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WO2004053127A1 - Method of constructing assigned molecule and library comprising the same and method of using the same - Google Patents

Method of constructing assigned molecule and library comprising the same and method of using the same Download PDF

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WO2004053127A1
WO2004053127A1 PCT/JP2003/014750 JP0314750W WO2004053127A1 WO 2004053127 A1 WO2004053127 A1 WO 2004053127A1 JP 0314750 W JP0314750 W JP 0314750W WO 2004053127 A1 WO2004053127 A1 WO 2004053127A1
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WO
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library
protein
sequence
molecule
rna
Prior art date
Application number
PCT/JP2003/014750
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French (fr)
Japanese (ja)
Inventor
Etsuko Miyamoto
Masamichi Ishizaka
Hiroshi Yanagawa
Original Assignee
Keio University
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Filing date
Publication date
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1093—General methods of preparing gene libraries, not provided for in other subgroups

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing and utilizing a library of assigning molecules and their components.
  • the present invention relates to a method for producing and using a library of assigning molecules and their components.
  • Non-patent Documents 1 and 2 the base sequences of the genomes of various organisms are being decoded.
  • Non-patent Document 3 the second act of post-sequence research involves analyzing the meaning of the decoded genomic information, that is, analyzing the structure and function of genes and proteins.
  • Non-patent Document 5 immunoprecipitation
  • Non-patent Document 6 pull-down atssie by GST fusion protein
  • Non-patent Document 7 TAP method
  • yeast-one-hybrid method yeast-one-hybrid method
  • Non-patent Document 9 the method described below, which features “association of genes (genotypes) and proteins (phenotypes)” originally born as a tool for evolutionary molecular engineering, also involves the interaction between proteins in post-genome functional analysis. Is expected to be a method of analyzing the data (Non-Patent Document 9).
  • Non-patent Document 10 Non-patent Document 11, Patent Document 1
  • STABLE method Non-patent Document 12
  • phage display method Non-patent Document 13
  • ribosome Display method
  • Non-patent Document 14 Patent Document 2
  • mA-peptide fusion mRNA display;
  • Such bost genome functional analysis is expected to create drugs by discovering important biological enzymes from the analysis of interaction networks between proteins and between proteins and nucleic acids, and is expected to be used in many fields such as medicine, food, energy, and the environment. In these industries, excellent network analysis technology is desired.
  • a method for preparing an RNA library or a cDNA library used for analysis of interactions with a protein is an essential elemental technology.
  • Various tools have been developed for post-genomic structure and functional analysis research. Regardless of the analysis method, an RNA library or a cDNA library is indispensable for the analysis between proteins and between proteins and nucleic acids.
  • Non Patent Literature 10 Non Patent Literature 11, Patent Literature 1, Patent Literature 3
  • IVV in vitro virus
  • Non Patent Literature 10 Non Patent Literature 10, Non Patent Literature 11, Patent Literature 1, Patent Literature 3
  • RNA or Techniques known so far for creating a cDNA library include a method of constructing a library from an A library extracted from a tissue or an existing cDNA library via cloning into an expression vector, or cloning.
  • There was a method of directly constructing a library without intervention Non-Patent Document 16).
  • a library that includes a template that does not include a 3 ′ UTR suitable for a library of associating molecules (IVV) and that does not shorten the average length of a library, such as when a random primer is used at both ends, is used.
  • the challenge is to achieve one.
  • the present inventors can create a library with high template efficiency that does not contain UTR and is suitable for IVV, even from an mRNA library.
  • the present inventors have found that the problem that the average length when using is shortened can be solved, and completed the present invention.
  • CDNA constituting the assigning molecules cDNA library one comprises a sequence having promoter evening one and Enhansa foremost 5 3 end, or from 1 to 4 including the Akusepu evening one sequence of Raige one Chillon 3 'end The production method according to item 1.
  • a method for producing an assigning molecule RNA library comprising transcribing an assigning molecule cDNA library obtained by the production method according to any one of 1 to 6.
  • the spreader has puromycin or a puromycin derivative at the terminal opposite to the terminal ligated to the associating RNA molecule, and has a nucleotide sequence equivalent to 10-lOObp in length, and The supplier is the puromycin or puroma.
  • a method for producing a protein random priming library comprising: translating an assigning molecule ligated A library obtained by the production method described in 13.8 or 10 with a cell-free translation system to form a protein. .
  • a method for producing a protein random priming library comprising translating an assigning molecule RNA library obtained by the production method according to 14.7 in a cell to form a protein.
  • mapping molecule random braining live including translating a mapping molecule-ligated RNA library obtained by the production method described in 8 or 9 into cells to form a mapping molecule. Rari's manufacturing method.
  • a method for producing a protein random priming library comprising translating an assigning molecule ligated MA library obtained by the production method according to 16.8 or 10 into cells to form a protein.
  • a protein-nucleic acid interaction analysis method for analyzing an interaction between a nucleic acid library and a protein, wherein the library is any one of 1, 5, 7 to 10 The above method, which is a library obtained by the method.
  • a method for creating a functional protein by evolutionary molecular engineering including screening of the library, wherein the library is a library obtained by the production method according to 12 or 15.
  • a method for analyzing protein-protein interaction comprising: performing the method for analyzing protein-protein interaction described in 21. 21; and then performing the method for analyzing protein-protein interaction described in 19 or 20.
  • the adapter is double-stranded and comprises a ligated main strand and a non-ligated sub-chain, and the sub-chain has a shorter chain length than the main strand.
  • a dsDNA library can be created.
  • the dsDNA library obtained by using the single-stranded DNA as type I and a dsDNA library formed in the presence of RNase H, MA polymerase I and DNA ligase was used.
  • the IVV cDNA library can also be prepared by PCR using a primer having a specific sequence using the ligated dsDNA library as a template.
  • the RNA or nMA library used in the present invention may be a MA or mRNA library extracted from any tissue of any kind such as prokaryote, eukaryote, and virus.
  • an MA library that transcribes the decoded genome or cDNA library, an artificial RNA library that reproduces it, or an RNA library that transcribes an artificial cDNA library that contains sequences that do not exist in nature may be used.
  • the single-stranded (ss) DNA library is a library obtained by reverse transcription (FIG. 1, I) of the above-mentioned MA or mRNA library with random primers having a specific sequence.
  • the dsDNA library is obtained by synthesizing the above ssDNA library into double-stranded DNA (Fig. 1, II). At this time, synthesis of complementary strand DNA by MA polymerase I and RNA degradation by RNase H were performed at the same time. Furthermore, DNA ligase was used to eliminate nicks between DNAs synthesized by DNA polymerase I. Double-stranded DNA library one synthesized, only the complementary strand which is synthesized by DNA polymerase I 5 'terminus is phosphorylated, is an important feature to have a specific sequence in 3 3 terminus.
  • the dsDNA library is preferably formed by this method, but other enzymes may be used as long as a dsDNA library in which only the 5 'end of the complementary DNA of the single-stranded DNA is phosphorylated is formed. Or may be formed by other principles.
  • the IVV cDNA library of the present invention is synthesized by using the above-mentioned ligated dsDNA library as a template and performing PCR (FIG. 1, IV) with 5 ′ and 3, primers having a specific sequence. 5, and 3, the primers are 5, UTR, Tag 1, Tag 2, Tag 3, tail Annealing with a specific sequence may include part of 5, UTR, Ta1, Tag2, 3, and tail as an adapter sequence.
  • PCR a cDNA library with specific sequences such as 5, UTR, Tag 1, Tag 2, Tag 3 'tail is completed.
  • puromycin Puromycin
  • 3 3, -N-aminoacylbiyl-mycinanonucleoside (3,- N-Aminoacylpuromycin aminonucleoside (PANS-amino acid)
  • the amino acid portion is PANS-Gly for glycine
  • P, PANS-Val for phosphorus PANS-Ala for alanine
  • PANS-all amino acids corresponding to all amino acids Available.
  • a 3'-N-aminoacyl linked by an amide bond formed as a result of dehydration condensation of the amino group of 3'-aminoadenosine and the carboxyl group of amino acid as a chemical bond.
  • a part of the above-described amino acid protected with an appropriate protecting group is bound to a solid support, and a nucleotide phosphoramidite and a deoxynucleotide phosphoramidite are used as a nucleotide linker using a nucleic acid synthesizer. It can be prepared by sequentially binding phosphoramidite to which a fluorescent substance or biotin is bound as a functional modifier, and then performing deprotection. Depending on the type of each part or the type of bonding, it may be possible to combine them by liquid phase synthesis. Alternatively, both can be used in combination.
  • the library of mapping molecules uses the Darwinian evolutionary mechanism as an evolutionary molecular engineering to progressively repeat the three unit operations of “Mutation”, “Selection ⁇ ”, and “Amplification ⁇ ”. It can be applied to engineering by creating a material that has acquired the desired function, and it can be used for the analysis of genomic functions, such as interaction with a desired substance or protein from a cDNA library.
  • genomic functions such as interaction with a desired substance or protein from a cDNA library.
  • One with The gene sequence of the group can be analyzed comprehensively (Fig. 5).
  • the primary screening detects the interaction with the substance or protein (co-translation screening in Fig. 3 is an example), and the details of the interaction are analyzed using FCCS, microarray, etc. It can be analyzed by secondary screening.
  • the library of the present invention can be used alone as a library of IVV or C-terminal labeled proteins for analysis of interaction with substance-protein by FCCS, microarray, or the like.
  • the IVV library or the C-terminal labeled protein library obtained above is brought into contact with the “target molecule” in an appropriate combination depending on the type of the modifying substance and the type of the reaction system, and the modified protein or the target molecule is emitted.
  • the interaction can be analyzed by measuring the change in the signal generated based on the interaction between the two molecules in the signal. Interaction analysis can be performed by, for example, fluorescence correlation spectroscopy, fluorescence imaging analysis, fluorescence resonance energy transfer, evanescent field molecular imaging, fluorescence depolarization, surface plasmon resonance, or solid-phase enzyme immunoassay. Inspection It is performed by a standard method.
  • Target molecule means a molecule that interacts with an IW or C-terminal labeled protein, and specifically includes proteins, nucleic acids, sugar chains, low molecular weight compounds, and the like.
  • the protein is not particularly limited as long as it has an ability to interact with the modified protein of the present invention, and may be a full-length protein or a partial peptide containing a binding active site.
  • the protein may have a known amino acid sequence and its function, or may have an unknown protein. These can be used as target molecules even with a synthesized peptide chain, a protein purified from a living body, or translated from a cDNA library or the like using an appropriate translation system, and a purified protein or the like can be used as a target molecule.
  • the interaction include the binding and dissociation between an antigen and an antibody, the binding and dissociation between a protein receptor and a ligand, the binding and dissociation between an adhesion molecule and a partner molecule, the binding and dissociation between an enzyme and a substrate.
  • the detection method of the present invention includes a method for detecting an interaction between a bait and a play.
  • the present invention uses the library of the present invention.
  • the pait and the prey are subjected to separation modification and detection labeling in a specific manner, and the prey is generated by translation in the presence of a byte in a cell-free translation system to allow the pait and the prey to be translated.
  • the main feature is to make contact.
  • bringing a play into contact with a play by generating a play by translation in the presence of a sheet in a cell-free translation system is also referred to as “cell-free cotranslation”.
  • the bait includes a complex composed of any kind of ligand such as any protein (including peptide), nucleic acid, antibody, hormone, etc., and any one of natural and artificial. But it doesn't matter.
  • ligand such as any protein (including peptide), nucleic acid, antibody, hormone, etc., and any one of natural and artificial.
  • a protein includes a functional domain or a full-length protein containing a functional domain. In the case of using the preamplifier, more complete detection is possible by using the full-length protein.
  • a protein library is preferably used.
  • the molecular weight of the play There is no particular limitation on the molecular weight of the play.
  • the pate should have a separating modification.
  • the pate is used as a fusion protein with a protein that can be used as a modification for separation, and the mRNA encoding the pate-containing fusion protein is translated in a cell-free translation system. It is preferable that the protein be present in a cell-free translation system.
  • modification for separation when the bait is a protein examples include CST (separable by affinity with calmodulin beads) and protein A (IgG-protein A affinity) used for GST protein and TAP method etc.
  • the affinity tag may be a fusion protein with various antibody tags. If the paste itself has a property that can be used as a modification for separation, it can be used as it is as a paste having the modification for separation.
  • the modification for detection of prey includes a fusion protein with a fluorescent protein such as GFP (green fluorescent protein).
  • mRNA encoding the above fusion protein and translation of this mRNA in a cell-free translation system
  • mRNA may be produced by transcription of DNA in a cell-free transcription / translation system.
  • An assigning molecule means a molecule that associates a phenotype with a genotype.
  • the assigning molecule is usually a molecule in which a genotype molecule containing a nucleic acid having a nucleotide sequence reflecting the genotype is combined with a phenotypic molecule containing a protein involved in phenotypic expression. is there.
  • prey By using prey as this protein, prey can be used as an associating molecule.
  • Such an assigning molecule is used in a cell-free translation system to perform translation of mRNA encoding play, such that the translated play associates with the mRNA, or a cell-free transcription / translation system.
  • the peptide receptor region preferably comprises puromycin or a derivative thereof, or puromycin or a derivative thereof and one or two residues of deoxyribonucleotides or ribonucleotides.
  • a derivative means an inducer capable of binding to the C-terminus of a peptide in a protein translation system.
  • Puromycin derivatives are not limited to those having a complete puromycin structure, but also include those in which a portion of the puromycin structure is missing. Specific examples of puromycin derivatives include PANS-amino acids, MNS-amino acids and the like.
  • the ratio of surfactant to mineral oil is usually 1:
  • the ratio of the reaction solution is 1 to 50% (volume ratio), usually 5%, based on the whole emulsion, and it is usually 5% in the mixture of surfactant and mineral oil.
  • the reaction solution can be divided into several portions at a low temperature and mixed to form an emulsion.
  • the transcription and translation reactions can be started by raising the temperature of the emulsion. Can be.
  • a plurality of plays interacting with the composite pay can be detected, and the second pay can be detected. It acts as a reinforcing agent for the interaction between bait and prey, and by realizing a more specific interaction, it is possible to avoid non-specific detection in exhaustive detection.
  • the play is an assigning molecule (fusion). In the formation of a complex using a play library or multiple plays, the play may or may not directly interact with the bets.
  • the gene sequence of the protein prey can be known by RT-PCR or PCR after screening.
  • the protein play here is a play that interacts with the play or a play that interacts with the play, and any protein play that interacts with the payt. Multiple play can be analyzed comprehensively. If you need to re-screen your play, Transfer the DNA template that is the product of RT-PCR or PCIl and repeat the same cycle. Also, if play is determined by RT-PCR or PCR followed by a sequence, the protein play can be used as a bait. If multiple plays interacting with the first pay are found, a composite bait can be formed, and even more plays can be detected.
  • the protein-protein interaction can be detected in vitro consistently by the pull-down method and the TAP method, but since the TAP method does not form an assigning molecule, it can be directly analyzed in play analysis. It is necessary to analyze the protein. Therefore, if the pull-down method or the TAP method is applied to the in vitro virus method or the STABLE method as a screening method, an associating molecule is formed, so that RT-PCR or PCR can be used to analyze interacting plays. Gene sequences can be easily detected. Furthermore, the use of cell-free cotranslation will allow consistent detection of protein-protein interactions in vitro using the in vitro virus method and the STABLE method.
  • Play 'libraries' include cDNA libraries (random priming library, dT priming 'library'), random 'libraries, peptide' library ', hormone' library '1, antibody' library ', ligand'. And a library of pharmaceutical compounds, and any library may be used. For example, if a random primed cDNA library is used as a play library, full-length play cannot be expected from this library, but play including functional domains can be expected. Such a library is effective for comprehensive detection of play, particularly when used for screening in combination with a complex pattern / full-length protein.
  • random priming libraries include, on the 5th side of the Multi-Cloning Site (MCS), a Promoter for SP6 RNA polymerase (SP6) as a transcription promoter, and a Tobacco Mosaic Virus as a translation enhancer.
  • MCS Multi-Cloning Site
  • SP6 SP6 RNA polymerase
  • TMV omega sequence A 5 'untranslated (UTR) region containing a part of the TMV omega sequence (029) and an affinity sequence on the 3 side of MCS for affinity separation analysis by antigen-antibody reaction
  • a Flag-tag sequence which is a tag, was added to the MCS of a vector with a terminus that included a Flag-tag to be added to the C-terminus of the protein expressed from the insertion sequence incorporated in the MCS. Examples include those in which cDNA is incorporated.
  • the prepared IW cDNA library was evaluated. The results of the evaluation are shown in FIG.
  • the genes contained in the original mouse brain or mouse testis (polyA +) RNA library were detected by RT-PCR using gene-specific primers (SEQ ID NOs: 8 to 33).
  • a in Fig. 2 For these genes, an IVV cDNA library created from a mouse brain (polyA +) RNA library (029) and an IVV cDNA library created from a mouse testis (polyA +) RNA library (0,) In this case, it was confirmed whether or not the gene was present as in the case of the original RNA library (B in FIG. 2). In each library, each gene was detected reflecting the original RNA library. In other words, during the library creation process, an IVV cDNA library could be created without deteriorating the quality of the original A library.
  • PCR One step RT-PCR kit (QIAGEN), primers; SEQ ID NOs: 4 and 5, program; RT-QH30,) for 3 rounds, c-Jun protein gene that interacts with c-Fos protein is found in Southern blot. Ing (Southern) was clearly detected (Fig. 3B). Cloning the library after three rounds revealed that the c-Jun protein gene occupies about 1/4. In addition, the c-Jmi protein gene within the cloned library was sequenced and confirmed (Fig. 4). Details are as follows.
  • the frame misalignment is 1/3, 5, UTR / (mF / 3, UTR, the frame misalignment is 1/3, and the front and back are 1/2.
  • cloning is used to create a library, it is difficult to maintain the quality of the original library by ligating to the vector, and in the present invention, it is possible to use the cloning. , Making it easier to maintain the quality of the original library, and making the library in vitro, compared to 10 8 / ml when using cells via cloning.

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Abstract

An assigned molecule cDNA library is constructed by forming a single-stranded DNA by reverse transcription with the use of a random primer from an RNA or mRNA library; using the single-stranded DNA as a template, constructing a double-stranded DNA library phosphorylated exclusively at the 5’-end of the complementary strand DNA of the single-stranded DNA; ligating the double-stranded DNA library with an adaptor made of a nucleic acid not phosphorylated at the end to give a ligated double-stranded DNA library; using the ligated double-stranded DNA library as a template, constructing an assigned molecule cDNA library by PCR with the use of a primer having a sequence required in forming an assigned molecule.

Description

明細書  Specification
対応付け分子およびその構成要素のライブラリーの製造方法および利用方法 技術分野 TECHNICAL FIELD The present invention relates to a method for producing and utilizing a library of assigning molecules and their components.
本発明は、 対応付け分子およびその構成要素のライブラリーの製造方法および 利用方法に関する。 背景技術  The present invention relates to a method for producing and using a library of assigning molecules and their components. Background art
現在、 多様な生物のゲノムの塩基配列が解読されようとしている。 ゲノムシー ケンスの研究では、 第 2幕のポストシーケンスの研究として、 解読したゲノム情 報からその意味を解析する研究、 すなわち、 遺伝子や蛋白質の構造や機能解析 (非特許文献 1、 非特許文献 2 )、 および蛋白質間、 核酸-蛋白質間相互作用解析 などが期待されている（非特許文献 3、 非特許文献 4 )。  At present, the base sequences of the genomes of various organisms are being decoded. In genome sequence research, the second act of post-sequence research involves analyzing the meaning of the decoded genomic information, that is, analyzing the structure and function of genes and proteins (Non-Patent Documents 1 and 2) , And protein-protein and nucleic acid-protein interaction analysis are expected (Non-patent Document 3, Non-patent Document 4).
蛋白質間の相互作用を解析する方法としては、 免疫沈降（非特許文献 5 )、 GST 融合蛋白質によるプルダウン ·アツセィ（非特許文献 6 )、 TAP法 （非特許文献 7 )、 酵母ヅ一ハイブリッド法 （非特許文献 8 )などが知られている。 一方、 もともと は進化分子工学のツールとして誕生した 「遺伝子 (遺伝子型）と蛋白質 (表現型）の 対応付け」 を特徴とする以下に示す方法も、 ポストゲノム機能解析における蛋白 質間などの相互作用を解析する方法どして期待されている（非特許文献 9 )。 代表 的な方法は、 in vitroウィルス法 （非特許文献 1 0、 非特許文献 1 1、 特許文献 1 )、 STABLE法 （非特許文献 1 2 )、 ファージディスプレー法 （非特許文献 1 3 )、 リボソーム .ディスプレイ法 （非特許文献 1 4、 特許文献 2 ) 、 m A-ペプチド ヒュ一ジョン（mRNAデイスプレイ；)法（非特許文献 1 5 )などである。  Methods for analyzing the interaction between proteins include immunoprecipitation (Non-patent Document 5), pull-down atssie by GST fusion protein (Non-patent Document 6), TAP method (Non-patent Document 7), and yeast-one-hybrid method ( Non-patent document 8) is known. On the other hand, the method described below, which features “association of genes (genotypes) and proteins (phenotypes)” originally born as a tool for evolutionary molecular engineering, also involves the interaction between proteins in post-genome functional analysis. Is expected to be a method of analyzing the data (Non-Patent Document 9). Representative methods include the in vitro virus method (Non-patent Document 10, Non-patent Document 11, Patent Document 1), STABLE method (Non-patent Document 12), phage display method (Non-patent Document 13), ribosome . Display method (Non-patent Document 14, Patent Document 2), mA-peptide fusion (mRNA display;) method (Non-patent Document 15), and the like.
このようなボストゲノム機能解析によって、 蛋白質間および蛋白質-核酸間な どの相互作用ネットワーク解析から重要な生体酵素の発見などによる医薬品の創 製などが期待され、 医療、 食料、 エネルギー、 環境など多くの分野の産業で優れ たネットワーク解析技術が所望されている。 蛋白質間および蛋白質-核酸間など の相互作用ネヅトワーク解析のためには、 ペイ ト蛋白質との相互作用解析に用い る RNAライブラリー又は cDNAライブラリー作成方法は欠かせない要素技術となる。 ポストゲノム構造および機能解析研究のツールとして様々なものが開発されて きている。 どのような解析方法であっても、 蛋白質間および蛋白質-核酸間の解 析に共通して欠かせないものは、 RNAライブラリー又は cDNAライブラリ一である。 ライブラリーの質が高ければ、 解析結果も質が高いものとなるため、 要素技術と してライブラリー作成技術は重要である。 ボストゲノム機能解析の蛋白質間およ び蛋白質-核酸間の解析方法である in vitroウィルス（IVV) 法 （非特許文献 1 0、 非特許文献 1 1、 特許文献 1、 特許文献 3 )において、 RNA又は cDNAライブラリ一 作りとしてこれまで知られていた技術は、 組織から抽出した Aライブラリ一か ら、 あるいは既存の cDNAライブラリーから、 発現ベクターにクローニングを介し てライブラリーを構築する方法、 あるいは、 クローニングを介さずに直接ライブ ラリーを構築する方法 （非特許文献 1 6 )があった。 Such bost genome functional analysis is expected to create drugs by discovering important biological enzymes from the analysis of interaction networks between proteins and between proteins and nucleic acids, and is expected to be used in many fields such as medicine, food, energy, and the environment. In these industries, excellent network analysis technology is desired. For the analysis of interaction networks between proteins and between proteins and nucleic acids, a method for preparing an RNA library or a cDNA library used for analysis of interactions with a protein is an essential elemental technology. Various tools have been developed for post-genomic structure and functional analysis research. Regardless of the analysis method, an RNA library or a cDNA library is indispensable for the analysis between proteins and between proteins and nucleic acids. If the quality of the library is high, the analysis results will also be of high quality, so library creation technology is important as a component technology. In the in vitro virus (IVV) method (Non Patent Literature 10, Non Patent Literature 11, Patent Literature 1, Patent Literature 3) which is an analysis method between proteins and between protein and nucleic acid in the Bost genome function analysis, RNA or Techniques known so far for creating a cDNA library include a method of constructing a library from an A library extracted from a tissue or an existing cDNA library via cloning into an expression vector, or cloning. There was a method of directly constructing a library without intervention (Non-Patent Document 16).
<非特許文献 1 >  <Non-Patent Document 1>
Saegusa A. Japan boosts proteomics and cell biology... Nature 401, 6751 (1999) <非特許文献 2 >  Saegusa A. Japan boosts proteomics and cell biology ... Nature 401, 6751 (1999) <Non-Patent Document 2>
Dalton R, Abbott A. Can researchers find recipe for proteins and chips? Nature 402， 6763 (1999)  Dalton R, Abbott A. Can researchers find recipe for proteins and chips? Nature 402, 6763 (1999)
<非特許文献 3 > .  <Non-Patent Document 3>.
宮本悦子、 柳川弘志 （2000 ) シリーズ 'ポストシークェンスのゲノム科学 3 : プロテオミクス， pp. 136- 145  Etsuko Miyamoto, Hiroshi Yanagawa (2000) Series' Genomics of Post-sequence 3: Proteomics, pp. 136-145
<非特許文献 4 >  <Non-patent document 4>
宫本悦子、 柳川弘志 (2001 ) 蛋白質 ·核酸，酵素、 46(2) , pp. 138-147  悦 Etsuko Moto, Hiroshi Yanagawa (2001) Proteins · Nucleic acids, Enzymes, 46 (2), pp. 138-147
<非特許文献 5 >  <Non-Patent Document 5>
Xiong et al. 1993 Nature 366, 701-704  Xiong et al. 1993 Nature 366, 701-704
<非特許文献 6 >  <Non-Patent Document 6>
Kaelin, et al. 1991 Cell 64, 521-532  Kaelin, et al. 1991 Cell 64, 521-532
<非特許文献 7 >  <Non-Patent Document 7>
Guillaume Rigaut, et al., Nature Biotechnology 17， 1030 (1999)  Guillaume Rigaut, et al., Nature Biotechnology 17, 1030 (1999)
<非特許文献 8 >  <Non-Patent Document 8>
Fields S, Song O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature 340, 245 (1989) Fields S, Song O.A novel genetic system to detect protein-protein interactions.Nature 340, 245 (1989)
<非特許文献 9 >  <Non-Patent Document 9>
Mendelsohn A.R, Brent R. Protein interaction methods— toward an endgame. Science 284, 1948 (1999)  Mendelsohn A.R, Brent R. Protein interaction methods— toward an endgame. Science 284, 1948 (1999)
<非特許文献 1 0 >  <Non-Patent Document 10>
Miyamoto-Sato E， et al. The constraction of the virus type assignment molecule in evolutionary molecular engineering. Viva Origino 25， 35 (1997)  Miyamoto-Sato E, et al. The construction of the virus type assignment molecule in evolutionary molecular engineering.Viva Origino 25, 35 (1997)
<非特許文献 1 1 >  <Non-patent document 1 1>
Nemoto N， et al. In vitro virus: Bonding of mRNA bearing puromycin at the 3 '-terminal end to the C- terminal end of its encoded protein on the ribosome in vitro. FEBS Lett. 414, 405 (1997)  Nemoto N, et al. In vitro virus: Bonding of mRNA bearing puromycin at the 3'-terminal end to the C-terminal end of its encoded protein on the ribosome in vitro.FEBS Lett. 414, 405 (1997)
<特許文献 1 >  <Patent Document 1>
国際公開パンフレヅト第 WO 9 8 / 1 6 6 3 6号  International Publication Pamphlet No. WO 98/166 6 3 6
<非特許文献 1 2 >  <Non-patent document 1 2>
Doi N, Yanagawa H. STABLE: orotein-DNA fusion system ror screening of combinatorial protein libraries in vitro. FEBS Lett. 457, 227 (1999)  Doi N, Yanagawa H. STABLE: orotein-DNA fusion system ror screening of combinatorial protein libraries in vitro.FEBS Lett. 457, 227 (1999)
<非特許文献 1 3 >  <Non-Patent Document 13>
Smith G.P. Searching for peptide ligands with an epitope library. Science 228, 1315 (1985)  Smith G.P.Searching for peptide ligands with an epitope library.Science 228, 1315 (1985)
<非特許文献 1 4 >  <Non-patent document 1 4>
Mattheakis, L.C. et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91， 9022-9026  Mattheakis, L.C. et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 9022-9026.
