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WO2003031381A2 - Synthese du (z) -3, 5, 4' trimethoxystilbene et son utilisation - Google Patents

Synthese du (z) -3, 5, 4' trimethoxystilbene et son utilisation Download PDF

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WO2003031381A2
WO2003031381A2 PCT/FR2002/003492 FR0203492W WO03031381A2 WO 2003031381 A2 WO2003031381 A2 WO 2003031381A2 FR 0203492 W FR0203492 W FR 0203492W WO 03031381 A2 WO03031381 A2 WO 03031381A2
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cells
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medicament
trimethoxystilbene
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PCT/FR2002/003492
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Francis Raul
Yann Schneider
Raymond Brouillard
André FOUGEROUSSE
Philippe Chabert
Emmanuel Gonzalez
Original Assignee
Universite Louis Pasteur
Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale
Centre National De La Recherche Scientifique
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Publication date
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Definitions

  • the present invention relates to the field of organic chemistry and more particularly that related to the synthesis of new molecules capable of exhibiting biological properties, in particular therapeutic and more particularly properties in the field of prevention or treatment of certain diseases such as in particular diseases of the “cancer” type.
  • compound R3 a new process for the chemical synthesis of (Z) -3,5,4'-trimethoxystilbene (hereinafter referred to as compound R3), the compound R3 capable of being obtained by said process, various uses of the compound synthesized (in particular as a medicament), in particular as a synthetic anticancer agent at low cost price, a medicament having said compound R3 as an active principle as well as a cosmetic composition.
  • Compound R3 is a derivative of resveratrol, a natural polyphenol found in the plant world.
  • the present invention provides a new synthesis of a molecule derived from resveratrol, namely, (Z) -3,5,4'- trimethoxystilbene, of formula I:
  • compound R3 hereinafter designated as compound R3, in fact corresponding to the tri-methylated derivative of resveratrol.
  • Compound R3 has been tested for its possible anticarcinogenic properties. Biological studies have unexpectedly and surprisingly demonstrated that the compound R3 exhibits great stability and a remarkable anticancer action which turns out to be much superior (of the order of 100 times greater) than that of resveratrol.
  • the subject of the present invention is a process for synthesizing the compound according to the invention, characterized in that it essentially consists in exposing a sample of (E) -3,5,4'-trimethoxystilbene isomer dissolved in a solvent suitable for ultraviolet light with a wavelength culminating between 200 nm and 400 nm, this for an exposure time of between one hour and two hours for a quantity of (E) isomer of 10 "2 mole and, the if necessary, evaporating said solvent in order to collect the desired isomer (Z)
  • the present invention also relates to the compound R3 capable of being obtained by the aforementioned process, the use of said compound R3 according to the invention as a medicament , especially for the preparation a drug for the treatment or prevention of a disease involving abnormal cell proliferation or growth, such as cancer.
  • the compound according to the invention is used for the preparation of a medicament intended to treat or prevent cystic fibrosis.
  • a subject of the present invention is also the use of the compound according to the invention as an agent for depolymerization of the microtubular network of living human or animal cells, as an agent for inhibiting the polyamine synthesis of living human or animal cancer cells, as an agent for blockage of the cell cycle, in particular of the cell cycle of living human or animal cancer cells, as an agent for the treatment or prevention of hyperproliferative pathologies, in particular inflammatory conditions, infectious and / or parasitic diseases such as malaria and as an agent photoprotective, in particular for protection against UV-A and / or UV-B rays.
  • the present invention further relates to a medicament characterized in that it comprises, as active principle, at least the compound R3 according to the invention.
  • the present invention also relates to a cosmetic composition with photoprotective property, characterized in that it comprises, as active principle, at least the compound according to the invention.
  • FIG. 1 represents an example of a synthetic diagram of the process according to the invention
  • FIG. 2 represents the growth curve of CaCo- 2 cells as a function of the concentration of compound R3 added (FIG. 2a) as well as the growth curve of IEC-6 cells as a function of the concentration of compound R3 added (FIG. 2b)
  • FIG. 3 illustrates the double labeling of CaCo-2 cells with Annexin-FITC (FIG. 3a) and propidium iodide (FIG. 3b) after treatment with the compound R3, FIG.
  • FIG. 4 represents an analysis of a cycle cell by flow cytometry of cancer cells treated with the compound R3 (FIG. 4a)
  • FIG. 4b represents the analysis of the cycle of FIG. 4a in the absence of treatment with the compound R3
  • FIG. 5 represents the activity of the ODC as a function of the duration of the treatment with the compound R3 (FIG. 5a) and the activity of the AdometDC (SAMDC) as a function of the duration of the treatment with the compound R3 (FIG. 5b)
  • FIG. 6 represents snapshots of the microtubular network of CaCo-2 cells under the influence of the compound R3 and two known compounds
  • FIG. 7 represents a competition curve between R3 and ligands labeled with tritium (vinblastine, colchicine) for their fixation on tubulin
  • Figure 8 shows histograms showing t the percentage of cells marked either by annexin V (apoptotic cells) or having a hyperdiploid character
  • FIG. 9 represents a histogram illustrating the "in vivo" effects of R3 on the development of tumors after subcutaneous implantation of human tumor cells in nu / nu athymic mice.
  • the process for synthesizing the compound according to the invention is characterized in that it essentially consists in exposing a sample of isomer (E) -3.5.4 ′ ⁇ trimethoxystilbene 5 dissolved in a solvent suitable for ultraviolet light with a wavelength peaking between 200 nm and 400 nm, this for an exposure time of between one hour and two hours for a quantity of (E) isomer of 10 " mole and, if applicable if necessary, evaporating said solvent in order to collect the desired isomer (Z).
  • the method according to the invention is characterized in that the culminating wavelength of the ultraviolet light chosen is preferably 254 nm.
  • the irradiation time is preferably one hour for 10 "2 mole of isomer (E).
  • the solvent used is preferably ethanol.
  • the isomer (E) is obtained by preparation of a 4-methoxybenzyl halide, transformation of said halide into phosphonate, in parallel, 3,5-dihydroxybenzoic acid is transformed into 3,5-dimethoxybenzoate of methyl 2, then into 3,5-dimethoxybenzyl alcohol 3, oxidation of said alcohol to the corresponding aldehyde and finally transformation of 3,5-dimethoxybenzaldehyde 4 into the (E) - 3,5,4'-trimethoxystilbene isomer 5 by reaction with said phosphonate .
  • the 4-methoxybenzyl halide is preferably 4-methoxybenzyl bromide 1.
  • 3,5-dimethoxybenzaldehyde 4 is obtained by adding, according to the Corey method, pyridinium dichromate to 3,5-dimethoxybenzyl alcohol 3.
  • the present invention also relates to the compound capable of being obtained by the process according to the invention, characterized in that it is (Z) -3,5,4'-trimethoxystilbene.
  • the dimethylformamide used in the context of the synthesis was distilled over a 0.4 nm molecular sieve and under reduced pressure.
  • the dichloromethane used for step 4 was dried over calcium hydride.
  • the 4-methoxybenzylic alcohol, the 3,5-dihydroxybenzoic acid and the triethylphosphite used below are products which are commercially available and which can be used as they are.
  • This method consists in adding in 20 minutes 15.8 g of pyridine to 20 g of chromium trioxide diluted in 20 ml of distilled water, taking care that the temperature does not exceed 20 ° C. After 15 minutes of vigorous stirring, 80 ml of acetone are added.
  • the solution obtained is stirred for one hour at room temperature and then another hour at 100 ° C. After cooling, the reaction mixture is stirred overnight, seized with water and extracted with ether. The organic phases are combined, washed with salt water, checked with litmus paper and finally dried over magnesium sulfate.
  • the crude product is purified by chromatography on silica 60 with a mixture of hexane and ethyl acetate (4: 1) as eluent (volume ratio). 7.85 g of a solid are obtained in the form of colorless needles. The yield is 83%.
  • Human colonic cancer cells of the CaCo 2 line and murine transformed cells of the IEC-6 line were treated 24 h after sowing with increasing concentrations of R3, ranging from 0.1 ⁇ M to 0.6 ⁇ M.
