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WO2003035259A2 - Arrays mit hairpin-strukturen - Google Patents

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WO2003035259A2
WO2003035259A2 PCT/EP2002/011755 EP0211755W WO03035259A2 WO 2003035259 A2 WO2003035259 A2 WO 2003035259A2 EP 0211755 W EP0211755 W EP 0211755W WO 03035259 A2 WO03035259 A2 WO 03035259A2
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analyte
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analytes
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Markus Beier
Peer F. STÄHLER
Original Assignee
Febit Ag
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Definitions

  • the invention relates to arrays of nucleic acids immobilized on a carrier, which are at least partially in the form of secondary structures, such as hairpin structures. Methods of making such arrays and uses thereof are also disclosed.
  • the technology of receptor arrays immobilized on a carrier e.g. DNA chips, a valuable tool that enables complex analyte determination procedures to be carried out quickly and in high parallel.
  • the biophysical principle on which the receptor arrays are based is that of the interaction of a specific immobilized receptor with an analyte present in a liquid phase, for example by nucleic acid hybridization, with a large number of receptors, e.g. Hybridization probes are attached which are compatible with analytes present in the sample, e.g. specifically bind complementary nucleic acid analytes.
  • a binding event between immobilized receptor and analyte is usually detected by detection of a label group that is bound to the analyte.
  • a carrier and a method for analyte determination which allow integrated synthesis of receptors and analysis are e.g. described in WO 00/1 301 8.
  • This object is achieved by providing receptor arrays which contain nucleic acid receptors which are at least partially in the form of hairpins.
  • Hairpins are a special form of secondary structures in nucleic acids, which are composed of two complementary sequence sections in the so-called stem and a further sequence section in the so-called loop (FIG. 1 a).
  • FIG. 1 a Here there is a balance between the closed shape and the open shape ( Figure 1 b).
  • Hairpin structures have already been used in solution for the label-free detection of hybridization events (Tyagi et.al, Nature Biotechnology 1 995, 14, 303-308).
  • These hairpin structures (FIG. 2 type A) are distinguished by the fact that the recognition sequence is in the loop of the hairpin (Marras et al, Genetic Analysis; Biomolecular Engineering, 1 999, 14, 1 51 -1 56).
  • a quencher and a fluorophore molecule are in close spatial proximity in the closed state, so that the fluorescence is quenched. If a hybridization event occurs with the recognition sequence in the loop, the hairpin opens, whereby Fluorophore and quencher are spatially separated. As a result, a fluorescence signal can be observed.
  • quenchers can also be poly-deoxyguanosine sequences (M. Sauer, BioTec, 2000, 1, 30ff). This has the advantage that the hairpin structure only has to be labeled with a fluorophore (M. Sauer et.al., Anal.Chem. 1999, 71 (14), 2850ff) that the incorporation of a quencher molecule is omitted.
  • the invention relates to a method for determining analytes, comprising the steps:
  • Another object of the invention is a device for determining analytes, comprising
  • a carrier with a plurality of predetermined positions, at each of which different receptors are immobilized on the carrier, (iii) means for supplying fluids to the carrier and for removing fluids from the carrier, and (iv) a detection matrix with a plurality of detectors, which are assigned to the predetermined positions on the carrier.
  • the inventions according to the structure of the structure can be used for a very precise discrimination of base mismatches on a solid phase, in particular on an array.
  • the hairpin structures according to the invention can be generated highly parallel both in situ on the solid phase, but can also, if prefabricated, be immobilized on this.
  • the receptors are selected from nucleic acid biopolymers, e.g. Nucleic acids such as DNA and RNA or nucleic acid analogues such as peptide nucleic acids (PNA) and locked nucleic acids (LNA) as well as combinations thereof. Nucleic acids are particularly preferably determined as analytes, the binding of the analytes comprising hybridization. However, the method also enables the detection of other receptor-analyte interactions, e.g. the detection of nucleic acid-protein exchange effects.
  • Nucleic acid biopolymers e.g. Nucleic acids such as DNA and RNA or nucleic acid analogues such as peptide nucleic acids (PNA) and locked nucleic acids (LNA) as well as combinations thereof. Nucleic acids are particularly preferably determined as analytes, the binding of the analytes comprising hybridization. However, the method also enables the detection of other receptor-analyte interactions, e.g. the detection of nucle
  • the method according to the invention preferably comprises a parallel determination of several analytes, ie a carrier is provided, that contains several different receptors that can react with different analytes in a single sample.
  • the method according to the invention preferably determines at least 50, preferably at least 100 and particularly preferably at least 200 analytes in parallel.
  • the receptors can be immobilized on the carrier by covalent binding, non-covalent self-assembly, charge interaction or combinations thereof.
  • the covalent bond preferably comprises the provision of a support surface with a chemically reactive group to which the starting components for receptor synthesis can be bound, preferably via a spacer or linker.
  • the non-covalent self-assembly can, for example, on a noble metal surface, e.g. a gold surface, by means of thiol groups, preferably via a spacer or linker.
  • the present invention is preferably characterized in that the detection system for analyte determination combines a light source matrix, a microfluidic carrier and a detection matrix in an at least partially integrated structure.
  • This detection system can be used for integrated synthesis and analysis, in particular for the construction of complex supports, e.g. Biochips, and for analysis of complex samples, e.g. for genome, gene expression or proteome analysis.
  • the synthesis of the receptors takes place in situ on the carrier, for example by passing fluid with receptor synthesis building blocks over the carrier, the building blocks are immobilized in place-specific and / or time-specific manner on predetermined areas on the carrier and these steps are repeated, until the desired receptors have been synthesized on the respective predetermined areas on the support.
  • the light source matrix is preferably a programmable light source matrix, e.g. selected from a light valve matrix, a mirror array, a UV laser array and a UV LED (diode) array.
  • the carrier is preferably a flow cell or a micro flow cell, i.e. a microfluidic carrier with channels, preferably with closed channels, in which the predetermined positions with the differently immobilized receptors are located.
  • the channels preferably have diameters in the range from 10 to 10000 ⁇ m, particularly preferably from 50 to 250 ⁇ m, and can in principle be designed in any form, e.g. with a round, oval, square or rectangular cross-section.
  • the secondary structures of the receptors preferably comprise a hairpin structure, which is composed of a stem and a loop.
  • the sequence of the receptor which is bindable with the analyte can be located in the area of the loop of a hairpin.