<特許文献 2 >  <Patent Document 2>
国際公開パンフレヅト第 W0 9 5 / 1 1 9 2 2号  International publication pamphlet No.W095 / 1 1 9 2 2
<非特許文献 1 5 >  <Non-Patent Document 15>
Roberts R.W, Szostak J.W. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 12297  Roberts R.W, Szostak J.W. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 12297
<特許文献 3 >  <Patent Document 3>
国際公開パンフレヅト第 WO 0 2 / 4 6 3 9 5号  International Publication Pamphlet No. WO 02/4 6 3 9 5
<非特許文献 1 6 >  <Non-patent document 1 6>
Hammond, P.W., Alpin, J., Rise, C.E., Wright, M.C., and Kreider, B.L. 2001. In vitro selection and characterization of Bcl-XL binding proteins from a mix of tissue-specific mRNA display libraries. J. Biol. Chem. 276: 20898-20906 発明の開示 Hammond, PW, Alpin, J., Rise, CE, Wright, MC, and Kreider, BL 2001. In vitro selection and characterization of Bcl-XL binding proteins from a mix of tissue-specific mRNA display libraries.J. Biol. Chem. 276: 20898-20906
ボストゲノム機能解析研究のヅールとして様々なものが開発されてきている。 どのような解析方法であっても、 蛋白質の解析に共通して欠かせないものは、 質 の高い Aライブラリ一や cDNAライブラリ一の構築である。 IWのためのライブラ リ一作成方法の従来法としては、 ランダムプライミング法によりストヅプコドン を持たない 0KF領域を多く含むように工夫した DNA断片を、 IVV形成のための 5' UTR、 3' tail配列を持った発現ベクターにクローニングしてライブラリーを構築する方 法があつたが、 この方法では、 クローニングを介するためライブラリ一の規模が 制限され、 ライブラリーの質はよいものとは言えなかった。 また、 ライブラリ一 の構築に時間がかかった。 さらに、 上述の、 クロ一ニングを介さずに直接ライプ ラリーを構築する方法として、 ランダムプライミング法によりストヅプコドンを 持たない 0RF領域を多く含むように工夫した DNA断片を、 IVV形成のための配列を 持ったテンプレートを作成し、 特定配列で PCI こよってライブラリーを構築する 方法があった。 この方法では、 3' ランダムプライマ一で逆転写し、 さらに、 5， ランダムプライマ一で二本鎖 DNAの相補鎖を形成しているので、 33および 5，末端 の両端ともランダムプライマ一を使用することからライブラリ一の平均長が短く なる問題点があった。 Various tools have been developed for research on functional analysis of bost genomes. Regardless of the method of analysis, the key to protein analysis is the construction of a high-quality A library and a high-quality cDNA library. As a conventional method for preparing a library for IW, a DNA fragment devised to contain a large number of 0KF regions having no stop codon by a random priming method, and a 5 ′ UTR and 3 ′ tail sequence for IVV formation are used. There was a method of constructing a library by cloning it into an expression vector possessed, but with this method, the size of the library was limited due to cloning, and the quality of the library could not be said to be good. Also, it took time to build the library. Furthermore, as a method for directly constructing libraries without cloning as described above, a DNA fragment devised to contain a large number of 0RF regions having no stop codon by random priming has a sequence for IVV formation. There was a method to create a template based on a specific sequence and to construct a library by PCI using a specific sequence. In this method, 3 'random primer one reverse transcribed, further 5, since the form complementary strands of a double stranded DNA with random primers one, 3 3 and 5, using random primers one at both ends of the end Therefore, there was a problem that the average length of the library became short.
よって、 本発明では、 対応付け分子 （IVV) のライブラリ一に適した 3' UTRを含 まないテンプレートを含み、 両端にランダムプライマ一を使用したときのような ラィブラリ一の平均長が短くならないライブラリ一を実現することを課題とする。 本発明者らは、 ランダムプライマーとアダプターを組み合わせて使用すること により、 mRNAライブラリーからでも、 IVVに適した、 3， UTRを含まないテンプレー ト効率の高いライブラリ一が作成でき、 両端にランダムプライマーを使用したと きの平均長が短くなる問題が解決できることを見出し、 本発明を完成した。  Therefore, in the present invention, a library that includes a template that does not include a 3 ′ UTR suitable for a library of associating molecules (IVV) and that does not shorten the average length of a library, such as when a random primer is used at both ends, is used. The challenge is to achieve one. By using a combination of a random primer and an adapter, the present inventors can create a library with high template efficiency that does not contain UTR and is suitable for IVV, even from an mRNA library. The present inventors have found that the problem that the average length when using is shortened can be solved, and completed the present invention.
本発明は、 以下のものを提供する。  The present invention provides the following.
1 . UNA又は mRNAライブラリーから、 ランダムプライマーで逆転写により一 本鎖 DMを形成し、 さらに該一本鎖 DNAを鎵型として、 該一本鎖 DNAの相補鎖 DNAの 5'末端のみがリン酸化されている二本鎖 DNAライブラリ一を形成し、 1. Reverse transcription using random primers from UNA or mRNA library Forming a single-stranded DM, further forming the single-stranded DNA as 鎵, forming a double-stranded DNA library in which only the 5 ′ end of the complementary strand DNA of the single-stranded DNA is phosphorylated,
該ニ本鎖 DNAライブラリーと、 末端がリン酸化されていない核酸からなるァダ プ夕一とをライゲーシヨンしてライゲ一テヅドニ本鎖 MAライブラリーを形成し、 該ライゲーテヅドニ本鎖 DNAライブラリ一をテンプレ一トとして、 対応付け分 子の形成に必要な配列を持つプライマ一を用いた PCIUこより、 対応付け分子 cDNA ライブラリーを作成する  The double-stranded DNA library is ligated with an adapter consisting of a nucleic acid whose terminus is not phosphorylated to form a ligated single-stranded DNA library, and the ligated double-stranded DNA library is templated. As an example, a mapping molecule cDNA library is prepared from a PCIU using a primer having a sequence necessary for the formation of a mapping molecule.
ことを含む対応付け分子 cDNAライブラリ一の製造方法。  And a method for producing a cDNA library.
2 . アダプターが二本鎖であり、 ライゲ一シヨンされる本鎖とライゲ一ショ ンされない副鎖からなる 1の製造方法。  2. The process of 1 wherein the adapter is double-stranded and comprises a ligated main strand and a non-ligated substrand.
3 . 副鎖が本鎖よりも鎖長が短い 2記載の製造方法。  3. The production method according to 2, wherein the side chain has a shorter chain length than the main chain.
4 . 一本鎖 DNAの相補鎖 DNAの 5，末端のみがリン酸化されている二本鎖 DNAラ イブラリーを、 一本鎖 DNAを錶型として、 RNase H、 MAポリメラーゼ Iおよび DNA リガーゼ存在下で形成する 1〜 3のいずれか 1項に記載の製造方法。  4. Double-stranded DNA library in which only the 5 'end of the complementary strand of single-stranded DNA is phosphorylated is converted to single-stranded DNA in the presence of RNase H, MA polymerase I and DNA ligase. 4. The production method according to any one of 1 to 3, wherein
5 . 対応付け分子 cDNAライブラリ一を構成する cDNAが、 53末端にプロモー夕 一とェンハンサ一を有する配列を含み、 3'末端にライゲ一シヨンのァクセプ夕一 配列を含む 1〜 4のいずれか 1項に記載の製造方法。 5. CDNA constituting the assigning molecules cDNA library one comprises a sequence having promoter evening one and Enhansa foremost 5 3 end, or from 1 to 4 including the Akusepu evening one sequence of Raige one Chillon 3 'end The production method according to item 1.
6 . プロモ一夕一配列が SP6プロモーターで、 ェンハンサー配列がオメガ配 列又はオメガ配列の一部であり、 ァクセプ夕一配列が 2〜 1 0塩基のポリ A配列 である 5記載の製造方法。  6. The production method according to 5, wherein the promoter overnight sequence is the SP6 promoter, the enhancer sequence is an omega sequence or a part of the omega sequence, and the exceptor sequence is a 2- to 10-base poly A sequence.
7 . 1〜 6のいずれか 1項に記載の製造方法により得られる対応付け分子 cD NAライブラリーを転写することを含む、 対応付け分子 RNAライブラリーの製造方 法。  7. A method for producing an assigning molecule RNA library, comprising transcribing an assigning molecule cDNA library obtained by the production method according to any one of 1 to 6.
8 . 7に記載の製造方法により得られる対応付け分子 RNAライブラリーを構 成する対応付け分子 RNAの 3'末端にスぺ一サーをライゲーシヨンすることを含む、 対応付け分子ライゲーテッド RNAラィブラリ一の製造方法。  8.7. Ligation of a mapping molecule RNA-containing library including ligation of a spacer to the 3 ′ end of the mapping molecule RNA constituting the mapping molecule RNA library obtained by the production method described in 8.7. Production method.
9 . スぺ一サ一が、 対応付け RNA分子にライゲーシヨンする末端の反対の末 端にピューロマイシン又はピュ一ロマイシン誘導体を有し、 かつ、 塩基配列で 10 - lOObp相当の長さを持ち、 該スぺ一サ一は、 該ピューロマイシン又はピューロマ ィシン誘導体を介して、 該対応付け分子ライゲ一テッド RNAラィブラリ一のテン プレートから翻訳された蛋白質と連結するものである 8記載の製造方法。 9. The spreader has puromycin or a puromycin derivative at the terminal opposite to the terminal ligated to the associating RNA molecule, and has a nucleotide sequence equivalent to 10-lOObp in length, and The supplier is the puromycin or puroma. 9. The production method according to 8, wherein the protein is linked to a protein translated from a template of the assigning molecule-ligated RNA library via a glycine derivative.
1 0 . 該スぺ一サ一が、 該対応付け分子ライゲーテツ ド RNAライブラリ一か ら翻訳された蛋白質と連結しないものである 8記載の製造方法。  10. The production method according to 8, wherein the spacer is not linked to a protein translated from the assigning molecule ligated RNA library.
1 1 . 7に記載の製造方法により得られる対応付け分子 RNAライブラリーを 無細胞翻訳系で翻訳して蛋白質を形成することを含む、 蛋白質ランダムプライミ ングライブラリーの製造方法。  11. A method for producing a protein random priming library, comprising: translating an assigning molecule RNA library obtained by the production method according to 1.7 to a cell-free translation system to form a protein.
1 2 . 8又は 9に記載の製造方法で得られる対応付け分子ライゲ一テツド M Aライブラリーを無細胞翻訳系で翻訳して対応付け分子を形成することを含む、 対応付け分子ランダムプライミングライブラリーの製造方法。  12. A method for producing an assigning molecule random priming library, comprising: translating an assigning molecule ligated MA library obtained by the production method according to 8 or 9 by a cell-free translation system to form an assigning molecule. Production method.
1 3 . 8又は 1 0に記載の製造方法で得られる対応付け分子ライゲ一テツド Aライブラリーを無細胞翻訳系で翻訳して蛋白質を形成することを含む、 蛋白 質ランダムプライミングライブラリーの製造方法。  13. A method for producing a protein random priming library, comprising: translating an assigning molecule ligated A library obtained by the production method described in 13.8 or 10 with a cell-free translation system to form a protein. .
1 4 . 7に記載の製造方法で得られる対応付け分子 RNAライブラリ一を細胞 内で翻訳して蛋白質を形成することを含む、 蛋白質ランダムプライミングライブ ラリーの製造方法。  14. A method for producing a protein random priming library, comprising translating an assigning molecule RNA library obtained by the production method according to 14.7 in a cell to form a protein.
1 5 . 8又は 9に記載の製造方法で得られる対応付け分子ライゲ一テツド RN Aライブラリーを細胞内で翻訳して対応付け分子を形成することを含む、 対応付 け分子ランダムブラィミングラィブラリ一の製造方法。  15. A mapping molecule random braining live, including translating a mapping molecule-ligated RNA library obtained by the production method described in 8 or 9 into cells to form a mapping molecule. Rari's manufacturing method.
1 6 . 8又は 1 0に記載の製造方法で得られる対応付け分子ライゲーテツド MAライブラリーを細胞内で翻訳して蛋白質を形成することを含む、 蛋白質ラン ダムプライミングライブラリ一の製造方法。  16. A method for producing a protein random priming library, comprising translating an assigning molecule ligated MA library obtained by the production method according to 16.8 or 10 into cells to form a protein.
1 7 . 該蛋白質を C末端ラベル化法で修飾することを含む、 1 1、 1 3、 1 4又は 1 6に記載の製造方法。  17. The production method according to 11, 13, 13, 14 or 16, comprising modifying the protein by a C-terminal labeling method.
1 8 . 核酸のライブラリーと蛋白質との相互作用を解析する蛋白質と核酸の 相互作用解析方法であって、 ライブラリーが、 1、 5、 7〜1 0のぃずれか1項 に記載の製造方法で得られるライブラリーである前記方法。  18. A protein-nucleic acid interaction analysis method for analyzing an interaction between a nucleic acid library and a protein, wherein the library is any one of 1, 5, 7 to 10 The above method, which is a library obtained by the method.
1 9 . 蛋白質のライブラリ一と蛋白質との相互作用を解析する蛋白質間相互 作用解析方法であって、 ライブラリーが、 1 7に記載の製造方法で得られるライ ブラリーである前記方法。 19. A protein-protein interaction analysis method for analyzing the interaction between a protein library and a protein, wherein the library is a library obtained by the production method described in 17. The above method, wherein the method is a library.
2 0 . 対応付け分子のライブラリーと蛋白質との相互作用を解析する蛋白質 間相互作用解析方法であって、 ライブラリ一が、 1 2又は 1 5に記載の製造方法 で得られるライブラリーである前記方法。  20. A protein-protein interaction analysis method for analyzing the interaction between a library of assigning molecules and a protein, wherein the library is a library obtained by the production method according to 12 or 15. Method.
2 1 . 相互作用が共翻訳スクリーニング法により解析される、 2 0記載の方 法。  21. The method according to 20, wherein the interaction is analyzed by a co-translation screening method.
2 2 . ライブラリ一のスクリ一ニングを含む進化分子工学による機能蛋白質 の創製方法であって、 ライブラリ一が、 1 2又は 1 5に記載の製造方法により得 られるライブラリーである前記方法。  22. A method for creating a functional protein by evolutionary molecular engineering including screening of the library, wherein the library is a library obtained by the production method according to 12 or 15.
2 3 . 2 0に記載の蛋白質間相互作用解析方法を行い、 ついで、 1 9又は 2 0に記載の該蛋白質間相互作用解析方法を行うことを含む、 蛋白質間相互作用解 析方法。  23. A method for analyzing protein-protein interaction, comprising: performing the method for analyzing protein-protein interaction described in 23.20; and then performing the method for analyzing protein-protein interaction described in 19 or 20.
2 4 . 2 1に記載の該蛋白質間相互作用解析方法を行い、 ついで、 1 9又は 2 0に記載の該蛋白質間相互作用解析方法を行うことを含む、 蛋白質間相互作用 解析方法。  24. A method for analyzing protein-protein interaction, comprising: performing the method for analyzing protein-protein interaction described in 21. 21; and then performing the method for analyzing protein-protein interaction described in 19 or 20.
2 5 . 2 2に記載の該機能蛋白質の創製方法を行い、 ついで、 1 9又は 2 0 に記載に記載の該蛋白質間相互作用解析を行うことを含む蛋白質の創製方法。 本発明においては、 ライプラリーの規模を保ち、 質の高いライブラリーを実現 し、 かつ簡単で短時間で作成可能なライブラリーを実現する手段として、 RNA又 は mRNAライプラリーから、 クローニングベクターを介することなく、 対応付け分 子（IVV)形成に必要な配列 （以下、 「特定配列」 ともいう） を 5' および 33末端に 含むことを特徴とする IVV cDNAライブラリーを作成する。 すなわち、 RNA又は m Aライブラリーから、 5，末端に特定配列を持つアダプター領域を含むランダムプ ラィマーで逆転写により一本鎖 DNAを形成し、 さらに該一本鎖 DNAを錶型として、 該一本鎖 DNAの相補鎖 DNAの 5'末端のみがリン酸化されている二本鎖 DNAを形成し たものであることを特徴とする二本鎖（ds)DNAライブラリ一を作成し、 さらに、 該 dsDNAラィブラリ一に特定配列を含むアダプターをライゲーシヨンすることに よりライゲーテツド dsDNAライブラリーを作成する。 該ライゲ一テツ ド dsDNAライ ブラリーをテンプレートとして対応付け分子（ I VV )形成に必要な 5'および 3，末端 配列を持つプライマーで PCRを行うことにより IVV cDNAライブラリ一を作成する。 ついで、 該 IVV cDNAライブラリ一を転写した IVV RNAライブラリ一、 該 IVV RNAラ ィブラリーを翻訳した IVVランダムプライミングライブラリーを作成することが できる。 25. A method for creating a protein, comprising performing the method for creating a functional protein described in 22. 22, and then performing the protein-protein interaction analysis described in 19 or 20. In the present invention, as a means of maintaining the size of the library, realizing a high-quality library, and realizing a library that can be created easily and in a short time, without using a cloning vector from an RNA or mRNA library. , mapping partial element (IVV) sequences necessary for formation (hereinafter, also referred to as "specific sequence") to create a IVV cDNA library, which comprises the 5 'and 3 3 terminus. That is, a single-stranded DNA is formed from the RNA or mA library by reverse transcription with a random primer containing an adapter region having a specific sequence at the end of the 5, and the single-stranded DNA is further converted into a 錶 -type to form the single-stranded DNA. Producing a double-stranded (ds) DNA library characterized in that it forms a double-stranded DNA in which only the 5 ′ end of the complementary strand DNA of the single-stranded DNA is phosphorylated, A ligated dsDNA library is prepared by ligating an adapter containing a specific sequence to the dsDNA library. Using the ligated dsDNA library as a template, the 5 'and 3' ends required for the formation of an assigning molecule (IVV) An IVV cDNA library is prepared by performing PCR with primers having a sequence. Next, an IVV RNA library to which the IVV cDNA library has been transcribed and an IVV random priming library to which the IVV RNA library has been translated can be prepared.
従来は、 一本鎖 DNAを錶型として相補鎖 DNAを合成して二本鎖 DNAを形成する際 に 5'末端にランダムプライマーを用いていたが、 その方法では、 作成された二本 鎖 DNAの 3，末端および 5'末端の両端ともにランダムプライマーを用いているため にライブラリーの平均長が短いものとなってしまう問題点がある。 本発明では、 RNA又は mRNAライプラリ一から、 ランダムプライマーで逆転写により形成された 一本鎖 DNAを錶型として形成された片側の相補鎖 DNAの 5'末端のみがリン酸化され ていることを特徴とする dsDNAライプラリーとリン酸化されていないアダプタ一 をライゲーシヨンする手段を利用する。 このとき、 アダプターが二本鎖であり、 ライゲーシヨンされる本鎖とライゲ一シヨンされない副鎖からなること、 さらに 副鎖は本鎖よりも鎖長が短いことを特徴とするアダプターを用いたライゲ一テツ ド dsDNAライブラリーを作成することができる。 また、 このとき、 該一本鎖 DNAを 铸型として、 RNase H、 MAポリメラ一ゼ Iおよび DNAリガーゼ存在下で形成された ものである dsDNAライブラリ一を用いて、 ライゲ一デヅ ド dsDNAライブラリーを作 成し、 ライゲーテツ ド dsDNAライプラリーをテンプレートとして特定配列を持つ プライマ一を用いた PCRにより IVV cDNAライブラリ一を作成することもできる。 I VV cDNAライブラリ一は、 5' 末端にプロモ一夕一とェンハンサ一を有した特定の 配列を含み、 3'末端にライゲーシヨンのァクセプ夕一配列を含むものでもよい。 従来のアダプタ一のライゲーシヨンでは、 アダプタ一をリン酸化するために、 セルフライゲーシヨンやライブラリー .テンプレートの両端にライゲ一シヨンさ れてしまうためにクローニングでは方向性が決められない問題点があり、 PCRで も方向性がまちまちのテンプレートが出来てしまいテンプレートの質が落ちてし まうなどの問題点がある。 本発明では、 アダプタ一は、 用いるリガ一ゼに応じて 選択することが好ましく、 ライゲーシヨンを DNAリガーゼで行う場合は、 ァダプ 夕一は一部二本鎖とし、 アダプターをリン酸化しないことでアダプターのセルフ ライゲーシヨンによるコンカマーが出来ることを防ぎ、 5，末端がリン酸化された 二本鎖 DNAと比較してアダプターの長さが十分短いことから、 優先的にアダプタ —と二本鎖 DNAのライゲ一シヨンが促進されることを利用している。 このとき、 アダプタ—の方向が定まってライゲーシヨンされるように、 アダプタ一がライゲIn the past, random primers were used at the 5 'end to form double-stranded DNA by synthesizing complementary strand DNA using single-stranded DNA as type II, but in this method, the created double-stranded DNA was used. However, the use of random primers at the 3, 3 and 5 'ends results in a short average library length. The present invention is characterized in that, from RNA or mRNA libraries, only the 5'-end of the single-stranded complementary DNA formed as a 鎖 -type single-stranded DNA formed by reverse transcription with random primers is phosphorylated. Ligation of dsDNA library and non-phosphorylated adapter is used. At this time, the adapter is double-stranded and comprises a ligated main strand and a non-ligated sub-chain, and the sub-chain has a shorter chain length than the main strand. A dsDNA library can be created. At this time, the dsDNA library obtained by using the single-stranded DNA as type I and a dsDNA library formed in the presence of RNase H, MA polymerase I and DNA ligase was used. The IVV cDNA library can also be prepared by PCR using a primer having a specific sequence using the ligated dsDNA library as a template. The IVV cDNA library may include a specific sequence having a promoter and an enhancer at the 5 'end, and may include a ligation sequence at the 3' end. With conventional adapter-based ligation, there is a problem that the orientation cannot be determined by cloning because self-ligation or library is ligated at both ends of the template to phosphorylate the adapter. However, even with PCR, there are problems such as the possibility of creating templates with different directions and the quality of the templates is degraded. In the present invention, the adapter is preferably selected according to the ligase to be used.When ligation is performed using DNA ligase, the adapter is partially double-stranded, and the adapter is not phosphorylated, so that the adapter is not phosphorylated. Prevents the formation of self-ligation concamer, 5.Terminal is phosphorylated Since the length of the adapter is sufficiently shorter than that of double-stranded DNA, it utilizes the fact that the ligation of adapter and double-stranded DNA is preferentially promoted. At this time, the adapter is ligated so that the direction of the adapter is determined and ligated.
—シヨンされる本鎖とライゲ一シヨンされない副鎖からなること、 副鎖は本鎖よ りも鎖長が短いことを特徴とするアダプターを用いることができる。 また、 ライ ゲーシヨンを RNAリガ一ゼで行う場合は、 アダプタ一は一本鎖とし、 ここでもァ ダプ夕一をリン酸化しないことでアダプタ一のセルフライゲーシヨンを防ぎ、 か つアダプタ一の長さが 5'末端がリン酸化された一本鎖 DNAと比較して十分短いこ とから、 優先的にアダプタ一と一本鎖 DNAのライゲーシヨンが促進されることを 利用できる。 ただし、 IVVランダムライブラリー作成時では、 テンプレートの 3' 末端が RNAリガーゼの良いァクセプ夕一となるための配列（A配列）を有しており、 テンプレート同士のライゲ一シヨンが起こる確率は、 DNAリガーゼを用いた作成 方法より断然高くなる点が不利である。 1つの回避手段としては、 A配列をライ ゲ一シヨン後に PCRで付加するようにすれば問題ないが、 それでも、 RNAリガ一ゼ は DNAリガ一ゼに比較してライゲ一シヨン効率が落ちるので、 総合的に見て、 ラ ィゲ一シヨンを DNAリガーゼで行う手段が好ましい。 図面の簡単な説明 -An adapter can be used which comprises a main strand to be screened and a non-ligated sub-chain, and the sub-chain has a shorter chain length than the main strand. When ligation is performed using RNA ligase, the adapter is single-stranded, and the adapter is not phosphorylated, thereby preventing self-ligation of the adapter and reducing the length of the adapter. Is short enough compared to single-stranded DNA whose 5 'end is phosphorylated, and it can be used to preferentially promote ligation between adapter 1 and single-stranded DNA. However, when creating an IVV random library, the 3 'end of the template has a sequence (A sequence) that makes it a good candidate for RNA ligase, and the probability of ligation between templates is low. The disadvantage is that the cost is significantly higher than the method using ligase. One circumvention is to add the A sequence by PCR after ligation, but there is no problem.However, RNA ligase has a lower ligation efficiency than DNA ligase. As a whole, a means for performing ligation with DNA ligase is preferred. BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
図 1は、 本発明のランダムブライミングライブラリ一とその構成要素と製法の 説明図である。  FIG. 1 is an explanatory diagram of a random priming library of the present invention, its components, and a manufacturing method.
図 2は、 本発明のライブラリーの評価の結果 （電気泳動写真） を示す。  FIG. 2 shows the results (electrophoresis photograph) of the evaluation of the library of the present invention.
A: マウス脳とマウス精巣 （polyA+) RNAライブラリーに含まれる RNAの調査のた めに、 1 3種類の特定の遺伝子や MAのプライマ一を用いて RT-PCRによりそれら の存在を確認した。 レーン 1 ― 13; c-fos, fosB, fral， fra2, c-jun, junB, junD, ? -ァクチン遺伝子， 18S リボゾーム RNA， c-rafl 5 Hras, S15 リボゾーム 蛋白質遺伝子， jmj遺伝子の順。 A: In order to investigate the RNA contained in the mouse brain and mouse testis (polyA +) RNA libraries, their presence was confirmed by RT-PCR using 13 specific genes and MA primers. Lanes 1 to 13; c-fos, fosB, fral, fra2, c-jun, junB, junD,? -Actin gene, 18S ribosomal RNA, c-rafl 5 Hras, S15 ribosomal protein gene, and jmj gene.
B : マウス脳とマウス精巣 （polyA+) MAライブラリーから作成した IVV cDNAライ ブラリー（029)と IVV cDNAライブラリ一（0' )においても同様に、 1 3種類の特定 の遺伝子や RNAのプライマ一を用いて PCI こよりそれらの存在を確認した。 レーン 1 - 13; c-fos, fosB, fral， fra2, c- jun, junB, junD, ァクチン遺伝子， 18S リボゾーム RNA, c- rafl, Hras, S15 リボゾーム蛋白質， jmj遺伝子の順。 図 3は、 本発明のライブラリーを用いた IVVの共翻訳スクリーニング法による 相互作用検出の概略および結果 （電気泳動写真） を示す。 B: Similarly, in the IVV cDNA library (029) and IVV cDNA library (0 ') created from the mouse brain and mouse testis (polyA +) MA library, the primers of 13 specific genes and RNAs were also identified. Using PCI, we confirmed their existence. lane 1-13; c-fos, fosB, fral, fra2, c-jun, junB, junD, actin gene, 18S ribosomal RNA, c-rafl, Hras, S15 ribosomal protein, jmj gene. FIG. 3 shows the outline and results (electrophoretic photograph) of the interaction detection by the IVV cotranslation screening method using the library of the present invention.
A: マウス脳の IVVライブラリーとベイ トとして c-fosを用いて、 無細胞共翻訳ス クリーニングを行い、 スクリーニング後のライブラリーを RT- PCRで増幅して再び ペイ トと共に無細胞共翻訳スクリ一二ングすることを 3回繰り返すことにより内 在 c- junを濃縮した。 A: Cell-free cotranslation screening was performed using the mouse brain IVV library and c-fos as a bait, and the library after screening was amplified by RT-PCR and re-populated with the plate again. The endogenous c-jun was enriched by repeating this step three times.
B: Aにおいて、 マウス脳の IVVライブラリ一の内在 c-junの濃縮について、 各ラウ ンドごとのスクリーニング後の RT- PCR産物を 1 %ァガロースゲルで電気泳動し、 c-junのプローブを用いてサザン ·プロヅ 卜した。 M; DIGラベルしてある分子量 マーカ一（ロシュ ·ダイァグノスティック）  B: In A, the RT-PCR product after screening for each round was electrophoresed on a 1% agarose gel for enrichment of endogenous c-jun in the mouse brain IVV library. · Produced. M; DIG-labeled molecular weight marker (Roche Diagnostics)
図 4は、 本発明のライブラリーから検出されたべィ トと相互作用のある蛋白質 の例を示す。 図 3の Aに示す方法により得られた 3ラウンド目のライブラリーを クローニングしシ一ケンスして検出した内在 c-jun配列の一例。  FIG. 4 shows examples of proteins interacting with the bait detected from the library of the present invention. An example of an endogenous c-jun sequence detected by cloning and sequencing the third round library obtained by the method shown in FIG. 3A.
図 5は、 本発明のライブラリーを用いた IVVの物質や蛋白質との相互作用解析 の一次スクリーニングと二次スクリーニングの概略を示す。  FIG. 5 shows an outline of the primary screening and the secondary screening of the interaction analysis with IVV substances and proteins using the library of the present invention.
図 6は、 翻訳テンプレート （A) ならびにその構成要素であるコード分子 （B ) およびスぺーサ一分子 （C ) の構成を示す。 翻訳テンプレートは、 コード分子由 来のコード部とスぺ一サー分子由来のスぺーサ一部からなる。 F1および F2は蛍光 色素を示す。  FIG. 6 shows the structure of the translation template (A) and its components, the coding molecule (B) and the spacer molecule (C). The translation template consists of a coding part derived from the coding molecule and a part of the spacer derived from the spacer molecule. F1 and F2 represent fluorescent dyes.
