WO2004009065A1

WO2004009065A1 - 紅豆杉由来リグナン類を含む血糖降下剤、肝臓保護薬、抗ガン剤

Info

Publication number: WO2004009065A1
Application number: PCT/JP2003/009370
Authority: WO
Inventors: Shigetoshi Kadota; Takahiro Nobukawa
Original assignee: Kotosugi Inc.
Priority date: 2002-07-24
Filing date: 2003-07-23
Publication date: 2004-01-29
Also published as: CN100350902C; HK1075213A1; KR100639273B1; CN1665493A; AU2003248097A1; US20080146659A1; US20060035964A1; KR20060086458A; JP4290119B2; JPWO2004009065A1; KR20050025641A; KR100625138B1

Abstract

　　紅豆杉に含まれるリグナン類である、タキシレシノール(Taxiresinol)、ヒドロキシラリシレシノール((7'R)-7'-Hydroxylariciresinol)、セコイソラリシレシノール(Secoisolariciresinol)、イソタキシレシノール(Isotaxiresinol)を有効成分とする医薬である。また、紅豆杉の植物体を水で抽出し、得られた水抽出物を有機溶媒により抽出して得られる抽出物を有効成分とする医薬である。これらは、特に、血糖降下剤、肝臓保護薬、抗ガン剤として有用である。

Description

紅豆杉由来リグナン類を含む血糖降下剤、肝臓保護薬、抗ガン剤

技術分野

本発明は、リグナン類化合物を含む医薬、特に血糖降下剤、肝臓保護薬、抗ガン剤に関するものである。

明

1

背景技術

真性糖尿病は炭化水素、脂質、及びタンパク質の代謝障害である。世界中の約 1 0 % の人々が真性糖尿病を発症しているとの報告もある。糖尿病に対して、ィンシュリンゃ様々な副作用を伴ういくつかの血糖降下剤を除いてほかに有効な薬剤は依然として現れていない。

また、肝臓は自然治癒力が強く少々の障害では表立った症状が表れないことから「沈 '黙の臓器」とも呼ばれ、物質代謝、血糖の調節、解毒、胆汁循環の調節、栄養素の貯蔵等、人の生命の維持に不可欠な機能を担っている。肝機能障害の病因、病態は多種多様であるが、治療薬の開発が最も求められているのは医療ニーズの高い慢性活動性肝炎である。本疾患を標的として肝保護薬をはじめ原因療法としての抗ウィルス剤や免疫調節薬など治療薬の研究が行われている。

さらに、抗ガン剤は現在約 6 0知られていて、約 4 0が臨床に使用されている。にもかかわらず、ガンは人の死亡原因の上位にあり、新たな医薬の開発が待たれている。一方、中国雲南省の高山地帯などに生息している常緑樹木である紅豆杉（学名 Taxus yunnanensis) は、消炎、利尿、血圧降下、血中脂質減少などに効果のある薬用植物として知られている。また、紅豆杉の植物体には抗ガン剤であるパクリ夕キセル（タキソール）が含まれていることが確認されている。

このような薬効に着目して、特開平 10-120582には紅豆杉の幹部を粉砕した樹木茶が開示されている。また、特開 2000- 236835、特開 2000-236836には、紅豆杉の幹の粉砕物と、特定の薬用植物を混合した食品が開示されている。

そして、中国政府が、近年、日本とアメリカ合衆国向けに、限定的な紅豆杉の輸出を許可したこともあり、紅豆杉の成分と薬理作用の研究が進みつつある。

本発明の目的は、紅豆杉に含まれる成分について未知の生物活性を見出し、当該活性に基づく当該成分の新規医薬用途を提供することである。また、本発明の目的は、紅豆杉の抽出画分についでの新規医薬用途を提供することである.。発明の開示

本発明の発明者は、紅豆杉に含まれるリグナン類化合物が、インビトロ ·ィンビボにおいて生物活性を示すことを見出し、本発明を完成した。

すなわち本発明は、式（1 )

(式中 R ¹は水素または水酸基、 R ²は炭素数 1〜4のアルキルォキシ基または水酸基、 R ³は炭素数 1〜 4のアルキルォキシ基を表す）

で示される化合物、または式（1 )化合物の医学的に許容される塩またはエステルを有効成分とする医薬である。

また、本発明は、式（2 )

(式中 R ⁴、 R ⁵は炭素数 1〜 4のアルキルォキシ基を表す）

で示される化合物、または式（2 )化合物の医学的に許容される塩またはエステルを有効成分とする医薬である。

さらに、本発明は、式（3 )

( 3 )