  • Figure 2 shows the cell growth curve
  • FIG. 2a CaCo-2 (FIG. 2a) as a function of the concentration of compound R3 added, while FIG. 2b shows the growth curve of IEC-6 cells as a function of the concentration of compound R3. Each point on these two curves represents the mean value ( ⁇ SEM) calculated from 8 samples.
  • the legend of Figure 2a also applies to Figure 2b.
  • cell suicide is also used.
  • Measuring the activity of intracellular enzymes released into the culture medium is a good indicator of cell lysis. Indeed, destruction of the cell membrane results in the release of the cytoplasmic content in the supernatant, and this in proportion to the number of cells destroyed.
  • Lactate dehydrogenase is a ubiquitous intracytoplasmic enzyme, and its appearance in the external environment is a prime indicator for evaluating the cytotoxicity of a product (Decker and Lohmann-Matthes 1988).
  • apoptosis is used to describe a particular mode of cell degeneration which, ultimately, results in cell death. It is an endogenous cellular process put in place as a last resort when an external or internal signal activates a metabolic pathway creating a significant dysfunction of the cell. Apoptosis is characterized by condensation and degradation of chromatin, reduction in cell volume and membrane deformation. One of the biochemical markers of apoptosis is a characteristic breakdown of DNA. Indeed, a DNA fragmentation is observed which results from the activation of an endonuclease selectively cleaving the DNA at sites located near the nucleosomal units. Mono- and oligonucleosomal fragments are thus generated. The detection of these fragments by electrophoresis on agarose gel is one of the most commonly used methods to qualify apoptosis.
  • Another biochemical marker that can characterize apoptosis is the translocation of phosphatidyl serine from the cytoplasmic surface of the membrane to the outside of the cell membrane.
  • the in vitro detection of this phenomenon can be visualized from the interaction between annexin V (a protein specifically binding phosphatidyl serine) and phosphatidyl serine.
  • Annexin V is labeled with a specific fluorochrome and detection is carried out by flow cytometry.
  • the cells were therefore treated with 0.3 and 1 ⁇ M of R3 for 24 hours, then the analysis of the link between annexin V and phosphatidyl serine was carried out by flow cytometry (cf. FIG. 3a of the figure). 3).
  • PI propidium iodide
  • Flow cytometry is defined as the precise study of isolated cells entrained by a liquid flow. It allows the qualitative and quantitative characterization of cells by determining the distribution and variation of the number of cells in each phase of the cell cycle, namely the phases Gi (preparation for entry into phase S), S (synthesis), G 2 (preparation for entering phase M) and M (mitosis). This characterization is based on the fact that the cell has, during its development, a variable DNA content. We will find 2n chromosomes in phase G], while for cells in phase G 2 the number of chromosomes present will be 4n. The intermediate values are those corresponding to the DNA synthesis phase, therefore to phase S of the cycle. In a cytometer, the channeled cells comparable to particles, cut the light beam of a laser and the signals which they emit in return are analyzed. These signals are a function of the amount of DNA present in the cell.
  • the CaCo-2 cells are treated with 0.3 ⁇ M of R3 over a period of 64 hours ( Figures 4a and 4b).
  • the distribution of cells in the different phases of the cell cycle was analyzed for sampling times of 16, 24, 40, 48 and 64 hours. Each curve represents the proportion of cells in the phase of the cycle concerned.
  • the legend of Figure 4a also applies to Figure 4b.
  • a blockage of cells in the G 2 / M phase is observable from 16 hours after treatment and is maintained approximately until 40 hours. During this period, an accumulation of cells blocked in the G2 / M phase is observed. It seems that beyond 24 hours, the compound R3 no longer makes it possible to completely maintain this blocking, this therefore results in a slight inflection of the curve. This phenomenon is not due to a possible reversibility of the product, but is probably associated with a slightly low concentration and which does not make it possible to affect all the cells in a pronounced way. This hypothesis is confirmed by the fact that the cells are again blocked. when 48 hours of fresh medium containing the R3 molecule is added.
  • Polyamines are ubiquitous compounds which can be considered as growth factors for the tumor cell.
  • ODC ornithine decarboxylase
  • AdoMetDC S-adenosylmethionine decarboxylase
  • FIGs 5a and 5b show the activities of the ODC and the
  • the compound R3 strongly inhibits the synthesis of polyamines (putrescine, spermidine and spermine) by the cancer cell which contributes to explain the powerful antiproliferative effects of this molecule.
  • the R3 molecule causes a blockage of the cell cycle in the G2 / M phase.
  • the passage of this phase is essential in cell division. Indeed, it is at this period of the cycle that the cell will be able to split and for this there is the play of key elements of the cytoskeleton.
  • the microtubular network represents one of these elements.
  • taxol by its anti-depolymerizing action freezes the microtubular network while nocodazole (photo bottom and left of Figure 6) significant disorganization of this network. It has been found that the compound R3 causes the same type of alterations as those which are observable when the cells are treated with nocodazole (photographs from the top right and the two photographs from the middle of FIG. 6). Compound R3 therefore falls into the class of agents causing depolymerization of the microtubular network and which lead to cell death.
  • the inventors of the present application have established that the compound R3 interferes with the microtubular network by causing a depolymerization of the latter.
  • Colchicine having applications in the treatment of cystic fibrosis, it is proposed, by analogy, the use of compound R3 according to the invention for the preparation of a medicament intended to treat or prevent cystic fibrosis.
  • the aforementioned inventors have also carried out a characterization of the antiproliferative effects of R3 on cell lines of lymphoid origins. These cells have the advantage of not adhering to their culture support and therefore do not therefore have to be subjected to the digestive action of trypsin to be analyzed. This helps to maintain perfect cellular integrity.
  • the NH32 lymphoid line was used, the p53 gene of which was completely inactivated by homologous double recombination, this in order to also see whether the antiproliferative effect of R3 was dependent on the presence or not of this tumor suppressor gene.
  • the same series of experiments as that used during the characterization of the antiproliferative power of R3 on the Caco-2 cell line was undertaken.
  • the TK6 and NH32 cells are treated with increasing doses of the compound R3 (0.1 to 1 ⁇ M) and the analysis of the link between annexin V and phosphatidyl serine is carried out by flow cytometry, after 16, 24, 40 and 48 hours of treatment (Figure 8).
  • Treatment of the cells with the R3 compound has no significant effect during the first 24 hours of treatment regardless of the dose of R3 used.
  • a very significant increase in the percentage of cells outsourcing phosphatidyl serine is then obtained from a concentration of R3 of the order of 0.3 ⁇ M. This increase is “dose-dependent” in the two lines studied.
  • the NH32 line seems less affected than the TK6 line.
  • the compound R3 according to the invention shows a higher activity on the lines which have the fastest replication times (TK6, NH32, KB).
  • the antiproliferative effects of R3 are manifested on all the cancer lines tested.
  • IC 50 concentration (micromolar) in R3 necessary to inhibit cell growth by 50%.
  • Figure 9 illustrates the effects of R3 on tumor development after subcutaneous implantation of human tumor cells in nu / nu athymic mice. Three weekly injections (intraperitoneal route) were carried out on six subjects at a dose of 100 mg / kg, then the tumors were removed 25 days after implantation.
  • the compound R3 inhibits the development of the tumor by 50% and R3 has no apparent toxicity on the animal (identical weight evolution in the 2 groups of mice).
  • the present invention therefore also relates to the compound R3 according to the invention for use as a medicament.
  • It also relates to its use as an agent for depolymerization of the microtubular network of human or animal living cells, in particular by providing that the (Z) -3,5,4'- trimethoxystilbene is fixed at least partially on the site of colchicine .
  • said compound R3 according to the invention as an agent for inhibiting the polyamine synthesis of human or living animal cancer cells, as an agent for blocking the cell cycle, in particular of the cell cycle of human cancer cells or live animals, as an agent for the treatment or prevention of hyproliferative pathologies, in particular inflammatory conditions, infectious and / or parasitic diseases (malaria) and as a photoprotective agent, in particular for protection against UV-A and UV- rays B.
  • the use is further characterized in that said blockage of the cell cycle takes place at the G2 / M phase.
  • compound R3 according to the invention is further characterized in that said blocking of the cell cycle is irreversible.
  • the present invention further relates to a medicament characterized in that it comprises, as active principle, at least the compound R3 ((Z) -3,5,4'-trimethoxystilbene).
