-abl, bcr/abl, de c-kit et/ou de la tyrosine kinase associée au récepteur du PDGF, puis administration des cellules dendritiques ainsi obtenues à un sujet.
Lorsque les cellules NK ou les cellules dendritiques ont ainsi été activées, il est possible soit de séparer les cellules NK des cellules dendritiques, soit de récolter directement la co-culture cellules NK/CD.
Le terme « activation » des cellules NK au sens de l'invention désigne plus particulièrement la régulation positive précoce du CD69, surtout sur la population CD56bnght des NK (celle qui s'expand chez les patients porteurs de GIST traités par STI571 ), l'augmentation de la production d'IFNγ et/ou de l'activité cytotoxique des cellules NK. Ces trois paramètres peuvent être aisément mesurés selon les techniques connues de l'homme du métier. Le terme cellules NK « activées » désigne au sens de l'invention des cellules NK présentant au moins une des propriétés mentionnées ci-dessus. Il est aussi possible de détecter une activation NK par la capacité de ces cellules à libérer de façon prolongée de forts taux d'IFNγ en présence de " CD immatures " et, éventuellement, en présence de LPS.
Dans les compositions selon l'invention qui comprennent des cellules dendritiques et ou des cellules NK, les populations cellulaires sont préférentiellement autologues, c'est-à-dire issues d'un même organisme. Elles peuvent également être constituées de cellules allogéniques. En outre, il peut également s'agir de cellules dendritiques sensibilisées à un ou plusieurs antigènes ou au contraire de cellules « naïves ». Ces compositions sont avantageusement constituées de populations cellulaires isolées, c'est-à-dire que chacune des populations cellulaires est composée au moins de 10%, de préférence au moins 30%, notamment au moins 50% du type cellulaire correspondant (NK ou dendritique). Ces compositions peuvent être conditionnées dans tout dispositif adapté tel que poches, fioles, ampoules, seringues, flacons, etc., et peuvent être conservées (au froid) ou utilisées extemporanement, comme décrit plus loin. Avantageusement, ces compositions comprennent de 104 à 109 cellules dendritiques traitées, de préférence de 105 à 108 environ.
L'administration de l'inhibiteur ou des cellules (dendritiques ou NK) peut être réalisée par toute technique et toute voie connue, et notamment par injection ou prise orale. Il peut s'agir par exemple d'une injection sous cutanée, systémique (intra-veineuse, intra-artérielle, intra-péritonéale) ou intra-musculaire. Lorsque cela est possible, l'inhibiteur est avantageusement administré par voie orale. L'injection est de préférence une injection locale ou régionale, notamment une injection au site ou proche du site à traiter, notamment proche d'une tumeur. Les injections sont généralement réalisées sur la base de doses de cellules pouvant aller de 104 à 109 cellules dendritiques, de préférence comprises entre 105 et 107 inclus. Il est possible d'effectuer le transfert passif de cellules dendritiques par des administrations répétées, par exemple 1 à 2 administrations par semaine pendant plusieurs mois. Le composé inhibiteur peut être administré à des doses variées, comprises par exemple entre 200 et 800 mg per os/jour, de préférence entre 400 mg et 600 mg per os/jour, notamment en cas d'association avec un agent potentialisant (par exemple Flt3L se 10-50 μg/kg pendant 10-20 jours). L'utilisation de l'inhibiteur in vitro ou ex vivo sur les cellules dendritiques avant transfert passif est réalisée préférentiellement à la dose de 10"6M ou 10"8M. Des administrations répétées sont bien entendu possibles. En outre, le protocole d'administration peut être adapté par l'homme du métier selon les situations (préventif, curatif, tumeurs isolées, métastases, infection importante ou localisée, etc.).
ACTION ANTI-INFLAMMATOIRE
Les demandeurs ont également découvert que des inhibiteurs spécifiques de tyrosine kinase, tels que définis ci-avant, permettaient de bloquer la maturation des cellules dendritiques induite par un agent microbien tel que le LPS ou par un signal « Toll-like 4» .
Cette propriété immuno-modulatrice des inhibiteurs permet d'envisager une modulation négative de la réponse inflammatoire ou de la réponse immune dans différents contextes pathologiques. En effet, la maturation des cellules dendritiques participe activement au développement de la réaction inflammatoire, et la possibilité de contrôler cette propriété offre donc de nouvelles approches thérapeutiques dans le traitement ou le contrôle de l'inflammation.
L'invention concerne donc une méthode pour prévenir ou inhiber la maturation des cellules dendritiques, notamment celle induite par une toxine telle le LPS, comprenant la mise en contact in vitro, ex vivo ou in vivo des cellules dendritiques avec un inhibiteur des tyrosine kinases c-abl, bcr/abl, de c-kit et/ou de la tyrosine kinase associée au récepteur du PDGF.
L'invention concerne également l'utilisation d'un inhibiteur spécifique de tyrosine kinase tel que défini ci-avant pour le traitement préventif ou curatif des maladies immunitaires et/ou inflammatoires chez un mammifère.