  • the hairpin structure is opened by binding the loop to the receptor. This hairpin opening can in turn be detected by suitable measures (eg see above).
  • the sequence of the receptor that is specifically bindable with the analyte is located in the stem of the hairpin structure. In this embodiment too, the binding of the analyte to the receptor brings about a detectable dissolution of the hairpin structure.
  • the hairpin structures according to the invention with a recognition sequence in the stem comprise complementary sequences A and A * in the stem and a linker unit L in the loop.
  • base pairings e.g. polyethylene glycol, alkyl, polyethylene glycol phosphate or alkyl phosphate units
  • Both sequence sections A (FIG. 3B) or A * (FIG. 3A) in the stem can serve as recognition sequences.
  • a hybridization experiment for example a sequence A in the sample to be examined competes with the reference sequence A in the stem of the hairpin for the sequence A * (FIG. 3A). This competitive situation is used to increase the specificity of the hybridization. If, for example, sequence A in the sample is not completely complementary to A * (ie mismatches occur), the pairing between the two sequences A and A * is more stable in the hairpin, which has the consequence that the hybridization balance on the left side is shifted to the closed form of the hairpin (FIG. 3A). If a labeled sample A is used for hybridization, this means that no or only a small signal can be detected, since the equilibrium lies on the side of the closed hairpin. Signals can only be detected when the hairpin structure is in the open state, ie a stable pairing between A in the sample to be examined and A * in the hairpin is possible, and the equilibrium is on the right, ie with an open hairpin.
  • hybridization balance (and thus the stringency) of the reference probe or the recognition sequence can be varied, inter alia, by the fact that these sequences contain building blocks of nucleic acid analogues which are distinguished by the fact that they bind more strongly with DNA than DNA with DNA.
  • PNA or LNA building blocks or other building blocks known to the person skilled in the art having the described characteristics can be used for this purpose.
  • the procedure described ensures that, in contrast to the usual procedure (use of 1 perfect match + 1 single base mismatch probe), only one probe needs to be used for the discrimination between perfect match and single base mismatch, and thus parking spaces on the array can be saved or more information can be queried with a predetermined amount of parking spaces. Furthermore, terminal mismatches can also be queried, since the presence of the reference sequence in the same molecule allows higher stringency conditions to be set than if two separate probes were used to discriminate perfect match and single base mismatch.
  • the hairpin structures comprise two complementary sequences (A, A *) and two non-complementary units (Z, X) in the stem and a linker unit (L) in the loop
  • Sequence sequence A * -Z ( Figure 4B) serve.
  • Crucial is the fact that X and Z don't pair up.
  • X is one or more nucleic acid building blocks capable of pairing
  • Z is one or more non-pairing building blocks.
  • Z can be, for example, an “abasic site” (DNA or RNA building block without a heterobase) or a building block known to the person skilled in the art which does not enter into base pairing, but does
  • Z can also be the mixture of the 4 bases adenosine, guanosine, cytidine and thymidine or uracil.
  • the hairpin structure contains a marker group which is at least partially quenched in the closed state, for example a fluorophore.
  • a marker group which is at least partially quenched in the closed state
  • fluorophore By dissolving the hairpin structure, the signal originating from the marker group increases and this signal increase is demonstrated.
  • a hairpin structure (FIG. 5) according to the invention thus contains, for example, a quencher (Q) and a fluorophore (F), which are located at opposite ends of the hairpin nucleic acid sequence.
  • Q quencher
  • F fluorophore
  • Fluorescence in the closed hairpin is quenched by the spatial proximity of Q and F. Fluorescence can be detected in the open state. Molecule combinations Q and F are well known to those skilled in the art.
  • hybridization can also be carried out using double-stranded targets (FIG. 6). If both strands are marked, the light intensity detectable for a parking space can be increased.
  • the hairpin structures of type A (recognition sequence in the loop) and type B (recognition sequence in the stem) can be connected to the carrier not only terminally but also internally (FIG. 7). It also discloses type A hairpin structures internally bonded to the carrier. Combinations of terminally and internally immobilized receptors on a carrier are also possible.
  • the hairpin structure according to the invention contains the recognition sequence in the stem.
  • the strand complementary to the recognition sequence is used as a reference sequence for mismatch discrimination.
  • a target sequence in the sample solution competes with the reference sequence (A *) for the probe sequence (A).
  • the stringency can be further increased by incorporating special nucleic acid building blocks (PNA, LNA) in the reference strand. This means that only hybridization will take place - ie change the hairpin to the open form - if the target sequence in the sample solution is exactly complementary to the probe sequence.
  • the reference sequence integrated in the hairpin ensures that the hairpin does not change to the open form and therefore no hybridization with a target sequence can take place. Furthermore, the hairpin structure according to the invention allows the discrimination of terminal base mismatches. These are made possible by hybridizing the target sequence to position X. Base pairings complementary to terminal position X decide whether the hairpin changes to the open form and whether a hybridization event can be detected as a result.
  • an integrated system for determining analytes is provided, which allows highly parallel in situ production of complex populations of hairpin receptors immobilized in microstructures for the detection of analytes.
  • a device comprising:
  • Specific areas of the receptors in the absence of one bindable analytes are at least partially present as a secondary structure, (iii) means for supplying fluids to the carrier and for deriving fluids from the carrier and (iv) a detection matrix comprising a plurality of detectors which are assigned to the predetermined areas on the carrier.
  • the carrier is particularly preferably arranged between the light source matrix and the detection matrix.
  • the detectors of the detection matrix are preferably made of photodetectors and / or electronic detectors, e.g. Electrodes selected.
  • the device according to the invention can be used for the controlled in situ synthesis of nucleic acids, e.g. DNA / RNA oligomers are used, and photochemical, fluid-chemical and / or electronically removable protective groups can be used as temporary protective groups.
  • the location- and / or time-resolved receptor synthesis can be carried out by targeted activation of electrodes in the detection matrix, targeted fluid supply in defined areas or area groups on the support or / and targeted exposure via the light source matrix.
  • FIG. 1A schematically shows a hairpin structure and FIG. 1B shows the balance between the closed and open form of the hairpin.
  • Figure 2 shows two types of surface-bound hairpin structures.
  • the recognition sequence of the receptor that is bindable with the analyte is in the loop.
  • the recognition sequence in the stem which is bindable with the analyte.
  • the arrangement of the recognition sequence shown in FIG. 2B represents a preferred embodiment of the invention.
