WO2004097019A1 - ヒト抗ヒトインターロイキン－１８抗体およびその断片、並びにそれらの利用方法 - Google Patents

Abstract

　本発明のヒト由来のヒト抗ヒトＩＬ−１８抗体は、ヒトＩＬ−１８に対する抗体であり、以下の（ａ）または（ｂ）のポリペプチドからなるＨ鎖の相補性決定領域と、（ｃ）または（ｄ）のポリペプチドとからなる、ヒトインターロイキン−１８に対するＬ鎖の相補性決定領域とを含むものである。（ａ）配列番号４～６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。（ｂ）（ａ）に記載のポリペプチドの改変体であって、Ｈ鎖の相補性決定領域となるポリペプチド。（ｃ）配列番号１０～１２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド。（ｄ）（ｃ）に記載のポリペプチドの改変体であって、Ｌ鎖の相補性決定領域となるポリペプチド。これにより、ヒト抗ヒトＩＬ−１８抗体およびその利用方法を提供することが可能となる。

Description

明 細 書 ヒ ト抗ヒ トインターロイキン一 1 8抗体およびその断片、 並びにそれらの利用方 法 技術分野

本発明は、 ヒト抗ヒ トインターロイキン一 1 8抗体おょぴその断片、 並びにそ れらの利用方法に関し、 より詳細には、 ヒトインターロイキン一 1 8 (以下、 ヒ ト IL- 1 8とする） に結合し、 その生理活性を阻害するヒ ト抗ヒ ト IL-18抗体お よびその抗体フラグメント、 並びにそれらの利用方法に関するものである。 この 抗体及ぴ抗体フラグメントは、 IL- 18 が原因となって惹起される炎症、 免疫異常 性疾患の治療薬として期待される。 背景技術

アトピー性皮膚炎 （atopic dermatitis (AD) ) は、 主に外的刺激に対する炎症 性皮膚病変で、 慢性反復性の強い搔痒を伴う疾患である。 A D発症のメカニズム は不明な点が多いが、 A D発症には遺伝的背景があり、 A D患者の血清中には高 いレベルの IgEが存在する。 また、 AD発症のメカニズムには、 活性化 T細胞、 好塩基球、 肥満細胞が深く関与する。 特に、 アレルゲンによる肥満細胞あるいは 好塩基球上の Fc ε受容体 （Fc ε R) に結合した IgE分子の架橋によって、 これら の細胞が活性化される。 その結果、 2型ヘルパー T (Th2) 細胞由来のサイトカイ ンとケミカルメディエーターとの産生が起こり、 AD が発症すると考えられてい る。 Th2 サイ トカインとして重要なのは、 IL - 4、 IL- 5、 IL- 9、 IL- 13 等であり、 ケミカルメディエーターとして重要なのは、 ヒスタミン、 セロ トニン、 ロイコト リエン等である。

ヘルパー T 細胞 （Th) は、 抗原刺激を受けるとサイトカインを産生するが、 そ の産生パターンから 2つの亜集団 （Thl と Th2細胞） に分類される。 1型へルパ 一 T (Thl) 細胞が刺激を受けると IFN- y、 IL- 2、 TNF- ]3などの T h 1サイ トカ インを産生し、 2型ヘルパー T (Th2) 細胞が刺激を受けると IL- 4、 IL- 5、 IL- 10、 IL- 13 などの T h 2サイ トカインを産生する。 前者 （Thl 細胞） はおもに細 胞性免疫を誘導し、 後者 （Th2 細胞） は液性免疫を誘導し、 ときにはアレルギー 応答を誘導する。 ナイーブ T細胞は、 IL- 12の存在下で抗原刺激を受けると Thl 細胞に、 また IL- 4の存在下で抗原刺激を受けると Th2細胞に分化する。

IL- 18は、 発見当初、 T細胞や NK (ナチュラルキラー） 細胞から IFN- Vの産生 を誘導する因子と して注目されていた （Okamura, H. et al. Nature 378， 88 (1995) . ) 。 しカゝし、 IL- 18 がこの様な機能を発揮するのは IL-12 が共存した 場合である (Nakanishi, K. et al. , Annu. Rev. Immunol. , 19， 423 (2001) ) 。 また、 T h lサイト力インである IFN- γは、 T h 2サイ ト力インである IL-4 の作用を阻止するので、 IFN- γを誘導する IL - 18は、 T h 2細胞による免疫反応 を抑制し、 抗アレルギー作用を示すと考えられた。

寄生虫をマウスに感染させると、 Th2'細胞が誘導され IgE産生がおこる。 発明 者は、 感染直後から IL- 12と IL - 18とを投与すると、 T細胞、 NK細胞、 B細胞な どから、 IFN - γの産生が誘導され IgE 産生が抑制されることを明らかにした （ Yoshimoto, T. et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. USA.， 94, 3948 (1997) ) 。

さらに、 IL - 18だけを投与すると IgE産生が増強されることも明らかにした （ Yoshimoto, T. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA.， 96, . 13962 (1999) ) 。 ま た、 その後の解析から、 IL- 18を正常なマウスに投与すると IgE産生が誘導され ることも明らかとなった （Yoshimoto, T. et al. , Nat. Immunol, . 1, 132 (2000) ) o

生体内に投与された IL-18は、 CD4陽性 T細胞 （C D 4 + T細胞） に作用して CD40 リガンド（CD40L)の発現と、 IL- 4、 IL - 5、 IL-13 等の産生とを誘導する （ Yoshimoto, T. et al.， J. Exp. Med. , 197， 997 (2003) ) 。 また、 生体内で B細胞 は、 IL-18の刺激を受けた CD4陽性 T細胞が発現する CD40Lと、 IL - 4との刺激を 受けて IgEを産生する。

IL-18 は、 in vitro で、 IL - 3 によって誘導された好塩基球と肥満細胞とに作 用して、 IL- 4、 IL- 13、 ヒスタミン等の産生を誘導する （Konishi, H. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99， 11340 (2002) ) 。

従来の定説では、 初めに述べた様に、 肥満細胞上の Fc ε Rに Fc部位を介して 結合する複数の IgE分子に、 アレルゲンが結合して、 これらの IgE分子を架橋す ることによって、 肥満細胞が活性化されると考えられていた。 今もこの定説は正 しいが、 発明者らは IL - 18力 S、 アレルゲンおょぴ IgEの介在無しに、 直接的に肥 満細胞や好塩基球を活性化して IL- 4、 IL- 13、 ヒスタミン等の産生を誘導するこ とを明ら力にした （Yoshimoto, T. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA. , 96, 13962 (1999) ) 。 この様な場合もアレルギー性炎症がおこる。

IL-18 は、 生物学的に不活性な前駆体 （I L一 1 8前駆体） として産生され、 カスパーゼ 1の作用で開裂されて活性型となり、 細胞外に分泌される （Gu， Y. et al. , Science, 275， 206 (1997) ) 。 発明者は、 皮膚のケラチノサイ トで、 IL- 18 前駆体が産生されて蓄積されていることから、 皮膚のケラチノサイ ト特異的 にカスパーゼ 1を過剰発現させたマウス （カスパーゼ 1 トランスジエニックマウ ス） を作製した (Yamanaka, K. et al. , J. Immunol. , 165, 997 (2000) ) 。 その 結果、 このマウスは、 生物学的に活性のある IL- 18を大量に産生した。 また、 こ のマウスは、 血中に大量の IgE を産生していた （Yoshimoto, T. et al.， Nat. Immunol, . 1, 132 (2000) , Konishi, H. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 11340 (2002) ) 。 さらに、 このマウスは、 アレルゲンのない環境で飼育され ているにも関わらず、 強いアトピー性皮膚炎を発症した （Konishi, H. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99， 11340 (2002) ) 。

ところで、 IL-4 と IL-13のシグナルは、 Stat 6を介して標的細胞の核内に伝 達されることで、 これらのサイト力インの作用を発揮することが明らかにされて いる。 発明者らは、 stat6 を欠損させたマウスが、 IgE を産生しないことを明ら かにした （Takeda, K. et al. , Nature, 380， 627 (1996) ) 。 そして、 この様な Stat 6 遺伝子を欠損させたマウスと、 皮膚のケラチノサイ ト特異的にカスパー ゼ 1を過剰発現させたマウス （カスパーゼ 1 トランスジエニックマウス） とを交 配して、 stat6 遺伝子欠損カスパーゼ 1 トランスジエニックマウスを作製した。 その結果、 このマウスは、 全く IgEを作らなかったが、 強いアトピー性皮膚炎を 発症することが明らかとなった （Konishi, H. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99， 11340 (2002) ) 。

一方、 発明者は、 IL- 18 遺伝子を欠損したマウスとカスパーゼ 1 トランスジェ ニックマウスとを交配することにより、 IL- 18 欠損カスパーゼ 1 トランスジヱニ ックマウスも作製した。 その結果、 このマウスは、 IgE産生を抑制されてはいた 力 なおも大量の IgEを血中に認めた。 ところが、 このマウスは、 IgEを産生し ているにもかかわらず、 アトピー性皮膚炎の発症が完全に抑制されていた （ Konishi, H. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 11340 (2002) ) 。

これらの結果から、 IgE の産生を抑制することよりも、 IL- 18 の作用を抑制す ることが、 アトピー性皮膚炎の治療に有効と考えられる。

IL-18は、 発見当初 IFN- γ誘導因子とよばれていたように、 IL-12 と相乗的に 、 Thl 細胞や NK細胞に作用して IFN- γの産生を強力に誘導する （Okamura, H. et al. Nature 378， 88 (1995) .、 Nakanishi, K. et al. , Annu. Rev. Immunol. , 19, 423 (2001) ) 。 さらに、 IL- 18は、 これらの細胞上に Fas リガンド（FasL)の 発現を増強する （Tsutsui, H. et al. , J. Immunol. , 159， 3961 (1997) ) 。 FasL は、 三量体になると、 細胞のアポトーシスを誘導する。

発明者は、 Propionibacterium acnes を投与したマウスの肝臓に存在する Kupffer細胞が、 Fas を発現しており、 FasLの刺激を受けると、 活性型の IL - 18 を産生することを示した （Tsutsui, H. et al. , Immunity, 11， 359 (1999) ) 。 さらに、 IL-18は、 NK細胞おょぴ Thl細胞に作用して FasLの発現を増強する。 このように、 IL- 18 と FasL との間には、 正の相関性 （positive feedback loop ) があることも明ら力 こなった （Tsutsui, H. et al.， J. Immunol. , 159, 3961 (1997)、 Tsutsui, H. et al. , Immunity, 11， 359 (1999)、 Tsutsui, H. et al. , Immunol. Rev. , 174， 192 (2000) ) 。 そのため、 生体内で IL- 18が過剰に産 生されると、 肝臓や腸管で重篤な臓器障害が起こることが明らかとなった。 この ように、 IL- 18は、 いわゆる Thl病の原因にもなる。

このような疾患以外にも、 T h 1細胞に誘導される気管支喘息、 その他の様々 な疾患において、 IL- 18の病態への関与が指摘されている。

以上のように、 IL-18の産生あるいは活性の制御は、 このような IL- 18依存性 のアトピー性皮膚炎をはじめとする、 I L— 1 8依存性疾患の治療法として、 あ るいは IL- 18の過剰産生が原因となり疾患の発症を誘導あるいは増悪する Thl病 の治療法として、 極めて重要である。 それゆえ、 IL- 18 の生理活性を中和する特異的なモノクローナル抗体を開発す ることができれば、 IL - 18 の関与する多くの疾患の有効な治療手段になることが 期待される。

ところが、 ヒ ト IL - 18に対するする抗体 （抗ヒ ト I L一 1 8抗体） としては、 マウスゃラット由来のモノクローナル抗体がいくつか取得されているに過ぎない (例えば、 日本国公開特許公報 特開 2 0 0 0— 2 3 6 8 8 4号 （2 0 0 0年 9 月 5日公開） 、 WO 0 0/5 6 7 7 1の国際出願 （2 0 0 0年 9月 2 8日公開） ) 。

しかしながら、 従来の抗ヒ ト I L一 1 8抗体は、 主に、 ヒ ト以外の異種動物由 来のモノクローナル抗体であるため、 ヒトに対して投与した場合、 異物として認 識 ·排除される。 したがって、 従来の抗ヒ ト I L— 1 8抗体を、 ヒ ト I L一 1 8 の関与する疾患の治療薬剤として利用することは困難である。 特に、 慢性の自己 免疫性疾患の治療では、 長期間の継続投与が行われるので、 投与抗体に対する抗 体の出現が問題となる。

この問題を解決する方法として、 ヒ ト IL- 18に対するマウスモノクローナル抗 体を、 遺伝子工学的手法を用いてヒ ト化することが考えられる。

しかしながら、 マウスモノクローナル抗体をヒ ト化すれば、 抗原性は低下する ものの、 慢性の自己免疫性疾患患者に対する反復投与や長期投与を行った際には 、 そのヒ ト化抗 IL- 18抗体の活性を阻害するような抗体 （阻止抗体） が作り出さ れる可能性も否定できない。 その結果、 顕著な治療効果は期待できず、 場合によ つては重大な副作用が生じる可能性もあるという問題を有している。

それゆえ、 反復投与や長期投与を行った場合でも、 安全性の高い抗ヒ ト I L一 1 8抗体の開発が強く望まれている。

本発明は、 上記の課題に鑑みなされたものであり、 その目的は、 安全性と治療 効果を兼ね備えたヒト抗ヒ ト抗インターロイキン一 1 8抗体およびその断片を提 供するとともに、 それらの利用方法を提案することにある。 発明の開示

本発明者は、 上記課題に鑑みて鋭意に検討した結果、 健常人の末梢血 Bリンパ 球より調製した免疫グロブリン H鎖おょぴ L鎖の可変領域 （V_H， V_L) をコー ドする遺伝子を発現したファージディスプレイライプラリーから、 完全ヒ ト抗ヒ ト I L一 18抗体の 1本鎖可変領域 （ s c F V ) 分子 （抗体断片） を取得し、 そ のアミノ酸配列おょぴそれをコードする c DNAの塩基配列を明らかにした。 さ らに、 この s c F Vが、 ヒ ト I L一 18の生理活性を阻害することを見出し、 本 発明を完成させるに至った。

すなわち、 本発明は、 医学上または産業上有用な方法 ·物質として下記 A) 〜 X) の発明を含むものである。

A) ヒ トインターロイキン一 18に対する、 ヒ ト抗ヒ トインターロイキン一 1 8抗体。

B) 以下の （a) または （b) のポリペプチドからなる H鎖の相補性決定領域 と、 （c) または （d) のポリペプチドからなる L鎖の相補性決定領域とを含む 上記 A) に記載のヒ ト抗ヒ トインターロイキン一 18抗体。

( a ) 配列番号 4〜6に示されるァミノ酸配列からなるポリぺプチド。

(b) 配列番号 4〜6に示されるアミノ酸配列において、 1またはそれ以上のァ ミノ酸が置換、 欠失、 挿入、 および Zまたは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ、 ヒ トインターロイキン一 18に対する H鎖の相補性決定領域となるポリべ プチド。 .

