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WO2004064861A1 - 神経細胞死抑制剤 - Google Patents

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WO2004064861A1
WO2004064861A1 PCT/JP2004/000548 JP2004000548W WO2004064861A1 WO 2004064861 A1 WO2004064861 A1 WO 2004064861A1 JP 2004000548 W JP2004000548 W JP 2004000548W WO 2004064861 A1 WO2004064861 A1 WO 2004064861A1
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WO
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rptal
rat
cell death
seq
culture
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Application number
PCT/JP2004/000548
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English (en)
French (fr)
Inventor
Hiroshi Ueda
Original Assignee
Nippon Chemiphar Co., Ltd.
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Publication date
Application filed by Nippon Chemiphar Co., Ltd. filed Critical Nippon Chemiphar Co., Ltd.
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Publication of WO2004064861A1 publication Critical patent/WO2004064861A1/ja

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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/57581—Thymosin; Related peptides
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    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to a nerve cell death inhibitor comprising prothymosin a1 (hereinafter referred to as "PTA1”) as an active ingredient and a therapeutic agent for a disease associated with nerve cell death.
  • PTA1 prothymosin a1
  • the brain uses various protective mechanisms against various exogenous and endogenous stresses for a long life span of several hundred years, and maintains its survival.
  • the brain's own protective mechanisms are influenced by neuro-glia and neuro-neural communities, and work to maintain their advanced role.
  • the most well-known mechanisms of neuroprotection are those that are functioned by molecules such as neurotrophic factors and cytoplasm. These neurotrophic factors are known to have the function of suppressing programmed neuronal death (apoptosis) seen under various stress conditions.
  • neurogenesis Another mechanism is neurogenesis, and recent reports have reported that neurogenesis is enhanced during cerebral ischemia stress, but it is expected that it is not sufficient to supplement the nerves that undergo massive cell death. You. During cerebral ischemia, necrosis, which is destructive cell death, is observed in the central part of the ischemic core, but this cell death dissipates the cell contents to the outside. It should spread to the surroundings. However, a few days later, a phenomenon specific to apoptosis, such as fragmentation and condensation of cells and phagocytosis by microglia, is observed in a surrounding area called penambula.
  • Apoptosis seen in Penampra is considered to function as a kind of protective mechanism that prevents injury to the whole brain by localizing the injury site (see Non-Patent Document 1).
  • the present invention has been made under the above-mentioned technical background, and an object of the present invention is to specify a substance capable of converting a cell death form from necrosis to apoptosis.
  • Non-Patent Document 1 Hiroshi Ueda, Wakako Hamanabe Journal of Pharmaceutical Sciences of Japan, 119, 79-88 (2002)
  • PTA1 which was considered to be a precursor of thymosin, acts on (A) nerve cells to suppress necrosis. Necrosis inhibitory function), (B) Acts on neurons and promotes apoptosis (pro-apoptosis function), and (C) Acts on microglia to promote secretion of substances (neurotrophic factors) that inhibit apoptosis It has been found that it has a function to indirectly suppress apoptosis (indirect apoptosis suppression function).
  • PTA1 when acting only on nerve cells (such as when PTA1 is added to cultured neurons), PTA1 converts the cell death form of neurons from necrosis to apoptosis. PTA1 inhibits both neuronal necrosis and apoptosis when it acts on and microglia (such as when administering PTA1 in vivo).
  • the present invention has been completed based on the above findings.
  • the present invention is a nerve cell death inhibitor comprising PTA1 or a protein or peptide having a function equivalent thereto as an active ingredient.
  • the present invention is a therapeutic agent for a disease associated with nerve cell death, comprising PTA1 or a protein or a peptide having a function equivalent thereto as an active ingredient.
  • the present invention relates to a peptide represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 5, or a peptide substantially identical to these peptides.
  • PTA1 is a known protein, it has been reported by the present inventors that PTA1 has the above-mentioned necrosis-suppressing function, apoptosis-promoting function, and indirect apoptosis-suppressing function. It was discovered for the first time.
  • Trk neurotrophic factor receptor
  • PTA1 can be used as a nerve cell death inhibitor.
  • PTA1 used for the neuronal cell inhibitor is not particularly limited, and PTA1 derived from human, PTA1 derived from rat, PTA1 derived from mouse, and the like can be used.
  • the amino acid sequence of PTA1 actually obtained from these organisms is shown in FIG.
  • the amino acid sequences of three types of PTA1 are shown in SEQ ID NO: 1 (human), SEQ ID NO: 2 (rat), and SEQ ID NO: 3 (mouse).
  • Figure 3 shows the aligned figures.
  • PTA1 derived from organisms other than human, rat, and mouse includes PTA1 and PTA1 derived from force can also be used.
  • These amino acid sequences of PTA1 are registered in GenBank and the like as Accession No. TNB0A1 and CAC39397, respectively.
  • a protein or peptide having a function equivalent to that of PTM can be used.
  • a protein or a peptide having a function equivalent to PTA1 refers to a protein or a protein having all or a part of the necrosis-suppressing function, the apoptosis-promoting function, and the indirect apoptosis-suppressing function of PTM.
  • Means peptide. Examples of such a protein or peptide include a protein represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, or SEQ ID NO: 3 in which one or more amino acids have been deleted, substituted or added. included.
  • the number of amino acids to be deleted or the like is not particularly limited, but is usually 20 or less, preferably 10 or less, and particularly preferably 5 or less.
  • the “peptide having a function equivalent to that of PTA1” also includes a peptide fragment obtained from PTA1 and having the above-described necrosis-suppressing function and the like. Examples of such a fragment include peptides represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 5 (peptides substantially the same as these peptides).
  • substantially the same peptide refers to an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 5, and A peptide that has all or part of the necrosis-suppressing function, apoptosis-promoting function, and indirect apoptosis-suppressing function.
  • the number of amino acids to be deleted is not particularly limited, it is usually 5 or less, preferably 3 or less, and particularly preferably 1.
  • the peptide represented by the amino acid sequence corresponding to SEQ ID NO: 4 in FIG. 2 is the “substantially identical” Peptides. "
  • the nerve cell death inhibitor of the present invention inhibits only necrosis and inhibits both necrosis and apoptosis. May be controlled.
  • the nerve cells to which the nerve cell death inhibitor of the present invention is applied are not particularly limited, and can be used to suppress cell death of neurons derived from the cerebral cortex, striatum, midbrain, hippocampus, cerebellum, spinal cord, visual organ, etc. Applicable.
  • PTA1 can be used not only as a nerve cell death inhibitor, but also as a therapeutic agent for diseases associated with nerve cell death.
  • disease associated with neuronal cell death refers to a disease associated with apoptosis, necrosis, or both.
  • diseases include those caused by ischemia, such as stroke, traumatic brain injury, glaucoma, diabetic retinopathy, or compression injury during retinal detachment treatment.
  • treatment used herein includes not only the case where the disease is completely cured, but also the case where the disease condition is reduced or the disease condition is prevented from worsening.
  • the therapeutic agent for a disease associated with nerve cell death of the present invention is formulated by mixing PTA1 with a pharmaceutically acceptable carrier or diluent according to a known method.
  • a pharmaceutically acceptable carrier or diluent according to a known method.
  • Formulations containing suitable carriers and diluents and proteins are described, for example, in Remington's Pharmaceutical Sciences.
  • the dosage form suitable for administration is not particularly limited, but is preferably prepared as an injection as in the case of a pharmaceutical composition containing many proteins already used as a medicament. More specifically, an injection is prepared by dissolving PTA1 in an appropriate solvent such as water, physiological saline, or an isotonic buffer. At that time, it can be prepared by adding polyethylene dalicol, glucose, various amino acids, collagen, albumin, etc. as a protective material. It is also possible to embed the polypeptide in an inclusion body such as ribosome and administer it.
  • the dose varies depending on the age, weight, disease state, administration route, and other factors of the subject, but can be easily determined by the administering physician as appropriate.
  • the dose when administered intravitreally for the treatment of glaucoma, the dose is about 0.0012 mg to 0.012 mg once; when administered intraventricularly for the treatment of stroke, the daily dose is about 0 012 mg to 1.2 mg.
  • the administration method of PTA1 is not particularly limited, and various administration methods that are actually used at present can be adopted for intracerebral administration. An example of such an administration method is intracisternal administration. Intracisternal administration is advantageous in that it does not damage the brain parenchyma. BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
  • FIG. 1 is a diagram schematically showing the effects of PTA1 on nerve cells and microglia.
  • Figure 2 shows the amino acid sequence of PTA1 actually obtained from organisms such as humans, rats, and mice. (The right end of the amino acid sequence in Figure 2a and the left end of the amino acid sequence in Figure 2b are linked. The right end of the amino acid sequence in Figure 2b is connected to the left end of the amino acid sequence in Figure 2c.)
  • FIG. 3 is a view showing the amino acid sequence of PTA1 derived from human, rat, and mouse.
  • FIG. 4 is a diagram showing a step of purifying a protein having a survival activity on cultured neurons.
  • FIG. 5 is a diagram showing the results of reversed-phase HPLC analysis of a digest of a protein having survival activity and Lysyl endopeptidase.
  • FIG. 6 is a graph showing the relationship between the survival activity of nerve cells and the amount of rat rPTM coated.
  • FIG. 7 is a graph showing the relationship between the survival activity of neurons derived from cerebral cortex, striatum, midbrain, or hippocampus and the amount of rat rPTAl coated.
  • FIG. 8 is a graph showing the relationship between the survival activity of nerve cells and the site of deficiency of rat rPTAl added during nerve cell culture.
  • FIG. 9 is a fluorescence micrograph of nerve cells cultured in the presence or absence of rat rPTAl.
  • FIG. 10 is a transmission electron micrograph of nerve cells cultured in the presence or absence of rat rPTAl.
  • Fig. 11 shows intracellular ATP of neurons cultured in the presence or absence of rat rPTAl. It is a figure which shows a time-dependent change of content.
  • FIG. 12 is a graph showing the effect of the addition of Cal C or U-73122 on the change in intracellular ATP content of neurons cultured in the presence or absence of rat rPTAl.
  • FIG. 13 is a graph showing the effect of the addition of Cal C or U-73122 on the 2-DG uptake effect of neurons cultured in the presence or absence of rat rPTAl.
  • FIG. 14 is a fluorescence micrograph showing the position of GLUT1 or GLUT4 in neurons cultured in the presence or absence of rat rPTAl.
  • FIG. 15 is a fluorescence micrograph showing the position of cytochrome c in nerve cells cultured in the presence or absence of rat rPTAl.
  • FIG. 16 is a diagram showing regulation of Be1-2 family protein expression by rat rPTAl as an apoptosis induction mechanism.
