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WO2003031971A1 - Reactif pour detecter un facteur de risque de la maladie d'alzheimer, necessaire de detection a cet effet, et procede de detection du facteur de risque de la maladie d'alzheimer au moyen de ce necessaire - Google Patents

Reactif pour detecter un facteur de risque de la maladie d'alzheimer, necessaire de detection a cet effet, et procede de detection du facteur de risque de la maladie d'alzheimer au moyen de ce necessaire Download PDF

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WO2003031971A1
WO2003031971A1 PCT/JP2002/010363 JP0210363W WO03031971A1 WO 2003031971 A1 WO2003031971 A1 WO 2003031971A1 JP 0210363 W JP0210363 W JP 0210363W WO 03031971 A1 WO03031971 A1 WO 03031971A1
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WO
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apolipoprotein
alzheimer
antibody
risk factor
ap0e4
Prior art date
Application number
PCT/JP2002/010363
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English (en)
French (fr)
Inventor
Shigeo Ota
Masahiro Maeda
Original Assignee
Immuno-Biological Laboratories Co., Ltd.
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Publication date
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Priority to EP02800770A priority patent/EP1434053B1/en
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
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    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
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    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
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    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2814—Dementia; Cognitive disorders
    • G01N2800/2821—Alzheimer

Definitions

  • the present invention relates to a reagent and a kit for detecting an Alzheimer's risk factor, and a method for detecting an Alzheimer's risk factor using the same.
  • the present invention relates to a reagent for detecting an Alzheimer's risk factor using an antibody capable of being accurately detected, a detection kit, and a detection method using the same.
  • Alzheimer's disease was first reported by German neuropathologist A. Alzheimer (Aizheimer) in 2007 and is now one of the major causes of senile dementia.
  • the proportion of dementia patients in the elderly aged 65 and over is about 7%, and since it is increasing year by year, it is not just a fool that is contributing to soaring medical expenses for the elderly, but for nursing care.
  • the economic burden on the people is about to increase. Under such circumstances, general physicians are now in an era in which dementia patients should be actively diagnosed and treated at an early stage.
  • Alzheimer's disease shows a remarkable and multiple higher cerebral cortical dysfunction with a rapidly devastating course after its onset, and aphasia, agnosia and apraxia are recognized relatively early.
  • Pathologically the brain is significantly atrophied, weighing less than 900 grams at the end. Histologically, characteristic lesions such as loss of nerve cells, neurofibrillary tangles, and senile plaques appear.
  • Table 1 Proteins are biosynthesized based on genes. This is a gene This is called “encoded protein J. Table 1
  • apolipoprotein E gene (AD 2) is abbreviated as apolipoprotein (hereinafter ⁇ ), which is one of the components of lipoprotein tin (a complex of lipid and protein) in human blood. It is a gene that encodes ⁇ . This gene has been postulated to be an Alzheimer dementia susceptibility gene or an Alzheimer risk factor.
  • ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ is composed of 299 amino acids, and from the ⁇ terminus, the 1st, 2nd and 15th 8th are those of cysteine, A ⁇ 0 ⁇ 2, the 1st and 2nd are cysteine, and the 1 Those are called Ap0E3, and those of both are called Ap0E4.
  • the genotypes of these Ap0E-encoding genes are as follows: (Ap0E2ZAp0E2), (ApoE2 / ApoE3) , (A po E 2 / A po E 4), (A po E 3 / A po E 3), (A po E 3 / A po E 4) and (A po E 4 / A po E 4) All birds fall into one of these categories.
  • Alzheimer's disease frequently occurs in (Ap0E4 / Ap0E4) and (ApoE3 / ApoE4) types. I have. Conversely, Ap 0 E 2 containing (A p 0 E 2 / A po E2), (A po E 2 / A po E 3) and (A po E 2 / A po E 4) are less. Further In addition, antioxidant effects are in the order of Ap0E2>Ap0E3> Ap0E4, and it has been speculated that Ap0E4 promotes fibrosis of amyloid / 3 protein. I have.
  • a p 0 E When one of the dimeric structures formed by A p 0 E has one A p 0 E 4, it means that heptococcal junction (A p 0 E 2 / A p 0 E 4 or A po E 3 / A po E According to 4), the age of onset is said to be about 10 years earlier. Homozygous (ApoE4 / ApoE4) leads to an earlier age of onset for nearly 20 years.
  • the gene frequency of ApoE4 is about 10% in Japanese, but it is about 30% in Alzheimer's disease group.
  • Ap0E4 is expressed on the AD gene, Alzheimer's disease is liable to occur, that is, Ap0E4 is a risk factor for Alzheimer's disease. It is required to detect the disease and delay the onset of Alzheimer's disease, or to administer drugs for improving cognitive function of Alzheimer-type dementia to alleviate the condition.
  • a gene amplification test typified by the PCR (PoIymaseRaseChainReanActione) method is currently performed.
  • This method is the most reliable in terms of specificity for genotyping.
  • this method requires cells having genes (such as leukocytes), requires a special gene amplifying device to detect the genes with high sensitivity, and requires half a day for the measurement. There is a problem that the cost is high, and a simple and inexpensive alternative measuring method is desired.
  • the present invention has found a method for detecting the ApoE4 genotype at a lower cost and sensitivity than the PCR method currently used for genetic testing, and provides a method for detecting the risk factor of the Alzheimer's disease using the same. The task is to do so. Disclosure of the invention
  • the present inventor has studied a method capable of detecting only Ap0E4 from Ap0E2, E3 to E4 which are very structurally similar. And as a result, It was found that an antibody against a certain peptide specifically reacts with ApoE4, and that the use of this antibody could clarify the presence of Alzheimer's risk factor.
  • ApOE4 can be detected with higher accuracy.
  • the ability to measure large numbers of samples, the measurement cost per sample is extremely low compared to gene testing, and the use of automatic colorimeters, which have been widely used in laboratories such as hospitals, can be used.
  • the present inventors have found that a special device is not required, and completed the present invention.
  • the present invention provides a reagent for detecting an Alzheimer's risk factor, comprising an antibody specific to apolipoprotein E4 as an active ingredient.
  • the present invention also provides a kit for detecting an Alzheimer's risk factor, comprising the following components (a) and (b):
  • the present invention provides a method for detecting an Alzheimer's risk factor using the above detection reagent or detection kit.
  • FIG. 1 is a diagram showing the specificity of the antibodies prepared in Examples 1 and 2.
  • FIG. 2 is a diagram showing the relationship between the absorbance obtained in Example 4 and the result of genotyping by the PCR method. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • antibody refers to an antibody that can recognize only ApoE4 and does not recognize Ap0E2 and Ap0E3, which have similar structures as peptides.
  • Such antibodies contrast the proteins encoded by the Ap0E2 and ApoE3 and ApoE4 genes (the amino acid sequences of ApoE2, AoE3 and ApoE4 are NCBI data).
  • Ap0E2 and ApoE3 and ApoE4 are NCBI data.
  • accession numbers 2301 18 and AAH 03557 and AAB 59397 are registered as accession numbers 2301 18 and AAH 03557 and AAB 59397, respectively), and synthesize an oligopeptide of an appropriate length centered on a sequence specific to ApoE4 only.
  • An antibody thereto may be prepared by a conventional method.
  • oligonucleotide having an appropriate length centered on the sequence specific to Ap0E4 only include amino acids 106 to 116 of the amino acid sequence of Ap0E4.
  • a synthetic peptide having the amino acid sequence of CADME DVRG R LV (SEQ ID NO: 2) in which cysteine (C) is bound to the N-terminal side of a certain ADME DV RGR LV (SEQ ID NO: 1) (hereinafter referred to as ⁇ p0E4 fragment). Peptide)) can be used for the production of antibodies.
  • Ap0E4 fragment peptide can be obtained by various methods without particular limitation. For example, it can be synthesized by a method known in the art.
  • This ApoE4 fragment peptide is then bound to a biopolymer compound, and this can be used as an antigen to prepare an antibody specific to ApoE4.
  • this biopolymer compound examples include squash hemocyanin (hereinafter, referred to as LHJ), ovalbumin (hereinafter, referred to as rOVAj), ⁇ serum albumin (hereinafter, referred to as “BSA”), and egrets.
  • LHJ squash hemocyanin
  • rOVAj ovalbumin
  • BSA serum albumin
  • RSAJ serum albumin
  • thyroglobulin etc. Of these, KLH and thyroglobulin are more preferred.
  • the binding between the Ap0E4 fragment peptide and the biopolymer compound can be performed, for example, by the mixed acid anhydride method (BF Er. Langereta: J. Biol. Ch. em. 234 1 090-1 094 (1 954)) or the activated ester method (AE KARU eta I .: J. Agric. Food Chem. 42 301-309 ( ⁇ 994)). Can be done by any method.
  • the mixed acid anhydride used in the mixed acid anhydride method is obtained by subjecting an Ap0E4 fragmented peptide to a usual Schotten-Baumann reaction, and is then reacted with a biopolymer compound. Thus, a peptide-biopolymer compound conjugate is prepared.
  • the haloformate used in the mixed acid anhydride method include methyl chloroformate, methyl bromoformate, ethyl ethyl chloroformate, ethyl ethyl bromoformate, and isobutyl chloroformate.
  • the ratio of the peptide, the haloformate and the polymer compound used in the method can be appropriately selected from a wide range.
  • the Schotten-Baumann reaction is carried out in the presence of a basic compound.
  • a basic compound used in the reaction a compound commonly used in the Schotten-Baumann reaction can be used.
  • organic bases such as trimethylamine, pyridine, dimethylaniline, N-methylmorpholine, DBN, DBU and DABCO
  • inorganic bases such as potassium carbonate, sodium carbonate, potassium hydrogencarbonate and sodium hydrogencarbonate can do.
  • the above reaction is usually carried out at a temperature of from 20 ° C to 100 ° C, preferably from 0 ° C to 50 ° C, and the reaction time is from 5 minutes to 10 hours, preferably from 5 minutes to 2 hours.
  • the reaction between the obtained mixed acid anhydride and the biopolymer compound is usually carried out at a temperature of ⁇ 20 ° C. to 150 ° C., preferably 0 ° C. to 100 ° C., and the reaction time is 5 minutes to 10 ° C. Time, preferably 5 minutes to 5 hours.
