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WO2004022595A1 - MRL/lprマウスを用いた抗体の作製 - Google Patents

MRL/lprマウスを用いた抗体の作製 Download PDF

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WO2004022595A1
WO2004022595A1 PCT/JP2002/008998 JP0208998W WO2004022595A1 WO 2004022595 A1 WO2004022595 A1 WO 2004022595A1 JP 0208998 W JP0208998 W JP 0208998W WO 2004022595 A1 WO2004022595 A1 WO 2004022595A1
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WO
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antibody
protein
mouse
gpc3
producing
Prior art date
Application number
PCT/JP2002/008998
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English (en)
French (fr)
Inventor
Iwao Ohizumi
Mikiyoshi Saito
Original Assignee
Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
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Publication date
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Priority to EP03794237A priority patent/EP1541686B1/en
Priority to AT03794237T priority patent/ATE430198T1/de
Priority to US10/526,372 priority patent/US20060246550A1/en
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing an antibody using an autoimmune disease non-human animal. Specifically, the present invention relates to a method for producing an antibody against a protein having high amino acid sequence homology between an animal and a human using a non-human animal that develops an autoimmune disease.
  • Glypican 3 GPC3 is a target protein of the present invention.
  • Antibodies against human-derived proteins are used in a wide range of fields such as disease diagnosis and treatment.
  • the simplest way to obtain an antibody against a human-derived protein is to administer human-derived protein as an antigen to a non-human animal.
  • the human-derived protein is recognized as non-self by a non-human animal, and an immune reaction occurs to induce antibody production in the animal. Since the self protein originally possessed by the non-human animal is not recognized as non-self by immune tolerance, it does not cause an immune response, and no antibody against the protein is produced.
  • the protein serving as an antigen has an epitope (antigenic determinant) composed of 5 or 6 amino acids, and the epitope is recognized in an animal to which the antigen is administered, and an antibody is produced against the epitope. Epitope formation is also affected by the conformation of the protein.
  • Some proteins have amino acid sequences that are conserved during evolution and have high amino acid sequence homology between heterologous animals. Proteins with high amino acid sequence homology between heterologous animals also have similar tertiary structures, so their epitope structure is also preserved. Therefore, even if a protein derived from one species is administered to another animal species, the protein is not recognized as non-self, and no antibody is produced. Can not be obtained.
  • the dalippican family has been described as a new family of heparan sulfate proteoglycans present on the cell surface. So far, five members of the glypican family have been reported to be members of the glypican family (daribican 1, glypican 2, glypican 3, dalipican 4, and glypican 5).
  • GPC3 glycosylphosphatidylinositol
  • GPC3 shows extremely high homology of 94% at the amino acid level between mouse and human, it is difficult to recognize antibodies as a foreign substance in normal immunization of Balb / c mice etc. There is. Therefore, there has been a demand for a system for easily and efficiently producing antibodies for proteins having high amino acid sequence homology between human and non-human animals such as GPC3. Disclosure of the invention
  • An object of the present invention is to provide a method for producing an antibody against a protein having high amino acid sequence homology between a human and a non-human animal such as a mouse using an animal that develops an autoimmune disease. Furthermore, an object of the present invention is to provide a method for producing an antibody against GPC3 protein having high amino acid sequence homology between human and mouse using a mouse that develops an autoimmune disease.
  • the present inventors have proposed a protein having a high amino acid sequence homology between a human and a non-human animal, and a protein which is difficult to produce an antibody even when the human-derived protein is administered to a non-human animal.
  • the intense study was carried out on the assumption that administration to a non-human animal having an autoimmune disease that produces an immune response to the self would produce an antibody against the protein in the non-human animal.
  • an autoimmune disease model MRL / lpr mice are known to produce autoantibodies (The genetics of autoantibody production in MRL / lr lipus mice Eisenberg RA et al.
  • an autoimmune disease model mouse such as MRL / lpr mouse
  • protein antigens with low amino acid sequence homology between mouse and other species but also mouse-derived antigen and mouse and human like GPC3 It was considered that antibodies could be efficiently produced even for protein antigens having very high homology at the amino acid level.
  • MRL / lpr mice immunized MRL / lpr mice and Balb / c mice and produced antibodies using human GPC3 as an immunogen for the purpose of verifying the usefulness of antibody production using MRL / lpr mice.
  • MRL / lpr mice can obtain about 40 times more positive gels with higher 0D values compared to Balb / c mice, have a wide variety of isotypes, and have an antibody antigen affinity of about 100. Found it to be twice as expensive.
  • an autoimmune disease refers to a disease caused by autoantibodies.
  • Diseases caused by autoantibodies include not only those caused by autoantibodies alone, but also those caused by complexes of autoantibodies and other substances, such as complexes of autoantibodies with corresponding antigens. It is. Also included are diseases in which the presence of autoantibodies is closely related to the establishment of lesions, as well as those in which the pathogenesis of autoantibodies is clear.
  • autoimmune diseases include autoimmune hepatitis, autoimmune thyroiditis, autoimmune bullous disease, autoimmune adrenocortitis, autoimmune hemolytic anemia, Autoimmune thrombocytopenic purpura, autoimmune atrophic gastritis, autoimmune neutropenia, autoimmune orchitis, autoimmune encephalomyelitis, autoimmune receptor Yuichi disease, self-immune sterility , Rheumatism, Crohn's disease, systemic lupus erythematosus, multiple sclerosis, Basedow's disease, juvenile diabetes, Addison's disease, myasthenia gravis, lens uveitis, and the like.
  • the non-human animal that develops the autoimmune disease of the present invention only needs to develop one or more autoimmune diseases, and the type of the autoimmune disease is not particularly limited.
  • the non-human animal used for immunization is not only a non-human animal having an autoimmune disease but also a non-human animal that produces an excessive amount of an autoantibody as compared to a normal non-human animal. It is also possible to use human animals.
  • normal non-human animals that do not normally produce autoantibodies are administered autoantibodies by administering polyclonal B cells such as LPS-dextran sulfate overnight. It is also possible to use non-human animals that have been put into production.
  • non-human animals that develop an autoimmune disease or non-human animals that produce autoantibodies include non-human animals with abnormal immune regulatory mechanisms, such as non-human animals with mutations in the Fas gene and defective Fas function. Human animals can be mentioned.
  • Fas is a transmembrane protein belonging to the NGF / TNF receptor family and a receptor molecule that transmits apoptosis-inducing signals. Normally, when a B cell that reacts with a self antigen encounters a T cell that is specific to the self antigen, Fas ligand on the surface of the T cell binds to Fas (CD95) on the surface of the B cell, and apoptosis is induced in the B cell that reacts with the self antigen. However, if Fas has a mutation, this mechanism does not work, and B cells that produce autoantibodies in response to self antigens will survive and produce excessive autoantibodies.
  • Fas function-deficient non-human animal for example, a Fas ligand-deficient non-human animal having a mutation in the Fas ligand gene can be used.
  • non-human animals deficient in Fas function include MRL / lpr mice.
  • Lpr mice with a mutated Fas gene (MRL / lpr mice) generally develop abnormal T cell accumulation and systemic lupus erythematosus-like autoimmune disease.
  • non-human animals lacking Fas ligand include MRL / gld mice Can be
  • Fas function-deficient mice and Fas ligand-deficient mice are commercially available, those skilled in the art can easily obtain them.
  • MRL / Mp — + / + mice MRL / Mp — + / + mice
  • NZB / NZW F1 mice BXSB / MpJ mice
  • B / WF1 mice BXSB mice
  • SL / Ni mice etc.
  • Fas or Fas ligand is artificially suppressed by using, for example, the following method, for example, by using the Gene evening method.
  • DNA containing the exon portion of the Fas (or Fas ligand) gene is isolated from a mouse, and a suitable marker gene is inserted into this DNA fragment to construct a targeting vector.
  • the targeting vector is introduced into a mouse ES cell line by an electroporation method or the like, and a cell line in which homologous recombination has occurred is selected.
  • an antibiotic resistance gene such as a neomycin resistance gene is preferable.
  • a cell line in which homologous recombination has occurred can be selected only by culturing in a medium containing the antibiotic.
  • the obtained ES cell line is injected into the mouse blastoderm to obtain a chimeric mouse.
  • a mouse in which one of the Fas (or Fas ligand) gene pair has been inactivated Can be obtained.
  • a mouse in which both of the Fas (or Fas ligand) gene pairs are inactivated can be obtained.
  • non-human animal of the present invention examples include monkeys, bush, dogs, rats, mice, and egrets, and are preferably rodents such as rats, mice, and hamsters. Preferred is a mouse.
  • any protein can be used as the antigen, but the protein serving as the antigen has high homology at the amino acid sequence level with the homologous protein of the immunized non-human animal corresponding to the antigen protein.
  • Having high homology means having at least 65% homology in the amino acid sequence, preferably having 75% or more homology, and more preferably 90% or more homology. And particularly preferably at least 94% homology.
  • Optimal alignment of sequences to determine protein homology can be performed using a variety of algorithms, for example, Wilbur, WJ and Liman, DJ; Proc. Natl. Acad ScI. USA (1983) 80, 726-730 algorithm, Smith and Waterman, 1981, Adv. Appl.
  • HSP HSP
  • T is called the neighborhood word score threshold.
  • the first neighborhood word hit serves as a seed to initiate the search for the longer HSP.
  • Word hits are extended in both directions along each sequence as long as the cumulative alignment score can be increased. Word hit extension in each direction stops when the following parameters are met: Cumulative alignment score drops from maximum attainment by an amount X; residue alignment of one or more negative scores accumulates And the cumulative score fell below zero; or both sequences reached the end.
  • the BLAST algorithm parameters W, T and X determine the sensitivity and speed of the alignment. The BLAST program is used for nucleic acid comparison of both strands.
  • word length 00 11 as default, BLOSUM62 scoring matrix (Henikoii and Henikofi, 1992, Pro Natl.
  • the BL0SUM matrix assigns a probability score for each position in the alignment, but the assignment is based on the frequency of substitutions between consensus blocks in related proteins, as this is known.
  • a variety of other matrices may be used in place of BL0SM62, such as P Cliff 30 (9, 1, 0.87); PAM70 (10, 1, 0.87), BLOSUM80 (10, 1, 0.87) ), BL0S ring 62 (11, 1, 0.82) and BL0S ⁇ 45 (14, 2, 0.87).
  • the minimum sum probability is the probability that a match between two nucleotide or amino acid sequences can occur by chance. Shown. In other embodiments of the present invention, the minimum sum probability is less than about 1, preferably less than about 0.1, more preferably less than 0.01, and most preferably about If the value is lower than 0.001, it is considered to be substantially the same.
  • the Glyvican family consists of Daribican 1, Daribican 2, Daribican 3, Glypican 4, Glypican 5, etc. (Trends in Glycoscience and Glycotechnology, Vol. 10, No. 52 , (March 1998) pp. 145-152) 0 Guripikanfa Among Milly, especially Daribikan 3 protein is preferred.
  • the antibody may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, but is preferably a monoclonal antibody.
  • Immunization of an animal with a sensitizing antigen is performed according to a known method.
  • the sensitizing antigen is injected intraperitoneally or subcutaneously into a mammal.
  • the sensitizing antigen is diluted and suspended in an appropriate amount with PBS (Phosphate-Buffed Saline), physiological saline, or the like, and then mixed with an appropriate amount of a normal adjuvant, for example, Freund's complete adjuvant, if desired.
  • a suitable carrier can be used during immunization of the sensitizing antigen.
  • a partial peptide having a small molecular weight is used as a sensitizing antigen, it is preferable to immunize albumin or keyhole lysate with a carrier protein such as mosinein.
  • immunocytes are collected from the mammal and subjected to cell fusion. Splenocytes.
  • Mammalian myeloma cells are used as the other parent cells fused with the immune cells.
  • the myeloma cells can be obtained from various known cell lines, for example, P3 (P3x63Ag8.653) (J. Immnol. (1979) 123, 1548-1550), P3x63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81, 1-7), NS-1 (Kohler.G. And Milste in, C. Eur.J.I maraudal imoL (1976) 6, 511-519), MPC-11 (Margulies.DH et al., Ce ll
  • MRL / lpr mice When MRL / lpr mice are selected as animals immunized with the antigen, any of these myeloma cells can be used.