  • FIG. 17 is a diagram showing the effect of adding a neurotrophic factor on the survival activity of nerve cells by rat rPTM.
  • FIG. 18 is a fluorescence micrograph showing changes in the position of cytochrome c in neurons caused by rat rPTAl and changes due to coexistence with BDNF.
  • FIG. 19 is a diagram showing the time-dependent change in the amount of PTA1 in cells and culture supernatant.
  • FIG. 20 is a graph showing the time course of the expression level of IL-6 mRNA in microdial and nerve cells cultured in the presence or absence of rat rPTAl.
  • FIG. 21 shows a light microscope and a transmission electron micrograph of a retinal cell layer prepared from a mouse subjected to an ischemic treatment after the vitreous administration of the mouse PTA1 AS-0DN.
  • FIG. 22 is an optical microscope and a transmission electron micrograph of a retinal cell layer prepared from a mouse to which vitreous administration of mouse rPTAl was performed before or after ischemia.
  • FIG. 23 is a photomicrograph of a forehead fragment prepared from a mouse subjected to carotid ischemia treatment after intraventricular administration of mouse rPTAl.
  • FIG. 24 shows the effect of intracerebroventricular administration of mouse rPTAl on latency during step-through in mice treated with carotid ischemia.
  • the culture supernatant was cultured at a density of 5 ⁇ 10 5 cels / cm 2 (high density) for 3 days, and the supernatant was filtered through a Mixx Fil Yuichi (Millipore) and stored at -20 until use.
  • the supernatant is coated by adding it to the low-density (1 ⁇ 10 5 cels / cm 2 ) culture, or by adding it to the culture plate immediately before the culture, incubating at 25 ° C for 2 hours, and then washing twice with PBS. It depends.
  • Cytotoxicity was determined by measuring the activity of cytosolic lactate dehydrogenase (LDH) released from the injured cells into the culture supernatant using a cytotoxicity detection kit from Roche Molecular Biochemicals (Mannheim, Germany). It was determined by measuring according to the protocol described in Specifically, it is as follows.
  • LDH cytosolic lactate dehydrogenase
  • Nerve cell death was assessed by reduced trypan blue exclusion from cells. To the cultured cells, 0.4% trypan solution of the same volume as the medium was added, left for 5 minutes, washed twice with ice-cold PBS, and fixed with 4% paraformaldehyde dissolved in PBS at room temperature for 30 minutes. The percentage of cell death was evaluated as a percentage (%) of total cells. Measurement of intracellular ATP level
  • the luciferin luciferase method was measured using an ATP quantification kit (Molecular Probes, Eugene, OR). Using 2 ⁇ 10 6 whole cells, the cells were washed twice with ice-cold PBS and suspended in a cell diluent solution (100 mM Tris-HC1 pH7.75, 4 mM EDTA). 0.5 mM luciferin, 1.25 g / ml luciferase and 1 mM DTT were mixed in a 201 cell suspension. Luciferin-luciferase bioluminescence measurements were performed using LUMAT LB 9507 from EG & Gberthold (BadWildbad, Germany). Annexin V binding and PI staining experiments
  • Apoptosis and necrosis were evaluated using the AnnexinV-FLU0S staining kit from Roche Molecular Biochemicals and Provided 'iodide (PI) from Sigma, respectively.
  • Cerebral cortical cells were cultured in an 8-well Lab-Tek TM chamber, and after a certain period of time, annexin V fluorescein and 10 Mg / ml PI were added, and incubated at room temperature for 15 minutes. Thereafter, the cells were washed with ice-cold PBS and fixed with 4% PFA for 30 minutes at room temperature. Fluorescence was measured using a Carl Zeiss LSM410 fluorescence microscope.
  • DNA fragmentation in cells showing apoptosis was measured histochemically using the terminal deoxyribonucleotidyl transf erase-mediated dUTP-biotin nick end labeling (TUNEL) method.
  • TUNEL terminal deoxyribonucleotidyl transf erase-mediated dUTP-biotin nick end labeling
  • Cultured cerebral cortex cells were fixed by incubating with 0.1% phosphate buffer (pH 7.4) and 0.5% dartal aldehyde for 1 hour at room temperature, and then incubated with 1% osmium tetroxide for 1 hour at room temperature. Post fixation was performed. Subsequently, after dehydration with alcohol, Epon812 was embedded, and ultra-thin sections of 80 nm were prepared using Ultracut S (Leica, Austria). The sections were stained with uranium acetate and lead citrate for 30 and 5 minutes, respectively, and observed with an electron microscope (JEM-1210; JEOL, Tokyo, Japan).
  • Cerebral cortical cells were cultured in 6-well plates containing DMEM / F-12 medium containing 17.5 mM glucose. The plates used were those coated with recombinant small PTA1 and those not coated. After a certain time from the start of culture
  • [ 3 H] -2-DG (1 Ci / well, 10 nM) was added, and the mixture was further incubated at 37 ° C. for 2 hours. Then, the supernatant was removed and the cells were washed twice with ice-cold PBS. The cells were lysed with a 0.5 M NaOH solution of IOOI, neutralized with 0.5 M hydrochloric acid, and the radioactivity was measured with a liquid scintillation counter.
  • Cultured cells are suspended in a buffer containing 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.3% j3-mercaptoethanol, 5 mM EDTA, 10 mM EGTA, 50 g / ml PMSF, 10 mM benzamidine, and then glycerol of the same volume And homogenized on ice.
  • the PKC activity was measured using the protein kinase C enzyme activity measurement system of Amersham Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ) and according to the attached protocol.
  • the culture sample [S] is mixed with a substrate (0.3 mg / ml La-phosphatidyl-L-serin) that is phosphorylated by PKC and mixed with 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 30 mM dithiothreitol, and [r- 32 [P] ATP and magnesium-incubated with ATP buffer for 37 minutes for 15 minutes.
  • Maximum Maximum PKC activation [Max] was measured by adding 24 rag / ml phorbol 12-myristate 13-acetate and 12 mM calcium acetate to the above composition.
  • Background value [B] was measured without the substrate. The reaction was stopped by adding a stop solution, and the solution was adsorbed on peptide-bonded paper.
  • Example 1 Protein structure determination and preparation of recombinant protein Purification of a viable protein from the cerebral cortical neuron culture supernatant of the 17-day embryo of the rat by anion exchange chromatography, gel filtration, and SDS-PAGE, yielding a molecular weight of approximately 20 kDa And two proteins of about 22 kDa (NDI20 and NDI22) were obtained (FIGS. 4a and b). The survival activity was evaluated using WST-8 Atsushi.
  • NDI20 could be detected stably even when the extraction conditions were changed, but NDI22 could not be detected in some cases. From this, NDI22 was expected to have another small molecule adsorbed to NDI20, and NDI20 was regarded as the active form.
  • NDI 20 could be estimated to be PTA1 from the database
  • rat and mouse cDNA clones were isolated by RT-PCR, expressed in Escherichia coli, and extracted with acidic phenol and biophoresis (Atoichi Co., Ltd .; Recombinant PTAU or less (referred to as “rPTAl”) was prepared using AEP-820).
  • the rPTAl prepared in this manner exhibited the same electrophoretic mobility as the original NDI20, and the molecular weight in the mass spectrum (VOYAGER; (MALDI) PerSeptive Biosystems) was also consistent.
  • the cerebral cortical neurons of the 17-day embryo of the rat were cultured under serum-free conditions in the presence or absence of rat rPTAl, and the survival activity and cytotoxicity 12 hours after the start of the culture were evaluated.
  • the culture was performed under two conditions: low-density culture (lxlO 5 cells / cm 2 ) and high-density culture (5xl0 5 cells / cm 2 ) (hereinafter, low-density and high-density unless otherwise specified).
  • the culture shall be performed at the above-mentioned density.
  • the culture in the presence of rat rPTAl was performed by coating rat rPTAl at a dose of 3 to 50 Pino1 / cm 2 on a 96-well culture dish in advance, and sprinkling nerve cells thereon. Survival activity was evaluated by WST 8 assay, and cytotoxicity was evaluated by LDH release. In addition, the time course of the survival activity and the degree of cytotoxicity when cultured in the presence of 25 pmol m 2 of rPTAl was examined. The above results are shown in Figs.
  • Fig. 6A when the cells were cultured in the absence of rat rPTAl (V in the figure), the viability decreased to about 40% of that at the start of the culture.
  • the culture improved the survival activity in a dose-dependent manner.
  • Rat rPTAl also reduced the degree of cytotoxicity in a dose-dependent manner (Fig. 6C).
  • dorsal root ganglion (DRG) cells and cerebral cortical neurons were cultured at low density in the presence of rat rPTAl under serum-free conditions, and the cell death rate after 12 hours was examined using a trypable monochromic exclusion test. .
  • Figure 7 shows the above results.
  • rat rPTAl As shown in FIG. 7A, the improvement of the survival activity by rat rPTAl was observed not only in the cerebral cortex but also in neurons derived from the striatum, midbrain, and hippocampus. Neurodegeneration in the cerebral cortex and hippocampus is a brain region associated with Alzheimer's disease and senile dementia. It is known that neurodegeneration in the striatum is associated with Huntington's disease and that in midbrain degeneration is associated with Parkinson's disease. Therefore, rat rPTAl may be effective in such a wide range of neurodegenerative diseases.
  • the rPTAl deletion mutant thus prepared was fractionated by electrophoresis on 12% SDS-PAGE, and visualized by Coomassie brilliant blue (CBB) staining.A band of the expected size was observed. Therefore, the survival activity of cerebral cortical neurons of rat 17-day embryos was evaluated using these (Fig. 8A). Survival activity by adding 25 pmol / cm 2 rPTAl deletion mutant was 12 hours after the start of culture under serum-free low-density culture conditions. It was measured later. The result is shown in FIG. 8B.
  • mutants in which the 48th amino acid was deleted from the N-terminus of rPTAl and the mutants in which the 79th to 112th amino acids were deleted were comparable to the full length of rPTAl. Improved survival activity, but mutants deleted at amino acids 68 and 86 from the N-terminus and mutants deleted at amino acids 30 to 112 and amino acids 58 to 112 The increase in body viability was markedly diminished.
  • the active form of rat rPTAl is the 49th to 78th amino acid region.
  • the amino acid sequence of this 49-78 fragment is shown in SEQ ID NO: 4.
  • human PTA1 the amino acid sequence of the fragment corresponding to this fragment is shown in SEQ ID NO: 5.
  • Rat ⁇ day embryonic cerebral cortical neurons were cultured under serum-free conditions in rat rPTAl (25 pmol / cm 2 ). The cells were cultured at low or high density in the presence or absence, and the state of the cells 12 hours after the start of the culture was observed with a transmission electron microscope. The results are shown in FIG.