L'invention concerne également l'utilisation d'un inhibiteur spécifique de tyrosine kinase tel que défini ci-avant pour la préparation d'une composition destinée au traitement de pathologies inflammatoires, notamment chroniques, telles que l'athérosclérose, la maladie de Crohn, l'asthme (chronique), la polyarthrite rhumatoïde, la dermatite (chronique), le choc septique ou endotoxinique, etc. Dans ce contexte, le terme traitement inclut également une réduction de la réponse inflammatoire, même partielle et/ou temporaire, conduisant à une amélioration de la qualité de vie des patients.
L'invention concerne également l'utilisation d'un inhibiteur spécifique de tyrosine kinase tel que défini ci-avant pour la préparation d'une composition destinée au traitement de pathologies auto-immunes.
L'invention concerne également l'utilisation d'un inhibiteur spécifique de tyrosine kinase tel que défini ci-avant pour la préparation d'une composition destinée à la greffe allogénique. L'invention est particulièrement adaptée à l'amélioration des greffes de moelle allogénique. En effet, en stimulant l'activité NK, l'invention permet d'améliorer l'activité GVL (« graft versus Leukemia »), et donc le bénéfice thérapeutique. Mais de plus, en réduisant la maturation des cellules dendritiques et donc, potentiellement, l'activation de lymphocytes T cytotoxiques alloréactifs, l'inhibiteur permet en outre de réduire la GVHD (« Graft Versus Host Disease ») et ainsi d'améliorer la sécurité du traitement. L'invention peut donc être utilisée avantageusement pour traiter un hôte recevant un greffon de moelle allogénique, HLA non compatible. L'invention peut également être utilisée pour prévenir ou traiter des maladies immunitaires congénitales, telles qu'un déficit en récepteur à l'IL-12, un déficit en récepteur à l'IFNγ, un déficit en chaîne gamma (IL-2Rγ) commune des récepteurs aux cytokines (syndrome SCID).
Pour ces différentes applications, les doses administrées et les modes d'administration décrits précédemment sont directement applicables.
D'autres avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs. Le contenu de toutes les références citées dans la description et dans les exemples, y compris les articles, brevets et demandes de brevets, est incorporé entièrement à la présente par référence.
LEGENDE DES FIGURES
Tableau 1 : Corrélation biologique entre STI571 et l'activation des NK.
Une cohorte de patients pris en charge à l'institut Gustave Roussy a été étudiée pour le traitement d'un GIST. Les NK des patients ont été purifiées par sélection négative à partir du sang périphérique. Les fonctions des cellules NK (sécrétion d'interféron gamma et cytotoxicité) ont été analysées après culture avec des cellules dendritiques allogéniques. Dans 14 cas, les prélèvements sont effectués avant l'introduction du STI 571 ; dans 31 cas, les prélèvements sont effectués pendant le traitement par STI 571. Une cohorte de 17 volontaires sains est étudiée selon les mêmes modalités.
Les fonctions cytotoxiques sont rapportées en pourcentage de lyse spécifique d'une cible sensible à la lyse NK (K562). Les résultats sont rapportés sous forme d'une moyenne pour chaque groupe étudié. L'analyse des données est réalisée en utilisant des tests exacts de Fisher qui permettent de mettre en évidence les différences statistiquement significatives entre les groupes. Tableau 2 : Corrélation entre effets biologiques et cliniques du STI571.
Les cellules NK activées par des cellules dendritiques matures (présence de LPS) ont la capacité de sécréter de l'interféron gamma. Cette production d'interféron gamma a été définie comme significative si l'on pouvait mesurer plus de 100 pg/mL dans les surnageants des cocultures. Les patients répondant à ce critère sont définis comme répondeurs biologiques. Une corrélation est établie entre ces patients et l'efficacité clinique du STI 571. La distribution des patients dont la maladie progresse sous STI 571 est étudiée en fonction de la réponse biologique.
Aucun patient identifié comme répondeur biologique ne présente une maladie progressive sous STI 571 , alors que 5 des 16 patients non répondeurs biologiquement, progressent cliniquement( p=0,042 ;Fisher exact test).
Figure 1 : Suivi longitudinal de sept patients GIST sous STI571. Acquisition des fonctions NK.
Concernant 7 patients, des prélèvements et des mesures de la production d'interféron gamma sont disponibles. La figure 1 rapporte l'étude des fonctions
NK avant et pendant le traitement par STI 571. Pour deux patients, une nette augmentation des cellules NK CD56bright (panel A) a pu être mise en évidence.
Pour les sept patients suivis, les sécrétions d'interféron gamma sont augmentées lors de l'exposition au STI 571 (panel B).
Figure 2. Les cellules dendritiques incubées en présence de STI 571 sont capables d'activer les cellules NK.