(式中 R ⁶は炭素数 1〜 4のアルキルォキシ基を表す）

で示される化合物、または式（3 )化合物の医学的に許容される塩またはエステルを有効成分とする医薬である。

本発明の 1の実施態様において、請求の範囲第 1項記載の医薬は、血糖降下剤、肝臓保護薬または抗ガン剤であることを特徴とする。

本発明の他の実施態様において、請求の範囲第 2項記載の医薬は、血糖降下剤、肝臓保護薬または抗ガン剤であることを特徴とする。

本発明の更なる他の実施態様において、請求の範囲第 3項記載の医薬は、血糖降下剤、肝臓保護薬または抗ガン剤であることを特徴とする。

本発明においてエステルとは、式（1 ) 、式（2 ) 、式（3 ) 中のメチロール基 ( C H ₂ O H) の水酸基が有機酸または無機酸と結合し、水分子が脱離した化合物を意味する。式（2 )、式（3 ) の化合物においては、一分子中にメチロール基が 2つあり、その一方のみがエステル化されてもよく、また、両者がエステル化されてもよい。医学的に許容されるエステルは、医学 '薬学の分野で公知のものが制限なく使用できる。例えば、有機酸として酢酸、無機酸としてリン酸が使用できる。

塩は、無機及び有機の塩基から誘導されるいかなる塩でもよく、化合物中のフヱノ一ル基がフエノキシドイオン（phenoxide ion)基となる塩及び/またはメチロール基がメチ Dキシドイオン（methyloxide ion)基となる塩を含む。医学的に許容される塩は、医学-薬学の分野で公知のものが制限なく使用できる。例えば、アルカリ金属、アルカリ土類金属、ァミンの塩が使用出来る。

さらに本発明は、紅豆杉の植物体を水で抽出し、得られた水抽出物を有機溶媒により抽出して得られる抽出物を有効成分とする医薬である。

本発明の好ましい実施態様にあっては、請求の範囲第 7項記載の医薬は、血糖降下剤、肝臓保護薬または抗ガン剤であることを特徴とする。 · '

本発明において血糖値降下剤とは、糖尿病の治療 '予防に用いる薬剤を、また、肝臓保護薬とは、肝臓機能の回復、保全に用いる薬剤き、さらに、抗ガン剤とは、ガンの治療 ·予防 ·再発防止に用いる薬剤を意味する。

式（1).の化合物において、 R¹が H、 R²が OH、 R³が CH₃0であるとき、すなわち式（4) .

の化合物は夕キシレシノール（Taxiresinol) (以下 TAXという）である。

式（1) の化合物において、： ¹が OH、 R²が CH₃0、 R³が CH₃0であるとき- すなわち式 (5)

の化合物は（7， R) -7，-ヒドロキシラリシレシノール

((7' R)-7' -Hydroxylariciresinol) (以下 HYLという）である, 式（2) の化合物において、 R⁴が CH₃〇、 R⁵が CH₃0であるとき、すなわち式 (6)

の化合物はセコイソラリシレシノール（Secoisolariciresinol) (以下 S I Lと記す）である。

式（3) の化合物において、 R⁶が CH₃0であるとき、すなわち式（7)

の化合物はイソ夕キシレシノール（Isotaxiresinol) (以下 ITXと記す）である。

TAX, HYL、 SIL、 I TXは紅豆杉の植物体（葉、樹皮、材部、芯部、根など）に含まれており、次のようにして抽出、単離することができる。まず、植物体を熱水抽出し水抽出物を得る。次に、その水抽出物を有機溶媒（例えば酢酸ェチル）で抽出し有機溶媒画分を得る。さらに、その有機溶媒画分からクロマトグラフィー（カラムクロマトグラフィ一、薄層クロマトグラフィー、 HPLCなど）を用いてこれら化合物を単離する。

さらに、これら化合物から有機合成により、式（1)、式（2)、式（3) の化合物を合成することが出来る。

TAXのメトキシ基（CH₃0)は、エトキシ基（C₂H₅〇）、プロピオキシ基 (C ₃ H ₇0 ) 、プチ口キシ基（C ₄ H ₉0 ) に置換されても良い。 H Y Lの 2つのメトキシ基は、各々がエトキシ基、プロピオキシ基、プチロキシ基に置換されても良く、また、 2つのアルキルォキシ基は同一でも良く、異なっていても良い。 S I Lの 2つのメトキシ基は、各々がェトキシ基、プロピオキシ基、プチロキシ基に置換されても良く、また、 2つのアルキルォキシ基は同一でも良く、異なっていても良い。 I T Xのメトキシ基は、エトキシ基、プロピオキシ基、プチロキシ基に置換されても良い。 ·

本発明にかかる紅豆杉の水抽出物の有機溶媒抽出物を得るには、まず、紅豆杉の植物体（葉、樹皮、材部、芯部、根など）を水で抽出し水抽出液を得る。植物体として材部と樹皮（あわせて木部という）を使用することが好ましい。水抽出は、熱水抽出とする. ことが好ましい。抽出操作のより具体的な一実施態様は、例えば、植物体粉砕物と、当該粉砕物の約 2倍から 2 0倍量の純水を混合 (植物体粉砕物 1 k gに対し純水 2 Lから. 2 0 L ) し、室温又は加熱下、好ましくは加熱下、より好ましくは 1 0 0 °Cで、 1分〜 2時間、好ましくは 2 0分〜 1時間抽出し、濾過または遠心分離により、上清を回収する方法が挙げられる。