  • FIG. 3 shows an embodiment of the hairpin structure according to the invention and its mode of action, where S is the solid phase and L is a linker sequence.
  • a * is the recognition sequence of the receptor which is capable of binding to the analyte and A is a sequence (reference sequence) of the receptor which is complementary thereto.
  • a * is a sequence (reference sequence) of the receptor which is complementary thereto.
  • FIGS. 4A and 4B show a further embodiment of the hairpin structures according to the invention with an additional recognition sequence X and a sequence Z which is not complementary to it within the star or its mode of action.
  • FIGS. 5A and 5B show an embodiment of the hairpin structures according to the invention, which enables label-free detection, i.e. for the detection of unmarked analytes and their mode of action.
  • F represents a fluorescent labeling group
  • Q a quencher.
  • Figure 6 shows the mode of action of hairpin structures according to the invention in double-strand hybridization, i.e. the analyte to be determined is in the form of a double-stranded target.
  • FIG. 7 shows hairpin structures according to the invention which are not bound to the solid phase via the ends, but inside the sequence.
  • the recognition sequence is in the loop and according to FIG. 7B the recognition sequence is in the stem.
  • FIG. 8 shows an example of a hybridization on an array with hairpin structures in which the recognition sequence is in the loop.
  • FIG. 9 shows an example for a hybridization on an array which contains hairpin structures with a recognition sequence in the stem.

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Abstract

Die Erfindung betrifft Arrays von auf einem Träger immobilisierten Nukleinsäuren, die zumindest teilweise in Form von Sekundärstrukturen, wie etwa Hairpin-Strukturen, vorliegen. Weiterhin werden Verfahren zur Herstellung solcher Arrays und Anwendungen davon offenbart.

Description

Arrays mit Hairpin-Strukturen
Beschreibung
Die Erfindung betrifft Arrays von auf einem Träger immobilisierten Nukleinsäuren, die zumindest teilweise in Form von Sekundärstrukturen, wie etwa Hairpin-Strukturen, vorliegen. Weiterhin werden Verfahren zur Herstellung solcher Arrays und Anwendungen davon offenbart.
In den letzten Jahren wurde mit der Technologie von auf einem Träger immobilisierten Rezeptorarrays, z.B. DNA-Chips, ein wertvolles Mittel geschaffen, das es erlaubt, komplexe Analytbestimmungsverfahren schnell und hochparallel durchzuführen. Das den Rezeptorarrays zugrunde liegende biophysikalische Prinzip ist das der Wechselwirkung eines spezifischen immobilisierten Rezeptors mit einem in einer Flüssigphase vorhandenen Analyten, beispielsweise durch Nukleinsäurehybridisierung, wobei auf dem Träger eine Vielzahl von Rezeptoren, z.B. Hybridisierungssonden, angebracht sind, die mit in der Probe vorhandenen Analyten, z.B. komplementären Nukleinsäureanalyten, spezifisch binden.
Ein Bindungsereignis zwischen immobilisiertem Rezeptor und Analyt wird üblicherweise durch Detektion einer Markierungsgruppe nachgewiesen, die an den Analyten gebunden ist. Ein Träger und ein Verfahren zur Analytbestimmung, die eine integrierte Synthese von Rezeptoren und Analyse erlauben, sind z.B. in WO 00/1 301 8 beschrieben.
Um mit Rezeptorarrays, z.B. DNA-Chips, komplexe biologische Fragestellungen (Genexpressions-Studien, Target-Validierung, Sequencing By Hybridisation, Re-Sequenzierung) bearbeiten zu können, ist es von grundlegender Bedeutung, dass die Hybridisierung zwischen Rezeptor und Target möglichst fehlerfrei durchgeführt werden kann. Das Nachweissystem muss daher in der Lage sein, zwischen einem sogenannten „füll match", d.h. wenn Sonde und Target vollkommen komplementär sind, und einem „mismatch", wenn eine oder mehrere fehlerhafte Basenpaarungen vorliegen, zu unterscheiden. Besonders schwer ist natürlicherweise die Unterscheidung zwischen einem „Single mismatch", wenn lediglich 1 Basenpaarung fehlerhaft ist , und dem „füll match". Desweiteren sind aus thermodynamischen Gründen besonders endständige (terminale) Basen-Fehlpaarungen schwer bzw. nur unzureichend zu detektieren. Fehlpaarungen in der Mitte einer Sequenz sind dagegen aus denselben Gründen einfacher zu detektieren.
Auf bekannten DNA-Chips liegen Nukleinsäure-Rezeptoren möglichst in einzelsträngiger Form vor. Bei der Auswahl der Sequenzen für die Rezeptoren wird daher darauf geachtet, dass eine etwaige Ausbildung von Sekundärstrukturen vermieden wird. Die Detektion von Basen- Fehlpaarungen erfolgt nun dadurch, dass auf dem DNA-Chip nicht nur die eigentliche abzufragende Sequenz, sondern auch als Vergleich die entsprechende Sequenz mit einer Fehlpaarung in der Mitte der Basenabfolge als Negativ-Kontrolle aufgebracht ist. Ob es sich um einen „füll match" oder „mismatch" handelt, wird durch die jeweils unterschiedlichen Signalintensitäten, die sich durch Hybridisierung der Probe (Target) auf die Sonde bzw. ihrer Negativ-Kontrollsequenz (Mismatch-Sequenz) ergeben, detektierbar. Da aber auch hier nicht immer eine eindeutige Entscheidung getroffen werden kann, müssen zur Detektion einer bestimmten DNA-Sequenz innerhalb des Targets nicht nur eine einzige Sequenz, sondern mehrere (z.B. 20 Sequenzen pro Gen) Sequenzen (R. Lipschutz et.al., Nature Genetics, 1 999, 21 , 20ff), die sich jeweils als Bruchstücke der nachzuweisenden Probe ergeben, mit den jeweils zugehörigen Kontroll-Sequenzen (Mismatch-Sequenzen) verwendet werden. Dadurch wird zum Nachweis einer einzigen Probensequenz nicht nur eine einzige Nukleinsäuresequenz auf dem DNA-Chip benötigt, sondern es sind üblicherweise 20 Sequenzen zuzüglich der jeweiligen 20 Negativ- Kontrollsequenzen (Mismatch-Sequenzen) erforderlich. Dies resultiert in einem erheblichen Mehraufwand bei der Herstellung von DNA-Chips und verringert deren Informationsdichte signifikant.