Des cellules dendritiques humaines sont générées à partir de cellules souches hematopoïetiques, en présence de GM-CSF et de TNFα, pendant 12 jours. Ces cellules dendritiques sont ensuite incubées avec du STI 571 pendant 24 heures.
Deux expériences représentatives menées sur deux prélèvements différents (A et B) sont rapportées. Les fonctions cytotoxiques NK sont étudiées par des tests de lyse utilisant des cibles marquées au chrome 51 et sensibles à la lyse NK (K562). Dans les deux cas, le STI 571 confère aux cellules dendritiques la capacité à activer les cellules NK.
Figure 3 : Les cellules dendritiques incubées en présence de STI571 sont capables d'activer les cellules NK.
Le STI 571 confère aux cellules dendritiques la capacité d'activer les cellules NK. Des cellules dendritiques d'origine murine, dérivées de moelle osseuse ou de rate sont pré-incubées avec du STI 571 à des doses croissantes puis cultivées avec des cellules NK. L'utilisation du STI 571 permet d'augmenter la sécrétion d'interféron gamma par les NK cultivés en présence de cellules dendritiques. De plus, il existe un effet dose entre les doses de STI 571 utilisées et l'effet biologique observé. L'expérience précédente est renouvelée en présence d'un inhibiteur de phosphorylation non spécifique (AG 957) et du STI 571. Cette expérience révèle que les résultats précédents sont spécifiques du STI 571.
Figure 4. L'analogue du STI, AB1003, augmente la capacité des cellules dendritiques à activer les cellules NK.
Les expériences précédentes sont reproduites en utilisant un analogue synthétique du STI 571 , AB1003. Cette molécule confère également aux cellules dendritiques une fonction activatrice des cellules NK.
Figure 5 : Activation in vivo de NK par injection de cellules dendritiques incubées en présence de STI571.
Des cellules dendritiques murines sont pré-incubées avec du ST1571 puis injectées, par voie sous cutanée, dans les membres inférieurs des souris. Les ganglions drainant sont recueillis et les fonctions des cellules NK analysées après purification. L'utilisation de cellules dendritiques pré-incubées avec du STI 571 permet l'activation in vivo des NK dans le ganglion drainant comme en atteste la présence de CD69 sur la membrane des NK étudiées.
Figure 6 : Activation in vivo de NK par injection de STI571 et d'un facteur de croissance des cellules dendritiques.
Des souris Nude sont traitées pendant 10 jours par des injections intra- péritonéales de Flt3L. Ceci permet le recrutement et la différenciation de précurseurs dendritiques. Le STI 571 est administré par gavage (per os), du J8 au J12. Les rates et les foies des souris sont ensuite prélevés pour purification des cellules NK. Les tests fonctionnels réalisés montrent une activation des cellules NK dans le groupe traité par l'association Flt3L+STI, au contraire des groupes contrôles (souris traitées par PBS IP, IL2 IP, PBS IP+ gavages de STI 571 , Flt3-L IP+ gavages de PBS). Les panels A et B présentent l'analyse par cytométrie en flux de la présence du CD69 (marqueur membranaire d'activation) à la surface des cellules NK (DX5+), dans la rate et le foie des souris. Les panels C et D présentent les capacité de ces cellules NK, purifiées à partir des rates des souris de chaque groupe, à sécréter de l'interféron gamma après une phase de culture avec des cellules dendritiques.
Le panel E représente l'étude des fonctions cytotoxiques des cellules NK de ces mêmes groupes, contre une cible NK sensible (YAC1) et selon deux ratios effecteur/cible (200/1 et 50/1).
Figure 7 : Le STI571 bloque la maturation des DC par le LPS (Fig. 7A) et prévient le choc endotoxinique in vivo (Fig. 7B).
Des cellules dendritiques sont générées à partir de moelle osseuse de souris C57BL6. Ces cellules dendritiques d'origine médullaire sont ensuite testées pour leur capacité à induire une prolifération des lymphocytes allogéniques (panel A). Les cellules dendritiques cultivées en GM-CSF et IL4 (BM-DC), activées par du LPS (BM-DC+LPS) ou par du STI 571 (BM-DC STI) ou par un inhibiteur non spécifique de phosphorylation (BM-DC AG), sont cultivées en présence de lymphocytes allogéniques pendant 5 jours. La prolifération des lymphocytes est évaluée par leur capacité à intégrer de la thymidine tritiée. Le STI ne stimule pas la prolifération des lymphocytes allogéniques. Son effet immunomodulateur s'avère spécifique de la population lymphocytaire NK.
Cette capacité d'inhibition des signaux inflammatoires comme le LPS est également testée dans le modèle du choc endotoxinique. Des souris C57BL6 sont traitées par ingestion per os de STI 571 matin et soir (150mg/kg). Les groupes contrôles sont traités de la même manière, par ingestion de PBS. Au décours de 24 heures de traitement, on administre aux souris 1 mg de LPS par voie intrapéritonéale. Les gavages des souris avec du STI 571 ou du PBS sont poursuivis 48 heures.