  • a cosmetic composition with photoprotective property characterized in that it comprises, as active principle, at least the compound R3 ((Z) -3,5,4'-trimethoxystilbene).
  • the compound R3 of the present invention it also becomes possible to provide a method of treatment or prevention of a disease in a mammal, in particular diseases involving an abnormal cell proliferation or growth such as diseases of the "cancer" type. or hypeifroliferative pathologies, in particular inflammatory states, infectious and / or parasitic diseases or a disease such as cystic fibrosis, said treatment or prevention method comprising the administration (by any possible route) to said mammal of a therapeutically effective amount of at least one R3 compound of general formula I or of a pharmaceutically acceptable derivative (salt, ester, etc.) of said R3 compound according to the present invention.

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Abstract

La présente invention concerne le domaine de la chimie organique et plus particulièrement celui lié à la synthèse de nouvelles molécules susceptibles de présenter des propriétés biologiques, en particulier thérapeutiques et plus particulièrement des propriétés dans le domaine de la prévention ou du traitement de certaines maladies telles que notamment les maladies du type 'cancers'. Elle a pour objet un nouveau procédé de synthèse chimique du (Z)-3,5,4'-triméthoxystilbène (composé R3), le composé susceptible d'être obtenu par ledit procédé, l'utilisation dudit composé comme médicament en particulier comme anticancéreux de synthèse à faible prix de revient, le médicament correspondant ainsi que différentes utilisations dudit composé, (R3).

Description

Procédé de synthèse du (Z)-3,5,4'-triméthoxystilbène, composé obtenu et utilisations dudit composé, notamment comme médicament, en particulier comme anticancéreux
La présente invention concerne le domaine de la chimie organique et plus particulièrement celui lié à la synthèse de nouvelles molécules susceptibles de présenter des propriétés biologiques, en particulier thérapeutiques et plus particulièrement des propriétés dans le domaine de la prévention ou du traitement de certaines maladies telles que notamment les maladies du type « cancers ».
Elle a pour objet un nouveau procédé de synthèse chimique du (Z)-3,5,4'-triméthoxystilbène (ci-après désigné comme composé R3), le composé R3 susceptible d'être obtenu par ledit procédé, différentes utilisations du composé synthétisé (notamment comme médicament), en particulier comme anticancéreux de synthèse à faible prix de revient, un médicament présentant ledit composé R3 en tant que principe actif ainsi qu'une composition cosmétique.
Le composé R3 est un dérivé du resvératrol, polyphénol naturel présent dans le monde végétal.
Les effets anticancérogènes des polyphénols présents dans l'alimentation ont fait l'objet de nombreuses études. Ces dernières ont conduit à l'étude des effets du resvératrol (3,5,4'-trihydroxy-trα«s-stilbène ou isomère (E)), constituant naturel de nombreuses plantes, de la vigne et du raisin. Le resvératrol qui a des propriétés fongicides est produit par la vigne pour lutter contre le développement du champignon Botritis cinerea. Des recherches ont permis de montrer que ce composé possède, aussi bien in vitro, sur les cellules cancéreuses humaines, q 'in vivo, chez la souris cancéreuse, des propriétés anti-cancéreuses intéressantes (F. Raul et al. « Anti-proliferative effect of resvératrol, a natural component of grapes and wine, on human colonie cancer cells », Cancer Lett. 158. 85-91, 2000 et « Resvératrol inhibits intestinal tumorigenesis and modulâtes host-defense related gène expression'in an animal model of human familial adenomatous polyposis », Nutrition and Cancer, 39, 102-107, 2001). Cependant, ledit composé naturel est, sous sa forme « trans », instable et rapidement transformé par la cellule. Ainsi, le problème posé à la présente invention est celui de la mise à la disposition du public d'une nouvelle molécule anticancéreuse qui soit à la fois efficace et d'un faible prix de revient.
A cette fin la présente invention propose une nouvelle synthèse d'une molécule dérivée du resvératrol, à savoir, le (Z)-3,5,4'- triméthoxystilbène, de formule I :
Figure imgf000004_0001
ci-après désigné comme composé R3, correspondant en fait au dérivé tri-méthylé du resvératrol.
Le composé R3 a été testé pour ses propriétés anticancérogènes éventuelles. Des études biologiques ont démontré de façon inattendue et surprenante que le composé R3 présente une grande stabilité et une remarquable action anticancéreuse qui se révèle bien supérieure (de l'ordre de 100 fois plus importante) à celle du resvératrol.
En étudiant les mécanismes cellulaires et moléculaires de son action, il a été mis en évidence qu'il possédait des propriétés biologiques, en particulier anticancéreuses, similaires voire supérieures à celles qui sont décrites pour le Taxotere® (docétaxel, Aventis, France) utilisé en chimio- et radio-thérapies anticancéreuses.
La présente invention a pour objet un procédé de synthèse du composé selon l'invention, caractérisé en ce qu'il consiste essentiellement à exposer un échantillon d'isomère (E)-3,5,4'-triméthoxystilbène mis en solution dans un solvant adapté à une lumière ultraviolette de longueur d'onde culminante comprise entre 200 nm et 400 nm, ce pendant une durée d'exposition comprise entre une heure et deux heures pour une quantité d'isomère (E) de 10"2 mole et, le cas échéant, à évaporer ledit solvant afin de recueillir l'isomère (Z) recherché. La présente invention a encore pour objet le composé R3 susceptible d'être obtenu par le procédé précité, l'utilisation dudit composé R3 selon l'invention comme médicament, en particulier pour la préparation d'un médicament pour le traitement ou la prévention d'une maladie impliquant une prolifération ou croissance cellulaire anormale, telle que le cancer.
Selon une autre utilisation, le composé selon l'invention est employé pour la préparation d'un médicament destiné à traiter ou à prévenir la mucoviscidose.
La présente invention a encore pour objet l'utilisation du composé selon l'invention comme agent de dépolymérisation du réseau microtubulaire de cellules humaines ou animales vivantes, comme agent d'inhibition de la synthèse polyaminique de cellules cancéreuses humaines ou animales vivantes, comme agent de blocage du cycle cellulaire, en particulier du cycle cellulaire de cellules cancéreuses humaines ou animales vivantes, comme agent de traitement ou de prévention de pathologies hyperprolifératives, en particulier d'états inflammatoires, des maladies infectieuses et/ou parasitaires telles que le paludisme et comme agent photoprotecteur, en particulier pour la protection contre les rayons UV-A et/ou UV-B.
La présente invention concerne, en outre, un médicament caractérisé en ce qu'il comprend à titre de principe actif au moins le composé R3 selon l'invention.
Enfin, la présente invention concerne encore une composition cosmétique à propriété photoprotectrice, caractérisée en ce qu'elle comprend à titre de principe actif au moins le composé selon l'invention.
Les utilisations, médicaments et compositions cosmétiques selon l'invention font l'objet des revendications 10 à 23.
L'invention sera mieux comprise, grâce à la description ci- après, qui se rapporte à un mode de réalisation préféré, donné à titre d'exemple non limitatif, et expliqué avec référence aux dessins schématiques annexés, dans lesquels : la figure 1 représente un exemple de schéma de synthèse du procédé selon l'invention, la figure 2 représente la courbe de croissance de cellules CaCo- 2 en fonction de la concentration en composé R3 ajouté (figure 2a) ainsi que la courbe de croissance de cellules IEC-6 en fonction de la concentration en composé R3 ajouté (figure 2b), la figure 3 illustre le double marquage de cellules CaCo-2 par l'Annexine-FITC (figure 3a) et l'iodure de propidium (figure 3b) après un traitement avec le composé R3, la figure 4 représente une analyse d'un cycle cellulaire par cytométrie en flux de cellules cancéreuses traitées par le composé R3 (figure 4a), la figure 4b représente l'analyse du cycle de la figure 4a en l'absence de traitement par le composé R3, la figure 5 représente l'activité de l'ODC en fonction de la durée du traitement avec le composé R3 (figure 5a) et l'activité de l'AdometDC (SAMDC) en fonction de la durée du traitement avec le composé R3 (figure 5b), la figure 6 représente des clichés du réseau microtubulaire de cellules CaCo-2 sous l'influence du composé R3 et de deux composés connus, la figure 7 représente une courbe de compétition entre R3 et des ligands marqués au tritium (vinblastine, colchicine) pour leur fîxaion sur la tubuline, la figure 8 représente des histogrammes indiquant le pourcentage de cellules marquées soit par l'annexine V (cellules apoptotiques) soit présentant un caractère d'hyperdiploïde, et la figure 9 représente un histogramme illustrant les effets « in vivo » de R3 sur le développement de tumeurs après implantation sous- cutanée de cellules tumorales humaines chez la souris athymique nu/nu.
