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WO2004083367A2 - Cellules lyophilisees et procede de lyophilisation permettant l’obtention desdites cellules. - Google Patents

Cellules lyophilisees et procede de lyophilisation permettant l’obtention desdites cellules. Download PDF

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WO2004083367A2
WO2004083367A2 PCT/FR2004/000561 FR2004000561W WO2004083367A2 WO 2004083367 A2 WO2004083367 A2 WO 2004083367A2 FR 2004000561 W FR2004000561 W FR 2004000561W WO 2004083367 A2 WO2004083367 A2 WO 2004083367A2
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lyophilized
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lyophilized cells
ampoules
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Jean Gabert
John Saldanha
Peter Phillips
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Universite De La Mediterranee
Institut National De Controles Et De Standards Biologiques
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions

Definitions

  • Lyophilized cells used as standards or controls for the assay of intracellular nucleic acid sequence (s), their epigenetic modifications or their products, and lyophilization process allowing the production of said cells.
  • the invention relates to lyophilized non-living cells derived from prokaryotic or eukaryotic organisms and their use as standards or controls for the assay of intra cellular nucleic acid sequences (RNA or DNA), their epigenetic modifications or their products (proteins). , etc).
  • the invention also relates to a method implemented for obtaining these cells.
  • the solution provided locally is the development of a reference sample by building up a large stock of material (cells or ribonucleic acid) stored either in nitrogen or at - 80 ° c at least, setting the problem of keeping the cold chain and the limited quantity of equipment available.
  • lyophilized cells overcomes these drawbacks. Indeed, lyophilized cells, containing the product to be assayed such as for example a ribonucleic acid sequence, have the following advantages:
  • these lyophilized cells can be distributed at room temperature (around 15 ° C to 28 ° C) by simple mail regardless of the distance to be traveled in the world.
  • the lyophilized cells are obtained by implementing the method described below:
  • the cells to be lyophilized are chosen from; , all cells can be produced in large quantities.
  • it will be a single cell line, or a mixture of cell lines from the same organism or from several eukaryotic or prokaryotic organisms.
  • the choice of cell line or cell mixture to be lyophilized is adapted according to the marker (s) to be analyzed or assayed.
  • the cells are cultured in their growth medium until the exponential phase. They are then collected at this phase, then washed in a buffer type saline phosphate buffer at 2X concentration, preferably at pH 7.2, and resuspended in this buffer at the desired concentration per ampoule, for example 3.10 6 cells per ml.
  • the ampoules are washed with acid then rinsed thoroughly, and then dried, marked and put in the oven.
  • the cells are then distributed in vials (1 ml / vial) and kept at + 4 ° C until the aliquoting is complete.
  • the ampoules are then placed in the lyophilizer, and lyophilized according to the protocol described below:
  • a hypertonic buffer preferably chosen from the range of products below: tris, phosphate , borate, acetate, hepes, etc.
  • the cell concentration can be taken between 10 4 and 10 9 cells per ml depending on the type of dosage.
  • the drying of the cells can be carried out with or without the assistance of a pressure reduction.
  • the presence of a cryoprotector or a lyophilization protector may be necessary.
  • the assay can be either absolute or relative (by comparison between samples) and this whatever the methods used to express the results.
  • Example 1 Determination of the BCR ABL transcript (ribonucleic acid) by the quantitative real-time PCR technique (RQ-PCR) after reverse transcription in the lyophilized line K562.
  • the cells of the K562 line or the Tom1 line were cultured until the exponential growth phase where they are harvested and lyophilized at a concentration of 2-3 ⁇ 10 6 cells / aliquot.
  • the bulbs used are with screw cap.
  • These halobutyl silicone caps are washed in an industrial ethyl alcohol and air dried. They were put in a bag and autoclaves before use.
  • the caps are fixed on the neck of the ampoules and they are freeze-dried by placing them directly on pre-cooled shelves in a Serail type freeze-dryer (CS -15 or CS-100). After lyophilization, the ampoules are rinsed with liquid nitrogen. Then the screw caps are put in place and locked by hand.
  • the freeze-drying cycle stopped on day 50 for the batch (01/604) is 50 days.
  • the vials containing the cells were placed on shelves precooled to -50 ° C and frozen at -50 ° C for 720 minutes (12 hours).
  • the vacuum was then applied to a level of 100 ⁇ bar and the shelves kept at -50 ° C for another 780 minutes.