  • the cerebral cortical neurons of the rat per day embryo were cultured under the same conditions as in Example 5, and the time-dependent changes in the ATP content in the cells were examined. The results are shown in FIG.
  • Rat 17-day embryonic cerebral cortical neurons were cultured at low and high density under serum-free conditions, and the intracellular ATP content 6 hours after the start of the culture was examined.
  • the culture was performed in the presence or absence of rat rPTAl (25 pmol / cm 2 ), and calphosphin C (Cal 0 or U-73122 (U22) was added to 1 / i M immediately after the start of the culture.
  • calhostin C is a protein kinase C (PKC) inhibitor
  • ⁇ -73122 is a phospholipase C (PLC) inhibitor.
  • rat rPTAl By culturing in the presence, the decrease in ATP content was suppressed, but this effect was abolished by the addition of Cal C and U-73122.
  • Rat ⁇ The embryonic cerebral cortical neurons were transformed with rat rPTAl in the presence or absence of serum.
  • Cerebral cortical neurons of the 17-day embryo of the rat were cultured at low density, and the state of the cells 2 hours after the start of the culture was observed with a fluorescence microscope.
  • the culture was performed in the presence or absence of rat rPTAl (25 mol / cm 2 ) in the presence or absence of serum (10% FBS) or serum, and Cal C was added to 1 M immediately after the start of the culture.
  • Cells were also stained with a primary antibody recognizing GLUT1 or GLUT4 (these are glucose transporters) and a fluorescently labeled secondary antibody recognizing the primary antibody. The results are shown in FIG.
  • rat rPTAl is mediated by a receptor expected to be present on the cell membrane, followed by activation of PLC and PKC, localization of GLUT1 and GLUT4 to the cell membrane, promotion of glucose uptake, It has been shown to drive mechanisms such as increased ATP production.
  • the cerebral cortical neurons of the 17-day embryo of the rat were cultured at low density and high density under serum-free conditions, and the state of the cells 12 hours after the start of the culture was observed with a fluorescence microscope.
  • the culture was performed in the presence or absence of rat rPTAl (25 pmol / cm 2 ), and Cal C was added to 1 M immediately after the start of the culture.
  • Cells were double-stained with CMRXos (red fluorescence, binding to mitochondria) and anti-Cyto C antibody (green fluorescence, binding to Cyto C).
  • Anti-Cyto C antibody was recognized by a fluorescently labeled secondary antibody. The results are shown in FIG.
  • the cerebral cortical neurons of the 17-day embryo of the rat were cultured at low density under serum-free conditions, and the cells were collected over time from the start of the culture, and analyzed by the immunoblotting method.
  • the culture was performed in the presence or absence of rat rPTAl (25 pmol / cm 2 ), and Cal C and U73122 were added to M immediately after the start of the culture.
  • Rat rPTAl treatment at 25 pmol / cm 2 in low-density culture causes a time-dependent increase in Bax expression that promotes Cyto C release (Figure 16A, B), and also increases Bim expression with a similar function (Fig. 16B).
  • Bd-2 acts to suppress Cyto C release And the expression of Bd-xL was reduced (Fig. 16A, B).
  • the effect of increasing Bax by rat rPTAl was blocked by U73122 and Cal C (Fig. 16C).
  • the mechanism of rat apoptosis induction by rPTAl promotes Cyto C release from mitochondria through regulation of Bd-2 family protein expression via PLC and PKC, as well as suppression of necrosis. It has been proved that this leads to apoptosis mechanism such as activation of caspase system.
  • Example 1.2 Enhancement of cell death inhibitory effect of rat rPTAl by neurotrophic factor
  • Rat cerebral cortical neurons of 17-day embryo were cultured at low density under serum-free conditions, and survival activity 12 hours after the start of culture ( WST-8 Atsushi) was evaluated. The culture was performed in the presence or absence of rat rPTAl (25 mol / cm 2 ), and NGF, BDNF, bFGF, or IL6 was added to 100 ng / ml immediately after the start of the culture.
  • Figure 17 shows the results.
  • Example 13 Inhibition of apoptosis-inducing effect of rat rPTAl by BDNF
  • Rat cerebral cortical neurons of 17-day embryo were cultured at low density under serum-free conditions, and the state of the cells 12 hours after the start of culture was determined. Observed with a fluorescence microscope. The culture was performed in the presence or absence of rat rPTAl (25 pmol / cm 2 ), and BDNF was added immediately after the start of the culture so as to be 100 ng / ml.
  • the cells were stained with CMRXos (red fluorescence, binding to mitochondria) and double staining with an anti-Cyto C antibody (green fluorescence, binding to Cyto C), which was fluorescently labeled and recognized as a secondary antibody.
  • CMRXos red fluorescence, binding to mitochondria
  • an anti-Cyto C antibody green fluorescence, binding to Cyto C
  • Cyto C releasing action of rat rPTAl was completely suppressed by the addition of BDNF.
  • Examples 12 and 13 demonstrate that rPTAl inhibits necrosis of cerebral cortical neurons and switches to an apoptotic form that is protected by neurotrophic factors.
  • Example 14 Release of endogenous PTA1 from nerve cells due to serum-free stress Rat cortical neurons of 17-day embryos were cultured at high density in the absence of serum or serum to determine the amount of endogenous PTA1 released. The intracellular content of PTA1 was quantified. Endogenous PTA1 release was concentrated and purified by extraction of the culture supernatant with acidic phenol, developed by SDS-PAGE, and visualized and quantified by the Housein method. On the other hand, the intracellular content was directly extracted and quantified similarly. The results are shown in FIG.
  • Example 15 Increase in microglial neurotrophic factor gene expression by rat rPTAl
  • Microglia prepared from the cerebrum of a 17-day-old rat embryo were cultured, and rat rPTAl (25 pmol / cm 2 ) was added under the condition that the serum was temporarily made 1%, and the amount of IL-6 mRNA (RT-PCR Over time) was measured.
  • RT-PCR Over time was measured using cerebral cortical neurons from rat 17-day embryos cultured at low density without serum instead of microglia.
  • the amount of IL-6 mRNA was measured one hour after the addition of rat rPTAl while the amount of rat rPTAl was varied. At this time, the amount of cyclophilin mRNA was also measured for comparison.
  • Figures 20A, B and C The above results are shown in Figures 20A, B and C.
  • Retinas extracted from ischemia-treated ddY mice were embedded in paraffin to prepare sections of the retinal cell layer. The sections were stained with hematoxylin-eosin and then observed using an optical microscope. Further, a section embedded in epoxy resin was prepared, and the outer granular layer was observed with a transmission electron microscope.
  • ischemia treatment a reperfusion model was used in which retinal ischemia was performed by applying a pressure of 130 mmHg to the anterior chamber of the mouse for 45 minutes and then returning to normal pressure.
  • Antisense oligodeoxynucleotide (AS-0DN, ACT GCC GCG TCT GAC ATG GT) and missense oligodeoxynucleotide (MS_ODN, AGT GCA GCT TCG CAC CTG GT) in vitreous g / ll / -dose was administered.
  • a photograph of the retinal cell layer section 4 days after the ischemia treatment is shown in FIG. 21B, and a photograph of the outer nuclear layer section 24 hours after the ischemia treatment is shown in FIG. 21F.
  • Fig. 21A shows the protein amount of PTA1 when AS-0 ⁇ and MS-0DN were administered (concentrated and purified by acidic phenol extraction, developed by SDS-PAGE, and visualized by the Housein method). .
  • the thickness of the retinal nerve cell layer was reduced by the ischemic treatment.
  • the thickness was further reduced when AS-0DN was administered, but no such change was observed when MS-0DN was administered.
  • Sections of the retinal cell layer and outer nuclear layer were prepared from ddY mice treated with ischemia and observed with a transmission electron microscope.
  • the ischemic treatment and preparation of the sections were performed in the same manner as in Example 16. 30 minutes before or 24 hours after the ischemia treatment, 0.1 or 1.
  • Opmol mouse rPTAl and 100 pmol Cal C or Herb imyc in A (tyrosine kinase inhibitor) were injected into the vitreous body.
  • Pictures of retinal cell layer sections 4 days after ischemia treatment are shown in FIGS. 22A to G, and photographs of outer nuclear layer sections 24 hours after ischemia treatment are shown in FIGS. 22J to N.
  • ischemia treatment reduced the thickness of the retinal nerve cell layer (FIGS. 22A and B), such a decrease in thickness was suppressed by administration of mouse i-PTAl.
  • the administration of mouse rPTAl was effective before and after the ischemic treatment (Fig. 22C, F), and was effective in both the administration of 0.1 lpniol and the administration of 1. Opmol (Fig. 22). H ⁇ J).
  • the effect of administration of mouse rPTAl was not affected by Herbimyc in A (FIG. 22E), but was abolished by administration of Cal C (FIG. 22D).
  • necrosis was observed in the cells of the outer nuclear layer due to the ischemic treatment (Fig. 22 J, K).
  • mice were pre-administered with rPTAl, necrosis was suppressed, and no apoptosis was observed (Fig. 22L).
  • mouse rPTAl was administered together with Cal C, necrosis was observed, and the effect of rPTAl to suppress necrosis was abolished.
  • mouse rPTAl was administered together with Herb imyc in A, necrosis was not observed and apoptosis was observed.
  • mice After ligating the carotid artery of the ddY mouse for 30 minutes and reperfusion, 4 days later, a forehead section (1 mm) containing the cerebral striatum or hippocampus area was prepared and stained with TTC. Observed in a mirror. Mice received intraventricular administration of 1 pmol of mouse rPTAl 30 minutes before or 24 hours after ischemia treatment. The results are shown in FIG.