  • the mixed acid anhydride method is generally carried out in a solvent, but any solvent commonly used in the mixed acid anhydride method can be used as the solvent, and specifically, dichloromethane, chloroform, dichloroethane, etc. Halogenated hydrocarbons such as benzene, toluene, xylene, etc.
  • Ethers such as getyl ether, dioxane, tetrahydrofuran and dimethyloxetane, esters such as methyl acetate and ethyl acetate, N, N-dimethylformamide, dimethylsulfoxide, hexamethylphosphoric triamide, etc.
  • Aprotic polar solvents and the like are examples of polar solvents and the like.
  • the activated ester method can be generally performed as follows. First, the synthetic peptide is dissolved in an organic solvent and reacted with N-hydroxysuccinimide in the presence of a coupling agent to form an N-hydroxysuccinimide active ⁇ ester.
  • an ordinary force coupling agent commonly used in a condensation reaction can be used, and examples thereof include dicyclohexylcarpoimide, carbonyldiimidazole, and water-soluble carpoimide.
  • the organic solvent for example, N, N-dimethylformamide (DMF), dimethyl sulfoxide, dioxane and the like can be used.
  • the molar ratio of the peptide and N-hydroxysuccinimide used in the reaction is preferably 1:10 to 10: 1, most preferably 1: 1.
  • the reaction temperature is 0 to 50 ° C, preferably 22 to 27 ° C, and the reaction time is 5 minutes to 24 hours, preferably 1-2 hours.
  • the reaction can be carried out at a temperature from the melting point to the boiling point.
  • the reaction solution is added to a solution in which the biopolymer compound is dissolved and reacted.
  • the reaction temperature is 0 to 60 ° C, preferably 5 to 4 CTC, more preferably 22 to 27 ° C, and the reaction time is 5 minutes to 24 hours, preferably 1 to 16 hours, more preferably Is 1-2 hours.
  • reaction product obtained by any of the above methods is purified by dialysis, desalting ram, or the like, and a conjugate of an Ap0E4 fragment peptide and a polymer compound (hereinafter simply referred to as " J), sometimes called compound J, can be obtained.
  • J a conjugate of an Ap0E4 fragment peptide and a polymer compound
  • an animal may be immunized with the conjugate and the antibody may be collected from the animal.
  • a conjugate such as an ApoE4 fragment peptide-thyroglobulin conjugate is dissolved in a sodium phosphate buffer (hereinafter, referred to as rPBS j), and this is combined with Freund's complete adjuvant or incomplete adjuvant,
  • rPBS j sodium phosphate buffer
  • a mammal immunized with an adjuvant such as alum is used as an immunogen.
  • an animal to be immunized any of those commonly used in the art can be used, and examples thereof include a mouse, a rat, a rabbit, a goat, and a rabbit.
  • the method of administering the immunogen upon immunization may be any of subcutaneous injection, intraperitoneal injection, intravenous injection, subcutaneous injection, and intramuscular injection, but subcutaneous injection or intraperitoneal injection is preferred. Immunization can be performed once or at appropriate intervals, preferably multiple times at intervals of 1 to 5 weeks.
  • blood is collected from the immunized animal according to a conventional method, and an antibody against the Ap0E4 fragment peptide can be obtained using the serum separated therefrom.
  • an immune cell obtained by immunizing an animal with the conjugate is fused with myeloma cells to obtain a hybridoma, and an antibody is collected from the culture of the hybridoma.
  • an antibody against the Ap0E4 fragment peptide can be obtained.
  • HRP horseradish peroxide old oxidase, Arukarifu old Sufata one zero or the like of the enzyme, full-year old receptacle in iso Xia Natick Bok, fluorescent substances such as rhodamine, 3 2 P , radioactive material, such as 1 2 5 I, chemiluminescent substances.
  • a product obtained by binding the above-described labeling substance to the Ap0E4 fragment peptide can be used in an immunochemical assay.
  • the reagent for detecting an Alzheimer's risk factor of the present invention (hereinafter referred to as “reagent of the present invention”) is prepared by combining the above antibody with a carrier. Examples of such a carrier include glass tubes, polystyrene beads, microtiter plates, and membranes.
  • the reagent of the present invention may be a liquid or a lyophilized product that can be converted into a liquid by adding water at the time of use.
  • examples of a sample from which a Realzheimer's risk factor is to be detected by the reagent of the present invention include various body fluids such as whole blood, serum, and plasma.
  • This sample can be used after being appropriately diluted as necessary, and a buffer containing phosphoric acid, carbonic acid, tris, or the like, or a physiological saline solution can be used for this dilution.
  • Specific examples of sample dilution include: 1-fold dilution for whole blood (add 500 ⁇ 1 of dilution buffer to 1 I of whole blood); 0-fold dilution for serum or plasma (serum or plasma) Add 10 000 ⁇ l of dilution buffer to 10 nI).
  • method J of the present invention The method for detecting an Alzheimer's risk factor according to the present invention is performed by adding the reagent of the present invention to a sample and detecting the antigen-antibody reaction of the antibody in the reagent of the present invention.
  • the method for detecting an antigen-antibody reaction in the method of the present invention include the RIA method (radioisotope immunoassay method), the ELISA method (EngVaII, E, Methodsin Enzymo I, 70, 41).
  • a so-called sandwich method in which Ap0E4 to be detected is sandwiched between two kinds of antibodies can be mentioned.
  • One of the antibodies used in this method is an antibody specific to ApoE4 described above, and the other antibody is ApoE2, ApoE3 and ApoE4.
  • Antibodies to all of Ap0E2, Ap0E3 and ApoE4 used in the present invention refer to any of ApOE2, ApoE3 and ApoE4.
  • the antibody is not particularly limited as long as it is an antibody recognizable by ApoE2, ApoE3, and ApoE4. What is necessary is just to produce the antibody with respect to it.
  • cysteine (C) is added at the N-terminal side of EKVQAAVGTSAA PV PS DNH (SEQ ID NO: 3), which is 281 to 299 of the consensus amino acid sequence of ApoE2, Ap0E3 and ApoE4.
  • a synthetic peptide having the amino acid sequence of bound CE KVQAAVGTSAA PVP S DNH (SEQ ID NO: 4) may be artificially synthesized and prepared in the same manner as the above-described antibody against Ap0E4.
  • the procedure for the detection of A p 0 E 4 will be described using the sandwich method as an example. That is, first, (a) an antibody against all of ApoE2, 00 £ 3 and 0E4 is immobilized on a carrier, and (b) the carrier surface on which the antibody is not immobilized is used as an antigen. Blocking by irrelevant eg BSA. In addition, (c) a sample obtained by diluting the sample containing Ap0E is added to the mixture to generate an ApoE-antibody complex, and then (d) specific to Ap0E4 to which the labeled enzyme is bound. By adding a specific antibody and binding it to the Ap0E-immobilized antibody complex, and finally (e) measuring the color development of the labeled enzyme, the ApoE in the sample can be determined from the calibration curve prepared in advance. The amount of 4 can be determined.
  • the carrier on which the antibody is immobilized is not particularly limited, and any carrier commonly used in ELISA can be used.
  • a 96-well microtiter plate made of polystyrene or an amino-bonded microtiter plate can be used.
  • a buffer solution containing the antibody may be added to the carrier and incubated.
  • a known buffer can be used, for example, 1 OmM PBS.
  • the concentration of antibody in the buffer can be selected from a wide range, but is usually 0.01-100 g / m I, preferably 0.1 to 2 O g / m I.
  • the blocking in the step (b) is carried out because, in the carrier on which the antibody is immobilized, there may be a portion where A p O E in the sample to be added later is adsorbed independently of the antigen-antibody reaction. This is done to prevent it.
  • the blocking agent for example, in addition to BSA and skim milk solution, it is possible to use a commercially available blocking agent such as Block Ace (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd., code N 0. UK-25B). it can.
  • a specific blocking method a method in which an appropriate amount of a 1% BSA solution is added to the antigen-immobilized portion, incubated at 4 ° C overnight, and then washed with a buffer solution can be mentioned.
  • the buffer solution used in this method preferably 0.05% (v / v) Twe en- 20 and 0.05% N a N containing 3 5 Omm of PBS (p H 7.2).
  • the sample containing ApoE is brought into contact with the immobilized antibody, and ApoE is supplemented with the immobilized antibody to form an ApoE-immobilized antibody complex.
  • the reaction is not limited, but may be performed at about 37 ° C. for about 1 hour.
  • the carrier is preferably washed with a buffer to remove unreacted proteins and the like.
  • 1 OmM PBS (pH 7.2) containing 0.05% (v / v) Tween 20 is preferable.
  • step (d) an antibody specific to ApoE4 labeled with a labeling substance is added to ApoE captured by the solid phased antibody, and the solid phased antibody—Ap0E—labeled substance is added.
  • a complex of an antibody specific to the labeled Ap0E4 is formed.
  • the carrier is preferably washed with a buffer to remove unreacted proteins and the like.
  • label with labeling substance The antibody specific for ApoE4 is diluted to about 5000 to 10,000 times with respect to the solid-phased antibody bound to the carrier, and preferably diluted so that the final absorbance becomes 1.0 to 1.5. It is desirable to react.
  • a buffer can be used for dilution.
  • Labeling substances used in the above step (d) include enzymes such as HRP and alkaline phosphatase, fluorescent substances such as full-length restained isocyanate and rhodamine, radioactive substances such as 32 P and 125 I, and chemiluminescence. Substances. For example, if peroxidase is used as an enzyme, hydrogen peroxide and 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzine (hereinafter referred to as "TMBJ”) or 0-phenylenediamine (hereinafter referred to as "TMBJ”) Chromogenic reaction solution including, but not limited to, rOPDj).
  • enzymes such as HRP and alkaline phosphatase
  • fluorescent substances such as full-length restained isocyanate and rhodamine
  • radioactive substances such as 32 P and 125 I
  • chemiluminescence chemiluminescence.
  • Substances for example, if peroxidase is used as an enzyme,
  • the color reaction is not limited, but after adding the chromogenic substrate solution and reacting at about 25 ° C for about 20 minutes, 2N sulfuric acid is used. Stop the enzymatic reaction by adding the solution. Measure the absorbance at 492 nm when using OPD, and measure the absorbance at 450 nm when using TMB. When alkaline phosphatase is used as the enzyme to be developed, the color is developed using p-diethyl phenyl phosphate as a substrate, the enzyme reaction is stopped by adding 2N NaOH, and the absorbance at 415 nm is measured. Is the most appropriate method.