  • the temperature of the shelves was then raised to -45 ° C over a period of 25 minutes and then held at -45 ° C for 720 minutes.
  • the temperature of the shelves is then increased to -35 ° C over 50 minutes and maintained at -35 ° C for 360 minutes.
  • the temperature of the shelves is then increased to -25 ° C over 50 minutes and maintained at -25 ° C for 720 minutes. .
  • the temperature of the shelves is then increased to -15 ° C over 50 minutes and maintained at -15 ° C for 360 minutes.
  • the temperature probe indicated an inflection in the temperature of the product at -25 ° C which suggests that the primary drying was complete for the ampoule containing the probe at this time.
  • the temperature of the shelves is then raised to 0 ° C over 75 minutes and maintained at 0 ° C for 120 minutes.
  • the temperature of the shelves was then raised to 25 ° C over 125 minutes.
  • the vacuum is then accentuated by SO ⁇ bar and the temperature maintained at 25 ° C for 24 hours for the second drying.
  • the temperature of the shelves is then reduced to 22 ° C and the vacuum maintained until the bulbs are removed.
  • Example 2 Analysis of the expression profile of 2 ampoules of the lyophilized K562 line.
  • the assay using lyophilized cells can be applied to any nucleic acid sequence or its products, extracted from cells present in a prokaryotic or eukaryotic organism, in particular plants, animals and man.
  • nucleic acid sequences or their product (s) which it is desired to assay can be normal or modified in particular by mutation either naturally or artificially. These nucleic acid sequences can be present naturally in the organism, or introduced artificially by any process, in particular by transfection or transduction in cells or transgenic organisms.
  • lyophilized cells can find application in various fields, and for example:
  • nucleic acid assay 1.1. Genomic DNA o
  • PCR techniques in particular quantitative real-time PCR of one or a few nucleic acid sequences of the genome or any technique allowing precise dosing.
  • Analyzes by comparative genomic hybridization in particular analyzes by "CGH array” which allow the detection and measurement of amplifications and deletions of genomic sequences between 2 samples. o Any technique resulting from the combination of the techniques mentioned above.
  • nucleotide sequences deposited on this support for example PCR products or oligo nucleotides from 10 to 100 seas;
  • any technique in particular high-speed and / or automated, allowing the measurement of a cellular protein mixture, in particular the protein profiles measured by techniques involving mass spectroscopy techniques.
  • lyophilized cells also makes it possible to envisage different types of measurement, and for example:

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Abstract

L'invention concerne des cellules lyophilisées non vivantes issues d'organismes procaryotes ou eucaryotes et leur utilisation comme standards ou contrôles pour le dosage de séquences d'acides nucléiques intra cellulaires (ARN ou ADN), de leurs modifications épigénétiques ou de leurs produits (protéines, etc.). L'invention vise également un procédé mis en oeuvre pour l'obtention de ces cellules.

Description

Cellules lyophilisées utilisées comme standards ou contrôles pour le dosage de séquence(s) d'acides nucléiques intra cellulaires, de leurs modifications épigénétiques ou de leurs produits, et procédé de lyophilisation permettant l'obtention desdites cellules.
L'invention concerne des cellules lyophilisées non vivantes issues d'organismes procaryotes ou eucaryotes et leur utilisation comme standards ou contrôles pour le dosage de séquences d'acides nucléiques intra cellulaires (ARN ou ADN), de leurs modifications épigénétiques ou de leurs produits (protéines, etc). L'invention vise également un procédé mis en œuvre pour l'obtention de ces cellules.
II n'existe pas actuellement de matériel de référence de composition complexe permettant la comparaison et donc l'analyse de la reproductibilité des dosages des technologies innovantes telles que la PCR quantitative en temps réel ou les analyses à grande échelle (de quelques marqueurs à des milliers/millions de marqueurs en une seule réaction). La disponibilité d'un tel matériel de référence (standards et contrôles) est indispensable tant dans le domaine de la recherche que dans le domaine des dosages biologiques en médecine ou pour établir des éléments de traçabilite fiables dans les animaux et/ou plantes et/ou végétaux transgéniques.
Notamment, il n'existe pas de matériel de référence universel :
• ni pour les dosages innovants transférés actuellement dans les laboratoires hospitaliers, et éventuellement à l'avenir dans les laboratoires de ville pour le monde médical
• ni pour les technologies innovantes qui sont aujourd'hui du domaine de la recherche mais dont des applications ciblées vont représenter les dosages de demain notamment dans le domaine de la médecine.
