WO2003106689A1

WO2003106689A1 - 光学活性α−メチルシステイン誘導体の製造方法

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Publication number: WO2003106689A1
Application number: PCT/JP2003/007108
Authority: WO
Inventors: 孝洋大石; 難波　弘憲; 昌信菅原; 将司泉田; 本田　達也; 耕平森; 恵広柳澤; 長嶋　伸夫; 井上　健二
Original assignee: 鐘淵化学工業株式会社
Priority date: 2002-06-05
Filing date: 2003-06-05
Publication date: 2003-12-24
Also published as: CA2486350A1; KR20050010826A; US20130261331A1; JP5096435B2; JP2009292842A; JPWO2003106689A1; US20100197934A1; EP2287152A3; EP1550725A1; US8993800B2; EP1550725A4; JP4485941B2; US20060105435A1; EP2287152A2; EP2287152B1; AU2003242072A1

Abstract

　本発明は、医薬品等の中間体として有用な、Ｌ体又はＤ体の光学活性α−メチルシステイン誘導体又はその塩を、安価で入手容易な原料から、簡便かつ工業的に製造する方法を提供する。　本発明は、ラセミ体Ｎ−カルバモイル−α−メチルシステイン誘導体又はその塩をヒダントイナーゼによってＤ体選択的に環化させて、Ｄ−５−メチル−５−チオメチルヒダントイン誘導体又はその塩及びＮ−カルバモイル−α−メチル−Ｌ−システイン誘導体又はその塩とし、次いで、それぞれのアミノ基、硫黄原子の脱保護及び加水分解を行うことによる、Ｌ体又はＤ体の光学活性α−メチルシステイン誘導体又はその塩の製造方法である。

Description

明細書

光学活性 α ン誘導体の製造方法

技術分野

本発明は、医薬品等の中間体として有用な、光学活性な L体又は D体の Q；—メン誘導体又はその塩の製造方法に関する。

背景技術

光学活性な L体又は D体のひ一メチルシスティン誘導体又はその塩の製造方法としては、以下の様な方法が知られている。

1 ) 光学活性システィンとピバルアルデヒドょり得られる光学活性チアゾリジン化合物への不斉メチル化による方法 (WOO 1/72702) 。

2) 光学活性ァラニンとベンズアルデヒドより得られる光学活性ォキサゾロン化合物への不斉チオメチル化による方法（J. O r g. Ch em. ， 1996， 6 1， 33 50〜 3357) 。

3) システィンとシァノベンゼンより得られるチアゾリン化合物のメチル化を行い、得られたラセミ体のチアゾリン化合物をキラル H P L Cにて分離精製する方法（S y n l e t t. , 1 994, 9， 702— 704) 。

4) 光学活性パリンとァラニンより合成される光学活性ジケトピぺラジン化合物を不斉ブロモメチル化し、得られた化合物の臭素原子をアルカリ金属アルキルチォラートで置換する方法（S y n t h e s i s， 1 983， 3 7〜38) 。

5) 2—メチルー 2—プロペン一 1—オールのシャープレス不斉酸化により得られる光学活性な 2ーメチルダリシドールから光学活性アジリジンを合成し、これにチオールを反応させる方法（J. O r g. Ch em. ， 1995, 60， 79 0〜 79 1 ) 。

6) ァミノマロン酸誘導体をメチル化した後に、豚肝臓エステラーゼ（以下 PL Eと略す）による非対称化を行い、得られた非対称エステルをチォ酢酸アルカリ金属塩と反応させる方法（ J. Am. Ch em. S o c. , 1 993, 1 15， 8449〜 8450) 。しかしながら、上記 1 ) 〜 4 ) の方法はいずれも、ブチルリチウム等の高価な塩基を用いた低温反応が必要である。 5 ) の方法では、工程数が長くて煩雑であり高価な試薬を多く使う必要がある。 6 ) の方法ではエステラーゼとして P L E を用いたジエステルの非対称化をキーとしているが、 P L Eは大量生産が困難であるため工業的規模での安定確保は難しく、実用的とは言い難い。このように、いずれの方法においても光学活性メチルシスティン誘導体又はその塩の工業的製造方法としては解決すべき課題を有している。

また、上記のような方法を経て得られる、光学活性メチルシスティン誘導体は必要に応じて、適切に脱保護を行い、光学活性 α—メチルシスティン又はその塩とすることができる。そこで得られた光学活性ひ一メチルシスティン又はその塩の単離精製法としては、晶析による方法が好ましいと考えられる。しカゝし、光学活性 a—メチルシスティン又はその塩を結晶として晶析単離取得した例は知られていない。わずかに、単離された例としては、前記 WO O 1 / 7 2 7 0 2等に記載があるにすぎない。これらは、光学活性 α—メチルシスティン誘導体であるチァゾリジン化合物を塩酸により脱保護し、得られた光学活性ひ一メチルシスティン又はその塩の水溶液を濃縮して固化させ、場合によっては、有機溶媒にて洗浄して単離する方法である。しかしながら、我々が、この方法に従い該化合物の単離を行ったところ、水溶液を濃縮するにつれ、固体が析出すると共に含水した大きな塊状となり、攪拌が不良となることが判明した。また、引き続き濃縮操作を行っても、固体が壁面に強固に付着し流動性の全くない状態となった。したがつて、水溶液を濃縮して乾固させ固体を析出させることですら、工業的操作としては不具合があるうえに、濃縮するにつれ塊状化する傾向があることから、晶析液の攪拌や固体の取り出しが困難であると考えられる。以上のことから、前記 WO 0 1 / 7 2 7 0 2等に記載の単離方法も、工業的生産に適した方法とは言い難い。さらに、光学活性メチルシスティン誘導体を脱保護し、得られる光学活性 α— メチルシスティン又はその塩に、例えば反応若しくは中和等の後処理工程上、難溶性無機塩等が副生、混入する場合には、上述の従来法ではそれら無機塩を除去することは全くできない。

また、 a—メチルシスティン及びその塩は、酸化に対して不安定で 2量化しジスルフイドになりやすい。例えば、類似構造を有するシスティンの場合、シスチンへの 2量化は速やかに進行する（「タンパク質化学 1、アミノ酸'ペプチド」共立出版、 3 2 6ページ）。本化合物においても 2量化が進行し、しかもジスルフィド体が一且生成するとその除去は容易ではなく、製品中への混入を避けることは難しい。故に、ジスルフイド体の生成及び混入を高度に抑制したプロセスの構築も重要である。

このように、工業的に実施可能な、高品質の光学活性 α—メチルシスティン及びその塩を好適に結晶として晶析取得する方法の確立が強く望まれていた。ところで、光学活性 α _メチルシスティン誘導体を簡便に製造するための従来技術とは異なる方法論の 1つとして、ラセミ体の α—メチルシスティン誘導体を酵素的に分割して光学活性な α—メチルシスティン誘導体へと導く方法が考えられる。本方法論を実現するためには、光学分割に供するラセミ体ひ一メチルシスティン誘導体の製造方法、並びに、高い光学分割能力を有する酵素反応の確立が重要である。さらには、酵素的光学分割に供するラセミ体 α _メチルシスティン誘導体の選定も大きなポイントとなる。

酵素的光学分割を用いる方法を実現するうえで、基質となるラセミ体 _α—メチルシスティン誘導体は、簡便かつ効率的に製造できること、酵素の基質特異性に適合し、かつ高い立体選択性を得るための適切な保護基あるいは補助基を有すること、更には、酵素反応後に前記保護基あるいは補助基が簡単に除去できること、が要求される。このような観点からは、好適なラセミ体 α—メチルシスティン誘導体として、 Ν—力ルバモイルー α—メチルシスティン誘導体を挙げることができる。

古くから、ヒダントインの開環加水分解酵素として知られているヒダントイナーゼは、 Ν—力ルバモイルー α—アミノ酸を対応する 5—置換ヒダントインに変換する逆反応も触媒することが知られており、当該酵素を用いてラセミ体の Ν _ 力ルバモイルーひ一メチルシスティン誘導体のうち、一方の光学異性体のみを選択的にヒダントインに変換し、光学分割することが期待される。光学分割で得られた光学活性 Ν—力ルバモイル— «—メチルシスティン誘導体は、脱力ルバモイル化して容易に光学活性ひ一メチルシスティン誘導体に変換できる。一方、光学分割のもう一方の生成物である光学活性 5—メチルー 5—チオメチルヒダントイン誘導体は、光学活性 _α—メチルシスティン誘導体の等価体であり、開環加水分解おょぴ脱力ルバモイル化を経て光学活性 α_メチルシスティン誘導体（光学分割で直接得られるものとは逆の立体を有する）に導くことができる。

ラセミ体 Ν—力ルバモイルー α—メチルシスティン誘導体は、一般的なァミノ酸の化学的合成法と Ν—力ルバモイル化反応とを組み合わせて製造することができるが、ラセミ体の Ν—力ルバモイルー α—メチルシスティン誘導体を短工程かつ高収率で製造する方法は、未だ確立されていない。

—般的なラセミ体 Ν—力ルバモイルーひ一二置換アミノ酸の製造方法としては、 Bu c h e r e r法により、アセトン誘導体をラセミ体 5, 5—二置換ヒダントインに変換した後、これを加水分解することによりラセミ体 α—二置換アミノ酸誘導体とし（Ag r. B i o l . Ch em. ， 1 971, 35, 53— 58) 、次いでシァン酸カリウムで処理して N—力ルバモイル化する方法が知られている。しかしながら、この方法では、ラセミ体 5， 5—二置換ヒダントインのウレィレン基（一NHCONH—）をラセミ体 N—力ルバモイルー c¾—二置換アミノ酸誘導体のウレイド基（力ルバモイルァミノ基：一 NHCONH₂) として有効に利用することができず、また、 3工程を要するなど、効率的な方法とは言い難い。一方、ヒダントイン類を加水分解し、アミノ酸を経由せず力ルバモイル体を製造する方法としては、塩基として水酸化カルシウムを用いて加水分解する方法が知られている（US 5338859) 。し力しながら、我々が、本特許記載の方法により、ラセミ体 N—力ルバモイル一一メチルシスティン誘導体の製造を試みたところ、わずか 25%の収率でしか目^の化合物が得られないことがわかつた。即ち、少ない工程で効率的に、かつ、高収率でラセミ体 N—力ルバモイルー ο;—二置換アミノ酸誘導体、特にはラセミ体 Ν—力ルバモイルー α—メチルシスティン誘導体を製造する方法は確立されていない。

一方、ラセミ体 Ν—力ルバモイルー α—メチルシスティン誘導体の酵素的光学分割に関しては、特開平 1— 1 24398号公報には、ラセミ体 Ν—力ルバモイルーァミノ酸誘導体にヒダントイナーゼを作用させ立体選択的に環化することにより分割を行う方法が記されているが、 Ν—力ルバモイルーひ一メチルシスティン誘導体の反応の可能性については、記載も示唆もない。発明の要約

上記に鑑み、本発明の目的は、医薬品等の中間体として有用な、光学活性な L 体又は D体の α—メチルシスティン誘導体又はその塩を、安価で入手容易な原料から簡便に製造でき、工業的生産に対して実用的な方法を提供することにある。本発明者等は上記に鑑み鋭意検討を行った結果、ラセミ体 Ν—力ルバモイルー α—メチルシスティン誘導体又はその塩にヒダントイナーゼを作用させることにより D体選択的に環化させ、 D— 5—メチルー 5—チオメチルヒダントイン誘導体又はその塩及び Ν—力ルバモイル— _α—メチル一 L—システィン誘導体又はその塩とし、次いで Ν—力ルバモイルー α—メチル一L一システィン誘導体又はその塩の脱力ルバモイル化と硫黄原子の脱保護を行うことによりひーメチルー L— システィン誘導体又はその塩を得る方法を見出した。

また、 D— 5—メチルー 5ーチオメチルヒダントイン誘導体又はその塩の加水分解及び硫黄原子の脱保護を行うことによ.り、ひーメチルー D—システィン誘導体又はその塩を得る方法を見出した。さらには、上記方法の原料となるラセミ体 Ν—力ルバモイルーひ一メチルシスティン誘導体を簡便かつ高収率で製造する方法も確立し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、一般式（1 ) ：

(式中、 R ¹は置換基を有していても良い炭素数 1 〜 2 0のアルキル基、置換基を有していても良い炭素数 7〜 2 0のァラルキル基、又は、置換基を有していても良い炭素数 6 ~ 2 0のァリール基を表す）で表されるラセミ体 Ν—力ルバモイルーひ一メチルシスティン誘導体又はその塩に、ヒダントイナーゼを作用させ D 体選択的に環化させることを特徴とする、一般式（2 ) ：

(式中、 R ¹は前記と同じ）で表される D— 5—メチルー 5—チオメチルヒダントイン誘導体又はその塩、及び、一般式（3 ) ：

(式中、 R ¹は前記と同じ）で表される N—力ルバモイルーひ一メチルー Lーシスティン誘導体又はその塩の製造方法に関する。

また、本発明は、前記 N—力ルバモイル一a—メチルー L—システィン誘導体

( 3 ) 又はその塩を脱力ルバモイル化し、必要に応じて硫黄原子の脱保護を行うことを特徴とする、一般式（4 ) ：

H₂

(⁴)

(式中、 R ²は前記 R ¹若しくは水素原子を表す）で表される a—メチル一L _ システィン誘導体又はその塩の製造方法に関する。

また、本発明は、前記式（3 ) において R ¹が炭素数 4〜1 5の 3級アルキル基である N—力ルバモイルー a—メチル一L一システィン誘導体又はその塩を酸で処理することにより、脱力ルバモイル化と硫黄原子の脱保護を同時に行うことを特徴とする、一般式（5 ) ：

H

(⁵)

で表される a—メチルー L一システィン又はその塩の製造方法に関する。

また、本発明は、前記 N—力ルバモイル一a—メチルー L—システィン誘導体 (3) 又はその塩の、環化及び硫黄原子の脱保護を行うことを特徴とする、一般式（6) ：

（⁶)

で表される L一 5ーメチルー 5ーチオメチルヒダントイン又はその塩の製造方法、また、 N—力ルバモイルーひ一メチル一L一システィン誘導体（3) 又はその塩を環化して、一般式（7) ：

）

(式中、 R¹は前記と同じ）で表される L— 5—メチルー 5—チオメチルヒダントイン誘導体又はその塩とし、次いで酸で処理することにより硫黄原子の脱保護を行うことを特徴とする L一 5—メチル一5—チオメチルヒダントイン (6) 又はその塩の製造方法に関する。

また、本発明は、前記 D— 5—メチルー 5—チオメチルヒダントイン誘導体（ 2) 又はその塩を加水分解し、必要に応じて硫黄原子の脱保護を行うことを特徴とする、一般式（8) ：

H₂IST 、COOH (⁸)

(式中、 R ²は前記と同じ）で表されるメチル一D—システィン誘導体又はその塩の製造方法に関する。

また、本発明は、前記式（2) において R¹が炭素数：〜 15の 3級アルキル基である化合物を、酸で処理することにより加水分解反応と硫黄原子の脱保護を同時に行うことを特徴とする、一般式（9) ：

で表される α—メチル一D—システィン又はその塩の製造方法に関する。

また、本発明は、前記式（8) において R²が R¹と同じである α—メチルー D—システィン誘導体又はその塩を力ルバモイル化し、一般式（10) ：

(式中、 R¹は前記と同じ）で表される Ν—力ルバモイル一a—メチルー D—システィン誘導体又はその塩とし、次いで、環化及び硫黄原子の脱保護を行うことを特徴とする、下記式（1 1) ：

H

で表される D— 5—メチルー 5—チオメチルヒダントイン又はその塩の製造方法に関する。

また、本発明は、前記式（2) で表される化合物を酸で処理することにより、硫黄原子の脱保護を行うことを特徴とする、前記式（1 1) で表される D— 5— メチル一 5ーチオメチルヒダントイン又はその塩の製造方法に関する。これら光学活性 5—メチルー 5—チオメチルヒダントイン誘導体又はその塩は、加水分解することにより容易に光学活性 _α—メチルシスティンに変換することができ、光学活性 α—メチルシスティンと同様に、医薬等の合成中間体として好適に使用できる。

さらに、本発明は、光学活性 α—メチルシスティン又はその塩の水溶液から、有機溶剤の共存下にこれらの晶出を行うことを特徴とする、光学活性 α _メチルシスティン又はその塩の晶析方法にも関する。さらに、本発明は、下記式（1 2)

(式中、 R³、 R⁴はそれぞれ独立して置換基を有していても良い炭素数 1〜 2 0のアルキル基、置換基を有していても良い炭素数 7〜 20のァラルキル基、又は、置換基を有していても良い炭素数 6〜 20のァリール基を表す）で表されるラセミ体 5， 5—二置換ヒダントイン誘導体又はその塩、とりわけ下記式（14 ) ：

(式中、 R¹は前記と同じ）で表されるラセミ体 5—メチルー 5—チオメチルヒダントイン誘導体又はその塩を、有機塩基又はアル力リ金属水酸化物を用いて加水分解を行うことを特徴とする、下記式（1 3) ：