  • the concentration of Ap0E4 in the sample can be calculated using a calibration curve prepared in advance based on the absorbance of the reaction solution to which a known concentration of Ap0E4 has been added.
  • a standard solution 1 (hereinafter, simply referred to as “standard solution 1”) capable of discriminating between the ApoE4 homogenous type and the Ap0E4 heterogenous type in the detection method
  • standard solution 2 (hereinafter simply referred to as “standard solution 2J”) that can distinguish between the 0 E4 heterogenotype and a genotype other than A p 0 E4, the genotype of A po E in the sample can be determined.
  • the concentration of the standard solution 1 is determined from the concentration of Ap0E4 contained in various body fluids, for example, samples such as whole blood, serum, and plasma, and the concentration of Ap0E4 contained in the sample is determined.
  • Ap0E4 having a homogenous genotype of Ap0E4 / E4
  • the minimum concentration of Ap0E4 in the subject and ApoE4 and ApoE3 or Apo It is the concentration of Ap0E4 between E4 and the highest concentration of ApoE4 in the subject (having ApoE4 heterogenotype) that is APoE2.
  • the concentration of the standard solution 2 is also determined from the concentration of A p 0 E 4 contained in the sample, and A p 0 E contained in the sample is A po E 4 and po ⁇ ⁇ ⁇ 3 or A po E 2 and A po E 4 (with the A po E 4 heterogenotype)
  • the minimum concentration of A po E 4 in the subject and all A po E 3, all A p 0 E 2 and A p 0 The concentration of Ap0E4 between E3 and ApoE2 (having a genotype other than Ap0E4) of the subject's highest concentration of ApoE4.
  • standard solution I and standard solution 2 should be used when measuring the solutions with Ap0E4 concentrations of 1-2 Mg / mI and 0.24 g / mI, respectively. Diluted to the same dilution ratio as whole blood used for
  • genotype of Ap0E is determined as follows, where A is the absorbance of standard solution 1, B is the absorbance of standard solution 2, and C is the absorbance of Ap0E4 in the sample. can do.
  • C ⁇ B has a genotype other than A p 0 E 4 (A p 0 E 3 / E 3,
  • This detection kit is composed of, for example, the following combinations.
  • the detection reagent of the present invention it is possible to accurately and easily detect ApoE4 in a sample.
  • the presence and amount of ApoE4 in the sample indicates that the living body has the Ap0E4 gene, and that the possibility of Alzheimer's disease is high, that is, the risk factor for Alzheimer's disease. It is to show that you own it.
  • Example 1 Example 1
  • the antibody specifically recognizing A po E4 is the amino acid of CA DMEDVRGRLV (SEQ ID NO: 2), which binds cysteine (C) to the N-terminal of No. 106 to No. 116 of the amino acid sequence of Ap0E4. It was prepared as follows using a synthetic peptide having a sequence (hereinafter referred to as ⁇ 4 fragment peptide).
  • a conjugate of an Ap0E4 fragment peptide (manufactured by Synpep) serving as an immunogen and a thyroglobulin was prepared by the EMCS (N— (6—Maieimidocarorolyloxy) -succiminimide) method.
  • the molar ratios of thyroglobulin, Ap0E4 fragment peptide, and EMCS were 1: 300: 400, respectively.
  • thyroglobulin is dissolved in 1 ml of 0.01 M phosphate buffer (pH 7.0), and EMCS 8 Og / I dissolved in dimethylformamide is added to the above-mentioned molar equivalent, and the thyroglobulin-EMCS complex is added.
  • a solution of 4 mg of the ApoE4 fragment peptide in about 1 ml of distilled water was added in an amount equivalent to the above-mentioned molar amount, whereby the ApE4 fragment peptide cross-linked with EMCS and the cycloglobulin were added.
  • a conjugate with phosphorus was made. Then, this was dialyzed using PBS, and the concentration was adjusted to 1.0 S / ⁇ I to obtain an antigen for immunization.
  • Egret and mice were immunized with the antigen for immunization obtained in the above (1). Egrets were immunized 100 I (100 g) every other week or every two weeks. The mice were immunized with 50 ⁇ l (50 tg) every other week. The antigen was mixed with Freund's complete adjuvant only for the first immunization, and mixed with Freund's incomplete adjuvant for both the first immunization and the mouse. ⁇ Eg heron was immunized eight times and mice were immunized four times, and blood was collected to separate serum and used as antiserum.
  • Ap E4 fragment peptide (Synpep) dissolved in distilled water This was used as the Apo E4 fragment peptide antigen for screening.
  • ApoE2, ApoE3 and ApoE4 (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) dissolved in distilled water were used as the Ap0E antigen for screening.
  • Apo E 4 (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was used as a standard solution in Example 3.
  • the Ap0E4 fragment peptide antigen for screening prepared in the above (3) was diluted to 0.1 Otg / ml in 0.1 M carbonate buffer (pH 9.5), and 50 I was fixed in a 96-mL plate. It matched. Washed with PBS, and then, after blocking with 0. 1% BSA / PBS / 0.05 % N a N 3 solution, 1 00-fold dilution of the antisera sequentially 2 bye diluted, placed in a 50 I Ueru, The reaction was performed at 37 ° C for 30 minutes.
  • Each 100 I was placed in each well, and left at room temperature for 15 minutes in a light-shielded state to develop color. After the color development, 1 N sulfuric acid was added to each well, and the reaction was stopped. The absorbance at 490 nm was measured to confirm the reactivity of the antiserum to the ApoE4 fragment peptide.
  • the reactivity of the antiserum was examined by Western blotting.
  • the above antigen was applied to a 12% acrylamide gel, and electrophoresis was performed at 2 OmA. After plotting Bok this gel Menpuren, Burokkin with 3% skim milk 1% BSA / PBS / 0.05% N a N 3 At 37 ° C. for 2 hours. After washing with 0.05% Tween 20-PBS, each antiserum was diluted 200-fold with 0.1% Tween 20-PBS and allowed to react at 4 ° C.
  • the cells were washed with 0.05% Tween 20-PBS, and HRP-labeled anti-mouse IgG was added to the mouse antiserum and HRP-labeled anti-mouse IgG was added to the mouse antiserum. Allowed to react for hours.
  • the plate was washed with 0.05% Tween 20-PBS, emitted light using ECL (Amersh am Pharmacia Biotech), and exposed to an X-ray film. This confirmed the reactivity of the antiserum with Ap0E4.
  • Monoclonal antibodies were prepared for the mice whose antiserum titer and reactivity with ApoE4 were confirmed in (5) above.
  • spleen cells of a mouse having high anti-Ap0E4 fragment peptide antibody activity in serum and mouse myeoma cells (X63-Ag8) were subjected to cell fusion by the PEG method.
  • the antibody activity against the Ap0E4 fragment peptide was examined for the culture supernatant in which cell proliferation was observed by the following method.
  • the reactivity of the culture supernatant was examined by ELISA using the Ap0E antigen for screening prepared in (3) above.
  • the Ap0E antigen for screening prepared in (3) above was diluted with 0.1 M carbonate buffer-(pH 9.5) to 1.0 g / ml, and 96 plates were prepared at 50 I / well. To solid phase. Washed with PBS, then blocked with 0. l ⁇ BSAZPBSZO. OS ⁇ NaN 3 solution was placed the culture solution to 50 n I / Ueru, and reacted overnight at 4 ° C. After the completion of the reaction, the well was washed four times with 0.05% Tween 20-PBS, and then 50 I of HRP-labeled anti-mouse IgG was added to each well and reacted at 37 ° C for 30 minutes.
  • FIG. 1 shows the specificity of the antibodies prepared in Example I and Example 2. As is clear from FIG. 1, the antibody prepared in Example 1 showed reactivity only with Ap0E4, and the antibodies prepared in Example 2 were ApoE2, ApoE3 and ApoE4. Reactivity was shown with all of. Example 3
  • the construction of the sandwich ELI SA method was made as follows. Antibodies specifically reacting to all of Ap0E2, E3 and E4 prepared in Example 2 at 1 Otg / ml were added to the 96-well ELISA plate in a volume of ⁇ 00 I. After a reaction at 4 ° C, blocking was performed with a 1.0% BSA / PBS / NaN 3 solution, and this was used as a sandwich ELISA plate. The conjugate of the anti-ApoE4 fragment peptide antibody and HRP prepared in (7) of Example 1 was used as a labeled antibody.
  • the reactivity with Ap0E4 was measured as follows. 100 I of the standard solution prepared in (3) of Example 1 was added to a sandwich ELISA plate, and the mixture was reacted at 37 ° C for 1 hour. After the reaction, the plate was washed four times with 0.05% Tween 20-PBS, 100 AI of the labeled antibody was added, and the mixture was reacted at 37 ° C for 30 minutes. After the reaction, the plate was washed six times with 005% Tween 20-PBS, 100 mL of a TMB solution was added, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 30 minutes under light shielding. The reaction was stopped with 1 N sulfuric acid, and the absorbance at 450 nm was measured. As a result, Ap0E4 was specifically measured, and a calibration curve was created.
  • Porantia's whole blood A total of 35 samples of Porantia's whole blood were used. To 1 I of whole blood, 500 ⁇ I of a phosphate buffer solution containing 1% of BS S and 0.05% of Tween 20 was added and diluted 51-fold to obtain a sample.
  • Example 2 100 I of the antibody specifically recognizing Ap0E4 labeled with HRP obtained in Example 1 was added, and the plate was covered, followed by reaction at 37 ° C for 30 minutes. Was. After a lapse of 30 minutes, washing was performed 9 times in the same manner as described above.
  • TMB 3, 3 ', 5, and 5
  • a substrate buffer obtained by mixing 5 ml of purified water and 5 ml of a buffer solution containing 0.01% hydrogen peroxide.
  • 5'-Tetra methylbenzidine tablet; Sigma Two tablets of a tablet were dissolved in a TMB substrate solution, and the TMB substrate solution was added to a well with ⁇ , I, and protected from light. The reaction was performed at room temperature for 30 minutes. ⁇ After the addition of the substrate solution, the reaction solution gradually turns blue. Further, add 100 tI of a stop solution consisting of sulfuric acid to the well, and gently tap the side of the plate to mix uniformly. After the addition of the stop solution, the reaction solution changes from blue to yellow.