次に、その水抽出液を有機溶媒で抽出し有機溶媒抽出液を得る。抽出前に水抽出液を減圧濃縮などにより減容してもよい。また、水抽出液に無機塩を溶解させた後に、有機溶媒で抽出してもよい。有機溶媒としては、水溶液から化合物を抽出する場合に、通常用いられる有機溶媒を使用することが出来、例えば、酢酸ェチル、アルコール類、エーテル類、脂肪族炭化水素類、芳香族炭化水素類（ベンゼン、トルエンなど）、ピリジンなどが使用できる。好ましい有機溶媒は極性を有するものであり、例えば分子内に酸素原子、窒素原子を有する有機溶媒であり、もっとも好ましくは酢酸ェチル、ジェチルェ —テルである。続いて、定法に従い、有機溶媒抽出液から有機溶媒を除去し、有機溶媒抽出物を得る。

本発明にかかる医薬は経口、非経口、又は経皮投与することができる。投与形態は、通常医薬の投与に用いられる形態が制限なく使用可能であり、例えば錠剤もしくは被覆錠、カプセル、溶液、シロップ、粉末、座薬が挙げられる。

錠剤は化合物または抽出物を、賦形剤（乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニットなど）、崩壊剤（コーンスターチ、アルギン酸など）、結合剤（スターチ、ゼラチンなど）、滑沢剤（ステアリン酸マグネシウム、タルクなど）および/または遅延放出を与える剤（力ルボキシメチルセルロース、セルロースアセテートフタレート、ポリビニルアルコールなど）を混合することにより製造できる。錠剤はいくつかの層からなっていてもよい。被覆錠は錠剤と同様にして製造した芯を錠剤被覆に通常用いられる物質、例えばコリドン（collidone)、シエラヅ.ク（shellac)、アラビアゴム、 'タルク、二酸化チタン、ショ糖などで被覆することにより製造できる。遅延放出を得るべく芯はいくつかの層からなつていてもよく、また錠剤についての上記賦形剤を用レ、ることができる。

液剤、シロヅプの剤型にするには、リグナン類化合物に、水、糖類（エリスリトール、キシリトール、マンニトール、ショ糖、トレハロース、マルトース、フラクト一ス、ソルビヅト、蜂蜜など）、 P方腐剤 (パラベンなど) 、各種香料、着色料、油類（大豆油など）を適宜添加、混合して調製することができる。： . 本発明にかかる医薬を含有するカプセルは、化合物または抽出物をゼラチンカプセルに封入し、または、化合物または抽出物と例えばラクトース、ソルビトールなどの不活性担体を混合し、混合物をゼラチン力プセルに封入、'またはゼラチン膜で被包成形して製造することができる。

本発明に係る化合物または抽出物の投与量は、通常、 1 m g〜 1 0 0 O m g/人ノ日である。しかしながら、最初に少量を投与し、次いで、意図した効果が達成されるまで増量することにより、適当な投与量を決定することも意図されている。

本リグナン類は、従来から安全に摂取されている薬用植物である紅豆杉の成分であり、安全な物質である。

本発明により様々な疾病治療や健康増進に有用な新規な医薬を得ることができる。特に、血糖降下剤、肝臓保護薬または抗ガン剤として有用な医薬を得ることができる。図面の簡単な説明

第 1図は、紅豆杉木部からの成分の抽出 ·分画過程の説明図である。

第 2図は、ラットを用いた S I Lの血糖値降下作用の試験結果を示すグラフであり、第 3図は、ラツトを用いた I TXの血糖値降下作用の試験結果を示すグラフである。第 4図は、 TAX、 HYL投与マウス血清中のアミノ基転移酵素量の測定結果を示すグラフであり、第 5図は、 S IL、 I TX投与マウス血清中のアミノ基転移酵素量の測定結果を示すグラフであり、第 6図は、酢酸ェチル可溶画分投与マウス血清中のアミノ基転移酵素量の測定結果を示すグラフである。

第 7図は、 TAX、 HYL投与マウス血清中の TNF - の測定結果を示すグラフであり、第 8図は、 SIL、 I TX投与マウス血清中の TNF-ひの測定結果を示すグラフである。

第 9図は、培養肝細胞死に対する、 TAX、 HYLの抑制活性測定結果を示すグラフであり、第 10図は、培養肝細胞死に対する S I L、 I TXの抑制活性測定結果を示すグラフである。

(符号の説明）

TAX タキシレシノール (Taxiresinol)

HYL (7，R)- 7，-ヒドロキシラリシレシノール（（7， R)- 7， - Hydroxylariciresinol) S I L セコイソラリシレシノーノレ (Secoisolariciresinol)

I TX ィソ夕キシレシノール（Isotaxiresinol)

SI シリマリン（Silymarin) 発明を実施するための最良の形態

以下に実施例により本発明をさらに説明する。この発明の実施例に記載されている原材料、化合物の抽出法などは、この発明の範囲をそれらのみに限定する趣旨のものではなく、単なる説明例にすぎない。 (単離）