(式中、 R³、 R ⁴は前記と同じ）で表されるラセミ体 N—力ルバモイルー α — アミノ酸誘導体又はその塩、とりわけ、前記式（1) で表されるラセミ体 Ν—力ルバモイルー _α—メチルシスティン誘導体又はその塩の製造方法にも関する。さらに、本発明は、前記式（1) で表されるラセミ体 Ν—力ルバモイルー α— メチルシスティン誘導体又はその塩；前記式（3) 又は（10) で表される L体又は D体の光学活性 N—力ルバモイルー α—メチルシスティン誘導体又はその塩；前記式（2 ) 又は（7 ) において R ¹が炭素数 4〜1 5の 3級アルキル基である、 D体又は L体の光学活性 5—メチル一 5—チオメチルヒダントイン誘導体又はその塩；前記式（4 ) 又は（8 ) において、 R ²が置換基を有していても良い炭素数 1〜2 0のアルキル基、置換基を有していても良い炭素数 7 ~ 2 0のァラルキル基、又は、置換基を有していても良い炭素数 6 ~ 2 0のァリール基である、 L体又は D体の光学活性ひ一メチルシスティン誘導体又はその塩；前記式（6 ) 又は（1 1 ) で表される L体又は D体の光学活性 5—メチルー 5—チオメチルヒダントイン又はその塩に関する。発明の詳細な開示

以下、本発明を詳細に説明する。まず、本発明の化合物について説明する。本発明に用いるラセミ体 Ν—力ルバモイルー α _メチルシスティン誘導体（ 1 ) において、 R ¹は、置換基を有していても良い炭素数 1〜2 0のアルキル基、置換基を有していても良い炭素数 7〜 2 0のァラルキル基、又は、置換基を有していても良い炭素数 6〜 2 0のァリール基を表す。

炭素数 1〜 2 0のアルキル基としては、例えばメチル基、ェチル基、 η—プロピル基、 η—ブチル基等の直鎖アルキル基、イソプロピル基、イソプチル基、 t 一ブチル基、ネオペンチル基、 t一ペンチル基、 t一へキシル基等の分枝アルキル基等が挙げられ、好ましくは炭素数 1〜1 0のアルキル基である。

炭素数 7〜2 0のァラルキル基としては、例えばべンジル基，； —メトキシべンジル基、フエネチル基，ナフチルメチル基等が挙げられ、好ましくは炭素数 7 〜1 5のァラ /レキノレ基である。

炭素数 6〜2 0のァリール基としては、例えばフエエル基，ナフチル基等が挙げられ、好ましくは炭素数 6〜1 5のァリール基である。

上記アルキル基、ァラルキル基、ァリール基は、それぞれ無置換であってもよく、また置換基を有していてもよい。置換基としては、アミノ基、ヒドロキシル基、ァリール基、アルカノィル基、アルケニル基、アルキ-ル基、アルコキシ基、ニトロ基、ハロゲン原子等が挙げられる。当該置換基としてのァリール基としては、例えばフエ-ル基、ナフチル基、 p 一メチルフエエル基、 m—メチルフエニル基、 o—メチルフエニル基等の炭素数 6〜 1 5のァリール基が挙げられる。アルカノィル基としては、例えばァセチル基、プロパノィル基、ブタノィル基等の炭素数 2〜1 0のアルカノィル基が挙げられる。ァルケエル基としては、例えばェテュル基、プロぺニル基等の炭素数 2 〜 1 0のアルケニル基が挙げられる。アルキニル基としては、例えばェチニル基、プロピニル基等の炭素数 2〜1 0のアルキエル基が挙げられる。アルコキシ基としては、例えばメトキシ基、エトキシ基、 n—プロポキシ基、イソプロポキシ基等の炭素数 1〜 1 0のアルコキシ基が挙げられる。ハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子が挙げられる。

上記 R ¹の中でも、脱保護の容易さ及ぴヒダントイナーゼによる立体選択的環化反応の反応性の点からは、置換基を有していても良い炭素数 4〜1 5の 3級ァルキル基が好ましい。具体的には、 t—ブチル基、 t一ペンチル基、 t一へキシル基等が挙げられ、より好ましくは t一プチル基である。

ラセミ体 N—力ルバモイルーひ一アミノ酸誘導体（1 3 ) において、 R ³、 R ⁴は、それぞれ独立して置換基を有していても良い炭素数 1〜 2 0のアルキル基、置換基を有していても良い炭素数 7〜2 0のァラルキル基、又は、置換基を有していても良い炭素数 6〜 2 0のァリ一ル基を表す。炭素数 1〜 2 0のアルキル基、炭素数 7 ~ 2 0のァラルキル基、炭素数 6〜2 0のァリール基としては、上記 R ¹の説明で挙げた基と同様の基を挙げることができる。

上記アルキル基、ァラルキル基、ァリール基は無置換であってもよく、置換基を有していても良い。置換基としては、前記 R ¹の説明で挙げた置換基に加え、下記式（1 5 ) ：

一 S R ¹ ( 1 5 )

で表される置換チォ基を挙げることができる。ここで、 R ¹は上記と同じであり、その好ましい具体例も上記と同じである。

後述するように、対応するヒダントインを加水分解して前記化合物 ( 1 3 ) を調製するうえでは、加水分解反応の反応性の観点から、 R ³、 R ⁴としては置換基を有していてもよい炭素数 1〜6のアルキル基が好ましく、具体的には、メチル基、ェチル基、プロピル基、 n—ブチル基、 n—ペンチル基、 n—へキシル基等が挙げられ、 R³、 R⁴の少なくとも一方がメチル基であるのがより好ましレ、。言うまでもなく、化合物（1 3) において、 R³、 R⁴の一方がメチル基、他方前記置換チォ基（1 5) で置換されたメチル基の場合、化合物（1) を表す。ラセミ体 N—力ルバモイル一ひ一メチルシスティン誘導体（1) 及ぴラセミ体 N—力ルバモイルー α—アミノ酸誘導体（13) は塩であってもよく、塩は、塩基との塩を表す。塩基との塩は、特に限定されないが、例えば、アルカリ金属水酸化物（水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム等）との塩；アルカリ土類金属水酸化物（水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム等）との塩等が挙げられる。好ましくは、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムとの塩である。前記式（2) 、（7) 又は（14) で表されるラセミ及び光学活性 5—メチル一 5—チオメチルヒダントイン誘導体において、 R¹は、前記式（1) で表される化合物において定義したものと同じである。

前記式（12) で表されるラセミ体 5， 5—二置換ヒダントイン誘導体において、 R³、 R⁴は、前記式（1 3) で表される化合物において定義したものと同様である。言うまでもなく、化合物（1 2) において、 R³、 R⁴の一方がメチル基、他方が前記置換チォ基（15) で置換されたメチル基の場合が、化合物（ 14) である。

これら 5， 5—二置換ヒダントイン誘導体は塩であってもよく、塩は、塩基との塩を表し、ヒダントイン環のイミド基上での塩を表す。塩基との塩は、特に限定されないが、例えば、アルカリ金属水酸化物（水酸化ナトリウム、水酸化カリゥム、水酸化リチウム等）との塩；アルカリ土類金属水酸化物（水酸化カルシゥム、水酸化マグネシウム等）との塩等が挙げられる。好ましくは、水酸化ナトリゥム又は水酸化力リゥムとの塩である。

前記式（3) 又は（10) で表される光学活性 N—力ルバモイルーひ一メチルシスティン誘導体において、 R¹は前記と同じである。これら光学活性 N—カルバモイル— _α一メチルシスティン誘導体は塩であってもよく、塩の種類は、前記式（1) で表される化合物の場合と同様である。

前記式（4) 及び（8) で表される光学活性 α—メチルシスティン誘導体において、 R ²は、 R ¹若しくは水素原子を表す。当該 R ¹は、置換基を有していても良い炭素数 1〜 2 0のアルキル基、置換基を有していても良い炭素数 7〜 2 0のァラルキル基、又は、置換基を有していても良い炭素数 6〜 2 0のァリール基を表し、前記式（1 ) で表される化合物で定義したものと同じである。これら光学活性 a—メチルシスティン誘導体は塩であってもよく、塩としては、酸との塩、塩基との塩が挙げられる。酸としては、ハロゲン化水素酸（塩酸、臭化水素酸、フッ化水素酸等）、スルホン酸（メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、 p _ トルエンスルホン酸等）、硫酸、硝酸、カルボン酸（ギ酸、酢酸、プロピオン酸、シユウ酸、トリフルォロ酢酸等）等が挙げられる。塩基としては、有機塩基（ァンモユア、トリェチルァミン、ァエリン、ピリジン等）、アルカリ金属水酸化物 (水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム等）、アルカリ土類金属水酸化物（水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム等）等が挙げられる。

前記式 ( 6 ) 又は ( 1 1 ) で表される光学活性 5 _メチル _ 5—チオメチルヒダントインは、塩であってもよく、塩の種類は、前記式（1 ) で表される化合物の場合と同様である。

次に、前記式（1 ) 及び（1 3 ) で表される化合物の製造法について詳細に記載する。ラセミ体 N—力ルバモイル一ひ一アミノ酸誘導体（1 3 ) 又はその塩は、前記式（1 2 ) で表されるラセミ体 5， 5—二置換ヒダントイン誘導体又はその塩を、有機塩基又はアル力リ金属水酸化物を用いて加水分解することにより製造することができる。

原料となるラセミ体 5， 5—二置換ヒダントイン誘導体（1 2 ) 又はその塩は、対応するケトンから当業者周知の B u c h e r e r法により合成することができる。

本製法においては、塩基として有機塩基又はアルカリ金属水酸ィヒ物を用いて加水分解する。当該有機塩基としては、特には限定されないが、例えばメチルアミン、ジメチルァミン、トリメチルァミン、ェチノレアミン、ジェチルァミン、トリェチルァミン、ジィソプロピルェチルァミン、ピリジン、ァニリン等が挙げられる。これら有機塩基は、それぞれ単独で用いても良いし、 2種類以上混合して用いても良い。上記アルカリ金属水酸化物としては、例えば水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化セシウム等が挙げられる。これらアルカリ金属水酸化物は、それぞれ単独で用いても良いし、 2種類以上混合して用いても良い。上記加水分解に用いる塩基は、収率、経済性の点から、好ましくはアルカリ金属水酸化物であり、より好ましくは、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムである。塩基の使用量としては、特には限定されないが、基質に対して、好ましくは 1 〜 1 0モル当量、より好ましくは 2 ~ 5モル当量である。

反応溶媒は、水単独でも良いし、水と有機溶媒を混合して用いても良い。上記溶媒として水と混合する有機溶媒は、特には限定されないが、炭化水素系溶剤、エステル系溶剤、エーテル系溶剤、アルコール系溶剤、二トリル系溶剤、アミド系溶剤等が挙げられる。好ましくは炭化水素系溶剤である。

上記炭化水素系溶剤としては、特には限定されないが、例えばトルエン、ベンゼン、キシレン、へキサン、シク口へキサン、ヘプタン等が挙げられ、これらのいずれか一種を単独で用いても良いし、又は二種以上を任意の割合で混合して用いても良い。好ましくはトルエンである。

エステル系溶剤としては、ギ酸ェチル、酢酸メチル、酉乍酸ェチル、酢酸イソプ口ピル、プロピオン酸メチル等が挙げられる。

エーテル系溶剤としては、ジェチルエーテル、テトラヒドロフラン、 1， 4 - ジォキサン、メチル t—プチルエーテル等が挙げられる。

アルコール系溶剤としては、メタノール、エタノール、 1一プロパノール、ィソプロパノール、 1ーブタノール、 2—ブタノール等が挙げられる。

二トリル系溶剤としては、ァセトエトリル、プロピオ二トリル等が挙げられる。アミド系溶剤としては、ジメチルホルムアミド、ジメチルァセトアミド等が挙げられる。

反応に用いる水は、基質に対して、好ましくは 0 . 1倍〜 1 0 0倍重量であり、収率、容積効率の点から、より好ましくは 0 . 1倍〜 1 0倍重量、さらに好ましくは 0 . 2〜 3倍重量である。

また、基質に対して、水を 0 . 2倍〜 3倍重量、塩基を 2〜5モル当量使用する場合に、最も反応は収率良く進行する。反応温度は、基質の種類、試材量に依存するので一概に言えないが、 5 0 °C〜 1 5 0 °Cの条件から選択でき、好ましくは 8 0 °C〜 1 1 0 °C、より好ましくは 8 5 °C〜 1 0 0 °Cである。

反応時間は、基質の種類、試材量、反応温度に依存するので一概に言えないが、 1〜 5 0時間反応させるのが好ましく、収率良く生成物を得るには、より好ましくは 2〜 2 4時間である。

反応後の後処理としては、このまま、次の反応に用いても良いし、酸を加えて中和した後に、抽出、精製により単離してもよい。また、反応混合物をろ過して該化合物を単離してもよい。

前記式（1 ) で表される化合物は上記と同様にして、チォアセトン誘導体から B u c h e r e r法にて前記式（1 4 ) で表されるラセミ体 5—メチルー 5—チオメチルヒダントイン誘導体を製造し、これを加水分解することにより製造することができる。

次に、ラセミ体 N—力ルバモイルーひ一メチルシスティン誘導体 ( 1 ) 又はその塩を、ヒダントイナーゼによって D体選択的に環化反応させ、 D— 5—メチル一 5—チオメチルヒダントイン誘導体 ( 2 ) 又はその塩及び N—力ルバモイル— _α—メチル一L一システィン誘導体 ( 3 ) 又はその塩を合成する方法について説明する。

ここでヒダントイナーゼとは、 5—置換ヒダントイン誘導体又はその塩を加水分解して Ν—力ルバモイルー a—アミノ酸誘導体を生成する活性を有する酵素である。また、本酵素は、一般に、加水分解反応の逆反応として、 Ν—力ルバモイルー一ァミノ酸誘導体を環化して 5—置換ヒダントイン誘導体を生成することが知られている（特開平 1— 1 2 4 3 9 8 9号公報）。

本発明で用いる D体選択的な環化反応を触媒するヒダントイナーゼとしては、動物、植物、又は、微生物由来のいずれでも使用できるが、工業的な利用には微生物由来のものが好ましい。酵素源となる微生物としては、当該酵素の生産能力を有する微生物であればいずれも利用できるが、例えば、以下の公知の、当該酵素の生産能力を有する微生物を挙げることができる。

例えば、細菌に属するものとしてはァセトバクター属（A c e t o b a c t e r ) 、ァク口モノクター属 (Ac h r omo b a c t e r) 、ァェロノクター属 (Ae r o b a c t e rj 、ァク、 'ロノくクテリゥム属 (Ag r o b a c t e r i u m) 、アル力リゲネス属（A l c a l i g e n e s) 、ァルスロパクター属（A r t h r o b a c t e r) 、バチルス属（B a c i l l u s) , プレビパクテリゥム属 (B r e v i b a c t e r i um) 、コリネバクテリゥム属 (C o r y n e b a c t e r i um) 、ェンテロノクター属 (En t e r o b a c t e r) 、エルウイニァ属（E r w i n i a ) 、ェシェリヒァ属 (E s c h e r i c h i a ) 、クレブシエラ属（K l e b s i e l l a) 、ミクロバクテリゥム属（M i c r o b a c t e r i umj クロコッカス (M i c r o c o c c u s) 、プ口タミノバクター属（P r o t am i n o b a c t e r) 、プロテウス属（P r

0 t e u s ) 、シユードモナス属 (P s e u d omo n a s) 、サノレチナ属 (S a r t i n a ) 、セラチア属（S e r r a t i a ) 、キサントモナス属（X a n t h omo n a s) 、ァェロモナス属 (Ae r omo n a s) 、フラポノクテリゥム属 (F l a v o b a c t e r i um) 、リゾビゥム属 (R h i z o b i um ) 等；放線菌に属するものとしてはァクチノミセス属（Ac t i n omy c e s ) 、ミコバクテリゥム属（My c o b a c t e r i um) 、ノカルディア属（N o c a r d i a) 、ストレプトミセス属（S t r e p t omy c e s) 、ァクチノプラネス属 (Ac t i n o p l a n e s) ^ ロドコッカス属 (R h o d o c o e c u s) 等；かびに属するものとしてはァスペルギルス属（A s p e r g i 1 1 u s ) 、ノェシロミセス属 (P a e c i l omy c e s) , ぺニシリゥム属 ( P e n i c i 1 1 i um) 等；酵母に属するものとしてはキャンディダ属（C a n d i d a ) 、ピキァ属（Ph i c h i a) 、ロードトルラ属 (R h o d o t o r u 1 a ) 、トルロプシス属（T o r u 1 o p s i s ) 等が挙げられる。

好ましくは、ァグロバタテリゥム属（Ag r o b a c t e r i um) 、バチルス属（B a c i l l u s) , シユードモナス属（P s e u d omo n a s) 又はリゾビゥム属（Rh i z o b i um) に属する微生物由来の酵素が挙げられる。より好ましくは、ァグロバタテリゥム■スピーシーズ（Ag r o b a c t e r