(c) 配列番号 10〜1 2に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。

(d) 配列番号 10〜12に示されるアミノ酸配列において、 1またはそれ以上 のアミノ酸が置換、 欠失、 挿入、 および または付加されたアミノ酸配列からな り、 かつ、 ヒ トインターロイキン一 18に対する L鎖の相補性決定領域となるポ リペプチド。

C) 以下 （e) または （f ) のポリペプチドからなる H鎖可変領域と、 （g) または （h) のポリペプチドからなる L鎖可変領域とを含む上記 A) または B) に記載のヒ ト抗ヒトインターロイキン一 1 8抗体。

( e ) 配列番号 3に示されるァミノ酸配列からなるポリべプチド。

(f ) 配列番号 3に示されるアミノ酸配列において、 1またはそれ以上のァミノ 酸が置換、 欠失、 揷入、 および Zまたは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ 、 ヒトインターロイキン一 1 8に対する H鎖可変領域となるポリペプチド。 ( g ) 配列番号 9に示されるアミノ酸配列からなるポリぺプチド。

( h ) 配列番号 9に示されるアミノ酸配列において、 1またはそれ以上のァミノ 酸が置換、 欠失、 挿入、 および または付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ 、 ヒ トインターロイキン一 1 8に対する L鎖可変領域となるポリペプチド。

D ) 以下 （e ) または （f ) のポリペプチドからなる、 ヒ トインターロイキ ンー 1 8に対するヒ ト由来の抗体 （ヒト抗ヒ ト I L— 1 8抗体） の H鎖可変領域 断片。

( e ) 配列番号 3に示されるァミノ酸配列からなるポリぺプチド。

( f ) 配列番号 3に示されるアミノ酸配列において、 1またはそれ以上のァミノ 酸が置換、 欠失、 揷入、 およぴノまたは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ 、 ヒトインターロイキン一 1 8に対する H鎖可変領域となるポリペプチド。

E ) 以下 （g ) または （h ) のポリペプチドからなる、 ヒ トインターロイキン - 1 8に対するヒ ト由来の抗体 （ヒ ト抗ヒ ト I L一 1 8抗体） の L鎖可変領域断 片。

( g ) 配列番号 9に示されるァミノ酸配列からなるポリぺプチド。

( h ) 配列番号 9に示されるアミノ酸配列において、 1またはそれ以上のァミノ 酸が置換、 欠失、 挿入、 および Zまたは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ 、 ヒトインターロイキン一 1 8に対する L鎖可変領域となるポリペプチド。

F ) 上記 B ) に記載の H鎖の相補性決定領域を含む H鎖可変領域断片または上 記 D ) に記載の H鎖可変領域断片と、 上記 B ) に記載の L鎖の相補性決定領域を 含む L鎖可変領域断片または上記 E ) に記載の L鎖可変領域断片とを連結してな る、 ヒトインターロイキン一 1 8に対するヒ ト由来の抗体の 1本鎖可変領域断片 G) 上記 B ) に記載の H鎖の相補性決定領域を含む H鎖可変領域断片または上 記 D ) に記載の H鎖可変領域断片、 および / /または、 上記 B ) に記載の L鎖の相 補性決定領域を含む L鎖可変領域断片または上記 E ) に記載の L鎖可変領域断片 に、 ヒ ト由来の定常領域を連結してなる、 ヒ トインターロイキン一 1 8に対する ヒ ト由来の抗体 （ヒ ト抗ヒ ト I L— 1 8抗体） またはその断片。 H) 上記抗体の断片が、 F a b、 F a b ' 、 F (a b ' ) ₂、 s cAb、 また は s c F v F cである上記 G) に記載の抗体の断片。

I ) 上記 A) 〜H) のいずれかに記載の抗体またはその断片に、 修飾剤が結合 されてなる修飾抗体。

J ) 上記 A) 〜H) のいずれかに記載の抗体またはその断片をコードする遺伝 子。

K ) 配列番号 1または 7に示される塩基配列をオープンリーディングフレーム 領域として有する上記 J ) に記載の遺伝子。

L) 上記】） または K) に記載の遺伝子を含む組換え発現ベクター。

M) 上記 J) または K) に記載の遺伝子が導入された形質転換体。

N) 上記】） または K) に記載の遺伝子を宿主に発現させることによって、 ヒ ト由来のヒ ト抗ヒ トインターロイキン _ 1 8抗体またはその断片を生産する方法

〇） 上記 A) 〜H) のいずれかに記載の抗体またはその断片、 または上記 I ) に記載の修飾抗体を用いたヒ トインターロイキン一 1 8検出器具。

P) 上記 A) 〜H) のいずれかに記載の抗体またはその断片、 または上記 I ) に記載の修飾抗体を含むヒ トインターロイキン一 1 8検出試薬を用いて、 被検試 料中のヒ トインターロイキン一 1 8量を測定する免疫疾患の診断キット。

Q) 上記 P) に記載の検出試薬を用いて測定した被検試料中のヒ トインター口 ィキン一 1 8量に基づいて免疫疾患を診断する方法。

R) ヒ トインターロイキン一 1 8アンタゴニス トを有効成分とするヒ トインタ 一ロイキン 1 8活性阻害剤。 '

S) 上記ヒ トインターロイキン _ 1 8アンタゴニストが、 以下のいずれかの物 質である上記 R) に記載のヒ トインターロイキン 1 8活性阻害剤。

以下のいずれかの物質を含むヒ トインターロイキン一 1 8活性阻害剤。

i)上記 A) 〜C) のいずれかに記載のヒト抗ヒ トインターロイキン一 1 8抗体 ii)上記 D) 〜H) のいずれかに記載の抗体の断片

iii)上記 I ) に記載の修飾抗体

iv)上記 i)〜： Lii)のいずれかに記載の抗体、 抗体の断片、 または修飾抗体が認識 するヒ トインターロイキン一 1 8上の抗原決定領域に基づいて分子設計された低 分子化合物。

T) 上記：[) または K) に記載の遺伝子を含む遺伝子治療剤。

U) 上記 R) または S) に記載のヒ トインターロイキン一 1 8活性阻害剤、 ま たは上記 T) に記載の遺伝子治療剤を含む免疫疾患治療剤。

V) 上記 U) に記載の免疫疾患治療剤を投与することによる免疫疾患の治療方 法。

W) 抗原とヒ トインターロイキン一 1 8とによる刺激によってヘルパー T 1細 胞から産生するサイ トカインを阻害することを特徴とする上記 U) に記載の免疫 疾患治療剤。

X) ヒ ト I L一 1 8が関与するアレルギー、 炎症、 慢性免疫異常疾患に適用す るものであることを特徴とする上記 U) または W) に記載の免疫疾患治療剤。 本発明によれば、 これまでのようにキメラ抗体またはヒ ト化抗体ではなく、 ヒ ト由来のヒ ト I L一 1 8に対する抗体およびその断片、 並びにそれらの利用方法 を提供できる。 それゆえ、 ヒ ト I L— 1 8が直接または間接的に関与する疾病の 治療において、 反復投与や長期投与を行っても、 顕著な治療効果と高い安全性と を維持した治療薬を提供できる。

本発明のさらに他の目的、 特徴、 および優れた点は、 以下に示す記載によって 十分わかるであろう。 また、 本発明の利益は、 添付図面を参照した次の説明で明 白になるであろう。 図面の簡単な説明

図 1は、 実施例 1において分離したクローン s c F vのヒ ト I L一 1 8に対す る特異性を EL I S Aによって評価した結果を示すグラフである。

図 2は、 実施例 1において精製したヒ ト由来の s c F vのヒ ト I L— 1 8に対 する特異性を EL I S Aによって評価した結果を示すグラフである。

図 3は、 実施例 1における s c F v (h l 8— 40、 h 1 8 - 1 08) 力、 I L- 1 8によるヒ ト骨髄単核球 KG— 1細胞からの I NF- γの産生を阻害する ことを示すグラフである。 図 4は、 実施例 1における s c F v (h 1 8 - 1 08) 力 S、 I L一 1 8のヒ ト 骨髄単核球 K G— 1細胞への結合を阻害することを示すグラフである。

図 5は、 図 4において、 s c F v (コントロール） の結果を示すグラフである 図 6は、 s c F v (h 1 8 _ 1 08 ) のウェスタンブロッテイングの結果を示 す図である。

図 7は、 s c F v (h 1 8 - 1 08) のゲルろ過クロマトグラフィ一の結果を 示すグラフである。

図 8は、 実施例 2における、 T h 1細胞おょぴ T h 2細胞の刺激により、 各細 胞から産生されたサイ トカインの量を示すグラフである。

図 9は、 実施例 2における、 T h 1細胞おょぴ T h 2細胞の刺激により、 各細 胞の表面の I L— 1 8 Rひ鎖の発現レベルを示す図である。

図 1 0は、 実施例 2における、 I L一 1 8の用量と、 T h i細胞からのサイト カインの産生量との関係を示すグラフである。

図 1 1は、 実施例 2における、 T h 1細胞への刺激後の培養時間と、 T h 1細 胞からのサイトカインの産生量との関係を示すグラフである。

図 1 2は、 実施例 2において、 I L一 1 8刺激を受けた Th 1細胞における、 細胞質 I FN— γおよび Zまたは I L— 1 3に陽性の C D 4 +Τ細胞の割合を、 F AC S分析した結果を示す図である。

図 1 3は、 実施例 2における、 抗 CD 3抗体刺激を受けた Th 1細胞中の、 I FN— y+Th 1細胞の割合と、 I FN— γ+Th 1細胞の陽性選別例とを示す 図である。

図 14は、 実施例 2における、 I FN— γ+Th 1細胞を、 抗 CD 3と I L一 1 8とにより刺激した場合の、 サイトカインの産生量を示すグラフである。 発明を実施する最良の形態

本発明の具体的態様について説明すれば、 以下の通りである。 なお、 本発明は これに限定されるものではない。

(1) 本発明の抗体およびその断片 本発明者は、 ヒ トインターロイキン一 1 8 ( I L- 1 8) に対するヒ ト抗ヒ ト I L- 1 8抗体について検討した結果、 ファージディスプレイ法によって得られ たヒ ト由来の 1本鎖可変領域断片 （ s c F V ) 力 ヒ ト I L一 1 8により誘導さ れるシグナル伝達おょぴ I N F— γ産生を阻害することを明らかにした。 さらに 、 この 1本鎖可変領域断片 （s c F v) における、 相補性決定領域 （CDR) 、 H鎖おょぴ L鎖の可変領域のアミノ酸配列およびそれらをコードする遺伝子の塩 基配列を同定した。

配列番号 3には、 V_H鎖のアミノ酸配列が示される。 配列番号 4〜 6は、 この V_H鎖における相補性決定領域 （CDR 1〜3) のアミノ酸配列が示される。 す なわち、 配列番号 3に示す V_H鎖のアミノ酸配列において、 3 1番目〜 3 5番目 のアミノ酸配列が CD R 1 (配列番号 4) 、 50番目〜 6 6番目のアミノ酸配列 が CDR 2 (配列番号 5) 、 9 9番目〜 1 08番目のアミノ酸配列が CDR 3 ( 配列番号 6) に対応している。

一方、 配列番号 9は、 V_L鎖のアミノ酸配列を示している。 配列番号 1 0〜1 2は、 この V_L鎖における相補性決定領域 （CDR 1〜3) のアミノ酸配列を示 している 33番目のアミノ酸配列が CD R 1 (配列番号 1 0) 、 4 9番目〜 5 5 番目のアミノ酸配列が CD R 2 (配列番号 1 1) 、 88番目〜 98番目のァミノ 酸配列が CD R 3 (配列番号 6).に対応している。

本発明の抗体おょぴその断片は、 上記 V_H鎖おょぴ V_L鎖、 並びにそれらの C DRとして、 配列番号 3〜6および 9〜1 2に示される配列に限定されるもので はなく、 それらの一部が改変された変異ポリべプチドであってもよい。

すなわち、 V_H鎖の CDRとしては、 （a) 配列番号 4〜 6に示されるァミノ 酸配列からなるポリペプチド、 のみならず、 （b) 配列番号 4〜 6に示されるァ ミノ酸配列において、 1またはそれ以上のアミノ酸が置換、 欠失、 挿入、 および ノまたは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ、 ヒ トインターロイキン一 1 8 に対する H鎖の相補性決定領域となるポリべプチド、 も含まれる。