  • the cell fusion between the immune cells and the myeloma cells is basically performed by a known method. For example, it can be carried out according to the method of Kohler and Milstein et al. (Kohler. G. and Milstein, Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46).
  • the cell fusion is performed, for example, in a normal nutrient medium in the presence of a cell fusion promoter.
  • a fusion promoter for example, polyethylene glycol
  • PEG PEG
  • Sendai virus HVJ
  • an auxiliary agent such as dimethyl sulfoxide can be added to enhance the fusion efficiency.
  • the ratio of the use of the immune cells and the myeloma cells can be arbitrarily set. For example, it is preferable that the number of immune cells be 1 to 10 times that of myeloma cells.
  • the culture solution used for the cell fusion for example, RPMI 1640 culture solution and MEM culture solution suitable for the growth of the myeloma cell line, and other normal culture solutions used for this type of cell culture can be used.
  • serum replacement fluid such as fetal calf serum (FCS) can be used in combination.
  • a predetermined amount of the immune cells and myeloma cells are mixed well in the culture medium, and a PEG solution (for example, an average molecular weight of about 1000 to 6000), which has been preliminarily heated to about 37 ° C., is usually 30 to 60%. (w / v) at the concentration and mix.
  • a PEG solution for example, an average molecular weight of about 1000 to 6000
  • w / v at the concentration and mix.
  • Hybridoma (Hybridoma). Subsequently, an appropriate culture solution is sequentially added, and the operation of centrifuging and removing the supernatant is repeated to remove cell fusion agents and the like that are unfavorable for the growth of the hybridoma.
  • the hybridoma thus obtained is selected by culturing it in a normal selective culture medium, for example, a HAT culture medium (a culture medium containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine).
  • a HAT culture medium a culture medium containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine.
  • the culturing in the HAT culture solution is continued for a time (usually several days to several weeks) sufficient for the death of cells (non-fused cells) other than the desired hybridoma.
  • a conventional limiting dilution method is performed, and screening and single cloning of hybridomas producing the desired antibody are performed.
  • the screening and single cloning of the target antibody may be performed by a screening method based on a known antigen-antibody reaction.
  • the antigen is bound to a carrier such as beads made of polystyrene or a commercially available 96-well microtiter plate, reacted with the culture supernatant of the hybridoma, and the carrier is washed, and then the enzyme-labeled secondary antibody is used. Reacting with the sensitizing antigen in the culture supernatant. You can determine if the body is included.
  • Hybridomas producing the desired antibody can be cloned by limiting dilution or the like.
  • an N-terminal peptide of GPC3 or a fragment thereof may be used as an antigen for screening.
  • artificially modified recombinant antibodies such as chimeric antibodies and humanized antibodies, antibody fragments, and modified antibodies can be prepared based on the antibodies obtained by the method of the present invention. is there.
  • a recombinant antibody can be produced by cloning the antibody gene from the hybridoma obtained by the method of the present invention, inserting the antibody gene into an appropriate vector, and introducing this into a host (for example, Vanda thigh e, AM et al., Eur. J. Biochem. (1990) 192, 767-775, 1990).
  • mRNA encoding the variable (V) region of the antibody is isolated from the hybridoma that produces the antibody.
  • mRNA can be isolated by known methods, for example, guanidine ultracentrifugation (Chirgwin, J. ⁇ ⁇ et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299), AGPC method (Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159) to prepare total RNA, and then use the mRNA Purification Kit (Pharmacia) to prepare the target mRNA.
  • mRNA can be directly prepared using the QuickPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia).
  • cDNA for the antibody V region is synthesized using reverse transcriptase.
  • cDNA is synthesized using AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit (manufactured by Seikagaku Corporation).
  • AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit manufactured by Seikagaku Corporation.
  • a 5'-RACE method using 5'-Ampli FINDER RACE Kit (Clontech) and PCR (Frohman, MA et al., Pro Natl. Acad. Sci. USA ( 1988) 85, 8998-9002, Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919-2932) and the like.
  • a target DNA fragment is purified from the obtained PCR product and ligated to a vector DNA. Further, a recombinant vector is prepared from this, introduced into E. coli, etc., and colonies are selected to prepare a desired recombinant vector. Then, the base sequence of the target DNA is confirmed by a known method, for example, a dideoxynucleotide chain termination method or the like. After obtaining the DNA encoding the V region of the desired antibody, this is incorporated into an expression vector containing ⁇ A encoding the desired antibody constant region (C region).
  • C region desired antibody constant region
  • the antibody gene is incorporated into an expression vector so that it is expressed under the control of an expression control region, for example, an enhancer or a promoter.
  • an expression control region for example, an enhancer or a promoter.
  • host cells are transformed with this expression vector to express the antibody.
  • Expression of the antibody gene may be performed by separately transforming the DNA encoding the antibody heavy chain (H chain) or the light chain (L chain) into an expression vector and co-transforming the host cells, or by using the H chain and L chain.
  • the host cell may be transformed by incorporating a DNA encoding the DNA into a single expression vector (see WO94 / 11523).
  • transgenic animals For the production of recombinant antibodies, not only the above host cells but also transgenic animals can be used.
  • an antibody gene is inserted into a gene encoding a protein (eg, goat casein) that is specifically produced in milk to prepare a fusion gene.
  • a DNA fragment containing the fusion gene into which the antibody gene has been inserted is injected into a goat embryo, and the embryo is introduced into a female goat.
  • the desired antibody is obtained from the milk produced by the transgenic goat born from the goat that has received the embryo or its progeny.
  • Hormones may also be used in transgenic goats as appropriate to increase the amount of milk containing the desired antibody produced by transgenic goats (Ebert, KM et al., Bio / Technology). (1994) 12, 699-702).
  • An artificially modified recombinant antibody for example, a chimeric antibody or a humanized antibody can be produced by a known method.
  • a chimeric antibody can be obtained by ligating the DNA encoding the antibody V region obtained as described above with a DNA encoding the human antibody C region, etc., inserting this into an expression vector, introducing the resultant into a host, and producing.
  • Humanized antibodies are also referred to as reshaped human antibodies, which are used to replace the complementarity determining regions (CDRs) of non-human mammals, such as mouse antibodies, with human antibodies. It has been transplanted to a determinant region, and its general genetic recombination technique is also known (see European Patent Application Publication No. EP 125023, W096 / 02576). Specifically, a DNA sequence designed to link the CDR of a non-human animal-derived antibody (for example, a mouse antibody) obtained by the method of the present invention with a framework region (FR) of a human antibody is used. It is synthesized by PCR using several oligonucleotides prepared so as to have portions overlapping both terminal regions of CDR and FR as primers (see the method described in W098 / 13388).
  • CDRs complementarity determining regions
  • the framework region of the human antibody to be linked via CDR is selected so that the complementarity-determining region forms an excellent antigen-binding site. If necessary, the amino acids of the framework region in the variable region of the antibody may be substituted so that the complementarity-determining region of the reshaped human antibody forms an appropriate antigen-binding site (Sato, K. eial , Cancer Res.
  • human antibodies are used for the C region of chimeric and humanized antibodies.
  • H1, C1, C2, Cr3, and C4 are used for the H chain
  • CK is used for the L chain. can do.
  • the human antibody C region may be modified to improve the stability of the antibody or its production.
  • a chimeric antibody comprises a variable region of an antibody derived from a non-human animal and a constant region derived from a human antibody.
  • a humanized antibody comprises a complementarity determining region of a non-human animal-derived antibody, a framework region and a C region derived from a human antibody. Since humanized antibodies have reduced antigenicity in the human body, they are useful when administered to humans for therapeutic purposes.
  • antibody fragments include Fab, F (ab ') 2, Fv, Fab / c having one Fab and complete Fc, or a single fragment obtained by linking an Fv of H chain or L chain with an appropriate linker.
  • Chain Fv (scFv) an antibody is treated with an enzyme, for example, papain or pepsin, to generate an antibody fragment, or a gene encoding these antibody fragments is constructed and introduced into an expression vector. Expressed in cells (for example, Co, MS et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976, Better, M.
  • scFv can be obtained by linking the H chain V region and L chain V region of the antibody.
  • the H chain V region and the L chain V region are linked via a linker, preferably a peptide linker (Huston, JS et al., Pro Natl. Acad. Sci. USA (1988) ) 85, 5879-5883).
  • a linker preferably a peptide linker (Huston, JS et al., Pro Natl. Acad. Sci. USA (1988) ) 85, 5879-5883).
  • the peptide linker connecting the V regions for example, any single-chain peptide consisting of 12 to 19 amino acid residues is used.
  • the scFv-encoding DNA is a DNA encoding the H chain or H chain V region of the antibody, and a DNA encoding the L chain or L chain V region.
  • the DNA portion to be coded is made into a type II, amplified by PCR using a primer pair defining both ends thereof, and then the DNA coding for the peptide linker portion, and both ends thereof are ligated to H chain and L chain, respectively. It is obtained by combining and amplifying a pair of primers defined as follows.
  • expression vectors containing them and a host transformed with the expression vector can be obtained according to a conventional method.
  • the scFv can be obtained according to a conventional method.
  • Modified antibodies bind to various molecules such as cytotoxic substances (chemotherapeutic agents, radioactive substances, cell-derived toxins, etc.) and labeling substances (fluorescent dyes, enzymes, coenzymes, chemiluminescent substances, radioactive substances, etc.) Can be mentioned.
  • cytotoxic substances chemotherapeutic agents, radioactive substances, cell-derived toxins, etc.
  • labeling substances fluorescent dyes, enzymes, coenzymes, chemiluminescent substances, radioactive substances, etc.
  • Such a modified antibody can be obtained by chemically modifying the antibody obtained by the method of the present invention.
  • a method for modifying an antibody has already been established in this field.
  • bispecific antibodies include a bispecific antibody having an antigen-binding site that recognizes different epitopes on the same antigen molecule, one antigen-binding site recognizing an antigen and the other antigen-binding
  • a bispecific antibody whose site recognizes another substance such as a labeling substance; one antigen-binding site recognizes the first antigen and the other Bispecific antibodies that recognize a second antigen whose antigen-binding site is different from the first antigen can be mentioned.
  • Bispecific antibodies can be produced by combining the HL pairs of two types of antibodies, or by fusing hybridomas producing different monoclonal antibodies to produce bispecific antibody-producing fusion cells. You can also.
  • bispecific antibodies can be produced by genetic engineering techniques.
  • the antibody gene constructed as described above can be expressed and obtained by a known method.
  • useful promoters that are commonly used, antibody genes to be expressed, and polyA signals can be functionally linked to the 3 'downstream of the gene to be expressed.
  • the promoter Z enhancer include human cytomegalovirus early promoter / enzocer (human cytomegalovirus immed iate early promoter / enhancer).
  • promoters that can be used for antibody expression include viral promoters / enhancers such as retrovirus, poliovirus, adenovirus, simian virus 40 (SV40), and human factoring factor la (HEFla).
  • viral promoters / enhancers such as retrovirus, poliovirus, adenovirus, simian virus 40 (SV40), and human factoring factor la (HEFla).
  • promoters derived from mammalian cells such as promoters and enhancers.
  • a useful promoter commonly used, a signal sequence for antibody secretion, and an antibody gene to be expressed can be functionally linked to express the gene.
  • the promoter include a lacz promoter and araB promoter overnight.
  • the signal sequence for antibody secretion is produced by E. coli periplasm.
  • the pelB signal sequence (Le i, SP et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379) may be used. Then, after separating the antibody produced in the periplasm, the antibody structure is appropriately refolded and used.
  • markers can include aminoglycoside transferase (APH) gene, thymidine kinase (TI0 gene, Escherichia coli xanthinguanine phospholiposyltransferase (Ecogpt) gene, dihydrofolate reductase (dhfr) gene, and the like.
  • Eukaryotic cells include, for example, established mammalian cell lines, insect cell lines, animal cells such as eukaryotic fungal cells and yeast cells, and prokaryotic cells include, for example, bacterial cells such as E. coli cells.
  • the antibodies are expressed in mammalian cells, such as CH0, COS, myeloma, BHK, Vero, HeLa cells.
  • the transformed host cells can be cultured in vitro or in vivo to obtain the desired antibody.
  • Culture of the host cell is performed according to a known method.
  • DMEM, MEM, RPMI 1640, IMDM can be used as a culture solution, and a serum replacement solution such as fetal calf serum (FCS) can also be used in combination.