1 um s p . ) KNK 712 (F E RM B P - 1 900) 、バチノレス，スピ一シーズ（B a c i l l u s s p . ) KNK 245 (FERM B P— 486 3) 、シユードモナス ·プチダ（P s e u d omo n a s p u t i d a) I F 01 2996、シユードモナス ·スピーシーズ（P s e u d omo n a s s p . ) KNKO 03 A (FERM B P- 31 81) 又はリゾビゥム 'スピーシーズ (R h i z o b i um s p . ) KNK 141 5由来の酵素が挙げられる。なお、ァグロバクテリウム ·スピーシーズ（A g r o b a c t e r i um s p . ) KNK 71 2は、 FERM B P— 1900の受託番号で、 1988年 5 月 3 1日付で；バチルス ·スピーシーズ（B a c i l l u s s p . ) KNK 2 45は、 FERM B P— 4863の受託番号で、 1 994年 1 1月 2 付で；シユードモナス ■ スピーシーズズ P s e u d omo n a s s p . ) KNKO 0 3 Aは、 FERM B P— 3181の受託番号で、 1 990年 12月 1日付で；それぞれ、日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6にある独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、ブダぺスト条約に基づいて国際寄託されている。

上記微生物は野生株であってもよく、また、変異処理によってヒダントイナーゼ活性が高められた変異株であってもよい。さらに、遺伝子組換え等の方法を用いて、上記微生物由来のヒダントイナーゼを高生産するように作成された形質転換微生物であってもよい。

ヒダントイナーゼを効率良く高生産する形質転換微生物の作成方法としては、例えば WO 96/20275記載のように、ヒダントイナーゼ活性を示す菌株からヒダントイナーゼ遺伝子をクローニングした後、適当なベクターとの組換えプラスミドを作成して、これを用いて適当な宿主菌を形質転換することで得られる。なお、組換え DNA技術については当該分野において周知であり、例えば、 Mo l e c u l a r C l o n i n g 2 n d E d i t i o n (C o l d S p r i n g Ha r b o r L a b o r a t o r y P r e s s, 1 989) 、 C u r r e n t P r o t o c o l s i n Mo l e c u l a r B i o l o g y (G r e e n e Pu b l i s h i n g As s o c i a t e s a n d W i 1 e y— I n t e r s c i e n c e) に己載されている。

このようにして得られた、ヒダントイナーゼを高生産する形質転換微生物としては、 WO 96/20275記載の、バチルス ■ スピーシーズ（B a c i 1 1 u s s p . ) KN 245 (F ERM BP— 4863) 由来のヒダントイナーゼ遺伝子を含有するェシェリヒア 'コリ（E s c h e r i c h i a c o l i) HB 101 TH 104 (F ERM BP— 4864) 、ァグロパクテリゥム •スピーシーズ（Ag r o b a c t e r i um s p . ) KNK 712 (FER M B P_ 1 900) 由来のヒダントイナーゼ遺伝子を含有するェシエリヒア - コリ（E s c h e r i c h i a c o l i ) HB 101 AH 1043 (FE RM B P-4865) 、又はシユードモナス . スピーシーズ（P s e u d om o n a s s p. ) KNKO 03 A (F ERM B P_ 318 1) 由来のヒダントイナーゼ遺伝子を含有するェシエリヒア .コリ（E s c h e r i c h i a c o 1 i ) HB 101 PHD 301 (F ERM B P— 4866) を挙げることができる。

なお、ェシェリヒア - コリ（E s c h e r i c h i a c o l i ) HB 101 PTH104は、 FERM B P— 4864の受託番号で、 1 994年 1 1月 2日付で；ェシェリヒア 'コリ（E s c h e r i c h i a c o l i ) HB 10 1 pAH1043は、 FERM B P— 4865の受託番号で、 1994年1 1月 2日付で；ェシェリヒア ' コリ（E s c h e r i c h i a c o l i ) HB 101 p PHD 301は、 FERM B P _ 4866の受託番号で、 1994 年 1 1月 2日付で；それぞれ、日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6 にある独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、ブダぺスト条約に基づいて国際寄託されている。

前述のヒダントイナーゼ活性を示す微生物、或いは、上記形質転換微生物によるヒダントイナーゼの生産は、例えば、 WO 96/20275に記載されているように、通常の栄養培地を用いて培養を行えば良く、必要に応じて、酵素誘導のための処理を行うこともできる。酵素誘導は、例えば、培地にゥラシルを添加して培養することにより行うことができる。

本発明において、上記微生物によって生産されたヒダントイナーゼは、酵素自体として用いることができるほか、本酵素活性を有する微生物若しくはその処理物としても用いることができる。ここで、微生物の処理物とは、例えば、粗抽出液、培養菌体凍結乾燥生物体、アセトン乾燥生物体、又はそれらの菌体の破砕物を意味する。

さらにそれらは、酵素自体あるいは菌体のまま公知の手段で固定化して得た固定化酵素として用いられ得る。なお、酵素を固定ィヒして安定化することで、酵素反応を、より過酷な温度域で行うこと等が可能となり、反応をより効率的に進行させることができる。さらに、酵素の反復使用が可能となること、製造プロセスが簡略化できる等による製造コストの低減等のメリットも期待できる。

固定化は当業者に周知の方法である架橋法、共有結合法、物理的吸着法、包括法等で行い得る。酵素の固定化に使用される支持体としては、例えば、 Du o 1 i t e A— 568又は D S 1 7186 (ローム ' アンド ' ハース社：登録商標 ) 等のフエノールホルムアルデヒド陰イオン交換樹脂、 Amb e r 1 i t e I RA935、 I RA945、 I RA901 (ローム - アンド ' ハース社：登録商標）、 L ewa t i t OC 1037 (バイエル社：登録商標）、 D i a i o n EX— 05 (三菱化学：登録商標）等のポリスチレン樹脂のような各種アミンゃァンモニゥム塩あるいはジェタノールァミン型の官能基を持つ各種の陰ィオン交換樹脂が適している。その他、 DEAE—セルロース等の支持体も使用することができる。

固定化酵素の好適な製造方法としては、例えば、 WO 96Z20275に示す方法で行い得る。すなわち、ヒダントイナーゼ活性を有する菌株の培養液を集菌し、超音波等により菌体を破碎後、得られた酵素液に例えば陰イオン交換樹脂 D u o l i t e A— 568を加えて攪拌して酵素を吸着させることができる。この酵素を吸着した樹脂に、例えばダルタルアルデヒド等の架橋試薬を加えて攪拌することで架橋処理を行い、さらに安定性を向上させることもできる。これらの処理を行った後に、樹脂を濾集、洗浄して、固定化ヒダントイナーゼを得ることができる。

本発明の酵素反応は、以下の方法で行うことができる。基質として前記一般式 (1) で表されるラセミ体 N—力ルバモイルー一メチルシスティン誘導体又はその塩を用い、前述のヒダントイナーゼ存在下、水性媒体中で反応を行う。基質の仕込み濃度は 0. 1% (w/v) 以上 90% (w/v) 以下、好ましくは 1% (w/v) 以上 50% (w/v) 以下で、溶解又は懸濁した状態で反応を行い、反応温度は 1 0 °C以上 8 0 °C以下、好ましくは 2 0 °C以上 6 0 °C以下の適当な温度で調節し、 p H 4以上 9以下、好ましくは p H 5以上 8以下に保ちつつ、暫時静置又は攪袢すればよい。また、基質を連続的に添加しうる。反応は、バッチ法又は連続方式で行い得る。さらに、本発明の当該反応は、固定化酵素、膜リアクター等を利用して行うことも可能である。

水性媒体としては、水、緩衝液（例えばリン酸緩衝液、トリス緩衝液、炭酸緩衝液等）、これらに水溶性有機溶媒（例えばエタノール、メタノール、ァセトニトリル等）を含む溶媒等を用いることができる。なお、上記水性媒体は、水に溶解しにくい有機溶媒（例えば、酢酸ェチル、酢酸プチル、トルエン、クロ口ホルム、 n—へキサン等）との 2相系として用いることもできる。さらに必要に応じて、抗酸化剤、界面活性剤、補酵素、金属等を添加することもできる。

かくして、ラセミ体 N—力ルバモイル— α—メチルシスティン誘導体 ( 1 ) 又はその塩は、 D体のみが環化され、 D— 5 _メチル一 5—チオメチルヒダントイン誘導体（2 ) 又はその塩と、 Ν—力ルバモイル一α—メチルー L—システィン誘導体（3 ) 又はその塩に変換される。

生成した Ν—力ルバモイルー α—メチル一L—システィン誘導体 ( 3 ) 又はその塩は、反応液のまま、脱力ルバモイル化反応に供してもよいし、常套分離方法、例えば抽出、濃縮、晶析、又はカラムクロマトグラフィー等や、それらの組み合わせにより、分離、精製することができる。

例えば、前記式（1 ) において R ¹が t一プチル基である Ν—力ルバモイルー S— t—プチルー α—メチルシスティンをヒダントイナーゼによる D体選択的環化反応の基質とした場合、反応後に不溶分として析出する D— 5—メチルー 5— t一プチルチオメチルヒダントィンを、ろ過により容易に除去することができる。この場合、得られた N—力ルバモイル—ひーメチルー L—システィンを含むろ液は、そのまま次工程に使用してもよいし、精製して次工程に使用してもよい。精製する場合、例えば; Hを酸性にすることで結晶を析出させ、ろ過することにより該化合物を取得することができる。

また、不溶分として析出した D— 5—メチノレー 5 ~ t一プチルチオメチルヒダントインは、そのまま次工程に用いてもよいし、ー且アルカリ水溶液に溶解してアルカリ溶液として次の工程に用いることもできる。また、アルカリ水溶液を中和することにより、結晶として取得することもできるが、これらの方法に限られるものではない。

次に、 N—力ルバモイルー α—メチル一L一システィン誘導体（3 ) 又はその塩の脱力ルバモイル化及び必要に応じた硫黄原子の脱保護による前記式（4 ) で表される α—メチルー L—システィン誘導体又はその塩の製造方法について説明する。

硫黄原子の保護基は上記 R ¹で示されるなかから選択される。脱保護としては、脱力ルバモイル化（ァミノ基の脱保護）と硫黄原子の脱保護を一緒に行ってもよいし、段階的にどちらか片方を行い、続いて残りの保護基を除去してもよい。脱保護の方法は、保護基と目的により適切な方法を選択すればよい。

まず、脱力ルバモイル化と硫黄原子の脱保護を一緒に行う方法について説明する。本発明者らは検討を重ねる中で、硫黄原子の保護基（R ¹ ) として、 t—ブチル基等に代表される炭素数 4〜1 5の 3級アルキルを用いた場合、 N—力ルバモイルーーメチルー L一システィン誘導体（3 ) 又はその塩を酸で処理することにより、脱力ルバモイル化（ァミノ基の脱保護）と硫黄原子の脱保護を一段階で行えることを見出した。

本方法で用いる酸としては、例えば塩酸，硫酸，臭化水素酸，硝酸，酢酸，トリフルォロ酢酸等を挙げることができ、前記から選ばれる任意の 1種を単独で用いても良いし、あるいは 2種以上を任意の割合で混合して用いても良い。反応性、経済性から、好ましくは塩酸又は臭化水素酸であり、より好ましくは塩酸である。塩酸、臭化水素酸は、市販の濃塩酸、濃臭化水素酸を反応溶媒を兼ねて使用することができる。水や有機溶剤を添加しても良いが、反応性の観点からは反応溶媒を兼ねるのが好適である。

反応条件としては、例えば、硫黄原子の保護基が t〜プチル基である N—カルバモイル一 S— t一プチル一α—メチルシスティンを塩酸で処理することにより —段階で a—メチルシスティン塩酸塩を得る場合、反応温度は、好ましくは 7 0 °C〜 1 8 0 °C、より好ましくは 9 0 °C〜 1 5 0 °Cである。反応時間は、例えば 1 0 0 °C〜 1 1 0 °C、常圧で反応を行った場合、 2〜 4日間程度が好ましく、耐圧反応器を用いて、より高温で反応を行うことにより、反応時間を短くすることができる。

次に、まず N—力ルバモイルー α—メチル一L一システィン誘導体（3 ) 又はその塩の脱力ルバモイル化を行って、前記式（4 ) において R ²が前記式（1 ) における R ¹と同じであるメチルー L一システィン誘導体又はその塩とした後に、硫黄原子の脱保護を行い、前記式（5 ) で表される α—メチルー L一システィン又はその塩を得る方法について説明する。

この場合、脱力ルバモイル化は力ルバモイル基を除去でき得る方法であれば特に制限されるものではないが、例えば、亜硝酸酸化法、アルカリ加水分解法及び酸加水分解法が挙げられる。硫黄原子上の保護基が t _ブチル基等の 3級アルキル基の場合、塩酸等による酸加水分解法では、硫黄原子上の脱保護が進行する傾向にあるので、脱力ルバモイル化のみを行いたい場合は、他の方法を用いることが好ましい。

亜硝酸酸化法は、通常の脱力ルバモイル化に用レ、られる反応条件が利用できる。例えば、亜硝酸単独、又は、亜硝酸の塩と適当な酸の組み合わせを用いることができるが、亜硝酸塩と酸の組み合わせを用いることが好ましい。

亜硝酸塩としては、亜硝酸ナトリウム、亜硝酸力リウム、亜硝酸カルシウム、亜硝酸セシウム、亜硝酸マグネシウム、亜硝酸バリウム等が挙げられ、亜硝酸力リゥム、亜硝酸ナトリゥムが好ましい。また組み合わせる酸としては、酢酸、塩酸、硫酸、臭化水素酸等が好ましく、特に好ましくは塩酸である。溶媒としては特に制限されるものではないが、基質の溶解性から、水又はアルコール（例えばメタノール、エタノール、イソプロパノール等）を用いることが好ましい。亜硝酸酸化法の反応温度は、一 5 °C〜 1 0 0 °Cの範囲で行うことが好ましく、生成物の安定性、収率向上の面から、より好ましくは 0 °C〜5 0 °Cの範囲である。アルカリ加水分解法で用いるアルカリとしては、特に限定されないが、例えば水酸化ナトリウム、水酸化リチウム、水酸化カリウム、水酸化バリウム、水酸化マグネシウム、水酸化カルシウム等が好ましく、より好ましくは水酸化リチウムである。

アル力リ加水分解の反応温度は、一 5 °C〜 1 5 0 °Cの範囲で行うことが好ましく、生産性及び収率向上の面から、より好ましくは 8 0 °C〜1 2 0 °Cの範囲である。

前記式（4 ) において R ²が前記式（1 ) における R ¹と同じである化合物は、そのまま次工程に用いてもよいし、精製して次工程に用いてもよい。精製する場合、例えば R ²が t—ブチル基である場合、アルカリ加水分解後の反応溶液の p Hを、酸を加えることにより下げることで、前記式（4 ) において R ²が tープチル基であるひ一メチルー L一システィン誘導体又はその塩を結晶として得ることができる。

この場合、アルカリ加水分解に用いるアル力リとしては、水酸化ナトリゥム、水酸化リチウム、水酸化カリウム、水酸化バリウム、水酸化マグネシウム、水酸化カルシウム等のなかから任意に選ばれる。また、アルカリ加水分解後の反応溶液に加える酸としては、塩酸、硫酸、臭化水素酸、硝酸、酢酸、トリフルォロ酢酸等を挙げることができ、前記から選ばれる任意の 1種を単独で用いても良いし、あるいは 2種以上を任意の割合で混合して用いても良いが、中和時に生成する無機塩が水に対して良好な溶解度を有し、脱塩が容易であることから、アルカリとして水酸化リチウム、酸として塩酸の組み合わせを用いることが好ましい。ここでいう「中和」とは、反応液の p Hを結晶が析出する領域に調整することを表す。前記式（4 ) において R ²が t一ブチル基であるひーメチルー L一システィン誘導体又はその塩を結晶として収率良く得るためには、 p Hの上限は 9 . 5以下が好ましく、 7 . 0以下がより好ましい。 p Hの下限は通常、 1 . 0以上であり、 2 . 0以上が好ましく、 3 . 0以上がより好ましい。

以上のようにして脱力ルバモイル化した後、さらに硫黄原子の脱保護が必要な場合は、例えば反応液をそのまま、又は、ー且 α—メチルー L—システィン誘導体を単離した後、保護基に応じた反応条件で硫黄原子の脱保護を行うことができる。

例えば、保護基が t一プチル基等の 3級アルキル基の場合、酸で処理することにより硫黄原子の脱保護を行うことができる。酸としては、塩酸，硫酸，臭化水素酸，硝酸，酢酸，トリフルォロ酢酸等を挙げることができ、前記から選ばれる任意の 1種を単独で用いても良いし、あるいは 2種以上を任意の割合で混合して用いても良い。好ましくは塩酸又は臭化水素酸であり、より好ましくは塩酸である。塩酸、臭化水素酸の場合は、市販の濃塩酸、濃臭化水素酸を反応溶媒を兼ねて使用することもできる。水や有機溶剤を添加しても良いが、反応性の観点からは、溶媒を兼ねるのが好適である。反応温度は、好ましくは 5 0 °C〜 1 2 0 °C、より好ましくは 8 0 °C〜 1 0 0 °Cである。

次に、前記式 ( 3 ) で表される N—力ルバモイル一ひ一メチルー L一システィン誘導体又はその塩から、 L— 5—メチルー 5—チオメチルヒダントイン（6 ) 又はその塩を経由することによる、ひ一メチルー L—システィン（5 ) 又はその塩の製造方法について説明する。

まず、 N—カノレバモイル _ 一メチルー L一システィン誘導体 ( 3 ) 又はその塩の硫黄原子の脱保護と環化反応を一段階で行う方法について説明する。硫黄原子上の保護基が t一プチル基に代表される 3級アルキル基の場合、酸で処理することにより脱保護と環化を同時に行うことが可能である。