—方、 V_L鎖の CDRとしては、 （c) 配列番号 1 0〜 1 2に示されるァミノ 酸配列からなるポリペプチド、 のみならず、 （d) 配列番号 1 0〜 1 2に示され るアミノ酸配列において、 1またはそれ以上のアミノ酸が置換、 欠失、 揷入、 お ょぴ zまたは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ、 ヒ トインターロイキン一

1 8に対する L鎖の相補性決定領域となるポリペプチド、 も含まれる。

また、 V _H鎖可変領域は、 （e ) 配列番号 3に示されるアミノ酸配列からなる ポリペプチド、 のみならず、 （ f ) 配列番号 3に示されるアミノ酸配列において 、 1またはそれ以上のアミノ酸が置換、 欠失、 挿入、 および Zまたは付加された アミノ酸配列からなり、 かつ、 ヒトインターロイキン一 1 8に対する H鎖可変領 域となるポリペプチド、 も含まれる。

同様に、 V _H鎖可変領域は、 （g ) 配列番号 9に示されるアミノ酸配列からな るポリペプチド、 のみならず、 （h ) 配列番号 9に示されるアミノ酸配列におい て、 1またはそれ以上のアミノ酸が置換、 欠失、 揷入、 およびノまたは付加され たアミノ酸配列からなり、 かつ、 ヒトインターロイキン一 1 8に対する L鎖可変 領域となるポリペプチド、 も含まれる。

ここで、 上記 「1個又は数個のアミノ酸が置換、 欠失、 挿入、 及び/又は付加 された」 とは、 部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異タンパク質作製法によ り置換、 欠失、 挿入、 及び/又は付加できる程度の数のアミノ酸が置換、 欠失、 揷入、 及び/又は付加されることを意味する。 したがって、 例えば、 上記 （b ) のポリペプチドは、 上記 （a ) のポリペプチドの変異ペプチドであり、 ここにい う 「変異」 は、 主として公知の変異タンパク質作製法により人為的に導入された 変異を意味するが、 天然 （例えばヒト） に存在する同様の変異ポリペプチドを単 離精製したものであってもよい。

なお、 上記 「変異」 は、 後述のように本発明の抗体またはその断片を、 治療薬 として利用する場合 （ヒ トに投与する場合） には、 ヒ ト由来の構造またはヒ トが 免疫反応を起こさない範囲で行い、 検出器具や診断キットなどとして利用する場 合 （ヒ トに投与しない場合） には、 特に制限されない。 また、 本発明の抗体また はその断片を、 ヒ トに投与する場合、 抗原を認識する C D Rの高次構造を維持す る範囲で、 変異を行うことが好ましい。

また、 本発明に係る抗体およびその断片は、 付加的なポリペプチドを含むもの であってもよい。 このようなポリペプチドが付加される場合としては、 例えば、 His や Myc 、 Flag等によって本発明のタンパク質がェピトープ標識されるよう な場合が挙げられる。

なお、 CDRは抗原を認識する領域であるため、 ヒ ト I L一 1 8は、 本発明に かかる抗体またはその断片の相補性決定領域 （CDR) に認識される。 したがつ て、 少なくとも上記 CD Rを有する抗体は、 ヒ ト I L— 1 8を特異的に認識でき る。 すなわち、 上記 V_H鎖おょぴ V_L鎖は、 少なくとも前記 V_H鎖および 鎖の CDRを含んでいればよく、 それ以外は、 ヒ ト由来の V_H鎖おょぴ L鎖のアミノ 酸配列であればよい。 これにより、 ヒ ト I L一 1 8に対する特異性は保持される 。 ただし、 CDRは、 H鎖および L鎖の可変領域の 1次構造と高次構造とによつ て、 特異的に構築されている。 このため、 少なく とも前記 V_H鎖および 鎖の CDRを含み、 それ以外を、 ヒ ト由来の V_H鎖および L鎖からヒ ト抗 I L_ 1 8 抗体を構成する場合、 ヒ ト I L一 1 8に対する特異性を有する抗体とすることが 可能である。 例えば、 少なくとも CDRの高次構造を維持することによって、 ヒ ト I L一 1 8に対する特異性を有する抗体とすることが可能である。

より具体的には、 本発明にかかる抗体およびその断片としては、 ヒ ト由来のも のであって、 例えば、 以下に示すィ） 〜二） に示すものが挙げられる。

ィ） 上記 （a) または （b) に記載の H鎖の相補性決定領域を含む V_H鎖、 口） 上記 （e) または （f ) のポリペプチドからなる V_H鎖、

ハ） 上記 （c) または （d) に記載の L鎖の相補性決定領域を含む V_L鎖、 二） （g) または （h) のポリペプチドからなる V_L鎖、

ホ） 上記ィ） または口） の V_H鎖おょぴ上記ハ） または二） の V_L鎖とを連結し てなる 1本鎖可変領域断片 （s c F v) 、

へ） 上記ィ） または口） の V_H鎖および または上記ハ） または二） 鎖にヒ ト由来の定常領域を連結してなる断片などであってもよい。

上記ホ） およびへ） において、 上記 V_H鎖と V_L鎖とを連結する場合、 通常、 適当なペプチドリンカ一などによって連結される。 このペプチドリンカ一として は、 例えば、 1 0〜25アミノ酸残基からなる任意の 1本鎖ペプチドが用いられ る。

また、 上記へ） に記載の上記 V_H鎖およびノまたは 鎖にヒ ト由来の定常領 域を連結してなる断片 （フラグメント） は、 & 1)、 ？ & 1₃ ' 、 ？ （_& 13 ' ) 。 や、 少なくとも一部の F c部を有した s c Ab、 または s c F V F c、 さらには 完全抗体であってもよい。 なお、 s c Abとは s c F Vに L鎖または H鎖の定常 領域の一部のドメイン （Cドメイン） が結合したもの、 s c F v F cとは s c F Vに H鎖および L鎖の全定常領域が結合したものである。

さらに、 本発明の抗体およびその断片には、 安定性や抗体価を向上させるため に、 修飾剤が結合されていてもよい。 すなわち、 本発明の抗体およびその断片は 、 修飾抗体であってもよい。 この修飾剤としては、 例えば、 糖鎖や高分子などが 挙げられる。 糖鎖修飾を行った場合には、 その糖鎖が何らかの生理活性を有する 可能性があるが、 ポリエチレングリコール （PEG) などの単純な高分子修飾を 行った場合にはそれ自体生理活性を示さない。 さらに、 PEG化によって肝臓で の吸収を抑制したり、 血中での安定性を向上したりする可能性がある。 つまり、 修飾剤としては、 PEGなどの単純高分子が好ましい。

なお、 本発明の抗体およびその断片の修飾剤による修飾は、 前述の変異べプチ ドの作製と同様に、 治療薬として利用する場合には、 ヒ トが免疫反応を起こさな い範囲で行い、 検出器具や診断キットなどとして利用する場合には、 特に制限さ れない。 また、 本発明の抗体またはその断片を、 ヒ トに投与する場合、 抗原を認 識する CD Rの高次構造を維持する範囲で、 修飾することが好ましい。

また、 上記抗体は、 抗体と構造的に関連したタンパク質も包含する意味、 すな わち免疫グロブリンの意味である。 さらに、 本発明の抗体は、 I gA、 I gD、 I g E、 I g G、 I gMの何れのクラスでもよい。 言い換えると、 単量体であつ てもよいし、 2量体、 3量体、 4量体、 5量体といった多量体であってもよい。 後述する実施例に示すように、 上記 s c F Vについて詳細な解析を進めた結果 、 後の実施例において詳述するように、 その作用 ·性質について以下の知見が得 られた。

〔1〕 ヒ ト I L一 1 8と特異的に結合する。

〔2〕 ヒ ト I L一 1 8により誘導されるシグナル伝達および I NF— γの産生を 阻害する。

このように、 上記 s c F vは、 ヒ ト由来のアミノ酸配列を有しているため、 抗 体の活性を阻止する阻止抗体が形成される可能性は極めて低い。 さらに、 ヒ ト I L— 1 8と強く結合することにより、 その生理活性を阻害する作用があるので、 ヒ ト I L— 1 8によって惹起される種々の免疫応答を阻害することができる。 よ つて、 上記 s c F Vおよびそれを含む抗体またはその断片は、 ヒ ト I L一 1 8が 直接または間接的に関与する疾患、 例えば、 この免疫応答によって惹起されるァ レルギ一、 炎症、 および慢性免疫異常疾患の治療のために利用することができる 。 このような治療薬が開発されれば、 ヒ ト I L一 1 8が関与する疾患の新しい治 療方法の確立が期待される。

( 2 ) 本発明にかかる遺伝子

本発明にかかる遺伝子は、 上記 （1 ) で説明した抗体またはその断片をコード する遺伝子であり、 配列番号 1または 7に示される塩基配列をオープンリーディ ングフレーム （O R F ) 領域として有する遺伝子、 およびその塩基配列の一部を 改変した改変遺伝子などが含まれる。

上記の遺伝子は、 本発明の抗体またはその断片をコードしているので、 適当な 宿主 （例えば細菌、 酵母） に導入して、 本発明の抗体またはその断片を発現させ ることができる。

さらに、 上記 「遺伝子」 は、 上記 （1 ) の抗体またはその断片をコードする配 列以外に、 非翻訳領域 （U T R ) の配列やベクター配列 （発現ベクター配列を含 む） などの配列を含むものであってもよい。 例えば、 配列番号 1または 7に記載 の配列をベクター配列につないで本発明の遺伝子を構成し、 これを適当な宿主で 増幅させることにより、 本発明の遺伝子を所望に増幅させることができる。 また 、 本発明の遺伝子の一部配列をプローブに用いてもよい。 また、 後述するように

、 本発明の遺伝子は、 ヒ ト I L一 1 8が関与する疾患用の遺伝子治療剤 （遺伝子 治療薬） として利用できる。

( 3 ) 本発明の抗体およびその断片の取得方法 ·生産方法

上記 （1 ) に記載の抗体およびその断片は、 例えば、 後述する実施例に示すよ うに、 いわゆるファージディスプレイ法を利用することにより、 取得することが できる。 また、 上記 （1 ) に記載の抗体およびその断片は、 上記 （2 ) に記載の 遺伝子を宿主に発現させることによって、 生産することができる。 なお、 抗体お ょぴその断片の取得方法およぴ生産方法は、 これに限定されるものではない。 より具体的には、 健常人の末梢血 Bリンパ球から m R N Aを抽出し、 免疫グロ ブリン遺伝子の V _H鎖、 V _L鎖を、 その両端を規定するプライマー対を用いて R T— P C R法により増幅し、 多様な配列を有する H鎖、 L鎖の V領域集団を得る 。 次に、 更にペプチドリンカ一部分をコードする D N A、 およびその両端を各々 H鎖、 L鎖と連結されるように規定するプライマー対を組み合わせて増幅して、 H鎖、 L鎖の V領域のランダムな組み合わせによる多様な s c F V D N A集団 を調製する。 得られた s c F V D N Aをファージミ ドベクター _PCANTAB5E に組 込み、 s c F Vディスプレイファ一ジライブラリを作製する。 このライブラリを プラスチックチューブに固相化したヒ ト IL- 18と反応させ、 洗浄により未反応の s c F Vディスプレイファージを除去した後に、 ヒ ト IL- 18と結合している s c F Vファージクローンを酸で溶出する。 分離したファージクローンから s c F V D N Aを調製し、 これを発現ベクターに組み込み、 該発現べクタ一により形質転 換された宿主を常法に従って培養して目的の s c F V蛋白のみを得るというもの である。

なお、 配列番号 1および 7は、 ファージディスプレイ抗体法によって、 取得し たヒ ト I L一 1 8に対する 1本鎖可変領域 （ s c F V ) の V _H鎖および V _L鎖を コードする c D N Aの塩基配列である。

s c F V D N Aの発現方法としては、 例えば、 大腸菌で発現させることがで きる。 大腸菌の場合、 常用される有用なプロモーター、 抗体分泌のためのシグナ ル配列等、 発現させる s c F Vを機能的に結合させて発現させることが出来る。 例えば、 プロモーターとしては、 lacZ プロモーター、 araB プロモーター等を挙 げることができる。 s c F Vの分泌のためのシグナル配列としては、 大腸菌のぺ リブラズムに発現させる場合、 pelB シグナル配列 （Lei， SP.， et al, J. Bacteriol. , 1987, 169 ： 4379-4383) を用いるとよい。 培養上清中に分泌させ るには M13ファージの g 3蛋白のシグナル配列を用いることもできる。

前記のように発現された s c F vは細胞内外、 宿主から分離し均一にまで精製 することができる。 本願発明で発現される s c F Vは、 その C末端に E tag配列 が付加されているので、 抗 E tag抗体を用いたァフィ二ティークロマトグラフィ 一を用いて、 容易に短時間で精製することができる。 その他、 通常のタンパク質 で使用されている分離、 精製方法を組み合わせて精製することも可能である。 例 えば、 限外濾過、 塩析、 ゲル濾過 Zイオン交換 疎水クロマト等のカラムクロマ トグラフィーを組み合わせれば抗体を分離 ·精製することができる。

このようにして得られた s c F V蛋白 （ポリペプチド） は、 後述する実施例に 示すようにヒ ト IL-18に対する結合活性を有することが明らかになった。 本発明 のヒ ト抗ヒ ト IL- 18抗体の抗原結合活性を測定する方法としては、 E L I S A、 BIAcore等の方法がある。 例えば E L I S Aを用いる場合、 ヒ ト IL- 18を固相化 した 9 6穴プレートに目的の抗 IL- 18抗体や抗体フラグメントを含む試料、 例え ば大腸菌の培養上清や精製抗体を加える。 次にアル力リホスファターゼ等の酵素 で標識した二次抗体を添加し、 プレートをインキュベーション、 洗浄した後、 発 色基質パラニトロフ ニルホスフ ートを加えて吸光度を測定することで抗原結 合活性を評価することが出来る。