図 7は、 C末端修飾された蛋白質（C末端ラベル化蛋白質） （A) 、 本発明の翻 訳テンプレート （B ) 、 および、 修飾剤 （C ) の構成を示す。  FIG. 7 shows the configurations of the C-terminal modified protein (C-terminal labeled protein) (A), the translation template (B) of the present invention, and the modifying agent (C).
図 8は、 無細胞共翻訳による複合体の形成の概略を示す。  FIG. 8 shows the outline of the complex formation by cell-free cotranslation.
A: ペイ トとプレイが無細胞翻訳系で共に翻訳され相互作用し、 無細胞翻訳系に おいて複合体を形成する。 プレイは単数（I )であっても複数（Π )であっても構わ ないし、 また、 無細胞翻訳系での翻訳で得られるポリペプチドそのものであって も、 対応付け分子 (結合体)であっても構わない。 A: Pat and prey are translated together in a cell-free translation system and interact to form a complex in the cell-free translation system. The play may be singular (I) or plural (Π), and the polypeptide itself obtained by translation in the cell-free translation system may be an assigning molecule (conjugate). It does not matter.
B: ベイ トの共存下、 プレイが無細胞翻訳系で翻訳され相互作用し、 無細胞翻訳 系において複合体を形成する。 プレイは単数（I )であっても複数（I I )であっても 構わないし、 また、 無細胞翻訳系での翻訳で得られるポリペプチドそのものであ つても、 対応付け分子 (結合体)であっても構わない。 B: In the presence of bait, play is translated and interacts with a cell-free translation system, and cell-free translation Form a complex in the system. The prey may be singular (I) or plural (II), and the polypeptide itself obtained by translation in the cell-free translation system may be an assigning molecule (conjugate). It does not matter.
図 9は、 複合べィ トを用いた場合の無細胞共翻訳による複合体の形成の概略を 示す。  FIG. 9 shows an outline of the formation of a complex by cell-free cotranslation when using a complex vector.
複合べィ トを構成する一部のペイ トとプレイが無細胞翻訳系で共に翻訳され相 互作用し、 無細胞翻訳系において複合体を形成する。 プレイは、 単数（I )であつ ても複数（Π )であっても構わないし、 また、 無細胞翻訳系での翻訳で得られるポ リペプチドそのものであっても、 対応付け分子（結合体）であっても構わない。 ま た、 複合べイ トは、 図に示した無細胞翻訳系で翻訳されたポリペプチドと DNAベ ィ トの組合せに限られず、 無細胞翻訳系で翻訳された複数又は単独のポリべプチ ドと、 無細胞翻訳系で共存する複数又は単独のペイ ト（たとえば、 DNAペイ トなど） の組み合わせが挙げられる。  A part of the composite bait and the prey are translated together in the cell-free translation system and interact with each other to form a complex in the cell-free translation system. The play may be singular (I) or plural (Π), and may be a polypeptide itself obtained by translation in a cell-free translation system, or a mapping molecule (conjugate). It does not matter. Further, the composite bait is not limited to the combination of a polypeptide and a DNA byte translated by the cell-free translation system shown in the figure, but may be a plurality or a single polypeptide translated by the cell-free translation system. And a combination of two or more coexisting cells (for example, a DNA pattern) in a cell-free translation system.
図 1 0は、 無細胞共翻訳による複合体のスクリーニング方法の概略を示す。 図 8および 9で示したような無細胞共翻訳による複合体形成の工程（ 1 )、 その 複合体のプレイをスクリーニングする工程（2)、 および、 プレイの解析の工程（3 ) により、 無細胞共翻訳とスクリーニングをトータルに in vitroで実現することが できる。 プレイが対応付け分子でかつ複数であれば、 RT-PCR又は PCIUこよってプ レイをコードする mRNA又は DNAを再構成することにより再度（ 1 )の工程からスクリ —ニングを繰り返すことができる。 また、 得られたプレイを解析後、 ペイ トとし て（1)の工程からスクリーニングを新たに繰り返すことができる。 発明を実施するための最良の形態  FIG. 10 shows an outline of a method for screening a complex by cell-free cotranslation. The steps of forming a complex by cell-free cotranslation (1), screening the prey of the complex (2), and analyzing the prey (3) as shown in Figs. Cotranslation and screening can be realized in vitro. If the play is a mapping molecule and a plurality of plays, screening can be repeated from the step (1) again by reconstituting the mRNA or DNA encoding the play by RT-PCR or PCIU. After analyzing the obtained play, the screening can be newly repeated from the step (1) as a pay. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
本発明のライブラリ一およびその製法の概略を図 1を参照して説明する。  The outline of the library of the present invention and the method for producing the library will be described with reference to FIG.
本発明に使用される RNA又は] nMAライブラリ一は、 原核、 真核生物、 ウィルス などあらゆる種のいかなる組織から抽出した MA又は mRNAライブラリーでも構わ ない。 また、 解読したゲノムや cDNAライブラリ一を転写した MAライブラリ一や それを再現した人工の RNAライブラリー、 あるいは自然には存在しない配列を含 む人工の cDNAライブラリーを転写した RNAライブラリーでも構わない。 一本鎖（ ss )DNAラィブラリ一は、 上記の MA又は mRNAラィブラリ一を特定配列を 持つランダムプライマーで逆転写（図 1、 I )したライブラリ一である。 この際の 逆転写酵素としては特に定めはなく、 Superscript II RT (Superscript Double Strand cDNA Synthesis Kit; Invitrogen), Sensiscript Reverse Transcriptase(Qiagen)などで良レヽ。 また、 ランダムプライマーのアダプタ一部分の特定配列については、 最終的に対 応付け分子のライブラリ一を作成できるものあれば制限はないが、 通常には、 図 1にあるように、 3' tail又は Tag 2と 35 tailを含む配列となる。 ここで、 3' tail は、 A配列としてポリ Ax 8配列、 又は XA配列として Xhol配列や 4塩基以上で（C又 は G)藤 (C又は G)の配列と A配列の組み合わせが挙げられる。 Tag 2は、 親和性タグ 配列として Flag-tag配列、 HA- tag、 IgGのプロティン A( zドメイン）などの抗原抗 体反応を利用したもの、 His-tagなど、 蛋白質を検出又は精製できるいかなる手 段を用いるための配列でもかまわない。 ここで、 翻訳効率に影響する範囲として は、 C末端ラベル化蛋白質合成の際は、 XA配列の組み合わせが好ましく、 IVV形 成の際は、 A配列が好ましい。 また、 3， tailの XA配列又は A配列は、 IVVの PEGスぺ —サ一や翻訳をさらに促進する PEG(Boc)スぺ一サ一とのライゲ一シヨンの際に必 要な配列でもある。 The RNA or nMA library used in the present invention may be a MA or mRNA library extracted from any tissue of any kind such as prokaryote, eukaryote, and virus. Alternatively, an MA library that transcribes the decoded genome or cDNA library, an artificial RNA library that reproduces it, or an RNA library that transcribes an artificial cDNA library that contains sequences that do not exist in nature may be used. . The single-stranded (ss) DNA library is a library obtained by reverse transcription (FIG. 1, I) of the above-mentioned MA or mRNA library with random primers having a specific sequence. The reverse transcriptase at this time is not particularly limited, and is suitable for use with Superscript II RT (Superscript Double Strand cDNA Synthesis Kit; Invitrogen), Sensiscript Reverse Transcriptase (Qiagen) and the like. In addition, the specific sequence of the adapter part of the random primer is not limited as long as it can finally create a library of the corresponding molecules. 2 and the sequence containing the 3 5 tail. Here, the 3 'tail includes a poly Ax 8 sequence as an A sequence, an Xhol sequence as an XA sequence, a combination of (C or G) wister (C or G) with 4 or more bases and an A sequence. Tag 2 is an affinity tag sequence that uses antigen-antibody reaction such as Flag-tag sequence, HA-tag, IgG protein A (z domain), His-tag, or any other means that can detect or purify proteins. An arrangement for using columns may be used. Here, as a range that affects the translation efficiency, a combination of XA sequences is preferable when synthesizing a C-terminal labeled protein, and an A sequence is preferable when forming IVV. In addition, the XA or A sequence at the tail is also necessary for ligating with the PEG spacer of IVV and the PEG (Boc) spacer that further promotes translation. .
対応付け分子の構成は、 例えば、 W0 02/46395に記載されており、 対応付け分 子の形成に必要な配列、 すなわち、 特定配列は当業者であれば、 このような公知 の構成に基づき、 適宜設定できる。  The configuration of the assigning molecule is described, for example, in WO 02/46395, and the sequence necessary for forming the assigning molecule, that is, the specific sequence can be determined by those skilled in the art based on such a known configuration. It can be set appropriately.
dsDNAラィブラリ一は、 上記の ssDNAラィブラリーを二本鎖 DNAに合成（図 1、 I I ) したものである。 この際、 MAポリメラ一ゼ Iによる相補鎖 DNAの合成と RNase Hに よる RNA分解を同時に行い、 さらに、 DNAリガーゼで、 DNAポリメラーゼ Iにより合 成された DNA間のニックをつなく、。 合成された二本鎖 DNAライブラリ一は、 DNAポ リメラーゼ Iにより合成された相補鎖のみ 5'末端がリン酸化されており、 33末端 に特定の配列を持つことが重要な特徴である。 なお、 dsDNAライブラリ一は、 こ の方法により形成されることが好ましいが、 一本鎖 DNAの相補鎖 DNAの 5'末端のみ がリン酸化されている dsDNAライブラリーが形成される限り、 他の酵素を用いた り、 他の原理によって形成してもよい。 The dsDNA library is obtained by synthesizing the above ssDNA library into double-stranded DNA (Fig. 1, II). At this time, synthesis of complementary strand DNA by MA polymerase I and RNA degradation by RNase H were performed at the same time. Furthermore, DNA ligase was used to eliminate nicks between DNAs synthesized by DNA polymerase I. Double-stranded DNA library one synthesized, only the complementary strand which is synthesized by DNA polymerase I 5 'terminus is phosphorylated, is an important feature to have a specific sequence in 3 3 terminus. The dsDNA library is preferably formed by this method, but other enzymes may be used as long as a dsDNA library in which only the 5 'end of the complementary DNA of the single-stranded DNA is phosphorylated is formed. Or may be formed by other principles.
ラィゲ一テッド dsDNAラィブラリ一は、 上記の dsDNAラィブラリ一に、 特定配列 を持つアダプタ一を DNAリガーゼによりライゲ一シヨン（図 1、 I I I )したものであ る。 この際に、 アダプタ一主鎖の 5，末端はリン酸化されていないことでセルフラ ィゲ一シヨンを回避することが特徴であり、 ライゲ一シヨン効率の良い DNAリガ ーゼでライゲ一シヨンできるようにアダプタ一の 3，末端に主鎖より短い副鎖をハ イブリダィゼーシヨンし二本鎖にしておくことが好ましい。 ここで、 アダプタ一 の副鎖の 5'末端もリン酸化されていないことが必要であり、 理論的には主鎖より 短ければよいが、 ハイブリダィゼ一シヨンの有効性を考えると 6bp以上であるこ とが好ましい。 ライゲーシヨンを MAリガ一ゼで行う場合は、 アダプタ一は一本 鎖とし、 ここでもアダプタ一をリン酸化しない。 ただし、 IVVランダムライブラ リ一作成時では、 テンプレートの 3，末端が RNAリガーゼの良いァクセプ夕一とな るための配列（ A配列）を有しており、 テンプレート同士のライゲ一シヨンが起こ る確率は、 DNAリガ一ゼを用いた作成方法より断然高くなる点が不利である。 ま た、 UNAリガーゼは DNAリガーゼに比較してライゲ一ション効率が落ちるので、 総 合的に見て、 ライゲ一シヨンを DNAリガ一ゼで行うことが好ましい。 また、 ァダ プ夕一の特定配列については、 最終的に対応付け分子のライブラリ一を作成でき るものあれば制限はないが、 通常には、 図 1にあるように、 5' UTR又は 5' UTR と T ag 1を含む配列となる。 5' UTRは、 転写プロモーターと翻訳ェンハンサ一からな り、 転写プロモー夕一は T7/T3又は SP6などが利用でき、 特に制限はないが、 小麦 の無細胞翻訳系では、 転写プロモーターとしては SP6、 翻訳のェンハンサー配列 としてはオメガ配列やオメガ配列の一部を含む配列を利用することが好ましい。 翻訳ェンハンサ一のオメガ配列の一部（029 )は、 TMVのオメガ配列の一部を含んだ ものである（Gallie D.R., Walbot V. (1992) Nucleic Acids Res., vol. 20, 4631-4638、 お よび、 WO 02/48347の図 3参照）。 Tag 1については、 先程の Tag 2と同様であるが、 Ta 1と Tag 2の両方を配する場合は、 異なる Tag配列を配するようにする。 ライ ゲ一シヨンされるアダプターには、 これら 5' UTR又は UTR と Tag 1の一部又は全 部の配列が含まれる場合がある。 The ligated dsDNA library is the same as the above dsDNA library, This is the adapter that has been ligated by DNA ligase (Fig. 1, III). At this time, it is characteristic that the 5th end of the main chain of the adapter is not phosphorylated, thereby avoiding self-ligation, so that it can be ligated with DNA ligase with high ligation efficiency. It is preferable to hybridize a sub-chain shorter than the main chain at the end of the adapter to make it double-stranded. Here, it is necessary that the 5 'end of the subchain of the adapter is not phosphorylated, and it is theoretically sufficient if it is shorter than the main chain.However, considering the effectiveness of hybridization, it should be 6 bp or more. Is preferred. When ligation is performed with MA ligase, the adapter is single-stranded and the adapter is not phosphorylated. However, when the IVV random library was created, the 3rd end of the template had a sequence (A sequence) to become a good excep- tion for RNA ligase, and the probability of ligation between the templates occurred. Is disadvantageous in that it is significantly higher than the production method using DNA ligase. In addition, since ligation efficiency of UNA ligase is lower than that of DNA ligase, it is preferable to perform ligation with DNA ligase as a whole. The specific sequence of the adapter is not limited as long as it can finally create a library of assigned molecules, but usually, as shown in Figure 1, 5 'UTR or 5' UTR 'An array containing UTR and Tag1. The 5 'UTR consists of a transcription promoter and a translation enhancer.The transcription promoter can be T7 / T3 or SP6, etc., and there is no particular limitation.In a wheat cell-free translation system, the transcription promoter is SP6 or SP6. It is preferable to use an omega sequence or a sequence containing a part of the omega sequence as the enhancer sequence for translation. A part of the omega sequence (029) of the translation enhancer contains a part of the omega sequence of TMV (Gallie DR, Walbot V. (1992) Nucleic Acids Res., Vol. 20, 4631-4638, And FIG. 3 of WO 02/48347). Tag 1 is the same as Tag 2 described above, but when both Ta 1 and Tag 2 are arranged, different Tag sequences are arranged. Adapters to be ligated may include these 5 'UTRs or the sequences of some or all of UTR and Tag 1.
本発明の IVV cDNAライブラリ一は、 上記のライゲーテッド dsDNAライブラリ一 をテンプレ一トとして、 特定の配列を有する 5'および 3，プライマ一で PCR (図 1、 IV)を行い合成する。 5，および 3，プライマ一は、 5，UTR、 Tag 1、 Tag 2、 3， tailの 特定の配列でアニーリングし、 かつ 5，UTR、 Ta 1、 Tag 2、 3， tailの一部をァダ プ夕一配列として含む場合がある。 この PCRで 5，UTR、 Tag 1、 Tag 2、 3' tailなど の特定配列を持つ cDNAライブラリーが完成する。 The IVV cDNA library of the present invention is synthesized by using the above-mentioned ligated dsDNA library as a template and performing PCR (FIG. 1, IV) with 5 ′ and 3, primers having a specific sequence. 5, and 3, the primers are 5, UTR, Tag 1, Tag 2, Tag 3, tail Annealing with a specific sequence may include part of 5, UTR, Ta1, Tag2, 3, and tail as an adapter sequence. By this PCR, a cDNA library with specific sequences such as 5, UTR, Tag 1, Tag 2, Tag 3 'tail is completed.
本発明の IVV MAライブラリーは、 上記の IVV cDNAライブラリーを転写（図 1、 V)して得られる。 この際、 この IVV RNAライブラリ一をこのまま翻訳することや C末端ラベル化剤存在化に翻訳することで C末端ラベル化蛋白質ライブラリ一を 合成することが可能である。 転写の酵素は、 特定配列に選択した T3, T7又は SP6 などの酵素となる。  The IVV MA library of the present invention is obtained by transcription (FIG. 1, V) of the above-described IVV cDNA library. At this time, it is possible to synthesize a C-terminal labeled protein library by translating the IVV RNA library as it is or by translating it into the presence of a C-terminal labeling agent. The transcription enzyme will be an enzyme such as T3, T7 or SP6 selected for the specific sequence.
本発明の IVVラィゲーテッド RNAラィブラリ一は、 上記の IVV RNAラィブラリ一 をスぺ一サ一とライゲーシヨン（図 1、 VI )して得られる。 スぺーサ一としては、 IVV形成の場合は IVVの PEGスぺ一サ一、 および C末端ラベル化蛋白質合成のための PEG(Boc)スぺーサ一などが考えられる。 ライゲーシヨン酵素としては、 RNAリガ ーゼを用いる方法が代表的だが、 その他、 DNAリガーゼを用いるものや光反応に よる連結など何でもよく、 特に限定されるものではない。  The IVV-ligated RNA library of the present invention can be obtained by ligating the above-described IVV RNA library with a spacer (FIG. 1, VI). Examples of spacers include IVV PEG spacers for IVV formation and PEG (Boc) spacers for the synthesis of C-terminally labeled proteins. As a ligation enzyme, a method using RNA ligase is typical, but other methods such as DNA ligase and ligation by photoreaction may be used, and are not particularly limited.
本発明の IVVランダムプライミングライブラリーは、 上記の IVVライゲーテツド UNAライブラリーを無細胞翻訳系又は細胞内で翻訳（図 1、 VI I )して得られる。  The IVV random priming library of the present invention is obtained by translating the above-mentioned IVV ligated UNA library in a cell-free translation system or in a cell (FIG. 1, VII).
IVVの PEGスぺ一サ一および C末端ラベル化蛋白質合成の PEG(Boc )スぺ一サ一は、 CCA領域、 PEG領域、 ドナー領域からなる。 最低限必要な構成は、 ドナー領域であ る。 翻訳効率に影響する範囲としては、 ドナー領域のみならず PEG部を持つもの が好ましく、 さらにアミノ酸との結合能力のないピューロマイシンを持つことが 好ましい。 PEG領域のポリエチレングリコールの分子量の範囲は、 400〜30, 000で、 好ましくは; U 000〜； 10, 000、 より好ましくは 2, 000〜6, 000である。 また、 CCA領域 にはピュ一ロマイシンを含む構成と含まない構成が可能であり、 ピュ一ロマイシ ンについては、 ピューロマイシン （Puromycin) 、 3， -N-アミノアシルビユ一ロマ イシンァ ノヌクレオシド (3，-N-Aminoacylpuromycin aminonucleoside, PANS—ァ ミノ酸） 、 例えばアミノ酸部がグリシンの PANS- Gly、 ノ、'リンの PANS- Val、 ァラニ ンの PANS-Ala、 その他、 全アミノ酸に対応する PANS-全アミノ酸が利用できる。 また、 化学結合として 3' -アミノアデノシンのァミノ基とアミノ酸のカルボキシ ル基が脱水縮合した結果形成されたアミ ド結合でつながった 3' -N-アミノアシル アデノシンアミ'ノヌクレ才シド (3'-Aminoacyladenosine aminonucleoside, MNS—ァ ミノ酸） 、 例えばアミノ酸部がグリシンの MNS-Gly、 パリンの MNS-Val、 ァラニ ンの AANS- Ala、 その他、 全アミノ酸に対応する MNS-全アミノ酸が利用できる。 また、 ヌクレオシド又はヌクレオシドとアミノ酸のエステル結合したものなども 利用できる。 その他、 ヌクレオシド又はヌクレオシドに類似した化学構造骨格を 有する物質と、 アミノ酸又はアミノ酸に類似した化学構造骨格を有する物質を化 学的に結合可能な結合様式のものなら全て利用することができる。 CCA領域は、 5 '側に 1残基以上の DNAおよび/又は RNAからなる塩基配列を持つことが好ましい。 塩基の種類としては、 C>(U又は T)>G>Aの順で好ましい。 配列としては、 dC-ピュ 一口マイシン， rC-ピューロマイシンなど、 より好ましくは dCdC-ピュ一ロマイシ ン rCrC-ピューロマイシン， rCdC-ピューロマイシン， dCrC-ピュ一ロマイシンな どの配列で、 アミノアシル- tRMの 3'末端を模倣した CCA配列 (Philipps G.R. (1969) Nature 223, 374-377)が適当である。 C末端ラベル化蛋白質合成のための PEG(Boc) スぺーサ—では、 以上のピュー口マイシン誘導体のァミノ基がアミノ酸と結合す る能力を欠いたあらゆる物質、 およびピュ一口マイシンを欠いた CCA領域も考え られる。 PEG部は修飾物質を有する構成が可能である。 このことによって、 翻訳 テンプレートを回収、 精製による再利用、 あるいは固定化などのための夕グとし て利用することが出来る。 少なくとも 1残基の MAおよび/又は RNAの塩基に修飾物 質として、 蛍光物質、 ビォチン、 又は His-tagなど各種分離タグなどを導入した ものが可能である。 The IVV PEG spacer and the PEG (Boc) spacer for the synthesis of C-terminally labeled proteins consist of a CCA region, a PEG region and a donor region. The minimum required configuration is the donor area. As a range that affects the translation efficiency, one having not only a donor region but also a PEG portion is preferable, and further, puromycin having no ability to bind to an amino acid is preferable. The molecular weight range of the polyethylene glycol in the PEG region is 400 to 30,000, preferably; U 000 to; 10,000, more preferably 2,000 to 6,000. The CCA region can be configured with or without puromycin. For puromycin, puromycin (Puromycin), 3, -N-aminoacylbiyl-mycinanonucleoside (3,- N-Aminoacylpuromycin aminonucleoside (PANS-amino acid), for example, when the amino acid portion is PANS-Gly for glycine, P, PANS-Val for phosphorus, PANS-Ala for alanine, and PANS-all amino acids corresponding to all amino acids Available. Also, a 3'-N-aminoacyl linked by an amide bond formed as a result of dehydration condensation of the amino group of 3'-aminoadenosine and the carboxyl group of amino acid as a chemical bond. Adenosine amino'side (3'-Aminoacyladenosine aminonucleoside, MNS-amino acid), which corresponds to MNS-Gly of glycine, MNS-Val of palin, AANS-Ala of alanine, and all other amino acids MNS-all amino acids are available. Further, nucleosides or those in which a nucleoside and an amino acid are ester-bonded can also be used. In addition, any nucleoside or a substance having a chemical structural skeleton similar to a nucleoside and a substance having a chemical structural skeleton similar to an amino acid or an amino acid can be used as long as they can be chemically bonded. The CCA region preferably has a base sequence consisting of DNA and / or RNA of one or more residues on the 5 ′ side. The type of base is preferably in the order of C> (U or T)>G> A. The sequence is preferably a sequence such as dC-puromycin, rC-puromycin, more preferably dCdC-puromycin, rCrC-puromycin, rCdC-puromycin, dCrC-puromycin, and aminoacyl-tRM3. 'A CCA sequence that mimics the terminus (Philipps GR (1969) Nature 223, 374-377) is appropriate. For PEG (Boc) spacers for the synthesis of C-terminally labeled proteins, any substance in which the amino group of the above-mentioned puromycin derivative lacks the ability to bind to an amino acid, and a CCA region lacking the purimin-mycin It is also possible. The PEG portion can be configured to have a modifying substance. As a result, the translation template can be used for collection, reuse by purification, or as an evening for immobilization. It is possible to introduce at least one residue of MA and / or RNA into which a fluorescent substance, biotin, or various separation tags such as His-tag are introduced as modification substances.
C末端ラベル化剤は、 タンパク質の翻訳系でのペプチド転移反応、 すなわち、 リボソーム上でのぺプチド転移反応によってタンパク質と結合し得る基 （残基を 含む） をもつァクセプ夕一部が、 ヌクレオチドリンカ一を介して修飾部と結合し た構成をもつ。 この修飾剤の存在下でタンパク質合成を行い、 得られる C末端修 飾タンパク質を精製し、 分子間相互作用の検出系を用いることによって、 タンパ ク質相互作用の検出が可能となる。 修飾部には、 PEG部と同様に修飾物質が含ま れる。 修飾物質として、 非放射性修飾物質の具体例としては、 蛍光性、 非蛍光性 修飾物質等が挙げられる。 蛍光性物質としては、 フルォレセイン系列、 ローダミ ン系列、 Cy3、 Cy5、 ェォシン系列、 NBD 系列等の蛍光色素や、 緑色蛍光タンパク 質 （GFP) 等の蛍光性タンパク質がある。 また、 非蛍光性物質としては、 ビォチ ンのような補酵素、 タンパク質、 ペプチド、 糖類、 脂質類、 色素、 ポリエチレン グリコール等、 何らかの目印となり得る化合物であればいかなるものでもよい。 ァクセプ夕一部は、 タンパク質の翻訳系で、 ペプチド転移反応によってタンパク 質と結合し得る基をもち、 好ましくはピュー口マイシン又はその誘導体の残基を もつ。 ピューロマイシンはアミノアシル tRNAと類似した構造をもち、 タンパク質 合成を阻害する抗生物質として知られているが、 低濃度ではタンパク質の C末端 に結合することが知られている （Miyamoto-Sato, E. et al. (2000) Nucleic Acids Res. 28: 1176-1182) 。 本発明で用いることができるピュ一ロマイシン誘導体は、 ピュ 一口マイシンと類似した構造を有し、 タンパク質の C末端に結合することができ る物質であればいかなるものでもよい。 具体例としては、 3，-N-アミノアシルピ ユーロマイシンアミノヌクレオシド、 3， - N-アミノアシルアデノシンアミノヌク レオシド等が挙げられる。 修飾部とァクセプ夕一部との間をつなく、ヌクレオチド リンカ一とは、 具体的には、 リボヌクレオチド又はデォキシリボヌクレオチドが 1個ないし複数個つながった核酸又は核酸誘導体であり、 特に好ましい例として、 シトシン塩基を含むリボヌクレオチド（-rC-)又はデォキシリボヌクレオチド（- dC -)が 1個ないし複数個つながった化合物が挙げられる。 その他、 修飾部とァクセ プ夕一部との間に揷入することによって修飾タンパク質の収量を上げることがで きる物質であればいかなるものでもよい。 本発明修飾剤においては、 ヌクレオチ ドリンカ一が 2' -デォキシシチジル酸、 2' -デォキシシチジル-（35 , 5' )- 2' -デォ キシチジル酸、 リボシチジル酸、 又は、 リボシチジル -(3' , 5，）-リボシチジル酸 であることが好ましい。 修飾剤は、 上記修飾部とァクセプ夕一部とを所望のヌク レオチドリンカ一を介して、 それ自体既知の化学結合方法によって結合させるこ とにより製造することができる。 具体的には、 例えば、 適当な保護基で保護され た上記ァクセプ夕一部を固相担体上に結合させ、 核酸合成機を用いてヌクレオチ ドリンカーとしてヌクレオチドホスホアミダイ ト、 およびデォキシヌクレオチド ホスホアミダイ ト、 機能性修飾物質として蛍光物質やピオチンなどを結合したホ スホアミダイ トを順次結合させた後、 脱保護を行うことによって作製することが できる。 上記各部の種類又は結合の種類によっては液相合成法で結合させるかあ るいは両者を併用することもできる。 また、 機能性修飾物質としてニッケル等の 金属イオンを用いる場合には、 金属イオンが配位しうる二トリロトリ酢酸ゃィミ ノジ酢酸等のキレート性の試薬を結合させ、 次いで金属イオンを配位させること ができる。 The C-terminal labeling agent is a nucleotide linker that has a group (including a residue) capable of binding to a protein by a transpeptidation reaction in a protein translation system, that is, a peptide transfer reaction on a ribosome. It has a configuration in which it is connected to the modifier via one. By performing protein synthesis in the presence of this modifying agent, purifying the resulting C-terminally modified protein, and using a detection system for intermolecular interaction, protein interaction can be detected. The modifying part contains a modifying substance as in the case of the PEG part. Specific examples of the non-radioactive modifying substance as the modifying substance include fluorescent and non-fluorescent modifying substances. Examples of the fluorescent substance include fluorescent dyes such as fluorescein series, rhodamine series, Cy3, Cy5, eosin series, NBD series, and green fluorescent protein. There are fluorescent proteins such as quality (GFP). In addition, the non-fluorescent substance may be any compound such as a coenzyme such as biotin, a protein, a peptide, a saccharide, a lipid, a dye, a polyethylene glycol, or the like, as long as it can be any marker. A part of the protein is a protein translation system, which has a group capable of binding to a protein by a transpeptidation reaction, and preferably has a residue of pure mouth mycin or a derivative thereof. Puromycin has a structure similar to aminoacyl-tRNA and is known as an antibiotic that inhibits protein synthesis, but is known to bind to the C-terminus of proteins at low concentrations (Miyamoto-Sato, E. et. al. (2000) Nucleic Acids Res. 28: 1176-1182). The puromycin derivative that can be used in the present invention may be any substance as long as it has a structure similar to that of puripamicin and can bind to the C-terminus of the protein. Specific examples include 3, -N-aminoacylpiuromycin aminonucleoside, 3, -N-aminoacyladenosine aminonucleoside, and the like. The nucleotide linker is a nucleic acid or a nucleic acid derivative in which one or a plurality of ribonucleotides or deoxyribonucleotides are linked, and is particularly preferable. Examples include compounds in which one or more ribonucleotides containing cytosine bases (-rC-) or deoxyribonucleotides (-dC-) are linked. In addition, any substance can be used as long as it can increase the yield of the modified protein by inserting between the modified part and a part of the peptide. In the modifying agent of the present invention, nucleotide Dorinka one 2 '- Dokishishichijiru acid, 2' - Dokishishichijiru - (3 5, 5 ') - 2' - de O Kishichijiru acid, Riboshichijiru acid, or, Riboshichijiru - (3 ', 5 ,)-Ribocytidylic acid. The modifying agent can be produced by bonding the above-mentioned modified portion and a portion of the amino acid linkage via a desired nucleotide linker by a known chemical bonding method. Specifically, for example, a part of the above-described amino acid protected with an appropriate protecting group is bound to a solid support, and a nucleotide phosphoramidite and a deoxynucleotide phosphoramidite are used as a nucleotide linker using a nucleic acid synthesizer. It can be prepared by sequentially binding phosphoramidite to which a fluorescent substance or biotin is bound as a functional modifier, and then performing deprotection. Depending on the type of each part or the type of bonding, it may be possible to combine them by liquid phase synthesis. Alternatively, both can be used in combination. When a metal ion such as nickel is used as the functional modifier, a chelating reagent such as ditrilotriacetic acid diminodidiacetate, to which the metal ion can be coordinated, is bound, and then the metal ion is coordinated. be able to.