Gegenwärtig gibt es noch keine Möglichkeiten, terminale Basen- Fehlpaarungen auf DNA-Chips zu detektieren.
Eine Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein System bereitzustellen, dass es erlaubt, Basen-Fehlpaarungen sehr genau detektieren zu können. Weiterhin soll das erfindungsgemässe System nicht nur Basen- Fehlpaarungen in der Mitte einer Sequenz, sondern auch am Ende (terminal) auf einem Array hochparallel zu erkennen.
Diese Aufgabe wird durch Bereitstellung von Rezeptorarrays gelöst, die Nukleinsäure-Rezeptoren enthalten, die mindestens teilweise in Form von Hairpins vorliegen.
Hairpins sind eine spezielle Form von Sekundärstrukturen bei Nukleinsäuren, die sich aus zwei komplementären Sequenz-Abschnitten im sogenannten Stem und einem weiteren Sequenzabschnitt im sogenannten Loop zusammensetzen (Figur 1 a). Hierbei besteht ein Gleichgewicht zwischen der geschlossenen Form und der geöffneten Form (Figur 1 b). Hairpin-Strukturen wurden bereits in Lösung zur markierungsfreien Detektion von Hybridisierungs-Ereignissen eingesetzt (Tyagi et.al, Nature Biotechnology 1 995, 14, 303-308). Diese Hairpin-Strukturen (Figur 2 Typ A) zeichnen sich dadurch aus, dass sich die Erkennungssequenz im Loop des Hairpins befindet (Marras et.al, Genetic Analysis; Biomolecular Engineering, 1 999, 14, 1 51 -1 56). In einer besonderen Ausführungsform befinden sich ein Quencher- und ein Fluorophor-Molekül im geschlossenen Zustand in unmittelbar räumlicher Nähe, so dass die Fluoreszenz gelöscht wird. Tritt nun ein Hybridisierungs-Ereignis mit der sich im Loop befindlichen Erkennungssequenz ein, öffnet sich der Hairpin, wobei Fluorophor und Quencher räumlich voneinander getrennt werden. Als Folge davon ist ein Fluoreszenzsignal zu beobachten. Als Quencher können neben bekannten Farbstoffen auch poly-Deoxyguanosinsequenzen fungieren (M. Sauer, BioTec, 2000, 1 , 30ff). Dies hat den Vorteil, dass die Hairpin-Struktur nur mit einem Fluorophor markiert werden muss (M. Sauer et.al., Anal.Chem. 1999, 71 (14), 2850ff), dass der Einbau eines Quencher- Moleküls entfällt.
Studien über das Verhalten von Hairpinstrukturen auf einer festen Phase - d.h. Arrays mit Hairpin-Strukturen - sind zwar bekannt (US 5770772), nutzen jedoch lediglich das Vorhandensein der doppelsträngigen Struktur eines Hairpin als Erkennungsstelle für z.B. Proteine aus. Der Nachweis einer Analytbindung durch Auflösung der Hairpinstruktur wird nicht offenbart. Im Besonderen sind keine Hairpin-Strukturen bekannt, die die Sequenzinformation im Stem des Hairpins als Erkennungssequenz für eine Hybridisierung nutzen. Desweiteren sind bislang noch keine Hairpinstrukturen bekannt, deren Anbindung an die feste Phase nicht über ein terminales Ende erfolgt.
Ein Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Bestimmung von Analyten, umfassend die Schritte:
(a) Bereitstellen eines Trägers mit mehreren vorbestimmten Bereichen, an denen jeweils unterschiedliche Rezeptoren ausgewählt aus Nukleinsäuren und Nukleinsäureanaloga immobilisiert sind, wobei in einem oder mehreren der vorbestimmten Bereiche die Rezeptoren in
Abwesenheit eines damit spezifisch bindefähigen Analyten zumindest teilweise als Sekundärstruktur vorliegen,
(b) Inkontaktbringen des Trägers mit einer Analyten enthaltenden Probe und (c) Bestimmen der Analyten über deren Bindung an die auf dem Träger immobilisierten Rezeptoren, wobei die Bindung eines Analyten an einem damit spezifisch bindefähigen Rezeptor den Nachweis der Auflösung der in Abwesenheit des Analyten vorliegenden Sekundärstruktur umfasst.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Vorrichtung zur Bestimmung von Analyten, umfassend
(i) eine Lichtquellenmatrix,
(ii) einen Träger mit mehreren vorbestimmten Positionen, an denen jeweils unterschiedliche Rezeptoren auf dem Träger immobilisiert sind, (iii) Mittel zur Zufuhr von Fluids zum Träger und zur Ableitung von Fluids aus dem Träger und (iv) eine Detektionsmatrix mit umfassend mehrere Detektoren, die den vorbestimmten Positionen auf dem Träger zugeordnet sind.
D i e erfi n d ung sg em ässe n H ai rp i n- Stru ktu re n l assen si c h überraschenderweise für eine sehr genaue Diskriminierung von Basenfehlpaarungen auf einer Festphase, insbesondere auf einem Array, verwenden. Die erfindungsgemässen Hairpin-Strukturen lassen sich hochparallel sowohl in situ auf der festen Phase erzeugen, können aber auch, wenn vorgefertigt, auf dieser immobilisiert werden.
Die Rezeptoren werden ausgewählt aus Nukleinsäure-Biopolymeren, z.B. Nukleinsäuren wie DNA und RNA oder Nukleinsäureanaloga wie Peptidnukleinsäuren (PNA) und Locked-Nukleinsäuren (LNA) sowie Kombinationen davon. Besonders bevorzugt werden als Analyten Nukleinsäuren bestimmt, wobei die Bindung der Analyten eine Hybridisierung umfasst. Das Verfahren ermöglicht jedoch auch den Nachweis anderer Rezeptor-Analyt-Wechselwirkungen, z.B. den Nachweis von Nukleinsäure-Protein-Wechsel Wirkungen.
Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst vorzugsweise eine parallele Bestimmung von mehreren Analyten, d.h. es wird ein Träger bereitgestellt, der mehrere unterschiedliche Rezeptoren, die mit jeweils unterschiedlichen Analyten in einer einzigen Probe reagieren können, enthält. Vorzugsweise werden durch das erfindungsgemäße Verfahren mindestens 50, vorzugsweise mindestens 100 und besonders bevorzugt mindestens 200 Analyten parallel bestimmt.