Selon une première caractéristique, le procédé de synthèse du composé selon l'invention est caractérisé en ce qu'il consiste essentiellement à exposer un échantillon d'isomère (E)-3,5,4'~ triméthoxystilbène 5 mis en solution dans un solvant adapté à une lumière ultraviolette de longueur d'onde culminante comprise entre 200 nm et 400 nm, ce pendant une durée d'exposition comprise entre une heure et deux heures pour une quantité d'isomère (E) de 10" mole et, le cas échéant, à évaporer ledit solvant afin de recueillir l'isomère (Z) recherché.
De façon avantageuse, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que la longueur d'onde culminante de la lumière ultraviolette choisie est préférentiellement de 254 nm. Selon une autre caractéristique, la durée d'irradiation est préférentiellement d'une heure pour 10"2 mole d'isomère (E). De manière avantageuse, le solvant utilisé est préférentiellement l'éthanol.
Selon un mode de réalisation préféré, l'isomère (E) est obtenu par préparation d'un halogénure de 4-méthoxybenzyle, transformation dudit halogénure en phosphonate, parallèlement, l'acide 3,5-dihydroxybenzoïque est transformé en 3,5-diméthoxybenzoate de méthyle 2, puis en alcool 3,5- diméthoxybenzylique 3, oxydation dudit alcool en aldéhyde correspondant et enfin transformation du 3,5-diméthoxybenzaldéhyde 4 en isomère (E)- 3,5,4'-triméthoxystilbène 5 par réaction avec ledit phosphonate. De manière avantageuse, l'halogénure de 4-méthoxybenzyle est préférentiellement le bromure de 4-méthoxybenzyle 1.
Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux, le 3,5-diméthoxybenzaldéhyde 4 est obtenu par adjonction, selon la méthode de Corey, de dichromate de pyridinium à l'alcool 3,5-diméthoxybenzylique 3.
La présente invention a également pour objet le composé susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'invention, caractérisé en ce qu'il s'agit du (Z)-3,5,4'-triméthoxystilbène.
Ci-après, on décrira plus en détail un exemple préféré, non limitatif, de synthèse du composé R3 selon l'invention.
A) Exemple de procédé de synthèse chimique préféré du (Z)- 3,5,4 '-triméthoxystilbène ou composé R3 :
Dans ce qui suit, tous les points de fusion ont été mesurés, sans correction, à l'aide de tubes capillaires et d'un appareil type B-510 n° 533640 commercialisé par la société Bϋchi. Les spectres de résonance magnétique nucléaire du *H et du 13C ont été enregistrés avec un spectromètre de type Bruker AC à 200 MHz. Les spectres de masse proviennent d'une installation AutoSpec E Micromass, fonctionnant à 70 eV d'énergie et munie d'un dispositif d'introduction directe de l'échantillon à analyser.
Les résultats de mesure sont consignés dans le tableau suivant :
Figure imgf000008_0001
3,5 - C H10O3 45 - 48 °C 166,16 1H, CDCI3, 200MHz : 9,88 (IH, s, CHO) ; diméthoxybenzaldéhyde 6,98 (2H, d, J = 2,3 Hz, H2j6) ; 6,68 (IH, t, J = 2,3 Hz, H4) ; 3,82 (6H, s, 2 x OMe)
13 C, CDCI3, 200 MHz : 192 (CHO) ; 161,3 (C3, C5) ; 138,5 (C,) ; 107,2 (C2, C6) ; 55,7 (2 x OMe)
(E)-3, 5, 4' C17H18O3 56 - 57 °C 270,33 1H, CDCI3, 200 MHz : 3,85 (9H, s, 3 x triméthoxystilbène OMe) ; 6,40 (IH, t, J = 2,5 Hz, H4) ; 6,68 (2H, d, J = 2,5 Hz, H2>6) ; 6,93 (2H, d, J = 9 Hz, H3.,5.) ; 7,00 (2H, d, J = 16,5 Hz, vinylique) ; 7,48 (2H, d, J = 9 Hz, H2-,6
13C, CDCI3, 200 MHz : 161 (C3) ; 159,5 (C5) ; 159,3 (C,) ; 139,7 (d) ; 130 (Cr) ; 128,7 (Cp) ; 127,8 (C2.6.) ; 126,6 (Cα) ; 114,2 (C3.) ; 113,8 (C5.) ; 104,4 (C2,6) ; 99,7 (C4) ; 55,4 (OCH3 x 3)
Mass. m/z = 270 (M*, 100 %) ; 258,0 ; 239,0 ; 228,1 ; 197,1 ; 150,1 ; 137,0 ; 121,1 ; 109,1
Données physico-chimiques relatives aux composés mis en œuvre.
Le diméthylformamide employé dans le cadre de la synthèse a été distillé sur tamis moléculaire de 0,4 nm et sous pression réduite. Le dichlorométhane utilisé pour l'étape n° 4 a été séché sur hydrure de calcium. L'alcool 4-méthoxybenzylique, l'acide 3,5-dihydroxybenzoïque et le triéthylphosphite mis en œuvre ci-dessous sont des produits qui se trouvent dans le commerce et qui peuvent être utilisés tels quels.
1. Préparation du bromure de 4-méthoxybenzyle 1
Un volume de 6 ml d'acide bromhydrique concentré à 48% a été ajouté, en une seule fois, à 7,5 g (54 mmoles) d'alcool 4- méthoxybenzylique. On a ensuite vigoureusement agité le mélange pendant 30 minutes à température ambiante. Puis 100 ml d'éther diéthylique ont été rajoutés et la phase acide a été séparée. Après une deuxième extraction à l'éther, on a rassemblé les phases organiques que l'on a lavées avec, d'abord de l'hydrogénocarbonate de sodium, puis de l'eau salée, et que l'on a finalement séchées à l'aide de sulfate de magnésium. Le bromure de 4- méthoxybenzyle 1 obtenu est peu stable et a donc été immédiatement utilisé dans l'étape suivante. Il se présente sous forme d'une huile incolore et il en a été obtenu 10,54 g ce qui correspond à un rendement de 97 %.
2. Préparation du 3-5-diméthoxybenzoate de méthyle 2
Un mélange constitué de 5 g d'acide 3,5-dihydroxybenzoïque (32,4 mmoles), de 25 g de carbonate de potassium anhydre, de 20 ml de sulfate de diméthyle et de 100 ml d'acétone est porté à reflux pendant
4 heures. Après filtration du carbonate de potassium et évaporation de l'acétone, le mélange restant a été dilué avec 100 ml d'eau et 200 ml d'éther. Avant d'être séchée sur sulfate de magnésium, la phase éthérée a été lavée successivement, deux fois avec de l'ammoniaque concentrée, une fois avec de l'eau, deux fois avec de l'acide chlorhydrique dilué et enfin avec de l'eau salée. Le solvant évaporé, on obtient un produit brut que l'on purifie sur colonne chromatographique de silice 60 commercialisée par la société Merck en utilisant un mélange hexane : acétate d'éthyle à 4:1 (rapport en volumes). On obtient ainsi des aiguilles incolores de masse
6,17 g. Ceci correspond également à un rendement de 97%. 3. Préparation de l'alcool 3,5-diméthoxybenzylique 3
A une suspension de l'hydrure double d'aluminium et de lithium (1,02 g, soit 26,8 mmoles) dans 75 ml d'éther diéthylique, on ajoute 5 g (25,4 mmoles) de 3,5-diméthoxybenzoate de méthyle, contenus dans 25 ml d'éther diéthylique à un rythme permettant un reflux doux. Après un reflux de 2,5 heures, on refroidit, on dilue avec 50 ml d'un mélange 1 :1 (rapport en volumes) eau-éther et finalement avec de l'acide chlorhydrique dilué. L'extrait éthéré lavé à l'eau est séché sur sulfate de magnésium. On obtient des aiguilles incolores de masse 3,86 g, ce qui correspond à un rendement de 90%.