無細胞タンパク質合成系の具体例としては、 小麦胚芽抽出液、 ゥサギ網状赤血 球抽出液、 大腸菌 S30抽出液等が挙げられる。 これらの無細胞タンパク質合成系 の中に、 翻訳テンプレートであるライブラリ一を加え、 C末端ラベル化の場合は、 同時に 1〜100〃Mの修飾剤を加え、 25〜37°Cで 1〜数時間保温することによって C 末端修飾タンパク質が合成される。 対応付けの場合は、 翻訳テンプレートである ライブラリーを加えて、 25〜37°Cで 1〜数時間保温するだけで対応付け分子が合 成される。 合成された両修飾タンパク質は、 そのまま次の精製プロセス又は検出 プロセス、 あるいは直接細胞への導入に供することができる。 細胞発現系の具体 例としては、 大腸菌、 枯草菌、 好熱菌、 酵母等の細菌から、 昆虫細胞、 哺乳類等 の培養細胞、 さらに線虫、 ショウジヨウバエ、 ゼブラフィッシュ、 マウス等に至 るまでいかなる細胞でもよい。 これらの細胞の中に、 上記 C末端ラベル化又は対 応付けされた両修飾タンパク質を直接導入することもできるし、 あるいは、 翻訳 テンプレートであるライブラリ一を導入し、 C末端ラペル化の場合は、 同時に 1 〜 100〃Mの修飾剤を電気穿孔法、 マイクロインジ クシヨン法等により細胞の中 ' に導入し、 細胞の至適生育温度で数時間保温することによって修飾タンパク質が 合成される。 対応付けの場合は、 対応付けテンプレートであるライブラリ一を導 入し、 細胞の至適生育温度で数時間保温することによって対応付け分子が合成さ れる。 合成された両修飾タンパク質は、 細胞を破砕することによって回収し次の 精製プロセス又は検出プロセスに供することができる。 また、 そのまま細胞の中 で検出プロセスに供することも可能である。  Specific examples of the cell-free protein synthesis system include a wheat germ extract, a heron reticulocyte extract, and an Escherichia coli S30 extract. Add the library as a translation template to these cell-free protein synthesis systems.For C-terminal labeling, add 1-100〃M modifier at the same time, and at 25-37 ° C for 1 to several hours. C-terminal modified protein is synthesized by incubation. In the case of associating, the associating molecules are synthesized simply by adding a library as a translation template and incubating at 25 to 37 ° C for 1 to several hours. Both synthesized modified proteins can be directly used for the next purification or detection process, or directly into cells. Specific examples of cell expression systems include bacteria such as Escherichia coli, Bacillus subtilis, thermophiles and yeast, cultured cells of insect cells, mammals, etc., as well as nematodes, Drosophila, zebrafish, mice, etc. Any cell may be used. Both of the above C-terminally labeled or corresponding modified proteins can be directly introduced into these cells, or, if a translation template library is introduced and C-terminal lapelization is performed, At the same time, a modifying agent of 1-100〃M is introduced into the cells by electroporation, microinjection, etc., and the modified protein is synthesized by keeping the cells at the optimal growth temperature for several hours. In the case of associating, an associating molecule is synthesized by introducing a library, which is an associating template, and keeping the cells at an optimal growth temperature for several hours. Both synthesized modified proteins can be recovered by disrupting the cells and subjected to the subsequent purification or detection process. It can also be subjected to the detection process in cells as it is.
対応付け分子のライブラリ一は、 進化分子工学として、 ダーウィン進化機構を 利用して、 「変異 (Mutation)」 、 「選択（Selection^ 、 「増幅 (Amplification^ の 3つの単位操作を繰り返すことで漸進的に進化させ、 所望の機能を獲得した物 質を創製することで工学的に応用することが可能であり、 また、 ゲノム機能解析 への応用として、 cDNAライブラリーから所望の物質や蛋白質と相互作用を持つ一 群の遺伝子配列を網羅的に解析可能である（図 5 )。 本発明のライブラリーとして IVVの cMAをもちいて、 一次スクリーニングで物質や蛋白質と相互作用を検出し (図 3の共翻訳スクリーニングはその一例）、 さらに、 相互作用の詳細を FCCSやマ イクロアレイなどの二次スクリーニングで解析することが可能である。 また、 本 発明のライブラリーは、 IVV又は C末端ラベル化蛋白質のライブラリーとして、 単独で FCCSやマイクロアレイなどにより物質ゃ蛋白質との相互作用解析に利用す ることも可能である。 また、 もちろん本発明のライブラリ一を IVVを用いた進化 分子工学に応用し、 一次スクリーニングにより機能性蛋白質の創出に利用するこ とも可能であり、 その際に、 一次スクリーニングと二次スクリーニングを組み合 わせて、 創出した機能性蛋白質の相互作用の詳細を解析することも可能である。 この場合に、 対応付け分子の共翻訳スクリーニング/セレクションを用いた解 析は非常に有効である。 なぜなら、 共翻訳スクリーニング/セレクション法によ つて、 ペイ ト蛋白質と直接又は間接的に相互作用のある蛋白質を網羅的に検出す ることが可能となったからである。 さらに、 共翻訳スクリーニング/セレクショ ン法などによる一次スクリーニング後に、 二次スクリーニングとして、 物質ゃ蛋 白質と相互作用の詳細を FCCSやマイクロアレイなどにより解析することが可能で ある。 以上の解析は、 in vitroにおける共翻訳や共翻訳スクリーニング法と組み 合わせて利用することもできる。 また、 一次スクリーニングで対応付け分子を利 用するときは A配列のコード部を利用し、 二次スクリーニングでは、 対応付け分 子を利用するときは A配列のコ一ド部、 C末端ラベル化蛋白質を利用するときは X A配列のコード部をプライミングによって変更して使用することで、 それそれの 効果を使い分けることが出来る。 The library of mapping molecules uses the Darwinian evolutionary mechanism as an evolutionary molecular engineering to progressively repeat the three unit operations of “Mutation”, “Selection ^”, and “Amplification ^”. It can be applied to engineering by creating a material that has acquired the desired function, and it can be used for the analysis of genomic functions, such as interaction with a desired substance or protein from a cDNA library. One with The gene sequence of the group can be analyzed comprehensively (Fig. 5). Using the IVV cMA as the library of the present invention, the primary screening detects the interaction with the substance or protein (co-translation screening in Fig. 3 is an example), and the details of the interaction are analyzed using FCCS, microarray, etc. It can be analyzed by secondary screening. In addition, the library of the present invention can be used alone as a library of IVV or C-terminal labeled proteins for analysis of interaction with substance-protein by FCCS, microarray, or the like. In addition, it is of course possible to apply the library of the present invention to evolutionary molecular engineering using IVV and use it for the creation of functional proteins by primary screening, in which case the primary screening and the secondary screening are combined. In addition, it is possible to analyze the details of the interaction of the created functional protein. In this case, analysis using co-translation screening / selection of the assigning molecule is very effective. This is because the co-translation screening / selection method has made it possible to comprehensively detect proteins that interact directly or indirectly with the protein. Furthermore, after the primary screening by the co-translation screening / selection method or the like, the details of the interaction between the substance and the protein can be analyzed by FCCS, microarray, or the like as the secondary screening. The above analysis can also be used in combination with in vitro cotranslation and cotranslation screening methods. In addition, when using the assigning molecule in the primary screening, the coding portion of the A sequence is used. In the secondary screening, when using the assigning molecule, the coding portion of the A sequence and the C-terminal labeled protein are used. When you use, you can use the effect of each by changing the code part of XA sequence by priming and using it.
上記で得られた IVVライブラリー又は C末端ラベル化タンパク質のライプラリ 一と 「標的分子」 を、 修飾物質の種類や反応系の種類などにより適宜組み合わせ て接触せしめ、 該修飾タンパク質又は該標的分子が発する信号において両分子間 の相互作用に基づいて発生される上記信号の変化を測定することにより相互作用 を解析することが出来る。 相互作用の解析は、 例えば、 蛍光相関分光法、 蛍光ィ メ一ジングアナライズ法、 蛍光共鳴エネルギー移動法、 エバネッセント場分子ィ メージング法、 蛍光偏光解消法、 表面プラズモン共鳴法、 又は、 固相酵素免疫検 定法により行われる。 「標的分子」 とは、 IW又は C末端ラベル化タンパク質と 相互作用する分子を意味し、 具体的にはタンパク質、 核酸、 糖鎖、 低分子化合物 などが挙げられる。 タンパク質としては、 本発明修飾タンパク質と相互作用する 能力を有する限り特に制限はなく、 タンパク質の全長であっても結合活性部位を 含む部分ペプチドでもよい。 またアミノ酸配列、 およびその機能が既知のタンパ ク質でも、 未知のタンパク質でもよい。 これらは、 合成されたペプチド鎖、 生体 より精製されたタンパク質、 あるいは c D N Aライブラリー等から適当な翻訳系 を用いて翻訳し、 精製したタンパク質等でも標的分子として用いることができる。 合成されたペプチド鎖はこれに糖鎖が結合した糖タンパク質であってもよい。 こ れらのうち好ましくはアミノ酸配列が既知の精製されたタンパク質か、 あるいは c D NAライブラリー等から適当な方法を用いて翻訳および精製されたタンパク 質を用いることができる。 The IVV library or the C-terminal labeled protein library obtained above is brought into contact with the “target molecule” in an appropriate combination depending on the type of the modifying substance and the type of the reaction system, and the modified protein or the target molecule is emitted. The interaction can be analyzed by measuring the change in the signal generated based on the interaction between the two molecules in the signal. Interaction analysis can be performed by, for example, fluorescence correlation spectroscopy, fluorescence imaging analysis, fluorescence resonance energy transfer, evanescent field molecular imaging, fluorescence depolarization, surface plasmon resonance, or solid-phase enzyme immunoassay. Inspection It is performed by a standard method. "Target molecule" means a molecule that interacts with an IW or C-terminal labeled protein, and specifically includes proteins, nucleic acids, sugar chains, low molecular weight compounds, and the like. The protein is not particularly limited as long as it has an ability to interact with the modified protein of the present invention, and may be a full-length protein or a partial peptide containing a binding active site. The protein may have a known amino acid sequence and its function, or may have an unknown protein. These can be used as target molecules even with a synthesized peptide chain, a protein purified from a living body, or translated from a cDNA library or the like using an appropriate translation system, and a purified protein or the like can be used as a target molecule. The synthesized peptide chain may be a glycoprotein having a sugar chain bonded thereto. Of these, a purified protein having a known amino acid sequence, or a protein translated and purified from a cDNA library or the like using an appropriate method can be preferably used.
これら標的分子と IVV又は C末端ラペル化タンパク質との 「相互作用」 とは、 通常は、 タンパク質と標的分子間の共有結合、 疎水結合、 水素結合、 ファンデル ヮ一ルス結合、 および静電力による結合のうち少なくとも 1つから生じる分子間 に働く力による作用を示すが、 この用語は最も広義に解釈すべきであり、 いかな る意味においても限定的に解釈してはならない。 共有結合としては、 配位結合、 双極子結合を含有する。 また静電力による結合とは、 静電結合の他、 電気的反発 も含有する。 また、 上記作用の結果生じる結合反応、 合成反応、 分解反応も相互 作用に含有される。 相互作用の具体例としては、 抗原と抗体間の結合および解離、 タンパク質レセプ夕一とリガンドの間の結合および解離、 接着分子と相手方分子 の間の結合および解離、 酵素と基質の間の結合および解離、 核酸とそれに結合す るタンパク質の間の結合および解離、 情報伝達系におけるタンパク質同士の間の 結合と解離、 糖タンパク質とタンパク質との間の結合および解離、 あるいは糖鎖 とタンパク質との間の結合および解離が挙げられる。  The “interaction” between these target molecules and the IVV or C-terminal lapelated protein usually means covalent, hydrophobic, hydrogen, van der Waals, and electrostatic coupling between the protein and the target molecule. The term refers to the action of forces acting between molecules arising from at least one of the above, but this term should be interpreted in the broadest sense and not in any sense in a limited sense. Covalent bonds include coordination bonds and dipole bonds. The coupling by electrostatic force includes not only electrostatic coupling but also electric repulsion. The interaction also includes a binding reaction, a synthesis reaction, and a decomposition reaction resulting from the above action. Specific examples of the interaction include the binding and dissociation between an antigen and an antibody, the binding and dissociation between a protein receptor and a ligand, the binding and dissociation between an adhesion molecule and a partner molecule, the binding and dissociation between an enzyme and a substrate. Dissociation, binding and dissociation between nucleic acids and proteins that bind to it, binding and dissociation between proteins in the signaling system, binding and dissociation between glycoproteins and proteins, or between sugar chains and proteins Binding and dissociation.
以下、 共翻訳スクリーニング /セレクションを用いた解析方法の例について説 明する。 解析方法には、 相互作用の検出方法および相互作用する蛋白質のスクリ 一二ング方法が含まれる。  The following describes an example of an analysis method using co-translation screening / selection. Analysis methods include methods for detecting interactions and screening for interacting proteins.
本発明検出方法は、 ベイ トとプレイとの間の相互作用の検出において、 プレイ として本発明のライブラリ一を用いるものである。 The detection method of the present invention includes a method for detecting an interaction between a bait and a play. The present invention uses the library of the present invention.
好ましくは、 ペイ トおよびプレイに特定の様式で分離用修飾および検出用標識 を行い、 そして、 無細胞翻訳系においてべィ トの存在下で、 プレイを翻訳により 生成させることによりペイトとプレイとを接触させることを主な特徴とするもの である。 本明細書においては、 無細胞翻訳系においてペイ 卜の存在下で、 プレイ を翻訳により生成させることによりペイ トとプレイとを接触させることを 「無細 胞共翻訳」 ともいう。  Preferably, the pait and the prey are subjected to separation modification and detection labeling in a specific manner, and the prey is generated by translation in the presence of a byte in a cell-free translation system to allow the pait and the prey to be translated. The main feature is to make contact. In the present specification, bringing a play into contact with a play by generating a play by translation in the presence of a sheet in a cell-free translation system is also referred to as “cell-free cotranslation”.
本明細書において、 ベイトおよびプレイの用語は、 物質間の相互作用の解析の 技術分野で通常に用いられる意味を有する。 すなわち、 既知の物質である蛋白質 や核酸などをべィ ト（おとり）と呼び、 それと相互作用する物質である蛋白質や核 酸などをプレイ（獲物）と呼ぶ。 本発明では、 プレイは蛋白質であることが好まし い。  As used herein, the terms bait and prey have meanings commonly used in the art of analyzing interactions between substances. That is, proteins and nucleic acids that are known substances are called baits, and proteins and nucleic acids that interact with them are called prey. In the present invention, the play is preferably a protein.
ここで、 ベイ トとしては、 あらゆる蛋白質 （ペプチドを含む） 、 核酸、 抗体、 ホルモンなどのリガンド、 金属などの任意のものから構成される複合体が挙げら れ、 天然のものでも人工のもののいずれでも構わない。 ペイ トとしての分子量の 制限などは特にない。 たとえば蛋白質であれば、 機能ドメイン又は機能ドメイン を含む完全長蛋白質などが挙げられる。 プレイライプラリーを用いる場合は、 完 全長蛋白質とすることでより網羅的検出が可能となる。  Here, the bait includes a complex composed of any kind of ligand such as any protein (including peptide), nucleic acid, antibody, hormone, etc., and any one of natural and artificial. But it doesn't matter. There is no particular restriction on the molecular weight of the paste. For example, a protein includes a functional domain or a full-length protein containing a functional domain. In the case of using the preamplifier, more complete detection is possible by using the full-length protein.
また、 プレイとしては、 好ましくは、 蛋白質のライブラリーが用いられる。 プ レイとしての分子量の制限などは特にない。  As the play, a protein library is preferably used. There is no particular limitation on the molecular weight of the play.
本発明検出方法は、 好ましくは、 上述のように、 ペイ トとプレイとの間の相互 作用の検出において、 ペイトおよびプレイに特定の様式で検出用標識および分離 用修飾を行い、 そして、 無細胞共翻訳を行うことを主な特徴とするものである。 従って、 本発明検出方法の好ましい構成は、 ベイトおよびプレイに特定の様式で 検出用檫識および分離用修飾を行い、 そして、 無細胞共翻訳を行うことを除いて、 ペイ トとプレイとを接触させ、 接触により形成された複合体を検出することを含 む、 ペイ 卜とプレイとの間の相互作用の通常の検出方法と同様でよい。  The detection method of the present invention preferably comprises, as described above, performing detection labeling and separation modification in a specific manner on the pait and the prey in detecting the interaction between the pait and the prey, The main feature is to perform co-translation. Therefore, a preferred configuration of the detection method of the present invention provides for the contact between the bait and the prey except that the bait and the prey are subjected to detection recognition and separation modification in a specific manner, and cell-free cotranslation is performed. The method may be the same as the usual method for detecting the interaction between the pait and the play, including detecting the complex formed by the contact.
ペイトおよびプレイの分離用修飾および検出用標識は、 複合体の検出に適合し たものが適宜選択されるが、 無細胞共翻訳において、 ペイ トとプレイとが共に検 出用標識で標識されたり、 分離用修飾を受けたりしないように行われる必要があ る。 そのため、 プレイは、 検出用標識として使用できる蛋白質との融合蛋白質と されるか、 又は、 対応付け分子とされ、 それに応じて、 ベイトは分離用修飾を有 するものとされる。 As the modification and detection label for separation of the pate and prey, those suitable for complex detection are selected as appropriate, but in cell-free cotranslation, both pate and prey are detected. It must be done so that it is not labeled with a sign of entry or modified for separation. Therefore, the prey is a fusion protein with a protein that can be used as a detection label, or an assigning molecule, and accordingly, the bait has a modification for separation.
プレイが融合蛋白質とされる場合には、 ペイトは分離用修飾を有するようにす る。 ペイトが蛋白質である場合には、 ペイ トは、 分離用修飾として使用できる蛋 白質との融合蛋白質として、 無細胞翻訳系において、 ペイ トを含む融合蛋白質を コードする mR N Aの翻訳が行われることにより無細胞翻訳系に存在させること が好ましい。  If the prey is a fusion protein, the pate should have a separating modification. When the pate is a protein, the pate is used as a fusion protein with a protein that can be used as a modification for separation, and the mRNA encoding the pate-containing fusion protein is translated in a cell-free translation system. It is preferable that the protein be present in a cell-free translation system.
ベイ トが蛋白質の場合の分離用修飾の例としては、 蛋白質として、 GST蛋白質 や TAP法などに用いられている CBP (カルモジュリンビーズとの親和性により分離 可能）やプロテイン A( IgG-プロティン A親和性により分離可能 )、 親和性タグとし て、 各種の抗体タグなどとの融合蛋白質とすることが挙げられる。 ペイ ト自体が 分離用修飾として使用できる性質を有する場合には、 ペイ トをそのまま、 分離用 修飾を有するペイ トとして使用できる。 プレイの検出用修飾としては、 GFP (green fluorescent protein)などの蛍光蛋白質との融合蛋白質とすることが挙げられ る。  Examples of modification for separation when the bait is a protein include CST (separable by affinity with calmodulin beads) and protein A (IgG-protein A affinity) used for GST protein and TAP method etc. The affinity tag may be a fusion protein with various antibody tags. If the paste itself has a property that can be used as a modification for separation, it can be used as it is as a paste having the modification for separation. The modification for detection of prey includes a fusion protein with a fluorescent protein such as GFP (green fluorescent protein).
上記の融合蛋白質をコードする mR N Aの調製およびこの mRN Aの無細胞翻 訳系での翻訳は通常の方法に従って行うことができる。 mR NAは、 無細胞転写 翻訳系において、 D N Aの転写により生成するものであってもよい。  Preparation of mRNA encoding the above fusion protein and translation of this mRNA in a cell-free translation system can be carried out according to ordinary methods. mRNA may be produced by transcription of DNA in a cell-free transcription / translation system.
プレイが対応付け分子とされる場合には、 ペイトには任意の分離用修飾を施す ことができる。 ペイ トが蛋白質である場合には、 上述の分離用修飾の例が挙げら れる他、 ベイ トが核酸やドラッグなどの場合の分離用修飾の例としては、 ストレ れる。 ペイ ト自体が分離用修飾として使用できる性質を有する場合には、 ペイ ト をそのまま、 分離用修飾を有するペイ トとして使用できる。  If play is the assigning molecule, the pait may be modified for any separation. When the sheet is a protein, the above-mentioned examples of the modification for separation can be mentioned, and examples of the modification for separation when the bait is a nucleic acid, a drug or the like can be used. If the paste itself has a property that can be used as a modification for separation, it can be used as it is as a paste having the modification for separation.
対応付け分子とは、 表現型と遺伝子型と対応付ける分子を意味する。 対応付け 分子は、 通常には、 遺伝子型を反映する塩基配列を有する核酸を含む遺伝子型分 子と、 表現形の発現に関与する蛋白質を含む表現型分子とが結合してなる分子で ある。 この蛋白質としてプレイを用いることによりプレイを対応付け分子とする ことができる。 このような対応付け分子は、 無細胞翻訳系において、 プレイをコ ードする mRN Aの翻訳を、 翻訳されたプレイが該 mRN Aと会合するように行 うこと、 又は、 無細胞転写翻訳系において、 プレイをコードする DN Aの転写お よび翻訳を、 翻訳されたプレイが該 DN Aと会合するように行うことにより形成 することができる。 従って、 この製造の際に、 ペイ トを存在させることにより、 無細胞共翻訳を行うことができる。 すなわち、 下記 （1) 又は （2) により無細 胞共翻訳を行うことができる。 An assigning molecule means a molecule that associates a phenotype with a genotype. The assigning molecule is usually a molecule in which a genotype molecule containing a nucleic acid having a nucleotide sequence reflecting the genotype is combined with a phenotypic molecule containing a protein involved in phenotypic expression. is there. By using prey as this protein, prey can be used as an associating molecule. Such an assigning molecule is used in a cell-free translation system to perform translation of mRNA encoding play, such that the translated play associates with the mRNA, or a cell-free transcription / translation system. In the above, transcription and translation of the DNA encoding the play can be performed by performing the translated play in association with the DNA. Therefore, cell-free co-translation can be performed by the presence of a sheet during this production. That is, cell-free cotranslation can be performed by the following (1) or (2).
(1)無細胞翻訳系において、 前記べィ トの存在下で、 前記プレイをコードす る mRNAの翻訳を、 翻訳されたプレイが該 mRNAと会合するように行うこと により、 無細胞翻訳系にプレイを生成させて、 ペイ トとプレイとを接触させる。  (1) In the cell-free translation system, the translation of the mRNA encoding the prey is performed in the presence of the byte so that the translated prey is associated with the mRNA, whereby the cell-free translation system is obtained. The play is generated, and the pay comes into contact with the play.
(2)無細胞転写翻訳系において、 前記べィ トの存在下で、 前記プレイをコー ドする DN Aの転写および翻訳を、 翻訳されたプレイが該 DN Aと会合するよう に行うことにより、 無細胞転写翻訳系にプレイを生成させて、 ベイ トとプレイと を接触させる。  (2) In a cell-free transcription / translation system, in the presence of the byte, transcription and translation of the DNA encoding the prey are performed so that the translated prey is associated with the DNA. The prey is generated by the cell-free transcription / translation system, and the bait and the prey are brought into contact.
以下、 上記 （1) および （2) の態様について説明する。  Hereinafter, the embodiments (1) and (2) will be described.
(1) の態様では、 mRNAが、 その 3'末端に結合したスぺ一サ.一領域と、 ス ぺーサ一領域に結合した、 ぺプチド転移反応によってぺプチドと結合し得る基を 含むぺプチドアクセプ夕一領域とを有することにより、 翻訳されたプレイが該 m RN Aと会合することが好ましい。 このような対応付け分子を用いる相互作用の 検出方法としては、 in vitroウィルス方法が挙げられる。  In the embodiment of (1), the mRNA comprises a spacer bound to its 3 ′ end and a region bound to the spacer and bound to the peptide by a peptide transfer reaction. It is preferred that the translated play associates with the mRNA by having a peptide accept region. Examples of a method for detecting an interaction using such an assigning molecule include an in vitro virus method.
mRN Aは、 好ましくは、 転写プロモーターおよび翻訳ェンハンサ一を含む 5' 非翻訳領域と、 5'非翻訳領域の 3'側に結合した、 プレイをコードする 0RF領域と、 0RF領域の 3'側に結合した、 ポリ A配列を含む 3'末端領域を含む核酸である。 好ま しくは、 ポリ A配列の 5，側に、 S匪 S (Sは G又は C)配列を含む発現増幅配列 （例え ば制限酵素 Xholが認識する配列） が更に含まれる。 5'末端に Cap構造があっても なくても良い。  The mRNA preferably comprises a 5 'untranslated region containing a transcription promoter and a translation enhancer, a play-encoding 0RF region linked to the 3' side of the 5 'untranslated region, and a 3' side of the 0RF region. A nucleic acid comprising a bound 3 'terminal region comprising a poly A sequence. Preferably, on the fifth side of the poly A sequence, an expression amplification sequence containing a S-band S (S is G or C) sequence (for example, a sequence recognized by the restriction enzyme Xhol) is further included. The 5 'end may or may not have a Cap structure.
ポリ A配列は、 少なくとも 2残基以上の dAおよび/又は rAの混合あるいは単一の ポリ Α連続鎖であり、 好ましくは、 3残基以上、 より好ましくは 6以上、 さらに好 ましくは 8残基以上のポリ A連続鎖である。 The poly A sequence is a mixture of dA and / or rA of at least 2 residues or more, or a single polycontinuous chain, preferably 3 or more residues, more preferably 6 or more, and still more preferably. Preferably, it is a poly-A continuous chain of 8 residues or more.