  • a standard solution 1 (Ap0E4 (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) capable of discriminating between the Ap0E4 homogenotype and the Ap0E4 genotype instead of the sample in the same manner as described above was adjusted to 1.2 g / m I and diluted 5-fold with purified water: hereinafter, referred to as “standard solution 1 j”, A p 0 E 4 heterogenotype and other than A p 0 E 4
  • a standard solution 2 (Ap0E4 (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), which can be distinguished from a genotype, adjusted to 0.24 gZmI and diluted 51-fold with purified water: Standard solution 2) and reagent blank were performed simultaneously on one sample plate. Also, the specimen The same operation as that for the sample plate was performed for the sample blank plate.
  • the measured absorbance is defined as follows.
  • the value obtained by subtracting the absorbance obtained from the sample blank plate from the absorbance of the sample plate is used as the corrected absorbance.
  • the genotype was determined based on the absorbance corrected as described above according to the criteria shown in Table 2.
  • Table 2 The genotype was determined based on the absorbance corrected as described above according to the criteria shown in Table 2.
  • Figure 2 shows the relationship between the absorbance obtained as described above and the results of genotyping by PCR
  • Table 3 shows the results of genotypes determined by absorbance and the results of genotyping by PCR. Show.
  • the genotype determination by the PCR method is based on the method of Hixson et al. (Hixson JE and Vernier DT, J. Lipid. Res. 1990, Mar, 31 (3): 545-8). It was done according to.
  • an automatic colorimetric device conventionally used widely in a laboratory such as a hospital can be used as it is, and a special device is not required. Therefore, the Waltzheimer is extremely inexpensive as compared with the conventional PCR method. Risk factors can be detected.
  • Genetic testing requires cells that have genes (such as leukocytes), but in the present invention, whole blood or serum and plasma can be used as a sample, so the range of applications, such as serum and plasma, is widened. is there.
  • the present invention is extremely effective as a screening test for measuring a large amount of a sample before the ApoE gene test, which is currently regarded as a definitive test.

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Description

明細害 アルツハイマー危険因子の検出試薬および検出用キッ卜ならびに これらを用いるアルツハイマー危険因子の検出方法 技術分野
本発明は、 アルツハイマー危険因子を検出するための試薬、 キットおよびこれ らを用いるアルツハイマー危険因子の検出方法に関し、 更に詳細には、 アルッ八 イマ一危険因子であるアポリポプロティン E 4ァレル型を簡便に精度良く検出可 能とする抗体を用いるアルツハイマー危険因子の検出試薬、 検出キッ卜ならびに これらを用いる検出方法に関する。 背景技術
アルツハイマー病ば 9 0 7年ドイツの神経病理学者 A . アルツハイマー （A I z h e i m e r ) によって最初に報告され、 現在では老人痴呆の大きな原因の 一つとなっている。 日本においては 6 5歳以上の高齢者に占める痴呆患者の割合 は約 7 %とされ、 年々増加しているため高齢者医療費の高騰の一因であるばかリ でなく、 その介護のために国民の経済的負担が益々増加しょうとしている。 このような現状から一般医も積極的に痴呆患者を早期に診断し治療すべき時代 となってきている。
アルツハイマー病は、 発症後急速に荒廃する経過をとリ、 顕著で多発性の高次 脳皮質機能障害を示し、 比較的早期から失語、 失認、 失行が認められる。 病理学 的には、 脳が著しく萎縮し、 末期には 9 0 0グラム以下までになる。 組織学的に は、神経細胞の消失、神経原線維変化、老人斑といった特徴ある病変が出現する。 現在までに下記表 1に示すように 4個の遺伝性アルツハイマー病原因遺伝子が 報告されている。 タンパク質は遺伝子をもとに生合成される。 これを遺伝子によ つて 「コードされるタンパク質 J と呼ぶ。 表 1
Figure imgf000004_0001
このうち、 アポリポプロテイン E遺伝子 （AD 2) は、 ヒ卜の血液中のリポプ 口ティン （脂質とタンパク質の複合体） の構成成分の一つであるアポリポプロテ イン （以下、 ΓΑ ρ ο」 と省略することもある） Εをコードする遺伝子である。 この遺伝子はアルツハイマー痴呆感受性遺伝子またはアルツハイマー危険因子と 推定されている。
Α ρ ο Εは、 299個のアミノ酸から構成され、 Ν末端から 1 1 2番目と 1 5 8番目がシスティンのものが A ρ 0 Ε 2、 1 1 2番目がシスティン、 1 58番目 がアルギニンのものが A p 0 E 3、 両方ともアルギニンのものが A p 0 E 4と呼 ばれている。 これらの A p 0 Eをコードする遺伝子の遺伝子型は、 ホモ接合体、 ヘテロ接合体の各組合せとして、 （A p 0 E 2ZA p 0 E 2)、 (A p o E 2/A p o E 3)、 (A p o E 2/A p o E 4), ( A p o E 3 /A p o E 3 )、 (A p o E 3/A p o E 4) および （A p o E 4/A p o E 4) となり、 全てのヒ卜はこ れらのいずれかに分類される。
長寿に伴う孤発性のアルツハイマー病患者の遺伝型を調べると、 アルッハイマ 一病は （A p 0 E 4/A p 0 E4) および （A p o E 3/A p o E4) 型に多く 発症している。 逆に A p 0 E 2を含む （A p 0 E 2/A p o E2)、 (A p o E 2 /A p o E 3) および （A p o E 2/A p o E 4) では少なくなつている。 さら に、 抗酸化作用は A p 0 E 2>A p 0 E 3>A p 0 E 4の順になつておリ、 A p 0 E4がアミロイド /3タンパク質の線維化を促進するとの推測もなされている。
A p 0 Eの形成する二量体構造のうち A p 0 E 4を 1つ有すると、 つまりへテ 口接合 （A p 0 E 2/A p 0 E 4あるいは A p o E 3/A p o E 4) であると発 症年齢が 1 0年近く早くなるといわれている。 ホモ接合 （A p o E4/Ap o E 4) であると 20年近く発症年齢が早くなる。 日本人では A p o E4の遺伝子頻 度は 1 0%程度であるが、アルツハイマー病症例群ではこれが 30%程度となる。 このように、 AD遺伝子上に A p 0 E4が発現されていると、 アルツハイマー 病になりやすいこと、 すなわち、 A p 0 E 4がアルツハイマー病の危険因子であ るため、この因子の有無を早期に検出し、アルツハイマー病の発症を遅らせたり、 アルツハイマー型痴呆の認知機能改善薬等を投与し、 病状を緩和することが求め られている。
ところで、 これら遺伝子型を検査する方法として、 現在、 PCR (P o I ym e r a s e C h a i n R e a c t i o n) 法を代表とする遺伝子増幅検査が おこなわれている。 この方法は、 遺伝子型を確認する特異性という点では最も信 頼性の高い方法である。 しかしながら、 この方法では遺伝子を持つ細胞 （白血球 など） が必須であり、 また、 遺伝子を感度良く検出するための特別な遺伝子増幅 装置を必要とし、 更に、 測定にかかる時間も半日を要し、 かかるコストが高いと いう問題があり、 これにかわる簡便で安価な測定方法が望まれている。
従って本発明は、 現在遺伝子検査に用いられている P C R法と比べて安価で感 度良く A p o E 4遺伝子型を検出する測定方法を見出し、 これを利用したァルツ ハイマー危険因子の検出方法を提供することをその課題とするものである。 発明の開示