4. Préparation du 3.5-diméthoxybenzaldéhyde 4
A 3,5 g (20,8 mmoles) d'alcool 3,5-diméthoxybenzylique 3 dans 30 ml de dichlorométhane séché, on ajoute 11,75 g (31,2 mmoles) de dichromate de pyridinium préparé selon la méthode de Corey.
Cette méthode consiste à ajouter en 20 minutes 15,8 g de pyridine à 20 g de trioxyde de chrome dilué dans 20 ml d'eau distillée en veillant à ce que la température ne dépasse pas 20 °C. Après 15 minutes d'agitation vigoureuse, on ajoute 80 ml d'acétone.
Les cristaux oranges de dichromate de pyridinium (25,5 g) sont filtrés après 12 heures de croissance à -20 °C, ce qui correspond à un rendement de 68 %. Après agitation pendant 12 heures à température ambiante, le mélange réactionnel est dilué à l'aide de 60 ml d'éther diéthylique, filtré à travers une colonne remplie de silice 60 commercialisée par la société Merck pour donner, après évaporation du solvant, 3,1 g d'un solide sous forme d'aiguilles incolores. Le rendement est de 90 %. 5. Préparation de l'isomère (EV3.5.4'-triméthoxystilbène 5
On chauffe, à 120 °C pendant 6 heures, un mélange constitué de 14,5 ml (84,6 mmoles) de triéthylphosphite et de 10,54 g (52,4 mmoles) de bromure de 4-méthoxybenzyle 1. Pendant la réaction, il se produit un dégagement gazeux de bromure d'éthyle. Après refroidissement à 0°C, on ajoute au mélange 75 ml de diméthylformamide, préalablement distillé, et 2,97 g (55,2 mmoles) de méthylate de sodium et on agite encore pendant une heure. On y introduit ensuite 5,8 g (35mmoles) du 3,5- diméthoxybenzaldéhyde 4 précédemment synthétisé. La solution obtenue est agitée pendant une heure à température ambiante puis encore une heure à 100°C. Après refroidissement, le mélange réactionnel est agité pendant une nuit, saisi à l'eau et extrait à l'éther. Les phases organiques sont réunies, lavées à l'eau salée, contrôlées au papier-tournesol et finalement séchées sur du sulfate de magnésium. Le produit brut est purifié par chromatographie sur silice 60 avec comme éluant un mélange d'hexane et d'acétate d'éthyle (4:1) (rapport en volumes). On obtient 7,85 g d'un solide sous forme d'aiguilles incolores. Le rendement est de 83%.
6. Préparation du (ZV3.5.4'-triméthoxystilbène (composé R3
Un échantillon constitué d'une solution de 1 ml à 10"2 mole par litre de (E)-3,5,4'-triméthoxystilbène 5, est exposé à une lumière ultraviolette culminante à 254 nm. La durée de l'irradiation est d'une heure. Après évaporation sous pression réduite du solvant, on obtient quantitativement le stéréo-isomère Z recherché (R3).
Le coût des produits chimiques nécessaires à l'obtention d'un gramme de composé R3 pur à 98 % est actuellement d'environ 8 euros (soit environ 52 FRF). Le schéma de la synthèse du composé R3 est résumé sur la figure 1.
B) Effets Biologiques du composé R3 selon l'invention :
1) Inhibition par le composé R3 de la croissance de cellules cancéreuses et/ou transformées Afin de démontrer l'activité du composé R3 sur la croissance des cellules cancéreuses in vitro, les essais suivants ont été réalisés.
Des cellules cancéreuses coliques humaines de la lignée CaCo- 2 et des cellules transformées murines de la lignée IEC-6, ont été traitées 24 h après ensemencement avec des concentrations croissantes de R3, allant de 0,1 μM à O,6 μM.
La figure 2 représente la courbe de croissance de cellules
CaCo-2 (figure 2a) en fonction de la concentration en composé R3 ajouté, alors que la figure 2b montre la courbe de croissance de cellules IEC-6 en fonction de la concentration en composé R3. Chaque point sur ces deux courbes représente la valeur moyenne (±SEM) calculée à partir de 8 échantillons. La légende de la figure 2a s'applique également à la figure 2b.
Les résultats observés montrent que le composé R3 exerce une forte action inhibitrice (inhibition de 70%) sur la croissance des cellules cancéreuses coliques CaCo-2 pour des concentrations supérieures à 0,2 μM, c'est-à-dire une inhibition similaire à celle obtenue avec le resvératrol mais pour des concentrations 150 fois moins élevées.
Un arrêt complet de la croissance cellulaire des cellules CaCo-2 est observé pour une concentration de 0,3 μM en composé R3. En ce qui concerne les cellules IEC-6, le composé R3 se montre encore plus actif, puisqu'une inhibition totale de la croissance cellulaire est déjà obtenue à une concentration en composé R3 de 0,2 μM.
La lignée IEC-6 ayant un pouvoir prolifératif significativement plus élevé que les cellules de type CaCo-2, ces résultats montrent que les effets engendrés par un traitement avec la molécule R3 sont directement liés à l'état prolifératif des cellules.
2. Caractérisation de l'effet antiprolifératif du composé R3
Cette étude permet de caractériser le mécanisme par lequel R3 inhibe la prolifération cellulaire cancéreuse.
Trois grands types d'inhibitions ont été décrits :
- la nécrose, ou cytotoxicité directe et aspécifique des cellules,
- l'apoptose ou mort programmée de la cellule, on emploie également le terme de « suicide cellulaire », et
- un simple blocage du cycle cellulaire. a) Cytotoxicité aspécifique (nécrose cellulaire) :
La mesure de l'activité d'enzymes intracellulaires libérées dans le milieu de culture constitue un bon révélateur de la lyse cellulaire. En effet, une destruction de la membrane des cellules entraîne la libération du contenu cytoplasmique dans le surnageant, et ceci proportionellement au nombre de cellules détruites.
La lactate déshydrogénase (LDH) est une enzyme intracytoplasmique ubiquitaire, et son apparition dans le milieu extérieur est un indicateur de choix pour évaluer la cytotoxicité d'un produit (Decker et Lohmann-Matthes 1988).
De manière inattendue et surprenante, il a pu être constaté qu'un traitement des cellules CaCo-2 par le composé R3, entraîne une disparition complète de l'activité LDH qui ne peut plus être détectée dans le milieu extracellulaire et ceci même pour des concentrations élevées en R3 permettant de conclure que l'inhibition de croissance observée au niveau des cellules CaCo-2 n'est pas le résultat d'une cytotoxicité aspécifique du composé R3.
b) apoptose
Le terme d'apoptose est utilisé pour qualifier un mode particulier de dégénérescence cellulaire qui, au final, se traduit par la mort de la cellule. C'est un processus cellulaire endogène mis en place en dernier recours lorsqu'un signal extérieur ou intérieur active une voie métabolique créant un dysfonctionnement important de la cellule. L'apoptose est caractérisée par une condensation et une dégradation de la chromatine, une réduction du volume cellulaire et une déformation membranaire. Un des marqueurs biochimiques de l'apoptose est une dégradation caractéristique de l'ADN. En effet on observe une fragmentation de l'ADN qui résulte de l'activation d'une endonucléase clivant sélectivement l'ADN sur des sites localisés à proximité des unités nucléosomiques. Des fragments mono- et oligonucléosomiques sont ainsi générés. La détection de ces fragments par électrophorèse sur gel d'agarose est une des méthodes les plus couramment utilisées pour qualifier l'apoptose.
En utilisant cette technique il a pu être constaté que la molécule R3 ne provoquait pas un tel processus. Après séparation, une fragmentation de l'ADN similaire a été obtenue dans les cellules traitées par rapport aux cellules de contrôle. Aucune dégradation de l'ADN n'a pu être mise en évidence, et ce même pour des concentrations élevées en composé R3 ajouté. Le traitement par la molécule R3 n'induit donc pas de processus apoptotique dans les cellules CaCo-2.