Figure 8 : Le STI571 empêche la croissance in vivo de tumeurs résistantes aux effets anti-prolifératifs du STI571 in vitro.
(A). Modèles de tumeurs de souris résistantes au STI571 in vitro.
Les cellules AK7, B16F10, RMA-S, MCA 102 ou BAF3p210 (qui sont porteuses de la translocation bcr/abl) ont été incubées pendant 24 heures avec les doses indiquées de STI571. Le nombre absolu de cellules survivantes a été déterminé à l'aide d'un test d'exclusion au bleu trypan. L'absence d'effet anti-prolifératif du STI571 sur l'ensemble des tumeurs à l'exception des cellules BAF3p210 a été confirmé dans deux expérimentations indépendantes. Les indices de prolifération sont apparents. Le test de Wilcoxon a été utilisé pour comparer les indexes de prolifération (* p(0.05).
(B). Le STI571 inhibe, in vivo, la croissance de AK7 et MCA102. 3x106 cellules de tumeur AK7 et 5x105 cellules de tumeur MCA102 ont été inoculées en sous-cutané dans le flanc abdominal, au jour 0. L'apport oral en STI571 (150 mg/kg) ou PBS (200 μl) a été réalisé du jour 20 au jour 27 et du jour 3 au jour 10 respectivement. Les résultats d'une expérience impliquant 7-9 souris par groupe apparaissent sur cette figure. Le test de Wilcoxon a été utilisé pour comparer les cinétiques de croissance (*p(0.05)). (C). Les effets anti-métastatiques du STI571 à encontre du B16F10 sont médiés par les cellules NK.
Des anticorps neutralisants anti-NK1.1 (300 μg d'Acm PK136 par souris) ou du sérum normal de souris (SNS) a été administré en intra-péritonéal au jour -4, -2, 0 et au jour +4 à des souris C57BL/6. 5χ105 cellules de tumeur B16F10 ont été injectées dans la veine de la queue au jour 0. L'apport oral de STI571 (150 mg/kg) ou PBS (200 μl) a été réalisé du jour +5 au jour +11 et les souris ont été sacrifiées pour procéder à l'énumération des métastases du poumon au jour +11. Les résultats d'une expérience impliquant 7-9 souris par groupe apparaissent sur cette figure. Le test de comparaison multiple de Kruskal Wallis a été utilisé pour comparer le nombre de métastases du poumon (*p(0.05 entre les groupes SNS STI571 et PBS ; ** p<0.05 entre les groupes SNS STI571 et Acm anti-NK1.1 ; PBS contre STI571 n'est pas significativement différent dans les groupes Acm anti-NK1.1).
Figure 9 : Le STI571 stimule l'inhibition de la croissance des tumeurs R A-S dépendante des cellules NK in vivo.
(A, B). FL et STI571 agissent en synergie pour prévenir la croissance de la tumeur RMA-S in vivo.
1 x10e cellules RMA-S déficientes, qui sont des cibles des NK (A), ou les cellules RMA TAP-suffisantes, qui ne sont pas des cibles des NK (B), ont été inoculées dans chacun des flancs abdominaux opposés de souris C57BL6 au jour 0. Du jour -6 au jour +3, FL (10μg/jour) ou PBS seul (200 μl) ont été injectés en ip. Du jour +1 au jour +4, le STI571 (150 mg/kg) ou le PBS (200μl) a été administré oralement. Le nombre de souris sans tumeur (sur 5 souris) à la fin de l'expérience est indiqué entre parenthèses.
(C, D). La combinaison de FL+STI571 promeut les effets anti-tumoraux dépendants des cellules NK sur des tumeurs volumineuses établies. L'anticorps neutralisant anti-NK1.1 Acm (300 μg d'Acm PK136 par souris) a été administré aux jours + 8, +10, +13, +17, +22 et +29. 1χ106 cellules RMA-S ont été inoculées dans le flanc abdominal au jour 0. L'administration de FL a commencé au jour +13 quand les tumeurs ont atteint un diamètre de 50+20 mm2. L'administration de FL a été maintenue pendant 10 jours et a été combinée au STI571 des jours +20 à +23 (les mêmes doses que dans A, B). Chaque expérience incluait 5 souris par groupe, a été répétée deux fois et a donné des résultats similaires.
(E). La combinaison de FL+STI571 induit des effets anti-tumoraux significatifs à l'encontre de AK7.
3x106 cellules de tumeur AK7 ont été inoculées au jour 0 dans le flanc abdominal de souris C57BL6. L'administration de FL a démarré au jour +11 quand les tumeurs AK7 ont atteint un diamètre de 20±20 mm2. L'administration a été maintenue pendant 10 jours et FL a été combiné au STI571 le jour précédant l'arrêt de son administration. STI571 a ensuite été maintenu pendant 9 jours consécutifs (les mêmes doses que dans A, B). Chaque expérience incluait 5 à 7 souris par groupe et a été répétée deux fois avec des résultats similaires. Le test de comparaison multiple de Kruskal Wallis a été utilisé pour des analyses statistiques et les effets significatifs sont indiqués par des astérisques.