紅豆杉の材部及び樹皮（合わせて木部）を粉碎機で粉砕し、 30メッシュパスの粉末を得た。この粉末を乾燥した。乾燥粉末 850gを 4Lの純水で 45分間還流抽出した。濾過後、残渣に 4Lの純水を加えて 45分間還流抽出した。さらに同じ還流抽出操作を 1 回繰り返した。 3回の水抽出液を合わせて減圧濃縮し、水抽出物 52. 5gを得た。 . 次に、水抽出物 52.5 gを 500mLの酢酸ェチルで抽出し、酢酸ェチル層を分離した。分離後、残渣に 500niLの酢酸ェチルを加えて抽出した。さらに同じ抽出操作を 1回繰り返した。 3回の抽出操作で得た酢酸ェチル層を合わせて減圧濃縮し、酢酸ェチル画分 3 4. lgを得た。

続いて、シリカゲルカラム（内径 3.5cm、長さ 60ϋηΐ、充填物 : Silica gel 60 (ナカライテスク株式会社）に前記酢酸ェチル画分 34. lgを添加し、クロ口ホルムにメタノールを添加した溶媒を使用して、溶出操作を行い 500mL毎の 9画分を得た。溶媒の組成と、各画分液体を減圧濃縮して得た流出物の重量、画分中に含まれる成分を表 1に示した。

紅豆钐水抽出物の酢酸ェチル可溶画分の力ラムクロマトグラフィー

(氺 1) 溶媒はクロ口ホルムとメタノールの混合液であし人

表中の値はメタノールの混合百分率を示す

(氺 2) 1%:100mL 2%:100mL 3%:100mL 4%:100mL 5%:100mL

による溶出物を混合した画分

(氺 3) 12%: 100mし 1^:100mし 16¾:100mL 18 : 100mし 20¾:100mL

による溶出物を混合した画分第 5画分の溶出溶液を減圧濃縮後に、結晶化した S I L (84 Omg)を得た。続いて、その残渣を分取薄層クロマトグラフィーにより分離した。薄層板は Kieselgel60F 25 厚さ 0.5醒（メルク社）を使用し、展開溶媒はメタノール：クロ口ホルム/ 10 ： 90溶液を使用した。 Rf値は、 TAX: 0. 25、 HYL : 0. 21であった。また、同条件で S I Lの値は 0. 36であった。分取の結果、 TAX (38.. 9mg) 、 HYL (10. 2mg) を得た。

TAX、 HYLく Sェ L、 I TXの構造式は、分光学的および化学的な分析に基づき、決定、確認した。以下に、主要な分析デ一夕を記述する。

TAX(Taxiresinol)：淡褐色無定形固体（light brown amorphous solid)

¾ NMR (CD₃0D) δ 6.76 (IH, d, J= 2.0， Hz, H-2), 6.76 (1H， d, J= 2.0 Hz, H - 2， )， 6.71 (IH, d, J= 8.0 Hz, H-5)， 6.69 (IH, d, J: 8.0 Hz, H 5，）， 6.63 (IH, dd, J = 2.0, 8.0 Hz, H-6' )， 6.61 (IH, dd, J= 2.0, 8.0 Hz, H-6), 4.66 (IH, d, J = 6.9 Hz, H-7' ), 3.93 (IH, dd, J= 6.4, 8.3 Hz, H-9，）, 3.80 (3H, s， H-0Me), 3.78 (IH, dd, J: 8.0, 10.5 Hz, H-9' ), 3.68 (IH, dd, J= 5.9, 8.3 Hz, H-9， ), 3.60 (IH, dd, J=6.4, 10.5 Hz, H-9' )， 2.90 (IH, dd, J=4.6， 13.4 Hz.， H-7), 2.70 (IH, m, H- 8)， 2.45 (1H， dd, J : 11.5, 13.4 Hz, H-7), 2.35 (IH, m, H-8，）;

1³C腿 (CD₃0D) 5 148.9 (C-3，）， 146.3 (C-3), 145.7 (C-4' ), 145.7 (C-4), 135.8 (C - 1，）， 133.5 (C-1), 122.1 (C-6), 118.6 (C- 6，）， 116.1 (C-5), 116.1 (C - 5，）， 114.1 (C-2，）， 113.4 (C-2), 83.9 (C- 7，）， 73.4 (C-9), 60.4 (C-9，）， 56.3 (C-OMe), 54.0 (C-8， )， 43.8 (C-8), 33.6 (C-7).