La solution apportée localement est le développement d'un échantillon de référence par constitution d'un grand stock de matériel (cellules ou acide ribonucléique) conservé soit dans l'azote, soit à - 80°c au moins, posant le problème de la conservation de la chaîne du froid et celui de la quantité limitée du matériel disponible.
Dans tous les cas, rien n'assure que le marqueur dosé possède la même fourchette de dosage entre les laboratoires.
Plus encore, pour les études de standardisation ou de contrôles de qualité sur les dosages des acides ribonucléiques qui sont particulièrement instables, leur transport doit se faire en colis spéciaux tout en respectant la chaîne du froid (utilisation de carbo glace), ce qui pose à l'évidence des problèmes de coût et des problèmes légaux notamment dans les transports aériens.
L'utilisation de cellules lyophilisées permet de remédier à ces inconvénients. En effet, les cellules lyophilisées, contenant le produit à doser tel que par exemple une séquence d'acide ribonucléique, présentent les avantages ci-après :
1. Elles permettent de comparer et contrôler toutes les étapes du dosage dès l'étape d'extraction du matériel à doser (acides nucléiques, leurs modifications épigénétiques ou leurs produits). 2. Elles représentent un matériel clairement identifié et stable, de composition homogène, qui, produit en quantité suffisante, permet de disposer d'un élément de référence sur plusieurs années et permet de juger de la bonne qualité du dosage.
3. Elles permettent une facilité d'utilisation et une limitation des coûts de transport : ces cellules lyophilisées peuvent être distribuées à température ambiante (de l'ordre de 15°C à 28°C) par courrier simple quelle que soit la distance à parcourir dans le monde.
4. Elles permettent d'isoler les acides ribonucléiques, très instables, de bonne qualité en vue de leur dosage. 5. Elles peuvent servir de référence pour la comparaison des résultats produits par des laboratoires et sont donc utilisables comme standards ou contrôles a. lors de la mise au point de techniques de dosage innovantes dans le domaine de la recherche permettant une standardisation des résultats telles que les analyses par puces à ADN (profils d'expression ou Comparative Hybridisation of Génomes (CGH) sur puces), b. dans le domaine médical, pour les dosages biologiques de ces nouveaux marqueurs, afin de procéder à des contrôles de qualité
De façon avantageuse quoique nullement limitative, les cellules lyophilisées sont obtenues par la mise en œuvre du procédé décrit ci-après :
Les cellules devant être lyophilisées sont choisies parmi; , toutes cellules pouvant être produites en grande quantité. De façon avantageuse, il s'agira d'une seule lignée cellulaire, ou d'un mélange de lignées cellulaires issues d'un même organisme ou de plusieurs organismes eucaryotes ou procaryotes. Le choix de la lignée cellulaire ou du mélange cellulaire à lyophiliser est adapté en fonction du ou des marqueur(s) à analyser ou doser.
Les cellules sont cultivées dans leur milieu de croissance jusqu'à la phase exponentielle. Elles sont ensuite collectées à cette phase, puis lavées dans un tampon type tampon phosphate salin à concentration 2X, de préférence à ph 7,2, et resuspendues dans ce tampon à la concentration désirée par ampoule, par exemple de 3.106 cellules par ml.
Les ampoules sont lavées à l'acide puis abondamment rincées, et ensuite séchées, marquées et mises au four.
Les cellules sont alors réparties dans des ampoules (1 ml/ampoule) et tenues à +4°C jusqu'à ce que l'aliquotage soit terminé.
Les ampoules sont ensuite mises dans le lyophilisateur, et lyophilisées selon le protocole ci-après décrit :
- congélation à une température de -50°C sur étagère pré refroidie,
- séchage primaire progressif de -50 à 0°C par paliers incrémentés
- vide primaire entre 10 et 1000 μbar, et de préférence 10Oμbar - séchage secondaire à des températures comprises entre 15 et 45 °C, et de préférence de l'ordre de 25°C resuspension des cellules avant la lyophilisation dans un tampon hypertonique de préférence choisi dans la gamme des produits ci-après : tris, phosphate, borate, acétate, hepes, etc.
- vide de séchage secondaire entre 10 et 300 μbar séchage des cellules en suspension sous forme vaporisée ou séchée à l'air
La concentration cellulaire peut être prise entre 104 et 109 cellules par ml en fonction du type de dosage.
Le séchage des cellules peut être effectué avec ou sans assistance d'une réduction de pression. La présence d'un cryoprotecteur ou d'un protecteur de lyophilisation peut être nécessaire.