  • FCS fetal calf serum
  • Antibodies expressed and produced as described above can be separated from cells and host animals and purified to homogeneity. Separation and purification of the antibody can be performed using an affinity column.
  • affinity column columns using Protein A column include Hyper D, P0R0S, Sepharose FF (Pharmacia) and the like.
  • the separation and purification methods used for ordinary proteins may be used, and there is no limitation.
  • antibodies can be separated and purified by appropriately selecting and combining a chromatography column other than the above affinity column, filtration, ultrafiltration, salting out, dialysis, etc. (Antibodies A Laboratory Manual. Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS
  • FIG. 1 shows a comparison between the amino acid sequences of human GPC3 and mouse GPC3.
  • FIG. 2 is a diagram showing a frequency distribution table for primary screening of hybridomas.
  • FIG. 3 is a diagram showing the subclassification of isotypes of the obtained monoclonal antibodies of 47 clones.
  • FIG. 4 is a diagram showing the results of kinetic analysis of anti-GPC3 antibodies by BIAcore. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • PCXND2 and pCXND3 As expression vectors for soluble GPC3 and soluble GPC3 core proteins, PCXND2 and pCXND3 in which DHFR gene and neomycin resistance gene were incorporated into pCAGGS were used.
  • DXB 11 cells purchased from ATCC were used, and 5% FBS (GIBCO BRL CAT # 10099-141, L0T # A0275242) / Minimum Essential Medium Alpha medium (a MEM (+)) (GIBCO BRL CAT # 12571) was used for culture. -071) / 1% Penicill in-St reptomyc in (GIBCO BRL CAT # 15140-122) was used.
  • the obtained hybridoma was cultured in 10% FBS I RPMI 1640/1 HAT media supply (SIGMA CAT * H-0262) /0.5 x BM-Condimed HI Hybridoma cloning supplement (Roche CAT * 1088947). .
  • the full-length cDNA encoding human GPC3 was prepared by a conventional method from the colon cancer cell line Caco2. Using the 1st strand cDNA as type I, upstream primer (5'_GAT AK ATG GCC GGG ACC GTG CGC ACC GCG T-3 '(SEQ ID NO: 1)), downstream primer (5'-GCT AGC TCA GTG CAC CAG GAA GAA Amplification was performed by PCR using GAA GCA C -3 ′ (SEQ ID NO: 2)). Using the plasmid DNA containing the full-length human GPC3 cDNA, a soluble GPC3 cDNA expression plasmid DNA was constructed.
  • a downstream primer (5'-ATA GAA TTC CAC CAT GGC CGG GAC CGT GCG C _3 '(SEQ ID NO: 3)) designed to exclude the C-terminal hydrophobic region (564-580 amino acids) and an EcoRI recognition sequence
  • Kozak PCR was carried out using an upstream primer to which the sequence was added (5′-ATAGGA TCC CTT CAG CGG GGA ATG AAC GTT C-3 ′ (SEQ ID NO: 4)).
  • the obtained PCR fragment (171 lbp) was cloned into PCXND2-F1ag.
  • the resulting expression plasmid DNA was introduced into the DXB11 strain of CH0 cells and selected with 500 g / mL Geneticin to obtain a soluble GPC3 highly expressing CH0 strain.
  • the soluble GPC3 high-expressing CH0 strain was cultured in large quantities, and the culture supernatant was recovered and purified.
  • the culture supernatant was charged into DEAE sepharoseFast Flow (Amersham CAT # 17-0709-01), washed, and eluted with a buffer containing 500 mM NaCl.
  • affinity purification was performed using Anti-Flag M2 agarose affinity gel (SIGMA CAT # A-2220). Elution was performed with 200 ag / mL FLAG peptide.
  • cDNA was prepared by substituting Ala for Sers at positions 495 and 509 by assembly PCR.
  • a primer was designed so that a His tag was added to the C-terminus, and the obtained cDNA was cloned into a pCXND3 vector.
  • the resulting expression plasmid DNA was introduced into the DXB11 strain, and selection with 500 g / mL Geneticin was performed to obtain a soluble GPC3 core protein highly expressing CH0 strain.
  • 1700 cm 2 roller performs mass culture using one bottle, Gyotsu recovered purified from culture supernatants Was.
  • the culture supernatant was charged into Q sepharose Fast Flow (Amersham CAT # 17-0510-01), washed, and eluted with a phosphate buffer containing 500 mM NaCl.
  • affinity purification was performed using Celling Sepharose Fast Flow (Amersham CAT # 17-0575-01). Gradient elution was performed with 10-150 mM imidazole. Finally, the mixture was concentrated using Q Sepharose Fast Flow, and eluted with a phosphate buffer containing 500 mM NaCl.
  • FIG. 1 shows a comparison between the amino acid sequences of human GPC3 and mouse GPC3.
  • the portion indicated by a solid triangle is a site that may be an N-linked dalcosylation site
  • the portion indicated by an asterisk is a site that may be bound by glycosaminodalican. Therefore, it was expected that it would be difficult to obtain antibodies by normal mouse immunization.
  • MRL / lpr mice which are known as autoimmune disease model mice, produce various autoantibodies, immunization of MRL / lpr mice can reduce antigens with low protein homology between mice and other species.
  • Heparan sulfate-added soluble GPC3 protein was used as the immunogen.
  • Five Balb / c mice female, 6 weeks old, Charles River Japan
  • 7 MRL / lpr mice oss, 7 weeks old, Japan Charles River
  • FCA complete Freund's adjuvant (H37Ra), Difco (3113-60) Becton Dickinson (cat # 231131)
  • the subcutaneously administered solution was administered subcutaneously, and after 2 weeks, the solution prepared to be 50 / xg / animal was treated with FIA (Freund's incomplete adjuvant, Di ico (0639-60))> Becton Dickinson (cat # 263910)), and then subcutaneously administered. After one week Booster immunizations were performed a total of 5 times at intervals, and the final immunization was diluted in PBS to a concentration of 502 g / animal and administered into the tail vein.
  • FIA Fluorouracil bovine serum
  • mice After confirming that the antibody titer in the serum against GPC3 was saturated by ELISA using an immunoplate coated with l ⁇ g / ml soluble GPC3 core protein in a gel, Balb / c No. 2 and MRL / lpr No. 6 mice were subjected to final immunization, and mouse myeloma cells P3U1 and mouse spleen cells were mixed according to a standard method, and cell fusion was performed using PEG1500 (Roche Diagnostics, cat # 783 641). I went.
  • PEG1500 Roche Diagnostics, cat # 783 641.
  • the number of Balb / c-derived hybridomas is 10 in 96-well culture plates and the number of MRL / lpr-derived hybridomas is 20. Seeded. The selection was started on the HAT medium the day after the fusion, and the culture supernatant was collected on the 10th and 14th days after the fusion, and ELISA screening was performed. ELISA screening was performed using an immunoplate coated with 100 ⁇ l of lg / ml soluble GPC3 core protein in the same manner as in the antibody titer measurement described above. screening
  • IgG3 and IgM are known as isotypes that have strong binding activity to complement and can induce CDC activity.
  • cancer treatment such as an anti-GPC3 antibody
  • it is very useful to be able to perform screening without losing IgG3 and IgM during primary screening. Therefore, screening was performed by a two-step method in which not only IgGl, IgG2a, and IgG2b but also IgG3 and IgM were picked up by changing the secondary antibody.
  • IgGl, IgG2a, and IgG2b were obtained by coloring using an alkaline phosphatase-labeled anti-mouse IgG (r) antibody (manufactured by ZYMED, Cat No. 62-6622) as a secondary antibody
  • the second step was a biotin-labeled anti-IgG3 antibody (M0N0SAN, Cat No. M0N5056B) and a horseradish peroxidase-labeled anti-IgM antibody (ZYMED, Cat No. 62-6820) was used to screen again by selectively developing IgG3 and IgM by recoloring.
  • Antibody was purified from the obtained culture supernatant by using Protein G column Hi Trap Protein G HP (Aniersliam CAT # 17-0404-01) for IgGK IgG2a and IgG2b and Protein L for IgM. Was. Specifically, IgG purification was performed using Hi Trap ProteinG HP (AmershamCAT # 17-0404-01). The hybridoma culture supernatant was directly charged into a column, washed with binding buffer (20 mM sodium phosphate (pH 7.0)), and eluted with elution buffer (0.1 mglycin_HCl (pH 2.7)).
  • IgM purification was performed using ImmunoPure Immobilized Protein L (PIERCE CAT # 20510). Charge the hybridoma culture supernatant directly to the column, wash with binding buffer-(lOOmM Sodium phosphate (pH 7.2), 150mM NaCl) and elute with elution buffer-(0.lMGlycin-HCl (pH2.5)) did. After elution, the same operation as for IgG was performed and stored at 4 ° C.
  • Isotyping of anti-glypican 3 antibody was performed using ImmunoPure Monoclonal Antibody Isotyping Kit II (PIERCE CAT * 37502), and the method was in accordance with the attached manual.
  • the buffer of the soluble GPC3 core protein was replaced with 10 mM Na Acetate (pH 5.0) by gel filtration.
  • the sensor chip was prepared according to the method described in the AminCutting kit (BR-1000-50, manufactured by BIAC0RE). Amin coupling was performed with CM5 (BR-1000-14, manufactured by BIACORE). By this operation, about 3000RU of soluble GPC3 core protein was immobilized on the CM5 chip.
  • BIACORE BIACORE2000 manufactured by BIACORE.
  • Each anti-GPC3 antibody was diluted with HBS-EP buffer to prepare 1.25, 2.5, 5, 10, 20 / ml.
  • Antibodies 401 of various concentrations were injected at a flow rate of 201 / min using HBS-EP buffer-1 (BR-1001-88 manufactured by BIACORE) as a running buffer.
  • the binding phase was set for 2 minutes during the injection of the antibody, and then switched to the running buffer, and the dissociation phase was set for 2 minutes.
  • 10 1 of 10 mM Glycine (pH 2.2) and 0.05% SDS were continuously injected to regenerate the sensor chip.
  • a soluble GPC3 protein lacking a C-terminal hydrophobic region was prepared.
  • Soluble GPC3 expression plasmid DNA was introduced into CH0 cells to construct a constant expression strain. After roughly purifying and concentrating the culture supernatant with an inion exchange column, affinity purification was performed using a Flag tag added to the C-terminal side.
  • affinity purification was performed using a Flag tag added to the C-terminal side.
  • a smear band of 50 to 300 kDa and a band of about 40 kDa were obtained.
  • GPC3 is a proteoglycan having a heparan sulfate addition sequence at the C-terminal of 69 kDa.
  • the smear band was considered to be GPC3 modified with heparan sulfate.
  • the band of about 40 kDa originated from the N-terminal fragment of GPC3, and it was predicted that GPC3 had undergone some kind of cleavage.
  • Anti-GPC3 antibody was prepared by the hybridoma method.
  • As an immunogen a soluble form of GPC3 was added to sulphate for purification. After confirming that the antibody titer to GPC3 in the serum was saturated, cell fusion between mouse myeloma cells ⁇ and mouse spleen cells was performed.
  • Balb / c mice (No. 2) and MRL / lpr mice (No. 6) were subjected to fusion with each mouse, and Balb / c mice were analyzed by ELISA using GPC3 core protein as antigen. A total of 180 positive wells were selected for the MRL / lpr mice.
  • the number of clones showing a 0D value of 0.2 or more was 652 ⁇ for the MRL / lpr mouse and 16 16 for the Balb / c mouse. High (0.2 or more) clones were obtained about 40 times more.
  • a comparison of the results of the primary screening between MRL / lpr mice is shown in FIG. 2 as a frequency (frequency) distribution table.
  • Isotype analysis was performed on 47 clones of the established anti-glypican 3 antibody.
  • antibodies derived from Balb / c include all IgG subclasses of IgGl, IgG2a, IgG2b and IgG3 and also IgM.
  • I was Figure 3 shows the isotypes of the 47 clones established.
  • GPC3 shows a very high homology of 94% at the amino acid level between mice and humans, it may be difficult to obtain antibodies by immunizing normal Balb / c mice and the like.
  • MRL / lpr mice which are autoimmune disease models, lack Fas ligand function, suggesting that apoptosis of autoantibody-producing B cells is not induced and a mechanism to break immune tolerance is working. .