[a] _D ²⁵+23.0^o (c=0.32 in Ethanol)

H Y L ( (7' R)-7' -Hydroxylariciresinol )：無色無定形固体（colorless amorphous solid)

¾ NMR (CD3OD) δ 6.91 (IH, d, J= 2.0 Hz, H-2), 6.86 (IH, 2, H- 2，）， 6.79 (IH, dd, J= 8.0, 2.0 Hz, H-6), 6.74 (IH, d， J= 8.0 Hz, H- 5)， 6.73 (2H, m, H-5' and H-6'), 4.61 (IH, d， J: 7.3 Hz, H-7), 4.47 (IH, d， J= 8.6 Hz, H-7'), 4.23 (IH, dd, J= 9.0, 4.4 Hz, H-9' ), 3.93 (1H， dd, J= 9.0， 7.8 Hz, H— 9，）， 3.84 (3H， s， H-OMe), 3.82 (3H, s， H-OMe), 3.21 (1H, dd, J: 10.9, 5.9 Hz, H - 9)， 3.30 (1H， dd, J= 10.9, 4.6 Hz, H-9), 2.54 (1H, m, H-8，）, 1.88 (1H, , H - 8);

1³C職 (CD₃OD) δ 148.9 (C - 3)， 148.9 (C-3, ), 147.1 (C-4), 147.1 (C-4，）， 136.1 (C~l，）， 134.7 (C - 1)， 120.7 (C- 6， ), 120.2 (C-6), 115.9 (C-5' ), 115.9 (C-5), 111.5 (C-2' ), 111.0 (C - 2)， 85.0 (C-7), 76.6 (C-7' ), 71.4 (C-9' )， 62.2 (C-9), 56.4 (C-OMe), 56.3 (C-OMe), 53.3 (C- 8)， 50.7 (C- 8，）.

[ひ] _D ²⁵+4.6° (c=0.18 in Methanol)

S I L (Secoisolariciresinol) ：無色結晶 (colorless crystal )

¾讓 (CD₃0D), δ 6.66 (2H, d， J = 8.0 Hz, H - 5), .6.58 (2H, d, J = 2.0 Hz, H-2), 6.53 (2H， dd, J = 2.0， 8.0 Hz, H-6), 3.71 (3H， s， H-OMe); 3.53 (4H, d， J - 4.3 Hz, H-9), 2.56 (2H, dd, J = 7.3, 13.7 Hz, H-7), 2.52 (2H, dd, J = 7.7, 13.7 Hz, H - 7)， 1.8 8 (2H, m, H-8)；

¹³C NMR (CD₃0D) δ 148.6 (C-3), 145.3 (C-4), 133.7 (C - 1), 122.6 (C-6), 113.3 (C - 2)， 115.7 (C-5), 61.9 (C-9), 56.1 (C-OMe), 44.0 (C - 8), 36.0 (C-7)

[a] _D ^z5-32.0° (c=0.1 in Acetone)

I TX (Isotaxiresinol) ：無色無定形固体 (colorless amorphous solid)

¾賺 (CD₃0D), δ 6.69 (1H, d, J = 8.0 Hz, H- 5， ), 6.61 (1H, s， H - 5), 6.52 (1H， d， J = 2.0 Hz, H-2' )， 6.50 (1H, dd, J二 2.0, 8.0 Hz, H-6' )， 6.19 (1H, s， H-2), 4.67 (2H， m, H-9), 4.67 (1H， m， H-9' ), 4.66 (1H， d， J = 6.9 Hz, H-7⁵ ), 3.77 (3H, s， H-OMe), 3.40 (1H， dd, J = 4.3, 11.1 Hz, H-9⁵ ), 2.73 (1H， br d, J = 6.8 Hz, H-7), 1.97 (1H, m, H-8), 1.71 (1H, m, H-8' )

¹³C NMR (CD₃0D) δ 147.1 (C-3), 146.2 (C- 3，）， 145.2 (C-4), 144.6 (C- 4，）， 138.7 (C - 1， )， 134.3 (C-l), 128.9 (C-6), 122.0 (C-6' )， 117.4 (C-2), 117.3 (C-2， )， 116.1 (C-5，）， 112.3 (C-5), 66.0 (C-9), 62.4 (C-9'), 56.4 (C-OMe), 48.1 (C-8，）， 47.8 (C-7，）， 40.1 (C- 8)， 33.5 (C-7) [a] _D ²⁵+47.3° (c=0.4 in Ethanol) 決定した TAX、 S I Lの構造式は、 Mujumdar， R.B.; Srinivasan, R. &

Venkataraman, K. , Taxiresinol, A New Lignan in the Heartwood of Taxus baccata; Indian J. Chem. , 40, 677-680(1972) に記載された構造式と一致した。 HYLの構造 '式は、 Barrero, A.F, Ha i dour, A.； Dorado, M.M.； Gravalos, D. & Quesada, T.6. , Lignans from the wood of Abies pinsapo; J. Nat. Prod.., 57, 713-719(1994) に記載された構造式と一致した。 I TXの構造式は、 King, F.E.; L.Jurd & King, T.J., isoTaxiresinol (3' -Dimethylisolariciresinol), A New Lignan extracted from the Heartwood of the English Yew, Taxus baccata; J. Chem. Soc. , 17-24(1952) に記載された構造式と一致した。

(抽出 ·分画）

第 1図を参照して、紅豆杉木部からの成分の抽出 ·分画操作を説明する。

紅豆杉の乾燥木部粉末（30メッシュパス） 850gを 4Lの水で 45分間還流抽出した。濾過後、残渣に 4Lの水を加えて 45分間還流抽出した。さらに同じ還流抽出操作を 1 回繰り返した。 3回の水抽出液を合わせて減圧濃縮し、水抽出物 52. 5 gを得た。次に、水抽出物 52. 5 gを 500mLの酢酸ェチルで抽出し酢酸ェチル層を分離した。分離後、残渣に 500mLの酢酸ェチルを加えて抽出した。さらに同じ抽出操作を 1回繰り返した。 3回の抽出操作で得た酢酸ェチル層を合わせて減圧濃縮し、酢酸ェチル画分 3 4. 1 gを得た。