本発明者は、 極めて構造的に類似している A p 0 E 2、 E 3ないし E4から、 A p 0 E 4のみを検出しうる方法について研究を行った。 そして、 その結果、 特 定のペプチドに対する抗体は、 Ap o E4に特異的に反応するものであり、 当該 抗体を利用すれば、 アルツハイマーの危険因子の存在を明確にしうることを見出 した。
また、 A p o E 2、 E 3ないし E 4の全てに対する抗体と、 上記 A p o E 4に 対する特異的な抗体を組み合わせて用いれば、 Ap o E 4をより精度高く検出可 能であり、 更に、 多量検体の測定が可能なこと、 1検体当たりの測定コストが遺 伝子検査に比べきわめて安価であること、 従来より病院などの検査室で汎用され ている自動比色装置が使用可能であリ、 新たに特別な装置を必要としないこと等 を見出し、 本発明を完成した。
すなわち本発明は、 アポリポプロティン E 4に特異的な抗体を有効成分として 含有するアルツハイマー危険因子の検出試薬を提供するものである。
また、 本発明は、 次の成分 （a) および （b) を含有するアルツハイマー危険 因子の検出キッ卜を提供するものである。
(a) アポリポプ口ティン E 4に特異的な抗体を含む試薬
(b) アポリポプロテイン E 2、 アポリポプロテイン E 3およびアポリポプロ ティン E 4の全てに対する抗体を含む試薬
更に、 本発明は、 上記検出試薬または検出キットを利用するアルツハイマー危 険因子の検出方法を提供するものである。 図面の ffi単な説明
第 1図は、実施例 1および実施例 2で作製された抗体の特異性を示す図である。 第 2図は、 実施例 4で得られた吸光度と P C R法による遺伝子型の判定結果の 関係を示す図である。 発明を実施するために最良の形態
本発明において使用される、 アポリポプロテイン E4 (A p 0 E4) に特異的 な抗体とは、 A p o E 4のみを認識できる抗体であり、 ペプチドとして構造の類 似する A p 0 E 2および A p 0 E 3は認識しない抗体をいう。このような抗体は、 Ap 0 E 2および A p o E 3と A p o E 4遺伝子がコードするタンパクを対比し (A p o E 2、 A o E 3および A p o E 4のアミノ酸配列は N C B Iのデータ ベースに、 それぞれァクセッション番号 2301 1 8、 AAH 03557および AAB 59397として登録されている）、 A p o E 4のみに特異的な配列を中 心とする適当な長さのオリゴペプチドを合成し、 それに対する抗体を常法により 作製すればよい。
上記の A p 0 E 4のみに特異的な配列を中心とする適当な長さのオリゴぺプチ ドの具体例としては、 A p 0 E 4のアミノ酸配列の 1 06番から 1 1 6番である ADME DV RGR LV (配列番号 1 ) の N末端側にシスティン （C) を結合し た CADME DVRG R LV (配列番号 2) のアミノ酸配列を持つ合成ペプチド (以下、 ΓΑ p 0 E 4フラグメン卜べプチド」 という） を抗体作製のために使用 することができる。
上記の A p 0 E4フラグメントペプチドは、 特に限定されることなく種々の方 法で得られることができる。 例えば、 当業界で公知の方法により合成することが できる。
この A p o E 4フラグメントペプチドは、 次に生体高分子化合物と結合させ、 これを抗原として A p 0 E 4に特異的な抗体を作製することができる。
この生体高分子化合物の例としては、スカシ貝のへモシァニン（以下 ΓΚ L HJ と言う）、 卵白アルブミン （以下、 rOVAj と言う）、 ゥシ血清アルブミン （以 下 「B SA」 と言う）、 ゥサギ血清アルブミン （以下 「R SAJ と言う）、 サイロ グロプリン等が挙げられ。 このうち K LHおよびサイログロプリンがより好まし い。
上記 A p 0 E 4フラグメントべプチドと生体高分子化合物との結合は、例えば、 混合酸無水物法 （B. F. E r . l a n g e r e t a に ： J . B i o l . C h em. 234 1 090- 1 094 (1 954))、 または活性化エステル法 （A. E. K A R U e t a I . ： J . A g r i c . F o o d C h e m. 42 301 - 309 (Ί 994)) 等の公知の方法によって行うことができる。
混合酸無水物法において用いられる混合酸無水物は、 A p 0 E 4フラグメン卜 ペプチドを通常のショッテン—バウマン反応に付すことにより得られ、 これを生 体高分子化合物と反応させることによリ目的とするぺプチド—生体高分子化合物 結合体が作製される。 混合酸無水物法において使用されるハロ蟻酸エステルとし ては、 例えばクロ口蟻酸メチル、 ブロモ蟻酸メチル、 クロ口蟻酸ェチル、 ブロモ 蟻酸ェチル、 クロ口蟻酸イソブチル等が挙げられる。 当該方法におけるペプチド とハロ蟻酸エステルと高分子化合物の使用割合は、 広い範囲から適宜選択され得 る。
なお、 ショッテン—バウマン反応は塩基性化合物の存在下に行われるが、 当該 反応に用いられる塩基性化合物としては、 ショッテン—バウマン反応に慣用の化 合物を使用することができ、 例えば、 卜リエチルァミン、 卜リメチルァミン、 ピ リジン、 ジメチルァニリン、 N—メチルモルホリン、 D BN、 DBU、 D A B C O等の有機塩基、 炭酸カリウム、 炭酸ナトリウム、 炭酸水素カリウム、 炭酸水素 ナ卜リウ厶等の無機塩基等を使用することができる。
また、 上記反応は、 通常、 一 20°Cから 1 00°C、 好ましくは 0°Cから 50°C において行われ、 反応時間は 5分から 1 0時間、 好ましくは 5分から 2時間であ る。
得られた混合酸無水物と生体高分子化合物との反応は、 通常マイナス 20°Cか ら 1 50°C、 好ましくは 0°Cから 1 00°Cにおいて行われ、 反応時間は 5分から 1 0時間、 好ましくは 5分から 5時間である。 混合酸無水物法は一般に溶媒中で 行われるが、 溶媒としては、 混合酸無水物法に慣用されているいずれの溶媒も使 用可能であり、 具体的には、 ジクロロメタン、 クロ口ホルム、 ジクロロェタン等 のハロゲン化炭化水素類、ベンゼン、 トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素類、 ジェチルエーテル、 ジ才キサン、 テ卜ラヒドロフラン、 ジメ卜キシェタン等のェ 一テル類、 酢酸メチル、 酢酸ェチル等のエステル類、 N， N—ジメチルホル厶ァ ミド、 ジメチルスルホキシド、 へキサメチルリン酸卜リアミド等の非プロトン性 極性溶媒等が挙げられる。
一方、 活性化エステル法は、 一般に以下のように行うことができる。 まず、 合 成べプチドを有機溶媒に溶解し、 カップリング剤の存在下にて N—ヒドロキシコ ハク酸イミドと反応させ、 N—ヒドロキシコハク酸イミド活性^エステルを生成 する。
カツプリング剤としては、 縮合反応に慣用されている通常の力ップリング剤を 使用でき、例えばジシクロへキシルカルポジイミド、カルボニルジイミダゾ一ル、 水溶性カルポジイミド等が挙げられる。 有機溶媒としては、 例えば N， N—ジメ チルホルムアミド （D M F )、 ジメチルスルホキシド、 ジ才キサン等が使用でき る。 反応に使用するペプチドと N—ヒドロキシコハク酸イミドのモル比は好まし くは 1 ： 1 0 ~ 1 0 ： 1、 最も好ましくは 1 ： 1である。 反応温度は、 0〜5 0 °C、 好ましくは 2 2— 2 7 °Cで、 反応時間は 5分〜 2 4時間、 好ましくは 1〜2 時間である。 反応温度は各々の融点以上沸点以下の温度で行うことができる。 カツプリング反応後、 反応液を生体高分子化合物を溶解した溶液に加え反応さ せると、 例えば生体高分子化合物が遊離のアミノ基を有する場合、 当該アミノ基 とペプチドのカルボキシル基の間に酸アミド結合が生成される。 反応温度は、 0 ~ 6 0 °C、 好ましくは 5〜4 CTC、 より好ましくは 2 2〜2 7 °Cで、 反応時間は 5分〜 2 4時間、 好ましくは 1〜1 6時間、 より好ましくは 1〜2時間である。 上記何れかの方法によリ得られた反応物を透析、 脱塩力ラム等によつて精製し て、 A p 0 E 4フラグメン卜ぺプチドと高分子化合物との結合体（以下、単に「結 合物 J ということがある J ) を得ることができる。
次に、 上記の様にして得られた結合物を抗原とし、 これを用いる抗体の作製方 法および当該抗体を用いる免疫化学測定法について説明する。 なお、 抗体の調製 にあたっては公知の方法、 例えば続生化学実験講座、 免疫生^学研究法 （日本生 化学会編） 等に記載の方法を適宜利用することができる。
上記結合体を使用して、 本発明の A p o E 4に特異的な抗体を作製するには、 当該結合体で動物を免疫し、 当該動物から抗体を採取すればよい。
すなわち、 まず例えば、 A p o E 4フラグメントペプチド—サイログロブリン 結合体等の結合体をリン酸ナトリウム緩衝液 （以下、 r P B S j という） に溶解 し、 これとフロイン卜完全アジュバン卜または不完全アジュバン卜、 あるいはミ ヨウバン等の補助剤と結合したものを、 免疫原として哺乳動物を免疫する。 免疫される動物としては当該分野で常用されたものをいずれも使用できるが、 例えば、 マウス、 ラッ卜、 ゥサギ、 ャギ、 ゥマ等を挙げることができる。 また、 免疫の際の免疫原の投与法は、 皮下注射、 腹腔内注射、 静脈内注射、 皮下注射、 筋肉内注射のいずれでもよいが、 皮下注射または腹腔内注射が好ましい。 免疫は 1回または適当な間隔で、 好ましくは 1週間ないし 5週間の間隔で複数回行うこ とができる。
次いで、 常法に従い、 免疫した動物から血液を採取し、 そこから分離した血清 を用い、 A p 0 E 4フラグメントペプチドに対する抗体を得ることができる。 また、 常法に従い、 前記結合体で動物を免疫して得た免疫細胞と、 ミエ口一マ 細胞とを融合させてハイプリドーマを得、 当該ハイプリドーマの培養物から抗体 を採取することによつても A p 0 E 4フラグメントペプチドに対する抗体を得る ことができる。
かくして得られた抗体は、 必要により標識することができる。 この標識物質と しては、 西洋わさびペル才キシダーゼ （以下 「H R P」 と言う）、 アルカリフ才 スファタ一ゼ等の酵素、 フル才レセインイソシァネー卜、 ローダミン等の蛍光物 質、 3 2 P、 1 2 5 I等の放射性物質、 化学発光物質などが挙げられる。
また逆に、 上記と同様に、 A p 0 E 4フラグメントべプチドに上記標識物質を 結合させたものを、 免疫化学的測定法において使用することができる。 本発明のアルツハイマー危険因子の検出試薬 （以下、 「本発明試薬」 という） は、 上記抗体と担体とを組み合わせることにより調製される。 このような担体と しては、 例えば、 ガラスチューブ、 ポリスチレンビーズ、 マイクロタイタープレ 一卜、 メンブレン等が挙げられる。 なお、 本発明試薬は、 液状であっても、 また 用時に水を加えて液状物となし得る凍結乾燥物であっても良い。