  • an autoimmune disease model mouse such as an MRL / lpr mouse
  • an MRL / lpr mouse not only antigens with low protein homology in mice and other species but also There is a possibility that antibodies can be efficiently produced even for mouse and human antigens that have very high homology at the amino acid level, such as the mouse antigen and GPC3.
  • MRL / lpr mice can obtain about 40 times higher positive levels with a higher 0D value than Balb / c mice, have a wide variety of isotypes, and have an antibody affinity of about 100. Found it to be twice as expensive.

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Description

明細書
MRL/lpr マウスを用いた抗体の作製 技術分野
本発明は、自己免疫疾患非ヒト動物を用いた抗体の作製法に関する。本発明は、 具体的には、 自己免疫疾患を発症する非ヒト動物を用いて、 該動物とヒトとでァ ミノ酸配列相同性の高いタンパク質に対する抗体を作製する方法に関する。 本発 明の対象とするタンパク質としてはグリピカン 3 (GPC3) が挙げられる。 背景技術
ヒト由来タンパク質に対する抗体は、 病気の診断、 治療等広い分野で利用され ている。 ヒト由来タンパク質に対する抗体を得る最も簡便な方法は、 ヒト由来夕 ンパク質を非ヒト動物に抗原として投与することである。 該ヒト由来タンパク質 は、 非ヒト動物に非自己と認識され免疫反応が生じ該動物において抗体産生が誘 発される。 該非ヒ卜動物がもともと有している自己タンパク質は免疫寛容により 非自己とは認識されないので免疫反応を引き起こすことはなく該タンパク質に対 する抗体も産生されることはない。
抗原となるタンパク質は 5、 6残基のアミノ酸からなるェピトープ （抗原決定 基） を有し、 ェピトープが抗原を投与した動物中で認識され該ェピトープに対し て抗体が産生される。ェピト一プの形成はタンパク質の立体構造の影響も受ける。 タンパク質の中には、 進化の過程でアミノ酸配列が保存され異種動物間でアミ ノ酸配列の相同性の高いものがある。 異種動物間でアミノ酸配列の相同性が高い タンパク質は立体構造も類似しているので、 ェピトープ構造も保存される。 従つ て、 異なる動物種間でアミノ酸配列の相同性の高いタンパク質において、 ある種 由来のタンパク質を別の動物種に投与しても非自己と認識されないので、 抗体も 産生されず、 容易に抗体をえることはできない。
ヒ卜とマウス等の非ヒト動物間でアミノ酸配列相同性の高いタンパク質は多数 あるが、 例えばダリピカンファミリーに属するタンパク質が挙げられる。 ダリピカンファミリ一は、 細胞表面上に存在するへパラン硫酸プロテオグリカ ンの新しいファミリー報告されている。 現在までのところ、 グリピカンファミリ 一のメンバーとして、 5種類のグリピカン （ダリビカン 1、 グリピカン 2、 グリ ピカン 3、ダリピカン 4およびグリピカン 5 )が存在することが報告されている。 このファミリーのメンバ一は、均一なサイズ（約 60kDa)のコアタンパク質を持ち、 特異的でよく保持されたシスティンの配列を共有しており、 グリコシルフォスフ ァチジルイノシトール（GPI) アンカ一により細胞膜に結合している。 このうちグ リピカン 3 (GPC3) は、 発生における細胞分裂やそのパターンの制御に深く関わ つていることが知られており、 また GPC3遺伝子が肝癌細胞において高発現してお り、 GPC3遺伝子が癌マーカーとして利用できる可能性があることが知られている。 このような特徴を有する GPC3に対する抗体が得られれば、 癌の診断、 研究に有用 であると思われる。
しかし、 GPC3はマウスとヒトでアミノ酸レベルで 94%という極めて高い相同性を 示すことから、 前述のような理由で通常の Balb/cマウス等への免疫では異物とし て認識されにくく抗体を得難い可能性がある。 従って、 GPC3を始めとしたヒトと 非ヒト動物の間でアミノ酸配列の相同性が高いタンパク質について、 抗体を容易 に効率的に作製する系が望まれていた。 発明の開示
本発明は、 自己免疫疾患を発症する動物を用いてヒ卜とマウス等の非ヒト動物 間でアミノ酸配列相同性の高いタンパク質に対する抗体を作製する方法を提供す ることを目的とする。 さらに、 本発明は、 ヒトとマウスでアミノ酸配列相同性が 高い GPC3タンパク質に対する抗体を、 自己免疫疾患を発症するマウスを用いて作 成する方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、 ヒトと非ヒト動物間でアミノ酸配列相同性が高いタンパク質で あって、 ヒ卜由来の該タンパク質を非ヒト動物に投与しても抗体を産生しにくい タンパク質であっても、 自己に対して免疫反応が生じる自己免疫疾患を発症して いる非ヒト動物に投与したならば、 該非ヒト動物内で前記タンパク質に対する抗 体が産生され得るであろうと考え鋭意検討を行った。 例えば、 自己免疫疾患モデ ルである MRL/lprマウスは自己抗体を産生することが知られている（The genetics of autoantibody production in MRL/l r lipus mice Eisenberg RA et al. Clin Exp Rheumatol 1989 Sep - Oct ;7 S聊 13:S35-40> Hidden autoantibodies against common serum proteins in murine systemic lupus erythematosus. Detection by in vitro plaque - forming cell assay. Cohen PL. et al. J Exp Med 1985 Jun 1； 161 (6)： 1587 - 92、 Lpr and gld:single gee models of systemic autoimmunity and lymphoprol iterative disease. Cohen PL. et al. Annu Rev Immunol 1991:9:243 - 69、 Establishment of Monoclonal AnU - Retroviral gp70 Autoantibodies from MRL/l r Lupus Mice and Induct ion of Glomerular gp70 Deposision and Pathology by Transfer into Non-Autoimmune Mice. Nobutada Tabata, J of Virology May 2000;Vol 74:9:4116-26) 。 従って、 MRL/lprマウス等の自己免疫疾患モデルマウ スを用いれば、 マウスと他の種でアミノ酸配列の相同性の低いタンパク質抗原は もちろんのこと、 マウス由来の抗原や GPC3のようにマウスとヒトでアミノ酸レべ ルで非常に高い相同性を有するタンパク質抗原に対しても効率良く抗体を作製で きる可能性があると考えた。
本発明者らは、 MRL/lprマウスを用いた抗体作製の有用性を検証する目的でヒト GPC3を免疫原として MRL/lprマウスと Balb/cマウスへの免疫、抗体作製を行なった。 その結果、 MRL/lprマウスでは Ba lb/cマウスに比較して 0D値の高い陽性ゥェルが約 40倍多く得られること、 アイソタイプもバラエティ一に富んでいること、 抗体の 抗原親和性も約 100倍高いことを見出した。従って、マウスと他の種でタンパク質 相同性の低い抗原はもちろんのこと、 GPC3のようにマウスとヒ卜でアミノ酸レべ ルで非常に高い相同性を有する抗原に対する抗体を取得するために、 MRL/lprマウ スに免疫して抗体を作製することは非常に有効であることが判明し、 本発明を完 成させるに至った。
すなわち、 本発明は
(1) 自己免疫疾患を発症する非ヒト動物をダリピカンタンパク質で免疫する ことを含むダリピカンタンパク質に対する抗体の作製方法、
(2) 自己抗体産生非ヒト動物をダリピカンタンパク質で免疫することを含む ダリピカンタンパク質に対する抗体の作製方法、
(3) 自己免疫疾患を発症する非ヒト動物又は自己抗体産生非ヒ卜動物が、 Fas 機能欠損非ヒト動物である （1) または （2) のグリピカンタンパク質に対する 抗体の作製方法、
(4) 非ヒト動物がマウスである （3) のグリピカンタンパク質に対する抗体 の作製方法、
(5) マウスが MRL/lprマウスである （4)のグリピカンタンパク質に対する抗 体の作製方法、
(6) グリピカンタンパク質がグリピカン 3である （1) から （5) のいずれ かのグリピカンタンパク質に対する抗体の作製方法、
(7) Fas機能欠損非ヒ卜動物を抗原で免疫することを特徴とする抗体の作製方 法、
(8) 非ヒト動物がマウスである （7) の抗体の作製方法、
(9) マウスが MRL/lprマウスである （8) の抗体の作製方法、
(10) 抗原となるタンパク質が、 ヒトとマウスで高いアミノ酸配列の相同性 を有している、 （7) から （9) のいずれかの抗体の作製方法、
(11) アミノ酸配列の相同性が 90%以上である、 （10) の抗体の作製方 法、 および
(12) アミノ酸配列の相同性が 94%以上である （11) の抗体の作製方法 である
以下、 本発明について詳細に説明する。
本発明において自己免疫疾患とは、 自己抗体によってひき起こされる疾患のこ とをいう。 自己抗体によってひき起こされる疾患は、 自己抗体単独でひき起こさ れる疾患のみでなく、 自己抗体と対応抗原との複合体物などの自己抗体と他の物 質の複合体によってひき起こされる疾患も含まれる。 又、 自己抗体の病因性が明 らかな疾患のみでなく、 自己抗体の存在が病変の成立と密接に関係している疾患 も含まれる。 自己免疫疾患の具体的な例としては、 自己免疫性肝炎、 自己免疫性 甲状腺炎、 自己免疫性水疱症、 自己免疫性副腎皮質炎、 自己免疫性溶血性貧血、 自己免疫性血小板減少性紫斑病、 自己免疫性萎縮性胃炎、 自己免疫性好中球減少 症、 自己免疫性精巣炎、 自己免疫性脳脊髄炎、 自己免疫性レセプ夕一病、 自己免 疫不妊、 リウマチ、 クローン病、 全身性エリテマト一デス、 多発性硬化症、 バセ ドウ病、 若年性糖尿病、 アジソン病、 重症筋無力症、 水晶体性ブドウ膜炎、 など を挙げることができる。 本発明の自己免疫疾患を発症する非ヒト動物は、 自己免 疫疾患の 1つ以上を発症していればよく、自己免疫疾患の種類は特に限定されない。 又、 本発明の抗体作製方法において、 免疫に用いる非ヒト動物は、 自己免疫疾 患を発症している非ヒト動物だけでなく、 正常非ヒト動物と比較して自己抗体を 過剰に産生する非ヒト動物を用いることも可能である。
さらに、 通常は自己抗体を産生しない正常非ヒト動物 （例えば、 Balb/cマウス など） に、 LPSゃデキス卜ランサルフエートなどのポリクロ一ナル Bセルァクチべ 一夕一を投与するなどして、 自己抗体を産生する状態にした非ヒト動物を用いる ことも可能である。
自己免疫疾患を発症する非ヒト動物又は自己抗体を産生する非ヒト動物の好ま しい例として、免疫調節機構に異常のある非ヒト動物、例えば Fas遺伝子に変異が 入り Fas機能が欠損している非ヒト動物を挙げることができる。 Fasは NGF/TNFレセ プターファミリ一に属する細胞膜貫通型タンパク質で、 アポトーシス誘導シグナ ルを伝達する受容体分子である。 通常、 自己抗原に反応する B細胞が自己抗原に 特異的な T細胞に遭遇すると T細胞表面の Fasリガンドが B細胞表面の Fas (CD95) に結合し、 自己抗原反応 B細胞にアポトーシスが誘導されるが、 Fasに変異がある 場合にはこのメカニズムが働かないため、 自己抗原に反応し自己抗体を産生する B細胞が生き残るようになり、 自己抗体を過剰に産生するようになる。
又、 Fas機能欠損非ヒト動物以外に、 例えば、 Fasリガンド遺伝子に変異が入つ た Fasリガンド欠損非ヒト動物を用いることもできる。
Fas機能欠損非ヒ卜動物の具体的な例としては、 MRL/lprマウスなどを挙げるこ とができる。 Fas遺伝子が突然変異した lprマウス（MRL/lprマウス）は一般的に異常 な T細胞の蓄積と全身性エリテマトーデス様の自己免疫疾患を発症する。
Fasリガンド欠損非ヒト動物の具体的な例としては、 MRL/gldマウスなどを挙げ ることができる。
Fas機能欠損マウスや Fasリガンド欠損マウスなどは市販されているので、 当業 者は容易にそれらを入手することが可能である。