残渣である水溶液を減圧濃縮し、酢酸ェチル不溶画分 16. l gを得た。

前記水抽出物を抽出後の残渣（木部粉末）に、メタノールと水（1対1) の混合液

4L を加え 45分間還流抽出した。濾過後、同じの還流抽出操作を 2回繰り返した。 3 回の抽出液を合わせて減圧濃縮し、メタノール/水抽出物 32. 3 gを得た。

続いて、残渣（木部粉末）にメタノール 4L を加え 45分間還流抽出した。濾過後、同じの還流抽出操作を 2回繰り返した。 3回の抽出液を合わせて減圧濃縮し、メタノール抽出物 7. 2 gを得た。

(試験例 1一血糖値降下活性）

ラットを用いて、リグナン類化合物と紅豆杉画分の血糖値降下活性を試験した。血中グルコース濃度は、採血した全血を血球分離し血清を用いて測定した。.試薬はグルコース C I I—テストヮコー（和光純薬工業株式会社）を使用し、吸光度測定には U V- 16 OA (株式会社島津製作所）を使用した。 ' · .

5— 6週齢、体重 180— 200 gの雄性ウィスターラヅトを 16時間絶食した後、ストレブトゾシン（以下 STZと記す）（55mg/kg (ラヅトの体重） ) のクェン酸緩衝液 (pH4.2)を腹腔内に注射した。 STZを注射した後、 5日後に尾静脈より採血し血中グルコース濃度を測定した。そして、血中グルコース濃度が 250mg/dL以上のラヅトを糖尿ラットとして試験に用いた。

糖尿ラヅトに化合物または画分を 100mg/kg (ラヅトの体重）の量で、 12時間間隔で 5回注射により腹腔内投与し、その後尾静脈より採血し血中グルコース濃度を測定した。試験は 4匹のラットを 1群として行い、測定値の平均値と標準偏差を算出した。'ネガティブコントロール（対照）として生理食塩水を投与した群を設けた。ポジティブコントロールとして、前記糖尿ラヅトにトリブ夕マイド（tolbutamide)200mg/kg (ラヅトの体重）とプホルミン（buformin)lmg/kg (ラヅトの体重）の混合物を同様に腹腔内投与した群を設けた。

S I Lの試験結果を図 2に示す。各グラフは平均値と標準偏差の値を表示し、また、 *印は、スチューデントの t検定（Student' st- test)の結果、 *p<0. 05 **p <0. 01で Control群との間の有意差があることを示す。グラフの表示と t検定結果の表示は、第 3図〜第 10図についても同様である。

S I Lは血糖値を 33. 4%減少した。これは血糖値を 24. 0 %減少した陽性コントロールと同等の効果であった。

I TXの試験結果を図 3に示す。 I TXは血糖値を 23. 6%減少した。これは血糖値を 24 %減少した陽性コントロールと同等の効果であった。 4

TAXおよび紅豆杉画分の試験結果を表 2に示す。

表 2

S i秀発糖尿ラトに対する TAXと紅豆 ίき画分の血糖降下作用

TAXは血糖値を 20. 9%減少した。これは血糖値を 24%減少した腸性コント口 —ルと同等の効果であった。

また、酢酸ェチル可溶画分は、血糖値を 12. 1%減少した。

(試験例 2—肝臓保護活性）

リグナン類化合物及び紅豆杉画分の肝障害に対する予防、治療活性を以下の方法により試験した。

(D—ガラクトサミン（D- galactosamine：以下 D- GalNと略す） /リポポリサヅカライド（Lipopolysaccharide：以下 LPSと略す）誘発肝障害モデル（J. Wang et al., Biochem. Pharm. , 39, 267(1990)、 A. Wendel et al., Biochem. Pharm. , 35, 2115 (1986) ) による評価）

12時間絶食した ddY系雄性マウス（6週齢）の腹腔内に D-GalN(700mg/kg)/ LPS(10〃g/kg)を注射して肝障害を惹起した。被検薬は D-GalN/LPSを注射する前の 1 2時間及び 1時間前に計 2回皮下投与した。 2群の被検薬投与群を設け、 1群は被検薬投与量 50mg/k_g (マウス体重）とし、他群は被検薬投与量 10mg/k_g (マウス体重）とした。対照群（Control) には生理食塩水を同様に投与した。また、薬効比較のために既存の肝臓保護薬であるシリマリン（silymarin)投与群（皮下投与： 100mg/kg)を設けた。 D-GalN/LPS注射の 9 0分後に血中の腫瘍壊死因子 (tumor necrosis factor alpha) ( 以下 TNF-ひと略す）の値を測定した。また、 8時間後に血中のアミノ基転移酵素 (6PT(glutamic yruvic transaminase； GOT(glutamic oxaloacetic transaminase)) の値を測定した。