さらにまた、 本願発明により得られた s c F V蛋白は、 ヒ ト IL-18により誘導 されるヒ ト骨髄単核球 KG-1 細胞からの IFN-γ産生を容量依存的に抑制すること も明らかとなった。

従って、 この s c F v蛋白は、 ヒ ト IL - 18 の生物活性を抑制する事から、 IL- 18の作用により惹起される疾患の予防または治療に有効であると期待される。

( 4 ) 本発明の組換え発現ベクター等

本発明の組換え発現ベクターは、 前記 （2 ) の遺伝子、 すなわち、 上記 （1 ) の抗体またはその断片をコードする遺伝子を含むものであり、 例えば、 配列番号 1又は 7に示される何れかの塩基配列を有する c D N Aが揷入された組換え発現 ベクターが挙げられる。 組換え発現ベクターの作製には、 プラスミ ド、 ファージ 、 又はコスミ ドなどを用いることができるが特に限定されるものではない。

このように、 組換え発現ベクターは、 本発明の遺伝子を含むものである。 ベタ ターの具体的な種類は特に限定されるものではなく、 ホス ト細胞中で発現可能な ベクターを適宜選択すればよい。 すなわち、 ホス ト細胞の種類に応じて、 確実に 遺伝子を発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、 これと本発明に係る 遺伝子を各種プラスミ ド等に組み込んだものを発現ベクターとして用いればよい 本発明の遺伝子がホスト細胞に導入されたか否か、 さらにはホスト細胞中で確 実に発現しているか否かを確認するために、 各種マーカーを用いてもよい。 例え ば、 ホスト細胞中で欠失している遺伝子をマーカーとして用い、 このマーカーと 本発明の遺伝子とを含むプラスミ ド等を発現ベクターとしてホスト細胞に導入す る。 これによつてマーカー遺伝子の発現から本発明の遺伝子の導入を確認するこ とができる。 あるいは、 本発明に係る抗体またはその断片を融合タンパク質とし て発現させてもよく、 例えば、 ォワンクラゲ由来の緑色蛍光タンパク質 G F P ( Green Fluorescent Protein) をマーカーとして用い、 本発明に係る抗体または その断片を G F P融合タンパク質として発現させてもよい。

上記ホスト細胞は、 特に限定されるものではなく、 従来公知の各種細胞を好適 に用いることができる。 具体的には、 上記 （2 ) 遺伝子が全長 D N Aの場合のホ ス ト細胞と しては、 ヒ ト又はマウス由来の細胞をはじめと して、 線虫 Caenorhabdit i s elegans、 アフリカッメガエノレ (Xenopas laevis) の卵母細胞 、 各種哺乳動物 （ラット、 ゥサギ、 ブタ、 サル等） の培養細胞、 あるいは、 キイ 口ショウジヨウバエ、 カイコガ等の昆虫の培養細胞等などの動物細胞が挙げられ 、 D N Aフラグメ ントの場合のホス ト細胞と しては、 例えば、 大腸菌 （ Escherichia col i) 等の細菌、 酵母 (出牙酵母 Saccharomyces cerevis iaeや分 裂酵母 Schizosaccharomyces pombe) などを挙げることができるが、 特に限定さ れるものではない。

上記発現ベクターをホスト細胞に導入する方法、 すなわち形質転換方法も特に 限定されるものではなく、 電気穿孔法、 リン酸カルシウム法、 リボソーム法、 D E A Eデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。

本発明の形質転換体は、 前記 （2 ) の遺伝子、 すなわち、 上記 （1 ) の抗体ま たはその断片をコードする遺伝子が導入された形質転換体である。 ここで、 「遺 伝子が導入された」 とは、 公知の遺伝子工学的手法 （遺伝子操作技術） により、 対象細胞 （宿主細胞） 内に発現可能に導入されることを意味する。 また、 上記 「 形質転換体」 とは、 細胞 ·組織 ·器官のみならず、 動物個体を含む意味である。 対象となる動物は、 特に限定されるものではないが、 ゥシ、 ブタ、 ヒッジ、 ャギ 、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモッ ト、 ハムスター、 マウス、 ラットなどの哺乳動 物が例示される。 特に、 マウスやラット等の齧歯目動物は、 実験動物 ·病態モデ ル動物として広く用いられており、 なかでも近交系が多数作出されており、 受精 卵の培養、 体外受精等の技術が整っているマウスが実験動物 ·病態モデル動物と して好ましく、 ノックアウトマウス等は、 上記抗体やその断片の更なる機能解析 、 ヒ ト I L一 1 8が関与する病気の診断方法の開発や、 その治療方法の開発など に有用である。

なお、 上記 （1 ) の抗体またはその断片は、 本発明の組換え発現ベクターを用 いて作製した、 本発明の形質転換体によっても生産することが可能である。

( 5 ) 本発明の抗体およびその断片の利用方法

( 5— 1 ) ヒ ト I L— 1 8検出器具 ·免疫疾患の診断キット ·診断方法 上記 （1 ) の抗体、 その抗体断片、 または修飾抗体は、 ヒ ト I L一 1 8に対し て、 特異的に強く結合するため、 ヒ ト I L一 1 8の検出 '測定などに利用できる 可能性がある。.すなわち、 上記ヒ トインターロイキン一 1 8検出器具によれば、 例えば、 血液や尿などの試料中に含まれるヒ ト I L— 1 8を高精度に検出できる 。 それゆえ、 ヒ ト I L一 1 8が関与する疾患の判定や治療効果の評価を行うため の診断用、 治療用として利用できる。

なお、 本発明のヒ ト I L— 1 8検出器具は、 本発明の抗体における少なくとも C D Rのアミノ酸配列を用いればよい。 ヒ ト I L— 1 8検出器具は、 種々の条件 下での I L— 1 8の検出 ·測定などに利用できる。 本発明のヒ ト I L一 1 8検出 器具としては、 例えば、 ヒ ト I L一 1 8と特異的に結合する本発明の抗体または その断片を基盤 （担体） 上に固定化した抗体チップや抗体カラム等が挙げられる また、 本発明の抗体またはその断片は、 ィムノアフィニティーク口マトグラフ ィ一によるヒ ト I L一 1 8の精製にも極めて有用である。 この精製方法は、 本発 明の抗体またはその断片をヒト I L— 1 8とそれ以外の物質の混合物に接触させ て抗体またはその断片にヒ ト I L— 1 8を吸着させる工程と、 吸着したヒ ト I L — 1 8を抗体またはその断片から脱着させ、 採取する工程を含むものである。 こ の精製方法によれば、 I L一 1 8を短時間かつ高精度に精製できる。

本発明の抗体またはその断片、 およびそれらの修飾抗体は、 ヒ ト I L— 1 8を 検出するための試薬 （ヒ ト I L一 1 8検出試薬） としても広範な用途を有する。 すなわち、 これらの抗体またはその断片によるラジオィムノアツセィ、 ェンザィ ムィムノアツセィ、 蛍光ィムノアツセィなどの標識ィムノアッセィを適用すると きには、 被検試料中のヒ ト I L一 1 8を迅速且つ正確に定性又は定量分析するこ とができる。 この標識ィムノアッセィでは、 上記抗体またはその断片は、 例えば 、 放射性物質、 酵素及び Z又は蛍光物質により標識して用いられる。 また、 これ らの抗体およびその断片は、 ヒ ト I L一 1 8に特異的に反応し、 免疫反応を呈す るので、 その免疫反応を標織物質を指標に測定すれば、 被検試料中のごく微量の ヒ ト I L一 1 8を精度良く検出することができる。 標識ィムノアッセィは、 バイ オアッセィと比較して、 一度に数多くの被検試料を分析できるうえに、 分析に要 する時間と労力が少なくてすみ、 しかも、 分析が高精度であるという特徴がある 本発明の免疫疾患の診断キット、 および免疫疾患を診断する方法は、 このよう なヒ ト I L— 1 8の検出方法に従い、 被検試料 （血液や体液、 組織など） 中のヒ ト I L一 1 8量を測定し、 その測定結果に応じて免疫疾患の診断を行うものであ る。 なお、 上記 「免疫疾患」 は、 ヒ ト I L一 1 8が関与する疾患であり、 例えば 、 ア トピー性皮膚炎、 気道炎症、 気道過敏性 （AH R ) 、 喘息などが例示される このように、 本発明のヒ ト I L— 1 8の検出器具による検出方法は、 ヒ ト I L 一 1 8を製造する際の工程管理や製品の品質管理に有用である。 また、 本発明の 免疫疾患の診断キットおよび診断方法は、 組織や体液におけるヒ ト I L一 1 8の レベルを指標とする種々の感受性疾患の診断や、 各種免疫疾患の治療評価を行う ために極めて有用である。

なお、 一般に診断用に用いる抗体は、 マウス、 ゥサギ、 ャギなどのヒ ト以外の 動物を免疫して作成される。 しカゝし、 動物の免疫系では、 自己の体を構成する分 子に結合する抗体を産生するリンパ球は、 排除または不活性化される。 つまり、 動物を免疫して作成した抗ヒ ト I L一 1 8抗体のうち、 ヒ ト I L一 1 8と動物の I L - 1 8とで酷似した部分を抗原決定領域とした抗体は含まれない。

これに対し、 本発明の抗体は、 ヒ ト抗ヒ ト I L一 1 8抗体を提示させたファー ジライブラリーからスクリーニングされた抗体である。 このファージには、 動物 のように抗体を排除または不活性化する機構は存在しない。 それゆえ、 本発明の 抗体には動物の免疫では作製できない、 ヒ ト、 サル、 その他各種の動物の I L一 1 8に共通した抗原決定領域に結合特異性を示す抗 I L一 1 8抗体が含まれる。 このような抗体を本発明の検出器具や診断キットに用いれば、 ヒ トのみならずサ ルをはじめとする各種動物疾患モデルにおける I L一 1 8関連疾患を診断するこ とができる。

(5- 2) ヒ ト I L一 1 8活性阻害剤など

上記 （1) の抗体は、 ヒ ト I L— 1 8を特異的に認識するヒ ト由来のヒ ト抗ヒ ト I L— 1 8抗体である。 さらに、 この抗体は、 ヒ ト I L— 1 8に特異的に結合 するとともに、 ヒ ト I L— 1 8の受容体への結合を阻害してこの受容体を介した シグナル伝達も阻害し、 さらには、 ヒ ト I L— 1 8によって誘導される I FN— γの産生も阻害する。

したがって、 この抗体は、 言い換えれば、 ヒ ト I L— 1 8アンタゴニストであ る。 そして、 このヒ ト I L— 1 8アンタゴニストは、 ヒ トインターロイキン一 1 8活性阻害剤として利用することができる。

上記 「ヒ ト I L_ 1 8アンタゴニスト」 としては、 特に限定されるものではな いが、 例えば、 以下の i)〜iv)の物質が挙げられる。

i)上記 （1) に記載の本発明の抗体。

ii)上記 （1) に記載の本発明の抗体の断片。

iii)上記 （1) に記載の本発明の抗体またはその断片の修飾抗体。

iv) i)〜iii)に記載の抗体、 抗体の断片、 または修飾抗体が認識するヒ ト I L一 1 8上の抗原決定領域に基づいて分子設計された低分子化合物。

ここで、 上記 「ヒ トインターロイキン一 1 8活性阻害剤」 は、 ヒ トインター口 ィキン一 1 8の活性を抑制するのはもちろん、 ヒ トインターロイキン一 1 8の受 容体への結合も拮抗的に阻害するもの、 さらには、 ヒ ト I L一 1 8と I L一 1 8 受容体との複合体に結合して、 シグナル伝達を阻害するものであってもよい。 また、 上記 （2) に記載の本発明の遺伝子は、 ヒ ト I L— 1 8が関与する免疫 疾患における遺伝子治療剤として利用することができる。 この遺伝子治療剤を摂 取すれば、 体内で本発明の抗体またはその断片が形成されるので、 上記ヒ ト I L — 1 8活^¾抑制剤と同様の効果が得られる。 なお、 ヒ ト抗 I L一 1 8抗体が、 生 体内で形成され続けると、 ヒ ト I L一 1 8の作用を過剰に抑制してしまう力 ヒ トの場合、 I L一 1 8が欠失したとしても、 I L一 1力 S I L— 1 8と同様の作用 を示すため、 特に問題は生じない。

本発明の抗体は、 ヒ ト I L一 1 8を特異的に認識するヒト由来のヒ ト抗ヒ ト I L— 1 8である。 すなわち、 この抗体のアミノ酸配列は、 従来のキメラ抗体やヒ ト化抗体とは異なり、 すべてヒ ト由来である。

したがって、 本発明の抗体の作用を阻止する抗体 （阻止抗体） が形成される虞 はない。 それゆえ、 たとえ、 この抗体を反復投与または長期投与したとしても、 高レ、安全性を保持したまま、 効果も持続することが可能である。

それゆえ、 本発明のヒ ト I L一 1 8活性阻害剤および遺伝子治療剤は、 ヒ ト I L一 1 8が関与する免疫疾患の治療法として有用な免疫疾患治療剤 （免疫治療薬 ) として利用可能である。