PARTIE EXPERIMENTALE
Matériels et Méthodes :
Purification des cellules NK
Les lymphocytes circulants périphériques (PBL) sont contenus dans la fraction non-adhérente des cellules mononucléées du sang périphérique après deux heures d'adhérence. Les cellules NK ont été isolées des PBL par sélection négative magnétique (MACS, NK cell isolation kit, Miltenyi biotec) utilisant des anticorps anti-CD3, anti-CD19, anti-CD14 , anti-CD36, anti-IgE couplés à un haptène, puis un marquage secondaire par un anticorps anti-haptène couplé à une microbille. La fraction négative a été obtenue après passage sur une colonne magnétique MidiMACS de type LS+/VS+ (Miltenyi biotec ). La pureté de la fraction ainsi déplétée est évaluée par cytométrie de flux. Le phénotypage après purification des NK comprend les anticorps anti CD45, anti CD3, anti CD56. La pureté des NK CD45+ / CD3- / CD56 +, ainsi sélectionnés varie de 85 à 95%.
Co-cultures DC/NK
La méthode utilisée a initialement été décrite par Femandez et al [18].
Les NK purifiés par sélection négative sont placés en culture dans des plaques 96 puits (105 NK/100 L/puits), fond U pendant 48 heures, selon 4 conditions : seuls en milieu RPMI A' [Gibco, 10% de sérum AB, 1% de sodium pyruvate 100mM (Gibco-BRL, France), 0,5% de pénicilline-streptomycine 10000UI/mL-10000 g/mL (Gibco-BRL, France) et 1% de L-glutamine 200mM (100X, Gibco-BRL, France)]. - seuls en milieu RPMI A' contenant 1000UI/ml d'interleukine 2. en coculture avec des cellules dendritiques (ratio de coculture DC/NK de 1/1 , 1/10, 1/25 ou 1/125 selon).
Evaluation de l'activation et des fonctions NK:
Les fonctions NK (cytotoxicité, sécrétion d'IFNγ, régulation positive du CD69) peuvent s'évaluer directement à partir du sang frais après purification sur colonnes, ou préférentiellement après réactivité avec des cellules dendritiques standardisées allogéniques en présence ou non de LPS 10μg/ml.
Fonctions Cytotoxiques
Les cellules NK sont utilisées comme effecteurs dans un test de cytotoxicité contre Daudi ou K562. Les cellules cibles sont marquées par du chrome 51 (100μCi/106cellules) pendant 1 heure, puis lavées 2 fois. Elles ont ensuite été réparties à 2000 cellules par puits dans des plaques 96 puits à fond V. La libération maximale de chrome 51(Cr51) est obtenue par l'adjonction de cétrimide (Sigma). Les cellules effectrices sont distribuées selon différents ratios effecteurs/cibles et maintenues à 37°C pendant 4 heures. Les surnageants sont prélevés. La cytotoxicité est évaluée par la libération prolongée spécifique de chrome 51 dans les surnageants (lecture par un compteur de radiation gamma : Topcount, Packard) : libération spécifique de Cr5i=[libération de Cr5ι de l'échantillon - libération spontanée de Cr5ι par les cibles] / [libération maximale de Cr5ι - libération spontanée des cibles].
Sécrétion de cytokines
Certaines cellules NK activées sécrètent de l'interféron (IFN ). De même, les cellules dendritiques immatures allogéniques (batchs standardisés), mises en présence de cellules NK préalablement activées [par une cause classique (IL-2, IL-12, matures DC) ou non (GIST sous STI571)] sécrètent des ng de TNFα. Afin de doser ces cytokines, les surnageants des cocultures DC/NK sont analysés en dosage ELISA (Enzyme Linked Immunoabsorbant Assay- kit OptEIA IFN et TNFα humain- Pharmingen). Les anticorps anti-IFN et anti-TNFα sont ensuite incubés pendant une nuit à 4°C sur une plaque 96 puits maxisorb. Après lavage et saturation des anticorps par une solution « d'Assay diluent », les échantillons sont incubés pendant 2 heures. La plaque est ensuite lavée en PBS/tween 20, 0,05%. Un anticorps de détection dirigé contre un second épitope de l'IFN ou du TNFα, couplé à la biotine permet de détecter ces cytokines. La révélation est effectuée par une réaction streptavidine biotine. La lecture de la densité optique est réalisée à 450 nm. Une correction est réalisée à 550 nm. Une gamme d'IFN et de TNFα standardisée permet la conversion de la densité optique en pg/mL.