TNF- αは TNF-ひ抗体（anti- mouse TNF-ひ antibody)(Endogen, Inc.， USA)を用いる E L I S A法によつて測定しだ。 GPT、 GOTは Transaminase CI I -Test kit (和光純薬ェ業株式会社）を用いて測定した。

本障害モデルにおいて誘発される肝障害機構は、免疫担当細胞の活性化、肝組織への浸潤、ロイコトリェン D 4や TNF-ひ等のォ一夕コイド、サイト力インの分泌、肝細胞のアポト一シスなど一連の過程を経由するため、免疫学的肝障害発生のモデルとして臨床成績との相関性が高いと考えられる。 .

ァミノ基転移酵素量の測定結果を第 4図と第 5図に示す。グラフの縦軸は血清中のァミノ基転移酵素量を IU/Lで示す。 Normalは D- GalN/LPS非処理群を表す。 Controlは生理食塩水を投与した群を表す。 T AX 5 0〜I T X 1 0はリグナン類の化合物名と投与量を表す。 S Iはシリマリン投与群を表す。 Normal 群のマウス個体数は 3であり、その他の実験群のマウス個体数は 6である。

T AX, HY L、 S I L、 I T Xは、 1 Omg/kgと 5 Omg/kgの投与量で、血清中 GPT と GOT上昇を抑制し、用量依存的かつ有意義な肝障害抑制作用を示した。

第 6図に、紅豆杉の酢酸ェチル可溶画分（グラフ中に S oと記載）を投与したァミノ基転移酵素量の測定結果を示す。酢酸ェチル可溶画分は、リグナン類化合物と同様に、血清中 GPTと GOT上昇を抑制し、用量依存的かつ有意義な肝障害抑制作用を示した。

TNF-α の測定結果を第 7図と第 8図に示す。グラフの縦軸は血清中の TNF-ひ量を pg/mLの単位で示す。 Controlは生理食塩水を投与した群を表す。 T AX 5 0〜I T X 1 0はリグナン類の化合物名と投与量を表す。 S Iはシリマリン投与群を表す。各実験群のマウス個体数は 6である。また、 D- GalN/LPS非処理群（マウス個体数： 3 ) の血清 TNF-ひ量は検出限界（10p_g/mL)以下であったため、図示していない。 TAX、 HYL、 SIL、 ITXは、 lOmg/kgと 50mg/kgの投与量で、血清中 TNF-α 上昇を抑制し、用量依存的かつ有意義な肝障害抑制作用を示した。

また、 S I L、 I TXを投与したマウスおよび対照群のマウスについて、 D- GalN/lPS 注射の 8時間後に ffiF臓細胞の病理組織学的観察を行った。対照群のマウスについては、細胞内のアポト一シス小体が多数観察され、また、細胞核内のクロマチンの凝縮が多数観察された。すなわち多数の細胞のアポトーシスが観察された。.一方、 SI L'、 .ITX を投与したマウスでは、より少ない数の細胞内のアポトーシス小体、また、細胞核内のク口マチンの凝縮が観察された。よって、肝臓細胞の病理組織学的観察からもリグナン類化合物の肝障害抑制作用が裏付けられた。

(試験例 3— TNF-ひ誘発マウス初代培養肝細胞死に対する抑制活性）

d d Y系雄マウスの肝臓からコラゲナーゼ灌流法の変法で分離した肝実質細胞を、

10%ゥシ血清、ペニシリン G100IU/mL、ストレプトマイシン 100〃g/mL、デキサメタゾン 100/M、インスリン 50ng/mLを補充したウイリアムス E (William⁵ s E)培地に懸濁し、

96ゥエルのプラスチヅクプレ一トに 1ゥエル当たり 1.5X10⁴セル（cell)を配布した c

2時間予備培養した後、 D-ガラクトサミン 0.5mMおよびリグナン類を含む新鮮な培地に置き換えた。 30分後、 TNF -ひ lOOng/mLを加えた。 18時間後、

MTT(3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl )-2, 5-dimethyltetrazol ium bromide)発色反応を用いて生存肝細胞数を計測した。

測定結果を第 9図と第 10図に示す。 '

グラフの縦軸は細胞生存割合を百分率で示す。 Normalは TNF-ひ非添加の培地中での細胞生存割合を示す。 Controlは被検薬非添加の培地中での細胞生存割合を示す。

TAX, HYL、 SIL、 I TXは培地中に 200，100，50，10 Mの濃度で添加した。それそれの細胞生存割合を 4本の棒グラフで示す。

TAXを培地に添加すると、肝細胞の生存割合は Controlに比較して用量依存的、かつ有意義に上昇した。 HYL、 SIL、 I TXを培地に添加した場合も、 TAXの添加と同様な試験結果が得られた