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Abstract

プロサイモシンα１又はこれと同等の機能を有するタンパク質若しくはペプチドを有効成分として含有する神経細胞死抑制剤を提供し、これによって神経細胞死を伴う疾患の治療手段を確立する。

Description

明 細 書 神経細胞死抑制剤 技術分野
本発明は、 プロサイモシン a 1 (以下、 「PTA1」 という） を有効成分として含 有する神経細胞死抑制剤及び神経細胞死を伴う疾患の治療剤に関する。 背景技術
ヒト脳では数百億個もの神経細胞が複雑なネットワークを構成しているが、 数 少ない神経幹細胞からの神経新生機構を考慮に入れないならば、 基本的にはその 細胞数は生後においては、 ただ減少するばかりである。 百数十年といわれる長い 寿命の期間、 様々な外来性、 内因性のストレスに対して脳は様々な保護機構を駆 使し、 生存を維持している。 脳自身のもつ保護機構には神経ーグリアや神経一神 経間に存在するコミュニティーが相互に影響しあってその高度な役割を維持すベ く働いている。 最もよく知られた神経保護メカニズムは神経栄養因子やサイ卜力 ィンなどの分子によって機能されているものである。 こうした神経栄養因子は 様々なストレス条件下に見られるプログラム神経細胞死 （アポトーシス） を抑制 する働きを有するものとして知られている。 もう一つのメカニズムは神経新生で あり最近の報告では脳虚血ス卜レス下に神経新生が亢進するとの報告はなされて いるが大量に細胞死に陥る神経を補うには十分ではないことが予想される。 脳虚血時には虚血中心部コアの部分で破壊的な細胞死であるネクローシスが観 察されるが、 この細胞死は細胞内容物を外部に放散するため、 本来ならば細胞傷 害作用は更に周囲に拡散するはずである。 ところが数日の後には周囲のペナンブ ラと呼ばれる領域では、 細胞の断片化や凝縮、 ミクログリアなどによる貪食とい つたアポト一シスに特有の現象が観察される。 このようなぺナンプラにみられる アポトーシスは、 傷害部位を限局させることにより脳全体の傷害を防止する一種 の保護機構として機能するものであると考えられる (非特許文献 1参照) 上述した脳虚血時にみられるネクローシスからアポト一シスへの細胞死形態の 変換は、 ある特定の物質によって引き起こさせるものと推定されているが （非特 許文献 1参照） 、 現在までのところ、 その物質は明らかになっていない。
本発明は、 以上のような技術的背景の下になされたものであり、 ネクローシス からアポトーシスへ細胞死形態を変換することのできる物質を特定することを目 的とする。
〔非特許文献 1〕 植田弘師， 濱邊和歌子 日薬理誌 119, 79-88 (2002) 発明の開示
本発明者は、 上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、 サイモシンの前 駆体であると考えられていた PTA1が（A)神経細胞に作用し、 ネクロ一シスを抑 制する機能 （ネクローシス抑制機能） 、 （B ) 神経細胞に作用し、 アポトーシス を促進する機能 (アポトーシス促進機能)、及び ( C )マイクログリアに作用し、 アポトーシスを抑制する物質 （神経栄養因子） の分泌を促進し、 間接的にアポト 一シスを抑制する機能（間接的アポトーシス抑制機能）を有することを見出した。 以上の機能から、 神経細胞に対してのみ作用する場合 （培養神経細胞に PTA1 を添加するような場合） には、 PTA1は神経細胞の細胞死形態をネクロ一シスから アポトーシスに変換し、 神経細胞とマイクログリアに作用する場合 （in vivo で PTA1を投与するような場合） には、 PTA1は神経細胞のネクロ一シス及びアポトー シスの両者を抑制することになる。
本発明は、 以上の知見から完成されたものである。
即ち、 本発明は、 PTA1又はこれと同等の機能を有するタンパク質若しくはぺプ チドを有効成分として含有する神経細胞死抑制剤である。
また、 本発明は、 PTA1又はこれと同等の機能を有するタンパク質若しくはぺプ チドを有効成分として含有する神経細胞死を伴う疾患の治療剤である。
更に、 本発明は、 配列番号 4又は配列番号 5記載のアミノ酸配列で表されるぺ プチド又はこれらのペプチドと実質的に同一のペプチドである。
以下、 本発明を詳細に説明する。
PTA1は、 既知のタンパク質であるが、 上述したネクロ一シス抑制機能、 アポト 一シス促進機能、 間接的アポトーシス抑制機能を有することは、 本発明者によつ て初めて見出されたものである。
これらの 3つの機能は、以下のような機序で発現するものと推定される（図 1)。
(A) ネクロ一シス抑制機能 -
1) 神経細胞における PTA1の受容体との結合
2) グルコーストランスポ一夕一の細胞表面への移動
3) 細胞内のグルコース量増大
4) ミトコンドリアからの ATP産生量の増大
5) ネクローシスの抑制
(B) アポトーシス促進機能
1) 神経細胞における PTA1の受容体との結合
2)神経細胞における Baxおよび Bimタンパク質の発現増大と Bel- 2および Bd-xL タンパク質の発現減少
3) ミトコンドリアからのチトクローム cの放出
4) カスパーゼの活性化
5) CADの活性化
6) アポ卜一シスの促進
(C) 間接的アポトーシス抑制
1) グリア細胞における PTA1の受容体との結合 -
2) グリア細胞における神経栄養因子およびサイトカイン遺伝子の発現増大
3)神経細胞における神経栄養因子受容体 （Trk) およびサイトカイン受容体の活 性化
4) アポ卜一シスの抑制
以上の知見から、 PTA1は、 神経細胞死抑制剤として利用することができる。 神経細胞抑制剤に使用する PTA1は特に限定されず、 ヒト由来の PTA1、 ラット 由来の PTA1、 マウス由来の PTA1などを使用することができる。 これらの生物か ら実際に得られた PTA1のアミノ酸配列を図 2に示す。 また、 これらの PTA1の中 から特に 3種類の PTA1のアミノ酸配列を配列番号 1 (ヒト由来）、配列番号 2 (ラ ット由来） 、 配列番号 3 (マウス由来） に示し、 更に、 各配列を整列させた図を 図 3に示す。 ヒト、 ラット、 マウス以外の生物由来の PTA1としては、 ゥシ由来の PTA1、 力エル由来の PTA1なども使用することができる。 これらの PTA1のァミノ 酸配列は、 GenBank等にそれぞれ Access ion No. TNB0A1, CAC39397として登録さ れている。
PTA1の代わりに PTM と同等の機能を有するタンパク質若しくはペプチドを使 用することもできる。 ここで 「PTA1と同等の機能を有するタンパク質若しくはべ プチド」 とは、 PTMの持つネクロ一シス抑制機能、 アポト一シス促進機能、 間接 的アポ卜一シス抑制機能のすべて又は一部を持つタンパク質若しくはペプチドを 意味する。 このようなタンパク質若しくはペプチドとしては、 例えば、 配列番号 1、 配列番号 2、 又は配列番号 3記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数個 のアミノ酸が欠失、 置換若しくは付加したアミノ酸配列で表されるタンパク質が 含まれる。 ここで、 欠失等するアミノ酸の個数は特に限定されないが、 通常は、 20個以内であり、好ましくは 10個以内であり、特に好ましくは 5個以内である。 また、 「PTA1と同等の機能を有するペプチド」 には、 PTA1から得られ、 上述した ネクロ一シス抑制機能等を有するペプチドフラグメントも含まれる。 このような フラグメントとしては、 配列番号 4又は配列番号 5記載のァミノ酸配列で表され るべプチドゃこれらのぺプチドと実質的に同一のぺプチドを例示することができ る。 ここで 「実質的に同一のペプチド」 とは、 配列番号 4又は配列番号 5記載の ァミノ酸配列において 1若しくは複数個のァミノ酸が欠失、 置換若しくは付加し たアミノ酸配列で表され、 PTA1の持つネクローシス抑制機能、 アポトーシス促進 機能、 間接的アポ卜一シス抑制機能のすべて又は一部を持つペプチドをいう。 欠 失等するアミノ酸の個数は特に限定されないが、 通常 5個以内であり、 好ましく は 3個以内であり、 特に好ましくは 1個である。 なお、 図 2中の配列番号 4に対 応するアミノ酸配列 （図 2において ラット活性本体のァミノ酸配列と同じ列に 位置するアミノ酸配列） で表されるぺプチドは、 この 「実質的に同一のペプチド」 に含まれる。
PTA1は、マイクログリアが存在する条件では間接的にアポトーシスを抑制する が、 マイクログリアが存在しない条件ではアポトーシスを抑制しない （逆にアポ 卜一シスを促進する） 。 従って、 本発明の神経細胞死抑制剤は、 使用の態様によ り、 ネクローシスのみを抑制する場合とネクロ一シスとアポトーシスの両者を抑 制する場合とがある。
本発明の神経細胞死抑制剤の適用対象とする神経細胞は特に限定されず、 大脳 皮質、 線条体、 中脳、 海馬、 小脳、 脊髄、 視覚器由来の神経細胞などの細胞死の 抑制に適用できる。
PTA1は、 神経細胞死抑制剤としてだけでなく、 神経細胞死を伴う疾患の治療剤 としても利用することができる。 ここで 「神経細胞死を伴う疾患」 とは、 アポト —シス、 ネクローシス、 又はその両者を伴う疾患をいう。 このような疾患には、 脳卒中、 外傷性脳傷害、 緑内障、 糖尿病性網膜症又は網膜剥離治療時の圧迫性傷 害などの虚血が原因となっている疾患が含まれるほか、 虚血以外の原因による疾 患や原因がよくわからない疾患、 例えば、 アルツハイマー、 ハンチントン病、 パ 一キンソン病、 筋萎縮性側索硬化症、 多発性硬化症なども含まれる。 なお、 ここ でいう 「治療」 には、 疾患を完治させる場合のみならず、 病状を軽減させる場合 や病状の悪化を阻止する場合なども含まれる。
本発明の神経細胞死を伴う疾患の治療剤は、 PTA1を公知の方法に従い薬学的に 許容される担体あるいは希釈剤と混合することにより製剤化される。 適当な担体 および希釈剤、 並びにタンパク質を含む製剤については、 例えば Remington' s Pharmaceut ical Sc iences等に記載されている。
PTA1に関して、 投与に適した剤型は特に限定はされないが、 既に医薬として使 用されている多くのタンパク質を含む薬学的組成物と同様に注射剤として調製さ れることが好ましい。 より具体的に言えば、 PTA1を、 水、 生理食塩水、 等張化し た緩衝液等の適当な溶媒に溶解することで注射剤とする。 その際、 ポリエチレン ダリコール、 グルコース、 各種アミノ酸、 コラーゲン、 アルプミン等を保護材と して添加して調製可能である。 また リボソーム等の封入体にボリペプチドを包 埋させて投与することも可能である。