なお、 本発明の免疫疾患治療剤は、 体内でその効果を発揮すればよいので、 例 えば、 配列番号 3に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド （またはこれを 含むヒ ト I L— 1 8活性阻害剤） を投与してもよいし、 プロドラッグ化して体内 で代謝されて当該ポリペプチドが発現されてもよい。 すなわち、 本発明の免疫疾 患治療剤は、 上記 i)〜iv)のヒ ト I L一 1 8アンタゴニスト （ヒ ト I L一 1 8活 性阻害剤） または上記遺伝子治療剤がプロ ドラッグ化されていてもよい。 すなわ ち、 体内で、 活性代謝物となるように、 免疫治療薬剤を修飾してもよい。

また、 本発明の免疫疾患治療薬剤には、 1種類以上の賦形剤、 1種類以上の結 合剤、 1種類以上の崩壊剤、 1種類以上の滑沢剤、 1種類以上の緩衝剤などのよ うに、 医薬品として許容される添加物が含まれていてもよい。

以上のように、 本発明の抗体 （ヒ トモノクローナル抗体） 及ぴ、 当該抗体フラ グメント分子は、 ヒ ト由来抗ヒ ト IL- 18抗体の可変領域を有し、 ヒト IL- 18と強 く反応して、 IL - 18 と IL - 18 受容体間の結合に阻害作用を示す。 さらに、 IL- 18 によって惹起される種々の免疫応答を阻害することができ、 当該免疫応答により 惹起されるアレルギー、 炎症及び免疫異常性疾患の予防または治療薬、 例えば、 抗炎症剤あるいは自己免疫疾患の治療及ぴ予防のための薬剤として使用すること ができる。

また、 本願発明のヒ ト IL- 18に対するヒ ト由来 s c F vは、 IL - 18 と特異的に 結合し、 IL- 18により誘導されるシグナル伝達及び IFN-γ産生を阻害するもので あることが示された。 従って、 当該 s c F V及ぴ s c F Vの V_H鎖及ぴ 鎖を ヒト定常領域またはその一部と結合させたヒ ト抗ヒ ト IL - 18抗体またはその抗体 フラグメントは、 IL- 18 の関与する疾患、 例えば慢性炎症性疾患や自己免疫疾患 等の治療への適用が期待される。 また、 IL - 18 とは結合するが抑制作用を示さな かった抗体を含めてこれらの抗体で、 IL - 18 の血中濃度を測定し、 病態の症状の 変動をモニターすることもできる。

なお、 前述のように本発明の抗体は、 I L一 1 8に対するシグナル伝達及び I N F— i/産生を阻害するので、 そのような特性を有する抗体とヒ ト I L一 1 8と の結合特異性を示す I L一 1 8上の抗原決定領域を明らかにすれば、 低分子化合 物の免疫疾患治療薬の開発への応用が可能となる。 この抗原決定領域を、 ェピト ープという。 このェピトープは、 アミノ酸の 1次配列そのものである場合や、 も しくは、 ペプチド鎖の折り畳まれ方で構築た立体構造である場合がある。 いずれ の場合でも、 例えば、 本発明者等が提案した 「モノクローナル抗体を用いた分子 鎳型デザイン法」 によって、 ェピトープの類似化合物 （ミミック分子） をデザィ ンすることができる （T. Fukumoto et al.， ature Biotechnology, 16 : 267— 270, 1998. ) 。 ここで、 「低分子化合物」 とは、 例えば、 ペプチドや抗体などの 比較的分子量の大きい化合物 （分子量 1万以上） のものではなく、 一般に低分子 医薬として用いられている、 分子量 1万未満、 好ましくは、 分子量 3 0 0 0未満 の化合物を示している。 なお、 低分子化合物の分子量は、 小さいほど好ましい。 なお、 上記低分子化合物として、 ペプチドやさらに低分子量の化合物を創製す る場合、 このミミック分子の分子構造に着目して分子設計を行う、 いわゆる in sillicoプロセスによって、 設計することができる。 このように、 in sillicoに よる分子設計を行うことにより、 安価かつ迅速に、 治療薬となりうる低分子化合 物を、 リード化合物として選抜できる。

具体的には、 例えば、 後述の実施例では、 ヒ ト抗ヒ ト I L一 1 8 s c F V抗体 の CDRは、 配列番号 4〜6， 10〜 1 2に示されている。 一般に、 抗体におい て、 CDRは、 抗原を認識する領域 （部位） である。 すなわち、 CDRは、 抗体 の活性中心となる。 つまり、 実施例 1に示した s c F Vは、 CDRによって、 ヒ ト I L一 1 8を特異的に認識する。 従って、 この CD Rの高次構造と略一致 （好 ましくは完全に一致） するように、 低分子化合物を設計すれば、 その低分子化合 物は、 低分子医薬品として利用できる。 言い換えれば、 低分子化合物は、 CDR のコンフオメーシヨンに近づくように設計する。 なお、 in sillico プロセスの 方法は、 特に限定されるものではないが、 例えば、 SBDD (Structure Based Drug Design), CADD (Conputer- Aided Drug Design)などにより、 CDRが有する官能 基や、 CDRの高次構造に基づいて、 コンピューター上で設計できる。

このようにして設計した低分子化合物は、 抗体のようなタンパク質 （ペプチド ) に比べて、 安定性が高い。 このため、 この低分子化合物は、 取り扱いやすい医 薬品として利用できる。

(5- 3) 免疫疾患治療薬剤の適用例一 1

前述のように、 本発明のヒ ト I L_ 1 8活性阻害剤および遺伝子治療剤は、 ヒ ト I L一 1 8が関与する免疫疾患の治療法として有用な免疫疾患治療薬剤となる 。 ここで、 免疫疾患治療薬剤の適用例について説明する。

Th 1細胞優位な免疫応答は、 一般に、 自己免疫疾患の病態に検討される。 し かし、 Th 1細胞優位な免疫応答は、 Th 2細胞が関与する疾患 （喘息 ·アトピ 一など） に対して、 防御的である。 しかしながら、 最近の研究で、 Th l細胞が 、 T h 2細胞が関与する気道過敏を増大させることに関与することが明らかとな つた。 さらに、 Th l細胞が、 好中球の増加と活性化によって、 気道過敏性 （A HR) を誘導することが示された。

実際、 喘息患者の気道は、 好中球数の増加だけでなく、 I FN— γ， TNF α , および I L一 8レベルの増加も見られる場合がある。 それにもかかわらず、 ど のように Th 1細胞が Th 2細胞の影響を妨げ、 病態を示すのか、 そのメカニズ ムは、 未だ解明されていない。 従って、 気道炎症および気道過敏性が誘導された 場合の、 Th 1細胞の病態への関与を解明することは重要である。

I L一 1 8は、 本来は、 抗 CD 3抗体および I L一 1 2存在下、 Th 1細胞か ら産生する I FN— γを増加させる因子として、 発見された。 このため、 I L一 1 2と I L一 1 8との混合物を注入すると、 in vivo で I F N—T/産生細胞を誘 導して、 Th 2細胞が誘導する I g E応答を阻害する。 しかしながら、 本発明者 等の最近の研究によって、 in vitro で誘導した抗原特異的 T h 1細胞あるいは Th 2細胞を、 ナイーブホストマウス （非感作性ホストマウス） に受動移入後、 ホストマウスを約 1ヶ月間、 無処置で放置しておくと、 移入した各細胞が、 メモ リー表現型の Th 1細胞あるいは Th 2細胞となること、 および、 これらの細胞 を、 経鼻的に投与した抗原、 または、 抗原と I I L一 1 8とにより刺激された場 合に、 ホス ト動物が、 気道炎症を発症することが明らかとなった （T.Sugimoto et. al. , J. EXP. Med.， 2004， 199， 535-545. ) 。 従来の報告は、 I L— 1 3の 中和は、 T h 2細胞が移入されたマウスの、 好酸球の増加と AHRとを阻害する というものであった。 これに対し、 同様の処理をした T h 1細胞が移入されたマ ウスでは、 たとえ、 この処理が、 著しく気道の好酸球の増加を減少させるもので あっても、 AHRが阻害されない。

これらの結果は、 T h i細胞が、 T h 2細胞とは全く異なる様式で、 AHRを 誘導することを示唆している。 Th l細胞は、 抗原と I L一 1 8とによる刺激に 対して、 ユニークな応答を示し、 Th lサイト力イン （I FN— γ) , Th 2サ イ ト力イン （ I L— 9， I L— 1 3) , ケモカイン （RANTE S, M I P— 1 a (マクロファージ由来炎症性タンパク質一 1 α) ， および GM— C S Fを産生 する。 Th 2サイト力インと GM— C S Fは、 主に、 気管支喘息を誘導する因子 として、 広く認められている。 いくつかの研究から、 Th l細胞と T h 2細胞と は互いに阻害しあうものではなく、 むしろ共同することで、 気管支喘息の発症を 誘導するとともに、 その症状を増幅することが示唆されている。 実際、 I FN— γと I L一 1 3との同時投与は、 最も重篤な気管支喘息を誘導する。 本発明者等 が見出した Th 1細胞の新規機能は、 抗原と I L一 1 8とで刺激を受けると、 T h iサイ ト力イン， Th 2サイ ト力イン， GM— S C Fおよぴケモカインを産生 することにより、 様々な炎症性病態を誘導することである。

従って、 ヒ ト Th l細胞も、 同条件下で、 病態を示す可能性がある。

後述の実施例 2では、 ヒ ト T h l細胞が、 抗原と I L一 1 8存在下で、 Th l サイト力イン， Th 2サイ ト力イン， GM— S C Fおよびケモカインを産生する ことが確認された。 この実施例では、 新たに誘導された I L一 1 8 R o!を強く発 現する Th 1細胞が、 抗 CD 3抗体と I L一 1 8とによる刺激によって、 I FN 一 γ, I L— 1 3， GM—C S F, および I L一 8の産生を著しく増加させるこ とが示された。 この結果は、 Th l細胞が、 Th lサイト力イン， T h 2サイ ト 力インだけでなく、 GM— C S F， I L一 8の産生により、 組織の損傷を誘導す る可能性を示している。

このように、 I L一 1 8は、 抗原と共同して Th 1細胞を刺激することにより 、 重篤な気道炎症および AHRを発症する。 従って、 例えば、 前述したヒ ト I L 一 1 8アンタゴニスト（前述の i)〜iv)) は、 その治療薬となる。 ' (5 -4) 免疫疾患治療薬剤の適用例一 2

次に、 免疫疾患治療薬剤の別の適用例について説明する。

これまで、 アトピー性皮膚炎は、 ァレルゲン特異的 I g E抗体依存性の獲得型 アトピーとして考えられていた。 このため、 アレルゲン特異的 I g E抗体を標的 とする、 I g E抗体阻害剤や、 抗アレルギー剤などが、 アトピー性皮膚炎の治療 薬として用いられてきた。 しかし、 これらの治療薬では治癒できない、 または、 再燃を繰り返すアレルギー患者が、 年々増加している。

従来のように、 獲得型ァトピー性皮膚炎 （ I g E抗体依存性ァトピー性皮膚炎 ) を照準とした治療法では無効な、 自然型アトピーの発症おょぴ重症度には、 I L— 1 8が重要な役割を果たしている。

しかし、 そのような症例に対する有効な治療法は、 未だ確立されていない。 Th 2細胞の機能に対し拮抗作用を示す T h 1細胞を、 C p GDNA投与する などの方法で誘導できるが、 同時に誘導される I L— 1 8は Th 1細胞に作用し て、 TH 1型の気管支喘息を誘導することが問題となる。

獲得型ァトピー性皮膚炎 （ I g E抗体依存性ァトピー性皮膚炎） の治療法とし て、 抗原特異的減感作療法が知られているが、 その分子機構は、 未だ解明されて おらず、 治療の有効性も低い。 なお、 減感作療法とは、 I g E抗体が関与する即 時型アレルギー反応 （I型アレルギー反応） の原因抗原であるアレルゲン， 特に 吸入性アレルゲンを生体内に投与し （一般には注射） 、 アレルゲンに対する過敏 反応を軽減させようとする治療法である。

I g E抗体の F c部に特異的で、 F c R 1部への結合を阻害するヒ ト型マウス 抗体が、 Genentic 社で開発され、 アレルギー治療薬として有効であることが報 告されている （Milgrom H. et al.， N. Engl. J. Med. , 1999:341， 1966-73.) 。

また、 、 Th 2サイ トカイン阻害剤は、 抗 I L一 4抗体， 抗 I L— 5抗体， 抗 I L一 1 3抗体、 および、 これらの受容体に対する抗体は、 アレルギー治療薬と しての抗体医薬 （医薬品） になり得ると考えられるが、 未だ、 有効な抗体医薬は 開発されていない。

FK 506に代表される低分子免疫抑制剤の低量使用は、 抗ァレルギ一作用を 発揮するが、 副作用として、 腎障害などが報告されている。

TLR (Toll Like Receptor) を介する刺激を加え、 I L一 1 2の産生を誘導 する手段として、 CpGDNAが注目されている。 この CpGDNAは、 非メチル化 CpGモ チーフを有する DNAである。 CpGDNAは、 特に Thl反応 （マクロファージを活性 化する反応） を強く惹起し、 臨床面での応用が期待されている分子である。 しか し、 CpGDNA は、 前述のように、 同時に誘導される I L— 1 8は Th 1細胞に作 用して、 TH 1型の気管支喘息を誘導することが問題となる。

このように、 アトピー性疾患は、 これまで、 アレルゲン特異的 I g E依存性の 獲得型のアトピー疾患として論じられ、 それを照準とした I g E阻害剤や抗ァレ ルギー剤などが、 治療薬として用いられている。 しかし、 これらの治療薬では、 治癒しない、 あるいは、 再燃を繰り返す患者が年々増加している。