上記 Fas又は Fasリガンド欠損非ヒト動物以外にも、 例えば、 突然変異常染色体 劣性遺伝子^]：( 即1101)]：01 1 { 6 011)ゃ 1(1などを入れたマゥス（例えば、 正常マ ウスや MRL/Mp— +/+マウス（MRL/nマウス）に lprを加えたマウスなど）、 NZB/NZW F1 マウス、 BXSB/MpJマウス、 B/WF1マウス、 BXSBマウス、 SL/Niマウスなどを用いる ことができる。
又、 ジーン夕ーゲッティング法などを用いて、 例えば以下の方法により、 Fas や Fasリガンドの発現を人為的に抑制したマウスを作製することも可能である。 まず、 マウスから Fas (又は Fasリガンド）遺伝子のェクソン部分を含む DNAを単 離し、 この DNA断片に適当なマーカ一遺伝子を揷入し、ターゲッティングベクタ一 を構築する。 その後、 該ターゲッティングベクターをエレクトロボレ一シヨン法 などによりマウス ES細胞株に導入し、 相同組換えを生じた細胞株を選抜する。 揷 入するマーカー遺伝子としては、 ネオマイシン耐性遺伝子などの抗生物質耐性遺 伝子が好ましい。 抗生物質耐性遺伝子を挿入した場合には、 抗生物質を含む培地 で培養するだけで相同組換えを生じた細胞株を選抜することができる。 得られた ES細胞株をマウス胚盤葉にィンジェクシヨンしキメラマウスを得ることができる このキメラマウスを交配させることにより、 Fas (又は Fasリガンド） 遺伝子の遺 伝子対の一方を不活性化したマウスを得ることができる。 さらに、 該マウスを交 配させることにより、 Fas (又は Fasリガンド） 遺伝子の遺伝子対の双方を不活性 化したマウスを得ることができる。
本発明の非ヒ卜動物としては、 例えば、 サル、 ブ夕、 ィヌ、 ラット、 マウス、 ゥサギなどを挙げることができるが、 好ましくはラット、 マウス、 ハムスターな どのげつ歯類であり、 特に好ましいのはマウスである。
本発明においては、 いかなるタンパク質も抗原として用いることができるが、 抗原となるタンパク質が、 該抗原タンパク質に対応する免疫非ヒト動物のホモ口 グタンパク質とアミノ酸配列レベルで高い相同性を有していることが好ましい。 高い相同性を有するとは、 アミノ酸配列において少なくとも 65 %以上の相同性 を有していることを意味し、 好ましくは 75 %以上の相同性を有し、 さらに好まし くは 90 %以上の相同性を有し、 特に好ましくは 94%以上の相同性を有する。 タン パク質の相同性を決定するための配列の最適ァラインメントは様々なァルゴリズ ムを使って実施することができ、 例えば、 Wi lbur, W. J. and Li man, D. J.； P roc. Nat l. Acad. Sc i. USA (1983) 80, 726 - 730のアルゴリズム、 Smi thおよび W aterman, 1981, Adv. Appl. Math 2 : 482の局所相同性アルゴリズム、 Needleinanおよ び Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48 : 443の相同性アラインメントアルゴリズム、 P ear sonおよび Lipman, 1988, Pro Nat l. Acad. Sci. USA 85 : 2444の類似性検索 法、 およびこれらのアルゴリズムのコンピューター実行プログラム （Wiscons in Genet ics Sof t Package (Genet ics Computer Group, Madison, WI, U. S. A. ) の G AP、 BESTFIT、 FASTAおよび TFASTAなど） がある。 配列アラインメントは、 Al tscli ulら， 1990, J. Mol. Biol. 215 : 403-10 (開示されたデフォルト設定を用いる） に 記載された BLASTアルゴリズムを用いて実施することもできる。 BLAST解析を実施 するためのソフトウェアは、 Nat ional Center for Biotechno l ogy Informat ion
(国立生物技術情報センター； ht tp ://www. ncbi. nlm. gov/) から利用可能である 。 BLASTアルゴリズムは、 最初にデータベース配列中の長さ Wの短いワードとァラ インメントしたときに、一致するかまたは任意の正値の閾値スコア Tを満たすクェ リ一配列中の同じ長さの短いワードを確認することによって、 高スコア配列ペア
(HSP) を同定することを含む。 Tは近傍ワードスコア閾値（ne ighbourhood word score threshold) と呼ばれる。 最初の近傍ワードヒットはより長い HSPを見出す 検索を開始するためのシーズとして機能する。 ワードヒットを、 それぞれの配列 に沿って、 累積アラインメントスコアが増加しうる限り両方向に伸長させる。 そ れぞれの方向のワードヒッ卜の伸長は、 次のパラメーターが適合したときに停止 する ：累積アラインメントスコアが最大達成値から量 Xだけ落ちた； 1以上の負ス コアの残基アラインメントが蓄積して、 累積スコアがゼロ以下になった； または いずれの配列も末端に到達した。 BLASTアルゴリズムパラメ一夕一 W、 Tおよび Xは ァラインメン卜の感度と速度を決定する。 BLASTプログラムは、両鎖の核酸比較に 対して、 デフォルトとしてワードの長さ 00 = 11、 BLOSUM62スコアリングマトリ ックス （Henikoiiおよび Henikofi, 1992, Pro Nat l. Acad. Sci. USA 89 : 1091 5-10919) アラインメント （B) =50、 期待値 （E) = 10 (他の実施形態においては 1または 0. 1または 0. 01または 0. 001または 0. 0001に変えてもよい； 0. 1より遥かに 高い E値は機能的に類似した配列を同定し得ないが、短い類似性領域に対してはよ り低い有意度、 0. 1と 10の間の E値を用いてヒットを判定するのが有用である） 、 M =5、 N=4を使用しうる。 タンパク質の比較に関しては、 BLASTPを次のデフォルトを 用いて使用しうる： G=l l (ギャップを空けるコスト） ； E=l (ギャップを拡げるコ スト） ； E=10 (期待値、 この設定では、 規定したアラインメントスコア Sと等しい かより優れたスコアをもつ 10ヒットが、 検索対象と同じサイズのデータベース中 で偶然に起こると期待される； E値を増加または減少して検索のストリンジェンシ 一を変えることができる） ；および W=3 (ワードサイズ、 デフォルトは BLASTNに 対して 11、 その他の blastプログラムに対して 3) 。
BL0SUMマトリックスはアラインメントの各位置に対する確率スコアを割当てる が、 その割当は、 関連タンパク質内のコンセンサスブロック間の置換が起こる頻 度が分かっているのでその頻度に基づく。 BL0SUM62 (ギャップ存在コスト = 11； 残基ギャップ当たりコスト = 1； λ比 = 0. 85) 置換マトリックスを BLAST 2. 0のデ フォルトで使う。 様々な他のマトリックスを、 BL0SM62の代わりに使ってもよく、 例えば P崖 30 (9, 1, 0. 87) ； PAM70 (10, 1, 0. 87)、 BLOSUM80 (10, 1, 0. 87)、 BL0S環 62 (11, 1， 0. 82) および BL0S丽 45 (14, 2, 0. 87) が挙げられる。 BLASTアルゴリズムを 使う 2つの配列間の統計的類似性の 1つの基準は、 最小和確率 （P (N) ) であり、 こ れは 2つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列の間に一致が偶然起り得る確率を示 す。本発明の他の実施形態においては、試験配列と比較して最小和確率が約 1より 低い、 好ましくは約 0. 1より低い、 さらに好ましくは 0. 01より低い、 そして最も好 ましくは約 0. 001より低い塲合には、 実質的に同一であると考えられる。
相同性の高いタンパク質の例としては、 ダリピカンファミリ一を挙げることが できる。グリビカンファミリ一は、 ダリビカン 1、 ダリビカン 2、 ダリビカン 3、 グリピカン 4、 グリピカン 5などから構成される（Trends in Glycoscience and Glycotechnology, Vol. 10, No. 52, (March 1998) pp. 145-152) 0 グリピカンファ ミリーの中でも、 特にダリビカン 3タンパク質が好ましい。
抗体は、 ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよいが、 モノクロ一 ナル抗体が望ましい。
感作抗原による動物の免疫は、 公知の方法に従って行われる。 例えば、 一般的 方法として、 感作抗原を哺乳動物の腹腔内または皮下に注射することにより行わ れる。 具体的には、 感作抗原を PBS (Phosphate-Buf fered Sal ine) や生理食塩水 等で適当量に希釈、 懸濁したものに所望により通常のアジュバント、 例えばフロ イン卜完全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に 4〜21日毎に数回投与 する。 また、 感作抗原免疫時に適当な担体を使用することもできる。 特に分子量 の小さい部分ペプチドを感作抗原として用いる場合には、 アルブミン、 キーホー ルリンぺッ卜へモシァニン等の担体タンパク質と結合させて免疫することが望ま しい。
このように哺乳動物を免疫し、 血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認 した後に、 哺乳動物から免疫細胞を採取し、 細胞融合に付されるが、 好ましい免 疫細胞としては、 特に脾細胞が挙げられる。
前記免疫細胞と融合される他方の親細胞として、 哺乳動物のミエローマ細胞を 用いる。 このミエローマ細胞は、公知の種々の細胞株、例えば、 P3 (P3x63Ag8. 653) ( J. Immnol. ( 1979 ) 123, 1548-1550 ) 、 P3x63Ag8U. 1 ( Current Topics in Microbiology and Immunology ( 1978) 81, 1-7) , NS-1 (Kohler. G. and Mi l s te in, C. Eur. J. I匪 imoL (1976) 6, 511-519) 、 MPC-11 (Margul ies. D. H. et al. , Ce l l
( 1976) 8, 405-415) , SP2/0 (Sliulman, M. et al. , Nature ( 1978) 276, 269-270)、 F0 (de St. Groth, S. F. et al. , J. Immunol. Methods ( 1980) 35, 1-21) 、 S 194 (Trowbridge, I. S. J. Exp. Med. ( 1978) 148, 313-323) 、 R210 (Gal f re, G. e t al. , Nature ( 1979) 277, 131-133) 等が好適に使用される。
抗原で免疫する動物として、 MRL/lprマウスを選択した時もこれらのミエローマ 細胞のいずれも用いることができる。
前記免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合は、 基本的には公知の方法、 たと えば、 ケーラーとミルスティンらの方法 （Kohler. G. and Mi l s te in, 、 Me thods Enzymol. ( 1981) 73, 3-46) 等に準じて行うことができる。
より具体的には、 前記細胞融合は、 例えば細胞融合促進剤の存在下に通常の栄 養培養液中で実施される。 融合促進剤としては、 例えばポリエチレングリコール
(PEG) 、 センダイウィルス （HVJ) 等が使用され、 更に所望により融合効率を高 めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を添加使用することもできる。
免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は任意に設定することができる。例えば、 ミエローマ細胞に対して免疫細胞を 1〜10倍とするのが好ましい。前記細胞融合に 用いる培養液としては、 例えば、 前記ミエローマ細胞株の増殖に好適な RPMI 1640 培養液、 MEM培養液、 その他、 この種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用 可能であり、 さらに、 牛胎児血清 （FCS) 等の血清補液を併用することもできる。 細胞融合は、 前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく 混合し、 予め 37°C程度に加温した PEG溶液（例えば平均分子量 1000〜6000程度） を 通常 30〜60 % (w/v) の濃度で添加し、 混合することによって目的とする融合細胞
(ハイプリドーマ） を形成する。 続いて、 適当な培養液を逐次添加し、 遠心して 上清を除去する操作を繰り返すことによりハイプリドーマの生育に好ましくない 細胞融合剤等を除去する。