PTA1を上述した疾患の治療に用いるとき、 その用量は、 対象の年齢、 体重、 病 状、 および投与経路、 その他の要素により異なるが、 投薬する医師が容易に適宜 決定することができる。例えば； 緑内障治療のため硝子体内投与する場合には、 1 回量約 0. 0012 mg〜0. 012 mgの投与であり、 脳卒中治療のため脳室内投与する場 合には、 1日量約 0. 012 mg〜l. 2 mgの投与である。 PTA1の投与方法は特に限定されず、脳内投与する場合も現在実際に行われてい る様々な投与方法を採用することができる。 このような投与方法の一例として、 大槽内投与を挙げることができる。 大槽内投与は、 脳実質を傷つけないという点 で有利である。 図面の簡単な説明
第 1図は、神経細胞及びマイクログリアに対する PTA1の作用を模式的に表した 図である。
第 2図は、 ヒト、 ラット、 マウスなどの生物から実際に得られた PTA1のァミノ 酸配列を示す図である （図 2 aのアミノ酸配列の右端と図 2 bのアミノ酸配列の 左端がつながり、 図 2 bのアミノ酸配列の右端と図 2 cのアミノ酸配列の左端が つながる。 ) 。
第 3図は、 ヒト、 ラット、 及びマウス由来の PTA1のアミノ酸配列を示す図であ る。
第 4図は、 培養神経細胞に対して生存活性を持つタンパク質の精製工程を示す 図である。
第 5図は、 生存活性を持つタンパク質のリジルェンドぺプチ夕ーゼ消化物の逆 相 HPLC分析の結果を示す図である。
第 6図は、 神経細胞の生存活性と、 ラット rPTMのコ一ティング量との関係を 示す図である。
第 7図は、 大脳皮質、 線条体、 中脳、 又は海馬由来の神経細胞の生存活性と、 ラット rPTAlのコーティング量との関係を示す図である。
第 8図は、 神経細胞の生存活性と、 神経細胞培養時に添加したラット rPTAlの 欠損部位との関係を示す図である。
第 9図は、 ラット rPTAl存在又は非存在下で培養された神経細胞の蛍光顕微鏡 写真である。
第 1 0図は、 ラット rPTAl存在又は非存在下で培養された神経細胞の透過型電 子顕微鏡写真である。
第 1 1図は、ラット rPTAl存在又は非存在下で培養された神経細胞の細胞内 ATP 含量の経時的変化を示す図である。
第 1 2図は、ラット rPTAl存在又は非存在下で培養された神経細胞の細胞内 ATP 含量変化に対する Cal C又は U-73122の添加の効果を示す図である。
第 1 3図は、ラット rPTAl存在又は非存在下で培養された神経細胞の 2- DG取り 込み作用に対する Cal C又は U-73122の添加の効果を示す図である。
第 1 4図は、 ラット rPTAl 存在又は非存在下で培養された神経細胞における GLUT1又は GLUT4の細胞中の位置を示す蛍光顕微鏡写真である。
第 1 5図は、 ラット rPTAl存在又は非存在下で培養された神経細胞におけるチ トクローム cの位置を示す蛍光顕微鏡写真である。
第 1 6図は、 ラット rPTAl によるアポトーシスメカニズム誘発機構としての Be l- 2ファミリータンパク質発現調節を示す図である。
第 1 7図は、 ラット rPTMによる神経細胞の生存活性に対する神経栄養因子の 添加効果を示す図である。
第 1 8図は、 ラット rPTAlによる神経細胞におけるチトクローム cの位置変化 と BDNF共存による変化を示す蛍光顕微鏡写真である。
第 1 9図は、 細胞及び培養上清中の PTA1量の経時的変化を示す図である。 第 2 0図は、 ラット rPTAl存在又は非存在下で培養されたマイクロダリァ及び 神経細胞における IL-6 mRNA発現量の経時的変化を示す図である。
第 2 1図は、 マウス PTA1の AS- 0DNを硝子体投与した後、 虚血処置を施したマ ウスから調製した網膜細胞層の光学顕微鏡及び透過型電子顕微鏡写真である。 第 2 2図は、 マウス rPTAlの硝子体投与を虚血前あるいは後に施したマウスか ら調製した網膜細胞層の光学顕微鏡及び透過型電子顕微鏡写真である。
第 2 3図は、 マウス rPTAlの脳室内投与後に頸動脈虚血処置を施したマウスか ら調製した前額断片切片の顕微鏡写真である。
第 2 4図は、 頸動脈虚血処置を施したマウスにおける、 Step- through潜時に対 するマウス rPTAlの脳室内投与の効果を示す図である。 発明を実施するための最良の形態 糸田
以下、 実施例により本発明を更に詳細に説明する。
最初に本実施例において使用した実験材料及び方法について説明する。
初代培養
胎生 17日胚ラットの大脳皮質の初代培養は、 Sasaki Y. Fukushima N. Yoshida A. and Ueda H. Cel lular and Molecular Neurobiology (1998) 18, 487- 496.に 記載した方法に従って行った。分散した細胞はあらかじめポリ DL-オル二チン（シ ダマ製） によりコ一ティングした 96ゥエル培養ディッシュ、 8ゥエルの Lab- Tek TMチャンバ一、 3. 5と 9cmの培養ディッシュにまき、 37°C、 5%の二酸化炭素中で 培養した。 培養上清は 5 X 105 cel ls/cm2の密度 （高密度） で 3 日間培養した上 清を Mi lexフィル夕一 (ミリポア社製) でろ過した後、 使用まで- 20 でで保存し た。 上清は低密度 （1 X 105 cel ls/cm2) 培養に添加する場合と、 培養直前に培養 プレートに加え 25°C、 2時間インキュベートし、 後に PBSで 2回洗浄する方法で コーティングする場合とによった。
乳酸脱水素酵素遊離実験
細胞傷害は、 傷害を受けた細胞から培養上清中に遊離した細胞質乳酸脱水素酵 素（LDH)の活性を、 Roche Molecular Biochemical s 社製 （ドイツ、 マンハイム） の細胞毒性検出キットを用い、 同社のプロトコールに従い測定することにより定 量した。 具体的には以下の通りである。
96ゥエル培養プレートに 3. 2 X 104cel l s/100 _d/ゥエルの 17 日胚大脳皮質細 胞をまき、 培養開始から一定の時間後、 100 1培養上清を取り、 これに 100 l の Tri ton X- 100を加え総量 200 ιι 1とした。 その 100 n 1を取り分け 96ゥェ ルプレー卜に移し、 キット反応液 100 1をさらに加え、 90分間室温暗所でイン キュペートし、 450腹の波長での吸光度測定を行い、 最大 LDH遊離量とした。 一 方、 培養上清に遊離した LDH量は培養上清（50 1)を 96ゥエルプレートに移し 50 1の 2¾ Tr i ton X- 100を加え、 さらにキット反応液 100 1を加えたのち吸 光度測定することにより求め、 最大 LDH遊離量に対するパーセント相対 LDH遊離 量として評価した。 .
WST-8
胞 の 生 存 活 性 は 2- (2-me thoxy-4-η i t ropheny 1) -3- (4-nitrop enyl) -5- (2, 4-disulfophenyl) -2H-t etrazolium, mono sodium salt (WST- 8)還元活性キット (同人研究所、 東京） を用 い、 添付のプロトコールに従って実験を行った。 WST- 8は比色測定の 3時間前加 え、 37 °Cでィンキュベ一トした。生存活性は培養開始直後の活性に対する割合（パ —セント） として求めた。
'一色素排除試験
神経細胞死は、 トリパンブルーの細胞からの排除機能低下により評価した。 培養細胞にメディゥムと同容量の 0.4%トリパンブル一液を添加し、 5分間放置 した後、 氷冷 PBSで 2回洗浄後、 PBSに溶解した 4%パラホルムアルデヒドにより 室温、 30分間固定した。 細胞死の割合は全細胞に対する割合 （％) で評価した。 細胞内 ATP量の測定
測定にはルシフェリンールシフェラ一ゼ法を ATP定量キット （モレキュラープ ローブ社、 Eugene, OR) を用いて行った。 2 x 106の全細胞を用い、 氷冷した PBS で 2回洗浄後、 細胞希釈溶液 （lOOmMTris- HC1 pH7.75， 4 mM EDTA) に懸濁した。 0.5 mMルシフェリン、 1.25 g/mlのルシフェラ一ゼと 1 mM DTTを 20 1の細 胞懸濁液に混合した。 ルシフェリン一ルシフェラ一ゼバイオルミネッセンス測定 は、 EG&Gberthold社（BadWildbad, Germany)の LUMAT LB 9507を用いて行った。 ァネキシン V結合および PI染色実験
アポトーシスとネクローシスはそれぞれロッシュ ·モレキュラーバイオケミカ ルズ社の AnnexinV- FLU0S染色 Kitとシグマ社のプロビディゥム 'ィォダイド (PI) を用いて評価した。 大脳皮質細胞を 8ゥエルの Lab-TekTMチャンバ一で培養し、 一定時間後にァネキシン Vフルォセインと 10 Mg/ml PIを添加し、 室温 15分間 喑所でィンキュベー卜した。その後細胞は氷冷 PBSで洗浄し、室温 30分間 4%PFA を用いて固定した。 蛍光は カールツァイス社の LSM410蛍光顕微鏡を用いて測定 した。
TUNEL解析
ア ポ ト 一 シ ス を 示す細 胞 に お け る DNA 断片化 は terminal deoxyribonucleotidyl transf erase-mediated dUTP-biotin nick end labeling (TUNEL)法を用いて組織化学的に測定した。 8ゥエルの Lab- TekTMチャンバ一で培 養した細胞を 10 g/ml PI と 37° (：、 30分間インキュベートし、 2回の氷冷 PBS 洗浄と 4%PFA固定の後、 50%と続き 100%の 5分間メタノール 処置により透過型 にした。その後、ロッシュ ·モレキュラーバイオケミカルズ社の TUNEL液で 37° (、 1時間処置し、 2回の PBS洗浄、 室温 1時間のプロック液（PBSに溶解した 1 %ゥ シ血清 ア ル ブ ミ ン 、 H7.4 ) と の イ ンキ ュ ベー ト 後、 さ ら に streptavidin - fluorescein isothiocyanate (FITC) (1:100; Vector Laboratories, Burlingame, CA) と室温 1.5時間インキュベートし、 蛍光顕微鏡測定を行った。 活性型カスパーゼ 3の免疫細胞化学