用いる酸としては、例えば塩酸，硫酸，臭化水素酸，硝酸，酢酸，トリフルォ口酢酸等を挙げることができ、前記から選ばれる任意の 1種を単独で用いても良いし、あるいは 2種以上を任意の割合で混合して用いてもよい。好ましくは塩酸である。塩酸、臭化水素酸の場合は、市販の濃塩酸、濃臭化水素酸を反応溶媒を兼ねて用いることができる。水や有機溶剤を添加しても良いが、反応性の観点からは、反応溶媒を兼ねるのが好適である。

反応温度は特に限定されるものではないが、 L一 5—メチルー 5—チオメチルヒダントイン（6 ) 又はその塩の加水分解を抑制するためには、温和な条件が良く、例えば 0 °C〜 1 0 0 °C、好ましくは 6 0 °C〜 9 0 °Cの範囲で数時間反応を行い、目的物が主たる生成物となった時点で反応を停止すればよい。

次に、環化のみを先に行い L一 5—メチルー 5—チオメチルヒダントイン誘導体（7 ) 又はその塩を得た後に、硫黄原子の脱保護を行う方法を説明する。硫黄原子上の保護基が t—プチル基に代表される 3級アルキル基の場合、酸で環化を行うと先に硫黄原子の脱保護が進行するため、アル力リで処理することが好ましい。

用いるアル力リとしては、特に制限されるものではなく、例えば水酸化ナトリゥム，水酸化カリウム，水酸化リチウム，水酸化マグネシウム，水酸化バリウム，水酸化カルシウム等が挙げられるが、入手の容易さ、価格の面等から、水酸化ナトリゥム，水酸化カリゥムあるいは水酸化リチウムが好ましい。

環化の際の反応温度としては、好ましくは 0 °C〜1 0 0 °C、より好ましくは 6 0 °C〜9 0 °Cである。また、溶媒は、水単独でも良いし、有機溶媒との混合溶媒でも良い。好ましくは水単独である。

L— 5—メチルー 5—チオメチルヒダントイン誘導体（7 ) 又はその塩は、そのまま次工程に用いてもよいし、有機溶媒で抽出後に次工程に用いてもよいし、晶析等により単離してから次工程に用いてもよい。

得られた（7 ) 又はその塩をさらに酸で処理することにより硫黄原子の脱保護が進行し、 L一 5—メチルー 5—チオメチルヒダントイン（6 ) 又はその塩を得ることができる。

用いる酸としては、塩酸，硫酸，臭化水素酸，硝酸，酢酸，トリフルォロ酢酸等が挙げられ、前記から選ばれる任意の 1種を単独で用いても良いし、あるいは 2種以上を任意の割合で混合して用いても良い。収率や価格の面から塩酸が好ましい。酸処理は、前述の脱保護と環化を一段階で行う場合と同様の条件にて、好適に実施できる。

以上のようにして得られた L— 5—メチルー 5—チオメチルヒダントイン（6 ) 又はその塩は、酸又はアルカリで加水分解することにより、 α—メチルー L一システィン（5 ) 又はその塩に変換できる。好ましくは酸による加水分解である。酸としては、例えば塩酸、硫酸、臭化水素酸、硝酸、酢酸、トリフルォロ酢酸等が挙げられ、前記から選ばれる任意の 1種を単独で用いても良いし、あるいは 2種以上を任意の割合で混合して用いても良い。塩酸又は臭化水素酸が好ましく、塩酸がより好ましい。また、アル力リとしては、例えば水酸化ナトリゥム、水酸化カリウム、水酸化リチウム等が好ましい。

次に、 D— 5—メチルー 5—チオメチルヒダントイン誘導体（2 ) 又はその塩の加水分解反応を行い、得られた前記式（8 ) において R ²が前記式（1 ) における R ¹と同じであるひ一メチルー D—システィン誘導体又はその塩の硫黄原子の脱保護を行うことによるひーメチルー D—システィン又はその塩の製造方法について説明する。

加水分解は、通常、アルカリを用いて行われる。加水分解に用いるアルカリは特に制限されるものではないが、例えば水酸化ナトリウム，水酸化カリウム，水酸化リチウム，水酸化バリウム，水酸化マグネシウム，水酸化カルシウム等が挙げられ、好ましくは水酸化ナトリウム，水酸ィヒカリウム，水酸化リチウムである。反応後に生成物の晶析を行う際に、生じる無機塩不純物が水に対して良好な溶解度を有することから、水酸化リチウムを用いることが特に好ましい。

溶媒は、水単独でも良いし、有機溶媒との混合溶媒でも良い。好ましくは水単独である。

反応温度としては、好ましくは一 5 °C~ 1 5 0 °C、より好ましくは 8 0 °C~ 1 2 0 °Cである。

例えば、 R ²が t—プチル基の場合、得られた α—メチルー S— t—プチルー D—システィンは、加水分解反応後に反応液に酸を加えて； Hを下げることにより、結晶として取得することができる。

ここで用いる酸は、反応液の p Hを下げ得るものであれば特に限定されるものではないが、例えば塩酸，硫酸，臭化水素酸，硝酸，酢酸，トリフルォロ酢酸等が挙げられ、前記から選ばれる任意の 1種を単独で用いても良く、あるいは 2種以上を任意の割合で混合して用いても良い。加水分解に水酸化リチウムを用いた場合、中和時に生成する無機塩不純物が水に対して良好な溶解度を有し、結晶中に混入しにくいことから塩酸を用いることが好ましい。

ここでいう「中和」とは、反応液の p Hを結晶が析出する領域に調整することを表す。 α—メチルー S— t一プチルー D—システィンを結晶として収率良く得るためには、 p Hの上限は 9 . 5以下が好ましく、 7 . 0以下がより好ましい。 p Hの下限は通常、 1 . 0以上であり、 2 . 0以上が好ましく、 3 . 0以上がより好ましい。、

かくして、得られた前記式（8 ) において R ²が R ¹と同じである化合物は、硫黄原子の脱保護を行うことにより α—メチルー D—システィン（9 ) 又はその塩に変換することが出来る。脱保護の方法は、硫黄原子上の保護基に応じて選択されるが、保護基として t一ブチル基等の 3級アルキル基を用いた場合、酸で処理することにより容易に脱保護することができる。

本方法で用いる酸としては、例えば塩酸，硫酸，臭化水素酸，硝酸，酢酸，トリフルォロ酢酸等を挙げることができ、前記から選ばれる任意の 1種を単独で用いても良いし、あるいは 2種以上を任意の割合で混合して用いても良い。反応性、経済性から、好ましくは塩酸又は臭化水素酸であり、より好ましくは塩酸である。塩酸、臭化水素酸を用いる場合は、市販の濃塩酸、濃臭化水素酸を反応溶媒を兼ねて使用することができる。水や有機溶剤を添加しても良いが、反応性の観点からは、溶媒を兼ねるのが好適である。

反応温度としては、好ましくは 7 0 °C〜 1 8 0 °C、より好ましくは 9 0 °C〜 1 5 0 °Cである。

次に、 D— 5—メチル _ 5—チオメチルヒダントイン誘導体（2 ) 又はその塩の加水分解反応と硫黄原子の脱保護を酸により一段階で行う方法を説明する。例えば、前記式（2 ) における R ¹が t一プチル基に代表される炭素数 4〜1 5の 3級アルキル基の場合、酸で処理することにより一段階で α _メチル一D—システィン（9 ) 又はその塩を得ることができる。

ここで用いる酸は、例えば塩酸，硫酸，臭化水素酸，硝酸，酢酸，トリフルォ口酢酸等を挙げることができ、前記から選ばれる任意の 1種を単独で用いても良いし、あるいは 2種以上を任意の割合で混合して用いても良い。好ましくは塩酸又は臭化水素酸であり、より好ましくは塩酸である。塩酸、臭化水素酸を用いる場合は、市販の濃塩酸、濃臭化水素酸を反応溶媒を兼ねて使用することがでできる。水や有機溶剤を添加しても良いが、反応性の観点からは、溶媒を兼ねるのが好適である。

次に、 D _ 5—メチルー 5—チオメチルヒダントイン誘導体 ( 2 ) 又はその塩から、硫黄原子の脱保護を行って D— 5—メチルー 5—チオメチルヒダントイン ( 1 1 ) 又はその塩とし、さらに該化合物を加水分解することによりひ一メチル —D—システィン（9 ) 又はその塩を製造する方法について説明する。

まず、 D— 5—メチルー 5—チオメチルヒダントイン誘導体 ( 2 ) 又はその塩の硫黄原子の脱保護のみを選択的に行い、 D— 5—メチルー 5—チオメチルヒダントイン（1 1 ) 又はその塩を得る方法について説明する。前述したように、硫黄原子の保護基が t—ブチル基等の 3級アルキル基である場合、酸で処理することにより容易に脱保護が可能である。

用いる酸としては、例えば塩酸，硫酸，臭化水素酸，硝酸，酢酸，トリフルォ口酢酸等を挙げることができ、前記から選ばれる任意の 1種を単独で用いても良いし、あるいは 2種以上を任意の割合で混合して用いても良い。好ましくは塩酸である。塩酸、臭化水素酸を用いる場合は、市販の濃塩酸、濃臭化水素酸を反応溶媒を兼ねて使用することができる。水や有機溶剤を添加しても良いが、反応性の観点からは、溶媒を兼ねるのが好適である。

反応条件は、加水分解を抑制し、選択性良く D _ 5—メチルー 5—チオメチルヒダントイン（1 1 ) を得られる比較的温和な条件であれば特に限定されるものではないが、 1 0 0 °C以下で数時間反応を行い、目的物が主たる生成物となった時点で反応を停止すればよい。

次いで、 D— 5—メチルー 5—チオメチルヒダントイン ( 1 1 ) 又はその塩を加水分解して、 α—メチルー D—システィン（9 ) 又はその塩を製造する。加水分解は、酸加水分解、アルカリ加水分解のいずれも可能である。酸加水分解の場合、酸としては、例えば塩酸、硫酸、臭化水素酸、硝酸、酢酸、トリフルォ口酢酸等を挙げることができ、前記から選ばれる任意の 1種を単独で用いても良いし、あるいは 2種以上を任意の割合で混合して用いても良い。反応性、経済性から好ましくは塩酸または臭化水素酸であり、更に好ましくは塩酸である。塩酸、臭化水素酸を用いる場合は、市販の濃塩酸、濃臭化水素酸を溶媒を兼ねて使用することができる。水や有機溶剤を添加しても良いが、反応性の観点からは、溶媒を兼ねるのが好ましい。反応温度は、好ましくは 7 0 °C〜 1 8 0 °C、更に好ましくは、 9 0 °C〜1 5 0 °Cである。反応時間は、例えば 1 0 0 °C~ 1 1 0 °C、常圧で反応を行う場合、 2〜4日間程度が好ましく、耐圧反応器を用いてより高温で反応を行うことにより、反応時間を短縮することができる。

次に、まず D— 5—メチルー 5—チオメチルヒダントイン誘導体 ( 2 ) 又はその塩の加水分解を先に行うことにより、前記式（8 ) で表される α—メチルー D —システィン誘導体又はその塩を得た後に、力ルバモイル化して、 N—カルバモィルーーメチルー D—システィン誘導体（1 0 ) 又はその塩で表される化合物に変換し、次いで、環化及び硫黄原子の脱保護を行うことにより D— 5—メチル一 5—チオメチルヒダントイン（1 1 ) 又はその塩を得る方法について説明する。この場合、 D— 5—メチル _ 5—チオメチルヒダントイン誘導体（2 ) 又はその塩からひ一メチル一D—システィン誘導体（8 ) 又はその塩への変換は、既に記載した方法で行うことができる。

α—メチルー D—システィン誘導体（8 ) 又はその塩の力ルバモイル化は、シァン酸のアル力リ金属塩及び酸を用いて行うことができる。シアン酸のアル力リ金属塩としては、例えばィソシアン酸力リウム、シアン酸力リウム、シアン酸ナトリウム等が挙げられる。酸としては、例えば塩酸、硫酸、臭化水素酸、硝酸、酢酸、トリフルォロ酢酸等が挙げられる。これらを用いて、通常の力ルバモイル化反応条件（例えば、水溶媒中、 0〜 1 0 0 °C) に付すことにより、力ルバモイル化する。

N—力ルバモイルー α—メチル—D—システィン誘導体（1 0 ) 又はその塩の環化及び硫黄原子の脱保護は、前述の Ν—力ルバモイルーひーメチルー L—システィン誘導体 ( 3 ) 又はその塩から L一 5—メチルー 5—チオメチルヒダントイン（6 ) への変換で記載した方法と同様にして行うことができる。

次に、光学活性 α—メチルシスティン又はその塩の晶析方法について詳細に説明する。光学活性ひ一メチルシスティン又はその塩の水溶液から、有機溶剤の共存下に、これらの晶出を行うことにより、光学活性 α _メチルシスティン又はその塩を容易に取得することが可能である。

光学活性 α—メチルシスティン又はその塩としては、特には限定されないが、光学活性メチルシスティン、光学活性 α—メチルシスティンの酸との塩、光学活性 α—メチルシスティンの塩基との塩が挙げられるが、好ましくは酸との塩である。また、光学活十生ひ一メチルシスティンは、 L体、 D体のいずれでもよい。前記の酸との塩の酸としては、ハロゲン化水素酸、スルホン酸、硫酸、硝酸、カルボン酸等が挙げられるが、好ましくはハロゲン化水素酸である。

前記ハロゲン化水素酸としては、塩酸、臭化水素酸、フッ化水素酸等が挙げられるが、好ましくは塩酸である。

スルホン酸としては、メタンスノレホン酸、ベンゼンスルホン酸、 -トルエンスルホン酸等が挙げられ、カルボン酸としては、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、シユウ酸、トリフルォロ酢酸等が挙げられる。また、塩基との塩の塩基としては、アンモエア、トリェチルァミン、ァ-リン、ピリジン等が挙げられる。

光学活性 α—メチルシスティン又はその塩の水溶液は、その調製法は特には限定されない。例えば、前記従来の技術 1 ) 〜 6 ) の方法により得られる α—メチルシスティン誘導体又はその塩、若しくは保護体を、適切に変換、脱保護して得られる水溶液である。また、本明細書記載の方法に従い得られる該化合物の水溶液であってもよい。好ましくは、本明細書記載の方法により製造された光学活性 α—メチルシスティン又はその塩の水溶液である。

本晶析方法においては、光学活性 α _メチルシスティン又はその塩の水溶液を、有機溶剤との共存下に濃縮することにより、水を系外に除去すると共に、有機溶剤に置換する。これにより、当該化合物が塊状化することを抑制して、取り出し及びろ過が容易なスラリーを得ることができる。得られたスラリーをろ過後、洗浄、乾燥し、光学活性 α—メチルシスティン又はその塩を結晶として取得することが可能である。

本晶析方法の実施にあたっては、有機溶剤の添加に先立ち、光学活性ひーメチルシスティン又はその塩の水溶液を予備的に濃縮しておくこともできる。この場合、該化合物の重量濃度が 1 0重量％以上、より好ましくは 3 0重量％以上となる程度に水溶液を濃縮するのが好ましい。

置換する有機溶剤の種類は、特には限定されないが、好ましくは水と共沸することができ、共沸時の水の組成が 5 . 0重量％以上の溶媒である。また、水と相溶性の低い又はない有機溶剤がさらに好ましい。

前記水と相溶性の低い又はない有機溶剤として、炭化水素系溶剤、エステル系溶剤、又はエーテル系溶剤等が挙げられる。水と相溶性が低く、光学活性ひーメチルシスティン又はその塩の溶解性が低く、溶剤の回収再利用が容易である点から、好ましくは炭化水素系有機溶剤である。

炭化水素系有機溶剤としては、特には限定されないが、例えばトルエン、ゼン、キシレン、へキサン、シクロへキサン、ヘプタンのいずれかの一種又は二種以上混合して用いても良い。好ましくは経済性の点からトルエンである。エステル系溶剤としては、酢酸ェチル、酢酸イソプロピル、酢酸イソブチル等が挙げられる。

エーテル系溶剤としては、ジプロピルエーテル、ジブチルエーテル、 1 , 4- ジォキサン、メチル t—プチルエーテル等が挙げられる。

これら上記溶剤は、各々単独で用いても良いし、同種または異種の溶剤を任意の割合で混合して用いても良い。

有機溶剤への置換は、一度に行っても良いし、複数回に分けて行っても良い。また、置換する有機溶剤の使用量は、有機溶剤の種類、濃縮の減圧度、内温により異なるので一概には言えないが、例えばトルエンの場合、一回の投入量として、水溶液の全重量に対して、好ましくは 0. 1〜 100倍重量であり、より好ましくは 0. 2〜 1 0倍重量である。

有機溶剤添加後、水を系外に除去しつつ、光学活性 α—メチルシスティン又はその塩を晶出させるときの濃度としては、溶質としての光学活性 α—メチルシスティン又はその塩が 0. 1〜70重量％、好ましくは 1〜70重量％である。上記操作により、系外に水を除去した後に最終的に残存する水の量としては、光学活性 α—メチルシスティン又はその塩に対して、 100重量％以下であることが好ましく、得られる結晶の性状、ろ過性、晶出率、スラリーの流動性の点からは、 40重量％以下まで水を系外に除去することがより好ましい。