(試験例 4一培養ガン細胞に対する細胞毒性活性）

ヒト HT-1080繊維肉腫細胞とマウス腸癌 Colon26- L5の 2種のガン細胞を用いてリグナン類化合物及び紅豆杉画分の細胞毒性活性試験を行った。ヒト HT-1080繊維肉腫細胞は 10%FCS (非働化したゥシ胎児血清）と 0.1%炭酸水素ナトリゥム及び 2mMグルタミンを含んだ EMEM培地で培養した。 '一方、マウス腸癌 Colon26- L&細胞は、 '前記 EMEM培地と同様なサプリメントを含んだ RPMI培地で培養した。細胞生存率は MTT

(3-(4₅5-dimethylthiazol-2-yl)-2₃5-dimethyltetrazolium bromide)法によって決定した。

指数関数的に増殖する細胞は 9 6·穴プレート中に、 100 L中に約 2000細胞を含んで' いる細胞懸濁培地液として加え、.培養した。 .

2 4時間後、細胞がプレートに接着した後に、培地液を除去し、濃度の異なる被検薬培地溶液（100,50 10,5 l〃g/mL) 100 Lを加え、 5 %二酸化炭素雰囲気下 37°Cで 72 時間培養した。被検薬は、まず DMS0に溶解し、その後培地で希釈して用いた。 DMS0の最終濃度は 0.25%以下になるように調整した。

その後、培地液を除去し、培地に溶解した MTT100〃Lを加え、 3時間培養し、形成されたホルマザンの量をプレートリーダ（パーキンエルマ一社 HTS- 7000)を用いて、 550服で吸光度を測定した。 1の濃度での試験は 4穴で行い、 4測定値の平均値を試験結果とした。そして、試験結果から I C₅。（50%有効濃度）値を算出した。

試験結果を表 3と表 4に示す。 8

表 3 リ ΰナン類化合物の細胞毒性活性

S I Lは HT-1080細胞に対して顕著な細胞毒性を示した。 TAX、 ITXは HT- 1080 と Colon26- L5に対して細胞毒性を示した。

表 4 .. .

紅豆杉画分の細胞毒性活性 '■

.酢酸ェチル可溶画分は HT- 1080と Colon26- L5に対して細胞毒性を示した。

(試験例 5— DPPHフリ一ラジカル消去活性）

DPPH(1,1- dipheny 2 - picrylhydrazyl)エタノール溶液 (濃度 60〃 M) 500 L と、被検薬のエタノールあるいは水溶液 500〃 Lを混合し、室温で 30分間放置後に 520nm で吸光度を測定した。試験は被検薬の濃度を変更して行い、その測定値から EC₅₀ (50% 有効濃度）値を算出した。

測定結果を表 5に示す。表 5 紅豆杉画分の D PPHフリ一ラジ力』レ;肖去活性

酢酸ェチル可溶画分は、顕著な D D P Hフリーラジカル消去活性を示した。

フリ一ラジカル消去能は、抗酸化活性の一つである。フリーラジカル消去活性の強い物質は抗酸化活性が強いと考えられる。 D-GalN/TNF-ひ誘発肝障害に対する、酢酸ェチル可溶画分の作用機序は、抗酸化活性による TNF- α産生の抑制にあると考えられ、その結果肝細胞がアポト一シスになるのを抑制すると考えられる。

また、糖尿病によって引き起こされる白内障などの合併症に抗酸化物質が有効であるとの報告がなされている。本発明にかかる酢酸ェチル可溶画分とリグナン類は糖尿病の合併症に対しても効果を有すると考えられる。産業上の利用可能性

以上のように、本発明にかかる化合物と紅豆杉の有機溶媒抽出画分は、医薬として有用であり、特に、血糖降下剤、肝臓保護薬または抗ガン剤に適している。

Claims

1. 式（1)

一省

Sの

(式中 R¹は水素または水酸基、 R²は炭素数 1〜4のアルキルォキシ基または水酸基、囲

R ³は炭素数 1〜4のアルキルォキシ基を表す） .

で示される化合物、または式（ 1 )化合物の医学的に許容される塩またはエステルを有効成分とする医薬。

2. 式（2)

(式中 R⁴、 R ⁵は炭素数 1〜4のアルキルォキシ基を表す）

で示される化合物、または式（2)化合物の医学的に許容される塩またはエステルを有効成分とする医薬。

3 . 式（3 )

( 3 )

(式中 R ⁶は炭素数 1〜4のアルキルォキシ基を表す）

で示される化合物、または式（3 )化合物の医学的に許容される塩またはエステルを有効成分とする医薬。

4 .血糖降下剤、肝臓保護薬または抗ガン剤であることを特徴とする請求の範囲第 1項記載の医薬。

5 .血糖降下剤、肝臓保護薬または抗ガン剤であることを特徴とする請求の範囲第 2項

6 .血糖降下剤、肝臓保護薬または抗ガン剤であることを特徴とする請求の範囲第 3項記載の医薬。

7 .紅豆杉の植物体を水で抽出し、得られた水抽出物を有機溶媒により抽出して得られる抽出物を有効成分とする医薬。

8 .血糖降下剤、肝臓保護薬または抗ガン剤であることを特徴とする請求の範囲第 Ί項記載の医薬。