このようにして得られたハイプリドーマは、通常の選択培養液、例えば HAT培養 液 （ヒポキサンチン、 アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液） で培養する ことにより選択される。上記 HAT培養液での培養は、 目的とするハイプリドーマ以 外の細胞 （非融合細胞） が死滅するのに十分な時間 （通常、 数日〜数週間） 継続 する。 ついで、 通常の限界希釈法を実施し、 目的とする抗体を産生するハイプリ ドーマのスクリーニングおよび単一クローニングを行う。
目的とする抗体のスクリーニングおよび単一クローニングは、 公知の抗原抗体 反応に基づくスクリーニング方法で行えばよい。 例えば、 ポリスチレン等ででき たビーズや市販の 96ゥエルのマイクロタイタープレート等の担体に抗原を結合さ せ、 ハイプリ ドーマの培養上清と反応させ、 担体を洗浄した後に酵素標識第 2次 抗体等を反応させることにより、 培養上清中に感作抗原と反応する目的とする抗 体が含まれるかどうか決定できる。 目的とする抗体を産生するハイプリドーマを 限界希釈法等によりクロ一ニングすることができる。この際、抗原としては、 GPC3 の N端ペプチドまたはその断片をスクリーニング用抗原として用いればよい。 さらに、 本発明の方法により得られた抗体を基に、 キメラ抗体、 ヒト型化抗体な どの人為的に改変した遺伝子組換え型抗体や、 抗体断片、 抗体修飾物などを作製 することが可能である。
又、 本発明の方法により得られたハイプリドーマから、 抗体遺伝子をクロー二 ングし、 適当なベクターに組み込んで、 これを宿主に導入すれば、 組換え型抗体 を作製することができる （例えば、 Vanda腿 e, A. M. et al.， Eur. J. Biochem. (1990) 192, 767-775, 1990参照） 。
具体的には、 抗体を産生するハイプリドーマから、 抗体の可変 （V) 領域をコー ドする mRNAを単離する。 mRNAの単離は、 公知の方法、 例えば、 グァニジン超遠心 法 (Chirgwin, J. Μ· et al. , Biochemistry (1979) 18, 5294-5299) 、 AGPC法 (Chomczynski, P. et al. , Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159) 等により行つ て全 RNAを調製し、 mRNA Purification Kit (Pharmacia製） 等を使用して目的の mRNAを調製する。 また、 QuickPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia製） を用 いることにより mRNAを直接調製することもできる。
得られた mRNAから逆転写酵素を用いて抗体 V領域の cDNAを合成する。 cDNAの合成 は、 AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit (生化学工業 社製） 等を用いて行う。 また、 cDNAの合成および増幅を行うには、 5'- Ampli FINDER RACE Kit (Clontech製) および PCRを用いた 5' -RACE法 （Frohman, M. A. et al. , Pro Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 8998-9002、 Belyavsky, A. et al. , Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919-2932) 等を使用することができる。
得られた PCR産物から目的とする DNA断片を精製し、ベクター DNAと連結する。さ らに、 これより組換えベクターを作製し、 大腸菌等に導入してコロニーを選択し て所望の組換えベクターを調製する。そして、 目的とする DNAの塩基配列を公知の 方法、 例えば、 ジデォキシヌクレオチドチェインターミネーシヨン法等により確 認する。 目的とする抗体の V領域をコードする DNAを得たのち、 これを、所望の抗体定常 領域 （C領域） をコードする丽 Aを含有する発現べクタ一へ組み込む。
抗体遺伝子は発現制御領域、 例えば、 ェンハンサー、 プロモーターの制御のも とで発現するよう発現べクタ一に組み込む。 次に、 この発現ベクターにより、 宿 主細胞を形質転換し、 抗体を発現させる。
抗体遺伝子の発現は、抗体重鎖（H鎖）または軽鎖（L鎖）をコードする DNAを別々 に発現ベクターに組み込んで宿主細胞を同時形質転換させてもよいし、あるいは H 鎖および L鎖をコードする DNAを単一の発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質 転換させてもよい （W0 94/11523 号公報参照） 。
また、 組換え型抗体の産生には上記宿主細胞だけではなく、 トランスジェニッ ク動物を使用することができる。 例えば、 抗体遺伝子を、 乳汁中に固有に産生さ れるタンパク質 （ャギ カゼインなど） をコードする遺伝子の途中に挿入して融 合遺伝子として調製する。抗体遺伝子が挿入された融合遺伝子を含む DNA断片をャ ギの胚へ注入し、 この胚を雌のャギへ導入する。 胚を受容したャギから生まれる トランスジエニックャギまたはその子孫が産生する乳汁から所望の抗体を得る。 また、 トランスジエニックャギから産生される所望の抗体を含む乳汁量を増加さ せるために、 適宜ホルモンをトランスジエニックャギに使用してもよい （Ebert, K. M. e t al. , Bio/Technology ( 1994) 12, 699-702) 。
人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、 例えば、 キメラ抗体、 ヒト型化 (Humanized) 抗体は既知の方法を用いて製造することができる。
キメラ抗体は、 前記のようにして得た抗体 V領域をコードする DNAをヒト抗体 C 領域をコードする DNAなどと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入 し産生させることにより得られる。
ヒト型化抗体は、 再構成 （reshaped) ヒト抗体とも称され、 これは、 ヒト以外 の哺乳動物、 例えばマウス抗体の相補性決定領域 （CDR ; co即 lementari ty determining region) をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、 その 一般的な遺伝子組換え手法も知られている （欧州特許出願公開番号 EP 125023号公 報、 W0 96/02576 号公報参照） 。 具体的には、 本発明の方法により得られた非ヒト動物由来抗体 （例えばマウス 抗体） の CDRとヒト抗体のフレームワーク領域 （f ramework region； FR) とを連結 するように設計した DNA配列を、 CDR及び FR両方の末端領域にオーバーラップする 部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い て PCR法により合成する（W098/13388号公報に記載の方法を参照）。
CDRを介して連結されるヒト抗体のフレームワーク領域は、相補性決定領域が良 好な抗原結合部位を形成するものが選択される。 必要に応じ、 再構成ヒト抗体の 相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように、 抗体の可変領域におけ るフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Sato, K. ei al. , Cancer Res.
( 1993) 53, 851-856) 。
キメラ抗体及びヒト型化抗体の C領域には、 ヒト抗体のものが使用され、 例え ば H鎖では、 C T 1、 Cァ 2、 C r 3 , C r 4を、 L鎖では C K、 を使用す ることができる。 また、 抗体またはその産生の安定性を改善するために、 ヒト抗 体 C領域を修飾してもよい。
キメラ抗体は、 非ヒ卜動物由来抗体の可変領域とヒ卜抗体由来の定常領域とか らなる。 一方、 ヒト型化抗体は、 非ヒト動物由来抗体の相補性決定領域と、 ヒト 抗体由来のフレームワーク領域および C領域とからなる。 ヒト型化抗体はヒト体 内における抗原性が低下されているため、 治療目的などでヒトに投与する場合に 有用である。
本発明の方法により得られた抗体から、 抗体の断片又はその修飾物を作製する ことも可能である。 例えば、 抗体の断片としては、 Fab、 F (ab' ) 2、 Fv、 1個の Fab と完全な Fcを有する Fab/c、または H鎖若しくは L鎖の Fvを適当なリンカーで連結 させたシングルチェイン Fv (scFv) が挙げられる。 具体的には、 抗体を酵素、 例 えばパパイン、 ペプシンで処理し抗体断片を生成させるか、 または、 これら抗体 断片をコードする遺伝子を構築し、 これを発現ベクターに導入した後、 適当な宿 主細胞で発現させる（例えば、 Co, M. S. et al.， J. Immunol. ( 1994) 152, 2968 - 2976、 Be t ter, M. S Horwi tz, A. H. Methods in EnzymoIogy( 1989) 178, 476-496, Academic Press, Inc. , Plueckthun, A. & Skerra, A. Me thods in Enzymology (1989) 178, 476-496, Academic Press, In 、 Lamoyi, E. , Me thods in Enzymology ( 1989) 121, 652-663 Rousseaux, J. e t al. , Me thods in Enzymol ogy( 1989) 121, 663-669, B i rd, R. E. et al. , TIBTECH ( 1991) 9, 132-137参照) 。
scFvは、 抗体の H鎖 V領域と L鎖 V領域とを連結することにより得られる。 こ の scFvにおいて、 H鎖 V領域と L鎖 V領域は、 リンカ一、 好ましくはペプチドリ ンカーを介して連結される (Hus ton, J. S. et al.、Pro Nat l. Acad. Sc i. U. S. A. ( 1988) 85, 5879-5883) 。 V領域を連結するペプチドリンカ一としては、 例えば アミノ酸 12〜 19残基からなる任意の一本鎖べプチドが用いられる。
scFvをコードする DNAは、 前記抗体の H鎖または H鎖 V領域をコードする DNA、 および L鎖または L鎖 V領域をコードする DNAのうち、それらの配列のうちの全部 又は所望のアミノ酸配列をコードする DNA部分を錡型とし、その両端を規定するプ ライマー対を用いて PCR法により増幅し、次いで、 さらにペプチドリンカ一部分を コードする DNA、およびその両端が各々 H鎖、 L鎖と連結されるように規定するプ ライマー対を組み合せて増幅することにより得られる。
また、一旦 scFvをコードする DNAが作製されると、それらを含有する発現べクタ 一、 および該発現ベクターにより形質転換された宿主を常法に従って得ることが でき、 また、 その宿主を用いることにより、 常法に従って scFvを得ることができ る。
抗体の修飾物として、 細胞障害性物質 （化学療法剤、 放射性物質、 細胞由来ト キシンなど） や標識物質 （蛍光色素、 酵素、 補酵素、 化学発光物質、 放射性物質 など） 等の各種分子と結合した抗体を挙げることができる。 このような抗体修飾 物は、 本発明の方法により得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得る ことができる。なお、抗体の修飾方法はこの分野においてすでに確立されている。 さらに、本発明の方法により得られた抗体を基に、二重特異性抗体（bispeci i ic ant ibody) を作製することも可能である。 二重特異性抗体の例として、 同一抗原 分子上の異なるェピ卜一プを認識する抗原結合部位を有する二重特異性抗体、 一 方の抗原結合部位が抗原を認識し、 他方の抗原結合部位が標識物質等の他の物質 を認識する二重特異性抗体、 一方の抗原結合部位が第一の抗原を認識し、 他方の 抗原結合部位が第一の抗原とは異なる第二の抗原を認識する二重特異性抗体、 な どを挙げることができる。 二重特異性抗体は 2種類の抗体の HL対を結合させて作 製することもできるし、 異なるモノクローナル抗体を産生するハイプリドーマを 融合させて二重特異性抗体産生融合細胞を作製し、 得ることもできる。 さらに、 遺伝子工学的手法により二重特異性抗体を作製することも可能である。
前記のように構築した抗体遺伝子は、 公知の方法により発現させ、 取得するこ とができる。 哺乳類細胞の場合、 常用される有用なプロモー夕一、 発現させる抗 体遺伝子、 その 3'側下流にポリ Aシグナルを機能的に結合させて発現させること ができる。 例えばプロモーター Zェンハンサーとしては、 ヒトサイトメガロウイ レス前期プロモ一夕一/ェンゾ、ンサ—— ( human cytomegalovi rus immed iate early promoter/enhancer) を挙げることができる。