Le dosage peut être soit absolu soit relatif (par comparaison entre échantillons) et ceci quelles que soient les modalités utilisées pour exprimer les résultats.
Dans les dosages relatifs comparatifs, il est avantageux d'utiliser deux ou plusieurs de ces mélanges de cellules lyophilisées.
Les exemples ci-après décrivent des modes de réalisation de dosage de différents produits, effectués à partir de cellules lyophilisées.
Exemple 1 : Dosage du transcrit (acide ribonucléique) BCR ABL par la technique de PCR quantitative en temps réel (RQ-PCR) après transcription inverse dans la lignée lyophilisée K562.
Contexte : A ce jour, il n'existe pas de Standards Internationaux pour les analyses de RQ-PCR notamment dans le cadre de protocoles multi-centriques visant à évaluer l'efficacité de drogues. En effet, ces protocoles nécessitent la comparaison des résultats obtenus dans différentes équipes et ces comparaisons sont rendues difficiles par l'absence de standards ayant une valeur référence. En particulier, le dosage précis du transcrit BCR ABL devient nécessaire pour adapter le traitement en fonction de la réponse aux drogues notamment avec l'introduction du GLEEVEC (Novartis), agent thérapeutique qui bloque l'activité tyrosine kinase de la protéine BCR ABL. Nous avons développé des cellules lyophilisées afin de pouvoir disposer de standards internationaux.
Procédé : Les cellules de la lignée K562 ou la lignée Tom1 ont été cultivées jusqu'en phase exponentielle de croissance où elles sont récoltées et lyophilisées à une concentration de 2-3x106 cellules/aliquot. Les ampoules employées sont avec capuchon à vis. Ces capuchons siliconés à l'halobutyl sont lavés dans un alcool léthylé industriel et séchés à l'air. Ils ont été mis dans un sac et autoclaves avant utilisation. Les bouchons sont fixés sur le cou des ampoules et celles ci sont lyophilisées en les mettant directement sur des étagères pré-refroidies dans un lyophilisateur de type Sérail (CS -15 ou CS- 100). Après lyophilisation, les ampoules sont rincées à l'azote liquide. Ensuite, les bouchons à vis sont mis en place et verrouillés à la main.
Le cycle de lyophilisation arrêté au jour 50 pour le lot (01/604) est de 50 jours.
Les ampoules contenant les cellules (près de 1500) ont été placées sur des étagères prérefroidies à -50°C et congelées à -50°C pour 720 minutes (12 heures). Le vide a été ensuite appliqué jusqu'à un niveau de 100μbar et les étagères maintenues à -50°C pendant encore 780 minutes. La température des étagères a été ensuite élevée jusqu'à -45°C sur une période de 25 minutes puis maintenue à -45°C pendant 720 minutes. La température des étagères est ensuite augmentée jusqu'à -35°C sur 50 minutes et maintenue à -35°C pendant 360 minutes. La température des étagères est ensuite augmentée jusqu'à -25°C sur 50 minutes et maintenue à -25°C pendant 720 minutes. . La température des étagères est ensuite augmentée jusqu'à -15°C sur 50 minutes et maintenue à - 15°C pendant 360 minutes. La sonde de température a indiqué une inflexion dans la température du produit à -25°C ce qui suggère que le séchage primaire était complet pour l'ampoule contenant la sonde à ce moment. La température des étagères est ensuite élevée à 0°C sur 75 minutes et maintenue à 0°C pendant 120 minutes. La température des étagères a été ensuite élevée à 25°C sur 125 minutes. Le vide est alors accentué de SOμbar et la température maintenue à 25°C pendant 24 heures pour le second séchage. La température des étagères est ensuite réduite à 22°C et le vide maintenu jusqu'à ce que les ampoules soient retirées. Différentes techniques d'extraction des ARN ont été testées et la qualité des ARN extraits a été vérifiée sur le Bioanalyseur 2100 (Agilent). Les analyses de RQ-PCR pour les gènes contrôle ABL et GUS ainsi que pour le transcrit de fusion BCR-ABL sont réalisées suivant le protocole établi dans le programme EAC (Europe Against Cancer) (brevet Européen déposé le 7 Mars 2003 n° 03290572.1)
Une fois la faisabilité établie dans notre laboratoire, une étude internationale strictement confidentielle a été lancée impliquant 22 laboratoires experts de par le monde, utilisant chacun leur procédé d'extraction, de transcription inverse et d'amplification par PCR quantitative en temps réel.