濃縮を行う際の蒸発速度としては、装置の能力に依存するので一概には言えないが、蒸発速度を大きくすると、発泡が激しくなり得られるスラリーの流動性が極めて悪くなり、また塊状化する傾向にある。したがって、蒸発速度を、単位蒸発面積及び単位時間あたりの速度として 1000 LZh ■ m ²以下に制御するのが好ましい。 600 L/h ■ m ²以下がより好ましく、 300 L/h · m²以下が更に好ましく、 100 L/h · m²以下が特に好ましい。

有機溶剤投入後濃縮を行う際の減圧度としては、通常 50 OmmHg以下であり、好ましくは 20 OmmHg以下である。下限は特に制限されないが、通常 0. ImmHg以上である。濃縮時の温度は、減圧度、装置の能力に依存するが、取り扱いが容易な、高品質の結晶を取得する為には、 0 °C~ 1 5 0 °Cであり、好ましくは 1 0 °C〜1 0 0 °C、より好ましくは 3 0〜7 0 °Cである。

次に、光学活性 α—メチルシスティン又はその塩の水溶液から、無機塩を除去した後に、該化合物を晶析取得する方法について下記に詳細に記載する。光学活性 α _メチルシスティン又はその塩の水溶液に有機溶剤を添加し、濃縮を行い、水を系外に除去すると共に有機溶剤に置換する。このとき、難溶性無機塩の大半は析出しており、ろ過等の方法により無機塩を除去することができる。そして、得られたろ液から、貧溶媒添加、冷却、又は濃縮等の操作により、該化合物を晶出させることにより、.光学活性 α—メチルシスティン又はその塩を結晶として取得することができる。

上記操作により、有機溶剤を添加し、系外に水を除去するとき最終的に残存する水の量としては、光学活性メチルシスティン又はその塩に対して、好ましくは 1 0 0重量。/ Q以下であり、除去すべき無機塩の析出量の点から、 4 0重量％以下まで水を系外に除去することがより好ましい。

置換する有機溶剤の種類は、特には限定されないが、無機塩が難溶又は不溶で、かつ、光学活性 _α _メチルシスティン塩酸塩が可溶な物性を有している点で、水と相溶性のある有機溶剤が好ましい。より好ましくは、アルコール系溶剤単独、水と相溶性のあるエーテル系溶剤単独、又は、各々を任意に混合した溶剤である。アルコール系溶剤としては、例えばメチルアルコール、エチルアルコール、 η 一プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、 η—プチルアルコール、イソプチノレアルコーノレ、 s e c—ブチノレアルコーノレ、 t一ブチルアルコーノレ等が挙げられる。これらの中から任意に 1種を単独で用いても良いし、 2種以上を任意の割合で混合して用いても良いが、脱水効率、経済性、エステル化等の副反応を低減する観点から、好ましくはイソプロピルアルコールである。

上記水と相溶性のあるエーテル系溶剤としては、例えば、ジェチルエーテル、ジイソプロピ /レエ一テル、テトラヒドロフラン、 1 , 4一ジォキサン、メチルー t一プチルエーテル等が挙げられる。これらの中から任意に 1種を単独で用いても良いし、 2種を任意の割合で混合して用いても良いが、脱水効率、経済性の点から、好ましくはテトラヒドロフランである。

難溶性無機塩を除去後、得られるろ液から、光学活性 α—メチルシスティン又はその塩を晶出させる方法としては特には限定されず、例えば貧溶媒添加、冷却、又は濃縮等の一般的な晶析操作が実施可能であるが、好ましくは貧溶媒を添加する方法である。

上記貧溶媒としては、特には限定されず、炭化水素系溶剤、エステル系溶剤、水と相溶性のない又は低いエーテル系溶剤等が挙げられる。結晶の析出量、純度の点から、好ましくは炭化水素系溶剤及びエステル系溶剤である。より好ましくは炭化水素系溶剤である。

上記炭化水素系溶剤としては、特には限定されないが、例えばトルエン、ベンゼン、キシレン、へキサン、シクロへキサン、ヘプタン等が挙げられ、好ましくはトルエン、' キシレン、へキサン、ヘプタン、より好ましくはトルエンである。上記エステル系溶剤としては、特には限定されないが、例えば酢酸メチル、酢酸ェチル、酢酸プロピル、プロピオン酸メチル、プロピオン酸ェチル等が挙げられ、好ましくは酢酸ェチルである。

水と相溶性のない又は低いエーテル系溶剤としては、特には限定されないが、例えばジプロピノレエーテノレ、ジブチノレエーテノレ、 1， 4一ジォキサン、メチノレ t —プチルエーテル等が挙げられる。

光学活性ひ一メチルシスティン又はその塩を晶出させるときの当該化合物の濃度としては、温度、溶媒比等により異なるが、溶液全体に対して、通常 0 . 1〜 7 0重量％、好ましくは 1〜 7 0重量％、より好ましくは 2〜 7 0重量％である。本発明の晶析方法によれば、高純度の光学活性ひ一メチルシスティン又はその塩を工業的に実施可能な工程で良好に取得できる。また、本発明の晶析方法で取得した結晶中の対応するジスルフイド体含有量は、 1 . 0モル％以下、好ましくは 0 . 5モル％以下、より好ましくは 0 . 1モル％以下である。ジスルフィド体の含有量の低い光学活性 α—メチルシスティン又はその塩を得るために好ましい形態は、酸との塩であり、より好ましくはハロゲン化水素酸との塩、さらに好ましくは塩酸との塩である。発明を実施するための最良の形態

以下に実施例を挙げ、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

(参考例 1 ) ラセミ体 5—メチルー 5 _ tーブチルチオメチルヒダントインの製造方法

窒素風船を備えた反応容器に、 5w t%水酸化ナトリウム水溶液（9. 6 g, 1 2mmo 1 ) 、 tーブチノレメノレカプタン（ 1. 1 3mL, 1 Ommo 1 ) を 0 °Cで混合し、 10分間攪拌した。クロ口アセトン（0. 79m L, 1 Ommo 1 ) を加え、室温に昇温し 2時間反応させた。このとき反応溶液は淡黄色で二相分離していた。反応容器にジムロート型冷却管を備え、 Na CN (588mg, 1 2mmo 1 ) 、 (NH₄) HC0₃ (2. 77 g , 3 5 mm o 1 ) 、 28%アンモニァ水（3. lmL) を加え、均一な溶液とした後、 55— 60°Cに昇温した。 6時間加熱攪拌した後、 0°Cに冷却し、反応溶液に濃塩酸を加え pH= 7. 0- 7. 6に調整した。生成した白色結晶を濾別し、 NMR分析を行ったところ目的物（1. 84 g、収率 84. 8%) であった。 (参考例 2 ) 5— (2—メトキシフエ-ルメチノレ) —5—メチノレーヒダントインの製造方法

2—メトキシフエニノレアセトン（16. 4 g、 10 Ommo 1 ) と水 164 g を混合し、これに Na CN (5. 88 g、 1 2 Ommo 1 ) 、 (NH₄) HCO a (27. 7 g、 35 Ommo 1 ) 、 28%アンモニア水 27. 7 gを加えた。 50°Cで 4時間、 60°Cで 1 2時間攪拌した後に、 23 °Cまで放冷し、濃塩酸を加え pH7. 5に調整した。析出した固体をろ取し、トルエンで洗浄した後に、減圧乾燥し、標題化合物 22. 10 g (収率 94. 5 %)を得た。

NMR (30 OMH z , CDC 1₃) δ ： 7. 10-6. 88 (m, 4 H) , 5. 49 (b r s， 1 H) ， 3. 86 (s， 3 H) , 3. 20 (d, 1 H ) , 2. 9 7 (d， l H) ， 1. 49 (s , 3H) 。

(参考例 3 ) ラセミ体 N—力ルバモイルー S_ t—プチル一 _メチルシスティンの製造方法

ラセミ体 5—メチルー 5—チオメチルヒダントイン（4. 77 g , 22. 1 m mo 1 ) を 10 %水酸化ナトリゥム水溶液（ 75 g ) に溶解し、 72時間還流させた。室温まで放冷後、反応液を一部抜き取り、 HPLC (カラム：コスモシル AR- I I (ナカライ社製）、移動相：リン酸ニ水素力リウム■ リン酸水溶液（ pH2. 0) Zァセトニトリル = 97/3、流速： 1. 0 m 1 /m i n、検出波長： 210 nm、カラム温度： 40°C、保持時間 21. 1 5分）にてラセミ体 S 一 t—プチルー α—メチルシスティンの生成を確認した。濃塩酸にて ρΗを 8に調整した後、溶液を 70 °Cに加熱、シアン酸カリウム（2. 07 g) を蒸留水（ 1 OmL) に溶解した溶液を 20分かけて滴下した。滴下終了後、 5時間攪拌した後、反応液の一部を抜き取り H P L Cにて分析したところ未反応のァミノ酸が認められたので、さらにシアン酸カリウム（4. 14 g) を蒸留水（2 OmL) に溶かした溶液を 20分かけて滴下した。滴下終了後、さらに 1時間攪拌し室温まで放冷、濃塩酸にて PHを 2とし、析出した固体をろ取した。得られた固体を水洗、乾燥させ¹ H NMRで分析したところ目的物であることがわかった（3. 38 g、収率 66 %) 。

(実施例 1) N—力ルバモイルー S— t—ブチルー α—メチル一L—システィン及び D— 5 - t一プチルチオメチル一 5—メチルヒダントインの製造方法

WO 96/20275記載の培養方法と固定化酵素の調製方法に従い、バチルス s p. KN 245株（FERM BP— 4863) を培養、集菌後、超音波破砕して得た酵素液に、固定化用担体である陰イオン交換樹脂、 Du o 1 i t e A— 568を添加して酵素を吸着させ、さらにグルタルアルデヒドで架橋処理することで固定化ヒダントイナーゼを得た。

次に、参考例 2で得たラセミ体の N—力ルバモイル一 S一 t一ブチル—α—メチルシスティン 1 5mgに 0. 1Mリン酸カリウム緩衝液（pH7. 0) 1. 5 m l と 0. 5 M硫酸マンガン水溶液 0. 003m 1を加え 10 N水酸化ナトリウム水溶液により PH6. 5に調整した溶液に、上記の様にして得られた固定化ヒダントイナーゼ 20 Omg (湿重量）を加えて、 40°C、 48時間攪拌して反応させた。反応中は 6 N塩酸により pHを 6. 5付近に保った。反応液を HP LC 分析（カラム： CO SMO S I L 5 C 8— MS、移動相：ァセトニトリル /1 0 mMリン酸ニ水素力リゥム水溶液 = 3/7, 流速： 0. 8m l /m i n、検出波長： 210 nm、カラム温度： 40。C) した結果、 N—力ルバモイル一 S— t 一プチルー α—メチルシスティンの残存率は 41 %であった。さらに、反応液中 Ν—カノレバモイノレ一 S_ t—プチルー α—メチルシスティンの光学純度を HP L C分析（カラム： CH I RAL PAK AS (ダイセル社製）、移動相：へキサン /イソプロパノール/トリクロ口酢酸 = 7ノ 3/0. 0 1、流速： 0. 5m l /m i n、検出波長： 210 n m、カラム温度： 30 °C) したところ 96. 7% e eであった。また、得られた光学活性 N—力ルバモイルー S— t—プチルー一メチルシスティンが L体であることを、実施例 9及び 10に示す方法でメチルシスティンに誘導して旋光度を測定することで確認した。

—方、上記酵素反応中に生成し析出した化合物を酢酸ェチルで抽出した後、キラル HP L Cで分析 (カラム： CI- I I RALPAK AD (ダイセル社製) 、移動相：へキサン/ィソプロパノール = 10/3、流速： lm lZm i n、検出波長： 210 nm、カラム温度： 30°C) したところ、溶出時間が標品と一致したことから光学活性 5— t—ブチルチオメチルー 5ーメチルヒダントインであることを確認した（面積比から化学純度 88 %、光学純度 100%e e) 。また、得られた光学活性 5一 t一プチルチオメチルー 5ーメチルヒダントインが D体であることを、別途合成した標品との HP LC分析（カラム： CH I RALPAK AD (ダイセル社製) 、移動相：へキサンノイソプロパノール = 10/1、流速 : 1m l /m i n、検出波長： 210 n m、カラム温度： 30。C、 D体： 14. 7分、 L体： 25. 3分）による保持時間の比較により確認した。

N—力ノレパモイノレー S— t一ブチル一α—メチノレ一 L—システィン： NM R (30 OMH z , CD₃OD) δ ： 3. 22 (d， 1 H) , 3. 16 (d, 1 Η) ， 1. 5 2 (s， 3Η) , 1. 29 (s， 9 Η) D— 5— t _プチルチオメチル _ 5—メチルヒダントイン： ¹ H NMR (30 ΟΜΗζ, CD C 1 a w i t h 3 d r o s o f CD₃OD) 6 ： 2. 90 (d, 1H) ， 2. 80 (d， 1H) ， 1. 49 (s， 3 H) , 1. 30 ( s , 9 H) 。

(実施例 2 ) 形質転換微生物ェシェリヒア · コリ HB 101 PTH104を用いた N—力ルバモイルー S_ t—プチルーひ一メチルー L—システィンの製造方法

バチルス s p. KNK245株（FERM BP— 4863) のヒダントイナーゼ遺伝子を組み込んだ形質転換微生物ェシェリヒア 'コリ HB 101 p TH 104 (F E RM B P-4864) を 10m l液体培地（ 10 g / 1 トリプトン、 l O g/1 イーストエキス、 5 g/l Na C l、 pH7を 120 °Cで 1 5分間殺菌後、 l O Omg/1 アンピシリンをろ過滅菌にて添加）に植菌し、 37°Cにて 18時間振とう培養した。この培養液 lm lを、 500m l容坂口フラスコ中、 120°Cで 15分間殺菌した 50m 1液体培地（10 gZ 1 トリプトン、 l O g/1 イーストエキス、 5 g/ 1 N a C 1、 H 7) に植菌し、 37°Cにて 24時間振とう培養した。この培養液 1 m 1から遠心分離により得られた菌体を 1. 5m lの 0. 1Mリン酸カリウム緩衝液（pH7. 0) に懸濁し、ラセミ体の N—力ルバモイル一 S— t一ブチル _ α _メチルシスティン 150mgと 0. 5M硫酸マンガン水溶液 0. 003m lを添加後、 10 N水酸化ナトリウム水溶液により pHを 6. 5に調整した。そして、 6 N塩酸により p Hを 6. 5付近に保ちつつ、 40°Cで 24時間攪拌して反応させた。反応液を H PLC分析（カラム： COSMO S I L 5C 8— MS、移動相：ァセトニトリル / 10 mMリン酸ニ水素力リゥム水溶液 = 3/7, 流速： 0. 8m l /m i n、検出波長： 210 nm、カラム温度： 40°C) した結果、 N—力ルバモイルー S 一 t一ブチル一ひ一メチルシスティンの残存率は 49%であった。さらに、反応液中 N—力ルバモイルー S - tーブチルー α—メチルシスティンの光学純度を H PLC分析（カラム： CH I RALPAK AS (ダイセル社製）、移動相：へキサン/イソプロパノール/トリクロ口酢酸 =7/3/0. 01、流速： ◦. 5 m 1 /m i n、検出波長： 2 1 0 n m、力ラム温度： 30 °C) したところ 94. 6 % e eであり、また、実施例 1で得られた N—力ルバモイルー S— t—ブチル一 α—メチル一 L一システィンとの保持時間の比較から L体であることを確認した。

(実施例 3 ) バチルス属細菌を用いた Ν—力ルバモイルー S— tーブチルー a一メチルー L—システィンの製造方法

バチルス s p. KNK245株（FERM B P— 48 6 3) の乾燥保存菌体を、 5 00m 1容坂ロフラスコ中、 1 20°Cで 1 5分間殺菌した 1 0 Om 1液体培地（l O g/ 1 ポリペプトン、 l O gZl 肉エキス、 5 g/ l ィーストエキス、 _PH7. 5) に植菌し、 4 5 °Cにて 1 5時間振とう培養した。この培養液 2m 1を、上記培地成分にさらに 1 gZl ゥラシル、 20mg/l 塩化マンガンを加えた培地に植菌し、 4 5°Cにて 24時間振とう培養した。この培養液 1 5m 1から遠心分離により得られた菌体を 1. 5m lの 0. 1Mリン酸カリゥム緩衝液（ρΗ7. 0) に懸濁し、ラセミ体の Ν—力ルバモイルー S— t—ブチノレ一 α—メチノレシスティン 1 5 Oragと 0. 5 M硫酸マンガン水溶液 0 · 00 3m lを添加後、 1 ON水酸化ナトリウム水溶液により pHを 6. 5に調整した。そして、 6N塩酸により pHを 6. 5付近に保ちつつ、 40°Cで 1 9時間攪拌して反応させた。反応液を HP LC分析（カラム： COSMOS I L 5 C 8 _M S、移動相：ァセトニトリル/ 1 0 mMリン酸ニ水素力リゥム水溶液 = 3/7, 流速： 0. 8m l /m i n、検出波長： 2 10 n m、カラム温度： 40 °C) した結果、 N—力ルバモイルー S— t—プチルー a—メチルシスティンの残存率は 4 4%であった。さらに、反応液中 N—カノレバモイノレ一 S— tーブチノレー α—メチルシスティンの光学純度を I- IP LC分析（カラム： CH I RAL P AK AS ( ダイセル社製）、移動相：へキサン Zイソプロパノール/トリクロ口酢酸 =9Z 1/0. 0 1、流速： 0. 5m 1 Zm i n、検出波長： 2 1 0 nm、カラム温度： 3 0°C) したところ 9 9. 0°/oe eであり、また、実施例 1で得られた N—力ルバモイルー S— t一プチルー α—メチルー L一システィンとの保持時間の比較からし体であることを確認した。 (実施例 4) シユードモナス属細菌を用いた N—力ルバモイルー S— t一プチル一 α—メチルー L—システィンの製造方法