すなわち、 従来の獲得型アトピーを照準とした治療法では、 無効な自然型アト ピーが存在しており、 その発症には、 I L一 1 8が重要な役割を果たしている。 従来の免疫学の考え方では、 Th l細胞誘導は、 Th 2細胞機能を抑制するこ とによって、 抗アレルギー作用を発揮するものと考えられてきた。 しかし、 本発 明者等は、 I L一 1 8力 T h 1細胞を in vivo条件下で刺激することにより、 I NF— γ， I L— 8, 9， 1 3などを産生し、 難知性の気管支喘息を誘導する ことを見出した。 これは、 アレルギー性炎症発症が、 Th lと Th 2とのバラン スが原因であるという、 従来の定説を覆すものである。 つまり、 従来のバランス 是正を目指す治療法を明確に否定するものである。

I L— 4 , 5， 9 , 1 3は、 重要な T h 2サイ ト力インである。 一方、 ロイコ トリェン、 ヒスタミン、 セ口とインなどは、 重要なケミカルメディエーターであ る。 これらを個々に抑制 （阻害） する技術はあっても、 その上流から阻止するも のではない。 すなわち、 各サイ ト力インに直接作用して、 それらの機能を抑制 （ 阻害） する技術はあっても、 各サイ ト力インの産生を上流で、 阻害する技術はな い。 I L _ 1 8は、 上記各サイ ト力インの上流にあることから、 I L一 1 8の活 性を阻害することによって、 アレルギー性疾患 （アレルギー性炎症） に有効であ ると考えられる。

アレルギー性疾患の発症メカニズムには、 活性化 T細胞， 好塩基球， および肥 満細胞が深く関与する。 特に、 アレルゲンによる肥満細胞または好塩基球上の F c ε Rに結合した I g E分子の架橋によって、 これらの細胞が活性化される。 そ の結果、 T h 2サイ トカインとケミカルメディエーターとが産生され、 アレルギ 一性炎症 （アレルギー性疾患） が誘導されると考えられている。 しかし、 アレル ゲンや I g E関与がなく、 感染を契機にアレルギー性炎症が誘導される場合があ る。 抗アレルギー剤， 免疫抑制剤など、 非特異的な治療法は存在するものの、 I L一 1 8を特異的に抑制する技術は開発されていない。

そして、 これまで作製されている抗 I L一 1 8抗体は、 マウス抗体をヒ ト化し たものであるため、 臨床応用できる抗体医薬にはなりえない。

本発明の抗体は、 自然型アトピー （I L— 1 8依存性疾患） を誘導する I L— 1 8に対する、 ヒ ト由来のヒ ト抗ヒ ト I L一 1 8モノクローナル抗体 （完全ヒ ト 型抗体） である。 これまで、 ヒ ト I L一 1 8に対する完全ヒ ト抗体は、 開発され ておらず、 本発明の抗体が、 国際的に唯一のものである。 この抗体は、 臨床適用 しても、 マウス抗体のように、 抗原性を示さない。 従って、 この抗体は、 副作用 のない優れた抗体医薬として利用できる。 これにより、 アレルギー性疾患， 自然 型アトピー， および喘息などの新規な治療法を確立できる。 例えば、 この抗体は 、 従来型の獲得免疫系の異常に基づく獲得型アトピー （ I g E依存性） を照準と した治療法では無効な、 自然型アトピー （I L一 1 8依存性） を標的とした新規 な治療法と確立できる。 後述する実施例に示すように、 この抗体は、 種々の in vitro 系で、 I L— 1 8の活性を抑制した。 特に、 この抗体は、 抗原と I L一 1 8とによる刺激によつ て生じる Th 1細胞からの Th 1サイト力インと Th 2サイトカインとの産生抑 制機能を有している。 この機能は、 I L_ 1 2の作用を損なわない点で重要であ る。

従って、 上記免疫疾患治療薬は、 現在の難病の 1つであるアレルギー性炎症の 治療標的として、 重要な役割を果たす。 さらに、 上記免疫疾患治療薬は、 従来の アレルギー性炎症治療薬と全く異なる新しいタイプの治療薬を創製するために有 用である。

以上のように、 I L_ 1 8は、 Th 1細胞を刺激して、 気管支喘息を誘導する また、 I L— 1 8は、 樹状細胞、 マクロファージなどの免疫系の細胞だけでな く、 皮膚ケラチノサイ ト、 腸管上皮細胞、 気道上皮細胞など、 種々の非免疫系の 細胞からも産生する。

また、 I L— 1 8は、 I L一 1 2の存在下で、 様々な免疫系または非免疫系の 細胞から、 I FN—！ の産生を誘導する。 一方、 I L— 1 8は、 I L— 1 2の非 存在下で、 NKT細胞、 T細胞、 NK細胞から、 I L一 4， I L— 1 3などの T h 2サイ ト力イン （ヘルパー T 2細胞から産生するサイト力イン） の産生を誘導 して、 抗原非特異的に I g E産生を誘導する。

また、 I L一 1 8は、 抗原刺激を受けた Th 1細胞を刺激して、 Th 1サイト 力インに属する I FN— γの産生を増強するばかりカヽ Th 2サイトカインに属 する I L一 9， I L— 1 3、 さらに代表的なケモカインである I L— 8の産生を 誘導する。

また、 I L— 1 8は、 OVA特異的 Th 1型メモリー T細胞を移入したマウス に、 経鼻的に〇VAと共に投与する （ I L— 1 8と O VAとを投与） ことにより 、 肺胞と間質内への好中球 · リンパ球 'マクロファージ '好酸球の強い湿潤像と 、 気道過敏性とを特徴とする Th 1型の気管支喘息を誘導できる。

また、 I L一 1 8は、 抗原 1 g E非依存的に、 直接、 肥満細胞や高塩基球を 刺激する。 その結果、 様々なサイト力インや化学伝達物質の産生を誘導し、 自然 型アトピー （ I L一 1 8依存性炎症） を誘導する。

Th 2細胞依存性の喘息は、 抗 I L一 5抗体、 あるいは、 抗 I L一 1 3抗体に よって、 抑制できる。 しかし、 抗原と I L一 1 8とにより刺激された Th 1細胞 が誘導する喘息に対しては、 これらの抗体による治療は無効である。 本発明の抗 体は、 上記の抗体では無効な喘息の治療に有効である。 すなわち、 本発明の抗体 は、 I L— 1 8によって誘導される喘息 （感染が原因で発症する喘息） に対して 有効である。

本発明は、 I L一 1 8が関与する喘息病態の発見を含み、 かつ、 従来型の獲得 免疫系の異常に基づく獲得型アトピー （ I g E依存性） を標準とした治療法では 無効な自然型アトピー （ I L一 1 8依存性） を標的とする新規な治療法を確立す る上で重要となる。

また、 本発明の抗体は、 自然免疫系と獲得免疫系とを結合する上で重要な役割 を果たすヒト I L一 1 8に対するヒ ト I L— 1 8モノクローナルヒ ト抗体 （抗ヒ ト I L— 1 8抗体） である。

この抗体は、 従来型の獲得免疫系の異常に基づく獲得型アトピー （I g E依存 性） を照準とした治療法では無効な自然型ァトビー （ I L— 1 8依存性） を標的 とした新しい治療法を提供するものである。

さらに、 この抗体は、 アトピー性皮膚炎疾患だけでなく、 喘息や鼻炎， その他 のアレルギー性疾患に対する新規な治療法を提供するものである。 特に、 I L_ 1 8は、 Th l細胞を刺激して、 難治性の気管支喘息を発症する。 このため、 気 道上皮に感染して、 気道上皮細胞から I L一 1 8の産生を誘導する作用を示す病 原体は、 気管支喘息を発症する原因となる。 従って、 この抗体は、 感染によって 発症した喘息に対して有効な治療薬となる。

本発明にかかる抗体およびその断片は、 ヒ ト I L— 1 8の受容体への結合を阻 害するヒト抗ヒ ト I L— 1 8抗体およびその断片である。 従って、 ヒ ト I L一 1 8が原因となる様々な炎症性疾患の治療薬 （治療方法） または予防薬 （予防方法 ) として利用可能である。

また、 本発明は、 例えば、 後述の実施例に示した、 s c F v抗体のうち、 CD Rの高次構造に基づき、 低分子化合物を設計することにより、 I L一 1 8依存の 低分子医薬品 （化学合成薬剤） の開発に重要な手段を提供する。

本発明で得られたヒ ト抗 I L一 1 8抗体は、 感染を契機に増悪するアトピー性 皮膚炎、 難知性の気管支喘息の治療に対して有効である。

本発明のヒ ト抗 I L— 1 8抗体は、 アレルゲン I g Eを原因としない I L— 1 8依存性炎症 （例えば、 自然型アトピー） に対して新規な治療法を確立できる 前述のように、 本発明のヒ ト抗 I L_ 1 8抗体は、 I L— 1 8の受容体への結 合を阻害する。 従って、 この抗体は、 上記のような、 I L— 1 8が原因となって 発症する、 様々な炎症性疾患の治療と予防に有効となる。

本発明では、 ヒ ト 1本鎖抗体 （s c F v) を提示するファージディスプレイラ イブラリから、 I L_ 1 8に特異的に結合する s c F Vの単離に成功した。 この 1本鎖抗体も、 I L一 1 8の受容体への結合を、 特異的に阻害することが可能で める。

以下、 本発明を実施例により詳細に説明する。 なお、 本発明は、 以下の実施例 の記載に限定されるものではなく、 本発明の範囲内で種々の変更が可能である。

〔実施例 1〕

(1 - 1) 健常者からのファージライプラリーの構築

ファージライブラリーの構築は、 J. D. Marks ら （J. Mol. Biol. , 222： 581— 597, 1991) により報告されている方法を参考に、 健常者 20名の末梢血由来リ ンパ球を出発材料として行った。 構築した V_H(Y)— V_K、 V_H(Y)-Vx, ν_Η(μ)-_νκ 、 ν_Η(μ)— ν_λの各サブライプラリーは、 それぞれ l.lxl0⁸、 2. lxl0⁸、 8.4xl0⁷、 5.3xl0⁷クローンの多様性を有すると評価された。

(1 -2) パンユング

ヒ ト IL - 18を 0.1M NaHC0₃1 mLに溶解し、 35mmのディッシュ （岩城） に 4 °C でー晚反応させて固定化した。 次いで、 0.5%ゼラチン B Sを用いて 20°C で 2時間ブロッキングした後、 0. l%Tween20- PBS で 6回洗浄した。 これに、 健 常人由来の抗体ファージライブラリー （1本鎖可変領域断片 （s c F v) 提示フ ァージ液） を 0.9mL (lxl0¹²tu/mL) 加え、 反応させた。

次に、 この反応液を、 0. l%Tween20- PBSで 1 0回洗浄した後、 l.OmLのグリシ ン緩衝液 （PH2.2) を加え、 IL- 18 と結合する s c F v提示ファージを溶出した 。 溶出したファージに、 lM Tris (hydroxymethyl)aminomethane-HCl, (pH9.1 ) を加えて pH を調製した後、 対数増殖期の大腸菌 TG 1に感染させた。 感染後 の TG 1を 3000xg， 1 0分で遠心分離して、 上清を除き、 200pL の 2xYT培地 で懸濁し、 SOBAGプレート （2%グルコース、 lOOpg/ml のアンピシリン含 有 SOBプレート） に播き、 30°Cのふ卵器中でー晚培養した。 生じたコロニーは 適量の 2 XYT培地を加えスクレイパー （Costar) を使って懸濁、 回収した。 この TG 1液 50 iL を、 3 OmL の 2xYT AG培地に植え、 ヘルパーファー ジを用いてレスキューし、 スクリ一二ング後のファージライブラリ一を調製した 。 健常人由来ファージライブラリー ν_Η(γ)— ν_κ、 ν_Η(γ)-ν_λ, ν_Η(μ)-ν_κ V_H — ν_λ、 それぞれについて、 前述の IL- 18固定化プレートを用いてパンニング を計 2回行った。 2回目のパンニング後に、 S OB AGプレートから任意にクロ ーンを抽出し、 s c F Vの発現の確認及ぴ IL- 18 E L I S Aによる特異性の確 (スクリーニング） と塩基配列の解析とを行った。

( 1— 3 ) IL- 18 E L I S Aによるスクリーニング

分離したクローンをスクリ一二ングするための E L I S Aは、 ヒ ト IL- 18を E L I S Aプレートに固定化して行った。 具体的には、 2pg/mL のヒ ト IL- 18、 2.5pg/mL のヒ ト血清アルブミン （HSA) を、 40 pL/well の E L I S Aプレ ート （Nunc) に入れ、 4°Cで 1 6時間静置し、 固定化した。 固定化プレートは、 0.5 % B S A、 0.5 %ゼラチン及ぴ 5 %スキム ミ ルクを含む P B S溶液 400 L/well を E L I S Aプレートに入れ、 4°Cで 2時間静置し、 ブロッキング を行った。

次に、 この E L I S Aプレートに、 s c F V提示ファージを含む試料液 40 μ L/well を入れて反応させた後、 試料液を捨て洗浄液で 5回洗った。 続いて、 こ の固定化された s c F Vファージに、 ピオチン標識した抗 M13モノクローナル抗 体 （Pharmacia biotech) を加え、 アルカリフォスファターゼ （AP) 標識した 抗マウス IgG抗体を二次抗体として反応させた。 この反応液を洗浄液で 5回洗 つた後、 発色基質液 （Ig/mL p-nitrophenyl phosphate (Wako) 、 10%ジェタノ ールァミン （Wako) を含む PB S溶液） を 5 OpL/well入れ、 遮光し、 室温〜 3 7°Cで、 5〜： 1 0分発色させた。 マルチプレートオートリーダー NJ- 2001 (Inter Med) で 405nm の吸光度を測定した結果、 評価したクローン全てが、 IL - 18 に特 異的であることが確認できた。 その結果を図 1に示す。