一方、 本発明試薬によリアルツハイマー危険因子を検出すべき検体としては、 種々の体液、 例えば、 全血液、 血清、 血漿等が挙げられる。 この検体は、 必要に より適宜希釈してから使用することができ、 この希釈にはリン酸、 炭酸、 卜リス 等を含有する緩衝液や、 生理食塩水等を使用することができる。 検体希釈の具体 例としては、 全血液の場合、 5 1倍希釈 （全血液 1 Iに対し、 希釈用緩衝液 を 500^ 1加える）、 血清または血漿の場合 0 1倍希靳 （血清または血漿 1 0 n Iに対し、 希釈用緩衝液を 1 000 μ I加える） が挙げられる。
本願発明によるアルツハイマー危険因子の検出方法 （以下、 「本発明方法 J と いう） は、 本発明試薬を検体中に加え、 本発明試薬中の抗体の抗原抗体反応を検 出することによリ行われる。 本発明方法における抗原抗体反応の検出方法として は、 例えば、 R I A法 （放射性同位元素免疫測定方法）、 E L I SA法 （E n g V a I I， E , Me t h o d s i n E n z y m o I , 70， 4 1 9— 443 9 (1 980))、 免疫比濁法、 蛍光抗体法、 プラーク法、 スポート法、 凝集法、 才クタロニー等、一般に使用する方法（「ハイプリドーマとモノクローナル抗体」、 株式会社 R& Dプランニング発行、 第 30頁一第 53頁、 昭和 57年 3月 5日） を利用することができる。
本発明方法をより有利に実施するための方法としては、 2種の抗体により、 検 出すべき A p 0 E 4を挟み込む、いわゆるサンドイッチ法を挙げることができる。 この方法において使用する一方の抗体としては、 上で説明した A p 0 E4に特異 的な抗体が利用され、 他方の抗体としては、 A p o E 2、 A p 0 E 3および A p o E 4の全てに対する抗体が挙げられる。 本発明において使用される A p 0 E 2、 A p 0 E 3および A p o E 4の全てに 対する抗体とは、 Ap o E 2、 A p o E 3および A p o E 4の何れをも特異的に 認識できる抗体であれば特に限定されないが、 上述した A p o E 2、 Ap o E 3 および A p o E 4の遺伝子配列よリ、 これらの全てに共通する配列に対応するタ ンパク貿を合成し、 それに対する抗体を作製すればよい。 例えば、 A p o E 2、 A p 0 E 3および A p o E 4の共通アミノ酸配列の 28 1番から 299番である EKVQAAVGTSAA PV P S DNH (配列番号 3 ) の N末端側にシスティ ン （C) を結合した CE KVQAAVGTSAA PVP S DNH (配列番号 4) のアミノ酸配列を持つ合成ペプチドを人工合成し、 上述した A p 0 E 4に対する 抗体と同様に作製すればよい。
A p 0 E 4の検出について、 サンドイッチ法を例にとってその手順を説明すれ ぱ次の通りである。 すなわち、 まず （a) Ap o E 2、 0 0 £ 3ぉょび 0 E 4の全てに対する抗体を、 担体に固相化し、 次いで （b) 抗体が固相化されて いない担体表面を抗原と無関係な、 例えば BSAにより、 ブロッキングする。 更 に、 （c) これに A p 0 Eを含む検体を希釈した試料を加え、 A p o E—抗体複 合体を生成させた後、 （d) 標識酵素を結合した A p 0 E 4に特異的な抗体を加 え、 Ap 0 E—固相化抗体複合体と結合させ、 最後に （e) 標識酵素の発色量等 を測定することにより、 予め作成した検量線から試料中の A p o E 4の量を決定 することができる。
まず、 （a) 工程において、 抗体を固相化する担体としては、 特別な制限はな く、 E L I S A法において常用されるものをいずれも使用することができる。 例 ぇぱ、 ポリスチレン製の 96穴マイクロタイタープレー卜あるいは、 アミノ基結 合型のマイクロタイタープレー卜が挙げられる。 抗体を固相化させるには、 例え ば、 抗体を含む緩衝液を担体上に加え、 インキュベーションすればよい。 緩衝液 としては公知のものが使用でき、例えば 1 OmMの P B Sを挙げることができる。 緩衝液中の抗体の濃度は広い範囲から選択できるが、 通常 0.0 1 — 1 00 g /m I程度、 好ましくは 0. 1 — 2 O g/m Iが適している。 また、 担体とし て 96ゥエルのマイクロタイタ一プレー卜を使用する場合には、 30 Ομ I /ゥ エル以下で、 好ましくは 2 0— 1 5 Ο I /ゥエルが適している。 更に、 インキ ュベーシヨンの条件にも特に制限はないが、 通常 4 °C程度で一晩のインキュべ一 ションが適している。
また、 （b) 工程のブロッキングは、 抗体を固相化した担体において、 後に添 加する試料中の A p 0 Eが抗原抗体反応とは無関係に吸着される部分が存在する 場合があるので、 それを防ぐ目的で行う。 ブロッキング剤としては、 例えば、 B S Aやスキムミルク溶液のほかに、 ブロックエース （大日本製薬社製：コード N 0. U K- 25 B) 等のブロッキング剤として市販されているものを使用するこ とができる。 具体的なブロッキング方法としては、 抗原を固相化した部分に 1 % B S A溶液を適量加え、 4 °Cで一晩インキュベートした後、 緩衝液で洗浄する方 法が挙げられる。 この方法で用いられる緩衝液としては、 0.05% (v/v) Twe e n— 20および 0.05%N a N3を含む 5 OmMの P B S (p H 7.2) が好ましい。
次いで （c) 工程において、 A p o Eを含む試料を固相化抗体と接触させ、 固 相化抗体で A p 0 Eを補足し、 A p 0 E—固相化抗体複合体を生成させる。 反応 は限定されるわけではないが、 37 °C程度で約 1時間行えばよい。 反応終了後、 緩衝液で担体を洗浄し、 未反応の蛋白質等を除去させることが好ましい。 この反 応に用いる緩衝液としては、 0.05% (v/v) Twe e n 20を含む 1 Om Mの P BS (p H 7.2) が好ましい。
更に （d) 工程において、 固相化抗体に補足された A p o Eに、 標識物質で標 識した A p o E4に特異的な抗体を加え、 固相化抗体— A p 0 E—標識物質で標 識した A p 0 E 4に特異的な抗体の複合体を形成させる。 この反応終了後、 緩衝 液で担体を洗浄し、 未反応のタンパク質等を除去させることが好ましい。 この反 応に用いる緩衝液としては、 前記したものが使用される。 また、 標識物質で標識 した A p o E 4に特異的な抗体は、 担体に結合した固相化抗体に対して約 500 0- 1 0000倍、 好ましくは最終吸光度が 1 .0— 1 .5となるように希釈して 反応させるのが望ましい。 希釈には緩衝液を用いることができる。 以上の反応に より、 標識物質で標識した A p o E4に特異的な抗体が、 固相化抗体に補足され た A p 0 Eのうちの A 0 E 4のみに結合することができる。 この複合体の標識 物質を検出することにより Ap 0 E 4を検出することができる。
上記 （d) 工程において使用される標識物質としては HR P、 アルカリフォス ファターゼ等の酵素、フル才レセインイソシァネー卜、ローダミン等の蛍光物質、 32 P、 125 I等の放射性物質、 化学発光物質などが挙げられる。 例えば、 酵素と してペル才キシダーゼを使用する場合には、 過酸化水素と 3 , 3 '， 5， 5 '—テト ラメチルベンジン (以下、 「TMBJ という） 又は 0—フエ二レンジァミン （以 下、 rOPDj という） を含む発色基質溶液を使用することができる。 発色反応 は限定されるわけではないが、 発色基質溶液を加え約 25 °Cで約 20分間反応さ せた後、 2 Nの硫酸を加えることによリ酵素反応を停止させる。 OPDを使用す る場合には 492 nmの吸光度を測定し、 T M Bを使用する場合には 450 n m の吸光度を測定する。 一方、 第二抗体に結合する酵素としてアルカリホスファタ ーゼを使用する場合には、 p—二卜口フエニルリン酸を基質として発色させ、 2 Nの N aOHを加えて酵素反応を止め、 4 1 5 n mでの吸光度を測定する方法が 適している。
既知の濃度の A p 0 E 4を添加した反応液の吸光度により予め作成しておいた 検量線を用いて、 試料中の A p 0 E4の濃度を算出できる。
また、 本発明によれば、 上記検出方法において A p o E4ホモ遺伝子型と A p 0 E 4ヘテロ遺伝子型とを判別しうる標準液 1 (以下、単に「標準液 1」という） と、 A p 0 E 4ヘテロ遺伝子型と A p 0 E 4以外の遺伝子型とを判別しうる標準 液 2 (以下、 単に 「標準液 2 J という） を用いることにより、 試料中の A p o E の遺伝子型を判別することができる。 この標準液 1の濃度は、 種々の体液、 例えば、 全血液、 血清、 血漿等の検体中 に含まれる A p 0 E 4の濃度から決められるものであり、 検体中に含まれる A p 0 Eがすべて A p 0 E 4である （A p 0 E 4 / E 4のホモ遺伝子型を有する） 被 検者の A p 0 E 4の最小濃度と、 A p o E4と Ap o E 3または A p o E 4と A P o E 2である （A p o E 4ヘテロ遺伝子型を有する） 被検者の A p o E 4の最 高濃度との間の A p 0 E 4の濃度である。
一方、 標準液 2の濃度も検体中に含まれる A p 0 E 4の濃度から決められるも のであり、 検体中に含まれる A p 0 Eが、 A p o E 4と Α ρ ο Ε 3または A p o E 2と A p o E 4である （A p o E 4ヘテロ遺伝子型を有する） 被検者の A p o E 4の最小濃度と、 すべて A p o E 3、 すべて A p 0 E 2また A p 0 E 3と A p o E 2である （A p 0 E4以外の遺伝子型を有する） 被検者の A p o E4の最高 濃度との間の A p 0 E 4の濃度である。
具体的に検体として全血液を用いる場合には、 標準液〗および標準液 2は A p 0 E 4の濃度がそれぞれ 1 - 2 Mg/m Iおよび 0.24 g/m Iである溶液を 測定の際に用いる全血液と同様の希釈倍率に希釈したものとなる。
より具体的に A p 0 Eの遺伝子型は、 標準液 1の吸光度を Aとし、 標準液 2の 吸光度を Bとし、 試料中の A p 0 E4の吸光度を Cとすると、 以下のように判別 することができる。
A<Cの場合 ： A p 0 E 4/ E 4のホモ遺伝子型を有する。
B<C<Aの場合 ： A p 0 E 4ヘテロ遺伝子型を有する （A p o E4ZE 3
または A p 0 E4/E 2遺伝子型）。