シユードモナス ·プチダ (P s e u d omo n a s p u t i d a ) I FOl 2996を固体培地（10 gZ 1 ポリペプトン、 2 g/l イーストエキス、 l g/1 硫酸マグネシウム七水和物、 1 5 gZl 寒天、 pH7. 0) で 30 °Cにて 24時間培養した。この菌体一白金耳を、 50 Om 1容坂ロフラスコ中、 1 20°Cで 15分間殺菌した 10 Om 1液体培地（20 g/ 1 肉エキス、 6 g / 1 グリセロール、 l gZl ゥラシル、 2 g/l リン酸二水素カリウム、 l g/ 1 硫酸マグネシウム七水和物、 40mgZl 塩化カルシウム二水和物、 20 m g Z 1 硫酸第一鉄七水和物、 20 m g / 1 硫酸マンガン四〜六水和物、 2 Omg/ 1 硫酸銅五水和物、 pH5. 5) に植菌し、 30でにて24時間振とう培養した。この培養液 10mlから遠心分離により得られた菌体を 1 m 1の 0. 1Mリン酸カリウム緩衝液（pH7. 0) に懸濁し、ラセミ体の N—力ルバモイノレ一 S_ t—ブチルー一メチノレシスティン 1 Omgと 0. 5 M硫酸マンガン水溶液 0. 002m lを添加した。そして、 6N塩酸にょり pHを6. 5付近に保ちつつ、 40°Cで 50時間攪拌して反応させた。反応液を HP LC分析（力ラム： COSMOS I L 5 C 8 -MS, 移動相：ァセトニトリル / 1 OmMリン酸ニ水素力リゥム水溶液 = 3 Z 7、流速： 0. 8 m 1 /m i n、検出波長： 2 10 nm、カラム温度： 40°C) した結果、 N—力ルバモイルー S _ t—ブチル一 α—メチルシスティンの残存率は 52%であった。さらに、反応液中 Ν—カルバモイルー S— t—プチル一α_メチルシスティンの光学純度を H PLC分析 ( カラム： CH I RALPAK AS (ダイセル社製）、移動相：へキサン Zイソプロパノール/トリクロ口酢酸 = 9Z 1/0. 01、流速： 0. 5 m 1 /m i n , 検出波長： 210 n m、カラム温度： 30 °C) したところ 95. 6 % e eであり、また、実施例 1で得られた N一力ルバモイル一 S _ t—プチルー α—メチルー L —システィンとの保持時間の比較から L体であることを確認した。

(害施例 5) ァグロパクテリゥム属細菌を用いた Ν—力ルバモイルー S— tーブチルー α—メチルー L—システィンの製造方法

ァグロバタテリゥム ' スピーシーズ KNK 71 2株（F ERM BP— 19 00 ) を大型試験管中、 1 20 °Cで 15分間殺菌した 10 m 1液体培地（ 10 g / 1 ポリペプトン、 l O g/1 肉エキス、 5 g/l ィーストエキス、 5 g / 1 グリセリン、 5 gZl リン酸二水素カリウム、 5 gZl リン酸水素二ナトリウム、 ρΗ6. 5) に植菌し、 30°Cにて 24時間振とう培養した。この培養液 lm lを、 10 Om 1液体培地（25 g/ 1 グリセリン、 5 g / 1 シユークロース、 _{5 g}Zi リン酸二水素カリウム、 5 g/l リン酸水素ニナトリウム、 l g/1 リン酸マグネシウム七水和物、 l OmgZl 塩化マンガン四水和物、 4 g/l イーストエキス、 pH6. 5を 1 20°Cで 1 5分間殺菌後、 2 g/ 1 ゥレア、 l g/1 D— N—力ルバモイルー α— ρ—ヒドロキシフエニルダリシンをろ過滅菌にて添加）に植菌し、 33°Cにて 23時間振とう培養した。この培養液 5m 1から遠心分離により得られた菌体を lm 1の 0. 1Mリン酸カリウム緩衝液 (pH7. 0) に懸濁し、ラセミ体の N—カルパモイル一 S— t—プチルー α—メチルシスティン 1 Omgと 0. 5 M硫酸マンガン水溶液 0 · 002m lを添加した。そして、 61^塩酸にょり 1)«[を6. 5付近に保ちつつ、 40°Cで 5時間攪拌して反応させた。反応液を HPLC分析（カラム： COSM O S I L 5 C 8 -M S、移動相：ァセトニトリル Z 10 mMリン酸ニ水素力リゥム水溶液 = 3/7, 流速： 0. 8m l /m i n、検出波長： 210 n m、カラム温度： 40°C) した結果、 N—力ルバモイル一 S— t—プチルー α—メチルシスティンの残存率は 23%であった。さらに、反応液中 Ν—力ルバモイルー S— t一プチルーひ一メチルシスティンの光学純度を HP LC分析 (カラム： C H I RALPAK AS (ダイセル社製）、移動相：へキサン Zイソプロパノール Z トリクロ口酢酸 =9 1Z0. 01、流速： 0. 5 m 1 Zm i n、検出波長： 2 10 nm、カラム温度： 30°C) したところ 85. 8 % e eであり、また、実施 ί列 1で得られた Ν—力ノレバモイノレー S— t一ブチノレー α—メチノレー L一システィンとの保持時間の比較から L体であることを確認した。

(実施 _例 6 )一 D— 5— t一プチルチオメチルー 5—メチルヒダントインの製造方実施例 3の方法により得られた酵素と D— 5— t—プチルチオメチルー 5—メチルヒダントインの混合物（50 g) に不純物として含まれる S— t—プチルー _α—メチルー L—システィンを除去するために、水（400 g) を加え攪拌した後に不溶分をろ取し、水（200 g) でさらに洗浄した。これに 5w t%水酸化ナトリウム水溶液（120 g) を加え、攪拌した。酵素を不溶分としてろ別し、ろ液を濃塩酸にて pH= 9に調整した。析出した結晶をろ取し、これを水洗した後に、減圧下にて乾燥を行い、粗生成物を結晶として得た（1 9. 7 g) 。これを H PLCにて分析（カラム： COSMOS I L 5 C 8— MS、移動相：ァセトニトリル/リン酸ニ水素力リウム ' リン酸水溶液 (pH2. 0) =2/8, 流速： 1. 0 m 1 /m i n、検出波長： 210 n m、カラム温度： 40 °C) し、標品との比較により純度及び収率を算出したところ、純度 87. 5 w t%, 収率 7 9. 6%であった。また光学純度は、 HPLC分析（カラム： CH I RAL PA K AS (ダイセル社製）、移動相：へキサン/イソプロパノール = 9/1、流速： 1. 0 m 1 /m i n、検出波長： 210 n m、カラム温度： 30 °C, 保持時間： D体 = 15. 2分，体= 39. 8分）により決定し、 97. 6%e eであつた。

(実施例 7) S— t一プチルー α—メチル一D—システィンの製造方法

実施例 1〜5のいずれかの方法で取得した D - 5 - t一プチルチオメチルー 5 —メチルヒダントインと酵素混合物（80 g) に、 10 w t%水酸化リチウム水溶液（1 50mL) を加えて溶解させた。酵素をろ別した後に、母液中に含まれる D— 5— t—ブチルチオメチル一 5—メチルヒダントインを HP LC (分析条件は実施例 6と同じ）にて定量したところ 44. 2 g含有していた。この溶液に水酸化リチウム（54 g) 、蒸留水（5 1 g) を加え 38時間加熱還流した。室温まで放冷し、生じた固体をろ別した。母液を内温 20°C付近に保ち、濃塩酸 (1 10 g) を加え pH=6. 7に調整し、内温 2° Cに冷却し 2時間攪拌を続けた。次に生じた固体をろ取し、 40。Cで 24時間真空乾燥し、乾燥結晶（3 4. 9 g) を取得した。 HPLC (カラム： C o smo s i 1 5 C 18— AR (ナカライ社製）、移動相：リン酸ニ水素カリゥム · リン酸水溶液（pH2. 0 ) /ァセトニトリル= 90/10、流速： 1. Om l /m i n、検出波長： 21 O nm、カラム温度： 40°C) で分析して、上記目的物であることを確認し、標品との比較により純度及び収率を決定した（純度 96. 7 w t %, 収率 85. 7

%) 。

(実施例 8 ) α—メチルー D—システィン塩酸塩の製造方法

S— t—プチルー α—メチルー D—システィン（20 g) を濃塩酸（180 g ) に溶解させ 45時間加熱還流した。室温まで放冷し、反応溶液を 35 gまで濃縮した。これを 40° Cに加温し、トルエン（l l OmL) を加え、約 40 gになるまで濃縮した。この操作をさらに 4回行い、生じた固体をろ取し、 60°C で 48時間真空乾燥し、標題化合物を白色固体として得た（1 5. 3 g) 。 HP LC (カラム： CAPCELL PAK S C X (資生堂社製）、移動相：リン酸二水素力リウム . リン酸水溶液（pH2. 0) Zァセトニトリル = 95/5、流速： 0. 3 m 1 /m i n、検出波長： 210 n m、カラム温度： 30 °C) で分析したところ、上記目的物であることを確認した（収率 84. 6%) 。また旋光度を測定したところ、 [a] ^D ₂₀ =— 6. 28 (c 1. 21， H₂0) であり、符号が実施例 10で得られた _α—メチル _ L一システィン塩酸塩と逆であることから、立体が目的とする D体であることを確認した。

(実施例 9) α—メチルー L一システィン塩酸塩の製造方法

Ν—カノレバモイノレ一 S— tーブチノレー α—メチノレ一 L—システィン（100m g， 0. 43mmo 1 ) を濃塩酸（lmL) に溶解し、窒素下、 60時間還流させ、 α—メチルー L一システィン塩酸塩の水溶液を得た。

(実施例 10) a—メチル—L一システィン塩酸塩の単離方法

実施例 9で得られた α—メチルー L—システィン塩酸塩反応溶液に、イソプロピルアルコール（0. 5mL) を加えて減圧下濃縮し、共沸脱水を行った。同様の操作を 3回繰り返し、容量が約 1/3となったところで濃縮を止め、 60でに加熱、トルエン（lmL) を加え、攪拌しながら室温まで放冷した。そのまま約 1時間攪拌した後、析出した結晶をろ別、トルエンで洗浄し、減圧下乾燥させ、標題化合物を白色固体として得た（44. 3mg) 。 HPLC (実施例 8の分析条件）で分析したところ、上記目的物であることを確認した（収率 60. 0%) 。また旋光度を測定したところ、 [a] ^D ₂₀= 8. 77 (c 1. 1 5， H₂0) であり、符号が文献値 (T e t r a h e d r o n, 1 993， 49， 21 31〜 2 138, WO 98/381 77) と一致することから、立体が目的とする L体であることを確認した。

NMR (30 OMH z， D₂0) δ ： 3. 1 8 (d， 1 H) , 2. 8 9 ( d， lH) , 1. 60 (s， 3H) 。

(実施例 1 1) S— t一プチルー α—メチルー L一システィンの製造方法

N—カノレバモイノレ一 S_ t—ブチルー a—メチノレ一 L—システィン（82. 4 g, 351. 4mmo 1 ) を 18 %水酸化リチウム水溶液（ 630 g ) に溶解し、窒素下、 41時間還流させた。室温まで放冷後、不溶分をろ別した後の溶液に濃塩酸（180. 1 g) を加えて pHを 6に調整し、そのまま約 1時間攪拌した後に 4〜 5 ° Cに冷却し、さらに 1時間攪拌した。得られた結晶をろ別し、水洗の後に減圧下乾燥を行い、標題化合物を白色固体として得た（53. 9 g) 。 HP LC (カラム： C o smo s i l 5 C 18—AR (ナカライネ土製）、移動相：リン酸ニ水素力リウム · リン酸水溶液 (p H2. 0) Zァセトニトリル = 90/ 10、流速： 1. 0m l /m i n、検出波長： 210 n m、カラム温度： 40°C ) で分析したところ、上記目的物であることを確認した（収率 85, 7 %) 。 ^ΐΊΆ NMR ( 30 OMH z , D₂0) δ ： 3. 1 8 (d, 1 H) , 2. 9 1 ( d， 1H) , 1. 60 (s， 3H) , 1. 35 (s , 9H) 。

(実施例 1 2) ひーメチルー L一システィン塩酸塩の製造方法

実施例 1 1記載の方法で得られた $— t一プチルー a—メチルー L一システィン（38. 4 g, 201mm o 1 ) に濃塩酸（345. 3 g ) を加え、 24時間還流し、 a—メチルー L一システィン塩酸塩の水溶液を得た。 (実施例 13) ーメチルー L—システィン塩酸塩の単離方法

実施例 12により得られた α—メチルー L一システィン塩酸塩反応溶液を 67. 5 gにまで濃縮（減圧度 30〜6 OmmHg、温度 45°C) し、トルエン（20 6 g) を加え、減圧濃縮操作（減圧度 40〜6 OmmHg、温度 40°C、留出速度 107 L/h ■ m²) を行い、全量 109 gとした。さらにトルエン（206 g) を加えて濃縮し、同様の操作を合計 6回繰り返し、得られた α—メチルー L 一システィン塩酸塩トルエンスラリー（104 g) を得た。このものの水分含量は 30重量⁰ /₀ (対 α—メチルー L—システィン塩酸塩）であった。ろ過し、トルェンにて結晶を洗浄、減圧下乾燥（0〜； L 0 OmmHg、 30〜80°C、 5— 1 0時間）させ、標題化合物を白色固体として得た（32. 2 g、収率 93. 4% ) ₀

(実施例 14) α—メチルー L一システィン塩酸塩の製造方法

実施例 11記載の方法で得られた S - t一プチル一 Q;—メチル— L—システィン（ 25 g， 131 mm o 1 ) に水（ 47. 6 g ) 及び濃塩酸（177. 4 g) を加え、 41時間還流した。さらに濃塩酸（47. 6 g) を加え 3時間還流させた後に、室温まで放冷した。イソプロピルアルコール（90mL) を加え減圧下濃縮を行い、共沸脱水を 3回、同量のイソプロピルアルコールを用いて行った。最後にィソプロピルアルコールを加え濃縮し、容量が約 1Z3となったところで濃縮を止め 60。Cに加熱、トルエン（90mL) を加え、攪拌しながら室温まで放冷した。そのまま約 1時間攪拌した後、析出した結晶をろ取し、トルエンで洗浄し、減圧下乾燥させ、標題化合物を白色固体として得た（13. 5 g、収率 60. 0 %) 。

(実施例 15) D— 5—メルカプトメチルー 5—メチルヒダントインの製造方法実施例 6により得られた D— 5 - tーブチルチオメチル一 5ーメチルヒダントイン（ 4. 38 g) を濃塩酸（ 100 g ) に溶解し、 80 °Cで 18. 5時間攪拌した。室温まで放冷後、約半量となるまで濃縮した後、 30 w t %水酸化ナトリゥム水溶液を 30. 5 g加えて pHを 0とした。酢酸ェチル（10 OmLX 3) で抽出後、有機相を全量の 10%となるまで濃縮した後、トルエン（30mL) を加えて析出した結晶をろ取し、目的の D— 5—メルカプトメチルー 5 _メチルヒダントイン（2. 65 g) を収率 80%で得た。このものの光学純度を HPL C (CH I RALPAK AS (ダイセル社製）、移動相：へキサン Zイソプロノヽ。ノール = 9 Z 1、流速： 1. Om l /m i n、検出波長： 210 n m、カラム温度： 35°C、保持時間 D体； 30. 4分、 L体； 33. 8分）により測定したところ、 L体は検出されなかった。

^XH NMR (400MHz、 M e OH- d 4) δ ： 1. 32 (s、 3 H) 、 2. 60 (d、 1. 6Hz、 1H) 、 2. 72 (d、 1. 6Hz、 1H) 。

(実施例 1 6) α—メチルー L一システィン塩酸塩の光学純度決定法

実施例 1 3記載の方法で得られた _α—メチル— L一システィン塩酸塩（74. 9mg, 0. 44mmo 1 ) を水（3mL) に溶解させ、炭酸水素ナトリウム（ 1 97. 7 m g) を添カ卩し、エタノール 3 m Lを加えた。窒素置換後、クロ口炭酸べンジルエステル（0. 17mL, 1. 1 Ommo 1 ) を加え、室温で 2日間攪拌した。反応液に濃塩酸を添加して pH=l. 9とし、酢酸ェチルで抽出後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去した。これを PTLC (へキサン Z酢酸ェチル = 1/1に少量の酢酸を添加）で精製し¹ H NMRにて分析したところ、目的物（106mg、収率 60%) であることを確した。これを HP L Cにて分析 (カラム： CH I RALCE L OD-RH (ダイセル社製) 、移動相：リン酸ニ水素力リウム · リン酸水溶液（p H 2 · 0 ) Zァセトニトリノレ = 6/4, 流速： 1. Ora l /m i n、検出波長： 210 n m、カラム温度： 3 0°C、保持時間 1 9. 15分（D) 、 22. 92分（L) ) した結果、光学純度は 98. 6 % e eであった。