翻訳効率に影響する要素としては、 転写プロモ一夕一と翻訳ェンハンサ一から なる 5' UTR、 および、 ポリ A配列を含む 3'末端領域の組み合わせがある。 3'末端領 域のポリ A配列の効果は通常には 10残基以下で発揮される。 5' UTRの転写プロモ一 夕一は T7/T3又は SP6などが利用でき、 特に制限はない。 好ましくは SP6であり、 特に、 翻訳のェンハンサー配列としてオメガ配列やオメガ配列の一部を含む配列 を利用する場合は SP6を用いることが特に好ましい。 翻訳ェンハンサ一は好まし くはオメガ配列の一部であり、 オメガ配列の一部としては、 TMVのオメガ配列の 一部（029; Gallie D.R., Walbot V. (1992) Nucleic Acids Res., vol. 20, 4631-4638、 お よび、 WO 02/48347の図 3参照）を含んだものが好ましい。  Factors affecting translation efficiency include a combination of a 5 'UTR consisting of a transcription promoter and a translation enhancer, and a 3' end region containing a polyA sequence. The effect of the poly A sequence in the 3 'terminal region is usually exerted with 10 residues or less. For the 5 'UTR transcription promoter, T7 / T3 or SP6 can be used, and there is no particular limitation. SP6 is preferred, and SP6 is particularly preferred when an omega sequence or a sequence containing a part of an omega sequence is used as the enhancer sequence for translation. The translation enhancer is preferably a part of the omega sequence, and a part of the omega sequence includes a part of the omega sequence of TMV (029; Gallie DR, Walbot V. (1992) Nucleic Acids Res., Vol. 20, 4631-4638, and FIG. 3 of WO 02/48347).
また、 翻訳効率に関し、 35末端領域においては、 Xhol配列とポリ A配列の組み 合わせが好ましい。 さらに、 0RF領域の下流部分、 すなわち Xhol配列の上流に親 和性夕グがついたものとポリ A配列の組み合わせが好ましい。 親和性夕グ配列と しては、 抗原抗体反応など、 タンパク質を検出できるいかなる手段を用いるため の配列であればよく、 制限はない。 好ましくは、 抗原抗体反応によるァフィニテ ィ一分離分析用タグである Flag- tag配列又は His-tag配列である。 ポリ A配列効果 としては、 Flag- tag等の親和性夕グに Xhol配列がついたものとそこへさらにポリ A配列がついたものの翻訳効率が上昇する。 ここで、 His-tagについては、 Xhol配 列のない構成でも十分な翻訳効率を示し、 有効である。 Also relates to translation efficiency, 3 in the 5-terminal region, is preferably a combination of Xhol sequences and poly A sequences. Further, a combination of a polyA sequence with a downstream portion of the 0RF region, that is, a sequence having a affinity flag upstream of the Xhol sequence is preferable. The affinity sequence is not limited as long as it is a sequence for using any means capable of detecting a protein such as an antigen-antibody reaction. Preferably, it is a Flag-tag sequence or His-tag sequence which is a tag for affinity separation analysis by antigen-antibody reaction. Regarding the effect of the poly A sequence, the translation efficiency increases when the Xhol sequence is added to the affinity tag such as the Flag-tag and when the poly A sequence is further added thereto. Here, with regard to His-tag, a configuration without the Xhol sequence shows sufficient translation efficiency and is effective.
上記の翻訳効率に関し効果のある構成は、 対応付け効率にも有効である。  The configuration effective for the translation efficiency described above is also effective for the association efficiency.
5' UTRを SP6+029とし、 33末端領域を、 たとえば、 ？1& + 1101+ 11(11ニ8)又は^3+ An (n=8)とすることで、 各長さは、 5' UTRで約 49bp、 3'末端領域で約 38bp又は約 26 bpであり、 PCRのプライマ一にアダプタ一領域として組み込める長さである。 こ のため、 あらゆるベクターやプラスミ ドや cDNAライブラリ一から PCRによって、 5 ' UTRと 3'末端領域をもったコード領域を簡単に作成できる。 コ一ド領域において、 翻訳は 0RF領域を超えてされてもよい。 すなわち、 0RF領域の末端に終止コドンが なくてもよい。 The 5 'UTR and SP6 + 029, the 3 3-terminal regions, e.g.,? By setting 1 & + 1101 + 11 (11 d 8) or ^ 3 + A n (n = 8), each length is about 49 bp in the 5 'UTR, about 38 bp or about 26 bp in the 3' terminal region. There is a length that can be incorporated as an adapter region into a PCR primer. This makes it easy to create a coding region with a 5 'UTR and 3' terminal region by PCR from any vector, plasmid or cDNA library. In the code region, translation may be done beyond the 0RF region. That is, a termination codon may not be present at the end of the 0RF region.
ぺプチドアクセプ夕一領域は、 ぺプチドの C末端に結合できるものであれば特 に限定されないが、 例えば、 ピューロマイシン、 3，- N-アミノアシルビユ一ロマ ィシンアミノヌクレオシド (3， -N-Aminoacylpuromycin aminonucleoside, PANS - アミノ酸） 、 例えばァミノ酸部がグリシンの PANS- Gly、 ノ リンの PANS-Val、 ァラ ニンの PANS- Ala、 その他、 全アミノ酸に対応する PANS-全アミノ酸が利用できる。 また、 化学結合として 3' -アミノアデノシンのァミノ基とアミノ酸のカルボキシ ル基が脱水縮合した結果形成されたアミ ド結合でつながった 3' -N-アミノアシル ァテノシンアミノヌクレオシド ' -Aminoacyiaaenosine aminonucleoside, AAN S -アミノ酸） 、 例えばアミノ酸部がグリシンの AA S- Gly、 バリンの AA S- Val、 ァ ラニンの AANS- Ala、 その他、 全アミノ酸に対応する NS-全アミノ酸が利用でき る。 また、 ヌクレオシド又はヌクレオシドとアミノ酸のエステル結合したものな ども利用できる。 その他、 ヌクレオシド又はヌクレオシドに類似した化学構造骨 格を有する物質と、 アミノ酸又はアミノ酸に類似した化学構造骨格を有する物質 を化学的に結合可能な結合様式のものなら全て利用することができる。 The peptide acceptor region is not particularly limited as long as it can bind to the C-terminus of the peptide. For example, puromycin, 3, -N-aminoacylvinyl Glycine aminonucleosides (3, -N-Aminoacylpuromycin aminonucleoside, PANS-amino acids), such as PANS-Gly for glycine, PANS-Val for norin, PANS-Ala for alanine, and all other amino acids PANS-all amino acids are available. In addition, 3'-N-aminoacyl atenosine aminonucleoside '-Aminoacyiaaenosine aminonucleoside, AAN S, which is linked by an amide bond formed as a result of dehydration condensation of the amino group of 3'-aminoadenosine and the carboxyl group of amino acid as a chemical bond. -For example, AAS-Gly of glycine, AAS-Val of valine, AANS-Ala of alanine, and other NS-all amino acids corresponding to all amino acids can be used. In addition, nucleosides or those in which a nucleoside and an amino acid are ester-bonded can be used. In addition, any of the bonding forms capable of chemically bonding a nucleoside or a substance having a chemical structural skeleton similar to a nucleoside and a substance having an amino acid or a chemical structural skeleton similar to an amino acid can be used.
ペプチドァクセプ夕ー領域は、 好ましくは、 ピューロマイシンもしくはその誘 導体、 又は、 ピューロマイシンもしくはその誘導体と 1残基もしくは 2残基のデ ォキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドからなることが好ましい。 こ こで、 誘導体とはタンパク質翻訳系においてべプチドの C末端に結合できる誘導 体を意味する。 ピューロマイシン誘導体は、 ピューロマイシン構造を完全に有し ているものに限られず、 ピュー口マイシン構造の一部が欠落しているものも包含 する。 ピューロマイシン誘導体の具体例としては、 PANS-アミノ酸、 MNS-ァミノ 酸などが挙げられる。  The peptide receptor region preferably comprises puromycin or a derivative thereof, or puromycin or a derivative thereof and one or two residues of deoxyribonucleotides or ribonucleotides. Here, a derivative means an inducer capable of binding to the C-terminus of a peptide in a protein translation system. Puromycin derivatives are not limited to those having a complete puromycin structure, but also include those in which a portion of the puromycin structure is missing. Specific examples of puromycin derivatives include PANS-amino acids, MNS-amino acids and the like.
ぺプチドアクセプ夕一領域は、 ピュー口マイシンのみの構成でもかまわないが、 5'側に 1残基以上の DNAおよび/又は RNAからなる塩基配列を持つことが好ましい。 配列としては、 dC-ピューロマイシン， rC-ピューロマイシンなど、 より好ましく は dCdC -ピューロマイシン， rCrC -ピューロマイシン， MC-ピュ一ロマイシン， d CrC-ピュー口マイシンなどの配列で、 ァミノァシル - tRNAの 3，末端を模倣した CCA 配列 (Philipps, G.R. (1969) Nature 223, 3フ4-377)が適当である。 塩基の種類としては、 C>(U又は T)>G>Aの順で好ましい。 . The peptide acceptor region may be composed of pure mouth mycin alone, but preferably has a nucleotide sequence of one or more residues of DNA and / or RNA on the 5 ′ side. The sequence may be dC-puromycin, rC-puromycin, or the like, more preferably dCdC-puromycin, rCrC-puromycin, MC-puromycin, dCrC-puromycin, or the like. , CCA sequence mimicking end (Philipps, GR (1969) Nature 223, 3 full 4 3 77) are suitable. The type of base is preferably in the order of C> (U or T)>G> A. .
スぺ—サ—領域は、 好ましくは、 ポリエチレングリコールを主成分とした PEG 領域である。 スぺ一サー領域は、 通常には、 PEG領域の他に、 核酸の 33末端に結 合できるドナー領域を含む。 The spacer region is preferably a PEG region containing polyethylene glycol as a main component. Scan Bae one server region is usually sintered in addition to, 3 3 terminus of the nucleic acid of the PEG region Includes donor regions that can be combined.
核酸の 3'末端に結合できるドナ一領域は、 通常、 1以上のヌクレオチドからな る。 ヌクレオチドの数は、 通常には 1〜1 5、 好ましくは 1〜2である。 ヌクレ ォチドはリボヌクレオチドでもデォキシリボヌクレオチドでもよい。 ドナ一領域 は修飾物質を有していてもよい。  The donor region that can bind to the 3 'end of a nucleic acid usually consists of one or more nucleotides. The number of nucleotides is usually 1-15, preferably 1-2. The nucleotide may be a ribonucleotide or a deoxyribonucleotide. The donor region may have a modifier.
ドナ一領域の 5，末端の配列は、 プレイをコードするコード領域とのライゲ一シ ョン効率を左右する。 コ一ド領域とスぺーサ一領域をライゲ一シヨンさせるため には、 少なくとも 1残基以上を含むことが必要であり、 ポリ A配列をもつァクセプ 夕一に対しては、 少なくとも 1残基の dC (デォキシシチジル酸）又は 2残基の dCdC (ジデォキシシチジル酸）が好ましい。 塩基の種類としては、 C>(U又は T)>G>Aの順 で好ましい。  The sequence at the 5 'end of the donor region determines the efficiency of ligation with the coding region encoding play. In order to ligate the coding region and the spacer region, it is necessary to include at least one residue or more, and for an amino acid having a poly A sequence to have at least one residue. Preferred is dC (doxycytidylic acid) or dCdC (dideoxycytidylic acid) having two residues. The type of base is preferably in the order of C> (U or T)> G> A.
PEG領域はポリエチレングリコールを主成分とするものである。 ここで、 主成 分とするとは、 PEG領域に含まれるヌクレオチドの数の合計が 20 bp以下、 又は、 ポリエチレングリコールの平均分子量が 400以上であることを意味する。 好まし くは、 ヌクレオチドの合計の数が 10 bp以下、 又は、 ポリエチレングリコールの 平均分子量が 1000以上であることを意味する。  The PEG region is mainly composed of polyethylene glycol. Here, the term “main component” means that the total number of nucleotides contained in the PEG region is 20 bp or less, or the average molecular weight of polyethylene glycol is 400 or more. Preferably, it means that the total number of nucleotides is 10 bp or less, or the average molecular weight of polyethylene glycol is 1000 or more.
PEG領域のポリエチレングリコールの平均分子量は、 通常には、 400〜30, 000、 好ましくは1，000〜10, 000、 より好ましくは 2，000〜8, 000である。 ここで、 ポリ エチレングリコールの分子量が約 400より低いと、 このスぺーサ一領域を含む遺 伝子型分子を対応付け翻訳したときに、 対応付け翻訳の後処理が必要となること があるが (Liu, R" Barrick, E" Szostak, J.W., Roberts, R.W. (2000) Methods in Enzyraology, vol. 318, 268-293)、 分子量 1000以上、 より好ましくは 2000以上の PEG を用いると、 対応付け翻訳のみで高効率の対応付けができるため、 翻訳の後処理 が必要なくなる。 また、 ポリエチレングリコールの分子量が増えると、 遺伝子型 分子の安定性が増す傾向があり、 特に分子量 1000以上で良好であり、 分子量 400 以下では DNAスぺーサ一と性質がそれほどかわらず不安定となることがある。 ポリエチレングリコ一ルを主成分とするスぺーサ一領域を有することによって、 対応付け分子がゥサギ網状赤血球のみならず小麦胚芽の無細胞翻訳系でも形成可 能となり、 両翻訳系での遺伝子型分子の安定性が飛躍的に向上し、 翻訳後の処理 を施すことが不要となる。 The average molecular weight of the polyethylene glycol in the PEG region is usually from 400 to 30,000, preferably from 1,000 to 10,000, more preferably from 2,000 to 8,000. Here, if the molecular weight of polyethylene glycol is lower than about 400, post-processing of the mapping translation may be required when the gene-type molecule containing this spacer region is translated by mapping. (Liu, R "Barrick, E" Szostak, JW, Roberts, RW (2000) Methods in Enzyraology, vol. 318, 268-293), using a PEG with a molecular weight of 1000 or more, more preferably 2000 or more, associative translation Since high-efficiency association can be performed only by using a translation, post-translation processing is not required. Also, as the molecular weight of polyethylene glycol increases, the stability of genotype molecules tends to increase, especially when the molecular weight is 1000 or more, and when the molecular weight is 400 or less, the properties are not so similar to DNA spacers and become unstable. Sometimes. By having a spacer region mainly composed of polyethylene glycol, the assigning molecules can be formed not only in the reticulocytes of the egret but also in the cell-free translation system of wheat germ, and the genotype molecules in both translation systems Dramatically improved stability and post-translation processing Is unnecessary.
( 2 ) の態様では、 D NAが、 蛋白質とストレプトアビジン又はアビジンとの 融合蛋白質をコードし、 D N Aがビォチンにより標識され、 D N A—分子がエマ ルジョンの一区画に含まれる状態で転写および翻訳が行われることにより、 翻訳 されたプレイが該 D N Aと会合することが好ましい。 このような対応付け分子を 用いる相互作用の検出方法としては、 STABLE法が挙げられる。  In the embodiment (2), the DNA encodes a fusion protein of the protein and streptavidin or avidin, the DNA is labeled with biotin, and transcription and translation are performed in a state where the DNA molecule is included in one section of the emulsion. It is preferred that the translated play be associated with the DNA by performing. As a method for detecting an interaction using such an assigning molecule, a STABLE method can be mentioned.
ェマルジヨンは、 通常には、 2種の界面活性剤およびミネラルオイルと、 無細 胞転写翻訳系の反応液を混合して形成される W/0型のェマルジヨンである。 W/0型 のェマルジョンを形成するには、 通常には、 界面活性剤の HLB(hydrophile-lipophile balance)値が 3. 5〜 6である必要がある。 2種の界面活性剤を混合した場合の HLB 値は、 個々の界面活性剤の HLB値から簡単な計算式で求められる。 例えば、 Span 85(HLB=1.8および Tween 80(HLB=15.0)を、 それそれ 40.2〃 1および 9.8〃 1の割合 で混合することにより となる。 界面活性剤とミネラルオイルの割合は、 通常 1 ： 1 8 (容量比） である。 また、 反応液の割合はェマルジヨン全体に対し て 1〜5 0 % (容量比） であり、 通常は 5 %である。 界面活性剤とミネラルオイ ルの混合物に、 撹袢しながら、 低温で、 反応液をいくつかに分けて添加し、 混合 することによりェマルジヨンを形成することができる。 転写および翻訳の反応は、 ェマルジョンの温度を上げることにより、 開始させることができる。  The emulsion is usually a W / 0 type emulsion formed by mixing two kinds of surfactants and mineral oil with a reaction solution of a cell-free transcription / translation system. To form a W / 0 emulsion, the surfactant usually needs to have an HLB (hydrophile-lipophile balance) value of 3.5 to 6. The HLB value when two types of surfactants are mixed can be calculated from the HLB values of individual surfactants using a simple formula. For example, by mixing Span 85 (HLB = 1.8 and Tween 80 (HLB = 15.0) in proportions of 40.2〃1 and 9.8〃1, respectively. The ratio of surfactant to mineral oil is usually 1: The ratio of the reaction solution is 1 to 50% (volume ratio), usually 5%, based on the whole emulsion, and it is usually 5% in the mixture of surfactant and mineral oil. While stirring, the reaction solution can be divided into several portions at a low temperature and mixed to form an emulsion.The transcription and translation reactions can be started by raising the temperature of the emulsion. Can be.
プレイをコードする D N Aの調製およびこの D N Aの無細胞転写翻訳系での転 写および翻訳は通常の方法に従って行うことができる。  Preparation of DNA encoding prey and transcription and translation of the DNA in a cell-free transcription / translation system can be performed according to a conventional method.
上述のように、 ペイ トおよびプレイに特定の様式で検出用標識および分離用修 飾を行うことにより、 無細胞共翻訳により形成された複合体を特異的に検出する ことができる。  As described above, the complex formed by cell-free cotranslation can be specifically detected by performing the labeling for detection and the modification for separation in a specific manner on the pait and play.
ペイ トとプレイの無細胞共翻訳において、 無細胞共翻訳を行う無細胞翻訳系 (無細胞転写翻訳系を含む） については、 大腸菌 E. coli、 ゥサギ網状赤血球、 小麦胚芽の系などいずれでも構わない。 in vitroウィルス法では、 対応付け分子 の形成は、 大腸菌 E. coliではかなり不安定であるが、 ゥサギ網状赤血球の系 (Neraoto N, Miyamoto-Sato E, Yanagawa H. (1997) FEBS Lett. 414, 405; Roberts R.W, Szostak J.W. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 12297)では安定であることが確認 Z7 In the cell-free co-translation of pait and prey, the cell-free translation system that performs cell-free co-translation (including the cell-free transcription / translation system) may be any of E. coli, Egret reticulocyte, wheat germ, etc. Absent. In the in vitro virus method, the formation of the assigning molecule is quite unstable in E. coli E. coli, but in the heron reticulocyte system (Neraoto N, Miyamoto-Sato E, Yanagawa H. (1997) FEBS Lett. 414, 405; Roberts RW, Szostak JW (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 1 229 7) Z7
されており、 さらに小麦胚芽の系（特開 2002-176987)ではより安定であることが 確認されている。 STABLE法では、 大腸菌 E. coli、 ゥサギ網状赤血球、 小麦胚芽 の系などいずれでも構わない。 Furthermore, it has been confirmed that the wheat germ system (JP-A-2002-176987) is more stable. In the STABLE method, any of E. coli, Egret reticulocytes, and wheat germ lines may be used.
無細胞共翻訳における翻訳又は転写および翻訳の条件は、 用いる無細胞翻訳系 に応じて適宜選択される。  The conditions for translation or transcription and translation in cell-free cotranslation are appropriately selected depending on the cell-free translation system used.
無細胞翻訳系に添加するべィ 卜とプレイのテンプレートは、 無細胞翻訳系が転 写も生じる無細胞転写翻訳系であれば、 RNAおよび DNAのどちらでも構わない。 以下、 ペイ トとして用いるのに好ましい翻訳テンプレートの例について説明す る。  The vector and prey template to be added to the cell-free translation system may be either RNA or DNA as long as the cell-free translation system also produces transcription. Hereinafter, an example of a translation template that is preferable to use as a paste will be described.
本態様の共翻訳スクリーニングにおけるベイ トとして、 図 6に示すように、 蛋 白質に翻訳される情報を持つコード部と PEGスぺ一サ一部からなることを特徴と する翻訳テンプレートを利用する。 コード部は、 蛋白質に翻訳される情報であり、 どのような配列でも良いが、 好ましくは、 コード部の 3'末端領域にァクセプ夕一 As a bait in the co-translation screening of this embodiment, as shown in FIG. 6, a translation template characterized by comprising a coding part having information to be translated into a protein and a part of a PEG spacer is used. The coding section is information to be translated into a protein, and may have any sequence. Preferably, the coding section is located at the 3 'end region of the coding section.
(A配列）を持つ、 あるいは、 コード部の 3'末端領域にァクセプ夕一 (A配列）を持 ち、 かつ A配列の 5'上流に翻訳増幅配列 （X配列） を持つことを特徴とする。 コ一 ド部の A配列として、 短いポリ A配列を含む。 短いポリ A配列とは、 通常には 2〜 1 0塩基の Aからなる配列である。 X配列として、 (C又は G)NN(C又は G)配列を有す る配列、 たとえば、 Xhol配列を有することを特¾¾とする。 PEGスぺ一サ一部は、 ポリエチレングリコールを主成分とした PEG領域、 コ一ド部と連結するためのド ナー領域、 および 3，末端に CCA領域を持つ。 PEGスぺ一サ一部は、 ドナ一領域のみ、 CCA領域のみでもかまわないが、 好ましくは、 ポリエチレングリコールを主成分 とした PEG領域を含む構成をとる。 CCA領域は、 該翻訳テンプレートによって翻訳 された蛋白質と、 ぺプチド転移反応によって結合する機能を有しないことを特徴 とする。 PEG領域のポリエチレングリコールの分子量は、 500以上であることを特 徴とする。 また、 ドナ一領域および/又は CCA領域において、 少なくとも 1つの機 能付与ュニヅト（F )を含むことを特徴とする。 機能付与ュニヅト（F 1あるいは/か つ F 2 )が、 該翻訳テンプレートおよび/又は該翻訳テンプレートから翻訳された 蛋白質を固定化又は蛍光ラベル化することを特徴とする。 固定化物質としてビォ チンなどが考えられ、 蛍光性物質として、 Fluorescein, Cy5, 又はローダミング リーン（RhG)などが考えられる。 これらのコード部や翻訳テンプレート、 および そのライプラリー、 さらに、 リボソーム上で翻訳された蛋白質やそのライブラリ 一に関するものである。 (A sequence), or has an Axceptor (A sequence) in the 3 'terminal region of the coding region and a translation amplification sequence (X sequence) 5' upstream of the A sequence. . A short A sequence is included in the A sequence of the code part. A short poly A sequence is a sequence consisting of A, usually 2 to 10 bases. The X array has a (C or G) NN (C or G) sequence, for example, an Xhol sequence. Some PEG sensors have a PEG region containing polyethylene glycol as the main component, a donor region for linking to the code portion, and a CCA region at the terminal. A part of the PEG spacer may be only a donor region or a CCA region, but preferably has a configuration including a PEG region containing polyethylene glycol as a main component. The CCA region is characterized in that it has no function of binding to a protein translated by the translation template by a peptide transfer reaction. The molecular weight of polyethylene glycol in the PEG region is 500 or more. In the donor area and / or the CCA area, at least one function providing unit (F) is included. The function imparting unit (F1 and / or F2) immobilizes or fluorescently labels the translation template and / or a protein translated from the translation template. Biotin can be considered as the immobilizing substance, and Fluorescein, Cy5, or rhodhaming as the fluorescent substance Lean (RhG) can be considered. It relates to these coding parts, translation templates, their libraries, and proteins and their libraries translated on ribosomes.
ペイ トの翻訳テンプレート（図 6の A )は、 コード分子（図 6の B )に由来するコ ―ド部と PEGスぺーサ一分子（図 6の C )に由来する PEGスぺ一サ一部からなる。 本 態様では、 基本的にはコード部の配列によらず、 コード部に PEGスぺーサ一部を 連結（ライゲーシヨン）することでその安定性が向上して翻訳効率を向上出来る。 しかしながら、 さらにコード部の構成や PEGスぺーサ一部の種類によって、 その 翻訳効率をより向上させることが可能である。 以下にその詳細を記載する。  The translation template of the sheet (A in Fig. 6) is composed of the code part derived from the coding molecule (B in Fig. 6) and the PEG spacer derived from one PEG spacer molecule (C in Fig. 6). Department. In this embodiment, the stability is improved and the translation efficiency can be improved by connecting (ligating) a part of the PEG spacer to the code part regardless of the sequence of the code part. However, the translation efficiency can be further improved depending on the configuration of the code part and the type of the PEG spacer. The details are described below.
本態様のコード部（図 6の B )は、 5'末端領域、 0RF領域、 3'末端領域からなり、 5，末端に Cap構造があってもなくても良い。 また、 コード部の配列には特に制限 はなく、 あらゆるベクタ一やプラスミ ドに組み込まれたものとしての利用が考え られる。 また、 コード部の 3'末端領域は、 A配列としてポリ Ax 8配列、 又は X配列 として Xhol配列や 4塩基以上で SNNS( Sは G又は C )の配列を持つもの、 および A配列 と X配列の組み合わせとしての XA配列がある。 A配列、 X配列、 又は XA配列の上流 に親和性タグ配列として Flag- tag配列、 からなる構成が考えられる。 ここで、 親 和性夕グ配列としては HA- tagや IgGのプロテイン A( zドメイン）などの抗原抗体反 応を利用したものや His- tagなど、 蛋白質を検出又は精製できるいかなる手段を 用いるための配列でもかまわない。 ここで、 翻訳効率に影響する範囲としては、 XA配列の組み合わせが重要であり、 X配列のなかで、 最初の 4塩基が重要であり、 SNNSの配列を持つものが好ましい。 また、 5，末端領域は、 転写プロモーターと翻 訳ェンハンサ一からなり、 転写プロモー夕一は T7/T3又は SP6などが利用でき、 特 に制限はないが、 小麦の無細胞翻訳系では、 翻訳のェンハンサー配列としてオメ ガ配列やオメガ配列の一部を含む配列を利用することが好ましく、 プロモー夕一 としては、 SP6を用いることが好ましい。 翻訳ェンハンサ一のオメガ配列の一部 (029 )は、 TMVのオメガ配列の一部を含んだものである（Gallie D.R., Walbot V. (1992) Nucleic Acids Res., vol. 20, 4631-4638、 および、 WO 02/48347の図 3参照）。 コード部の 0RF領域については、 DNAおよび/又は RNAからなるいかなる配列でもよ い。 遺伝子配列、 ェキソン配列、 イントロン配列、 ランダム配列、 あるいは、 い かなる自然界の配列、 人為的配列が可能であり、 配列の制限はない。 The coding portion (B in FIG. 6) of this embodiment is composed of a 5 ′ terminal region, an 0RF region, and a 3 ′ terminal region, and may or may not have a Cap structure at the 5, terminal. There is no particular restriction on the sequence of the code part, and it can be used as being incorporated into any vector or plasmid. In addition, the 3 'terminal region of the coding region is a poly Ax 8 sequence as an A sequence, an Xhol sequence as an X sequence, a sequence having SNNS (S is G or C) with 4 or more bases, and an A sequence and an X sequence There is an XA array as a combination of A configuration comprising a Flag-tag sequence as an affinity tag sequence upstream of the A sequence, X sequence, or XA sequence is considered. Here, as the affinity sequence, any means that can detect or purify proteins, such as those utilizing an antigen-antibody reaction such as HA-tag or IgG protein A (z domain) or His-tag, are used. May be an array. Here, as a range that affects the translation efficiency, the combination of XA sequences is important. Among the X sequences, the first four bases are important, and those having an SNNS sequence are preferable. The terminal region consists of a transcription promoter and a translation enhancer. The transcription promoter can use T7 / T3 or SP6, etc., and there is no particular limitation. It is preferable to use a sequence containing a part of the omega sequence or the omega sequence as the enhancer sequence, and it is preferable to use SP6 as the promoter. A part of the omega sequence of translation enhancer (029) contains a part of the omega sequence of TMV (Gallie DR, Walbot V. (1992) Nucleic Acids Res., Vol. 20, 4631-4638, And FIG. 3 of WO 02/48347). The 0RF region of the coding part may be any sequence consisting of DNA and / or RNA. Gene sequence, exon sequence, intron sequence, random sequence, or Such natural arrangements and artificial arrangements are possible, and there is no restriction on the arrangement.