(1— 4) クローンの配列分析

次に、 単離したクローンの s c F V遺伝子の V_H鎖及ぴ V_L鎖遺伝子の DNA

¾基配歹' J¾T Dye terminator cycle sequencing FS Ready Reaction kit (Applied Biosystems)を用いて決定した。 E L I S A及び配列分析の結果、 単離したクロ ーンは 2種に分類された （h l 8— 40、 h 1 8 - 1 08) 。

なお、 配列番号 1および 7にはクローン番号 h 1 8 - 1 0 8の V_H鎖及ぴ

鎖遺伝子の塩基配列がそれぞれ示される。 また、 配列番号 3および 8にはこの V _H鎖及び V_L鎖のアミノ酸配列が示される。

(1 - 5) ヒ ト抗 IL-18 s c F vの発現と精製

前記 （1一 2、 3) で単離したヒ ト IL- 18 に反応する s c F Vクローン （h 18-40 - h 18-108) からプラスミ ド DNAを回収して、 常法に従って大腸菌 HB1251を形質転換した。 2%グルコース及び 100pg/mlのアンピシリンを含む 2 XYT培地でこれらの大腸菌を一夜前培養後、 グルコースフリ一の 2XYT培地 に一部移植し、 終濃度 ImM IPTG、 100 g/ml のアンピシリンを加えて更に一夜培 養して s c F Vの発現誘導を行った。 培養終了後菌体を遠心回収し、 ImM ED T Aを含む P B Sに懸濁して氷中に 30分菌体を放置した。 次いで 8，900xg で 30分間遠心し、 上清を回収して 0.45μιη フィルター濾過後、 ペリプラズム画分 から s c F Vを精製するための出発材料とした。

このようにして調製した精製のための出発材料を、 抗 E tag抗体を用いたァフ ィニティークロマトグラフィーを用いて、 常法に従って精製した。 PB Sで透析 後、 エンドトキシン除去カラム Detoxi- gel (PIERCE社）で添付のプロトコルに従 いエンドトキシンを除去した。 分子量カット 10， 000の Centricon (Amicon社）で 濃縮後、 0.45μπιフィルター濾過して精製標品とした。

(1 -6) 精製 s c F Vの IL- 18に対する結合性

次に、 精製 s c F V ( h 18-40 - h 18-108) の IL- 18 に対する結合性を EL I S A法で測定した。 P B Sで 0.5 g/mLに調製したヒ ト IL - 18 を固相化した 9 6 穴プレート （NUNC. MAXIS0RP) に、 精製 s c F vを lOOpL加えて 3 7。Cで 1時 間反応させた。 0.05%Tween - PBS (以下 PBSTと省略することもある） で 5回洗浄 後、 パーォキシダーゼ標識抗 E tag抗体と更に 3 7°Cで 1時間反応させた。 PBST で 5回洗浄後、 発色基質液を加えて呈色させ、 405nm の吸光度を測定して結合性 を評価した。 その結果を図 2に示す。 同図に示すように、 2 種の抗体 （h 18 - 40 • h 18-108) は全て IL-18と特異的に結合した。

(1 - 7) IL-18に刺激されたヒ ト骨髄単核球 KG- 1 細胞からの IFN - γ産生に 対する作用

IL- 18(20η_§/100μ L)と scFv とを反応させた後に、 KG-l cell(3xl0⁵ cells/ 100 μ L )培養液に加え、 24 時間後の培養上清中における IFN- γ量を ELISA(Biosource)により測定した。 scFv ( h 18-40 - h 18-108) に関して IL - 18 阻害活性を KG- 1 cellの IFN- γ産生で調べた結果、 コントロールおよび scFv ( h 18-40) では阻害活性は見られなかったが、 scFv (h 18-108) は濃度依存的に KG - 1 cellの IFN-γ産生を抑制した。 図 3に、 その結果を示す。

(1 - 8) IL-18のヒ ト骨髄単核球 KG- 1 細胞への結合阻害作用

ビォチン標識 IL- 18(400ng/ 50 L)と scFv (コントロールまたは h 18-108) とを反応させた後に KG - 1 celKlxlO⁶ cells/ 50 L ) 培養液に加え、 phycoerythrin標識ストレプトァビジン （Becton Dickinson)を反応させフロー サイ トメ トリー解析（Beckman Coulter) を行った。

図 4および 5に示すように、 scFv (h 18-108) が IL- 18の KG-l cellへの結合 を阻害するかをフローサイ トメ トリー解析で調べた結果、 コントロール scFv は IL-18 の結合に変化は見られなかったが （図 4) 、 h 18-108 は IL- 18 の KG - 1 cellへの結合を濃度依存的に阻害した （図 5) 。

(1 - 9) scFv (h 1 8 - 1 08) の特性

ヒ ト IL- 18 に対する特異性を示した scFvh 1 8— 1 08について、 ゥエスタ ンブロッテイングを行った結果、 図 6に示すように、 分子量は約 30 kDa であ つた。 また、 ゲルろ過クロマトグラフィーを行った結果、 図 7に示すように、 分 離パターンから、 9割がモノマーの s c F Vを形成し、 残りの 1割がダイマーを 形成していることが確認された。 〔実施例 2〕

実施例 2では、 I L一 1 8によつて刺激した T h 1細胞および T h 2細胞から 産生するサイ トカインについて検討した。

( 2 - 1 ) 試薬

組み換えヒ ト I L一 2 , I L - 4 , I L— 1 2， および I F N— γは、 R&D (

Minneapolis, MN) から入手した。 組み換え I L— 1 8は、 MB L社 （名古屋 日本） から入手した。 F I T C (フルォレセインイソチオシァネート） 一抗ヒ ト C D 4 mA b (モノクローナル抗体） または CyChrome (シトクロム） 一抗ヒ ト CD 4 mA b , FITC -抗ヒ ト CD 4 5 R AmA b , FITC—抗ヒ ト I F N— γ mA b， P E—抗ヒ ト I L— 1 3 mA b , およぴ抗ヒ ト I L— 1 2 m A bは、 Pharmingen (San Diego, CA) から入手した。 PE -抗ヒ ト I L一 1 8 R o; mA b ( クローン 70625) , 抗ヒト CD 3 ε mA b、 および抗ヒ ト I L一 4 mA bは、 R &Dから入手した。

( 2 - 2) in vitroでの T h 1細胞または T h 2細胞の作製

健常なドナー末梢血から、 ナイーブ C D 4 + CD 4 5 RA + T細胞 （CD 4お よび C D 4 5陽性 T細胞） を単離した（K. Nakanishi et. al. , Int. Immunol. 12:151.)。 PHA (1 g /mL) ， IL一 12 (50 μ g /mL) , および中和抗 IL一 4mA b (500ng/mL) 、 または、 PHA (l μ g /mL) ， IL一 4 (200 μ g /mL) , および 中和抗 IL- 12mAb (ΐθ g/mL) とともに、 2 4ゥエルプレートで、 CD 4 + C D 4 5 RA + T細胞 （lX10⁶/mL) を培養することにより、 T h l細胞おょぴ T h 2細胞を作製した。 このようにして刺激した T細胞を、 3日目に洗浄し、 培地に I L— 2を lOOU/mLを加え、 さらに 4日間培養した。

( 2 - 3 ) I F N- γ +T h 1細胞の単離

I F N-γ +T h 1細胞を単離するため、 分極化した T h l細胞を、 固定化抗 CD 3 ( 5 μ g/mL) および I L— 2 ( 1 0 0 U/mL) とともに、 2 4ゥェ ルプレート中で培養した。 次に、 その培養物に、 生存する T h 1細胞が I F N— yの発現を豊富にする処理を行った。 3時間後、 付着細胞のみを、 回収し、 抗 C D 4 5 /抗 I F N— γ二重特異性抗体 （Miltenyi Biotec) と共に、 5分間氷上

しペートした。 処理した細胞を 5 O mLの底部が円錐状の試験管に移し 、 その試験管を 3 7 °Cの水浴に配し、 20m lの温めた培養液中で 5 X 1 0⁴細 胞 Zm 1の濃度で細胞を培養した。 30分後、 冷却した 0. 5 %ゥシ血清アルブ ミン （B SA) を含むリン酸緩衝液溶液 （PB S) で、 細胞を洗浄した。 細胞表 面で捕捉された I FN— γを、 PE—抗ヒ ト I FN— γを用いて検出した。 また 、 自動 MACSを用いる抗 ΡΕマイクロビーズにより、 表面に I FN— τ/を発現 した Th l細胞を、 確実に単離した。

( 2 - 4 ) in vitro 培養

新たに分極化した Th 1細胞おょぴ Th 2細胞、 および、 新たに分極化した T h 1細胞から選別した I FN— γ ⁺細胞を、 種々の濃度の I L一 1 8存在下、 固 定化抗 CD 3 ( 5 μ g/mL) を含んだ 1 X 10⁵/0.2mL/ゥェルで再培養した。 培 養開始から 6時間から 72時間経過後、 上澄を回収し、 I L一 4, I L一 5， I L- 8 , I L— 1 3， I FN- 7 , および GM— C S Fの含有量を、 EL I SA (R&G) により測定した。

(2 - 5) フローサイトメ トリー

分極化した Th l細胞 （lX10⁶/mL) を、 24ゥエルプレートで、 固定化 CD

3のみ、 および、 固定化 CD 3と I L_ 1 8 (100 n g/mL) とにより、 7 2時間 再刺激した。 最後の 3時間は、 サイト力インの分泌を阻害するため、 2 μΜのモ ネンシンを添加した。 細胞質内の I FN- γ⁺、 および/または I L— 1 3+細胞 の染色による分析は、 文献 （K. Nakanishi et. al.， J. EXP. Med.， 2004, 199， 535-545. ) に従って行った。 T h 1細胞および T h 2細胞上の I L一 1 8 R αの 発現量を測定するため、 ヒ ト I gGによる F c Rのブロッキング後、 各細胞を、 F I TC抗ヒ ト CD4、 および PE抗ヒ ト I L— 1 8 0；鎖111八13またはコント ロール P E—マウス I g G 1 mAbにより、 30分間、 4°Cで、 1 % F C Sを含 む P B S中でインキュベーションした。 このようにして得られたサンプルを、 F AC S C a l i b u r (BD Bioscience, San Jose, CA) によって分析した。

(2 -6) 実験結果

(2-2) 〜 （2— 5) に従い、 健常なドナー末梢血から単離したナイーブ C D 4 + CD 45 RA + T細胞を、 in vitro で、 T h 1細胞おょぴ T h 2細胞を誘 導する条件下、 連続して 7日間刺激した。 その結果を、 図 8に示す。 なお、 図 8では、 固定化抗 CD 3のみにより刺激し た結果 （ α— C D 3 ) と、 固定化抗 C D 3と I L— 1 8とにより刺激した結果 （ α— CD 3 + I L— 1 8) を示している。

図 8に示すように、 固定化抗 CD 3を用いた試験では、 Th 2細胞は、 かなり の量の I L一 4， I L— 5， および I L_ 1 3を産生したが、 I FN— γを産生 しなかった。 また、 Th l細胞は、 主に、 I FN— γ , I L_8， GM— C S F を産生した。

また、 図 8に示すように、 固定化抗 CD 3に加えて I L一 1 8により刺激して も、 Th 2細胞からの Th 2サイ ト力インの産生は、 増加しなかった。 これに対 し、 その処理によって、 T h 1細胞からの I FN— γ， I L— 8, I L— 1 3， および GM— C S Fの産生は、 著しく増加した。

Th 1細胞と Th 2細胞との I L— 1 8に対する応答の違いの根本となるメカ ニズムは、 主に、 Th 1細胞上への I L一 1 8 R α鎖の発現の選択性によって説 明できる。 図 9は、 上記の刺激による、 各細胞の表面の I L_ 1 8 Rひ鎖の発現 レベルを示す図である。 図 9に示すように、 ヒ ト Th l細胞は、 髙レベルの I L 一 1 8 R α鎖を発現するのに対し、 Th 2細胞は、 I L一 1 8 Rひ鎖の発現量は 、 わずかである。 したがって、 I L— 1 8 Rを発現する Th 1細胞は、 抗 CD 3 と I L— 1 8とに応答して、 Th lサイ ト力イン， Th 2サイ ト力イン， および GM- C S Fを産生する性質を示す。

同時に、 固定化抗 CD 3により刺激を受けた Th 1細胞の、 I L一 1 8投与量 による応答性 （ I FN— T/ , I L- 8 , I L一 1 3の産生） について検討した。 そこで、 Th l細胞を、 種々の濃度の I L— 1 8 (〜500ng/mL) により、 固定化 抗 CD 3存在下、 3日間、 刺激した。 図 1 0は、 I L— 1 8の用量と、 Th l細 胞からのサイ トカインの産生量との関係を示すグラフである。 図 1 0に示すよう に、 Th l細胞は、 I L— 1 8存在下、 用量依存的に、 I FN— γ , I L— 8， I L- 1 3の産生が増加した。 なお、 抗 CD 3刺激を受けた Th 2細胞を、 I L — 1 8によりさらに刺激しても、 サイ ト力イン産生の応答は、 増加しなかった。 したがって、 図 1 0に示すように、 ヒ ト Th 1細胞のみが、 抗原と I L一 1 8と の刺激に応答し、 Th lサイ ト力イン、 Th 2サイト力インばかりでなく、 GM 一 CS F， I L一 8を産生するという、 特有の作用を示した。

このように、 I L一 1 8は、 分極化したヒ ト T h 1細胞からの I FN— γ , I L— 8， I L— 1 3および GM— C S F産生を誘導した。