Etude phénotypique des marqueurs d'activation
Lorsque les cellules NK sont activées, elles peuvent exprimer à leur surface la molécule CD69 (lectine de type C). Afin d'évaluer la présence de ce marqueur d'activation, 5x104 à 1x105 cellules NK sont marquées pour analyse en cytométrie de flux. Les anticorps utilisés sont les anti-CD56, anti-CD3, anti CD69. Les contrôles isotypiques sont réalisés pour chaque manipulation.
Mise en évidence de l'amplification élective de sous populations NK in vivo chez les GIST traités
Après purification des NK périphériques des patients, un immunomarquage est effectué avec les Anticorps anti-CD3, CD56 et CD16. L'augmentation de la sous population CD16dl , CD56bright est mise en évidence, passant de 5% (pré-STI) à éventuellement 18% sous STI571.
Exemple 1 : Mise en évidence de l'activation des cellules NK chez les patients GIST traités par STI571.
Le sang et les tumeurs ont été obtenus auprès du CCPPRB, chez des patients GIST en phase II placés sous STI 571.
La fonction des cellules NK fraîchement extraites par déplétion négative (méthode Miltenyi) du sang circulant des patients porteurs de GIST traités (n=31) ou non (n=14) par STI571 (400 ou 600 mg/j depuis 2-4 ou 6 mois) ou de volontaires sains VS (n=17) a été évaluée. Les cellules NK ont été soumises à une incubation avec des cellules dendritiques immatures allogéniques standardisées en présence ou non de 10μg/ml LPS. Après 48hrs, un test de lyse des K562, DAUDI ou des CD immatures à divers ratios effecteurs/cibles ainsi qu'à un dosage d'IFNγ et TNFα dans les surnageants de coculture (selon les procédés proches de ceux suggérés dans Gerosa et al. (JEM 195 (2002) 327) ou Piccioli et al. (JEM 195 (2002) 335).
De façon intéressante, dans 30 à 55% des cas, les cellules NK des patients GIST sous STI571 présentent la capacité de produire l'IFNγ et de déclencher l'activation des CD immatures (sécrétion de TNFα ng/ml) in vitro, au contraire des cellules NK de volontaires sains (VS) ou de patients GIST non traités (Tableau 1 , Fig. 1). De telles activations NK après coculture avec les CD sont aussi reflétées en capacité lytique. L'étude longitudinale sur 7 patients montre par ailleurs clairement l'acquisition de l'activation NK après administration de STI571 (Fig. 1). La corrélation entre l'effet biologique immunomodulateur et l'effet clinique du STI571 est illustrée dans le Tableau 2, qui démontre que tous les patients répondant au traitement présentent des cellules NK activées.
Dans une série préliminaire impliquant une quarantaine de cas, les inventeurs ont ainsi observé que le STI571 active les fonctions NK en présence de GIST et possède donc une activité immunomodulatrice en plus de ses fonctions inhibitrices des activités tyrosine kinases.
Exemple 2 : Mise en évidence d'une action du STI571 sur les cellules dendritiques, pouvant rendre compte de l'activation des cellules NK
Puisque les cellules dendritiques sont, au contraire des macrophages, des précurseurs myéloïdes ou lymphoïdes électivement capables d'activer les NK au repos, nous avons testé les capacités du STI571 , administré à raison de 10"6 M, 10"8 M et 10"10 M, à moduler cette propriété.
Les cellules dendritiques humaines dérivées des CD34+ en SCF, GM-CSF, TNFα qui n'activent pas les NK humaines, acquièrent fortement cette capacité lorsqu'elles sont incubées 24 heures de J12 à J13 avec le STI571 à 10"6M (Fig 2).
Dans un système murin, la sécrétion d'IFNγ par les NK est augmentée de 2 à 3 fois à un ratio CD : NK de co-culture de 1 :1. En revanche, alors qu'à un ratio de co-culture CD : NK de 1 :10, les CD non traitées n'activent plus les NK, la CD- STI571 possède encore fortement cette propriété. De plus, seul le STI571 et non IΑG957 (Tyrphostin, un inhibiteur non spécifique des tyrosine kinases) induit l'activation des NK via les CD in vitro (Fig. 3). Ces données peuvent être reproduites en utilisant un analogue structural du STI 171 , le AB1003 (Fig. 4). Ainsi, les cellules dendritiques ou précurseurs, humaines ou murines, sont la cible potentielle du STI571 in vivo chez les patients GIST sous STI571. En effet, les demandeurs ont démontré que le STI571 n'active pas directement les NK in vitro.
Exemple 3 : L'injection in vivo de cellules dendritiques traitées avec du STI571 induit une activation des cellules NK
L'administration de CD in vivo permet de moduler l'activation des cellules NK des organes lymphoïdes (ganglions drainant si injectées en sous cutané, rate si injectées en intra veineuse). L'incubation pendant 24 heures des CD différenciées avec le STI571 avant l'injection in vivo permet de potentialiser le recrutement et l'activation NK in vivo (pourcentage de cellules Dx5+/CD3- acquérant le CD69) (Fig. 5).