本態様の PEGスぺ一サー分子（図 6の C )は、 CCA領域、 PEG領域、 ドナー領域か らなる。 最低限必要な構成は、 ドナー領域である。 翻訳効率に影響する範囲とし ては、 ドナー領域のみならず PEG領域を持つものが好ましく、 さらにアミノ酸と の結合能力のないピュー口マイシンを持つことが好ましい。 PEG領域のポリェチ レングリコールの分子量の範囲は、 400〜30，000で、 好ましくは 1， 000〜； 10, 000、 より好ましくは 2，000〜6, 000である。 また、 CCA領域にはピューロマイシンを含 む構成と含まない構成が可能であり、 ビューロマイシンについては、 ピューロマ イシン （Puromycin) 、 3， アミノアシルビユ一ロマイシンアミノヌクレオシド (3' -N-Aminoacylpuromycin aminonucleoside, PANS-アミノ酸) 、 例えばァミノ 酸部がグリシンの PANS-Gly、 ノ リンの PANS- Val、 ァラニンの PANS- Ala、 その他、 全アミノ酸に対応する PANS-全アミノ酸が利用できる。 また、 化学結合として 3' - アミノアデノシンのァミノ基とアミノ酸のカルボキシル基が脱水縮合した結果形 成されたアミ ド結合でつながった 3，- N-アミノアシルアデノシンアミノヌクレオ シド (3，- Aminoacyladenosine aminonucleoside, MNS -アミノ酸) 、 例えばアミ ノ酸部がグリシンの AA S- Gly、 ノ リンの AANS- Val、 ァラニンの AA S-Ala、 その他、 全アミノ酸に対応する AANS-全アミノ酸が利用できる。 また、 ヌクレオシド又は ヌクレオシドとアミノ酸のエステル結合したものなども利用できる。 その他、 ヌ クレオシド又はヌクレオシドに類似した化学構造骨格を有する物質と、 アミノ酸 又はアミノ酸に類似した化学構造骨格を有する物質を化学的に結合可能な結合様 式のものなら全て利用することができる。 本翻訳テンプレートでは、 以上のピュ 一口マイシン誘導体のァミノ基がアミノ酸と結合する能力を欠いたあらゆる物質、 およびピューロマイシンを欠いた CCA領域も考えられるが、 リボソーム上で蛋白 質と結合不能なピューロマイシンを含むことで、 より翻訳効率を高められる。 そ の理由は定かではないが、 蛋白質と結合不能なピューロマイシンがリボソームを 刺激することでターンオーバーが促進される可能性がある。 CCA領域（CCA)の 5' 側に 1残基以上の DNAおよび/又は Aからなる塩基配列を持つことが好ましい。 塩 基の種類としては、 C>(U又は T)>G>Aの順で好ましい。 配列としては、 dC-ビュー ロマイシン， rC-ピューロマイシンなど、 より好ましくは dCdC-ピュ一ロマイシン， rCrC-ピューロマイシン， rCdC-ピュ一ロマイシン， dCrC-ピューロマイシンなど の配列で、 アミノアシル- tRNAの 3，末端を模倣した CCA配列 (Philipps G.R. (1969) Nature 223, 374-377)が適当である。 本発明の一態様では、 これらのピュー口マイ シンが何らかの方法でアミノ酸と結合不可能となっている。 The PEG spacer molecule (C in FIG. 6) of this embodiment is composed of a CCA region, a PEG region, and a donor region. The minimum required configuration is the donor region. As a range that affects the translation efficiency, one having not only a donor region but also a PEG region is preferable, and further, it is preferable to have pure mouth mycin having no binding ability to amino acids. The molecular weight range of the polyethylene glycol in the PEG region is from 400 to 30,000, preferably from 1,000 to; 10,000, more preferably from 2,000 to 6,000. The CCA region can be configured with or without puromycin. For buromycin, puromycin, 3, aminoacylbiulomycin aminonucleoside (3'-N-Aminoacylpuromycin aminonucleoside, For example, PANS-Gly of glycine, PANS-Val of norin, PANS-Ala of alanine, and other PANS-amino acids corresponding to all amino acids can be used. In addition, 3, -N-aminoacyladenosine aminonucleoside (3, -Aminoacyladenosine aminonucleoside, which is linked by an amide bond formed as a result of dehydration condensation of an amino group of 3'-aminoadenosine and a carboxyl group of an amino acid as a chemical bond. MNS-amino acids), for example, AANS-Gly of glycine, AANS-Val of norin, AAS-Ala of alanine, and other AANS-amino acids corresponding to all amino acids can be used. Further, nucleosides or those in which a nucleoside and an amino acid are ester-bonded can also be used. In addition, any bonding type that can chemically bond a nucleoside or a substance having a chemical structure skeleton similar to a nucleoside and an amino acid or a substance having a chemical structure skeleton similar to an amino acid can be used. In this translation template, any substance that lacks the ability of the amino group of the above-mentioned pure bitemycin to bind to an amino acid, and a CCA region that lacks puromycin can be considered, but puromycin that cannot bind to proteins on the ribosome is considered. By including, the translation efficiency can be further improved. The reason is unclear, but puromycin, which cannot bind to proteins, may stimulate turnover by stimulating ribosomes. It is preferable to have a base sequence consisting of DNA and / or A of one or more residues on the 5 'side of the CCA region (CCA). The type of the base is preferred in the order of C> (U or T)>G> A. As the sequence, dC-buromycin, rC-puromycin and the like, more preferably dCdC-puromycin, A CCA sequence (Philipps GR (1969) Nature 223, 374-377) that mimics the 3, terminal of aminoacyl-tRNA with sequences such as rCrC-puromycin, rCdC-puromycin, dCrC-puromycin is appropriate. In one embodiment of the present invention, these pure mouth mycins are unable to bind to amino acids in any way.
本態様の PEGスぺーサ一部は修飾物質 (F 1および/又は F 2 )を有する構成が可能 である。 このことによって、 翻訳テンプレートを回収、 精製による再利用、 又は 固定化などのためのタグとして利用することが出来る。 少なくとも 1残基の DNAお よび/又は RNAの塩基に修飾物質として、 蛍光物質、 ピオチン、 又は His-tagなど 各種分離タグなどを導入したものが可能である。 また、 コード部の 5'末端領域を SP6+029とし、 3，末端領域を、 たとえば、 Flag+XhoI+An (n=8)とすることで、 各長 さは、 5，末端領域で約 60bp、 3'末端領域で約 40bpであり、 PCRのプライマーにァ ダブ夕一領域として設計可能な長さである。 これによつて新たな効果が生み出さ れた。 すなわち、 あらゆるベクターやプラスミ ドや cDNAライブラリ一から PCIUこ よって、 本態様の 5'末端領域と 3'末端領域をもったコード部を簡単に作成可能と なり、 このコード部に、 3，UTRの代わりとして PEGスぺーサ一部をライゲーショ ンすることで、 翻訳効率の高い翻訳テンプレートを得られる。 A part of the PEG spacer according to the present embodiment can be configured to have a modifying substance (F1 and / or F2). As a result, the translation template can be used as a tag for recovery, reuse by purification, or immobilization. It is possible to introduce at least one base of DNA and / or RNA into which various separating tags such as fluorescent substance, biotin, or His-tag are introduced as a modifying substance. By setting the 5 'end region of the code part to SP6 + 029 and 3, the end region to be, for example, Flag + XhoI + A n (n = 8), each length is about 5; The length is 60 bp, about 40 bp in the 3'-terminal region, and a length that can be designed as an adabu-yuichi region for PCR primers. This has created a new effect. In other words, by using PCIU from any vector, plasmid, or cDNA library, it is possible to easily create a code portion having the 5 'end region and the 3' end region of this embodiment. Alternatively, by ligating a part of the PEG spacer, a translation template with high translation efficiency can be obtained.
本態様の PEGスぺーサ一分子とコード分子のライゲ一シヨンは、 その方法につ いては、 一般的な DNAリガ一ゼを用いるものや光反応による連結など何でもよく、 特に限定されるものではない。 RNAリガーゼを用いるライゲ一シヨンでは、 コ一 ド部でライゲーシヨン効率に影響を与える範囲としては 3'末端領域の A配列が重 要であり、 少なくとも 2残基以上の dAおよび/又は rAの混合又は単一のポリ A連続 鎖であり、 好ましくは、 3残基以上、 より好ましくは 6から 8残基以上のポリ A連 続鎖である。 PEGスぺ一サ一部のドナ一領域の 5，末端の DNAおよび/又は RNA配列は、 ライゲーシヨン効率を左右する。 コード部と PEGスぺーサ一部を、 RNAリガーゼで ライゲーシヨンするためには、 少なくとも 1残基以上を含むことが必要であり、 ポリ A配列をもつァクセプ夕一に対しては、 少なくとも 1残基の dC (デォキシシチ ジル酸）又は 2残基の dCdC (ジデォキシシチジル酸）が好ましい。 塩基の種類とし ては、 C>(U又は T)>G>Aの順で好ましい。 さらに、 ライゲ一シヨン反応時に、 PEG 領域と同じ分子量のポリエチレングリコールを添加することが好ましい。 次に、 プレイとして用いるのに好ましい翻訳テンプレートの例について説明す る。 The method for ligating a PEG spacer molecule and a coding molecule in this embodiment may be any method, such as a method using a general DNA ligase or a ligation by photoreaction, and is not particularly limited. Absent. In ligation using RNA ligase, the A sequence in the 3'-terminal region is important as the range that affects ligation efficiency in the code part, and the mixing or mixing of dA and / or rA of at least two residues or more is important. It is a single poly A continuous chain, preferably 3 or more residues, more preferably 6 to 8 or more poly A continuous chains. The DNA and / or RNA sequence at the 5 'end of the donor region of some PEG controllers will affect ligation efficiency. In order to ligate the coding part and a part of the PEG spacer with RNA ligase, it is necessary to include at least one residue, and at least one residue is required for Axepyu having a poly A sequence. Of dC (doxycytidylic acid) or two residues of dCdC (dideoxycitylic acid) are preferred. The type of base is preferably in the order of C> (U or T)>G> A. Further, it is preferable to add polyethylene glycol having the same molecular weight as that of the PEG region at the time of the Liigession reaction. Next, an example of a translation template that is preferable for use as a play will be described.
本態様の共翻訳スクリーニングにおけるプレイとして、 図 7に示すように、 翻 訳テンプレートによって C末端修飾された蛋白質 (二対応付け分子）を利用する。 翻訳テンプレートは、 蛋白質に翻訳される情報を持つコード部と PEGスぺ一サー 部からなる。 コード部の 3'末端に A配列を有し、 A配列は、 短いポリ A配列を含む。 PEGスぺ一サ一部は、 ポリエチレングリコールを主成分とした PEG領域において、 ポリエチレングリコールの分子量が 400以上であることを特徴とする、 また、 ド ナー領域および/又は CCA領域において、 少なくとも 1つの修飾物質 (F 1および/又 は F 2 )を含むことを特徴とする。 また、 CCA領域は、 該翻訳テンプレートによつ て翻訳された蛋白質と、 ベプチド転移反応によって結合する機能を有することを 特徴とし、 代表的には CCA領域にピューロマイシンを有する。 また、 修飾物質 (F 1および/又は F 2 )が、 該翻訳テンプレートおよび/又は該翻訳テンプレートから 翻訳された蛋白質を固定化又は蛍光ラペル化することを特徴とする。 固定化物質 としてピオチンなどが考えられ、 蛍光性物質として、 Fluorescein, Cy5, 又は ローダミングリーン（MiG)などが考えられる。 これら、 コード部および翻訳テン プレート、 およびそのライブラリーが、 リボソーム上で翻訳されることにより合 成される蛋白質 (二対応付け分子）および蛋白質 ( =対応付け分子)のライブラリーに 関するものである。  As a play in the co-translation screening of this embodiment, as shown in FIG. 7, a protein (two-associated molecule) modified with a C-terminal by a translation template is used. The translation template is composed of a coding part having information to be translated into a protein and a PEG spacer part. It has an A sequence at the 3 'end of the coding portion, where the A sequence comprises a short poly A sequence. A part of the PEG matrix is characterized in that the polyethylene glycol has a molecular weight of 400 or more in the PEG region containing polyethylene glycol as a main component, and at least one in the donor region and / or the CCA region. It is characterized by containing a modifying substance (F 1 and / or F 2). Further, the CCA region has a function of binding to a protein translated by the translation template by a peptide transfer reaction, and typically has puromycin in the CCA region. Further, it is characterized in that the modifying substance (F1 and / or F2) immobilizes or fluoresces the translation template and / or the protein translated from the translation template. Examples of the immobilizing substance include biotin, and examples of the fluorescent substance include Fluorescein, Cy5, and rhodamine green (MiG). These relate to a protein (two-mapping molecule) and a library of proteins (= mapping molecule) synthesized by translating the coding part, translation template, and its library on the ribosome. .
プレイは、 翻訳テンプレートを用いた翻訳によって合成された、 翻訳テンプレ —卜で C末端修飾された蛋白質（図 7の A ;対応付け分子）であり、 翻訳テンプレ ート（図 7の B )と、 PEGによって C末端修飾された蛋白質（図 7の C )の構成に特 徴を持つ。 以下詳細に記述する。  The play is a protein synthesized by translation using a translation template and modified at the C-terminus with the translation template (A in FIG. 7; assigning molecule). The translation template (B in FIG. 7) It is characterized by the structure of the C-terminally modified protein (C in Fig. 7) by PEG. The details will be described below.
翻訳テンプレート（図 7の B )の PEGスぺーサ一部は、 ビュ一口マイシンがアミ ノ酸と連結できることを特徴とする以外は上記のペイ トとして用いるのに好まし い翻訳テンプレートと同様である。 また、 コード部も上記のベイ トとして用いる のに好ましい翻訳テンプレートと同様であるが、 特に、 対応付けに適した構成と しては、 3'末端領域を A配列にすることが重要であり、 トータル蛋白の対応付け の効率が著しく向上してフリー蛋白質の量が激減する。 ここでも、 コード部の 53 末端領域を SP6+029とし、 3，末端領域を、 たとえば、 Flag+XhoI+An(n=8)とするこ とで、 各長さは、 5，末端領域で約 60bp、 3，末端領域で約 40bpであり、 PCRのブラ イマ一にアダプタ一領域として設計できる長さである。 これによつて、 あらゆる ベクタ—やプラスミ ドゃ cDNAライブラリ一から PCRによって、 本態様の 5，末端領 域と 3'末端領域をもったコード部を簡単に作成可能となり、 PEGスぺ一サ一部を ライゲーシヨンすることで、 対応付け効率の高い翻訳テンプレートが得られる。 本態様の PEGによって C末端修飾された蛋白質（図 7の C )は、 蛋白質の相互作 用検出などにおいて、 コード部を利用しない場合、 たとえば、 FCCS測定、 蛍光リ —ダ一、 プロテインチップなどに応用する場合は、 RNase Aなどで意図的に切断 してもよい。 切断することによって、 コード部の妨害による蛋白質間相互作用の 検出の困難性が解消出来る。 また、 単独の対応付け分子をプレートやビーズゃス ライ ドガラスに固定することも可能である。 The PEG spacer portion of the translation template (FIG. 7B) is similar to the preferred translation template for use as the above-described plate, except that it is characterized by the fact that ViewMipmycin can be linked to amino acids. . In addition, the code part is the same as the translation template preferable for use as the above-mentioned bait, but it is particularly important that the 3 ′ terminal region be an A sequence for a structure suitable for association. The efficiency of total protein mapping is significantly improved and the amount of free protein is drastically reduced. Again, the code section 5 3 By setting the terminal region to SP6 + 029 and 3, the terminal region to be, for example, Flag + XhoI + A n (n = 8), each length is 5, the terminal region is about 60 bp, and the terminal region is Is about 40 bp, which is a length that can be designed as one adapter region in a PCR primer. As a result, it is possible to easily create a coding portion having the 5, 5'-terminal region and the 3'-terminal region of this embodiment by PCR from any vector or plasmid cDNA library. By ligating the parts, a translation template with high association efficiency can be obtained. The protein modified at the C-terminus with the PEG of this embodiment (C in FIG. 7) can be used for detecting protein interaction without using the coding part, for example, for FCCS measurement, fluorescent leader, protein chip, etc. When applied, it may be intentionally cut with RNase A or the like. Cleavage can eliminate the difficulty of detecting protein-protein interactions due to interference with the coding region. It is also possible to fix a single assigning molecule to a plate or bead-slide glass.
無細胞共翻訳を、 図 8を参照して説明する。 図 8に示すように、 ペイ トの存在 下でプレイが in vitroで翻訳される。 図 8の Aおよび Bに示されるように、 べィ トが蛋白質であって、 無細胞翻訳系でプレイと同時に翻訳される場合と、 ペイ ト が、 核酸やホルモンなどであって、 無細胞翻訳系に添加される場合がある。 図 8 に示すように、 プレイは融合蛋白質又は対応付け分子とされる。  The cell-free cotranslation will be described with reference to FIG. As shown in Figure 8, the play is translated in vitro in the presence of the pate. As shown in Figs. 8A and 8B, the case where the byte is a protein and is translated at the same time as play in the cell-free translation system, and the case where the byte is a nucleic acid or hormone and the cell-free translation May be added to the system. As shown in FIG. 8, the prey is a fusion protein or an assigning molecule.
複合体は、 ベイ トと一つのプレイが結合して形成されること （I )'の他に、 ベ ィ トに結合したプレイにさらに別のプレイが結合することにより形成されること ( II) もある。  A complex is formed by combining a bait with one play (I) ', and by combining another play with the play combined with the bait (II). There is also.
本発明検出方法によれば、 in vitroで複合体の形成を行うことができるので、 一貫して in vitroで蛋白質間又は核酸-蛋白質間などの相互作用を検出できる。 ベイ トが蛋白質である場合は、 ベイ トとしては、 目的蛋白質との相互作用のた めの機能ドメインのみの蛋白質、 機能ドメインを含む蛋白質、 又は完全長蛋白質 などが挙げられる。 ここで、 完全長蛋白質を用いることは、 複数の機能ドメイン を有することが一般に予測されるため、 さらに網羅的にプレイを検出可能となる ことから、 好ましい。 完全長蛋白質は、 単独で完全長の蛋白質でもよいし、 完全 長の蛋白質を再構成する複数のペイ 卜の集まりでもよい。  According to the detection method of the present invention, since a complex can be formed in vitro, it is possible to consistently detect the interaction between proteins or between nucleic acids and proteins in vitro. When the bait is a protein, the bait includes a protein having only a functional domain for interacting with a target protein, a protein containing a functional domain, or a full-length protein. Here, it is preferable to use a full-length protein, since it is generally expected that the protein has a plurality of functional domains, and it is possible to detect play more comprehensively. The full-length protein may be a full-length protein by itself or a collection of multiple palates reconstituting the full-length protein.
ペイ トは、 図 9に示したように、 複合体であってもよく、 これを 「複合べィ ト」 2003/014750 The sheet may be a complex, as shown in Figure 9, which is referred to as a “composite byte”. 2003/014750
33 と呼ぶ。 複合体 することによって、 より非特異的な吸着を減らすことができ、 かつ完全長蛋白質と同様の効果として、 より網羅的にプレイを検出することが可 能となる。 Call it 33. By forming a complex, nonspecific adsorption can be reduced, and play can be detected more comprehensively as an effect similar to that of a full-length protein.
以上のように、 無細胞共翻訳で考えられる複合体としては、 単独のペイ トと単 独のプレイの複合体、 複合べィ トとプレイの複合体、 ペイ トと複数のプレイの複 合体、 および、 複合ペイトと複数のプレイの複合体が可能である。 従って、 本発 明検出法により検出可能な相互作用は、 ペイ トとプレイとの間の直接の相互作用 だけでなく、 複合体を形成するための間接的な相互作用をも包含するものである。 本発明における無細胞共翻訳で最も重要なことは、 蛋白質がネィティブな状態 でフォールデイングしており、 翻訳されたての変性していない状態であり、 相互 作用するべきペイトとプレイ又はペイトとペイ トゃプレイとプレイが無細胞翻訳 系に共存しており、 速やかに相互作用できると言うことと考えられる。 このこと は、 別々に翻訳して翻訳直後に混合して共存させるよりも、 共に翻訳したものの 方が優れた結果が得られたことにより支持される。 すなわち、 in vitroで翻訳さ れた蛋白質がネイティブなフォールディング状態で、 蛋白質又は核酸などと出会 うことができるため、 速やかに相互作用による複合体の形成が可能となったため と思われる。  As described above, complexes that can be considered in cell-free co-translation include a single-pay and single-play complex, a composite-bait and play complex, a pay-multiple play complex, Also, a composite of multiple plays and multiple plays is possible. Therefore, the interactions that can be detected by the present invention detection method include not only the direct interaction between pait and play, but also the indirect interaction for forming a complex. . The most important thing in the cell-free cotranslation according to the present invention is that the protein folds in a native state and is in a non-denatured state just after translation. It is thought that the play and the play coexist in the cell-free translation system and can interact quickly. This is supported by the superior results obtained with co-translation rather than separate translation and co-existence immediately after translation. In other words, it is considered that the protein translated in vitro can meet with the protein or nucleic acid in a native folded state, and thus a complex can be rapidly formed by the interaction.
従来の相互作用の検出法では、 ペイ トを大腸菌で大量に発現精製する必要があ つた。 例えば、 TAP法などでペイ トとプレイの相互作用を細胞で発現させる場合 は、 最低一ヶ月の準備が必要であった。 また、 GST融合蛋白によるプルダウン法 を採用している mRNAディスプレイ法では、 ペイ トを大腸菌などで大量に発現させ て精製するため、 最低 2〜3週間かかり、 大腸菌で発現しないものはべィ トに出来 ないなどの問題があり、 さらに、 プレイと相互作用させるにはプレイの 50〜； 100 倍の量のペイ トを添加する必要があった。 無細胞共翻訳では、 無細胞翻訳系にお いて、 ほぼ同量の mRNA又は DNAテンプレートを添加すればよいだけとなり、 べィ トを細胞で発現させる必要は全くなくなり作業時間の大幅な短縮が行える。 さら に、 複合べィ トゃ完全長蛋白質によって、 ペイ 卜とプレイの相互作用をより強化 し特異的なものとし、 非特異的な結合の検出を回避することができる。 また、 複 合べィトによって、 その第二のペイ トと相互作用するより多くのプレイを網羅的 に解析できる。 In the conventional method for detecting interaction, it was necessary to express and purify the sheet in E. coli in large quantities. For example, in order to express the interaction between the paste and play in cells using the TAP method, at least one month of preparation was required. In the mRNA display method, which employs the GST fusion protein pull-down method, it takes at least 2-3 weeks to express and purify a large amount of the protein in Escherichia coli or the like. In addition, it was necessary to add 50 to 100 times the amount of play to interact with play. In cell-free cotranslation, it is only necessary to add approximately the same amount of mRNA or DNA template to the cell-free translation system, and there is no need to express the cells in cells, greatly reducing the work time. . In addition, the complex-bait full-length protein can enhance the interaction between the pait and the prey, make it more specific, and avoid the detection of non-specific binding. Also, compound baits cover more plays that interact with the second pay. Can be analyzed.
これまで、 一貫して in vitroで相互作用による複合体形成とスクリーニングを 実現するシステムは存在しなかったが、 以上の本発明検出法によって、 ベイ トも 含めて完全に in vitroで翻訳とスクリーニングを行って、 蛋白質間又は蛋白質 - 核酸間の相互作用を非特異的な検出を回避しかつ網羅的に検出可能なシステムを 構築できる。 従って、 本発明は、 本発明検出方法を利用したスクリーニング方法 も提供する。  To date, there has been no system that consistently realizes complex formation and screening by interaction in vitro.However, with the above detection method of the present invention, translation and screening can be completely performed in vitro, including the bait. By doing so, it is possible to construct a system that can comprehensively detect the interaction between proteins or between protein and nucleic acid while avoiding nonspecific detection. Therefore, the present invention also provides a screening method using the detection method of the present invention.
本発明スクリーニング法は、 ペイ トとプレイが無細胞共翻訳を通して相互作用 して複合体を形成し、 複合体のスクリーニングによってペイ トと相互作用するプ レイを解析することを特長とする。 従って、 本発明スクリーニング方法は、 本発 明検出方法により、 ペイ 卜とプレイとの間の相互作用を検出する検出工程を含む 他は、 ペイ トとプレイとの間の相互作用を検出する検出工程、 および、 相互作用 が検出されたプレイを選択する選択工程を含む、 ペイ トと相互作用するプレイの 通常のスクリ一ニング方法と同様でよい。  The screening method of the present invention is characterized in that a plate and a prey interact with each other through cell-free cotranslation to form a complex, and the complex interacting with the plate is analyzed by screening the complex. Therefore, the screening method of the present invention includes a detection step of detecting an interaction between a pait and a play by the present invention, and a detecting step of detecting an interaction between a pait and a play. , And may include a selection step of selecting a play for which an interaction has been detected, in the same manner as a normal screening method for a play interacting with a payt.
本発明スクリーニング方法は、 選択工程で選択されたプレイを調製する調製ェ 程をさらに含み、 調製されたプレイを、 検出工程で使用されたべィ トの代わりに 又はそのべィ トと共に用いて、 検出工程、'選択工程および調製工程を繰り返すこ とが好ましい。 この態様は、 例えば、 図 1 0に示すように、 1 )プレイおよびべィ トが相互作用を形成する無細胞翻訳系における無細胞共翻訳の工程、 2)ペイ 卜と 相互作用しているプレイを検出するスクリーニングの工程、 3 )プレイを分析およ び解析する工程、 および 4) 3 )で分析および解析されたプレイを新たな次のペイ トとし、 1 )から繰り返す工程から構成される。 1 )および 2)の工程が検出工程およ び選択工程に相当し、 3)の工程が調製工程に相当する。 すなわち、 検出工程のう ちの、 ペイ トとプレイを接触させる工程が無細胞共翻訳の工程に相当し、 検出ェ 程のうちの複合体の検出および選択工程がスクリ一二ングの工程に相当する。 本発明スクリーニング法では、 選択工程で選択されたプレイを再度検出工程に 付してもよい。  The screening method of the present invention further comprises a preparation step of preparing the prey selected in the selection step, wherein the prepared prey is used in place of or together with the bay used in the detection step to detect the prey. Preferably, the steps, 'selection step and preparation step are repeated. This embodiment includes, for example, as shown in FIG. 10, 1) a step of cell-free cotranslation in a cell-free translation system in which a play and a bait form an interaction, and 2) a play interacting with a plate. And 3) analyzing and analyzing the play, and 4) setting the play analyzed and analyzed in 3) as a new next pay and repeating from 1). Steps 1) and 2) correspond to a detection step and a selection step, and step 3) corresponds to a preparation step. In other words, of the detection steps, the step of bringing the pait into contact with the prey corresponds to the cell-free cotranslation step, and the step of detecting and selecting the complex among the detection steps corresponds to the screening step. . In the screening method of the present invention, the play selected in the selection step may be subjected to the detection step again.
本発明スクリーニング法では、 ペイ 卜と複数のプレイの集団であるプレイ 'ラ イブラリーとの無細胞共翻訳を行い、 スクリーニングの工程において、 2つ以上 のプレイが検出されてもよい。 In the screening method of the present invention, cell-free co-translation between a pait and a prey library, which is a group of a plurality of preys, is performed. May be detected.
図 9に示すように、 複合べィ トとプレイが共存し、 相互作用によって複合べィ トとプレイの複合体を形成する場合がある。 この無細胞共翻訳で、 プレイ 'ライ ブラリーの複数のプレイがペイ トと共存し、 相互作用によってべィ トと複数のプ レイの複合体を形成することによって、 スクリーニングにおいて、 一挙に網羅的 な相互作用する複数のプレイを検出できる。 また、 ベイ トが完全長蛋白質である ことによって、 完全長蛋白質は一般に相互作用の機能ドメインを複数含むので、 より多くのプレイを網羅的に検出可能となる。  As shown in FIG. 9, the composite bait and play may coexist and form a complex of the composite bait and play by interaction. In this cell-free co-translation, multiple plays of the play library coexist with the patte, forming a complex of the bait and the multiple play by interaction, which can provide a comprehensive screening at a glance. Multiple interacting plays can be detected. In addition, since the bait is a full-length protein, a full-length protein generally contains a plurality of functional domains of interaction, so that more plays can be comprehensively detected.
さらに、 図 9に示すように、 複合ペイ トと相互作用する複数のプレイの複合体 を形成することによって、 複合ペイ トと相互作用する複数のプレイを検出でき、 また、 第二のペイ トがべィ トとプレイの相互作用の補強剤となり、 より特異的な 相互作用が実現されることによって、 網羅的検出における非特異的検出の回避が 可能となる。 in vitroウィルス法や STABLE法など進化分子工学的手法では、 プレ ィは対応付け分子（fusion)となる。 プレイ ·ライブラリーや複数のプレイを用い た場合の複合体の形成では、 プレイは直接べィ 卜と相互作用する場合としない場 合がある。  Further, as shown in FIG. 9, by forming a complex of a plurality of plays interacting with the composite pay, a plurality of plays interacting with the composite pay can be detected, and the second pay can be detected. It acts as a reinforcing agent for the interaction between bait and prey, and by realizing a more specific interaction, it is possible to avoid non-specific detection in exhaustive detection. In evolutionary molecular engineering techniques such as the in vitro virus method and the STABLE method, the play is an assigning molecule (fusion). In the formation of a complex using a play library or multiple plays, the play may or may not directly interact with the bets.