Die Immobilisierung der Rezeptoren an den Träger kann durch kovalente Bindung, nicht-kovalente Selbstassemblierung, Ladungswechselwirkung oder Kombinationen davon erfolgen. Die kovalente Bindung umfasst vorzugsweise die Bereitstellung einer Trägeroberfläche mit einer chemisch reaktiven Grupppe, an die die Startbausteine zur Rezeptorsynthese, vorzugsweise über einen Spacer bzw. Linker gebunden werden können. Die nicht-kovalente Selbstassemblierung kann beispielsweise auf einer Edelmetalloberfläche, z.B. einer Goldoberfläche, mittels Thiolgruppen, vorzugsweise über einen Spacer bzw. Linker, erfolgen.
Die vorliegende Erfindung zeichnet sich vorzugsweise dadurch aus, dass das Detektionssystem zur Analytbestimmung, eine Lichtquellenmatrix, einen mikrofluidischen Träger und eine Detektionsmatrix in einem zumindest teilweise integrierten Aufbau kombiniert. Dieses Detektionssystem kann zur integrierten Synthese und Analyse eingesetzt werden, insbesondere zum Aufbau komplexer Träger, z.B. Biochips, und zur Analyse komplexer Proben, z.B. zur Genom-, Genexpressions- oder Proteomanalyse.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Synthese der Rezeptoren in situ auf dem Träger, beispielsweise indem Fluid mit Rezeptorsynthesebausteinen über den Träger geleitet wird, die Bausteine an jeweils vorbestimmten Bereichen auf dem Träger orts- oder/und zeitspezifisch immobilisiert werden und diese Schritte wiederholt werden, bis die gewünschten Rezeptoren an den jeweils vorbestimmten Bereichen auf dem Träger synthetisiert worden sind. Diese Rezeptorsynthese umfasst vorzugsweise mindestens einen fluidchemischen Schritt, einen fotochemischen Schritt, einen elektrochemischen Schritt oder eine Kombination solcher Schritte sowie eine online-Prozessüberwachung, beispielsweise unter Verwendung der Detektionsmatrix.
Die Lichtquellenmatrix ist vorzugsweise eine programmierbare Lichtquellenmatrix, z.B. ausgewählt aus einer Lichtventilmatrix, einem Spiegelarray, einem UV-Laserarray und einem UV-LED (Dioden)-Array.
Der Träger ist vorzugsweise eine Flusszelle bzw. eine Mikroflusszelle, d.h. ein mikrofluidischer Träger mit Kanälen, vorzugsweise mit geschlossenen Kanälen, in denen sich die vorbestimmten Positionen mit den jeweils unterschiedlich immobilisierten Rezeptoren befinden. Die Kanäle haben vorzugsweise Durchmesser im Bereich von 10 bis 10000 μm, besonders bevorzugt von 50 bis 250 μm und können grundsätzlich in beliebiger Form ausgestaltet sein, z.B. mit rundem, ovalem, quadratischem oder rechteckigem Querschnitt.
Wie bereits ausgeführt, umfassen die Sekundärstrukturen der Rezeptoren vorzugsweise eine Hairpin-Struktur, die aus einem Stem und einem Loop zusammengesetzt ist. In einer ersten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens kann sich die mit dem Analyten bindefähige Sequenz des Rezeptors im Bereich des Loops eines Hairpins befinden. Durch Bindung des Loops an den Rezeptor wird die Hairpin-Struktur geöffnet. Diese Hairpin-Öffnung kann wiederum durch geeignete Maßnahmen (z.B. siehe oben) nachgewiesen werden. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform befindet sich jedoch die mit dem Analyten spezifisch bindefähige Sequenz des Rezeptors im Stem der Hairpin- Struktur. Auch in dieser Ausführungsform bewirkt die Bindung des Analyten an den Rezeptor eine nachweisbare Auflösung der Hairpin- Struktur. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die erfindungsgemäßen Hairpin-Strukturen mit einer Erkennungssequenz im Stem (Figur 2B, 3A und 3B) komplementäre Sequenzen A und A* im Stem und eine Linker-Einheit L im Loop. Dabei befinden sich im Loop des Hairpins Bausteine, die keine Basenpaarungen eingehen können (z.B. Polyethylenglykol-, Alkyl-, Polyethylenglykolphosphat- oder Alkylphosphat- Einheiten) oder Bausteine, die nur schwache Basenpaarungen eingehen können (z.B. ein Tn-Loop mit n = 2-8). Als Erkennungssequenzen können beide Sequenzabschnitte A (Figur 3B) oder A* (Figur 3A) im Stem dienen. Wird ein Hybridisierungsexperiment durchgeführt, konkurriert z.B. eine in der zu untersuchenden Probe befindliche Sequenz A mit der Referenzsequenz A im Stem des Hairpins um die Sequenz A* (Figur 3A). Diese Konkurrenzsituation wird dazu verwendet, die Spezifität der Hybridisierung zu erhöhen. Ist z.B. die in der Probe befindliche Sequenz A nicht vollständig komplementär zu A* (d.h. es treten Fehlpaarungen auf), ist die Paarung zwischen den beiden Sequenzen A und A* im Hairpin stabiler, was zur Folge hat, dass das Hybridisierungsgleichgewicht auf die linke Seite zur geschlossenen Form des Hairpin verlagert ist (Figur 3A). Wird zur Hybridisierung also eine markierte Probe A verwendet, bedeutet dies, dass kein oder nur ein geringes Signal detektierbar ist, da das Gleichgewicht auf der Seite des geschlossenen Hairpins liegt. Signale werden nur detektierbar, wenn die Hairpinstruktur im geöffneten Zustand vorliegt, d.h. eine stabile Paarung zwischen A in der zu untersuchenden Probe und A* im Hairpin möglich ist, und das Gleichgewicht rechts, d.h. bei einem offenen Hairpin, liegt.
Somit wird neben gebräuchlichen Variablen der Stringenzbedingungen, wie z.B. Salzkonzentration, Temperatur, Sonden- und Target-Konzentration, eine weitere Variable eingeführt, mit der Einfluss auf die Stringenz eines Hybridisierungsexperimentes genommen werden kann. Desweiteren kann das Hybridisierungsgleichgewicht (und damit die Stringenz) der Referenz- Sonde bzw. der Erkennungssequenz u.a. dadurch variiert werden, dass diese Sequenzen Bausteine von Nukleinsäure-Analoga enthalten, die sich dadurch auszeichnen, dass diese stärker mit DNA binden, als DNA mit DNA. Hierfür kommen u.a. PNA oder LNA-Bausteine oder andere dem Fachmann bekannte Bausteine mit den beschriebenen Charakteristika in Frage.