Résultats :
1. Bonne qualité des acides ribonucléiques extraits à partir de l'extraction des cellules lyophilisées appréciée par le Bioanalyseur 2100 Agilent (Figure 1) 2. Comparaison de l'expression des transcrits p210BCR-ABL et GUS dans les Cellules K562 lyophilisées versus Cellules K562 fraîches mesurée par PCR quantitative en temps réel sont tout à fait comparables (Figure 2)
3. Etude préliminaire de Stabilité des Cellules K562 lyophilisées par la technique de dégradation accélérée (figure 3). Les cellules lyophilisées maintenues pendant 7, 21 ou 30 jours soit à 37°C soit à 45°C sont stables pour le dosage considéré pendant au moins 30 jours à 45°C selon le modèle Arrhenius. Cette étude préliminaire montre qu'il n'existe pas de dégradation significatives des transcrits géniques mesurés par RQ PCR après 30 jours à 45°C ou moins. Les valeurs obtenues sont comparables à celles obtenues sur des cellules fraîches, et mettent en évidence la bonne stabilité des Standards de cellules lyophilisées.
4. Etude internationale strictement confidentielle (Figure 4). Le dosage est réalisé sur 3 dilutions (pur, 1/10, 1/100) du matériel extrait à partir des cellules lyophilisées. L'analyse statistique montre une distribution normale permettant la définition d'une valeur de référence de l'ordre de 90 à 100 copies du transcrit BCR ABL pour 1 copie du transcrit du gène ABL dans ce batch de cellules de K562 lyophilisées.
Exemple 2 : Analyse du profil d'expression de 2 ampoules de la lignée K562 lyophilisées.
L'analyse est réalisée sur 10 000 séquences d'acide nucléique, représentant autant de gènes, déposées sur une membrane de nylon. La détection utilise la radioactivité et la mesure est donc absolue dans cet exemple. (Figure 5) La reproductibilité est excellente apportant la démonstration du principe
Le dosage à l'aide de cellules lyophilisées peut être appliqué à toute séquence d'acide nucléique ou ses produits, extraits à partir de cellules présentes dans un organisme procaryote ou eucaryote notamment les végétaux, les animaux et l'homme.
Les séquences d'acide nucléique ou leur(s) produit(s) que l'on souhaite doser peuvent être normaux ou modifiés notamment par mutation soit naturellement soit artificiellement. Ces séquences d'acide nucléique peuvent être présents naturellement dans l'organisme, ou introduites artificiellement par n'importe quel procédé notamment par transfection ou transduction dans des cellules ou des organismes transgéniques.
Les dosages permis par l'utilisation de cellules lyophilisées peuvent trouver une application dans divers domaines, et par exemple :
1. dosage d'acide nucléique 1.1. ADN génomique o Par des techniques de PCR, notamment la PCR quantitative en temps réel d'une ou quelques séquences d'acide nucléique du génome ou toute technique permettant un dosage précis. • Les analyses par Hybridation génomique comparative notamment les analyses par "CGH array" qui permettent la détection et la mesure des amplifications et des délétions des séquences génomiques entre 2 échantillons. o Toute technique résultant de l'association des techniques mentionnées précédemment.
1.2. Dosage des transcrits (acides ribonucléiques) cellulaires o Analyses de Polymerase chain reaction (PCR) après une étape de transcription inverse pour le dosage de l'expression d'un gène ou d'une combinaison de gènes et toute technique permettant ce dosage.
• Profils d'expression génique depuis les puces à ADN pan-génomiques ou à grande échelle jusqu'aux puces à ADN dédiées avec un nombre limité de gènes. Ceci quelle que soit la technique utilisée : • Quel que soit le support notamment le Nylon, le verre ou le plastique avec ou sans modification physiques, chimiques ou enzymatiques.
• Quel que soit le type de séquences nucléotidiques déposées sur ce support (par exemple de produits de PCR ou des oligo nucléotides de 10 à 100 mers) ;
• Quelles que soient les modalités de détection, notamment la radioactivité, la fluorescence ou la colorimétrie.
• Toute technique résultant de l'association des techniques mentionnées précédemment.
2. Dosage des modifications épigénétiques des séquences d'acide nucléique. Toute technique notamment à haut débit et/ou automatisable permettant la mesure des modifications des acides nucléiques sans changement de la séquence nucléotidique notamment la méthylation. 3. Dosage des protéines cellulaires.