複合体のスクリーニングにより得られた複合体が対応付け分子である場合には、 図 1 0に示すように、 複合体を形成するプレイを RT- PCR又は PCRにより検出し、 さらに、 PCR産物をプレイとして再スクリーニングする （プレイの再構築） 、 あ るいは、 PCR産物から解析したプレイを新たな次のペイ トとしてスクリーニング してもよい。 ここで、 PCR産物から再スクリーニングする、 あるいは、 PCR産物か ら解析したプレイを新たな次のペイ トとしてスクリーニングする方法は、 in vitro ウィルス法や STABLE法など進化分子工学的手法においてのみ可能であり、 ブルダ ゥン法、 TAP法など蛋白質を直接解析する方法ではできない。  If the complex obtained by screening the complex is an assigning molecule, as shown in Fig. 10, the prey that forms the complex is detected by RT-PCR or PCR, and the PCR product is further purified. The re-screening may be performed (reconstruction of the play), or the play analyzed from the PCR product may be screened as a new next payment. Here, the method of re-screening from the PCR product or screening the play analyzed from the PCR product as a new next pattern is possible only by the evolutionary molecular engineering methods such as the in vitro virus method and the STABLE method. However, direct analysis of proteins, such as the Burdun method and the TAP method, cannot be used.
対応付け分子を用いた場合には、 スクリーニングの後、 RT- PCR又は PCRによつ て蛋白質プレイの遺伝子配列を知ることが出来る。 図 8および 9に示すように、 ここでの蛋白質プレイとは、 ペイ トと相互作用しているプレイ又はそのプレイと 相互作用しているプレイなどであり、 ペイ 卜と相互作用しているすべての複数の プレイが網羅的に解析できる。 さらにプレイの再スクリ一ニングが必要な場合は、 RT - PCR又は PCIlの産物である DNAテンプレートを転写し、 同じサイクルを繰り返す。 また、 RT- PCR又は PCRとそれに続くシークェンスによってプレイが定まつた場合 は、 その蛋白質プレイはべィ トとして使えるようになる。 はじめのペイ トに対し て相互作用するプレイが複数個見つかれば、 複合べィ トを形成することが出来る ようになり、 さらにより多くのプレイを検出することが出来るようになる。 When the assigning molecule is used, the gene sequence of the protein prey can be known by RT-PCR or PCR after screening. As shown in Figs. 8 and 9, the protein play here is a play that interacts with the play or a play that interacts with the play, and any protein play that interacts with the payt. Multiple play can be analyzed comprehensively. If you need to re-screen your play, Transfer the DNA template that is the product of RT-PCR or PCIl and repeat the same cycle. Also, if play is determined by RT-PCR or PCR followed by a sequence, the protein play can be used as a bait. If multiple plays interacting with the first pay are found, a composite bait can be formed, and even more plays can be detected.
無細胞共翻訳を用いると、 プルダウン法や TAP法においても一貫して in vitro で蛋白質間相互作用を検出できることになるが、 TAP法では対応付け分子を形成 していないので、 プレイの解析において直接的に蛋白質を解析しなければならな い。 そこで、 プルダウン法や TAP法をスクリーニングの方法として in vitroウイ ルス法や STABLE法に応用すれば、 対応付け分子を形成しているので、 RT- PCR又は PCRによって、 相互作用するプレイの解析においてその遺伝子配列を簡単に検出 することが出来る。 さらに、 無細胞共翻訳を用いると、 in vitroウィルス法や ST ABLE法において、 一貫して in vitroで蛋白質間相互作用を検出できることになる。 また、 プレイの数が莫大な場合は、 サイクルを回すことで再スクリーニングによ りプレイを絞り込むことが可能である。 また、 解析されたプレイは、 次の解析で は、 ペイ トとして使うことができ、 ペイ トの数が増えれば、 ペイ 卜の複合化が進 み、 さらなるプレイが検出されることにつながる。 このように、 プレイをべイ ト として次のサイクルで使用することは、.対応付け分子を用いる in vitroウィルス 法や STABLE法などでのみ簡単に実現できる。 しかしながら、 mRNAディスプレイな どの方法では、 新しいペイ 卜の GST融合蛋白を大腸菌で大量合成と精製が必要で あり、 ペイ トの用意に時間がかかり困難である。 無細胞共翻訳によれば、 その必 要もなく簡単にサイクルを回すことが出来る。  If cell-free cotranslation is used, the protein-protein interaction can be detected in vitro consistently by the pull-down method and the TAP method, but since the TAP method does not form an assigning molecule, it can be directly analyzed in play analysis. It is necessary to analyze the protein. Therefore, if the pull-down method or the TAP method is applied to the in vitro virus method or the STABLE method as a screening method, an associating molecule is formed, so that RT-PCR or PCR can be used to analyze interacting plays. Gene sequences can be easily detected. Furthermore, the use of cell-free cotranslation will allow consistent detection of protein-protein interactions in vitro using the in vitro virus method and the STABLE method. If the number of plays is enormous, it is possible to narrow the play by re-screening by turning the cycle. In addition, the analyzed play can be used as a payout in the next analysis. As the number of payouts increases, the composition of the payouts proceeds, and further play is detected. In this way, using play as a bait in the next cycle can be easily realized only by the in vitro virus method using the assigning molecule or the STABLE method. However, methods such as mRNA display require large-scale synthesis and purification of a new GST fusion protein in Escherichia coli, which makes preparation of the paste time-consuming and difficult. According to cell-free co-translation, the cycle can be easily performed without the necessity.
無細胞共翻訳後の複合体のスクリーニングにおいて、 無細胞共翻訳によって出 来た複合体を壊すことなくプレイを網羅的にスクリ一ニングできることが好まし い。 このために、 親和性タグなどによってべィ トに固定化の仕組みを持たせ、 ベ イ トと相互作用するプレイを検出してもよい。 その固定化の仕組みは、 いかなる ものでも構わない。 たとえば、 既存の TAP法などのように、 IgG-プロテイン A親和 性やカルモジュリンビーズを用いた 2段階のスクリーニングを行う方法、 あるい はプルダウン法のように、 ストレプトアビジン又はアビジン-ピオチン親和性、 G ST - tag、 Flag-tag, T7-tag, His-tagなどを利用した一段階又は二段階のスクリ 一二ングを行う方法が挙げられる。 In screening for a complex after cell-free cotranslation, it is preferable that the play can be screened comprehensively without breaking the complex produced by cell-free cotranslation. For this purpose, a bay may be provided with a mechanism of immobilization using an affinity tag or the like, and a play interacting with the bay may be detected. The immobilization mechanism may be of any type. For example, two-step screening using IgG-protein A affinity or calmodulin beads as in the existing TAP method, or streptavidin or avidin-biotin affinity, G One-stage or two-stage screening using ST-tag, Flag-tag, T7-tag, His-tag, and the like.
プレイ 'ライブラリーとしては、 cDNAライブラリー（ランダムプライミング · ライブラリ一、 dTプライミング 'ライブラリ一）、 ランダム 'ライブラリー、 ぺ プチド 'ライブラリ一、 ホルモン 'ライブラリ一、 抗体 ·ラィブラリ一、 リガン ド . ライプラリ一、 医薬化合物ライブラリ一などが挙げられ、 いかなるライブラ リーでも構わない。 たとえば、 プレイ 'ライブラリ一としてランダムプライミン グ · cDNAライブラリーを用いた場合、 このライブラリーには完全長プレイは望め ないが、 機能ドメインを含むプレイは期待できる。 このようなライブラリ一は、 特に、 複合ペイ トゃ完全長蛋白質との組み合わせによるスクリーニングに用いる と、 プレイの網羅的検出に有効となる。  Play 'libraries' include cDNA libraries (random priming library, dT priming 'library'), random 'libraries, peptide' library ', hormone' library '1, antibody' library ', ligand'. And a library of pharmaceutical compounds, and any library may be used. For example, if a random primed cDNA library is used as a play library, full-length play cannot be expected from this library, but play including functional domains can be expected. Such a library is effective for comprehensive detection of play, particularly when used for screening in combination with a complex pattern / full-length protein.
ランダムプライミングライブラリーの例としては、 マルチクローニングサイ ト ( MCS )の 5，側に、 転写プロモ一夕一として SP6の RNAポリメラ一ゼのプロモー夕一 (SP6 )と、 翻訳ェンハンサ一としてタバコモザイクウィルスの TMVオメガ配列の一 部（029)とを含んだ 5'非翻訳 (UTR)領域を持ち、 かつ MCSの 3，側に親和夕グ配列と して、 抗原抗体反応によるァフィ二ティー分離分析用タグである Flag-tag配列を、 MCSに組み込まれた挿入配列から発現した蛋白質の C末端に Flag-tagが付加され るように含む 3，末端を持つベクターの MCSに、 ランダムプライミングで得られた cDNAが組み込まれたものが挙げられる。  Examples of random priming libraries include, on the 5th side of the Multi-Cloning Site (MCS), a Promoter for SP6 RNA polymerase (SP6) as a transcription promoter, and a Tobacco Mosaic Virus as a translation enhancer. A 5 'untranslated (UTR) region containing a part of the TMV omega sequence (029) and an affinity sequence on the 3 side of MCS for affinity separation analysis by antigen-antibody reaction A Flag-tag sequence, which is a tag, was added to the MCS of a vector with a terminus that included a Flag-tag to be added to the C-terminus of the protein expressed from the insertion sequence incorporated in the MCS. Examples include those in which cDNA is incorporated.
上記の本発明検出方法は、 ペイ トとプレイとを接触させ複合体を形成させるェ 程を含んでいる。 従って、 この工程に準じて、 ペイ トとそのべィ トと相互作用す るプレイとの複合体を形成させる方法が提供される。  The above-described detection method of the present invention includes a step of bringing a play into contact with a play to form a complex. Accordingly, there is provided a method of forming a complex of a play and a play interacting with the play according to this step.
本発明形成方法は、 ペイ トとペイ トと相互作用する蛋白質であるプレイとの複 合体の形成において、 プレイとして本発明のライブラリ一を用いるものであり、 好ましくは、 さらに、 ベイ トおよびプレイに特定の様式で検出用標識および分離 用修飾を行い、 そして、 無細胞共翻訳を行うことを主な特徴とするものである。 従って、 本発明形成方法の好ましい構成は、 ペイ トおよびプレイに特定の様式で 検出用標識および分離用修飾を行い、 そして、 無細胞共翻訳を行うことを除いて、 ペイ 卜とそのべィ 卜と相互作用するプレイとを接触させることを含む、 ペイ 卜と プレイとの複合体の通常の形成方法と同様でよい。 ペイ トおよびプレイの特定の 様式での検出用標識および分離用修飾ならびに無細胞共翻訳については、 本発明 検出方法に関し説明した通りでよい。 実施例 The method of the present invention uses the library of the present invention as a play in forming a complex of a play and a play that is a protein that interacts with a play. It is characterized by performing detection labeling and separation modification in a specific manner, and performing cell-free cotranslation. Accordingly, a preferred configuration of the method of forming the present invention is a method for preparing a sheet and a sheet thereof except that a label and a detection modification are applied to the sheet and the play in a specific manner, and cell-free cotranslation is performed. And play, including contacting play with It may be the same as the usual method of forming a composite with play. The labeling for detection and modification for separation and the cell-free cotranslation in a particular format of pait and play may be as described for the detection method of the invention. Example
以下、 具体的に本発明の IVVランダムプライミングライブラリ一とその作成に 使用され得るラィゲ一テッド dsDNAラィブラリ―、 IVV cDNAラィブラリ一および I VVライゲ一テツ ド RNAライブラリーの作成についての実施例を記述するが、 下記 の実施例は本発明についての具体的認識を得る一助とみなすべきものであり、 本 発明の範囲は下記の実施例により何ら限定されるものでない。 実施例 1 IVVランダムプライミングライブラリーの作成とライブラリ一からの 共翻訳スクリーニング  Hereinafter, specific examples of the preparation of the IVV random priming library of the present invention and the ligation dsDNA library, the IVV cDNA library and the IVV ligation RNA library which can be used for the preparation thereof will be described. However, the following examples should be regarded as helping to obtain a specific understanding of the present invention, and the scope of the present invention is not limited by the following examples. Example 1 Construction of IVV random priming library and co-translation screening from one library
図 1に概略を示す方法に従って IWランダムライブラリーを作成した。 すなわ ち、 MAライブラリ一を錶型として、 9塩基からなるランダム配列と特定配列 (tag 2 配列） を含むランダムプライマーを用いてランダムプライミング法によ り逆転写で mRNAに相補的な一本鎖 cDNA( ssDNA)ライブラリーを合成する（1 )。 RNase Hにより cDNAと RNAの二本鎖から RNAのみを分解すると同時に、 DNAポリメ ラ一ゼ I による cDNAに相補的な DNAを合成し、 さらに、 DNAリガーゼにより DNAポ リメラ一ゼ Iにより合成された MA間にある二ヅクを修正して dsDNAライブラリ一 を合成する（11 )。 合成された二本鎖 cDNAは DNAポリメラ一ゼ I により合成された 側のみ 5'末端にリン酸基を持つのでこれを利用し、 特定配列（5' UTR二プロモー夕 — +ェンハンサ一）を持つアダプタ一を DNAリガーゼを用いて結合し、 ライゲーテ ヅド dsDNA ライブラリー）を合成する（111 )。 アダプターとランダムプライマーの 特定配列を利用して PCRを行い、 5，側にプロモーターとェンハンサ一の配列、 3' 側に A tailをもつ IWの cDNAライブラリーを作成する（IV)。 次に IVV cDNAライブラ リ一を転写して IVV RNAライブラリーとし（V)、 IVVとするためのスぺ一サーをラ ィゲーシヨンし（VI )、 さらに、 無細胞翻訳系で翻訳すれば、 対応付け分子のライ ブラリーとなる（VI I )。 以下、 詳細を説明する。 RNAライプラリーとして、 市販のマウス脳又はマウス精巣 (polyA+) RNAライブ ラリ一（組織抽出 RNAライブラリ一を oligo dTカラムで精製したもの； clontech)を 購入した。 An IW random library was prepared according to the method outlined in FIG. That is, a single strand complementary to mRNA by reverse transcription by the random priming method using a random primer consisting of 9 bases and a specific sequence (tag 2 sequence) using the MA library 1 as type I A cDNA (ssDNA) library is synthesized (1). At the same time as decomposing RNA only from the double strand of cDNA and RNA with RNase H, DNA complementary to cDNA with DNA polymerase I was synthesized, and further synthesized with DNA polymerase I with DNA ligase. The dsDNA library is synthesized by correcting the gap between the MAs (11). Since the synthesized double-stranded cDNA has a phosphate group at the 5 'end only on the side synthesized by DNA polymerase I, this is used to have a specific sequence (5' UTR double promoter — + enhancer) The adapter is ligated using DNA ligase to synthesize a ligated dsDNA library (111). PCR is performed using the specific sequences of the adapter and the random primer to create an IW cDNA library with a promoter and enhancer sequence on the 5th side and an A tail on the 3 'side (IV). Next, the IVV cDNA library is transcribed into an IVV RNA library (V), the spacer for IVV is ligated (VI), and further translated by a cell-free translation system. It is a library of molecules (VI I). The details will be described below. As an RNA library, a commercially available mouse brain or mouse testis (polyA +) RNA library (purified tissue library RNA library using an oligo dT column; clontech) was purchased.
また、 あらかじめ、 アダプターを設計し MAを合成した。 ここでは、 対応付け 分子の形成に適した 5， UTR配列（プロモ一夕一 SP6+ェンハンサ一 029又は 0，）をライ ブラリーに特定配列として付加するための設計を行った。 マウス脳 (polyA+) RNA ライブラリーには、 ェンハンサ一 029をもつアダプタ一を使用し、 マウス精巣（po lyA+) RNAライブラリ一には、 ェンハンサ一 0，をもつアダプタ一を使用した。 ェ ンハンサ一 029用のアダプターの主鎖（配列番号 1 )と副鎖（gaattcgc)、 又は、 ェ ンハンサ一 0，用のアダプターの主鎖 (配列番号 2 )と副鎖 (ggaattcg)は、 各々 TEバ ヅファ一（10mM Tris-Cl， pH8.0, ImM EDTA)に溶解して 100 Μとし、 主鎖と副鎖 をそれそれ 10 1ずつ等モルで混合した。 90°Cで 2分間加熱し、 70°Cで 5分加熱 し、 60°Cのウォー夕一バスにセヅトしてバスのヒ一夕一を切ってゆつく りと 60°C から室温まで下げた。 5〃1ずつに分注して- 20°Cに保存した。  In addition, an adapter was designed in advance to synthesize MA. Here, a design was made to add a 5, UTR sequence (Promo Ichiichi SP6 + Enhansa I 029 or 0,) suitable for the formation of the mapping molecule as a specific sequence to the library. An adapter with Enhansa 029 was used for the mouse brain (polyA +) RNA library, and an adapter with Enhansa 10 was used for the mouse testis (polyA +) RNA library. The main chain (SEQ ID NO: 1) and subchain (gaattcgc) of the adapter for enhancer 029, or the main chain (SEQ ID NO: 2) and subchain (ggaattcg) of the adapter for enhancer 10 are each TE It was dissolved in a buffer (10 mM Tris-Cl, pH 8.0, ImM EDTA) to make 100 、, and the main chain and the sub-chain were mixed in an equimolar ratio of 101 each. Heat at 90 ° C for 2 minutes, heat at 70 ° C for 5 minutes, set in a 60 ° C warm bath, cut off the bath, and slowly cool down from 60 ° C to room temperature Was. Aliquots of 5 に 1 were stored at -20 ° C.
まず、 マウス脳 (polyA+) RNAライブラリ一を一本鎖 DNAに逆転写した（図 1 , 1)。 マウス脳（polyA+) RNAライブラリー（1.4pmole/0.5〃g)を 0.5〃g、 3，ランダムプ ライマ一（配列番号 3 )を 2pmolと DEPC水とを加えて 12.0 1とし、 70°Cで lOminカロ 熱し、 氷上で 1分間冷却した。 これを用いて、 Superscript I I RT (Superscript Double Strand cDNA Synthesis Kit; Invitrogen)により 45°Cで lh逆転写反応を行った。 次に、 逆転写反応で合成した一本鎖 DNA(ssMA)ライブラリ一を全量用いて、 E. c oli DNAリガ一ゼ、 E. coliポリメラ一ゼ I、 および E. coli RNase H (Superscript Double Strand cDNA Synthesis Kit; Invitrogen)により 16°Cで 2h反応させ、 さらに T4 DNAポリメラーゼにより 16°Cにおいて 5minの反応で末端を平滑化し、 二本鎖 DNAを 合成した（図 1 , 11 )。 次に、 この二本鎖 DNAの 5'末端がリン酸化されていること を利用して、 先に準備したアダプターを用いてライゲ一シヨンした（図 1 , 111 )。 合成した二本鎖 DNA(dsDNA)ライプラリーをエタノール沈殿し、 の DEPC水に溶 解した。 これに、 100〃Mの準備したアダプタ一を 1.0 z l添加し、 50〃1 ligation high (T0Y0B0)を加えて、 16°Cでー晚反応させ、 精製 (DNA purification kit ； QIAGEN)した後 50〃1とした。 次に、 PCR (EX Taq Hot Start Version; TaKaRa)を行 つた（図 1 , IV)。 50〃1のライゲ一シヨンした二本鎖 DNA (ライゲーテッド dsDNA) ライブラリーから 2 z lをテンプレートとして、 IVVに必要な特定配列（029 )を持つ 5，PCRプライマ一（配列番号 4 )と 3' PCRプライマ一（配列番号 5 )、 又は、 IVVに必 要な特定配列（0' )を持つ 5' PCRプライマー（配列番号 6 )と 3' PCRプライマ一（配列 番号 7 )を用いて、 IVV cDNAライブラリ一（029)、 および IVV cDNAライブラリ一（0 ' )を作成した。 PCRの条件は、 全量 100〃1、 22サイクル（94°Cで 30秒、 60。Cで 30秒、 72°Cで 90秒を 1サイクルとし、 最後の伸長反応は、 72°Cで 180秒）とした。 First, a mouse brain (polyA +) RNA library was reverse-transcribed into single-stranded DNA (Fig. 1, 1). 0.5 μg of mouse brain (polyA +) RNA library (1.4 pmole / 0.5 μg), 3, 2 pmol of random primer (SEQ ID NO: 3) and DEPC water to make 12.01, and lOmin at 70 ° C Heated and cooled on ice for 1 minute. Using this, lh reverse transcription reaction was performed at 45 ° C. using Superscript II RT (Superscript Double Strand cDNA Synthesis Kit; Invitrogen). Next, using the entire amount of the single-stranded DNA (ssMA) library synthesized by the reverse transcription reaction, E. coli DNA ligase, E. coli polymerase I, and E. coli RNase H (Superscript Double Strand The reaction was carried out at 16 ° C for 2 hours using a cDNA Synthesis Kit (Invitrogen), and the ends were blunt-ended with T4 DNA polymerase at 16 ° C for 5 minutes to synthesize double-stranded DNA (Figs. 1, 11). Next, utilizing the fact that the 5 ′ end of the double-stranded DNA was phosphorylated, ligation was performed using the adapter prepared above (FIGS. 1, 111). The synthesized double-stranded DNA (dsDNA) library was precipitated with ethanol and dissolved in DEPC water. To this, add 1.0 zl of the prepared adapter at 100〃M, add 50〃1 ligation high (T0Y0B0), react at 16 ° C, and purify (DNA purification kit; QIAGEN). It was set to 1. Next, PCR (EX Taq Hot Start Version; TaKaRa) was performed. (Fig. 1, IV). Using 2 zl as a template from a 50〃1 ligated double-stranded DNA (ligated dsDNA) library, the PCR primer (SEQ ID NO: 4) and 3 'having the specific sequence (029) required for IVV Using a PCR primer (SEQ ID NO: 5) or a 5 'PCR primer (SEQ ID NO: 6) having a specific sequence (0') required for IVV and a 3 'PCR primer (SEQ ID NO: 7), One library (029) and one IVV cDNA library (0 ') were prepared. PCR conditions were as follows: total volume 100 サ イ ク ル 1, 22 cycles (30 cycles at 94 ° C, 60 seconds at 30 ° C, 90 seconds at 72 ° C, and a final extension reaction of 180 seconds at 72 ° C) ).
作成した IW cDNAライブラリ一を評価した。 評価の結果は図 2に示した。 もと のマウス脳、 又はマウス精巣（polyA+) RNAライブラリーにどのような遺伝子が含 まれるかを、 遺伝子に特異的なプライマー (配列番号 8〜3 3 )を用いて RT- PCRで 検出し（図 2の A)、 それらの遺伝子について、 マウス脳（polyA+) RNAライブラリ 一から作成した IVV cDNAライブラリ一（029)とマウス精巣（polyA+) RNAライブラ リーから作成した IVV cDNAライブラリ一（0，）において、 もとの RNAライブラリ一 と同様に遺伝子が存在しているかを確認した（図 2の B )。 どちらのライブラリー でも、 もとの RNAライブラリ一を反映して各遺伝子が検出された。 すなわち、 ラ ィブラリーの作成工程で、 もとの Aライプラリーの質を落とすことなく IVV cDN Aライブラリ一を作成できた。  The prepared IW cDNA library was evaluated. The results of the evaluation are shown in FIG. The genes contained in the original mouse brain or mouse testis (polyA +) RNA library were detected by RT-PCR using gene-specific primers (SEQ ID NOs: 8 to 33). (A in Fig. 2) For these genes, an IVV cDNA library created from a mouse brain (polyA +) RNA library (029) and an IVV cDNA library created from a mouse testis (polyA +) RNA library (0,) In this case, it was confirmed whether or not the gene was present as in the case of the original RNA library (B in FIG. 2). In each library, each gene was detected reflecting the original RNA library. In other words, during the library creation process, an IVV cDNA library could be created without deteriorating the quality of the original A library.
次に、 マウス脳（polyA+) RNAライブラリーから作成した IVV cDNAライブラリー (029)を用いて、 IWの共翻訳スクリーニングに従って、 転写（図 1 , V)して、 ス ぺーサ一をライゲ一シヨン（図 1， VI )し、 そして小麦胚芽の無細胞翻訳系で、 IV Vライゲーテヅドライブラリーをプレイの翻訳テンプレートとし、 C- fos mRNAを ペイ 卜の翻訳テンプレートとし、 共翻訳スクリーニングと RT-PCR( One step RT-P CR kit (QIAGEN), プライマー；配列番号 4と 5、 プログラム； RT- QH30，）を 3ラ ゥンド回すと c- Fos蛋白質と相互作用する c-Jun蛋白質の遺伝子がサザンブロッテ イング （サザン） で明確に検出された（図 3の B )。 さらに、 3ラウンド回したラ イブラリーをクロ一ニングしたところ、 c-Jun蛋白質の遺伝子は約 1/4を占めるこ とがわかった。 また、 クロ一ニングしたライブラリ一内在の c-Jmi蛋白質の遺伝 子をシーケンスして確認した（図 4 )。 詳細は以下の通りである。  Next, using an IVV cDNA library (029) created from a mouse brain (polyA +) RNA library, transcription (Fig. 1, V) was performed according to the co-translation screening of IW, and the spacer was ligated. (Fig. 1, VI), and in a wheat germ cell-free translation system, the IV V ligated library was used as a translation template for play, C-fos mRNA was used as a translation template for the plate, and co-translation screening and RT-translation were performed. Turning PCR (One step RT-PCR kit (QIAGEN), primers; SEQ ID NOs: 4 and 5, program; RT-QH30,) for 3 rounds, c-Jun protein gene that interacts with c-Fos protein is found in Southern blot. Ing (Southern) was clearly detected (Fig. 3B). Cloning the library after three rounds revealed that the c-Jun protein gene occupies about 1/4. In addition, the c-Jmi protein gene within the cloned library was sequenced and confirmed (Fig. 4). Details are as follows.
ペイ ト C- Fos蛋白質の作成方法は以下の通りであった。 pCMV- FosCBPzzベクター (配列番号 3 4 )から、 TaKaRa Ex Taq (宝酒造）を用いて、 PCR (プライマー 5' SP6(0 29)T7- FosCBPzz (配列番号 3 5 )と 3， FosCBPzz (配列番号 3 6 )、 PCRプログラム CYC B 1 (表 1参照））によって DNAテンプレートを準備した。 MAテンプレートを R iboMAX ™ Large Scale RNA Production Systems (Promega)を用いて転写（37°C , 2h)を 行い、 ペイ ト c-Fos蛋白質の mRNAテンプレートを準備した。 共存させるペイ ト DNA は、 Fos/Junの結合配列を含む DNA-Fos/Jun (配列番号 3 7 )をテンプレートとし、 PCR(ブラィマー 5， DNA (配列番号 3 8 )と 3' DNA (配列番号 3 9 )、 PCRプログラム V- 2 (表 1参照））によって準備した。 The method for preparing the Pat C-Fos protein was as follows. pCMV- FosCBPzz vector PCR (primer 5 'SP6 (0 29) T7-FosCBPzz (SEQ ID NO: 35) and 3, FosCBPzz (SEQ ID NO: 36), PCR program using TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo) from (SEQ ID NO: 34) DNA template was prepared by CYC B 1 (see Table 1). The MA template was transcribed (37 ° C, 2h) using RiboMAX ™ Large Scale RNA Production Systems (Promega) to prepare an mRNA template for the patent c-Fos protein. The DNA to be co-existed was DNA-Fos / Jun (SEQ ID NO: 37) containing the Fos / Jun binding sequence as a template, and PCR (Breamer 5, DNA (SEQ ID NO: 38) and 3 ′ DNA (SEQ ID NO: 3) 9), prepared by PCR program V-2 (see Table 1)).