Durch das beschriebene Vorgehen wird erreicht, dass im Gegensatz zum üblichen Vorgehen (Verwendung von 1 Perfect-Match + 1 Single-Base- Mismatch Sonde) für die Diskriminierung zwischen Perfect-Match und Single-Base-Mismatch nur eine einzige Sonde verwendet werden muss, und somit Stellplätze auf dem Array eingespart werden können bzw. mehr Informationen mit einer vorgegebenen Menge an Stellplätzen abgefragt werden kann. Desweiteren können hierdurch auch terminale Mismatche abgefragt werden, da durch Anwesenheit der Referenzsequenz im gleichen Molekül höhere Stringenzbedingungen eingestellt werden können, als wenn für die Diskriminierung von Perfect-Match und Single-Base-Mismatch 2 separate Sonden verwendet werden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfassen die Hairpin- Strukturen zwei komplementäre Sequenzen (A, A*) und zwei nicht komplementäre Einheiten (Z, X) im Stem und eine Linker-Einheit (L) im Loop
(Figur 4). Als Erkennungssequenzen können sowohl die der Festphase nahe
Sequenzabfolge A-Z (Figur 4A) als auch die der Festphase ferne
Sequenzabfolge A*-Z (Figur 4B) dienen. Von entscheidender Bedeutung ist die Tatsache, dass X und Z nicht miteinander paaren. Hierzu wird erfindungsgemäß vorgeschlagen, dass es sich bei X um einen oder mehrere paarungsfähige Nukleinsäure-Bausteine und bei Z um eine oder mehrere nicht-paarungsfähige Bausteine handelt. Z kann beispielsweise eine „Abasic site" (DNA- oder RNA-Baustein ohne Heterobase) oder ein dem Fachmann bekannter Baustein sein, der zwar keine Basenpaarung eingeht, aber die
DNA-Struktur nicht stört. Unter L ist ein Linker zu verstehen, der vorzugsweise aus nicht paarungsfähigen Nukleinsäure-Bausteinen, so z.B. Polyethylenglykolphosphat-Einheiten (R. Micura, Angew. Chemie, 2000, 39(5), 922ff) oder Bausteinen, die nur schwache Basenpaarungen eingehen können (z.B. ein Tn-Loop mit n = 2-8), besteht. Hierdurch wird erreicht, dass besonders terminale Mismatche besser detektierbar werden. Dies erfolgt dadurch, dass in dieser Ausführungsform (Figur 4A) dem Target A- X* weitere Basen zur Paarung zur Verfügung stehen, jedoch der Referenz A-Z nicht. Das bewirkt, dass das Gleichgewicht zwischen geschlossener Form des Hairpins (links) vorteilhaft auf die rechte Seite (offener Hairpin) verschoben wird, wenn eine zusätzliche Basenpaarung vom Target A-X* mit dem Sequenzbereich X im Hairpin erfolgen kann. Treten Fehlpaarungen zwischen Target A-X* und dem Sequenzbereich X im Hairpin auf, ist dies nicht der Fall und das Gleichgewicht wird nicht verstärkt auf die rechte (offene) Seite verschoben.
Durch Vorhandensein zusätzlicher paarungsfähiger Abschnitte X in der Hairpinstruktur des Rezeptors, die mit dem nachzuweisenden Analyten k o m p l e m e n t ä r s i n d , k a n n s o m i t d i e St r i n g e n z d e s Hybridisierungexperimentes weiter erhöht werden (Figuren 4A und 4B). Auch hier können Nukleinsäure-Analoga, wie zuvor beschrieben, Verwendung finden, die stärker mit DNA binden, als DNA mit DNA.
In einer weiteren Ausführungsform kann Z auch das Gemisch der 4 Basen Adenosin, Guanosin, Cytidin und Thymidin bzw. Uracil sein.
In noch einer weiteren Ausführungsform enthält die Hairpin-Struktur eine im geschlossenen Zustand zumindest teilweise gequenchte Markierungsgruppe, z.B. einen Fluorophor. Durch Auflösung der Hairpinstruktur nimmt das von der Markierungsgruppe stammende Signal zu und man weist diese Signalzunahme nach. So enthält eine erfindungsgemäße Hairpin-Struktur (Figur 5) beispielsweise einen Quencher (Q) und einen Fluorophor (F), die sich an entgegengesetzten Enden der Nukleinsäure-Sequenz des Hairpins befinden. Erfindungsgemäß ist die Fluoreszenz im geschlossenen Hairpin durch die räumliche Nähe von Q und F gelöscht. Im geöffneten Zustand ist Fluoreszenz detektierbar. Molekül- Kombinationen Q und F sind dem Fachmann hinreichend bekannt.
In noch einer weiteren Ausführungform kann die Hybridisierung auch mit doppelsträngigen Targets erfolgen (Figur 6 ). Sind beide Stränge markiert, kann somit die für einen Stellplatz detektierbare Leuchtintensität verstärkt werden.
In einer weiteren Ausführungform kann die Trägeranbindung der Hairpinstrukturen sowohl vom Typ A (Erkennungssequenz im Loop) als auch vom Typ B (Erkennungssequenz im Stem) nicht nur terminal, sondern auch intern erfolgen (Figur 7). Es werden hiermit auch intern an den Träger gebundene Hairpinstrukturen vom Typ A offenbart. Auch Kombinationen von terminal und intern immobilisierten Rezeptoren auf einen Träger sind möglich.
Eine Verbesserung gegenüber dem Stand der Technik wird insbesondere dadurch erzielt, dass die erfindungsgemäße Hairpinstruktur die Erkennungssequenz im Stem beinhaltet. Der zur Erkennungssequenz komplementäre Strang wird als Referenz-Sequenz zur Mismatch- Diskriminierung verwendet. Bei einem Hybrisdisierungsexperiment konkurriert eine in der Probenlösung vorhandene Target-Sequenz mit der Referenz-Sequenz (A*) um die Sondensequenz (A). Ist es erwünscht, kann die Stringenz durch Einbau von besonderen Nukleinsäure-Bausteinen (PNA, LNA) im Referenz-Strang weiter gesteigert werden. Das heißt, es wird nur eine Hybridisierung erfolgen - d.h. der Hairpin in die offene Form wechseln - wenn die in der Probenlösung vorhandene Targetsequenz exakt komplementär zur Sondensequenz ist. Ist dies nicht der Fall, sorgt die im Hairpin integrierte Referenzsequenz dafür, dass der Hairpin nicht in die offene Form wechselt, und somit kein Hybridisierung mit einer Targetsequenz erfolgen kann. Desweiteren erlaubt die erfindungsgemäße Hairpinstruktur die Diskriminierung von terminalen Basenfehlpaarungen. Diese werden über die Hybridisierung der Targetsequenz an die Position X möglich. Basenpaarungen komplementär zu terminalen Position X entscheiden darüber, ob der Hairpin verstärkt in die offene Form wechselt und daraus resultierend ein Hybridisierungs-Ereignis detektiert werden kann.