C<Bの場合 ： A p 0 E 4以外の遺伝子型を有する（A p 0 E 3/E 3、
A p 0 E 3 ZE 2または A p o E 2 /E 2遺伝子型）。 なお、 当然のことながら、 これらの測定の際には試薬ブランクによる測定が行 われ、 吸光度の補正が行われてもよい。
なお、 本発明方法を容易に実施するために、 アルツハイマー危険因子の検出キ ッ卜を利用することができる。 この検出キッ卜は例えば次の組み合わせよりなる ものである。
次の試薬 （a) および （b) の組み合わせ
(a) A p 0 E 4に対する抗体を含む試薬
(b) Ap o E 2、 A p o E 3および A p o 4の全てに対する抗体を含む試薬 次の試薬 （c) および （d) の組み合わせ
(c) 標識された、 A p 0 E 4に対する抗体を含む試薬
(d) 固相化された、 A p o E 2、 A p 0 E 3および A p 0 E 4の全てに対す る抗体を含む試薬
更に、 上記検出キットに次の試薬 （e) および （f ) の組合わせ
(e) Ap 0 E 4ホモ遺伝子型と A p o E 4ヘテロ遺伝子型とを判別しうる 標準液 1
(f ) Ap 0 E 4ヘテロ遺伝子型と Ap o E 4以外の遺伝子型とを判別しうる 標準液 2
本発明検出試薬、 本発明方法および本発明キットによれば、 検体中の Ap o E 4を正確に、 かつ簡易に検出することが可能となる。 そして、 検体中の A p o E 4の存在およびその量は、 生体が A p 0 E 4遺伝子を保有することを示し、 ひい てはアルツハイマー症になる可能性が高いこと、 すなわちアルツハイマーの危険 因子を保有することを示すことになるものである。 実施例
以下、 実施例をあげて本発明を更に詳細に説明するが、 何らこれらに制約を受 けるものではない。 実 施例 1
A p 0 E 4を特異的に認識する抗体の調製： A p o E 4を特異的に認識する抗体は、 Ap 0 E4のアミノ酸配列の 1 06番 から 1 1 6番の N末端側にシスティン （C) を結合した C A DM E D V R G R L V (配列番号 2) のアミノ酸配列を持つ合成ペプチド （以下、 ΓΑ ρ ο Ε4フラ グメン卜ペプチド」 という） を用い、 次のようにして調製した。
( 1 ) 免疫用抗原の作製
免疫原となる A p 0 E 4フラグメントペプチド （S y n p e p社製） とサイロ グロブリンとの結合体は EMC S (N— (6— Ma i e i m i d o c a r o y l o x y) -s u c c i n i m i d e) 法で作製した。 結合体を作製するにあた リ、 サイログロプリンと Ap 0 E 4フラグメントペプチドと EMCSのモル比を それぞれ 1 : 300 : 400とした。 まず、 サイログロブリン 5 mgを 0.01 Mのリン酸緩衝液 （p H 7.0) 1 m Iに溶解し、 これにジメチルホルムアミド で溶解した EMCS 8 O g/ Iを上述モル相当量加え、 サイログロブリン— EMCS複合体を作製した。 この複合体を含む溶液に、 Ap o E 4フラグメント ペプチド 4mgを約 1 m Iの蒸留水に溶解した溶液を上述モル相当量加えること により、 EMCSで架橋された A p 0 E 4フラグメントペプチドとサイログロブ リンとの結合体を作製した。 次いでこれを P B Sを用いて透析し、 1.0 S/ μ Iになるように濃度を調整して、 免疫用抗原とした。
(2) 免疫感作
上記（1 )で得られた免疫用抗原についてゥサギおよびマウスに免疫を行った。 ゥサギは 1週間、 または 2週間おきに 1 00 I (1 00 g) 免疫した。 マウ スは 1週間おきに 50 μ 1 (50 tg) 免疫した。 抗原はゥサギおよびマウスと も初回免疫のみにフロイン卜完全ァジュバン卜と混和し、 2回目からはフロイン 卜不完全アジュバン卜と混和した。 ゥサギは 8回免疫後、 マウスは 4回免疫後採 血を行い、 血清を分離しこれを抗血清とした。
(3) スクリーニング用抗原の作製
Ap o E4フラグメントペプチド （S y n p e p社製） を蒸留水で溶解したも のをスクリーニング用 Ap o E4フラグメントペプチド抗原とした。 また、 A p o E 2、 Ap o E 3および A p o E4 (和光純薬工業社製） を蒸留水で溶解した ものをスクリーニング用 A p 0 E抗原とした。 さらに、 Ap o E 4 (和光純薬ェ 業社製） は実施例 3においても標準液として使用した。
(4) 抗血清の A p 0 E 4フラグメントペプチドに対する反応性
上記 （3) で調製したスクリーニング用 Ap 0 E 4フラグメントペプチド抗原 を用いて EL I SA法にょリ、 上記 （2) で調製した抗血清の反応性を調べた。 まず、 上記 （3) で調製したスクリーニング用 Ap 0 E 4フラグメントペプチド を 1. O tg/m Iになるように 0.1 M炭酸バッファー（p H 9.5) に希釈し、 50 Iずつ 96ゥエルプレー卜に固相した。 P B Sにて洗浄し、 次いで、 0. 1 %B S A/P B S/0.05 %N a N3溶液でブロッキングした後、 抗血清の 1 00倍希釈液を順次 2倍倍希釈し、 50 Iゥエルに入れ、 37°Cで 30分反応 させた。 反応終了後、 0.05 %Twe e n 20— P B Sにて 4回洗浄後、 ゥサ ギ抗血清には H P標識抗ゥサギ I g G ( I B L社製） を、 マウス抗血清には H R P標識抗マウス I g G ( I B L社製） を 50 ずつ各ゥエルに添加し、 37°C で 30分反応させた。 反応終了後、 0.4mg/m I になるようにオル卜フエ二 レンジァミン （O PD) を 0.03 %過酸化水素水を含む 0.05 Mリン酸クェン 酸緩衝液 （ p H 4 · 5 ) に溶解し、 各 1 00 Iずつ各ゥエルに入れ、 室温で 1 5分間遮光状態で放置し、 発色させた。 発色後、 1 N硫酸〗 0 O Iを各ゥエル に添カ卩し、 反応を停止させ、 490 n mの吸光度を測定して、 抗血清の A p o E 4フラグメン卜ぺプチドに対する反応性を確認した。
( 5 ) 抗血清の A p 0 Eに対する反応性
上記 （3) で調製したスクリーニング用 A p 0 E抗原を用いてウェスタンプロ ッ卜法にて抗血清の反応性を調べた。 まず上記抗原を 1 2%アクリルアミドゲル にアプライし、 2 OmAにて電気泳動を行った。 このゲルをメンプレンにプロッ 卜後、 3%スキムミルク 1 %B S A/P B S/0.05%N a N3でブロッキン グを 37 °Cで 2時間行つた。 0.05%Twe e n 20— P BSにて洗浄後、 各 抗血清を 0.1 %Twe e n 20— P BSで 200倍に希釈し、 4 °Cで一晚反応 させた。 反応終了後、 0.05%Twe e n 20— P BSにて洗浄後、 ゥサギ抗 血清には H R P標識抗ゥサギ I g Gを、 マウス抗血清には H R P標識抗マウス I g Gを添加し、 37 で 1時間反応させた。 反応終了後、 0.05%Twe e n 20 - P B Sにて洗浄し、 ECL (Ame r s h am P h a rma c i a B i o t e c h社製） にて発光させ、 X線フイルムに感光させた。 これにより、 抗血 清と A p 0 E 4との反応性を確認した。
(6) 八イブリドーマ細胞の作製
上記 （5) で抗血清の力価、 A po E4との反応性を確認したマウスについて モノクローナル抗体の作製を行った。 まず、 血清中の抗 A p 0 E4フラグメント ぺプチド抗体の活性が高くなつたマウスの脾臓細胞とマウスミエ口一マ細胞 （ X 63— Ag 8) とを P E G法にて細胞融合を行った。 細胞増殖が認められた培養 上清液について以下の方法で A p 0 E 4フラグメントべプチドに対する抗体活性 を調べた。 上記 （3) で調製したスクリーニング用 A p 0 E抗原を用いて E L I S A法により、 培養上清液の反応性を調べた。 まず、 上記 （3) で調製したスク リーニング用 A p 0 E抗原を 1.0 g/m Iになるように 0.1 M炭酸バッファ - (p H 9.5) に希釈し、 50 I /ゥエルにて 96プレー卜に固相した。 P B Sにて洗浄、 0. l ^BSAZPBSZO. O S^NaN 3溶液でブロッキング した後、培養液を 50 n I /ゥエルに入れ、 4 °Cで一晩反応させた。反応終了後、 0.05 %Tw e e n 20 - P B Sにて 4回洗浄後、 H R P標識抗マウス I g G を 50 Iずつ各ゥエルに添加し、 37°Cで 30分反応させた。反応終了後、 0. 4mg/m I になるように OPDを 0.03 %過酸化水素水を含む 0.05Mリン 酸クェン酸緩衝液 （p H 4.5) に溶解し、 1 00 t Iずつ各ゥエルに入れ、 室 温で 1 5分間遮光状態で放置し、 発色させた。 発色後、 1 N硫酸 1 0 Iを各 ゥエルに加え、 反応を停止させ 490 nmの吸光度を測定した。 この中で、 特異 性のある抗体活性が認められたゥエルを選抜した。 次に選抜されたゥエルの細胞 について限界希釈法を用いた細胞クローニングを行った。 その結果 A p 0 E 4に 特異的に反応する抗 A p o E 4フラグメントペプチド抗体を産生するハイプリド 一マ細胞株をクローン化した。
(7) 抗 A p o E4フラグメントペプチド抗体と HR Pとの結合体作製 抗 A p 0 E 4フラグメントぺプチド抗体と H R Pとの結合体の作製は以下の手 順に従った。 上記のようにして産生された抗 A p 0 E 4フラグメントペプチド抗 体 20 m gをペプシン消化し、 ゲル濾過することによリ抗 A p 0 E 4フラグメン 卜ペプチド抗体の F (a b') 2フラグメントを精製し、 2—メルカプトエタノー ルを用いることによリ F (a b') 2フラグメントを F a b' フラグメントに還元 した。 HR Pと EMCSとを 37°Cで 60分反応させ、 ゲル濾過することにより HR P— EMCS結合体を作製し、 この結合体と F a b' フラグメントとを 4 °C で一晚反応させ、 ゲル濾過することにより EMCS架橋による抗 A p 0 E4フラ グメントペプチド抗体と H R Pとの結合体を作製した。 実施例 2
Ap o E 2、 A p 0 E 3および A p o E 4の全てに対する抗体の調製： A p o E 2、 A p 0 E 3および A p o E 4の全てに対する抗体は、 これらの共 通アミノ酸配列である 28 1番から 299番の N末端側にシスティン （C) を結 合した CEKVQAAVGTSAAPV P S DNH (配列番号 4) のアミノ酸配 列を持つ合成ペプチドを用い、 実施例 1と同様に作製した。