Un autre marqueur biochimique pouvant caractériser l'apoptose est la translocation de la phosphatidyl serine de la surface cytoplasmique de la membrane vers l'extérieur de la membrane cellulaire. La détection in vitro de ce phénomène peut être visualisée à partir de l'interaction entre l'annexine V (une protéine liant spécifiquement la phosphatidyl serine) et la phosphatidyl serine. L'annexine V est marquée grâce à un fluorochrome spécifique et la détection est effectuée par cytométrie en flux.
Les cellules ont donc été traitées par 0,3 et 1 μM de R3 pendant 24 heures, puis l'analyse de la liaison entre l'annexine V et la phosphatidyl serine a été effectuée par cytométrie en flux (cf. figure 3a de la figure 3).
On peut constater sur ladite figure 3 a, que le traitement avec la molécule R3 de cellules CaCo-2 n'induit aucune variation dans le profil du marquage à l'annexine. Le pourcentage de cellule liant l'annexine ne subit aucune augmentation. La molécule R3 ne provoque donc pas la translocation de la phosphatidyl serine. De ce fait, ce composé ne revêt une fois de plus, pas les caractéristiques d'un inducteur d'apoptose.
Au cours de cette expérience, il a été réalisé en parallèle un marquage à l'iodure de propidium (IP). Les résultats sont visibles sur la figure 3b de la figure 3. L'IP est un intercalant de l'ADN qui est exclusivement inclus par les cellules perméabilisées. Il est donc exclu par des cellules viables (premier pic), alors qu'il sera incorporé dans des cellules mortes (tout ce qui se trouve après le premier pic).
Sur la figure 3b présentée précédemment on peut s'apercevoir que des cellules incorporent cet intercalant (pic à l'extrême droite sur la figure 3b de la figure 3), aussi bien dans les contrôles (présence de quelques cellules mortes) que dans les cellules ayant subit un traitement par le composé R3. Cependant on peut constater que le R3 induit une importante mort cellulaire comme le montre la diminution du nombre de cellules formant le premier pic. Ainsi, on peut constater que plus la dose de R3 est élevée, plus le nombre de cellules mortes est élevé. Ceci a amené à étudier les effets possibles du composé R3 sur le déroulement du cycle cellulaire. Les résultats de cette étude sont donnés ci-après. c) Etude par cytométrie de flux du blocage du cycle cellulaire par le composé R3
La cytométrie de flux est définie comme l'étude précise de cellules isolées entraînées par un flux liquide. Elle permet la caractérisation qualitative et quantitative des cellules en déterminant la distribution et la variation du nombre de cellules dans chaque phase du cycle cellulaire, à savoir les phases Gi (préparation à l'entrée en phase S), S (synthèse), G2 (préparation à l'entrée en phase M) et M (mitose). Cette caractérisation se base sur le fait que la cellule possède, au cours de son développement, un contenu en ADN variable. On trouvera 2n chromosomes en phase G], alors que pour des cellules en phase G2 le nombre de chromosomes présents sera de 4n. Les valeurs intermédiaires sont celles correspondant à la phase de synthèse d'ADN, donc à la phase S du cycle. Dans un cytomètre, les cellules canalisées assimilables à des particules, coupent le faisceau lumineux d'un laser et les signaux qu'elles émettent en retour sont analysés. Ces signaux sont fonction de la quantité d'ADN présent dans la cellule.
Les cellules CaCo-2 sont traitées avec 0,3 μM de R3 sur une période de 64 heures (figures 4a et 4b). La distribution des cellules dans les différentes phases du cycle cellulaire a été analysée pour des temps de prélèvement de 16, 24, 40, 48 et 64 heures. Chaque courbe représente la proportion de cellules se trouvant dans la phase du cycle concernée. La légende de la figure 4a s'applique également à la figure 4b.
Un blocage des cellules au niveau de la phase G2/M (duplication de l'ADN) est observable dès 16 heures après traitement et se maintient approximativement jusqu'à 40 heures. Durant cette période, on observe une accumulation de cellules bloquées en phase G2/M. Il semble qu'au-delà de 24 heures, le composé R3 ne permet plus de maintenir complètement ce blocage, cela se traduit donc par une légère inflexion de la courbe. Ce phénomène ne relève pas d'une possible réversibilité du produit, mais est probablement associé à une concentration un peu faible et qui ne permet pas d'affecter toutes les cellules de façon prononcée. Cette hypothèse se confirme par le fait que les cellules sont de nouveau bloquées lorsqu'à 48 heures du milieu frais contenant la molécule R3 est ajouté. Ce blocage est beaucoup plus prononcé que celui observé précédemment puisque 85% des cellules se trouvent désormais bloquées au niveau de la phase G2/M du cycle cellulaire. Cela montre donc que les effets engendrés par la molécule R3 sur le cycle cellulaire sont potentialisés au cours des traitements successifs et ne sont pas réversibles. Il est intéressant de constater que les effets sur le cycle cellulaire qui sont induits par le composé R3 sont similaires à ceux qu'exerce un autre anticancéreux de synthèse utilisé en clinique, à savoir le Taxotere® déjà évoqué plus haut.
3. Etude des effets du composé R3 sur la synthèse des polyamines
Les polyamines sont des composés ubiquitaires qui peuvent être considérés comme des facteurs de croissance pour la cellule tumorale.
Le métabolisme endogène des polyamines est régulé par 2 enzymes limitantes appelées ornithine décarboxylase (ODC) et S- adénosylméthionine décarboxylase (AdoMetDC ou SAMDC). L'ODC catalyse la décarboxylation de l 'ornithine en putrescine et l'AdoMetDC catalyse la décarboxylation de la S-adénosyl-méthionine en S-adénosyl- méthionine décarboxylée, donneur de groupe aminopropyle lors de la synthèse de la spermidine et de la spermine.
Les figures 5a et 5b représentent les activités de l'ODC et de la
SAMDC, exprimées en pmol/h/mg de protéines. Chaque colonne représente les valeurs moyennes (±SEM) des activités de l'ODC et de l'AdoMetDC calculées à partir de 3 échantillons. La légende de la figure 5a s'applique également à la figure 5b.
L'activité de l'ODC au sein des cellules tumorales est en général exacerbée, ce qui en fait une cible potentielle dans la recherche de nouveaux agents anticancéreux. Dans cette optique, les effets du composé
R3 ont été étudiés sur l'activité de l'ODC et de l'AdoMetDC (figures 5a et
5b de la figure 5).
On peut constater qu'un traitement par le composé R3 affecte de façon significative l'activité de l'ODC, et ceci dès le premier traitement, cependant l'intensité de l'inhibition décroît après 48h de traitement. Le composé R3 mis en contact avec les cellules lors du premier traitement n'est pas en concentration suffisante pour entraîner un blocage irréversible de l'enzyme. Cela se vérifie par le fait qu'un second traitement effectué à 48h conduit à une forte inhibition de l'ODC. Ces résultats sont encore confortés par le fait que l'activité de l'AdoMetDC qui ne subissait aucune variation significative lors du premier traitement est fortement inhibée lors d'un second traitement.
Ainsi le composé R3 inhibe fortement la synthèse des polyamines (putrescine, spermidine et spermine) par la cellule cancéreuse ce qui contribue à expliquer les puissants effets antiprolifératifs de cette molécule.
4. Effets du composé R3 sur le cytosquelette
Il a pu précédemment être démontré que la molécule R3 provoquait un blocage du cycle cellulaire au niveau de la phase G2/M. Or, il est connu que le passage de cette phase est essentiel dans la division cellulaire. En effet, c'est à cette période du cycle que la cellule va pouvoir se scinder et pour cela il y a mise en jeu d'éléments clés du cytosquelette. Le réseau microtubulaire représente un de ces éléments.
Par conséquent, les répercussions que pouvait avoir la molécule R3 sur ce réseau ont également été analysées. Il a été comparé l'action de ce composé à d'autres composés ayant un effet important et reconnu sur le réseau microtubulaire, à savoir le nocodazole qui provoque une dépolymérisation des microtubules, et le taxol qui lui au contraire inhibe cette dépolymérisation. Les cellules CaCo-2 sont traitées durant 2 heures par le composé R3 (5 μM, 10 μM et 20 μM), le taxol (lOμM) et le nocodazole (20 μM). La structure du réseau microtubulaire est alors révélée par des méthodes immunohistochimiques.