また、 その他に抗体発現に使用できるプロモーター Zェンハンサ一として、 レ トロウィルス、ポリオ一マウィルス、アデノウイルス、シミアンウィルス 40 (SV40) 等のウィルスプロモーター/ェンハンサー、 あるいはヒ卜ェロンゲ一ションファ クタ一 la (HEFla)などの哺乳類細胞由来のプロモータ一ノエンハンサ一等が挙げ られる。
SV40プロモーター Zェンハンサーを使用する場合は Mul l iganらの方法 （Nature ( 1979) 277, 108) により、 また、 HE aプロモーター/ェンハンサ一を使用する 場合は Mizushimaらの方法 (Nuc le ic Ac ids Res. ( 1990) 18, 5322) により、 容易 に遺伝子発現を行うことができる。
大腸菌の場合、 常用される有用なプロモーター、 抗体分泌のためのシグナル配 列及び発現させる抗体遺伝子を機能的に結合させて当該遺伝子を発現させること ができる。 プロモーターとしては、 例えば laczプロモーター、 araBプロモ一夕一 を挙げることができる。 l aczプロモータ一を使用する場合は Wardらの方法 (Nature ( 1098) 341, 544-546 ； FASEB J. ( 1992) 6， 2422-2427) により、 あるいは araB プロモーターを使用する場合は Be t terらの方法（Sc ience ( 1988) 240, 1041-1043) により発現することができる。
抗体分泌のためのシグナル配列としては、 大腸菌のペリブラズムに産生させる 場合、 pelBシグナル配列 (Le i, S. P. et al J. Bacteriol. ( 1987) 169, 4379) を使用すればよい。 そして、 ペリブラズムに産生された抗体を分離した後、 抗体 の構造を適切に組み直して （refold) 使用する。
複製起源としては、 SV40、 ポリオ一マウィルス、 アデノウイルス、 ゥシパピ口 一マウィルス （BPV) 等の由来のものを用いることができ、 さらに、 宿主細胞系で 遺伝子コピー数増幅のため、 発現ベクターは、 選択マーカーとしてアミノグリコ シドトランスフェラ一ゼ （APH) 遺伝子、 チミジンキナーゼ （TI0 遺伝子、 大腸菌 キサンチングァニンホスホリポシルトランスフェラーゼ (Ecogpt) 遺伝子、 ジヒ ドロ葉酸還元酵素 （dhfr) 遺伝子等を含むことができる。
抗体の製造のために、 任意の発現系、 例えば真核細胞又は原核細胞系を使用す ることができる。 真核細胞としては、 例えば樹立された哺乳類細胞系、 昆虫細胞 系、 真糸状菌細胞および酵母細胞などの動物細胞等が挙げられ、 原核細胞として は、 例えば大腸菌細胞等の細菌細胞が挙げられる。
好ましくは、 抗体は、 哺乳類細胞、 例えば CH0、 COS, ミエローマ、 BHK、 Vero、 HeLa細胞中で発現される。
次に、 形質転換された宿主細胞を in vi t roまたは in vivoで培養して目的とする 抗体を得ることが可能である。宿主細胞の培養は公知の方法に従い行う。例えば、 培養液として、 DMEM、 MEM、RPMI 1640、 IMDMを使用することができ、牛胎児血清（FCS) 等の血清補液を併用することもできる。
前記のように発現、 産生された抗体は、 細胞、 宿主動物から分離し均一にまで 精製することができる。 抗体の分離、 精製はァフィ二ティーカラムを用いて行う ことができる。例えば、プロティン A力ラムを用いたカラムとして、 Hype r D、 P0R0S、 Sepharose F. F. (Pharmac ia製） 等が挙げられる。 その他、 通常のタンパク質で使 用されている分離、 精製方法を使用すればよく、 何ら限定されるものではない。 例えば、 上記ァフィ二ティーカラム以外のクロマトグラフィーカラム、 フィル夕 一、 限外濾過、塩析、 透析等を適宜選択、組み合わせることにより、抗体を分離、 精製することができる (Ant ibodies A Laboratory Manual. Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988) 。 図面の簡単な説明 図 1は、 ヒ卜 GPC3とマウス GPC3アミノ酸配列の比較を示す図である。
図 2は、 ハイプリドーマの 1次スクリーニングの度数分布表を示す図である。 図 3は、 得られた 4 7クローンのモノクローナル抗体のアイソタイプの内分け を示す図である。
図 4は、 BIAcoreによる抗 GPC3抗体の速度論的解析結果を示す図である。 発明を実施するための最良の形態
以下、 実施例により、 本発明を具体的に説明する。 但し、 本発明はこれらの 実施例に限定されるものではない。
本願明細書記載の実施例において、 以下の材料を用いた。
材料
可溶型 GPC3、 可溶型 GPC3コア蛋白質の発現ベクターとして、 pCAGGSに DHFR遺伝 子及びネオマイシン耐性遺伝子を組み込んだ PCXND2、 pCXND3を用いた。
DXB 11は ATCCより購入した細胞を用い、 培養には 5%FBS (GIBCO BRL CAT# 10099-141, L0T# A0275242) / Minimum Essent ial Medium Alpha medium ( a MEM (+) ) (GIBCO BRL CAT# 12571-071) / 1% Penic i l l in- St reptomyc in (GIBCO BRL CAT# 15140-122)を用いた。 DXB11を用いた発現株の選抜には、 500 g/mL Genet ic in (GIBCO BRL CAT# 10131-027) / 5% FBS/ MEM wi thout ribonuc leos ides and deoxyribonucleos ides (GIBCO BRL CAT# 12561-056) ( « ΜΕΜ (-））/ PSあるいは同 培地に終濃度 25nMとなるように MTXを加えたものを用いた。
得られたハイ ブリ ドー マは 10 % FBS I RPMI 1640 / 1 HAT media suppl ement (SIGMA CAT* H-0262) / 0. 5 x BM-Condimed HI Hybridoma c loning supplement (Roche CAT* 1088947)で培養した。
〔可溶型ヒ卜 GPC3の作製〕
ヒ卜 GPC3をコードする全長 cDNAは、大腸癌細胞株 Caco2より常法により調製した 1st strand cDNAを铸型とし、 上流プライマ一 （5' _ GAT AK ATG GCC GGG ACC GTG CGC ACC GCG T -3' (配列番号 1 ) ) 、 下流プライマー （5' - GCT AGC TCA GTG CAC CAG GAA GAA GAA GCA C -3' (配列番号 2 ) ) を用いた PCR反応により増幅した。 この完全長ヒト GPC3cDNAを含むプラスミド DNAを用い、 可溶型 GPC3 cDNA発現ブラ スミド DNAを構築した。 C末端側の疎水領域（564- 580アミノ酸） を除くように設計 した下流プライマー （5'- ATA GAA TTC CAC CAT GGC CGG GAC CGT GCG C _3' (配 列番号 3) ) と EcoRI認識配列、 Kozak配列を加えた上流プライマー （5'- ATAGGA TCC CTT CAG CGG GGA ATG AAC GTT C -3' (配列番号 4) ) を用いて PCRを行った。 得られた PCR断片（171 lbp)を PCXND2-F 1 agにクローニングした。 作製された発現プ ラスミド DNAを CH0細胞 DXB11株へ導入し、 500 g/mL Geneticin での選抜により、 可溶型 GPC3高発現 CH0株を得た。
1700 cm2ローラーポトルを用い可溶型 GPC3高発現 CH0株の大量培養を行い、 培養 上清を回収し精製を行った。培養上清を DEAE sepharoseFast Flow (Amersham CAT# 17-0709-01)にチャージし、洗浄後、 500mMNaClを含むバッファ一により溶出した。 次に、 Anti-Flag M2 agarose affinity gel (SIGMA CAT#A-2220) を用いてァフィ 二ティ一精製を行った。 溶出は 200 a g/mLの FLAGぺプチドにより行った。 Centriprep-10(Millipore CAT#4304) に よ る 濃縮後 、 Superdex 200 HR 10/30 (Amersham CAT* 17-1088-01)によるゲルろ過を行い FLAGぺプチドを除去した。 最後に DEAE sepharose Fast Flowカラムを用いて濃縮し、 同時に Tween20を含まな い PBS (500mMの NaClを含む） で溶出を行うことによりバッファー置換を行った。
〔可溶型ヒト GPC3コア蛋白質の作製〕
上記野生型ヒト GPC3 cDNAをテンプレートとし、 アッセンブリー PCR法によって 495番目と 509番目の Serを Alaに置換させた cDNAを作製した。 この際、 C末端に His タグが付加されるようにプライマ一を設計し、 得られた c DNAを p CXND 3ベクターに クローニングした。作製された発現プラスミド DNAを DXB11株へ導入し、 500 g/mL Geneticin での選抜により、 可溶型 GPC3コア蛋白質高発現 CH0株を得た。
1700 cm2ローラ一ボトルを用い大量培養を行い、 培養上清を回収し精製を行つ た。 培養上清を Q sepharose Fas t Flow (Amersham CAT# 17- 0510- 01)にチャージ し、洗浄後、 500mM NaC lを含むリン酸バッファ一により溶出した。次に、 Che l at ing sepharose Fas t Flow (Amersham CAT# 17- 0575- 01)を用いてァフィ二ティー精製 を行った。 10〜150mMのイミダゾールでグラジェント溶出を行った。 最後に Q sepharose Fas t Flow を用いて濃縮し、 500mM NaClを含むリン酸バッファ一によ り溶出した。
〔抗 GPC3抗体の作製〕
ヒト GPC3とマウス GPC3はアミノ酸レベルで 94%という非常に高い相同性を示す。 ヒ卜 GPC3とマウス GPC3アミノ酸配列の比較を図 1に示す。 図 1の配列中黒三角で 示した部分は、 N結合ダルコシル化部位の可能性のある部位であり、米印で示した 部位は、 グリコサミノダリカンが結合する可能性のある部位である。 従って、 通 常のマウスへの免疫では抗体を取得し難いことが予想された。 しかし、 自己免疫 疾患モデルマウスとして知られる MRL/lprマウスは種々の自己抗体を産生するこ とから、 MRL/lprマウスに免疫することで、マウスと他の種で蛋白相同性の低い抗 原はもちろんのこと、 GPC3のようにヒトとマウスで相同性の高い抗原に対しても 抗体を作製できる可能性がある。そこで、 MRL/lprマウスを用いた抗体作製の有用 性を確かめる目的で、 MRL/lprマウスと Balb/cマウスへの免疫による抗体作製の比 較検討を行なった。 免疫及びハイプリドーマ作製
免疫原としてへパラン硫酸付加可溶型 GPC3蛋白を用いた。 Balb/cマウス（メス、 6週齢、 日本チャールズリバ一） 5匹及び MRL/lprマウス （ォス、 7週齢、 日本チヤ ールズリバ一） 7匹に定法に従い免疫を行なった。 すなわち、 初回免疫には免疫 蛋白質を lOO g/匹となるように調製し、 FCA (フロイント完全アジュバント （H37 Ra) 、 Di fco (3113-60) べクトンディッキンソン （cat#231131) ) を用いてェマル ジョン化したものを皮下に投与し、 2週間後に 50 /x g/匹となるように調製したもの を FIA (フロイン卜不完全アジュバント、 Di ico (0639-60) >べクトンディツキンソ ン （cat#263910) ) でェマルジヨン化したものを皮下に投与した。 以降 1週間間 隔で追加免疫を合計 5回行い、 最終免疫については 50 2 g/匹となるように PBSに希 釈し尾静脈内に投与した。 l ^ g/mlの可溶型 GPC3コア蛋白質を ゥエルでコ ートしたィムノプレートを用いた ELISAにより GPC3に対する血清中の抗体価が飽 和しているのを確認後、 Balb/c No. 2および MRL/lpr No. 6マウス 1匹ずつに最終免 疫を施し、 定法に従い、 マウスミエローマ細胞 P3U1とマウス脾臓細胞を混合し、 PEG1500 (ロシュ ·ダイァグノスティック、 cat#783 641) により細胞融合を行つ た。 MRL/lprマウスの脾臓由来単核細胞は Balb/cマウスのそれよりも数が多いため、 Balb/c由来のハイプリドーマは 96穴培養プレート 10枚に、 MRL/lpr由来のハイプリ ドーマは 20枚に播種した。 フュージョン翌日より HAT培地で選択を開始し、 フュー ジョン後 10日目及び 14日目に培養上清を回収し ELISAスクリーニングを行なった。 ELISAスクリーニングは前述の抗体価測定と同様に l g/mlの可溶型 GPC3コア蛋白 質を 100 ゥエルでコートしたィムノプレートを用いて行なった。 スクリーニング