^XH NMR (30 OMH z , D₂0) 5 ： 7. 30- 7. 40 (m， 10 H) ， 5. 22 (s, 2H) , 5. 10 (s， 2H) ， 3. 60 (s， 2 H) , 1. 6 3 ( s , 3 H) 。 (実施例 17— 21) N—力ルバモイル一 S— tーブチルーひーメチルーシステインの製造方法

5— t—プチルチオメチル— 5—メチルヒダントインに水酸化ナトリゥムと水を加え、所定の温度まで加熱攪拌した。反応液を HPLC分析（カラム： COS MOS I L 5 C 18 -AR (ナカライ社製），移動相：ァセトニトリル Z 10 mMリン酸二水素カリウム水溶液 = 30/70，流速： 1. 0 m 1 /m i η , 検出波長： 21 0 nm, カラム温度： 40°C) し、表題化合物の収率を求めた。結果を表 1に示す。

NaOH 水反応温度反応時間収率実施例

(モル当量） (倍重量） (°C) (時間） (%)

17 3.3 1.4 90 44 82

18 3.3 1.4 95 15 81

19 3.3 1.4 100 9 64

20 2.2 1.0 95 13 80

21 1.6 0.7 95 6 54

(実施例 22) N—力ルバモイルー S— t—ブチル _ a—メチルーシスティンの製造方法

5 - t—プチノレチオメチルー 5—メチノレヒダントイン（5 g、 23 mm o 1 ) と 58%水酸化カリウム水溶液（9. 2 g) を混合した後、 95 °Cまで加熱し、 22時間攪拌した。反応液を HPLC分析した結果、反応収率 92%で表題化合物が生成していた。

(実施例 23) N—力ルバモイルー S— t—ブチルー a—メチルーシスティンの製造方法

5 - tーブチルチオメチル一 5—メチルヒダントイン (5 g、 23mmo 1 ) 、 65 %水酸化力リゥム水溶液 (4. 4 g ) 及び、トルエン 5 m 1を混合した後、 9 5 ° Cまで加熱し、 27時間攪拌した。反応液を H P L C分析した結果、反応収率 88%で表題化合物が生成していた。 (実施例 24) N—力ルバモイルー S— t—プチルー α—メチルーシスティンの製造方法

5— tーブチルチオメチルー 5—メチノレヒダントイン (5 g_s 23 mm o 1 ) 、 7 3 %水酸化力リゥム水溶液（ 5. 7 g) 及び、トルエン 1 0 m 1を混合した後、 9 5。 Cまで加熱し、 5 1時間攪拌した。反応液を H P L C分析した結果、反応収率 9 0%で表題化合物が生成していた。

(実施例 2 5) N—力ルバモイル一 2—アミノー 2—メチルプロピオン酸の製造方法

5， 5—ジメチルヒダントイン 4. 0 g、水酸化ナトリウム 4. 0 g、水 4. O gを混合し、 8 5〜90°Cで 3. 5時間攪拌した。反応混合物を HP LC (力ラム： CO SMOS I L 5 C 1 8-ARH (ナカライ社製），移動相：ァセト二トリル/ 1 0 mMリン酸ニ水素力リゥム水溶液 = 20/80, 流速： 0. 5 m 1 /m i n, 検出波長： 2 1 0 nm，カラム温度： 40°C) にて分析したところ、標題化合物が 3. 3 8 g (収率 74. 1 %) 生成していた。

τΗ NMR ( 3 00MH z , D₂0) δ ： 1. 3 9 ( s， 6 H) 。

(実施例 2 6) N—力ルバモイルー 2—アミノー 3— (2—メトキシフエニル) 一 2—メチルプロピオン酸の製造方法

5— （2—メトキシフエニノレメチノレ）一 5—メチル一ヒダントイン 4. 40 g、水酸化ナトリウム 2. 64 g、水 3. 5 gを混合し、 94~9 6°Cで 3 0時間反応させた。反応混合物を HP LC (カラム： CO SMOS I L 5 C 1 8— AR Π (ナカライ社製），移動相：ァセトニトリル Zl OmMリン酸二水素カリウム水溶液 = 20 Z 8 0 , 流速： 1. 0 m 1 /m i n，検出波長： 2 1 0 n m, カラム温度： 40°C) にて分析したところ、標題化合物と 2—アミノー 3— （2—メトキシフエニル） _ 2—メチルプロピオン酸と原料が 78. 8 : 5. 5 : 1 5. 5の面積比で生成していた。

aH NMR (3 00MH z , D₂0) δ 7. 3 2- 6. 9 0 (m， 4 H) , 4. 84 ( s， 3H) ， 3. 1 9 (d, 1 H) , 3. 1 8 (d, 1 H) ， 1. 3 7 ( s， 3 H) 。

(実施例 27) N—力ルバモイルー S—べンジルー α—メチルーシスティンの製造方法

5—ベンジルチオメチルー 5—メチル一ヒダントイン 5. O g、水酸化力リウム 3. 6 g、水 3 gを混合し、 94〜96°Cで 12時間反応させた。反応混合物を HPLC (カラム： CO SMO S I L 5 C 18 -ARH (ナカライ社製），移動相：ァセトニトリル Z 10 mMリン酸ニ水素力リゥム水溶液 = 30/70, 流速： 1. Om l /m i n，検出波長： 254 n m, カラム温度： 40 °C) にて分析したところ、標題化合物が 3. 56 g (収率 66. 4%) 生成していた。 ^aH NMR ( 30 OMH z , D_sO) 8 ： 7. 40- 7. 30 (m, 5 H) ， 3. 78 (s， 2H) ， 3. 1 5 (d, 1H) ， 3. 14 (d, 1H) ， 1. 4 1 ( s， 3 H) 。 (比較例 1) N—力ルバモイルー S— t一プチルー α—メチルーシスティンの製造方法

5— t—プチルチオメチルー 5—メチノレヒダントイン（5 g、 23 mm o 1 ) 、水酸化バリウム（1 1. 7) 、水（10 g) を混合した後、 95 °Cまで加熱し、 2時間攪拌した。反応液を H PLC分析した結果、反応収率 39%で表題化合物が生成していた。

(比較例 2) N—力ルバモイルー S— t一プチルー α—メチルーシスティンの製造方法 (US 5338859記載の方法により実施）

5— t _プチルチオメチルー 5—メチルヒダントイン（純分 10. 82 g、 5 0. 0 mm o 1 ) 、水酸化カルンゥム 3. 70 g、 50. 0 mm o 1 ) 、水（ 60 g) を混合した後、 100。Cまで加熱し、 3. 5時間攪拌した。反応液を HP LC分析した結果、反応収率 25%で表題化合物が生成していた。産業上の利用可能性以上述べたように、本発明によれば、安価で入手容易な原料から簡便かつ工業的に実施可能な方法によって、医薬品等の中間体として有用な光学活性 a—メチルシスティン誘導体又はその塩の D体、 L体両方を製造することができる。また、該化合物を工業的実施可能な形態で、晶析取得することができる。

Claims

請求の範囲一般式（1)

(式中、 R¹は置換基を有していても良い炭素数 1〜20のアルキル基、置換基を有していても良い炭素数 7〜20のァラルキル基、又は、置換基を有していても良い炭素数 6〜 20のァリーノレ基を表す）で表されるラセミ体 N—力ルバモイルー α—メチルシスティン誘導体又はその塩に、ヒダントイナーゼを作用させ D 体選択的に環化させることを特徴とする、一般式（2) ：

(式中、 R¹は前記と同じ）で表される D 5ーメチノレー 5ーチオメチルヒダントイン誘導体又はその塩及び一般式（3)

(式中、 R¹は前記と同じ）で表される Ν— メチルー Lーシスティン誘導体又はその塩の製造方法。

2. ヒダントイ ^ "一ゼが、ァグロパクテリゥム属（Ag r o b a c t e r i u m) 、バチルス属（B a c i l l u s) 又はシユードモナス属（P s e u d om o n a s) に属する微生物由来である請求の範囲第 1項に記載の製造方法。

3. ヒダントイナーゼが、ァグロバタテリゥム 'スピーシーズ（Ag r o b a c t e r i um s p . ) KNK 71 2 (FERM B P— 1900) 、バチルス ·スピーシーズ（B a c i l l u s s p. ) KNK 245 (FERM BP -4863) 又はシユードモナス■プチダ（P s e u d omo n a s p u t i d a) I F01 2996由来である請求の範囲第 1項記載の製造方法。

4. ヒダントイナーゼを固定化酵素として使用することを特徴とする請求の範囲第 1から 3項のいずれかに記載の製造方法。 5. R¹が置換基を有していても良い炭素数 4~ 1 5の 3級アルキル基である請求の範囲第 1から 4項のいずれかに記載の製造方法。

6. 3級アルキル基が t—プチル基である請求の範囲第 5項記載の製造方法。 7. 一般式（3) ：

(式中、 R¹は置換基を有していても良い炭素数 1〜20のアルキル基、置換基を有していても良い炭素数 7~ 20のァラルキル基、又は、置換基を有していても良い炭素数 6〜 20のァリール基を表す）で表される N—力ルバモイルーひ一メチルー L—システィン誘導体又はその塩を脱力ルバモイル化し、必要に応じて硫黄原子の脱保護を行うことを特徴とする一般式（4) ：

H₂

(⁴)

(式中、 R ²は前記 R¹若しくは水素原子を表す）で表される α—メチルー L ン誘導体又はその塩の製造方法。

8. 脱力ルバモイル化を、亜硝酸、又は、亜硝酸の塩及び酸で処理することにより行い、前記式（4) において R ²が前記式（3) における R¹と同じである化合物を製造することを特徴とする請求の範囲第 7項記載の製造方法。

9. 脱力ルバモイル化をアルカリで処理することにより行い、前記式（4) において R²が前記式（3) における R¹と同じである化合物を製造することを特徴とする請求の範囲第 7項記載の製造方法。 10. 脱力ルバモイル化に用いるアルカリが、水酸化ナトリウム、水酸化カリゥム、水酸化リチウム、水酸化マグネシウム、水酸化バリウム、又は水酸化カルシゥムであることを特徴とする請求の範囲第 9項記載の製造方法。

1 1. 脱力ルバモイル化に用いるアルカリが水酸化リチウムであることを特徴とする請求の範囲第 9項記載の製造方法。

12. 脱力ルバモイル化反応後に、反応溶液に酸を加えて Hを下げることにより、前記式（4) において R²が前記式（3) における R¹と同じである化合物を晶析し、結晶を取得する請求の範囲第 9から 1 1項のいずれかに記載の製造方法。

13. 用いる酸が、塩酸，硫酸，臭化水素酸，硝酸，酢酸，トリフルォロ酢酸から選ばれる任意の 1種あるいは 2種以上の混酸であることを特徴とする請求の範囲第 1 2項記載の製造方法。

14. 用いる酸が塩酸であることを特徴とする請求の範囲第 12項記載の製造方法。

15. 反応溶液の: pHを 9. 5以下に下げることを特徴とする請求の範囲第 1 2から 14項のいずれかに記載の製造方法。

16. 前記式（3) で表される N—力ルバモイルーひ一メチルー L—システィン誘導体又はその塩が、請求の範囲第 1項記載の方法で製造されたものである、請求の範囲第 7から 1 5項のいずれかに記載の製造方法。

1 7. 請求の範囲第 7から 15項のいずれかに記載の方法により得られた、前記式（4) において R²が前記式（3) における R¹と同じである化合物を、酸で処理することにより硫黄原子の脱保護を行うことを特徴とする一般式（5) ：

で表される一メチル一L一システィン又はその塩の製造方法 _c 18. 用いる酸が、塩酸，硫酸，臭化水素酸，硝酸，酢酸，トリフルォロ酢酸から選ばれる任意の 1種あるいは 2種以上の混酸であることを特徴とする請求の範囲第 1 7項記載の製造方法。

1 9. 用いる酸が塩酸であることを特徴とする請求の範囲第 17項記載の製造方法。

20. -般式（3)

において R ¹が炭素数 4〜 1 5の 3級アルキル基である N—力ルバモイルー α— メチルー L一システィン誘導体又はその塩を酸で処理することにより、脱力ルバモイル化と硫黄原子の脱保護を同時に行うことを特徴とする、一般式（5) ：

で表されるひ一メチル—L一システィン又はその塩の製造方法。

21. 用いる酸が、塩酸，硫酸，臭化水素酸，硝酸，酢酸，トリフルォロ酢酸から選ばれる任意の 1種あるいは 2種以上の混酸であることを特徴とする請求の範囲第 20項記載の製造方法。 22. 用いる酸が塩酸であることを特徴とする請求の範囲第 20項記載の製造方法。

23. 前記式（3) において R¹が炭素数 4〜 1 5の 3級アルキル基である N —力ルバモイルー α—メチル一L—システィン誘導体又はその塩が、請求の範囲第 1項記載の方法で製造されたものである請求の範囲第 20から 22項のいずれかに記載の製造方法。

24. 一般式（ 3 )

(式中、 R¹は置換基を有していても良い炭素数 1〜 20のアルキル基、置換基を有していても良い炭素数 7~20のァラルキル基、又は、置換基を有していても良い炭素数 6〜 20のァリール基を表す）で表される Ν—力ルバモイルー α— メチルー L—システィン誘導体又はその塩の、環化及び硫黄原子の脱保護を行うことを特徴とする、一般式（6) ：

で表される L一 5—メチルー 5—チオメチルヒダントイン又はその塩の製造方法。

2 5 . 前記式 ( 3 ) で表される N—力ルバモイルー α—メチルー L一システィン誘導体又はその塩を環化して、一般式（7 ) ：

(式中、 R ¹は前記と同じ）で表される L一 5—メチル一 5—チオメチルヒダントイン誘導体又はその塩とし、次いで酸で処理することにより硫黄原子の脱保護を行うことを特徴とする請求の範囲第 2 4項記載の製造方法。

2 6 . 環化反応を、アルカリを用いて行うことを特徴とする請求の範囲第 2 5 項記載の製造方法。 2 7 . 用いるアルカリが、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、水酸化マグネシウム、水酸化バリウム、又は、水酸化カルシウムであることを特徴とする請求の範囲第 2 6項記載の製造方法。

2 8 . 前記式（3 ) で表される Ν—力ルバモイルー α—メチルー L一システィン誘導体又はその塩を酸で処理することにより、硫黄原子の脱保護と環化を同時に行うことを特徴とする請求の範囲第 2 4項記載の製造方法。

2 9 . 用いる酸が、塩酸、硫酸、臭化水素酸、硝酸、酢酸、トリフルォロ酢酸から選ばれる任意の 1種あるいは 2種以上の混酸であることを特徴とする請求の範囲第 2 5から 2 8項のいずれかに記載の製造方法。

3 0 . 用いる酸が塩酸であることを特徴とする請求の範囲第 2 5から 2 8項のいずれかに記載の製造方法。

3 1 . 前記式 ( 3 ) で表される N—力ルバモイルーひーメチルー L一システィン誘導体又はその塩が、請求の範囲第 1項記載の方法により得られたものである請求の範囲第 2 4から 2 9項記載の製造方法。

3 2 . 請求の範囲第 2 4項記載の方法により得られた前記式（ 6 ) で表される L— 5—メチル一 5—チオメチルヒダントイン又はその塩を加水分解することを特徴とする、一般式（5 ) ：

(5)

で表されるひ一メチルー L—システィン又はその塩の製造方法。

3 3 · 加水分解を酸で行うことを特徴とする請求の範囲第 3 2項記載の製造方法。

3 4 . 用いる酸が、塩酸、硫酸、臭化水素酸、硝酸、酢酸、トリフルォロ酢酸から選ばれる任意の 1種あるいは 2種以上の混酸であることを特徴とする請求の範囲第 3 3項記載の製造方法。 3 5 . 用いる酸が塩酸であることを特徴とする請求の範囲第 3 3項記載の製造方法。

3 6 . —般式（ 2 ) ：

(式中、 R ¹は置換基を有していても良い炭素数 1〜2 0のアルキル基、置換基を有していても良い炭素数 7〜2 0のァラルキル基、又は、置換基を有していても良い炭素数 6〜 2 0のァリーノレ基を表す）で表される D— 5—メチルー 5—チオメチルヒダントイン誘導体又はその塩を加水分解し、必要に応じて硫黄原子の脱保護を行うことを特徴とする、一般式（8 ) ：

(式中、 R ²は前記 R ¹若しくは水素原子を表す）で表される α—メチルー D ン誘導体又はその塩の製造方法。

3 7 . 加水分解を、アルカリを用いて行い、前記式（8 ) において R ²が前記式（2 ) における R ¹と同じである化合物を製造することを特徴とする請求の範囲第 3 6項記載の製造方法。

3 8 . 加水分角早に用いるアル力リが、水酸化ナトリウム、水酸化力リウム、水酸化リチウム、水酸化バリウム、水酸化マグネシウム、又は、水酸化カルシウムであることを特徴とする請求の範囲第 3 7項記載の製造方法。