Comme l'illustre le cliché correspondant (en bas et à droite de la figure 6), le taxol de par son action anti-dépolymérisante fige le réseau microtubulaire alors que le nocodazole (cliché en bas et à gauche de la figure 6) provoque une désorganisation importante de ce réseau. Il a été trouvé que le composé R3 provoque le même type d'altérations que celles qui sont observables lorsque les cellules sont traitées par du nocodazole (clichés du haut à droite et les deux clichés du milieu de la figure 6). Le composé R3 entre donc dans la classe des agents provoquant une dépolymérisation du réseau microtubulaire et qui conduisent à la mort des cellules.
En étudiant les effets du composé R3 sur la croissance de diverses lignées cancéreuses, il a pu être apporté des données significatives relatives au pouvoir antiprolifératif de ce composé sur les cellules cancéreuses humaines ou animales. Ainsi, il a pu être démontré que la molécule R3 possède un puissant pouvoir antiprolifératif provoquant un blocage des cellules cancéreuses au niveau de la phase G2/M du cycle cellulaire. Ce blocage est la résultante de l'effet direct de cette molécule sur le réseau microtubulaire, puisqu'il provoque une dépolymérisation de ce réseau conduisant à la mort des cellules (momification des cellules). D'autres travaux également ont permis de montrer que le composé R3 n'est aucunement toxique envers une lignée de cellules lymphocytaires normales même à forte concentration, ce qui permet d'envisager une réelle sélectivité du composé R3 selon l'invention vis-à-vis des cellules en phase active de croissance. Ce fait est remarquable et renforce l'intérêt dudit composé R3 dans la thérapie anticancéreuse puisque d'autres anticancéreux actuellement utilisés en clinique, notamment le Taxotere®, ne montrent pas une telle sélectivité d'action.
Des études complémentaires plus récentes ont en outre permis de mettre en évidence les autres propriétés suivantes :
5. Etudes « in vitro »
a) Identification du site de liaison de R3 sur la tubuline
Les inventeurs de la présente demande ont établi que le composé R3 interfère avec le réseau microtubulaire en provoquant une dépolymérisation de ce dernier.
Il existe trois sites de liaison possible pour les poisons du réseau microtubulaire au niveau de la sous unité β de la tubuline: le domaine des alcaloïdes de la pervenche, le sites des taxoïdes et celui de la colchicine. Or, il a été constaté de manière inattendue et surprenante que les effets obtenus lors du traitement des cellules Caco-2 avec R3, sont similaires à ceux décrits pour d'autres poisons des microtubules tels que la colchicine et les alcaloïdes de la pervenche de Madagascar (Vincristine, Vinblastine). La colchicine n'est actuellement pas utilisée comme agent anti-cancéreux en raison de sa trop grande toxicité. Le composé R3, du fait de sa faible toxicité, pourrait donc représenter un composé alternatif de choix si ce dernier se lie au même domaine que celui de la colchicine. Pour déterminer si R3 se lie ou non au site de liaison de la colchicine, une étude de compétition a donc été entreprise.
A cette fin, un extrait cellulaire riche en tubuline provenant de cellules Caco-2, a été mis en contact avec de la colchicine marquée et des concentrations croissantes de R3. Les résultats obtenus montrent sur la figure 7 (où chaque point représente la valeur moyenne (±SEM) calculée à partir de 3 échantillons) que R3 provoque un déplacement « dose- dépendant » de la colchicine jusqu'à 5μM, et qu'au-dessus de ce seuil, quelque soit la dose de R3 utilisée, 14 % de la colchicine marquée reste liée à la tubuline. Ces résultats suggèrent que R3 se fixerait soit sur le site de la colchicine lui même, soit sur un site distinct, qui influencerait la liaison de la colchicine sur son site.
La colchicine ayant des applications dans le traitement de la mucoviscidose, il est proposé, par analogie, l'utilisation du composé R3 selon l'invention pour la préparation d'un médicament destiné à traiter ou à prévenir la mucoviscidose.
b) Induction d'un processus apoptotique original dans des lignées cellulaires lymphoïdes:
Afin de mieux caractériser le processus dégénératif qu'entraîne le composé R3 sur les cellules cancéreuses, les inventeurs précités ont également effectué une caractérisation des effets antiprolifératifs de R3 sur des lignées cellulaires d'origines lymphoïdes. Ces cellules ont l'avantage de ne pas adhérer à leur support de culture et n'ont donc pas à ce titre à être soumises à l'action digestive de la trypsine pour être analysées. Ceci permet de conserver une intégrité cellulaire parfaite.
Il a été utilisé la lignée lymphoïde NH32 dont le gène p53 a été totalement inactivé par double recombinaison homologue, ceci dans le but de voir également si l'effet antiprolifératif du R3 était dépendant de la présence ou non de ce gène suppresseur de tumeur. La même série d'expérience que celle utilisée lors de la caractérisation du pouvoir antiprolifératif de R3 sur la lignée cellulaire Caco-2 a été entreprise.
Les résultats obtenus montrent que R3 provoque une inhibition « dose-dépendante » de la croissance cellulaire comparable dans ces deux lignées. Cependant contrairement à ce que qui avait été obtenu lors des précédents résultats, un processus de mort cellulaire de type apoptotique a été mis en évidence.
Les cellules TK6 et NH32 sont traitées par des doses croissantes du composé R3 (0,1 à 1 μM) et l'analyse de la liaison entre l'annexine V et la phosphatidyl serine est effectuée par cytométrie de flux, après 16, 24, 40 et 48 heures de traitement (Figure 8). Le traitement des cellules par le composé R3 n'a pas d'effet significatif durant les premières 24 heures de traitement quelque soit la dose de R3 utilisée. Après 40 heures de traitement, une augmentation très importante du pourcentage de cellules externalisant la phosphatidyl serine est alors obtenue à partir d'une concentration en R3 de l'ordre de 0,3 μM. Cette augmentation est « dose- dépendante » dans les deux lignées étudiées. Cependant la lignée NH32 semble moins affectée que la lignée TK6. Pour tenter d'expliquer cette tendance à la diminution du nombre de cellules externalisant la phosphatidyl serine dans les cellules de type NH32, l'effet de R3 sur le contenu en ADN des cellules a été examiné. Les résultats démontrent encore une fois que l'action du composé R3 provoque un blocage des cellules au niveau de la phase G2/M du cycle cellulaire. De manière suφrenante après traitement avec R3, un pourcentage élevé de cellules présentait un profil particulier au niveau des cellules NH32, à savoir un contenu en ADN supérieur à la normale. Un traitement avec R3 provoque donc un phénomène d'hypeφloïdie.
Comme illustré dans la Figure 8, on s'aperçoit que ce phénomène est très marqué pour les cellules NH32 alors qu'il est relativement modéré pour les cellules TK6. Ce phénomène expliquerait la légère différence observée au niveau de l'externalisation de la phosphatidyl serine et suggère que le processus dégénératif entraîné par R3 est sous la dépendance de p53. Il est envisageable que les cellules présentant un statut p53 sauvage (TK6) entreraient rapidement en apoptose sous l'action de p53, alors que l'entrée de la cellule dans une phase d'hypeφloïdie provoquerait un retard dans ce processus. Ces résultats montrent que R3 se comporte comme un agent pro-apoptotique sur ces lignées cellulaires cancéreuses.
6. Effets de R3 sur d'autres lignées de cellules cancéreuses humaines:
Comme le montre le tableau 1 ci-dessous, le composé R3 selon l'invention montre une plus forte activité sur les lignées qui présentent les temps de réplication les plus rapides (TK6, NH32, KB). Les effets antiprolifératifs de R3 se manifestent sur toutes les lignées cancéreuses testées.
Tableau 1 : Inhibition de la croissance de cellules tumorales par R3
Figure imgf000022_0001
IC50 = concentration (micromolaire) en R3 nécessaire pour inhiber de 50 % la croissance des cellules.
7. Etudes « in vivo » : Effets de R3 sur le développement de tumeurs chez la souris athvmique nu/nu.
La Figure 9 illustre les effets de R3 sur le développement de tumeurs après implantation sous cutanée de cellules tumorales humaines chez la souris athymique nu/nu. Trois injections (voie intrapéritonéale) hebdomadaires ont été réalisées sur six sujets à raison d'une dose de 100 mg/kg, puis on a procédé au prélèvement des tumeurs 25 jours après implantation.