8 ゥエルの Lab-TekTMチャンバ一で培養した細胞を PFA で固定した後、 0.1% Triton X- 100で透過型にした。室温で 1時間ブロック液（2% low-fat mi lk powder, 2% ゥシ血清アルブミン， 0.1¾ Tween-20を pH 7.4 PBSに溶解したもの）とィンキ ュペートし、 活性型カスパーゼ 3抗体（1:50; Cell Signal ing)と室温 2時間イン キュペート、 洗浄の後、 FITC結合型抗ゥサギ IgG抗体（1:200; Cappel, Aurora) と室温 4時間インキュベートし、 蛍光顕微鏡観察を行った。 培養大脳皮質細胞を 0.1Mリン酸緩衝液 （pH7.4)に溶解した .5%ダルタルアル デヒドと室温 1時間インキュベートすることにより固定化し、後に 1%四酸化ォス ミゥムを用いて室温 1時間の後固定を行った。 続いて、 アルコール脱水の後、 Epon812包埋を行い、 Ultracut S (Leica, Austria)を用いて 80 nmの超薄切片作 製を行った。切片は酢酸ウランとクェン酸鉛を用いてそれぞれ 30と 5分間の染色 を行い、 電子顕微鏡（JEM- 1210; JE0L, Tokyo, Japan)観察を行った。
ィムノプロッ卜解析
12%ポリアクリルアミドゲルを用いた SDS-ポリアクリルアミド電気泳動した 試料は一次抗体として抗カスパーゼ 8及び 9抗体（1:500; StressGen, Victoria, Canada)と抗活性型カスパーゼ 3抗体（1:500; Cell Signaling, Tokyo, Japan) , 抗 Bax、 抗 Bim、 抗 Bd- 2、 抗 Bd- xL抗体 （1:1000; Santa Cruz) を用いてィ ムノブロット解析を行った。 免疫活性バンドの検出には Pierce Chemical 社 (Rockford, IL)の増強化学発光基質（Super Signaling Substrate)を用いて horseradish peroxides測定を行った。 2 -デォキシ- D- [3H] グルコース取り込み実験
実験は、 Koivistoの方法を改良した方法に従い、 以下の通り行った。
大脳皮質細胞を、 17.5 mM グルコースを含む DMEM/F- 12メディウムを入れた 6 ゥエルプレート中で培養した。プレートは、 リコンビナン小 PTA1をコーティング したものと、 コーティングしないものとを用いた。 培養開始から一定時間後に
[3H] -2-DG (l Ci/well, 10 nM)を添加し、 37°C、 2時間さらにインキュベートし た後、 上清の除去と 2回の氷冷 PBSによる洗浄を行った。 細胞は IOO Iの 0.5M NaOH溶液で溶解し、 0.5M塩酸で中和した後、 放射活性を液体シンチレーシヨン カウンタ一により測定した。
PKCキナーゼ活性測定
培養細胞は 50 mM Tris - HCl, pH 7.5， 0.3% j3 -mercaptoethanol, 5 mM EDTA, 10 mM EGTA, 50 g/ml PMSF, 10 mM benzamidineを含む緩衝液で懸濁した後、 同容 量のグリセロールと混合し、 氷上でホモジェナイズした。 PKC 活性は Amersham Pharmacia Biotech社（Piscataway, NJ)のプロティンキナーゼ C酵素活性測定シ ステムを用い、 添付プロトコールの手法に従った。 培養試料 [S] を PKCでリン酸 化される基質 (0.3mg/ml La-phosphat idyl-L-ser in) と混合し 50 mM Tris- HCl (pH 7.5)、 30 mM dithiothreitol 並びに [r- 32P] ATP とマグネシウム - ATP buffer と 37 、 15分間インキュベートした。 最大 Maximum PKC 活性化量 [Max] は上記組 成に 24 rag/ml phorbol 12-myristate 13- acetate 及び 12 mM酢酸カルシウムを 添加して測定した。 バックグラウンド値 [B] は基質を除いて測定した。 停止液を 加えて反応を停止し、 ペプチド結合紙に吸着させた。 この結合紙を 5 %酢酸で 2 回洗浄し取り込まれた 32P放射性活性を液体シンチレ一シヨンカウン夕一により 測定した。 P C 活性は以下の数式によ り求めた。 PKC 活性化 (%) = ( [S] - [B] ) / ( [Max] - [B] ) 100
統計解析
多次元分散分析 (AN0VA)解析を行ったのちに Studentの t一検定を用いて統計的 解析を行った。 有意差は危険率 0.05%を基準とし、 全ての結果は平均 +標準誤差と して表現した。
〔実施例 1〕 タンパク質の構造決定とリコンビナントタンパク質の調製 ラット 17 日胚の大脳皮質神経細胞培養上清から陰イオン交換クロマトグラフ ィ一、ゲル濾過ク口マトグラフィ一及び SDS-PAGEにより生存活性を有する夕ンパ ク質の精製を行い、 これにより分子量約 20kDaと約 22kDaの 2種類のタンパク質 (NDI20 及び NDI22) が得られた （図 4 a及び b ) 。 なお、 生存活性の評価には WST- 8アツセィにより行った。
得られた 2種類のタンパク質をリジルエンドべプチダーゼ消化したところ、 共 に KEWEEAEの配列を持つ部分ペプチドが得られた （図 5 ) 。 また、 抽出の条件を 変化させても NDI20は安定して検出できたが、 NDI22は検出できない場合があつ た。このことから NDI 22は、 NDI20に別の小分子が吸着したものと予想され、 NDI20 を活性本体とみなした。 この NDI 20は、データベースから PTA1であることが推定 できたので、 RT-PCRによりラッ卜及びマウス型の cDNAクローンを単離、 大腸菌 に発現させ、 酸性フエノール抽出およびバイオフォレシス (アト一株式会社； AEP- 820型） によりリコンビナント PTAU以下 「rPTAl」 という）を調製した。 こ のようにして調製された rPTAlは、 もとの NDI20と同様の電気泳動上の移動度を 示し、 マススペクトル （VOYAGER; (MALDI) PerSept ive B iosys tems) での分子量 も一致した。
〔実施例 2〕 ラット rPTAlによる神経細胞死保護効果
ラット 17日胚の大脳皮質神経細胞を、無血清条件下、 ラット rPTAl存在又は非 存在下で培養し、 培養開始から 12時間後の生存活性及び細胞傷害度を評価した。 培養は低密度培養（lxlO5 ce l l s/cm2)及び高密度培養 (5xl05ce l l s/cm2) の 2通り の条件で行った (以下、 特に断りがない場合は、 低密度及び高密度培養は前述し た密度で培養するものとする。 ) 。 ラット rPTAl存在下での培養は、 ラット rPTAl を 3〜50 Pino 1 /cm2の用量で 96ゥエルの培養ディッシュに予めコ一ティングして おき、 その上に神経細胞をまいて行った。 生存活性は WST 8アツセィにより評価 し、 細胞傷害度は LDH遊離量により評価した。 また、 25pmol m2の rPTAl存在下 で培養した場合の生存活性及び細胞傷害度の経時的変化を調べた。 以上の結果を 図 6 A〜Dに示す。
図 6 Aに示すように、 ラット rPTAl非存在下で培養した場合は（図中の V)、 生 存活性が培養開始時の 40%程度にまでに低下していたが、 ラット rPTAl存在下で 培養することにより、 生存活性は用量依存的に向上した。 また、 細胞傷害度につ いても、 ラット rPTAlによる用量依存的な軽減がみられた （図 6 C ) 。
ラット 17日胚の大脳皮質、 線条体、 中脳、 及び海馬から調製した神経細胞を、 無血清条件下、 0〜50pmol/cm2のラット rPTAl存在下で低密度培養し、 12時間後 の生存活性 （WST- 8アツセィによる） を評価した。 また、 後根神経節 （DRG) 細胞 と大脳皮質神経細胞を、 無血清条件下、 ラット rPTAl存在下で低密度培養し、 12 時間後の細胞死率をトリパンブル一色素排除試験を用いて調べた。 以上の結果を 図 7に示す。
図 7 Aに示すように、 ラット rPTAlによる生存活性の向上は、 大脳皮質だけで なく線条体、 中脳、 及び海馬由来の神経細胞においても観察された。 大脳皮質や 海馬の神経変性はアルツハイマーや老人性痴呆に関連する脳領域であり、 線条体 の神経変性はハンチントン病に関連し、 中脳変性ではパーキンソン病に関連する ことが知られている。 従って、 ラット rPTAlは、 こうした幅広い神経変性疾患に 有効である可能性がある。
図 7 Bに示すように、 大脳皮質神経細胞では、 ラット rPTAl存在下で培養する ことにより用量依存的に細胞死率が低下したが、 DRG細胞では、 細胞死率の低下 はみられなかった。
〔実施例 3〕 rPTAl欠失変異体による神経細胞死保護効果
ダル夕チオン S-トランスフェラーゼ （GST) とラット rPTAl欠失変異体融合夕 ンパク質発現クローン作製のため、 欠失変異体それぞれの領域に対応するプライ マ一を用いて、 すでにクローニング済みのラット rPTAl全長のクローンを錡型に PCRを行った。 得られた PCR産物は PGEX-5X- 1ベクターにクローニングした。 欠 失変異体の GST融合タンパク質は常法により発現させ， 菌体抽出液よりダル夕チ オン一セファロ一スカラムを用いて精製した。
このようにして作製した rPTAl欠失変異体を 12% SDS-PAGE による電気泳動に よって分画し、 クーマシープリリアントブルー (CBB) 染色によって可視化したと ころ、 予想されるサイズにバンドが観察されたので (図 8 A) 、 これらを用いて ラッ卜 17日胚の大脳皮質神経細胞の生存活性を評価した。 25 pmol/cm2の rPTAl 欠失変異体の添加による生存活性は、無血清低密度培養条件下、培養開始 12時間 後に測定した。 この結果を図 8 Bに示す。
図 8 Bで示すように、 rPTAlの N末端より 48番目のアミノ酸までを欠失させた 変異体および 79番目から 112番目までのアミノ酸を欠失させた変異体は、 rPTAl の完全長と同程度の生存活性の向上が見られたが、 N末端より 68および 86番目 のアミノ酸までを欠失させた変異体と 30番目から 112番目、 58番目から 112番 目までのアミノ酸を欠失させた変異体の生存活性の向上は著明に減弱した。
これらの事実から、 ラット rPTAlの活性本体が 49番目から 78番目のアミノ酸 領域であることが予想される。 なお、 この 49-78のフラグメントのアミノ酸配列 を配列番号 4に示す。 また、 ヒト PTA1において、 このフラグメントに対応するフ ラグメントのアミノ酸配列を配列番号 5に示す。