一般的に IgG3、 IgMは補体との結合活性が強く CDC活性を誘導し得るアイソ夕ィ プとして知られている。抗 GPC3抗体のように癌治療を目的とした場合、 1次スクリ 一二ング時に I gG3、 I gMを取りこぼすことなくスクリーニングができることは非常 に有用である。そこで、 2次抗体を変えることで IgGl、 IgG2a、 IgG2bのみならず IgG3、 IgMもとりこぼさず拾う 2段階の方法でスクリーニングを行なった。すなわち、一 段階目は、 2次抗体としてアルカリフォスファターゼ標識-抗マウス IgG (r)抗体 (ZYMED社製、 Cat No. 62-6622) を用いて発色させることで IgGl、 IgG2a、 IgG2b を取得し、 次に、 プレ一トを十分 washした後、 二段階目はピオチン標識した抗 IgG 3抗体 （M0N0SAN社製、 Cat No. M0N5056B) 及びホースラディッシュペルキシダ一 ゼ標識した抗 IgM抗体 （ZYMED社製、 Cat No. 62-6820) で再度発色させることで選 択的に IgG3及び IgMを取得する方法でスクリーニングを行なった。
Balb/c マウス （No. 2) 、 MRL/lpr マウス （No. 6) 、 各一匹ずつについてフュー ジョンを行い、 GPC 3コア蛋白質を抗原とした ELISAスクリーニングにより陽性ゥ エルを選択した。 陽性ゥエルは 24ゥエルプレートに拡大した後、 限界希釈法 （1 陽性ゥエルにつき 96ゥエル 1 プレートに播きこむ）によりクロ一ニングを行った。 抗体精製
抗体の精製は得られた培養上清から、 IgGK IgG2a、 IgG2bについては Protein G カラム Hi Trap ProteinG HP (Aniersliam CAT#17- 0404- 01)を用いて、 IgMについて は Protein Lを用いて精製を行った。 具体的に、 IgG精製は Hi Trap ProteinG HP(AmershamCAT#17- 0404- 01)を用いて行った。ハイプリドーマ培養上清を直接力 ラムにチャージし、 結合バッファ一 （20mM Sodium phosphate (pH7.0) ) にて洗浄 後、 溶出バッファ一 （0. lMGlycin_HCl (pH2.7) ) で溶出した。 溶出は中和バッフ ァー （1M Tris-HCl (pH9.0) ) を加えたチューブに行い直ちに中和した。 抗体画分 をプールした後、 0.05 % Tween20ZPBSで一昼夜透析を行ぃバッファ一置換した。 精製された抗体は 0.02%となるように NaN3を添加した後、 4 で保管した。
一方、 IgM精製は ImmunoPure Immobilized Protein L (PIERCE CAT#20510)を用 いて行った。 ハイプリドーマ培養上清を直接カラムにチャージし、 結合バッファ ― (lOOmM Sodium phosphate (pH7.2) , 150mM NaCl) にて洗浄後、 溶出バッファ ― (0. lMGlycin-HCl (pH2.5) ) で溶出した。溶出後は IgGと同様の操作を行い 4°C で保管した。
〔抗 GPC3抗体のアイソタイプ解析〕
抗グリピカン 3抗体のァイソタイピングは、 ImmunoPure Monoclonal Antibody Isotyping Kit II (PIERCE CAT* 37502)を用い、 方法は添付のマニュアルに従つ た。
[BIAC0REによる抗 GPC3抗体の速度論的解析〕
可溶型 GPC3コア蛋白チップの作製
ゲルろ過にて可溶型 GPC3コア蛋白を lOmMNa Acetate (pH5.0)にバッファー置換 した。バッファ一置換した可溶型 GPC3コア蛋白約 10 gを用いて、ァミンカツプリ ングキット （BIAC0RE社製 BR-1000- 50) に記載された方法にて、 センサーチップ CM5 (BIACORE社製 BR- 1000-14) にァミンカップリングした。 この操作にて約 3000RUの可溶型 GPC3コア蛋白が CM5チップ上に固定化された。 抗 GPC3抗体の速度論的解析
BIACORE (BIACORE社製 BIACORE2000) を用いて以下の速度論的解析を行った。 各抗 GPC3抗体を HBS- EP バッファ一にて希釈して、 1. 25、 2. 5、 5、 10、 20 /ml になるように調製した。 ランニングバッファーに HBS-EPバッファ一（BIACORE社製 BR - 1001- 88) を用いて、 流速 20 1/minにて各濃度の抗体 40 1をインジェクトし た。抗体をインジェクト中の 2分間を結合相とし、その後ランニングバッファ一に 切り換え、 2分間を解離相とした。解離相終了後、 10 1の 10mM Glycine (pH2. 2) , 及び の 0. 05 % SDSを連続してインジェクトすることにより、 センサ一チップ を再生した。
この操作により得られたセンサーグラムを重ね書きし、 BIAevaluat ion (ver. 3. 0)にて結合速度定数 （ka) 、 解離速度定数 （kd) 、 解離定数 （KD) 、 最大結合 量 （Rmax) を算出した。 結果
〔リコンビナン卜 GPC3の作製〕
抗 GPC3抗体作製のための材料として、 C末端側の疎水性領域を欠損させた可溶型 GPC3蛋白質を作製した。 CH0細胞に可溶型 GPC3発現プラスミド DNAを導入し定常発 現株を構築した。培養上清をインイオン交換カラムで粗精製、 濃縮した後、 C末端 側に付加した Flagタグを利用したァフィ二ティー精製を行った。 SDSポリアクリル アミドゲル電気泳動の結果、 50〜300kDaのスメァなバンドと、約 40kDaのバンドが 得られた。 GPC3は 69kDaの C末端にへパラン硫酸付加配列を有するプロテオグリカ ンである。スメァなバンドはへパラン硫酸修飾を受けた GPC 3であると考えられた。 約 40kDaのバンドはアミノ酸シークェンスの結果、 GPC3の N末端側断片を起点とし ており、 GPC3は何らかの切断を受けていることが予想された。
ハイプリドーマのスクリーニングにおいてへパラン硫酸に対する抗体を排除す るため、 へパラン硫酸付加シグナル配列である 495番目と 509番目の Serを Alaに置 換させた可溶型 GPC3コア蛋白質を作製した。同様に CH0高発現株を構築し、培養上 清より Hisタグを利用したァフィ二ティー精製を行った。 SDSポリアクリルアミド ゲル電気泳動の結果、 70kDa、 40kDa、 30kDaの 3つのバンドが得られた。 アミノ酸 シークェンスの結果、 30kDaのバンドは GPC3の C末端側断片であることが判明し、 GPC3は 358番目のアルギニンと 359番目のセリンの間で何らかの酵素的な切断を受 けていることが示された。へパラン硫酸付加型 GPC3でこの 30kDaのバンドが見られ なかったのは、 へパラン硫酸が付加しているためスメァなバンドになっていたた めと思われる。 GPC3が特定のアミノ酸配列で酵素的な切断を受けることは新しい 知見であり、 生物学的意義に関しては明らかにされていない。
〔抗 GPC3抗体の作製〕
ハイプリドーマ法により抗 GPC3抗体を作製した。 免疫原としては、 精製へパラ ン硫酸付加可溶型 GPC3を用いた。 血清中の GPC3に対する抗体価が飽和しているの を確認後、 マウスミエローマ細胞 Πϋΐとマウス脾臓細胞の細胞融合を行った。 Balb/c マウス （No. 2) 、 MRL/lpr マウス （No. 6) 、 各一匹ずつについてフユ一ジ ョンを行い、 GPC 3コア蛋白質を抗原とした ELISAスクリーニングにより Balb/cマ ウス、 MRL/lprマウス合わせて 180個の陽性ゥエルを選択した。その結果、 0D値 0. 2 以上を示すクローン数は MRL/lprマウス由来が 652ゥエル、 Balb/cマウス由来が 16 ゥエルであり、 MRL/lprマウスの方が Balb/cマウスよりも 0D値の高い （0. 2以上） クローンが約 40倍も多く得られた。 MRL/lprマウス間での一次スクリーニング結果 の比較を、 度数 （頻度） 分布表として図 2に示す。
一次スクリーニング後、 180の陽性ゥエルを 24ゥエルプレートに拡大した後、限 界希釈法（1陽性ゥエルにつき 96ゥエル 1 プレートに播きこむ）によりクローニン グを行った。 最終的に、 抗体を安定に産性する 47クローンを樹立した。
〔抗 GPC3抗体のアイソタイプ解析〕
樹立した抗グリピカン 3抗体 47クローンについてアイソタイプ解析をしたとこ ろ、 Balb/c由来の抗体が IgGl、 IgG2a、 IgG2bの 3タイプのみであるのに対し、 MRL/lpr由来の抗体には IgGl、 IgG2a、 IgG2b、 IgG3という全ての IgGサブクラスと さらに IgMも含まれていた。樹立した 47クローンについてのアイソタイプの内分を 図 3に示す。
以上のことから、 Balb/cマウスよりも MRL/lprマウスを用いることでバラエティ 一に富んだアイソ夕ィプを取得できることが明らかとなりその有用性が示された さらに、 IgG3及び IgMなど一般的に出現頻度の低いアイソタイプも取得できること から、 CDC活性を有する抗体取得を目的とした場合にも MRL/lprマウスを用いた抗 体作製が有用であることが示された。
〔BIAC0REによる抗 GPC3抗体の速度論的解析〕
Balb/cマウス由来 10クローン、 MRL/lprマウス由来 28クローンの精製抗体を用い て BIAC0REによる速度論的解析を行なった。速度論的解析結果を図 4に示す。 Balb/c マウス由来抗体に比べて MRL/lprマウス由来抗体の方が親和性の高い抗体がより 多く含まれていた。 Balb/cマウス由来抗体では最も親和性の高いものでの解離定 数が 10—8Mオーダ一であるのに対し、 MRL/lprマウス由来抗体には 10— lflMオーダーの 解離定数を持つ高親和性抗体が 4種類 （IgGlタイプと IgG2bタイプがそれぞれ 2種 類）含まれていた。 以上のように、 MRL/lprマウスからの方が Balb/cマウスよりも 約 100倍親和性の高い抗体が得られたことから、 MRl/lprマウスを用いた抗体作製 の有用性が示された。 考察および結論
GPC3はマウスとヒトでァミノ酸レベルで 94%という極めて高い相同性を示すこ とから通常の Balb/cマウス等への免疫では抗体を得難い可能性がある。 一方、 自 己免疫疾患モデルである MRL/lprマウスは Fasリガンドの機能が欠損していること から自己抗体産生 B細胞のァポプトーシスが誘導されず免疫寛容を打破する機構 が働いているものと思われる。従って、 MRL/lprマウス等の自己免疫疾患モデルマ ウスを用いれば、 マウスと他の種で蛋白相同性の低い抗原はもちろんのこと、 マ ウス抗原や GPC3のようにマウスとヒトでアミノ酸レベルで非常に高い相同性を有 する抗原に対しても効率良く抗体を作製できる可能性がある。
今回の検討により、 MRL/lprマウスでは Balb/cマウスに比較して 0D値の高い陽性 ゥエルが約 4 0倍得られること、アイソタイプもバラエティーに富んでいること、 抗体の抗原親和性も約 100倍高いことを見出した。 産業上の有用性
以上の結果から、 マウスと他の種で蛋白相同性の低い抗原はもちろんのこと、 マウス抗原や GPC3のようにマウスとヒ卜でアミノ酸レベルで非常に高い相同性を 有する抗原に対する抗体を取得するために、 MRL/lprマウスに免疫して抗体を作製 することは非常に有効であると考えられる。 本明細書に引用されたすベての刊行物は、その内容の全体を本明細書に取り 込むものとする。 また、 添付の請求の範囲に記載される技術思想および発明の 範囲を逸脱しない範囲内で本発明の種々の変形および変更が可能であること は当業者には容易に理解されるであろう。本発明はこのような変形および変更 をも包含することを意図している。

Claims

請求の範囲
1 . 自己免疫疾患を発症する非ヒト動物をダリビカンタンパク質で免疫するこ とを含むダリピカンタンパク質に対する抗体の作製方法。
2 . 自己抗体産生非ヒト動物をダリピカンタンパク質で免疫することを含むグ リビカンタンパク質に対する抗体の作製方法。
3 . 自己免疫疾患を発症する非ヒト動物又は自己抗体産生非ヒト動物が、 Fas 機能欠損非ヒト動物である請求項 1または 2に記載のダリビカンタンパク質に対 する抗体の作製方法。
4 . 非ヒ卜動物がマウスである請求項 3記載のダリピカンタンパク質に対する 抗体の作製方法。
5 . マウスが MRL/lprマウスである請求項 4記載のダリピカンタンパク質に対す る抗体の作製方法。
6 . グリピカンタンパク質がグリピカン 3である請求項 1から 5のいずれか 1 項に記載のグリピカンタンパク質に対する抗体の作製方法。
7 . Fas機能欠損非ヒト動物を抗原で免疫することを特徴とする抗体の作製方法
8 . 非ヒト動物がマウスである請求項 7記載の抗体の作製方法。
9 . マウスが MRL/lprマウスである請求項 8記載の抗体の作製方法。
1 0 . 抗原となるタンパク質が、 ヒトとマウスで高いアミノ酸配列の相同性を 有している、 請求項 7から 9のいずれか 1項記載の抗体の作製方法。
1 1. アミノ酸配列の相同性が 90 %以上である、 請求項 1 0記載の抗体の作 製方法。
12. アミノ酸配列の相同性が 94%以上である請求項 1 1記載の抗体の作製 方法。
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