Les expériences chez la souris démontrent que le STI571 augmente d'un facteur 10-30 la capacité des CD à entraîner la sécrétion d'IFNγ par les NK au repos in vitro et à activer les NK in vivo.
Exemple 4 : L'injection in vivo de STI571 et d'un facteur de croissance des CD induit une activation des cellules NK
Les inventeurs ont combiné le STI571 au Flt3L (facteur de croissance hematopoïetique des CD in vivo) dans le but de tester si cette association pouvait conduire à l'activation des cellules NK, et à l'éradication de tumeurs NK sensibles, indépendamment d'une mutation c-kit, abl ou du récepteur au PDGF.
Les fonctions NK des foies et rates des animaux traités ont été évaluées de diverses façons (%CD69 sur les CD3-/Dx5+, activités lytiques directes des foies et rates sur YAC-1 , sécrétion d'IFNγ des organes lymphoïdes traités in vitro
24hrs par IL-2). Les activités lytiques spontanées des splénocytes de souris Nude traitées par l'association Flt3L+STI571 se sont révélées, de façon surprenante, supérieures à celles des souris Nude traitées par Flt3L seul, STI571 seul ou PBS (Fig. 6). L'augmentation du CD69 sur les NK est claire avec la combinaison Flt3L+STI, alors qu'elle ne l'est pas avec chacun des composants pris isolément. La production d'IFNγ est surtout visible dans les cultures de ganglions provenant des animaux ayant reçu Flt3L+STI571 (Fig6). La combinaison STI571 - Flt3L permet donc d'induire in vivo une activation importante de l'activité des cellules NK, permettant la lyse efficace de cellules pathologiques in vivo.
Exemple 5 : Le STI571 bloque la maturation des CD induite par le LPS et prévient le choc septique
Les cellules dendritiques dérivées de moelle osseuse (« BM-DC ») de souris H- 2b (par culture en présence de GM-CSF, IL-4 à J7 de culture, selon la méthode décrite dans Fernandez et al. Nat. Med. 5 (1999) 405) sont incubées 24 heures en présence de 10μg/ml LPS. Elles surexpriment ainsi l-Ab, CD40, CD80, CD86 de façon très significative. Elles stimulent de façon spectaculaire la prolifération de splénocytes totaux alloréactifs (H-2d) à divers ratios E :T (réaction de type MLR). La co-incubation de STI571 (et non de AG957) avec les BM-DC en concommittante présence de LPS prévient la maturation LPS induite et les alloproliférations (Figure 7A).
La propriété de ces inhibiteurs de tyrosine kinases à inhiber les signaux inflammatoires tels le LPS a également été investiguee in vivo, dans le modèle murin du choc endotoxinique (Fig.7B). Des souris C57BL6 ont été traitées par ingestion per os de STI 571 (150mg/Kg/12h) ou par PBS. Au décours des 24 premières heures du traitement, on induit un choc endotoxinique au moyen d'une injection intrapéritonéale de LPS (1 mg, sérotype 026 :B26 ;SIGMA). Les traitements par STI 571 ou PBS sont poursuivis pendant 48 heures supplémentaires. Nos résultats préliminaires permettent d'observer une réduction de la mortalité dans le groupe traité par STI 571 (45% vs. 17,6%). Tableau 1
Sécrétion Sécrétion de Lyse Spécifique d'interféron γ * TNF α * de K562
Conditions de - LPS + LPS LPS LPS + LPS
Culture **
GIST avant STI 0% 16,7% 0% 15,4% 38,5%
571 (N=14)
GIST pendant 30%* 56,7% * : v 21,7%* 45,8% 62,5%
STI 571 (N=31)
Volontaires sains 11,1% 11,1% 10% 30,8% 42,9% (N=17)
Significatif avec un intervalle de sécurité de 95% selon la méthode exacte de Fisher, comparé au GIST avant STI 571 v Significatif avec un intervalle de sécurité de 95% selon la méthode exacte de Fisher, comparé aux volontaires sains *Seuil de positivité défini à 100 pg/ml
** Les fonctions des cellules NK sont évaluées après incubation de cellules NK CD3- /CD56+ du sang périphérique avec des cellules dendritiques immatures allogéniques en présence ou en l'absence de LPS.
Tableau 2
Maladies progressives Maladies stabilisées ou en réponse
Patients biologiquement O 16 sensibles au STI 571
Patients biologiquement non sensibles au STI 571 1 1
*Test exact de Fisher : p=0,042. Exemple 6 : Le STI571 exerce un effet thérapeutique à rencontre des tumeurs GIST NK-sensibles non liées à une mutation constitutive dans une tyrosine kinase.