Dies hat zur Folge, dass im Gegensatz zu herkömmlichen DNA-Arrays für die Entscheidung, ob es sich um einen „füll match" oder „mismatch" handelt, wesentlich weniger Sequenzen aufgebracht werden müssen. Daraus resultiert, dass mit der a priori gegebenen maximalen Stellplatzdichte eines Array mehr unterschiedliche Targetsequenzen bearbeitet werden können. Dies steigert die Informationsdichte des Arrays signifikant.
Durch Inkorporation von Fluoreszenz- (F) oder/und Quencher (Q) - Bausteinen in die erfindungsgemäße Hairpinstruktur lässt sich außerdem eine markierungsfreie Detektion von DNA-Arrays erreichen (Figur 5).
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird ein integriertes System zur Bestimmung von Analyten bereitgestellt, welches eine hochparallele in situ Herstellung komplexer Populationen von Hairpin- Rezeptoren immobilisiert in Mikrostukturen zum Nachweis von Analyten erlaubt.
Hierzu verwendet man günstigerweise eine Vorrichtung, umfassend:
(i) eine Lichtquellenmatrix,
(ii) einen mikrofluidischen Träger mit mehreren vorbestimmten
Positionen, an denen jeweils unterschiedliche Rezeptoren ausgewählt aus Nukleinsäuren und Nukleinsäureanaloga auf dem Träger immobilisiert sind, wobei in einem oder mehreren der vorbestimmten
Bereiche die Rezeptoren in Abwesenheit eines damit spezifisch bindefähigen Analyten zumindest teilweise als Sekundärstruktur vorliegen, (iii) Mittel zur Zufuhr von Fluids zum Träger und zur Ableitung von Fluids aus dem Träger und (iv) eine Detektionsmatrix, umfassend mehrere Detektoren, die den vorbestimmten Bereichen auf dem Träger zugeordnet sind.
In der erfindungsgemäßen Vorrichtung legen vorzugsweise zumindest die Komponenten (ii), (iii) und (iv) in integrierter Form vor. Besonders bevorzugt ist der Träger zwischen Lichtquellenmatrix und Detektionsmatrix angeordnet. Die Detektoren der Detektionsmatrix sind vorzugsweise aus Fotodetektoren oder/und elektronischen Detektoren, z.B. Elektroden, ausgewählt.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann zur gesteuerten in situ Synthese von Nukleinsäuren, z.B. DNA/RNA-Oligomeren benutzt werden, wobei als temporäre Schutzgruppen fotochemische, fluidchemische, oder/und elektronisch abspaltbare Schutzgruppen, verwendet werden können. Die orts- oder/und zeitaufgelöste Rezeptorsynthese kann durch gezielte Ansteuerung von Elektroden in der Detektionsmatrix, gezielte Fluidzufuhr in definierte Bereiche oder Bereichsgruppen auf dem Träger oder/und gezielte Belichtung über die Lichtquellenmatrix erfolgen.
Weiterhin soll die vorliegende Erfindung durch die nachfolgenden Abbildungen erläutert werden:
Figur 1A zeigt schematisch eine Hairpin-Struktur und Figur 1 B zeigt das Gleichgewicht zwischen geschlossener und offener Form des Hairpins.
Figur 2 zeigt zwei Typen von oberflächengebundenen Hairpin-Strukturen. Gemäß Figur 2A befindet sich die mit dem Analyten bindefähige Erkennungssequenz des Rezeptors im Loop. Gemäß Figur 2B befindet sich die mit dem Analyten bindefähige Erkennungssequenz im Stem. Dabei bestehen zwei Möglichkeiten zur Anordnung der Erkennungssequenz, d.h. oberflächennah (A) oder oberflächenfern (A*). Die in Figur 2B gezeigte Anordnung der Erkennungssequenz stellt eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung dar.
Figur 3 zeigt eine Ausführungsform der erfindungsgemäßen Hairpin- Struktur und deren Wirkungsweise, wobei S die Festphase und L eine Linkersequenz bedeutet. In Figur 3A ist A* die mit dem Analyten bindefähige Erkennungssequenz des Rezeptors und A eine dazu komplementäre Sequenz (Referenzsequenz) des Rezeptors. In Figur 3B ist A die mit dem Analyten bindefähige Erkennungssequenz des Rezeptors und A* eine dazu komplementäre Sequenz (Referenzsequenz) des Rezeptors.
Figur 4A und 4B zeigen eine weitere Ausführungsform der erfindungsgemäßen Hairpin-Strukturen mit einer zusätzlichen Erkennungssequenz X und einer dazu nicht komplementären Sequenz Z innerhalb des Sterns bzw. deren Wirkungsweise.
Figur 5A und 5B zeigen eine Ausführungsform der erfindungsgemäßen Hairpin-Strukturen, die eine markierungsfreie Detektion, d.h. zum Nachweis von nichtmarkierten Analyten, bzw. deren Wirkungsweise. F bedeutet eine Fluoreszenzmarkierungsgruppe, Q einen Quencher.
Figur 6 zeigt die Wirkungsweise erfindungsgemäßer Hairpin-Strukturen bei einer Doppelstrang-Hybridisierung, d.h. der zu bestimmende Analyt liegt in Form eines doppelsträngigen Targets vor.
Figur 7 zeigt erfindungsgemäße Hairpin-Strukturen, die nicht über die Enden, sondern im inneren der Sequenz an die Festphase gebunden sind. Gemäß Figur 7A befindet sich die Erkennungssequenz im Loop und gemäß Figur 7B befindet sich die Erkennungssequenz im Stem. Figur 8 zeigt ein Beispiel für eine Hybridisierung auf einem Array mit Hairpin-Strukturen, bei denen sich die Erkennungssequenz im Loop befindet.