プレイのマウス脳 cDNAライブラリーの作成方法は以下の通りであった。 図 1に 従って IVVランダムライブラリーを作成した。 RNAライブラリ一として、 市販のマ ウス脳 （polyA+) RNAライブラリ一（組織抽出 RNAライブラリーを oligo dTカラム で精製したもの； clontech)を購入した。 アダプター設計は、 対応付け分子の形成 に適した 5' UTR配列（プロモー夕一 SP6+ェンハンサ一 029又は 0，：)をライブラリーに、 IVV形成に必要な配列として付加するための設計を行った。 マウス脳 (polyA+) RN Aライブラリ一には、 ェンハンサー 029をもつアダプターを使用した。 ェンハンサ 一 029用のアダプタ一の主鎖（配列番号 1 )と副鎖（gaattcgc )は、 各々 TEバッファ — ( lOmM Tris-Cl , ρΗδ. Ο, ImM EDTA)に溶解して； 100〃Μとし、 主鎖と副鎖をそれ それ ずつ等モルで混合する。 90°Cで 2分間加熱し、 70°Cで 5分加熱し、 60 °Cのウォー夕一バスにセヅトしてバスのヒ一夕一を切ってゆつくりと 60°Cから室 温まで下げる。 5〃1づつに分注して- 20°Cに保存する。 次に、 マウス脳（polyA+) RNAライブラリ一を一本鎖 DNAに逆転写する（図 1 , 1 )。 マウス脳（polyA+ ) RNAラ ィブラリー（1.4pmole/0.5 /g)を 0.5〃g、 3，ランダムプライマ一（配列番号 3 )を 2 pmolと DEPC水とを加えて 12.0 lとし、 70°Cで lOmin加熱し、 氷上で 1分間冷却し た。 これを用いて、 SuperScriptl l RT (Superscript Double Strand cDNA Synthesis Kit; Invitrogen)で 45°Cで Ih逆転写反応を行った。 次に、 逆転写反応で合成した一 本鎖 MAを全量用いて、 E. coli DNAリガーゼ、 E. coli ポリメラ一ゼ I、 および E. c ol i RNase H(SuperScript Double Strand cDNA Synthesis Kit; Invitrogen)で 160Cで 2h 反応し、 さらに T4 DNAポリメラーゼで 16°Cで 5minで末端を平滑化し、 二本鎖 DNA を合成した（図 1， 11 )。 次に、 この二本鎖 DNAの 5'末端がリン酸化されているこ とを利用して、 先に準備したアダプターを用いてライゲーシヨンした（図 1 , 111 )。 合成した二本鎖 DNAライプラリ一をエタノール沈殿し、 4〃1の DEPC水に溶解した。 これに、 100〃Mの準備したアダプタ一を 1.0〃1添加し、 50〃1 ligation high(T0 Y0B0)を加えて、 16°Cでオーバ一ナイ トで反応させ、 精製 (DNA purification kit ； QIAGEN)した後 50〃1とした。 次に、 PCR(EX Taq Hot Start Version; TaKaRa)を行 つた（図 1 , IV)。 50〃1のライゲ一シヨンした二本鎖 DNAライブラリーから 2〃1を テンプレートとして、 IVVに必要な特定配列（029)を持つ 5' PCRプライマ一（配列番 号 4 )と 3，PCRプライマ一 (配列番号 5 )を用いて、 IVV cDNAライブラリ一を作成し た。 PCRの条件は、 全量 100 z l、 22サイクル（94°Cで 30秒、 60°Cで 30秒、 72°Cで 90 秒を 1サイクルとし、 最後の伸長反応は、 72°Cで 180秒）とした。 The method of preparing the mouse brain cDNA library for prey was as follows. According to FIG. 1, an IVV random library was prepared. As a RNA library, a commercially available mouse brain (polyA +) RNA library (purified tissue extracted RNA library by oligo dT column; clontech) was purchased. The adapter was designed to add a 5 'UTR sequence (Promo-Yuichi SP6 + Enhansa-1 029 or 0, :) suitable for the formation of the assigning molecule to the library as a sequence required for IVV formation. For the mouse brain (polyA +) RNA library, an adapter having Enhancer 029 was used. The main chain (SEQ ID NO: 1) and the side chain (gaattcgc) of the adapter for Enhansa 029 are each dissolved in TE buffer — (10 mM Tris-Cl, ρΗδ.Ο, ImM EDTA); The main and side chains are mixed in equimolar amounts. Heat at 90 ° C for 2 minutes, then heat at 70 ° C for 5 minutes, set in a 60 ° C warm bath, cut off the bath overnight, and slowly cool down from 60 ° C to room temperature . Aliquot 5〃1 and store at -20 ° C. Next, the mouse brain (polyA +) RNA library is reverse transcribed into single-stranded DNA (Fig. 1, 1). 0.5 g of mouse brain (polyA +) RNA library (1.4 pmole / 0.5 / g), 3, 2 pmol of random primer (SEQ ID NO: 3) and 12.0 l of DEPC water to make 12.0 l, and lOmin at 70 ° C Heated and cooled on ice for 1 minute. Using this, an Ih reverse transcription reaction was performed at 45 ° C. using SuperScript II RT (Superscript Double Strand cDNA Synthesis Kit; Invitrogen). Next, E. coli DNA ligase, E. coli polymerase I, and E. coli RNase H (SuperScript Double Strand cDNA Synthesis Kit; Invitrogen) were used for the entire amount of single-stranded MA synthesized by the reverse transcription reaction. in 16 2h reaction 0 C, further blunt-ended at 5min at 16 ° C with T4 DNA polymerase to synthesize a double-stranded DNA (Fig. 1, 11). Next, confirm that the 5 'end of this double-stranded DNA is phosphorylated. Ligation was performed using the adapter prepared above (FIGS. 1, 111). The synthesized double-stranded DNA library was precipitated with ethanol and dissolved in 4 溶解 1 DEPC water. To this, add 1.0〃1 of the prepared adapter at 100〃M, add 50〃1 ligation high (T0Y0B0), react at 16 ° C overnight, and purify (DNA purification kit; QIAGEN ) And set to 50〃1. Next, PCR (EX Taq Hot Start Version; TaKaRa) was performed (Fig. 1, IV). From the 50〃1 ligated double-stranded DNA library, using 2〃1 as a template, the 5 'PCR primer (sequence number 4) with the specific sequence (029) required for IVV and 3, the PCR primer Using (SEQ ID NO: 5), an IVV cDNA library was prepared. PCR conditions: Total volume 100 zl, 22 cycles (30 cycles at 94 ° C, 30 seconds at 60 ° C, 90 seconds at 72 ° C, and a final extension reaction of 180 seconds at 72 ° C) And
これらペイ ト c-Fos蛋白質の mMAテンプレート、 プレイのマウス脳 cDNAライブ ラリー、 そして共存させるベイ ト MAを小麦の無細胞翻訳系 (Wheat Germ Extract (Promega))を用いて 50 / 1で共翻訳 (26°C, 60min)させた。 50〃 1のサンプルに対し、 IgG結合バッファ一 (lOmM Tris - Cl， pH8.0, 150mM NaCl, 0. 1% NP40) 50〃1を添 加し計 100 l (共翻訳サンプル） とした。 その後、 IgGァガロース（Sigma)を IgG結 合バッファーで 2回洗浄し、 これに共翻訳サンプル（100 / 1 )を加え、 4 °Cで 2時 間回転攪拌した。 結合バッファ一で 3回、 TEV切断バッファ一 （lOmM Tris-Cl, pH8.03 150mM NaCl, 0. 1% NP40, 0.5inM EDTA, ImM DTT) で 1回洗浄、 IgGァガロ —スに結合したペイ ト /プレイ複合体を TEVプロテア一ゼ（GIBC0- BRL)で切断した ( 1 6 °C、 2時間）。 さらに、 上清 90〃1を 300〃1 カルモジュリン結合バッファ一 と 0.3〃1 1M CaCl 2、 さらに、 500〃1カルモジュリン結合バッファ一で 2回洗浄 した 50 / 1 カルモジュリンビーズを加えて 4 °Cで 1時間回転攪拌した。 遠心後、 1000^ 1 カルモジュリン結合バッファーで 3回洗浄した。 50〃1カルモジュリン 溶出バッファーを加えて、 氷上で 1〜 2分放置し、 遠心後、 50〃1を回収した。 回収した溶液をテンプレートとして、 RT- PCR(One step RT-PCR kit (QIAGEN)、 プ ライマ一；配列番号 4と 5、 プログラム ； RT- QH30' (表 1参照））を行った。 この 操作（図 3 )を 3ラウンド繰り返した後のライブラリーをクローニングしてシ一ケ ンスした。 Co-translation of the mM cA-Fos protein mMA template, prey mouse brain cDNA library, and bait MA coexisting with wheat cell-free translation system (Wheat Germ Extract (Promega)) at 50/1 ( 26 ° C, 60min). To 50 サ ン プ ル 1 of the sample, 50〃1 of an IgG binding buffer (10 mM Tris-Cl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.1% NP40) was added to make a total of 100 l (cotranslation sample). Thereafter, IgG agarose (Sigma) was washed twice with an IgG binding buffer, a cotranslation sample (100/1) was added thereto, and the mixture was rotated and stirred at 4 ° C for 2 hours. Wash three times with binding buffer and one time with TEV cleavage buffer (10 mM Tris-Cl, pH 8.0 3 150 mM NaCl, 0.1% NP40, 0.5 inM EDTA, ImM DTT), and combine with IgG agarose. The pre / play complex was cut with TEV protease (GIBC0-BRL) (16 ° C, 2 hours). Further, add 90/1 of supernatant to 300〃1 calmodulin binding buffer and 0.3〃1 M CaCl 2 , and then add 50/1 calmodulin beads washed twice with 500〃1 calmodulin binding buffer. Stirred for hours. After centrifugation, the plate was washed three times with 1000 ^ 1 calmodulin binding buffer. 50〃1 Calmodulin elution buffer was added, left on ice for 1-2 minutes, and centrifuged to collect 50、1. Using the recovered solution as a template, RT-PCR (One step RT-PCR kit (QIAGEN), primer 1; SEQ ID NOs: 4 and 5, program; RT-QH30 '(see Table 1)) was performed. After repeating this operation (FIG. 3) three rounds, the library was cloned and sequenced.
以上から、 本発明のライブラリ一は、 ライブラリ一として非常に質が高いこと、 および、 IWのライブラリーとして利用できることが証明された。 From the above, the library of the present invention has a very high quality as a library, And it proved to be usable as an IW library.
表 1 プログラム名： CYCB1 Table 1 Program name: CYCB1
反応条件： Reaction conditions:
95°C 1 min 95 ° C 1 min
15サイクル15 cycles
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4°C ポーズ プログラム名 ： V - 2 4 ° C Pause Program name: V-2
反応条件： Reaction conditions:
35サイクル35 cycles
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4°C ポーズ プログラム名 RT-QH30' 4 ° C pause Program name RT-QH30 '
反応条件： Reaction conditions:
60°C 30 min 60 ° C 30 min
95°C 15 min 95 ° C 15 min
94°C 30 sec 94 ° C 30 sec
60°C 30 sec 1st- 2ndラウンド： 32サイクル， 3rdラウンド： 30サイクル 72 °C 3 min 60 ° C 30 sec 1st-2nd round: 32 cycles, 3rd round: 30 cycles 72 ° C 3 min
72°C 10 min 実施例 2 IVVランダムブライミングライブラリ一の作成 72 ° C 10 min Example 2 Preparation of IVV random priming library
実施例 1において、 配列番号 5の 3， PCRプライマーの代わりに、 配列番号 4 0 の 3， PCRプライマーを使用する他は、 実施例 1と同様に IVVランダムプライミング ライブラリ一の作成および評価を行った。 この結果、 実施例 1と同様の結果が得 られた。 実施例 3 IVVランダムプライミングラィブラリ一の作成 In Example 1, an IVV random priming library was prepared and evaluated in the same manner as in Example 1, except that the PCR primer of SEQ ID NO: 40 was used instead of the PCR primer of SEQ ID NO: 5 . As a result, the same result as in Example 1 was obtained. Example 3 Preparation of IVV random priming library
実施例 2において、 ェンハンサ一 029用のアダプタ一の主鎖および副鎖として、 配列番号 1および gaattcgcの代わりに配列番号 4 1および ggaattcgの配列を有す るものを使用する他は、 実施例 2と同様に IVVランダムプライミングライブラリ 一の作成および評価を行った。 この結果、 実施例 1と同様の結果が得られた。 産業上の利用分野  Example 2 was repeated except that the main chain and the subchain of the adapter for Enhansa-1 029 were replaced with those having the sequences of SEQ ID NO: 41 and ggaattcg instead of SEQ ID NO: 1 and gaattcgc. IVV random priming library 1 was prepared and evaluated in the same manner as described above. As a result, the same result as in Example 1 was obtained. Industrial applications
本発明によれば、 IVVのセレクション/スクリーニングに用いるライブラリーと その製法が提供される。 従来、 ランダムプライマ一によるライブラリー作成では、 平均長が短くなる問題がある。 また、 クロ一ニングを介在する作成方法の場合、 元の RNAライブラリーの規模や質を下げる問題がある。 本発明では、 二本鎖 DNAを 合成する際に Klenowフラグメントで 5'側ランダムプライマ一を使用する方法 (Hammond, P.W., Alpin, J., Rise, C.E., Wright, M.C and Kreider, B.L. 2001. In vitro selection and characterization of Bcl-XL binding proteins from a mix of tissue-specific mRNA display libraries. J. Biol. Chem. 276: 20898-20906.)の代わりに、 RNase H, DNA ポリメラ一ゼ I， そして DNAリガ一ゼ存在下で二本鎖 DNAを合成すると、 合成され た相補鎖のみがリン酸化されていることを利用して、 アダプターを相補鎖にライ ゲ一シヨンすることで、 DNA鎖の方向性を定めると同時に、 平均長が短くなるこ とも回避し、 このライゲ一シヨンした相補鎖 DNAを PCRのテンプレートとし、 クロ 一二ングを介さず直接 PCRにより cDNAライブラリ一を作成するため、 元の RNAライ ブラリーの規模や質を損なわないランダムプライミングライブラリーが提供可能 となる。 また、 クロ一ニングが必要な従来法に比べて、 ライブラリ一作成作業は 1ヶ月から 3日へ 1/10に短縮される。  According to the present invention, a library used for IVV selection / screening and a method for producing the same are provided. Conventionally, when creating a library using random primers, there is a problem that the average length becomes short. In addition, in the case of the production method involving cloning, there is a problem that the size and quality of the original RNA library are reduced. In the present invention, a method of using a 5 ′ random primer with a Klenow fragment when synthesizing double-stranded DNA (Hammond, PW, Alpin, J., Rise, CE, Wright, MC and Kreider, BL 2001. In In vitro selection and characterization of Bcl-XL binding proteins from a mix of tissue-specific mRNA display libraries. J. Biol. Chem. 276: 20898-20906.) instead of RNase H, DNA polymerase I, and DNA ligase. When synthesizing double-stranded DNA in the presence of enzyme, utilizing the fact that only the synthesized complementary strand is phosphorylated, the adapter is ligated to the complementary strand, and the orientation of the DNA strand is changed. At the same time, to avoid shortening the average length, use the ligated complementary strand DNA as a template for PCR, and create a cDNA library directly by PCR without cloning. Random without compromising the size and quality of the burrary A priming library can be provided. In addition, compared to the conventional method that requires cloning, the time required to create a library is reduced to 1/10 from one month to three days.
クローニングを介さない方法においては、 テンプレート作成のためのランダム プライマ—を 5'および 3，末端の両端に用いるためにライブラリ一の平均長が短く なる問題があつたが、 本発明では、 ランダムプライマ一（特定配列を持つァダプ 夕一付き）を最初の RNAライブラリーからの逆転写時のみに用いて、 二本鎖 DNAと する際には用いないで、 アダプターをライゲーシヨンする方法を採用する。 二本 鎖 DNAとしたときの相補鎖 DNAのみが 5'がリン酸化されていることを利用して、 特 定配列を持つリン酸化されていないアダプタ一をライゲーシヨンすることで（こ こでは、 ライゲ一シヨン効率が高い DNAリガーゼを用い、 PCRテンプレートの方向 性を定めるために、 長さの短い配列をハイプリダイゼ一シヨンした一部二本鎖の アダプタ一を用いる。 ）、 平均長が短くなることを回避し、 かつライゲ一シヨン の際の副産物も少なく質の良い PCRのテンプレートを作成することで、 質の高い ライブラリ一を実現できる。 In the method that does not involve cloning, there was a problem that the average length of the library was shortened because random primers for template creation were used at both ends of 5 'and 3 , and the random primer was used in the present invention. Use the adapter (with the specific sequence) with the adapter only at the time of the reverse transcription from the first RNA library and not with the double-stranded DNA, but ligate the adapter. By taking advantage of the fact that only complementary strand DNA is double-stranded at the 5 ' By ligating a non-phosphorylated adapter having a constant sequence (here, DNA ligase with high ligation efficiency is used, and in order to determine the direction of the PCR template, a short sequence is used for hybridization. Use a partially double-stranded adapter that has been subjected to shrinking.), Avoiding shortening of the average length, and producing high-quality PCR templates with few by-products during ligating The library can be realized.
一方、 ランダムプライミングによる対応付けライブラリ一を作成する際のラィ ブラリーの質を左右する他の要因としては、 ライブラリ一のテンプレートの中で 対応付け分子を形成できるテンプレートの存在率を向上させることが考えられる。 この場合、 フレームのズレが 1/3、 5，UTR/(mF/3，UTRの 3領域の枠組みのズレが 1/ 3、 さらに、 表と裏で 1/2なので、 組み合わせると 1/18の確率となる。 さらに、 ラ ィブラリーの作成にクローニングを介すると、 ベクターへのライゲーシヨンでバ ィヤスがかかり、 元のライブラリーの質を保つことは難しい。 本発明では、 クロ 一二ングを介することがないために元のライブラリーの質を保つことが容易にな り、 かつライブラリーの規模はクロ一ニングを介して細胞を用いた場合は 108/ml であるのに対して試験管内で作成するので 101 4/mlが実現できるため、 最終的に ライブラリーのテンプレートの中で対応付け分子を形成できるテンプレートの量 は大幅に増加し、 極微量存在しているテンプレートでもスクリーニングゃセレク ションの際の RT- PCRで増幅可能なライブラリ一が作成できることになる。 On the other hand, another factor that affects the quality of the library when creating a mapping library by random priming is to improve the abundance of templates that can form mapping molecules in the templates of the library. Can be In this case, the frame misalignment is 1/3, 5, UTR / (mF / 3, UTR, the frame misalignment is 1/3, and the front and back are 1/2. In addition, if cloning is used to create a library, it is difficult to maintain the quality of the original library by ligating to the vector, and in the present invention, it is possible to use the cloning. , Making it easier to maintain the quality of the original library, and making the library in vitro, compared to 10 8 / ml when using cells via cloning. since the 10 1 4 / ml can be achieved because the amount of template that can form the assigning molecule in the final library template greatly increased, screening Ya selector Deployment in template that trace amounts present Amplifiable library one is able to create in Bruno RT- PCR.

Claims

請求の範囲 The scope of the claims
1 . RNA又は mRNAライブラリーから、 ランダムプライマーで逆転写により一 本鎖 DNAを形成し、 さらに該一本鎖 DNAを錶型として、 該一本鎖 DNAの相補鎖 DNAの 5，末端のみがリン酸化されている二本鎖 DNAライブラリーを形成し、  1. A single-stranded DNA is formed from the RNA or mRNA library by reverse transcription using random primers, and the single-stranded DNA is formed into a type III, and only the 5'-end of the complementary strand DNA of the single-stranded DNA is phosphorylated. Form an oxidized double-stranded DNA library,
該ニ本鎖 DNAライブラリーと、 末端がリン酸化されていない核酸からなるァダ プ夕一とをライゲーシヨンしてライゲ一テッド二本鎖 DNAラィブラリ一を形成し、 該ライゲーテヅドニ本鎖 DNAライブラリーをテンプレートとして、 対応付け分 子の形成に必要な配列を持つプライマ一を用いた PCRにより、 対応付け分子 cDM ライブラリ一を作成する  The double-stranded DNA library is ligated with an adapter consisting of a nucleic acid whose terminal is not phosphorylated to form a ligated double-stranded DNA library, and the ligated double-stranded DNA library is obtained. Create a mapping molecule cDM library by PCR using a primer having a sequence necessary for the formation of a mapping molecule as a template
ことを含む対応付け分子 cDNAライブラリ一の製造方法。  And a method for producing a cDNA library.
2 . アダプタ一が二本鎖であり、 ライゲ一シヨンされる本鎖とライゲーショ ンされない副鎖からなる請求項 1の製造方法。  2. The method of claim 1, wherein the adapter is double stranded and comprises a ligated main strand and a non-ligated sub-chain.
3 . 副鎖が本鎖よりも鎖長が短い請求項 2記載の製造方法。  3. The production method according to claim 2, wherein the side chain has a shorter chain length than the main chain.
4 . 一本鎖 DNAの相補鎖 MAの 5'末端のみがリン酸化されている二本鎖 DNAラ イブラリーを、 一本鎖 DMを鎵型として、 RNase H、 DNAポリメラーゼ Iおよび DM リガーゼ存在下で形成する請求項 1〜 3のいずれか 1項に記載の製造方法。  4. A double-stranded DNA library in which only the 5 'end of the complementary strand MA of single-stranded DNA is phosphorylated, using single-stranded DM as type III, in the presence of RNase H, DNA polymerase I and DM ligase. The production method according to any one of claims 1 to 3, which is formed.
5 . 対応付け分子 cDNAライブラリ一を構成する cDNAが、 5'末端にプロモータ —とェンハンサーを有する配列を含み、 3，末端にライゲーシヨンのァクセプ夕ー 配列を含む請求項 1〜 4のいずれか 1項に記載の製造方法。  5. The cDNA constituting the associating molecule cDNA library comprises a sequence having a promoter and an enhancer at the 5 'end, and a ligation lactose sequence at the end. The method according to 1.
6 . プロモー夕一配列が SP6プロモータ一で、 ェンハンサー配列がオメガ配 列又はオメガ配列の一部であり、 ァクセプ夕ー配列が 2〜1 0塩基のポリ A配列 である請求項 5記載の製造方法。  6. The production method according to claim 5, wherein the promoter sequence is the SP6 promoter, the enhancer sequence is an omega sequence or a part of the omega sequence, and the exceptor sequence is a poly A sequence of 2 to 10 bases. .
7 . 請求項 1〜 6のいずれか 1項に記載の製造方法により得られる対応付け 分子 cDNAライブラリ一を転写することを含む、 対応付け分子 RNAライブラリーの 製造方法。  7. A method for producing an associating molecule RNA library, comprising transcribing an associating molecule cDNA library obtained by the production method according to any one of claims 1 to 6.
8 . 請求項 7に記載の製造方法により得られる対応付け分子 RNAライブラリ 一を構成する対応付け分子 RNAの 3'末端にスぺーサーをライゲーシヨンすること を含む、 対応付け分子ライゲーテッ ド RNAラィブラリ一の製造方法。  8. A ligated RNA library, comprising ligating a spacer to the 3 'end of the mapping molecule RNA constituting the mapping molecule RNA library obtained by the production method according to claim 7. Production method.
9 . スぺーサ一が、 対応付け RNA分子にライゲ一シヨンする末端の反対の末 端にピューロマイシン又はピュ一ロマイシン誘導体を有し、 かつ、 塩基配列で 10 -lOObp相当の長さを持ち、 該スぺ一サ一は、 該ピュ一ロマイシン又はピューロマ イシン誘導体を介して、 該対応付け分子ライゲ一テツド RNAライブラリ一のテン プレートから翻訳された蛋白質と連結するものである請求項 8記載の製造方法。 9. The spacer is opposite the end that ligates to the associating RNA molecule. Having a puromycin or puromycin derivative at its end and having a length equivalent to 10-lOObp in the nucleotide sequence, and the spacer having the puromycin or puromycin derivative through the puromycin or puromycin derivative; 9. The production method according to claim 8, which is linked to a protein translated from a template of an attached molecular RNA library.
1 0 . 該スぺ一サ一が、 該対応付け分子ライゲーテヅ ド RNAライブラリーか ら翻訳された蛋白質と連結しないものである請求項 8記載の製造方法。  10. The production method according to claim 8, wherein the spacer is not linked to a protein translated from the assigning molecule ligated RNA library.
1 1 . 請求項 7に記載の製造方法により得られる対応付け分子 RNAライブラ リ一を無細胞翻訳系で翻訳して蛋白質を形成することを含む、 蛋白質ランダムプ ライミングライブラリ一の製造方法。  11. A method for producing a protein random priming library, comprising translating an assigning molecule RNA library obtained by the production method according to claim 7 with a cell-free translation system to form a protein.
1 2 . 請求項 8又は 9に記載の製造方法で得られる対応付け分子ライゲ一テ ッ ド RNAライブラリーを無細胞翻訳系で翻訳して対応付け分子を形成することを 含む、 対応付け分子ランダムプライミングライブラリーの製造方法。  12. An assigning molecule random, comprising: translating an assigning molecule ligated RNA library obtained by the production method according to claim 8 or 9 with a cell-free translation system to form an assigning molecule. A method for producing a priming library.
1 3 . 請求項 8又は 1 0に記載の製造方法で得られる対応付け分子ライゲー テツ ド RNAライブラリ一を無細胞翻訳系で翻訳して蛋白質を形成することを含む、 蛋白質ランダムプライミングライプラリーの製造方法。  13. Production of a protein random priming library including translating an assigning molecule ligated RNA library obtained by the production method according to claim 8 or 10 with a cell-free translation system to form a protein. Method.
1 . 請求項 7に記載の製造方法で得られる対応付け分子 RNAライブラリー を細胞内で翻訳して蛋白質を形成する'ことを含む、 蛋白質ランダムプライミング ライブラリーの製造方法。  1. A method for producing a protein random priming library, comprising: 'translating an assigning molecule RNA library obtained by the production method according to claim 7 in a cell to form a protein'.
1 5 . 請求項 8又は 9に記載の製造方法で得られる対応付け分子ライゲーテ ッ ド RNAライブラリーを細胞内で翻訳して対応付け分子を形成することを含む、 対応付け分子ランダムプライミングライプラリ一の製造方法。  15. An assigning molecule random priming library comprising translating an assigning molecule ligated RNA library obtained by the production method according to claim 8 or 9 in a cell to form an assigning molecule. Manufacturing method.
1 6 . 請求項 8又は 1 0に記載の製造方法で得られる対応付け分子ライゲー テツ ド RNAライプラリーを細胞内で翻訳して蛋白質を形成することを含む、 蛋白 質ランダムプライミングライブラリーの製造方法。  16. A method for producing a protein random priming library, comprising translating an assigning molecule ligated RNA library obtained by the production method according to claim 8 or 10 into cells to form a protein.
1 7 . 該蛋白質を C末端ラベル化法で修飾することを含む、 請求項 1 1、 1 3、 1 4又は 1 6に記載の製造方法。  17. The production method according to claim 11, 13, 14, or 16, comprising modifying the protein by a C-terminal labeling method.
1 8 . 核酸のライブラリ一と蛋白質との相互作用を解析する蛋白質と核酸の 相互作用解析方法であって、 ライプラリーが、 請求項 1、 5、 7〜1 0のいずれ か 1項に記載の製造方法で得られるライブラリ一である前記方法。 18. A method for analyzing the interaction between a protein and a nucleic acid, which analyzes the interaction between a library of nucleic acids and a protein, wherein the library is a method according to any one of claims 1, 5, 7 to 10. The above method, which is a library obtained by the method.
1 9 . 蛋白質のライブラリーと蛋白質との相互作用を解析する蛋白質間相互 作用解析方法であって、 ライブラリーが、 請求項 1 7に記載の製造方法で得られ るライブラリ一である前記方法。 19. A protein-protein interaction analysis method for analyzing an interaction between a protein library and a protein, wherein the library is one of the libraries obtained by the production method according to claim 17.
2 0 . 対応付け分子のライブラリーと蛋白質との相互作用を解析する蛋白質 間相互作用解析方法であって、 ライプラリーが、 請求項 1 2又は 1 5に記載の製 造方法で得られるライブラリ一である前記方法。  20. A protein-protein interaction analysis method for analyzing the interaction between a library of assigning molecules and a protein, wherein the library is a library obtained by the production method according to claim 12 or 15. One such method.
2 1 . 相互作用が共翻訳スクリーニング法により解析される、 請求項 2 0記 載の方法。  21. The method of claim 20, wherein the interaction is analyzed by a co-translation screening method.
2 2 . ライプラリーのスクリーニングを含む進化分子工学による機能蛋白質 の創製方法であって、 ライブラリ一が、 請求項 1 2又は 1 5に記載の製造方法に より得られるライブラリ一である前記方法。  22. A method for creating a functional protein by evolutionary molecular engineering including screening of libraries, wherein the library is the library obtained by the production method according to claim 12 or 15.
2 3 . 請求項 2 0に記載の蛋白質間相互作用解析方法を行い、 ついで、 請求 項 1 9又は 2 0に記載の該蛋白質間相互作用解析方法を行うことを含む、 蛋白質 間相互作用解析方法。  23. A method for analyzing protein-protein interaction, comprising: performing the method for analyzing protein-protein interaction according to claim 20; and then performing the method for analyzing protein-protein interaction according to claim 19 or 20. .
' 2 4 . 請求項 2 1に記載の該蛋白質間相互作用解析方法を行い、 ついで、 請 求項 1 9又は 2 0に記載の該蛋白質間相互作用解析方法を行うことを含む、 蛋白 質間相互作用解析方法。  24. Performing the method for analyzing protein-protein interaction according to claim 21; and performing the method for analyzing protein-protein interaction according to claim 19 or 20. Interaction analysis method.
2 5 . 請求項 2 2に記載の該機能蛋白質の創製方法を行い、 ついで、 請求項 1 9又は 2 0に記載に記載の該蛋白質間相互作用解析を行うことを含む蛋白質の 創製方法。  25. A method for creating a protein, comprising: performing the method for creating a functional protein according to claim 22; and then performing the protein-protein interaction analysis according to claim 19 or 20.
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