Les tumeurs GIST sont les néoplasmes mésenchymateux les plus communs du tractus gastro-intestinal. Les mutations somatiques (apportant une fonction) des protooncogènes KIT ou PDGFA, sont présentes dans 92% des GIST [B.P. Rubin et al., Cancer Res. 61 , 8118 (2001 ) et M.C. Heinrich, et al, Science, 299, 708 (2003)]. Le STI571 stabilise la maladie ou induit des réponses partielles dans 80% des patients GIST [G.D. Demetri et al., N. Engl. J. Med. 347, 472 (2002)]. Toutefois, certains GIST ne répondent pas in vitro au STI571 ou deviennent résistants. Des études longitudinales de patients atteints de GIST traités au STI571 ont maintenant révélé l'augmentation, induite par thérapie, de la production d'IFNγ par les cellules NK, corrélée à une augmentation de la réponse anti-tumorale. Ainsi, dans un essai de phase II, plusieurs des patients répondant de façon significative au STI571 ne présentaient aucune mutation de KIT ou de PDGFRA (cf. tableau 3). En plus de son activité anti-tumorale, le STI571 agit donc indirectement sur les cellules hôtes exprimant KIT en dehors de la tumeur. Plusieurs modèles de tumeurs résistantes in vitro aux effets anti- prolifératifs du STI571 , mais sensibles in vivo ont ainsi été identifiés. Ainsi, le mélanome B16F10, le lymphome RMA-S, le fibrosarcome MCA102 et le mésothéliome AK7 résistent au STI571 in vitro (Fig. 8A) mais leur croissance naturelle dans des souris C57BL6 est significativement empêchée après 8 jours de traitement oral à l'aide de STI571 , à la fois pour l'expansion sous-cutanée des tumeurs AK7 et MCA102 (Fig. 8B), et pour l'établissement des métastases B16 du poumon (Fig. 8C). Dans ce contexte, les cellules NK sont des médiateurs critiques des effets anti-tumoraux du STI571. Les tumeurs refractaires aux effets anti-prolifératifs du STI571 in vitro répondent aux FL+STI571 in vivo d'une manière dépendante des cellules NK. Ainsi, la combinaison du FL et du STI571 supprime complètement la tumeur chez 100% des souris (Fig. 9A). La déplétion des cellules NK1.1+ supprime l'effet thérapeutique de FL+STI571 (Fig. 9C, D). FL+STI571 exerce un effet thérapeutique à rencontre des tumeurs établies atteignant une taille de 150+20 mm2 (Fig. 9C). Les effets thérapeutiques synergiques de FL+STI571 ont également été démontrés pour le mésothéliome AK7 (Fig.9E).
Figure imgf000037_0001
* les mutations cibles sont des mutations affectant dans KIT les exons 9, 11 , 13, 17 et dans PDGFRA les exons 12, 14 et 18 (6). § Patients toujours en vie au moment de l'évaluation.

Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation d'un inhibiteur des tyrosine kinases c-abl, bcr/abl, c-kit et/ou de la tyrosine kinase associée au récepteur du PDGF, pour la préparation d'une composition destinée au traitement prophylactique ou curatif des tumeurs NK sensibles non liées à une mutation constitutive dans une tyrosine kinase.
2. Utilisation d'un inhibiteur des tyrosine kinases c-abl, bcr/abl, c-kit et/ou de la tyrosine kinase associée au récepteur du PDGF, pour la préparation d'une composition destinée au traitement prophylactique ou curatif des maladies inflammatoires.
3. Utilisation selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que le mammifère est un être humain.
4. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que l'inhibiteur est un composé de la famille des pyrimidines.
5. Utilisation selon la revendication 4, caractérisée en ce que l'inhibiteur est la 2-phénylaminopyrimidine (STI571 ) ou un dérivé ou analogue de celui- ci.
6. Utilisation selon la revendication 5, caractérisée en ce que l'analogue du
STI571 est le AB1003.
7. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que l'inhibiteur est utilisé de façon combinée à un agent potentialisant.
8. Utilisation selon la revendication 7, caractérisée en ce que ledit agent potentialisant est choisi parmi un facteur de croissance des cellules dendritiques et un facteur de (co-)stimulation des cellules NK.
9. Utilisation selon la revendication 8, caractérisée en ce que ledit agent est choisi parmi le Flt3L, le GM-CSF, le ProGP-4 et leurs dérivés ou analogues.
10. Utilisation selon l'une des revendications 7 à 9, caractérisée en ce que ledit agent est utilisé de façon simultanée ou différée dans le temps par rapport à l'inhibiteur.
11. Composition caractérisée en ce qu'elle comprend un inhibiteur des tyrosine kinases c-abl, bcr/abl, c-kit et/ou de la tyrosine kinase associée au récepteur du PDGF et un agent potentialisant.
12. Composition selon la revendication 11 , comprenant du STI571 ou du AB1003 et un facteur de croissance des cellules dendritiques ou un facteur de (co-)stimulation des cellules NK.
13. Composition comprenant des cellules dendritiques traitées par un inhibiteur des tyrosine kinases c-abl, bcr/abl, c-kit et/ou de la tyrosine kinase associée au récepteur du PDGF.
14. Composition selon la revendication 13, caractérisée en ce que les cellules dendritiques sont immatures.
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