〔実施例 4〕 ラット rPTAlによる神経細胞死モ一ドスイッチ
8ゥエルの Lab- TekTMチャンバ一にラット 17日胚大脳皮質神経細胞をまき、無 血清条件下、 ラット rPTAl (25 pmol/cm2) 存在又は非存在下で低密度及び高密度 培養し、 3〜24 時間後の細胞の状態を蛍光顕微鏡で観察した。 細胞は、 （1 ) PI 染色と Annexin V染色、 （2 ) PI染色と活性型カスパーゼ 3免疫蛍光染色、 （3 ) PI染色と TUNEL染色の 3通りの方法で染色した。この結果を図 9 a〜c、 e〜g、 i〜kに示す。 また、 各染色方法によって染色された細胞の数を図 9 d、 h、 i に示す。
これらの図に示すように、 ラット rPTAl非存在下で低密度培養した場合には、 ネクロ一シスの指標となる PI染色による赤色蛍光が観察されたが、アポトーシス の指標となる Annexin Vによる緑色蛍光は観察されなかった。 逆に、 高密度培養 及びラッ卜 rPTAl存在下での低密度培養では、 ネクロ一シスの指標となる赤色蛍 光は観察されず、 アポト一シスの指標となる緑色蛍光が観察された。 同様な結果 が PI染色と活性型カスパーゼ 3免疫蛍光染色、 PI染色と TONEL染色によっても 確認された。 これらの事実から、 ラット rPTAlは神経細胞のネクローシスをアポ ト一シスに変換させる作用があることが明らかになった。
〔実施例 5〕 透過型電子顕微鏡観察によるラット rPTAlの神経細胞死モードス ィッチ作用
ラット Π日胚大脳皮質神経細胞を、無血清条件下、 ラット rPTAl (25 pmol/cm2) 存在又は非存在下で低密度及び高密度培養し、培養開始から 12時間後の細胞の状 態を透過型電子顕微鏡で観察した。 この結果を図 1 0に示す。
図 1 0に示すように、 ラット rPTAl非存在下で低密度培養した細胞では、 細胞 膜の傷害、 細胞質部分における電子密度の顕著な低下、 ミトコンドリアの膨潤化 などが観察された。 一方、 ラット rPTAl存在下で低密度培養をした場合では、 細 胞膜傷害ゃミトコンドリア膨潤化は観察されなかったが、 核の断片化や核クロマ チンの凝縮といったアポト一シスに見られる現象が観察された。こうした現象は、 高密度培養でも観察された。
〔実施例 6〕 ネクローシス機構としての ATP含量低下に対するラット rPTAlの 抑制効果
ラット Π日胚の大脳皮質神経細胞を実施例 5と同様の条件で培養し、細胞内の ATP含量の経時的変化を調べた。 この結果を図 1 1に示す。
図 1 1に示すように、 ラット rPTAl非存在下で低密度培養を行った場合には、 細胞内 ATP含量は急速に低下し、 18時間後にはほぼ 0レベルになった。 しかし、 高密度培養及びラット rPTAl存在下での低密度培養では、 細胞内 ATP含量の低下 は有意に抑制された。
〔実施例 7〕 ラット rPTAlによるネクロース抑制効果のホスホリパ一ゼ Cとプ ロティンキナーゼ Cを介するメカニズム
ラット 17日胚大脳皮質神経細胞を、 無血清条件下で低密度及び高密度培養し、 培養開始から 6 時間後の細胞内 ATP 含量を調べた。 培養は、 ラット rPTAl (25 pmol/cm2) 存在又は非存在下で行い、 培赛開始直後にカルフォスチン C (Cal 0 又は U- 73122 (U22)を 1 /i Mになるように添加した。 この結果を図 1 2 Aに示す。 なお、 カルフォスチン Cはプロテインキナーゼ C (PKC)阻害剤であり、 ϋ- 73122は ホスホリパーゼ C (PLC)阻害剤である。図 1 2 Aに示すように、 ラット rPTAl存在 下で培養することにより、 ATP含量の低下は抑制されたが、 この効果は Cal C及 び U- 73122の添加により消失した。
さらにラット rPTAlによる細胞内 ATP含量の低下の抑制のメカニズムを調べた。 図 1 2 Bに示すように、 ラット rPTAl存在下で培養することにより、 ATP含量の 低下は抑制されたが、 この効果はグルコースの取り込み阻害剤である 2—デォキ シグルコース （2- DG) 、 解糖系の阻害剤であるヨウ化酢酸 （IA) 及びミトコンド リアでの ATP産生の阻害剤であるオリゴマイシン（01 i go)の添加により消失した。 したがってラット rPTAlによる細胞内 ATP含量低下の抑制は細胞によるダルコ一 ス取り込みの後に生じる ATP産生系上昇を示唆している。
〔実施例 8〕 ラット rPTAlによるグルコース取り込み低下抑制効果
ラット Π日胚の大脳皮質神経細胞を、血清存在又は無血清条件下、ラット rPTAl
(25 pmol/cm2) 存在又は非存在下で低密度及び高密度培養し、 培養開始から 2時 間後における 2-デォキシ -D- [¾] グルコース取り込み作用を評価した。 この結果 を図 1 3に示す。
図 1 3に示すように、 無血清条件下での培養では、 血清存在下での培養と比較 し、 2 -デォキシ -D- [ ] グルコース取り込み作用が 10 %以下に低下した。 ラット rPTAl 存在下で培養することにより、 2-デォキシ- D- [¾] グルコース取り込み作 用は、 血清存在下での培養時の 65 %程度にまで回復した。 しかし、 この低下抑制 効果も Cal C又は ϋ- 73122を添加することにより消失した。 ΑΤΡ含量の急速な低 下は、 グルコース取り込み作用の低下と関連することが明らかとなり、 ラット rPTAlの ATP含量低下抑制効果における第一次反応は、 グルコース取り込み作用 の低下抑制によるものであることが示唆された。
〔実施例 9〕 ラット rPTAlによるグルコーストランスポーターの細胞膜表在化 効果
ラット 17日胚の大脳皮質神経細胞を低密度培養し、培養開始から 2時間後の細 胞の状態を蛍光顕微鏡で観察した。 培養は、 血清 （10%FBS) 存在又は無血清条件 下、 ラット rPTAl (25 mo l/cm2) 存在又は非存在下で行い、 培養開始直後に Cal C を 1 Mになるように添加した。 また、 細胞は、 GLUT 1又は GLUT4 (これらはグル コーストランスポーターである） を認識する一次抗体と一次抗体を認識する蛍光 標識した二次抗体で染色した。 この結果を図 1 4に示す。
図 1 4に示すように、 GLUT1 と GLUT4の細胞膜表在化は、 血清存在下で培養し た細胞では観察されたが、 無血清条件下で培養した細胞では観察されなかった。 ラット rPTAl存在下で培養した細胞では、血清が存在しなくても、 GLUT1と GLUT4 の細胞膜表在化が観察されたが、 Cal C を添加した場合には、 このような表在化 は消失した。 実施例 6— 9の結果からラット rPTAlは細胞膜に存在することが期 待される受容体を介し、 続いて PLCと PKCの活性化、 GLUT 1 と GLUT4の細胞膜表 在化、 グルコース取り込みの促進、 ATP 産生増加といったメカニズムを駆動する ことが証明された。
〔実施例 1 0〕 ラット rPTAlによるアポト一シスメカニズム誘発機構としての ミトコンドリアからのチトクローム C (Cyto C)遊離作用
ラット 17日胚の大脳皮質神経細胞を、無血清条件下で低密度及び高密度培養し、 培養開始から 12 時間後の細胞の状態を蛍光顕微鏡で観察した。 培養は、 ラット rPTAl ( 25 pmol/cm2) 存在又は非存在下で行い、 培養開始直後に Cal Cを 1 Mに なるように添加した。 また、 細胞は CMRXos (赤色蛍光、 ミトコンドリアと結合） と抗 Cyto C抗体 （緑色蛍光、 Cyto Cと結合） で二重染色した。 抗 Cyto C抗体は 蛍光標識した二次抗体によって認識した。 この結果を図 1 5に示す。
図 1 5に示すように、 ラット rPTAl非存在下で低密度培養を行った場合には、 ミトコンドリアの位置に緑色蛍光が観察され、 Cyto Cは遊離せず、 ミトコンドリ ァ内に局在していた。 一方、 高密度培養やラット rPTAl存在下での低密度培養で は、 緑色蛍光が観察されず、 Cyto C がミトコンドリアから遊離していた。 また、 このような Cyto Cの遊離は、 Cal Cにより抑制された。
Cyto C遊離は続くカスパーゼの活性化を引き起こすのでアポトーシス誘発のメ 力二ズムと考えられているので、 本実施例はラット rPTAlがアポト一シスを積極 的に誘発していることを証明している。
〔実施例 1 1〕 ラット rPTAlによるアポ! シスメカニズム誘発機構としての Bc l-2ファミリータンパク質発現調節
ラット 17日胚の大脳皮質神経細胞を、無血清条件下で低密度培養し 培養開始 から経時的に細胞を回収し、 ィムノブロッテイング法で解析を行った。 培養は、 ラット rPTAl (25 pmol/cm2) 存在又は非存在下で行い、 培養開始直後に Cal Cお よび U73 122を Mになるように添加した。
低密度培養における 25 pmol/cm2のラット rPTAl処置は Cyto C遊離に促進的な Bax発現の時間依存性の増加を引き起こし （図 1 6 A、 B ) 、 また同様な機能を 有する Bim発現を増加した（図 1 6 B )。対照的に、 Cyto C遊離抑制に働く Bd-2 と Bd- xLの発現を低下させた （図 1 6 A、 B ) 。 ラット rPTAlによる Bax増加作 用は U73122と Cal Cにより遮断された （図 1 6 C ) 。 実施例 1 0と 1 1の成績か らラット rPTAlによるアポトーシスメカニズム誘発機構はネクローシス抑制と同 様 PLCと PKCを介し、 Bd- 2ファミリータンパク質の発現調節を介してミトコン ドリァからの Cyto C遊離を促進させカスパーゼ系の活性化等のアポト一シスメカ ニズムにつながることが証明された。
〔実施例 1 .2〕 神経栄養因子によるラット rPTAlの細胞死抑制作用増強 ラット 17日胚の大脳皮質神経細胞を、無血清条件下で低密度培養し、培養開始 から 12時間後の生存活性 （WST- 8アツセィによる） を評価した。 培養は、 ラット rPTAl (25 mo l/cm2)存在又は非存在下で行い、 また、培養開始直後に NGF、 BDNF、 bFGF、又は IL6を l OOng/mlになるように添加して行った。 この結果を図 1 7に示 す。
図 1 7に示すように、 神経栄養因子の添加は、 ラット rPTAlの細胞死抑制作用 を増強した。 しかし、 これら神経栄養因子単独では、 細胞死を抑制する効果はな かった。