次に、 抗 CD 3と I L一 1 8による刺激後のサイ トカインの産生の速度論を検 討した。 図 1 1は、 Th 1細胞の刺激後の培養時間と、 Th l細胞からのサイ ト 力インの産生量との関係を示すグラフである。 図 1 1に示すように、 Th l細胞 は、 刺激後、 比較的早期に、 I FN— γを産生し始めた。 抗 CD 3による刺激の 24時間後でさえ、 大量の I FN— _γが検出された。 これに対し、 その時点では 、 I L— 8も I L— 1 3も検出されなかったが、 刺激から 7 2時間後、 I L一 8 および I L— 1 3が検出された。 通常は 48時間の測定を行うため、 当初、 Th 1細胞は、 I FN— γのみを産生するとみなしていた。 し力 し、 図 1 1に示すよ うに、 72時間後に、 I L一 8および I L— 1 3を検出することができた。 抗 C D 3に刺激された Th 1細胞を、 さらに I L— 1 8によって刺激することにより 、 上記のサイ ト力インを、 より早く、 より多く産生することが、 最も重要である 。 このように、 I L— 1 8刺激は、 T h 1細胞からの I FN— y， I L一 8， I L— 1 3の産生を促進し、 増加させた。

前述のように、 I L一 1 8刺激は、 用量依存的に、 抗 CD 3の刺激を受けた T h 1細胞からの I FN— y , I L_ 1 3の産生を誘導する （図 1 0) 。 しかし、 Th 0細胞が、 抗原と I L_ 1 8とに対する応答に、 I FN— γおよび I L一 1 3を産生する可能性を排除する必要がある。 そこで、 この可能性を排除するため に、 I L一 1 8刺激を受けた Th 1細胞における、 細胞質 I FN— yおよぴ /ま たは I L一 1 3に陽性の CD 4 +T細胞の割合を、 F AC S分析によって検討し た。 その結果を、 図 1 2に示す。

図 1 2に示すように、 固定化抗 CD 3と I L— 1 8とにより刺激されたヒ ト T h 1細胞の 5. 6 5 %が、 細胞質 I NF— yおよび I L— 1 3に陽性であつた。 ところが、 抗 CD 3のみによって処理した Th 1細胞のわずか 1. 2 1 %が、 細 胞質 I NF— γおよび I L— 1 3に陽性であった。 細胞内 I FN_ yまたは I L 一 1 3染色の特異性は、 アイソタイプが適合するコントロール抗体では染色され ないことから示されている。 さらに、 このような染色は、 過剰の組み換えヒ ト I FN- 7 s または、 I L_ 1 3による前処理によって完全に阻害される （データ は示さず） 。 このように、 Th 1細胞が、 抗 CD 3と I L一 1 8とにより刺激さ れた時に、 I FN— γおよび I L— 1 3を産生した。

次に、 I L一 1 8による I FN— γ+Th 1細胞からの I L— 1 3産生の誘導 について検討した。 I FN— yを産生する Th 1細胞も、 抗 CD 3と I L— 1 8 とによる刺激を受けると、 I L— 1 3を産生する可能性を検討することは重要で ある。 そこで、 I FN— γを発現するヒ ト Th 1細胞から分泌された I FN—γ を、 その T h 1細胞の表面に固定化した抗 I FN— γ抗体によって得ることによ り精製した。

図 1 3は、 抗 CD 3抗体刺激を受けた Th 1細胞中の、 I FN— γ+Th l細 胞の割合と、 I FN—y+Th 1細胞の陽性選別例とを示す図である。 図 1 3に 示すように、 抗 CD 3抗体で刺激を受けた T h 1細胞の 23. 1 %が、 細胞表面 で I FN— γを発現した。 次に、 I FN—γを細胞表面に発現する Th 1細胞 （ 1 1^ー ⁺丁11 1細胞） を、 自動 MAC Sを用いて、 陽性選別した。 99%の 純度で I FN— γ +CD 4 + T h 1細胞を、 精製できた。 得られた I FN— γ +T h 1細胞を、 抗 CD 3と I L_ 18と共に培養し、 刺激した。 図 14は、 この刺 激による、 I FN— Y+Th 1細胞からのサイ トカインの産生量を示すグラフで ある。 図 14に示すように、 その刺激によって、 I FN— γ, I L- 8 , および I L一 1 3の産生は、 かなり増加するが、 I L一 4の産生は増加しなかった。 従 つて、 高度に精製された I FN— γを発現する生きたヒ ト Th 1細胞は、 その細 胞表面に I L_ 1 8 Rひ鎖を強く発現しており、 抗 CD 3と I L— 1 8とによる 刺激を受けると、 I FN-γ, I L一 8， および I L— 1 3を産生すると結論づ けることができる。 この結果は、 ヒ ト Th l細胞が、 その TCR (T細胞抗原レ セプター） に抗原が結合し、 さらに、 I L— 1 8が作用すると、 刺激を受けた T h i細胞が、 I FN— γ， I L— 8， および I L— 1 3の産生を増強することを 示している。 なお、 図 8， 1 0， 1 1, 1 3および 14では、 独立した 4回の実 験の代表値であり、 各実験では、 同様の結果が得られた。

以上のように、 Th l細胞が、 抗原と I L— 1 8とによって刺激されると、 T h iサイ ト力イン （I FN— γなど） ， Th 2サイト力イン （I L一 9, I L— 1 3) ， ケモカイン （RANTE S, M I P- 1 α , および GM— C S Fを産生 する。 気管支上皮に対する I FN— γと I L一 1 3との刺激が、 最も重篤な気管 支喘息を誘導する。 従って、 実施例 1の s c F Vを投与して、 I L一 1 8の活性 を阻害することにより、 重篤な気管支喘息の治療が可能となる。

尚、 発明を実施するための最良の形態の項においてなした具体的な実施態様ま たは実施例は、 あくまでも、 本発明の技術内容を明らかにするものであって、 そ のような具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなく、 本発明の精 神と次に記載する特許請求の範囲内で、 いろいろと変更して実施することができ るものである。 産業上の利用の可能性

以上のように、 本発明のヒト I L— 1 8に対する抗体おょぴその断片は、 ヒ ト 由来のものである。 それゆえ、 ヒ ト I L— 1 8が直接または間接的に関与する疾 病の治療において、 反復投与や長期投与を行っても、 顕著な治療効果と高い安全 性とを維持した治療薬を提供できるという効果を奏する。

Claims

請求の範囲

1. ヒ トインターロイキン一 1 8に対する、 ヒ ト抗ヒ トインターロイキン一 18 几体。

2. 以下の （a) または （b) のポリペプチドからなる H鎖の相補性決定領域と 、 (c) または （d) のポリペプチドからなる L鎖の相補性決定領域とを含む請 求の範囲 1に記載のヒ ト抗ヒ トインターロイキン一 1 8抗体。

( a ) 配列番号 4〜 6に示されるァミノ酸配列からなるポリぺプチド。

(b) 配列番号 4 ~ 6に示されるアミノ酸配列において、 1またはそれ以上のァ ミノ酸が置換、 欠失、 挿入、 および/または付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ、 ヒ トインターロイキン一 18に対する H鎖の相補性決定領域となるポリぺ プチド。

( c ) 配列番号 10〜 12に示されるァミノ酸配列からなるポリぺプチド。 (d) 配列番号 10〜 12に示されるアミノ酸配列において、 1またはそれ以上 のアミノ酸が置換、 欠失、 挿入、 およぴノまたは付加されたアミノ酸配列からな り、 かつ、 ヒ トインターロイキン一 18に対する L鎖の相補性決定領域となるポ リぺプチド。

3. 以下 （e) または （f ) のポリペプチドからなる H鎖可変領域と、 （g) ま たは （h) のポリペプチドからなる L鎖可変領域とを含む請求の範囲 1または 2 に記載のヒ ト抗ヒ トインターロイキン一 18抗体。

( e ) 配列番号 3に示されるァミノ酸配列からなるポリぺプチド。

( f ) 配列番号 3に示されるアミノ酸配列において、 1またはそれ以上のァミノ 酸が置換、 欠失、 揷入、 およびノまたは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ 、 ヒ トインターロイキン一 18に対する H鎖可変領域となるポリべプチド。

( g ) 配列番号 9に示されるァミノ酸配列からなるポリぺプチド。

(h) 配列番号 9に示されるアミノ酸配列において、 1またはそれ以上のァミノ 酸が置換、 欠失、 揷入、 および/ または付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ 、 ヒ トインターロイキン一 18に対する L鎖可変領域となるポリペプチド。

4. 以下 （e) または （f ) のポリペプチドからなる、 ヒ トインターロイキン一 1 8に対するヒ ト由来の抗体の H鎖可変領域断片。

( e ) 配列番号 3に示されるァミノ酸配列からなるポリぺプチド。

( f ) 配列番号 3に示されるアミノ酸配列において、 1またはそれ以上のァミノ 酸が置換、 欠失、 揷入、 および Zまたは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ 、 ヒ トインターロイキン一 1 8に対する H鎖可変領域となるポリペプチド。

5 . 以下 （g ) または （h ) のポリペプチドからなる、 ヒ トインターロイキン一 1 8に対するヒ ト由来の抗体の L鎖可変領域断片。

( g ) 配列番号 9に示されるァミノ酸配列からなるポリぺプチド。

( ) 配列番号 9に示されるアミノ酸配列において、 1またはそれ以上のァミノ 酸が置換、 欠失、 挿入、 および Zまたは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ 、 ヒ トインターロイキン一 1 8に対する L鎖可変領域となるポリべプチド。

6 . 請求の範囲 2に記載の H鎖の相補性決定領域を含む H鎖可変領域断片または 請求の範囲 4に記載の H鎖可変領域断片と、 請求の範囲 2に記載の L鎖の相補性 決定領域を含む L鎖可変領域断片または請求の範囲 5に記載の L鎖可変領域断片 とを連結してなる、 ヒ トインターロイキン _ 1 8に対するヒ ト由来の抗体の 1本 鎖可変領域断片。

7 . 請求の範囲 2に記載の H鎖の相補性決定領域を含む H鎖可変領域断片または 請求の範囲 4に記載の H鎖可変領域断片、 およびノまたは、 請求の範囲 2に記載 の L鎖の相補性決定領域を含む L鎖可変領域断片または請求の範囲 5に記載の L 鎖可変領域断片に、 ヒ ト由来の定常領域を連結してなる、 ヒ トインターロイキン - 1 8に対するヒ ト由来の抗体またはその断片。

8 . 上記抗体の断片が、 F a b、 F a b ' 、 F ( a b ' ) ₂、 s c A b、 または s c F v F cである請求の範囲 7に記載の抗体の断片。

9 . 請求の範囲 1〜8のいずれか 1項に記載の抗体またはその断片に、 修飾剤が 結合されてなる修飾抗体。

1 0 . 請求の範囲 1〜8のいずれか 1項に記載の抗体またはその断片をコードす

1 1 . 配列番号 1または 7に示される塩基配列をオープンリーディングフレーム 領域として有する請求の範囲 1 0に記載の遺伝子。

1 2 . 請求の範囲 1 0または 1 1に記載の遺伝子を含む組換え発現ベクター。

1 3 . 請求の範囲 1 0または 1 1に記載の遺伝子が導入された形質転換体。

1 4 . 請求の範囲 1 0または 1 1に記載の遺伝子を宿主に発現させることによつ て、 ヒ ト由来のヒ ト抗ヒ トインターロイキン一 1 8抗体またはその断片を生産す る方法。

1 5 . 請求の範囲 1〜8のいずれか 1項に記載の抗体またはその断片、 または請 求の範囲 9に記載の修飾抗体を用いたヒ トインターロイキン一 1 8の検出器具。

1 6 . 請求の範囲 1〜8のいずれか 1項に記載の抗体またはその断片、 または請 求の範囲 9に記載の修飾抗体を含むヒ トインターロイキン一 1 8検出試薬を用い て、 被検試料中のヒ トインターロイキン一 1 8量を測定する免疫疾患の診断キッ 卜。

1 7 . 請求の範囲 1 6に記載の検出試薬を用いて測定した被検試料中のヒ トイン ターロイキン _ 1 8量に基づいて免疫疾患を診断する方法。

1 8 . ヒ トインターロイキン一 1 8アンタゴニス トを有効成分とするヒ トインタ 一ロイキン 1 8活性阻害剤。

1 9 . 上記ヒ トインターロイキン _ 1 8アンタゴェス トが、 以下のいずれかの物 質である請求の範囲 1 8に記載のヒ トインターロイキン 1 8活性阻害剤。

i)請求の範囲 1〜3のいずれか 1項に記載のヒ ト抗ヒトインターロイキン一 1 8抗体

ii)請求の範囲 4〜 8のいずれか 1項に記載の抗体の断片

iii)請求の範囲 9に記載の修飾抗体

iv)上記 i) 〜iii)のいずれかに記載の抗体、 抗体の断片、 または修飾抗体が 認識するヒ トインターロイキン一 1 8上の抗原決定領域に基づいて分子設計され た低分子化合物。

2 0 . 請求の範囲 1 0または 1 1に記載の遺伝子を含む遺伝子治療剤。

2 1 . 請求の範囲 1 8または 1 9に記載のヒ トインターロイキン一 1 8活性阻害 剤、 または請求の範囲 2◦に記載の遺伝子治療剤を含む免疫疾患治療剤。

2 2 . 請求の範囲 2 1に記載の免疫疾患治療薬を投与することによる免疫疾患の 治療方法。

2 3 . 抗原とヒトインターロイキン一 1 8とによる刺激によってヘルパー T 1細 胞から産生するサイ トカインを阻害することを特徴とする請求の範囲 2 1に記載 の免疫疾患治療剤。

2 4 . ヒ ト I L一 1 8が関与するアレルギー、 炎症、 慢性免疫異常疾患に適用す るものであることを特徴とする請求の範囲 2 1または 2 3に記載の免疫疾患治療 剤。