3 9 . 加水分角？反応後に、反応溶液に酸を加えて Ρ Ηを下げることにより、前記式（8 ) において R ²が前記式（2 ) における R ¹と同じである化合物を晶析し、結晶を取得する請求の範囲第 3 6から 3 8項のいずれかに記載の製造方法。

4 0 . 用いる酸が、塩酸、硫酸、臭化水素酸、硝酸、酢酸、トリフルォロ酢酸から選ばれる任意の 1種あるいは 2種以上の混酸であることを特徴とする請求の範囲第 3 9項記載の製造方法。

41. 用いる酸が塩酸であることを特徴とする請求の範囲第 39項記載の製造方法。

42. 反応溶液の: Hを 9. 5以下に下げることを特徴とする請求の範囲第 3 9から 41項のいずれかに記載の製造方法。

43. 請求の範囲第 36項記載の方法により得られた前記式（ 8 ) で表される化合物において R²が前記式（2) における R¹と同じである化合物を、酸で処理することにより硫黄原子の脱保護を行うことを特徴とする一般式（9) ：

Η₂Ν' 、COOH (⁹)

で表される ο;—メチル _D—システィン又はその塩の製造方法。

44. 用いる酸が、塩酸、硫酸、臭化水素酸、硝酸、酢酸、トリフルォロ酢酸力、ら選ばれる任意の 1種あるいは 2種以上の混酸であることを特徴とする請求の範囲第 43項記載の製造方法。

45. 用いる酸が塩酸であることを特徴とする請求の範囲第 43項記載の製造方法。

において R¹が炭素数 4〜 1 5の 3級アルキル基である化合物を、酸で処理することにより加水分解反応と硫黄原子の脱保護を同時に行うことを特徴とする、一般式（9) ：

H₂IST 、COOH (⁹)

で表される α—メチルー D—システィン又はその塩の製造方法。

47. 用いる酸が、塩酸、硫酸、臭化水素酸、硝酸、酢酸、トリフルォロ酢酸から選ばれる任意の 1種あるいは 2種以上の混酸であることを特徴とする請求の範囲第 46項記載の製造方法。

48. 用いる酸が塩酸であることを特徴とする請求の範囲第 46項記載の製造方法。 49. 前記式（2) において R¹が炭素数 4〜1 5の 3級アルキル基である化合物が、請求の範囲第 1項記載の方法で製造されたものである、請求の範囲第 4 6力ら 48項のいずれかに記載の製造方法。

50. 一般式（ 8 ) ：

. SR²

重

H₂IST 、COOH (⁸)

において R²が下記式（1 0) における R¹と同じである化合物を力ルバモイル化し、一般式（1 0) ：

(式中、 R¹は置換基を有していても良い炭素数 1〜 20のアルキル基、置換基を有していても良い炭素数 7〜 2 0のァラルキル基、又は、置換基を有していても良い炭素数 6〜 2 0のァリール基を表す）で表される N—力ルバモイルー α— メチルー D—システィン誘導体又はその塩とし、次いで環化及び硫黄原子の脱保護を行うことを特徴とする、一般式（1 1 ) ：

H

で表される D— 5—メチルー 5—チオメチルヒダントイン又はその塩の製造方法。

5 1 . 力ルバモイル化を、シアン酸のアルカリ金属塩及び酸を用いて行うことを特徴とする請求の範囲第 5 0項記載の製造方法。

5 2 . 硫黄原子の脱保護と環化反応を酸で行うことを特徴とする請求の範囲第 5 0又は 5 1項記載の製造方法。

5 3 . 用いる酸が、塩酸、硫酸、臭化水素酸、硝酸、酢酸、トリフルォロ酢酸から選ばれる任意の 1種あるいは 2種以上の混酸であることを特徴とする請求の範囲第 5 2項記載の製造方法。

5 4 . 用いる酸が塩酸であることを特徴とする請求の範囲第 5 2項記載の製造方法。

5 5 . 前記式（8 ) において R ²が前記式（1 0 ) における R ¹と同じである化合物が、請求の範囲第 3 6項記載の方法により得られたものであることを特徴とする請求の範囲第 5 0から 5 4項のいずれかに記載の製造方法。

5 6 . —般式（2 ) ：

(式中、 R ¹は置換基を有していても良い炭素数 1〜 2 0のアルキル基、置換基を有していても良い炭素数 7〜2 0のァラルキル基、又は、置換基を有していても良い炭素数 6 ~ 2 0のァリール基を表す）で表される D— 5—メチルー 5—チオメチルヒダントイン誘導体又はその塩を酸で処理することにより、硫黄原子の脱保護を行うことを特徴とする、一般式（1 1 ) ：

で表される D— 5ーメチルー 5—チオメチルヒダントイン又はその塩の製造方法。

5 7 . 用いる酸が、塩酸、硫酸、臭化水素酸、硝酸、酢酸、トリフルォロ酢酸から選ばれる任意の 1種あるいは 2種以上の混酸であることを特徴とする請求の範囲第 5 6項記載の製造方法。

5 8 . 用いる酸が塩酸であることを特徴とする請求の範囲第 5 6項記載の製造方法。

5 9 . 前記式（2 ) で表される化合物が、請求の範囲第 1項記載の方法により得られたものであることを特徴とする、請求の範囲第 5 6から 5 8項のいずれかに記載の製造方法。

6 0 . 請求の範囲第 5 6項記載の方法で得られた、前記式（1 1 ) で表される D— 5—メチルー 5—チオメチルヒダントイン又はその塩を加水分解することを特徴とする、一般式（9 ) ：

で表される α—メチル _D—システィン又はその塩の製造方法。

6 1. 加水分解を酸で行うことを特徴とする請求の範囲第 6 0項記載の製造方法。

6 2. 用いる酸が、塩酸、硫酸、臭化水素酸、硝酸、酢酸、トリフルォロ酢酸から選ばれる任意の 1種あるいは 2種以上の混酸であることを特徴とする請求の範囲第 6 1項記載の製造方法。

6 3. 用いる酸が塩酸であることを特徴とする請求の範囲第 6 1項記載の製造方法。

64. 光学活性 α -メチルシスティン又はその塩の水溶液から、有機溶剤の共存下に、該化合物の晶出を行うことを特徴とする光学活性ひ -メチルシスティン又はその塩の晶析方法。 6 5. 光学活性 α -メチルシスティンの酸との塩を取得する請求の範囲第 64 項記載の晶析方法。

6 6. 光学活性 α -メチルシスティンのハロゲン化水素酸との塩を取得する請求の範囲第 6 5項記載の晶析方法。

6 7. 光学活性ひ -メチルシスティン塩酸塩を取得する請求の範囲第 6 5項記載の晶析方法。

6 8. 請求の範囲第 7、 1 7、 20、 3 2、 36、 43、 4 6又は 60項に記載の方法により製造された光学活性ひ -メチルシスティン又はその塩を晶析する、請求の範囲第 6 4から 6 7項のいずれかに記載の晶析方法。

6 9 . 光学活性 a -メチルシスティン又はその塩の水溶液から、有機溶剤の共存下に、濃縮を行い、水を系外に除去すると共に、有機溶剤に置換し、該化合物を晶出させる請求の範囲第 6 4から 6 8項のいずれかに記載の晶析方法。

7 0 . 有機溶剤として、水と相溶性の低い又はない有機溶剤を用いる請求の範囲第 6 9項記載の晶析方法。

7 1 . 有機溶剤として、炭化水素系溶剤、エステル系溶剤、又はエーテル系溶剤を用いる請求の範囲第 6 9又は 7 0項記載の晶析方法。

7 2 . 有機溶剤として、炭化水素系溶剤を用いる請求の範囲第 6 9又は 7 0項記載の晶析方法。

7 3 . 炭化水素系溶剤として、トルエン、ベンゼン、キシレン、へキサン、シク口へキサン及びヘプタンから選ばれる一種又は二種以上の混合溶剤を用いる、請求の範囲第 7 2項記載の晶析方法。

7 4 . 光学活性 α—メチルシスティン又はその塩の濃度が 1〜 7 0重量％で晶出を行う、請求の範囲第 6 9から 7 3項のいずれかに記載の晶析方法。

7 5 . 残存する水の量として、光学活性 _α _メチルシスティン又はその塩に対して 1 0 0重量。 /₀以下まで濃縮、溶剤置換し、晶出する光学活性 α—メチルシスティン又はその塩を取得する、請求の範囲第 6 9から 7 4項のいずれかに記載の晶析方法。

7 6 . 濃縮時の蒸発速度を、 1 0 0 0 L / h · m ²以下に制御して行う請求の範囲第 69から 75項のいずれかに記載の晶析方法。

77. 濃縮時の蒸発速度を、 600 L/h ■ m²以下に制御して行う請求の範囲第 69から 75項のいずれかに記載の晶析方法。

78. 濃縮時の蒸発速度を、 300 L/h · m²以下に制御して行う請求の範囲第 69から 75項のいずれかに記載の晶析方法。

79. 濃縮時の減圧度を、 50 OmmHg以下に制御する請求の範囲第 69から 78項のいずれかに記載の晶析方法。

80. 光学活性 α—メチルシスティン又はその塩の水溶液から、有機溶剤の共存下に、濃縮を行い、水を系外に除去すると共に有機溶剤に置換し、析出する難溶性無機塩をろ別した後、該化合物の溶液から、貧溶媒添加、冷却、又は濃縮の操作により、該化合物を晶出させる請求の範囲第 64から 68項のいずれかに記載の晶析方法。 '

8 1. 残存する水の量として、光学活性ひ一メチルシスティン又はその塩に対して 100重量％以下まで水分を系外に除去する請求の範囲第 80項記載の晶析方法。

82. 置換する有機溶剤として、アルコール系溶剤単独、エーテル系溶剤単独、又は、各々を任意に混合した溶剤を用いる請求の範囲第 80又は 81項のいずれかに記載の晶析方法。

83. アルコール系溶剤が、メチルアルコール、エチルアルコール、 η—プロピゾレアノレコーノレ、イソプロピゾレアノレコーノレ、 η—プチノレァノレコーノレ、 s e c—プチルアルコール、イソブチルアルコール、 t一プチルアルコールのいずれか 1種あるいは 2種以上の混合溶媒である請求の範囲第 82項記載の晶析方法。

8 4 . エーテル系溶剤が、ジェチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、テトラヒドロフラン、 1， 4 _ジォキサン、メチノレー tーブチノレエ一テルのいずれか 1種あるいは 2種以上の混合溶媒である請求の範囲第 8 2項記載の晶析方法。

8 5 . 一メチルシスティン又はその塩を晶出させる為に、貧溶媒を加えることを特徴とする請求の範囲第 8 0から 8 4項のいずれかに記載の晶析方法。

8 6 . 貧溶媒が、炭化水素系溶剤、エステル系溶剤、エーテル系溶剤のいずれか一種又は二種以上の混合溶媒である請求の範囲第 8 5項記載の晶析方法。

8 7 . 貧溶媒が、炭化水素系溶剤である請求の範囲第 8 5項記載の晶析方法。

8 8 . 炭化水素系溶剤が、トルエン、キシレン、へキサン、ヘプタンのいずれか一種又は二種以上の混合溶媒である請求の範囲第 8 7項記載の晶析方法。

8 9 . 光学活性ひ一メチルシスティン又はその塩の晶析時の濃度が、 1〜 7 0 重量％である請求の範囲第 8 0から 8 8項のいずれかに記載の晶析方法。 9 0 . —般式（1 2 ) ：

(式中、 R ³、 R ⁴はそれぞれ独立して置換基を有していても良い炭素数 1 ~ 2 0のアルキル基、置換基を有していても良い炭素数 7〜 2 0のァラルキル基、又は、置換基を有していても良い炭素数 6〜 2 0のァリール基を表す）で表されるラセミ体 5 ， 5—二置換ヒダントイン誘導体又はその塩を、有機塩基又はアル力リ金属水酸化物を用いて加水分解を行うことを特徴とする、一般式（1 3) ：

(式中、 R³、 R ⁴は前記と同じ）で表されるラセミ体 N—力ルバモイルーひ一ァミノ酸誘導体又はその塩の製造方法。

9 1. 用いるアルカリ金属水酸化物が、水酸化ナトリゥム又は水酸化力リウムであることを特徴とする請求の範囲第 90項記載の製造方法。

92. 前記式（1 2) で表されるラセミ体 5， 5—二置換ヒダントイン誘導体又はその塩に対し、 0. 1倍から 10倍重量の水を用いることを特徴とする、請求の範囲第 90又は 9 1項のいずれかに記載の製造方法。

93. 前記式（12) で表されるラセミ体 5， 5—二置換ヒダントイン誘導体又はその塩に対し、 0. 2倍から 3倍重量の水を用いることを特徴とする、請求の範囲第 90から 92項のいずれかに記載の製造方法。

94. 前記式（12) で表されるラセミ体 5， 5—二置換ヒダントイン誘導体又はその塩に対し、 1モル当量から 10モル当量の塩基を用いることを特徴とする、請求の範囲第 90から 93項のいずれかに記載の製造方法。

95. 前記式（12) で表されるラセミ体 5， 5—二置換ヒダントイン誘導体又はその塩に対し、 2モル当量から 5モル当量の塩基を用いることを特徴とする、請求の範囲第 90から 94項のいずれかに記載の製造方法。 96. 前記式（12) で表されるラセミ体 5, 5—二置換ヒダントイン誘導体又はその塩に対し、 0. 2倍から 3倍重量の水と、 2モル当量から 5モル当量の塩基を用いることを特徴とする、請求の範囲第 90から 95項のいずれかに記載の製造方法。 97. 溶媒として、水単独、又は、水と有機溶剤の混合溶媒を使用する請求の範囲第 90から 96項のいずれかに記載の製造方法。

98. 水と組み合わせる有機溶剤として、炭化水素系有機溶媒を用いる請求の範囲第 9 7項記載の製造方法。

99. 反応温度が 80°Cから 110°Cであることを特徴とする請求の範囲第 9 0から 98項のいずれかに記載の製造方法。

100. 前記式（1 2) において、 R³が置換基を有していても良い炭素数 1 〜6の 1級アルキル基であることを特徴とする請求の範囲第 90から 99項のいずれかに記載の製造方法。

101. 前記式（1 2) において、 R³がメチル基であることを特徴とする請求の範囲第 100項に記載の製造方法。

102. 前記式（1 2) で表されるラセミ体 5, 5 _二置換ヒダントイン誘導体として、一般式（14) ：

(式中、 R¹は置換基を有していても良い炭素数 1〜20のアルキル基、置換基を有していても良い炭素数 7〜20のァラルキル基、又は、置換基を有していても良い炭素数 6〜 20のァリール基を表す）で表される化合物を用い、前記式（ 1 3) で表されるラセミ体 N—力ルバモイルー α—アミノ酸誘導体として、一般式（1) ：

(¹)

(式中、 R¹は前記と同じ）で表される化合物を製造する請求の範囲第 90から 10 1項のいずれかに記載の製造方法。

103. 前記式（14) において R¹が t一プチル基であることを特徴とする請求の範囲第 102項に記載の製造方法。

104. 請求の範囲第 102又は 103項のいずれかの方法により製造された前記式 ( 1) で表されるラセミ体 N—力ルバモイル一ひ一メチルシスティン誘導体又はその塩を用いることを特徴とする、請求の範囲第 1から 5項のいずれかに記載の製造方法。

05. 一般式（ 1 )

(式中、 R¹は置換基を有していても良い炭素数 1〜 20のアルキル基、置換基を有していても良い炭素数 7〜 20のァラルキル基、又は、置換基を有していても良い炭素数 6〜 20のァリール基を表す）で表されるラセミ体 N—力ルバモイルー α—メチルシスティン誘導体又はその塩。

106. 一般式（ 3 ) ：

(式中、 R¹は置換基を有していても良い炭素数 1〜20のアルキル基、置換基を有していても良い炭素数 7~20のァラルキル基、又は、置換基を有していても良い炭素数 6〜 20のァリール基を表す）、又は、一般式（10) ：

(式中、 R¹は前記と同じ）で表される、 L体又は D体の光学活性 N_カルバモィル一 α—メチルシスティン誘導体又はその塩。

107. が炭素数〜丄 5の 3級アルキル基である請求の範囲第 105又は 106項記載の化合物。

108. 3級アルキル基が t一ブチル基である請求の範囲第 107項記載の化合物。

09. 一般式（ 2 ) ：

又は一般式（7)

において R¹が炭素数 4〜 1 5の 3級アルキル基である、 D体又は L体の光学活性 5—メチルー 5ーチオメチルヒダントイン誘導体又はその塩。

0. 3級アルキル基が t—プチル基である請求の範囲第 109項記載の化合物 _ε 一般式（4)

又は一般式（8)

において、 R²が置換基を有していても良い炭素数 1〜20のアルキル基、置換基を有していても良い炭素数 7〜20のァラルキル基、又は、置換基を有していても良い炭素数 6〜 20のァリール基である、 L体又は D体の光学活性ひーメチン誘導体又はその塩。 1 12. R²が炭素数 4〜1 5の 3級アルキル基である請求の範囲第 1 1 1項記載の化合物。

113. 3級アルキル基が t一プチル基である請求の範囲第 1 12項記載の化合物。 '

4. 一般式（6) ：

又は一般式（1 1)

で表される、 L体又は D体の光学活性 5—メチル一 5—チオメチルヒダントイン又はその塩。