〔実施例 1 3〕 BDNFによるラット rPTAlのもつアポトーシス誘発効果の抑制 ラッ卜 17日胚の大脳皮質神経細胞を、無血清条件下で低密度培養し、培養開始 から 12時間後の細胞の状態を蛍光顕微鏡で観察した。 培養は、 ラット rPTAl (25 pmo l/cm2) 存在又は非存在下で行い、 培養開始直後に BDNFを lOOng/ml になるよ うに添加した。 また、 細胞の染色は、 CMRXos (赤色蛍光、 ミトコンドリアと結合） による染色、 二次抗体を蛍光標識し認識させた抗 Cyto C抗体 （緑色蛍光、 Cyto C と結合） による染色による二重染色で行った。 この結果を図 1 8に示す。
ラット rPTAlのもつ Cyto C遊離作用は、 BDNF添加により完全に抑制された。 実施例 1 2と 1 3から rPTAlは大脳皮質神経細胞のネクローシスを抑制し、 神経 栄養因子により保護される形のアポトーシス形態にスィツチさせることが証明さ れた。
〔実施例 1 4〕 無血清ストレスによる内在性 PTA1の神経細胞からの遊離 ラッ卜 17日胚の大脳皮質神経細胞を、 無血清又は血清存在下で高密度培養し、 内在性 PTA1の遊離量と PTA1の細胞内含量を定量した。 内在性 PTA1 遊離は、 培養上清の酸性フエノール抽出により濃縮精製し、 SDS- PAGE展開の後、 ブルースティン法により可視化して定量した。 一方、 細胞内 含量はそのまま抽出して同様に定量した。 この結果を図 1 9に示す。
図 1 9に示すように、 無血清条件下での培養では、 時間に依存した内在性 PTA1 遊離が観察され、 逆に細胞内含量は時間依存的に低下した。 また血清存在下での 培養では、 このような内在性 PTA1遊離は観察されなかった。 このことから、 この 遊離は無血清あるいは飢餓ストレス誘発性の非古典的遊離であることが示唆され た。
〔実施例 1 5〕 ラット rPTAlによるマイクログリア神経栄養因子遺伝子発現増 加
ラット 17 日胚の大脳から調製したマイクログリアを培養し、 一時的に血清を 1 %にした条件下でラット rPTAl (25pmo l/cm2)を添加し、 IL-6の mRNA量（RT-PCR 法で定量） の時間的変化を測定した。 同様の実験は、 マイクログリアの代わりに 低密度無血清培養したラッ卜 17日胚の大脳皮質神経細胞を用いて行った。 また、 ラット rPTAlの添加量を変化させ、ラット rPTAl添加から 1時間後の IL- 6の mRNA 量を測定した。 この際、 比較のためシクロフィリンの mRNA量も測定した。 以上の 結果を図 2 0 A、 B及び Cに示す。
ラット rPTAlの添加により、マイクログリアの IL- 6遺伝子の発現量が顕著に増 大した （図 2 O A) 。 このような遺伝子発現の増大は、 0. 1から 25pmo l/ciii2の用 量範囲で観察された （図 2 0 B ) 。 また、 神経細胞ではこのような遺伝子発現の 増大は観察されなかった （図 2 0 C ) 。
〔実施例 1 6〕 アンチセンス法による内在性 PTA1含量低下による網膜虚血スト レス誘発性神経細胞死の増悪効果
虚血処置を施した ddY系マウスから摘出した網膜をパラフィン包埋し 網膜細 胞層の切片を調製した。 この切片をへマトキシリン -ェォジン染色した後、光学顕 微鏡を用い観察した。 さらにエポキシ樹脂に包埋した切片を作成し、 外顆粒層を 透過型電子顕微鏡で観察した。 虚血処置は、 マウス前眼房に 130 mmHg の圧力を 45 分間適用による網膜虚血を行い、 その後常圧に戻す再灌流モデルを採用した。 また、 虚血処置 120時間前、 72時間前、 24時間前の 3回マウス PTA1遺伝子のァ ンチセンスオリゴデォキシヌクレオチド（AS- 0DN、 ACT GCC GCG TCT GAC ATG GT) とミスセンスオリゴデォキシヌクレオチド（MS_ODN、 AGT GCA GCT TCG CAC CTG GT ) を硝子体に g/l l/—回の用量で投与した。虚血処置 4日後の網膜細胞層切片 の写真を図 2 1 Bに、虚血処置 24時間後の外顆粒層切片の写真を図 2 1 Fにそれ ぞれ示す。
また、 顕微鏡の画像から視神経節細胞層、 内顆粒層、 及び外顆粒層の各々に含 まれる細胞数を計測した。 この結果を図 2 1 C、 D、 Eに示す。
更に、 AS- 0丽及び MS-0DNを投与した際の PTA1のタンパク質量（酸性フエノー ル抽出により濃縮精製し、 SDS- PAGE展開の後、 ブル一スティン法により可視化） を図 2 1 Aに示す。
図 2 1 B、 C、 D、 Eに示すように、 虚血処置により網膜神経細胞層の厚みが 低下した。 AS- 0DNを投与した場合には、 更に厚みが低下したが、 MS- 0DNを投与し た場合にはそのような変化は観察されなかった。
〔実施例 1 7〕 マウス rPTAlによる網膜虚血神経傷害の抑制
虚血処置を施した ddY系マウスから網膜細胞層及び外顆粒層の切片を調製し、 透過型電子顕微鏡で観察した。 虚血処置及び切片の作製は、 実施例 1 6と同様に 行った。 虚血処置 30分前又は 24時間後に 0. 1又は 1. Opmol のマウス rPTAl と lOOpmolの Cal C又は Herb imyc in A (チロシンキナ一ゼ阻害剤） を硝子体に注入 した。 虚血処置 4 日後の網膜細胞層切片の写真を図 2 2 A〜Gに、 虚血処置 24 時間後の外顆粒層切片の写真を図 2 2 J〜Nにそれぞれ示す。
また、 顕微鏡の画像から視神経節細胞層、 内顆粒層、 及び外顆粒層の各々に含 まれる細胞数を計測した。 この結果を図 2 2 G、 H、 Iに示す。
虚血処置により網膜神経細胞層の厚みが低下したが （図 2 2 A、 B ) 、 このよ うな厚みの低下は、 マウス i-PTAlの投与により抑制された。 マウス rPTAlの投与 は、 虚血処置の前後いずれでも有効であり （図 2 2 C、 F ) 、 また、 0. lpniol 投 与、 1. Opmol投与のいずれの場合も有効であった (図 2 2 H〜 J ) 。 マウス rPTAl の投与の効果は、 Herbimyc in Aによる影響を受けなかったが （図 2 2 E ) 、 Cal C の投与により消失した （図 2 2 D ) 。
また、虚血処置により外顆粒層の細胞にネクローシスが観察された（図 2 2 J、 K) 。 マウス rPTAl前投与した場合には、 ネクローシスは抑制され、 また、 アポ トーシスも観察されなかった （図 2 2 L ) 。 マウス rPTAlを Cal Cと共に投与し た場合には、 ネクローシスが観察され、 rPTAl のネクローシス抑制効果が消失し た。 マウス rPTAlを Herb imyc in Aと共に投与した場合には、 ネクロ一シスは観察 されず、 アポトーシスが観察された。
〔実施例 1 8〕 マウス rPTAlによる脳虚血神経傷害の抑制
ddY系マウスの頸動脈を 30分間結紮した後、 再灌流し、 4日後に大脳線条体或 いは海馬領域を含む前額断面切片 （1 mm) を調製し、 これを TTC染色した後顕微 鏡で観察した。 マウスには、 虚血処置 30分前又は 24時間後に 1 pmol のマウス rPTAlの脳室内投与を行った。 この結果を図 2 3に示す。
図 2 3に示すように、マウス rPTAlを投与せずに頸動脈結紮を行った場合には、 線条体や海馬領域に白く色素が抜けた部分が観察された。 しかし、 マウス rPTAl を投与した場合には、 虚血処置前後にかかわらず、 このような色素の抜けた部分 は観察されず、 虚血処置による傷害が抑制されていた。
〔実施例 1 9〕 マウス rPTAlによる脳虚血誘発性学習障害の抑制
ddY系マウスの頸動脈を 30分間結紮した後、 再灌流し、 4日後に Step Through 型受動回避実験を行った。 マウスには、 実施例 1 8と同様に、 虚血処置 30分前又 は 24時間後に 10 pmolのマウス rPTAlの脳室内投与を行った。 Step Through型 受動回避実験の結果を図 2 4に示す。
図 2 4に示すように、 虚血処置したマウスでは、 偽処置対照と比較し暗室移動 までの潜時の顕著な遅延が観察されたが、 マウス rPTAlを投与した場合には、 虚 血処置前後にかかわらず、 この潜時の遅延が消失した。 本明細書は、 本願の優先権の基礎である日本国特許出願、 特願 2003-015735号 の明細書および Zまたは図面に記載されている内容を包含する。 また、 本発明で 引用した全ての刊行物、 特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にと り入れるものとする。 産業上の利用可能性 本発明により、 神経細胞のアポトーシスゃネクローシスを抑制することができ るようになる。 これにより、 脳卒中、 緑内障などの神経細胞死を伴う疾患の治療 が可能になる。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . プロサイモシンひ 1又はこれと同等の機能を有するタンパク質若しくはぺプ チドを有効成分として含有する神経細胞死抑制剤。
2 . プロサイモシン 1が、 配列番号 1、 配列番号 2、 又は配列番号 3記載のァ ミノ酸配列で表されるタンパク質である請求項 1記載の神経細胞死抑制剤。
3 . プロサイモシン α 1と同等の機能を有するペプチドが、 配列番号 4又は配列 番号 5記載のアミノ酸配列で表されるペプチドである請求項 1記載の神経細胞死 抑制剤。
4 . 神経細胞死が、 アポトーシス及びネクローシスである請求項 1乃至 3のいず れか一項記載の神経細胞死抑制剤。
5 · プロサイモシンひ 1又はこれと同等の機能を有するタンパク質若しくはぺプ チドを有効成分として含有する神経細胞死を伴う疾患の治療剤。
6 . プロサイモシン α ΐが、 配列番号 1、 配列番号 2、 又は配列番号 3記載のァ ミノ酸配列で表されるタンパク質である請求項 5記載の神経細胞死を伴う疾患の 治療剤。
7 . プロサイモシン a 1と同等の機能を有するペプチドが、 配列番号 4又は配列 番号 5記載のアミノ酸配列で表されるペプチドである請求項 5記載の神経細胞死 を伴う疾患の治療剤。
8 . 神経細胞死が、 アポト一シス及びネクロ一シスである請求項 5乃至 7のいず れか一項記載の神経細胞死を伴う疾患の治療剤。
9 . 神経細胞死を伴う疾患が、 脳卒中、 外傷性脳傷害、 緑内障、 糖尿病性網膜症 又は網膜剥離治療時の圧迫性傷害である請求項 5乃至 8のいずれか一項記載の神 経細胞死を伴う疾患の治療剤。
1 0 . 配列番号 4又は配列番号 5記載のアミノ酸配列で表されるペプチド又はこ れらのぺプチドと実質的に同一のぺプチド。
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