Figur 9 zeigt ein Beispiel für eine Hybridisierung auf einem Array, der Hairpin-Strukturen mit einer Erkennungssequenz im Stem beinhaltet.

Claims

Ansprüche
1 . Verfahren zur Bestimmung von Analyten, umfassend die Schritte: (a) Bereitstellen eines Trägers mit mehreren vorbestimmten
Bereichen, an denen jeweils unterschiedliche Rezeptoren ausgewählt aus Nukleinsäuren und Nukleinsäureanaloga immobilisiert sind, wobei in einem oder mehreren der vorbestimmten Bereiche die Rezeptoren in Abwesenheit eines damit spezifisch bindefähigen Analyten zumindest teilweise als Sekundärstruktur vorliegen,
(b) Inkontaktbringen des Trägers mit einer Analyten enthaltenden Probe und
(c) Bestimmen der Analyten über deren Bindung an die auf dem Träger immobilisierten Rezeptoren, wobei die Bindung eines
Analyten an einem damit spezifisch bindefähigen Rezeptor den Nachweis einer Auflösung der in Abwesenheit des Analyten vorliegenden Sekundärstruktur umfasst.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass man einen mikrofluidischen Träger mit Kanälen, insbesondere mit geschlossenen Kanälen, verwendet, in denen sich die vorbestimmten Bereiche mit den dort immobilisierten Rezeptoren befinden.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man als Rezeptoren DNA-Moleküle verwendet.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Bindung eines Analyten an den Rezeptor eine Hybridisierung umfasst.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass man mehrere Analyten parallel in der Probe bestimmt.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass man mindestens 50, vorzugsweise mindestens 100 Analyten parallel bestimmt.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Immobilisierung der Rezeptoren an den Träger durch kovalente Bindung, nicht-kovalente Selbstassemblierung, Ladungswechselwirkung oder Kombinationen davon erfolgt.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Synthese der Rezeptoren in situ auf dem Träger erfolgt.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Synthese der Rezeptoren umfasst: das Leiten von Fluid mit Rezeptor-Synthesebausteinen über den Träger, das orts- oder/und zeitspezifische Immobilisieren der Bausteine an jeweils vorbestimmten Positionen auf dem Träger und das Wiederholen dieser Schritte bis die gewünschten Rezeptoren an den jeweils vorbestimmten Positionen synthetisiert worden sind.
0. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Synthese der Rezeptoren mindestens einen fluidchemischen Schritt, einen fotochemischen Schritt, einen elektrochemischen Schritt oder eine Kombination von zwei oder mehr solcher Schritte umfasst.
1 . Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Synthese der Rezeptoren eine on-line Prozessüberwachung umfasst.
2. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 1 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Analytbestimmung in einer Vorrichtung erfolgt, umfassend:
(i) eine Lichtquellenmatrix, (ii) einen mikrofluidischen Träger,
(iii) Mittel zur Zufuhr von Fluids zum Träger und zur Ableitung von Fluids aus dem Träger und (iv) eine Detektionsmatrix, umfassend mehrere Detektoren, die den vorbestimmten Bereichen auf dem Träger zugeordnet sind.
3. Verfahren nach Anspruch 1 2, dadurch gekennzeichnet, dass eine programmierbare Lichtquellenmatrix ausgewählt aus einer Lichtventilmatrix, einem Spiegelarray und einem UV-Laser-Array verwendet wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1 2 oder 1 3, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Vorrichtung verwendet, in der zumindest die Komponenten (ii), (iii) und (iv) in integrierter Form vorliegen.
1 5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Sekundärstrukturen der Rezeptoren eine Hairpin-Struktur, umfassend einen Stem und einen Loop, aufweisen.
1 6. Verfahren nach Anspruch 1 5, dadurch gekennzeichnet, dass sich die mit dem Analyten spezifisch bindefähige Sequenz des Rezeptors im Loop der Hairpin-Struktur befindet.
17. Verfahren nach Anspruch 1 5, dadurch gekennzeichnet, dass sich die mit dem Analyten spezifisch bindefähige Sequenz des Rezeptors im Stem der Hairpin-Struktur befindet.
1 8. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass der Loop der Hairpin-Struktur keine Bausteine enthält, die mit dem Analyten starke Hybridisierungsreaktionen eingehen können.
1 9. Verfahren nach Anspruch 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, dass der Stem aus miteinander komplementären Sequenzbereichen und miteinander nicht komplementären Sequenzbereichen besteht.
20. Verfahren nach Anspruch 1 9, dadurch gekennzeichnet, dass die nicht komplementären Sequenzbereiche des Stem zur Basenpaarung fähige Abschnitte oder/und nicht oder nur schwach zur Basenpaarung fähige Abschnitte umfassen.
21 . Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Rezeptoren terminal oder/und intern an den vorbestimmten Bereichen des Trägers immobilisiert werden.
22. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 21 , dadurch gekennzeichnet, dass man eine Hairpinstruktur verwendet, die eine im geschlossenen Zustand zumindestteilweise gequenchte Markierungsgruppe enthält, und dass man eine durch Auflösung der Hairpinstruktur bewirkte Zunahme eines von der Markierungsgruppe stammenden Signals nachweist.
23. Vorrichtung zur Bestimmung von Analyten, umfassend (i) eine Lichtquellenmatrix,
(ii) einen mikrofluidischen Träger mit mehreren vorbestimmten
Positionen, an denen jeweils unterschiedliche Rezeptoren ausgewählt aus Nukleinsäuren und Nukleinsäureanaloga auf dem Träger immobilisiert sind, wobei in einem oder mehreren der vorbestimmten Bereiche die Rezeptoren in Abwesenheit eines damit spezifisch bindefähigen Analyten zumindest teilweise als Sekundärstruktur vorliegen,
(iii) Mittel zur Zufuhr von Fluids zum Träger und zur Ableitung von Fluids aus dem Träger und
(iv) eine Detektionsmatrix umfassend mehrere Detektoren, die den vorbestimmten Positionen auf dem Träger zugeordnet sind.
24. Vorrichtung nach Anspruch 23, in der zumindest die Komponenten (ii), (iii) und (iv) in integrierter Form vorliegen.
25. Vorrichtung nach Anspruch 23 oder 24, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger zwischen Lichtquellenmatrix und Detektionsmatrix angeordnet ist.
26. Verwendung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 23 bis 25 in einem Verfahren zur parallelen Bestimmung einer Vielzahl von Analyten.
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