実施例〗および実施例 2で作製した抗体の特異性を図 1に示す。 図 1から明ら かなように実施例 1で作製した抗体は A p 0 E 4のみと反応性を示し、 実施例 2 で作製した抗体は A p o E 2、 A p o E 3および A p o E 4の全てと反応性を示 した。 実 施例 3
サンドイッチ E L I S A法の構築と A p o E 4の測定：
サンドイッチ E L I SA法の構築は以下のように作製した。 1 O tg/m lの 実施例 2で作製した A p 0 E 2、 E 3および E 4の全てに対し特異的に反応する 抗体を〗 00 Iずつ 96ゥエル E L I S A用プレー卜に加えた。 4 °Cで一晚反 応させた後、 1.0% B S A/P B S/N a N3溶液にてブロッキングを行い、 こ れをサンドイッチ EL I S A用プレートとした。 実施例 1の （7) で作製した、 抗 Ap 0 E 4フラグメントペプチド抗体と HR Pとの結合体を標識抗体とした。
Ap 0 E 4との反応性の測定は以下のように行った。 サンドイッチ E L I SA用 プレートに実施例 1の （3) で調製した標準液を 1 00 I加え、 37°0で1時 間反応させた。 反応後、 0.05%Twe e n 20- P B Sで 4回洗浄、 標識抗 体を 1 00A I加え、 37 °Cで 30分反応させた。 反応後、 005%Twe e n 20— P BSで 6回洗浄し、 T M B溶液を 1 00 i加え、 室温、 遮光下で 30 分放置した。 1 N硫酸で反応を止め、 450 nmの吸光度を測定した。その結果、 Ap 0 E 4を特異的に測定でき、 検量線を作成することができた。 実施例 4
酵素免疫測定試験：
( 1 ) 検体
ポランティアの全血液の 35検体を対象とした。 全血液 1 Iに対し、 1 % の B S Αおよび 0.05%の Twe e n 20を含有するリン酸緩衝溶液を 500 μ I加えて 5 1倍希釈したものを検体とした。
(2) 免疫反応
実施例 3で作製したサンドイッチ EL I S Α用プレー卜の各ゥエル中に、 上記 (1 ) で作製した検体を 1 0 I加え、 プレー卜カバ一をして 37°Cで 1時間 反応させた。 1時間経過後、 0. 05 %の Twe e n 20を含有するリン酸緩衝溶液からな る洗浄液で、 7回洗浄した。 推奨する洗浄方法は、 プレー卜の各ゥエルを洗浄ビ ンに入れた洗浄液を用いて勢い良く洗い流しその後、 洗浄液をゥエルに満たし 1 5〜 30秒間静置しプレー卜を逆さまにして振リ払い洗浄液を完全に除去する方 法である。 この洗浄操作を規定回数以上行い、 ペーパータオル等の上でたたいて ゥエルの水分を完全に除去する。 プレー卜ウォッシャーによる洗浄は、 機種によ リ洗浄が不十分な場合があるので洗浄後、 さらに上記洗浄方法による洗浄を 3回 程度おこなう。
次いで、 実施例 1で得られた、 H R Pで標識された A p 0 E 4を特異的に認識 する抗体を 1 00 I添加し、 プレートカバーをして 3 7°Cにて 30分間反応さ せた。 3 0分間経過後、 前述したのと同様の方法で洗浄を 9回行った。
さらに、 精製水 5 m Iと 0. 0 1 %の過酸化水素を含有する緩衝溶液 5m I と を混合して得られる基質用緩衝液に、 1 mgの TM B (3， 3'， 5， 5'—テ卜ラ メチルベンジジン タブレツ卜；シグマ社製） タブレツ卜の 2錠を溶解したもの を TMB基質液とし、 その T MB基質液をゥエルに Ο Ο μ, I添加し、 遮光をし て室温で 30分間反応させた。 ΤΜΒ基質液添加後、 反応液は徐々に青色に変わ る。 更に 1 Ν硫酸からなる停止液をゥエルに 1 00 t I添加し、 プレー卜の側面 を軽くたたいて均一になるように混和する。 停止液添加後、 反応液は青色から黄 色に変化する。
前記と同様の操作を検体のかわりに A p 0 E 4ホモ遺伝子型と A p 0 E 4へテ 口遺伝子型とを判別しうる標準液 1 (A p 0 E 4 (和光純薬工業製） を 1 .2 g/m I に濃度調整したものを精製水で 5 1倍希釈したもの：以下、「標準液 1 j という）、 A p 0 E 4ヘテロ遺伝子型と A p 0 E 4以外の遺伝子型とを判別しう る標準液 2 (A p 0 E 4 (和光純薬工業製） を 0. 2 4 gZm Iに調整したも のを精製水で 5 1倍希釈したもの：以下、 「標準液 2」 という） および試薬ブラ ンクに変えたものについて、 1つの検体用プレートで同時に行った。 また、 検体 用プレー卜と同様の操作を検体ブランク用プレー卜についても行った。
(3) 吸光度測定
(2) の抗体反応を行った後、 プレー卜底面のよごれや水滴を拭き取り液面に 気泡か'ないことを確認して、 30分以内に試薬ブランクを対照として検体、 標準 液 1および標準液 2の波長 450 nmにおける吸光度を測定する。 同様に検体ブ ランク用プレー卜についても測定を行う。
測定した吸光度を以下のように定義する。
検体用プレー卜
検体の吸光度 = Aとする。
標準液〗の吸光度- Bとする。
標準液 2の吸光度- Cとする。
検体ブランク用プレー卜
検体ブランクの吸光度 =Dとする。
標準液 1の吸光度- Eとする。
標準液 2の吸光度 =Fとする。
(4) 吸光度の補正方法
検体用プレー卜の吸光度から検体ブランク用プレー卜で得られた吸光度を各々 引いた値を補正後の吸光度とする。
(A) 検体の吸光度- A— D = Sとする
(B) 標準液 1の吸光度 =B— E = C 1とする
(C) 標準液 2の吸光度 =C— F = C 2とする
(5) 吸光度の判定方法
上記のように補正された吸光度を表 2に示す判定基準により遺伝子型を判定し た。 表 2
Figure imgf000024_0001
(6) 結果
上記のようにして得られた吸光度と P C R法による遺伝子型の判定結果との関 係を図 2に、 吸光度より判定した遺伝子型の結果と PC R法による遺伝子型の判 定結果を表 3に示す。
なお、 PC R法による遺伝子型の判定は、 ヒクソンらの方法 （H i x s o n J E a n d Ve r n i e r DT， J . L i p i d. Re s. 1 990， M a r , 31 (3) : 545— 8) に準じて行われた。
表 3
Figure imgf000025_0001
また、 本発明の検出方法と P C R法との一致率 （n = 3 5 ) を下記表 4に示し た < 表 4
Figure imgf000026_0001
図 2、 表 4および表 5から明らかなように本発明方法によれば、 P C R法によ る遺伝子型の判定結果と全く同一の判定結果が得られた。 産業上の利用可能性
本発明によれば、 従来より病院などの検査室で汎用されている自動比色装置が そのまま使用可能であり、 特別な装置を必要としないので、 従来の P C R法に比 べきわめて安価にァルツハイマー危険因子を検出することができる。
また遺伝子検査では遺伝子を持つ細胞 （白血球など） が必須であるが、 本発明 では試料としての検体は、 全血液または血清および血漿が使用可能であるので血 清 ·血漿など適応範囲が広がるものである。
従って本発明は、 現行において確定検査とされる A p 0 E遺伝子検査の前に大 量の検体を測定するスクリ一二ングの検査として、 きわめて有効なものである。

Claims

請求の範囲
1. アポリポプロテイン E 4に特異的な抗体を有効成分として含有するァルツ ハイマー危険因子の検出試薬。
2. ァポリポプロティン E 4に特異的な抗体が、 ADMEDV RG R LV (配 列番号 1 ) で表されるペプチド配列を有するポリペプチドを認識する抗体である 請求項第 1項記載のアルツハイマー危険因子の検出試薬。
3. 次の試薬 （a) および （b) を含有するアルツハイマー危険因子の検出キ ッ卜。
( a ) アポリポプ口ティン E 4に特異的な抗体を含む試薬
(b) アポリポプロテイン E2、 アポリポプロテイン E 3およびアポリポプロ ティン E 4の全てに対する抗体を含む試薬
4. 次の試薬 （c) および （d) を含有するアルツハイマー危険因子の検出キ ッ卜。
(c) 標識された、 アポリポプロテイン E 4に特異的な抗体を含む試薬
(d) 固相化された、 アポリポプロテイン E 2、 アポリポプロテイン E 3およ びアポリポプロティン E 4の全てに対する抗体を含む試薬
5. アポリポプロテイン E 4に特異的な抗体が、 ADMEDVRGR LV (配 列番号 1 ) で表されるペプチド配列を有するポリペプチドを認識する抗体である 請求項第 3項または第 4項記載のアルツハイマー危険因子の検出キッ卜。
6. アポリポプロテイン E 2、 アポリポプロテイン E 3およびアポリポプロテ イン E 4の全てに対する抗体が、 EKVQAAVGTSAA PV PSDNH (配 列番号 3 ) で表されるぺプチド配列を有するポリぺプチドを認識する抗体である 請求項第 3項または第 4項記載のアルツハイマー危険因子の検出キッ卜。
7. 更に、 次の試薬 （e) および （f ) を含有する請求項第 3項または第 4項 記載のアルツハイマー危険因子の検出キッ卜。
( e ) A p 0 E 4ホモ遺伝子型と A p o E4ヘテロ遺伝子型とを判別しうる 標準液 1
( f ) A p o E 4ヘテロ遺伝子型と A p o E 4以外の遺伝子型とを判別しうる 標準液 2
8. 検体とアポリポプロテイン E 4に特異的な抗体を反応させ、 検体中のアポ リポプロテイン E 4アレル型を検出することを特徴とするアルツハイマー危険因 子の検出方法。
9. 検体を、 アポリポプロテイン E 2、 アポリポプロテイン E 3およびァポリ ポプ口ティン E 4の全てに対する抗体と反応させ、 次いで得られた複合体にアポ プロテイン E 4に特異的な抗体を反応させ、 検体中のアポリポプロティン E 4ァ レル型を検出することを特徴とするアルツハイマー危険因子の検出方法。
1 0. 検体が全血液、 血清または血漿である請求項第 8項または第 9項記載の アルツハイマー危険因子の検出方法。
1 1. アポリポプロテイン E 2、 アポリポプロテイン E 3およびアポリポプロ ティン E 4の全てに対する抗体が固相化されたものであり、 アポリポプロテイン E 4に特異的な抗体が標識されたものである請求項第 9項記載のアルツハイマー 危険因子の検出方法。
1 2 . A p 0 E 4ホモ遺伝子型と A p o E 4ヘテロ遺伝子型とを判別しうる標 準液 1の吸光度と、 A p 0 E 4ヘテロ遺伝子型と A p 0 E 4以外の遺伝子型とを 判別しうる標準液 2の吸光度を指標に、 検体中のアポリポプロティンの遺伝子型 を判別することを特徴とするアポリポプロティン Eの遺伝子型判別方法。
1 3 . 請求項第 7項記載のアルツハイマー危険因子の検出キッ卜を用いて検体 中のアポリポプロティン Eの遺伝子型を判別することを特徴とするアポリポプ口 ティンの遺伝子型判別方法。
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