Toute technique notamment à haut débit et/ou automatisable permettant la mesure d'un mélange protéique cellulaire, en particulier les profils protéiques mesurés par des techniques faisant intervenir les techniques de spectroscopie de masse. Par exemple la spectrométrie de masse MALDI-TOF couplé avec l'électrophorèse bidïmensionnelle des protéines ou la spectrométrie de masse MS/MS couplée à de la chromatographie liquide nano-débit ou encore la spectrométrie de masse SELDI-TOF ou toute autre technique dérivée
4. Dosage des modifications post traductionnelles.
• Toute technique notamment à haut débit ou automatisable permettant la mesure des modifications des protéines cellulaires après la traduction notamment les histones comme par exemple la phosphorylation, la méthylation ou l'acétylation.
L'utilisation de cellules lyophilisées selon l'invention permet également d'envisager différents types de mesure, et par exemple :
1. mesure dans une situation pathologique telle que mesure de l'acide ribonucléique BCR ABL par PCR quantitative en temps réel (voir exemple
1 précité).
2. mesure permettant d'apprécier les conséquences engendrées au niveau cellulaire par l'introduction de séquences d'acides nucléiques ou de cellules vivantes o dans des organismes transgéniques (animaux ou végétaux) o Mesure après thérapie cellulaire ou génique.

Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation de cellules lyophilisées non vivantes issus d'organismes procaryotes ou eucaryotes pour le dosage de séquences d'acides nucléiques intracellulaires, de leurs modifications épigénétiques, par la technique de PCR quantitative en temps réel ou par puces à ADN.
2. Utilisation de cellules lyophilisées selon la revendication 1 comme élément de référence (standard ou contrôle)
3. Utilisation de cellules lyophilisées selon l'une des revendications 1 ou 2 pour les techniques automatisées de mesure en une réaction d'un ou plusieurs éléments d'origine cellulaire ceci quel que soit le mode d'expression des résultats.
4. Utilisation de cellules lyophilisées selon l'une des revendications 1 ou 2 pour des dosages absolus ou relatifs de séquences d'acides nucléiques intracellulaires, de leurs modifications épigénétiques, ou de leurs produits.
5. Utilisation de cellules lyophilisées selon l'une des revendications 1 ou 2 pour doser des marqueurs cellulaires dans des situations pathologiques
6. Utilisation de cellules lyophilisées selon l'une des revendications 1 ou 2 pour le dosage de transcrit génique par une technique appropriée.
7. Procédé d'obtention des cellules lyophilisées pour la mise en œuvre de la revendication 1 caractérisé en ce que ledit procédé comprend les étapes suivantes : a/ les cellules devant être lyophilisées sont cultivées dans leur milieu de croissance jusqu'à la phase exponentielle. b/ lesdites cellules sont collectées, puis lavées dans un tampon type tampon phosphate salin, ph 7,2, et resuspendues dans ce tampon à la concentration désirée par ampoule. c/ les cellules sont alors réparties dans des ampoules et tenues à +4°C jusqu'à ce que l'aliquotage soit terminé, les ampoules ayant été préalablement lavées à l'acide puis abondamment rincées, séchées, marquées et mises au four. d/ les ampoules sont ensuite mises dans le lyophilisateur, et lyophilisées selon le protocole ci-après décrit : - congélation à une température de -50°C sur étagère pré refroidie,
- séchage primaire progressif de -50 à 0°C par paliers incrémentés
- vide primaire entre 10 et 1000 μbar, et de préférence 100μbar
- séchage secondaire à des températures comprises entre 15 et 45 °C, et de préférence de l'ordre de 25°C resuspension des cellules avant lyophilisation dans un tampon hypertonique choisi dans la gamme des produits ci-après : tris, phosphate, borate, acétate, hepes.
- vide de séchage secondaire entre 10 et 300 μbar - séchage des cellules en suspension sous forme vaporisée ou séchée à l'air
8. Procédé d'obtention des cellules lyophilisées pour la mise en œuvre de la revendication 1 , selon la revendication 7, caractérisé en ce que les cellules devant être lyophilisées sont choisies parmis toutes cellules pouvant être produites en grande quantité
9. Procédé d'obtention des cellules lyophilisées pour la mise en œuvre de la revendication 1 , selon la revendication 8, caractérisé en ce que lesdites cellules sont issues d'une seule lignée cellulaire, ou d'un mélange de lignées cellulaires issues d'un même organisme ou de plusieurs organismes eucaryotes ou procaryotes.
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