Comme on peut le constater le composé R3 inhibe de 50 % le développement de la tumeur et R3 ne présente aucune toxicité apparente sur l'animal (évolution pondérale identique dans les 2 groupes de souris).
La présente invention a donc également pour objet le composé R3 selon l'invention pour utilisation comme médicament.
Elle a encore pour objet l'utilisation dudit composé R3 selon l'invention pour la préparation d'un médicament destiné à traiter ou à prévenir une maladie impliquant une prolifération ou croissance cellulaire anormale, telle que le cancer, en particulier en provoquant une mort cellulaire apoptotique dans les lignées cellulaires lymphoïdes.
Elle a également pour objet son utilisation comme agent de dépolymérisation du réseau microtubulaire de cellules humaines ou animales vivantes, en particulier en prévoyant que le (Z)-3,5,4'- triméthoxystilbène se fixe au moins partiellement sur le site de la colchicine.
Elle a également pour objet l'utilisation dudit composé R3 selon l'invention comme agent d'inhibition de la synthèse polyaminique de cellules cancéreuses humaines ou animales vivantes, comme agent de blocage du cycle cellulaire, en particulier du cycle cellulaire de cellules cancéreuses humaines ou animales vivantes, comme agent de traitement ou de prévention de pathologies hypeφrolifératives, en particulier d'états inflammatoires, de maladies infectieuses et/ou parasitaires (paludisme) et comme agent photoprotecteur, en particulier pour la protection contre les rayons UV-A et UV-B. Dans le cas des maladies impliquant un blocage du cycle cellulaire, l'utilisation est en outre caractérisée en ce que ledit blocage du cycle cellulaire se fait au niveau de la phase G2/M.
De manière avantageuse, l'utilisation du composé R3 selon l'invention est encore caractérisée en ce que ledit blocage du cycle cellulaire est irréversible.
La présente invention a en outre pour objet un médicament caractérisé en ce qu'il comprend à titre de principe actif au moins le composé R3 ((Z)-3,5,4'-triméthoxystilbène). Enfin, elle a encore pour objet une composition cosmétique à propriété photoprotectrice, caractérisée en ce qu'elle comprend à titre de principe actif au moins le composé R3 ((Z)-3,5,4'-triméthoxystilbène).
Parmi les nombreux et importants avantages du composé R3 selon l'invention on peut citer: - une synthèse chimique d'accès commode,
- l'accès à de nombreux analogues (dérivés alkylés) par la même voie de synthèse,
- un faible coût de fabrication (8 euros/g),
- une efficacité biologique dans le traitement des cancers et de toute pathologie liée à des états hypeφrolifératifs, et
- une faible toxicité vis-à-vis des cellules normales (notamment des cellules immunitaires).
Grâce au composé R3 de la présente invention, il devient également possible de proposer un procédé de traitement ou de prévention d'une maladie chez un mammifère, en particulier des maladies impliquant une prolifération ou croissance cellulaire anormale telle que les maladies du type "cancers" ou de pathologies hypeφrolifératives, en particulier d'états inflammatoires, de maladies infectieuses et/ou parasitaires ou d'une maladie comme la mucoviscidose, ledit procédé de traitement ou de prévention comprenant l'administration (par toute voie possible) audit mammifère d'une quantité efficace sur le plan thérapeutique d'au moins un composé R3 de formule générale I ou d'un dérivé pharmaceutiquement acceptable (sel, ester...) dudit composé R3 selon la présente invention.
Bien entendu, l'invention n'est pas limitée au mode de réalisation décrit. Des modifications restent possibles, notamment du point de vue de la constitution des divers éléments ou par substitution d' équivalents techniques, sans sortir pour autant du domaine de protection de l'invention.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de synthèse du (Z)-3,5,4'-triméthoxystilbène, caractérisé en ce qu'il consiste essentiellement à exposer un échantillon d'isomère (E)-3,5,4'-triméthoxystilbène (5) mis en solution dans un solvant adapté à une lumière ultraviolette de longueur d'onde culminante comprise entre 200 nm et 400 nm, ce pendant une durée d'exposition comprise entre 1 heure et 2 heures pour une quantité d'isomère (E) de 10" mole et, le cas échéant, à évaporer ledit solvant afin de recueillir l'isomère (Z) recherché.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la longueur d'onde culminante de la lumière ultraviolette choisie est préférentiellement de 254 nm.
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que la durée d'irradiation est préférentiellement d'une heure pour 10"2 mole d'isomère (E).
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le solvant utilisé est préférentiellement l'éthanol.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l'isomère (E) utilisé est obtenu par préparation d'un halogénure de 4-méthoxybenzyle, transformation dudit halogénure en phosphonate, parallèlement, l'acide 3,5-dihydroxybenzoïque est transformé en 3,5 diméthoxybenzoate de méthyle (2), puis en alcool 3,5- diméthoxybenzylique (3), oxydation dudit alcool en aldéhyde correspondant et enfin transformation du 3,5-diméthoxybenzaldéhyde (4) en isomère (E)-3,5,4'-triméthoxystilbène (5) par réaction avec ledit phosphonate.
6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que l 'halogénure de 4-méthoxybenzyle est préférentiellement le bromure de 4- méthoxybenz le (1).
7. Procédé selon la revendication 5 ou 6, caractérisé en ce que le 3,5-diméthoxybenzaldéhyde (4) est obtenu par adjonction, selon la méthode de Corey, de dichromate de pyridinium à l'alcool 3,5- diméthoxybenzylique (3).
8. Composé susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'il s'agit du (Z)- 3 , 5 ,4 '-triméthoxy stilbène .
9. Composé selon la revendication 8 pour utilisation comme médicament.
10. Utilisation du composé selon la revendication 8 ou 9 pour la préparation d'un médicament destiné à traiter ou à prévenir une maladie impliquant une prolifération ou croissance cellulaire anormale, telle que le cancer.
11. Utilisation selon la revendication 10, caractérisée en ce que le (Z)-3,5,4'-triméthoxystilbène provoque une mort cellulaire pro- apoptotique dans les lignées cellulaires lymphoïdes.
12. Utilisation du composé selon la revendication 8 ou 9 pour la préparation d'un médicament présentant une action de dépolymérisation du réseau microtubulaire de cellules humaines ou animales vivantes.
13. Utilisation du composé selon la revendication 12, caractérisée en ce que le (Z)-3,5,4'-triméthoxystilbène se fixe sur la tubuline au moins partiellement sur le site de la colchicine.
14. Utilisation du composé selon la revendication 8 ou 9 pour la préparation d'un médicament présentant une action d'inhibition de la synthèse polyaminique de cellules cancéreuses humaines ou animales vivantes.
15. Utilisation du composé selon la revendication 8 ou 9 pour la préparation d'un médicament présentant une action de blocage du cycle cellulaire, en particulier du cycle cellulaire de cellules cancéreuses humaines ou animales vivantes.
16. Utilisation du composé selon la revendication 15, caractérisée en ce que le blocage du cycle cellulaire se fait au niveau de la phase G2/M.
17. Utilisation du composé selon la revendication 16, caractérisée en ce que ledit blocage du cycle cellulaire est irréversible.
18. Utilisation du composé selon la revendication 8 ou 9 pour la préparation d'un médicament destiné à traiter ou à prévenir des pathologies hypeφrolifératives, en particulier d'états inflammatoires, des maladies infectieuses et/ou parasitaires telles que le paludisme.
19. Utilisation du composé selon la revendication 8 ou 9 pour la préparation d'un médicament destiné à traiter ou à prévenir la mucoviscidose.
20. Utilisation du composé selon la revendication 8 ou 9 comme agent photoprotecteur, en particulier pour la protection contre les rayons UV-A et/ou UV-B.
21. Médicament caractérisé en ce qu'il comprend, à titre de principe actif, au moins un composé selon la revendication 8 ou 9.
22. Composition cosmétique à propriété photoprotectrice, caractérisée en ce qu'elle comprend, à titre de principe actif, au moins un composé selon la revendication 8.
23. Composition selon la revendication 22, caractérisée en ce que le composé actif est activé par la lumière.
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