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WO2003018730A1 - Composition cosmetique comprenant une huile essentielle extraite d'helichrysum italicum - Google Patents

Composition cosmetique comprenant une huile essentielle extraite d'helichrysum italicum Download PDF

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WO2003018730A1
WO2003018730A1 PCT/FR2002/002954 FR0202954W WO03018730A1 WO 2003018730 A1 WO2003018730 A1 WO 2003018730A1 FR 0202954 W FR0202954 W FR 0202954W WO 03018730 A1 WO03018730 A1 WO 03018730A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
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essential oil
skin
cosmetic composition
collagen
composition according
Prior art date
Application number
PCT/FR2002/002954
Other languages
English (en)
Inventor
Yves Millou
Katia Fontes
Cécile TOUREL
Original Assignee
L'occitane
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by L'occitane filed Critical L'occitane
Publication of WO2003018730A1 publication Critical patent/WO2003018730A1/fr
Priority to US10/785,237 priority Critical patent/US7666454B2/en

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    • A61K2800/413—Nanosized, i.e. having sizes below 100 nm

Definitions

  • the subject of the present invention is an essential oil extracted from Helichrysum italicum, its preparation and the cosmetic and dermatological compositions containing it.
  • flavonoids have nothing to do with neryl acetate.
  • the essential oil of Helichrysum italicum has antimicrobial properties (Chir ina NN et al., CAS, vol. 81, no. 9, September 2, 1994) and can be used in antiseptic compositions to promote wound healing (US Patent 5,785,972)
  • the work carried out by the Applicant in the context of the present invention concerned the preparation of the essential oil extracted by hydrodistillation or at using an extraction fluid, preferably in a super critical or close state, from the plant material of flowering tops, from a plant of the asteraceae family: Helichrysum italicum serotinum variety also called Helichrysum angustifolium DC
  • the subject of the invention is therefore a cosmetic composition, in particular anti-wrinkle or anti-aging or moisturizing, comprising an essential oil extracted from the tops flowers of Helichrysum italicum, more particularly of the serotinum variety also called Helichrysum angustifolium DC
  • the composition according to the invention is very particularly intended for the care of the face and the body.
  • the composition of the invention is useful for caring for the skin, it is of particular interest for combating aging of the skin (anti-aging) and in particular for treating or preventing wrinkles, for moisturizing or protecting the skin. harmful effects of the environment such as the sun (solar composition).
  • the essential oil is obtained by hydrodistillation or using an extraction fluid preferably in the super critical or near state.
  • neryl acetate The composition of the essential oil of Helichrysum italicum from Corsica is very original. Its main constituent, neryl acetate, is in high proportion, from 40 to 50% on average and up to 70% in the mountains of Balagne, region located north-west of Corsica. It should be noted that neryl acetate is in high proportion when the flowering tops are distilled; when the whole plant is distilled, the rate drops to around 5%.
  • the invention relates to the non-therapeutic use of the essential oil of helichrysum italicum as defined above, in a cosmetic composition for caring for the skin, in particular by combating wrinkles and / or by hydrating the skin. and more generally by fighting against the effects of aging.
  • the invention relates to the use of essential oil of helichrysum italicum as a versatile anti-radical agent for the preparation of a cosmetic or dermatological composition for caring for the skin, in particular by fighting against wrinkles and / or by hydrating the skin and more generally by fighting against the effects of aging.
  • the essential oil, its use and the compositions containing it have remarkable properties for: - moisturizing the skin;
  • compositions according to the invention comprise an effective amount of said oil to obtain the anti-radical, pro-collagen I and VEGF effects demonstrated. This amount represents from 0.1 to 5%, preferably from 0.1 to 2.1% by weight of said oil relative to the weight of the composition.
  • the cosmetic and dermatological compositions according to the invention can comprise other active agents such as for example without limitation: natural perhydrosqualene, sucroesters, borage oil, evening primrose oil, grape seed oil, vitamin A, vitamin E, allantoin .
  • the cosmetic and dermatological compositions according to the invention generally also include one or more formulating agents, such as surfactants, preserving agents, solubilizing agents, gelling agents, non-vegetable fatty additives, propylene glycol, sorbitol, glycerol, triethanolamine, perfume bases, water in sufficient quantity for 100.
  • formulating agents such as surfactants, preserving agents, solubilizing agents, gelling agents, non-vegetable fatty additives, propylene glycol, sorbitol, glycerol, triethanolamine, perfume bases, water in sufficient quantity for 100.
  • compositions according to the invention can be in any form known to a person skilled in the art in the field of cosmetics and dermatology, such as, for example, a cream, a milk, a lotion, a gel, a mask, without no particular galenical restriction other than those of compatibility with the oil of the invention and for application to the skin.
  • the oil according to the invention can be free or included in delayed-release nanospheres so as to create a persistence effect.
  • nanospheres mention may be made of spherulites or those described in international patent application O00 / 35577.
  • the subject of the invention is a cosmetic care method consisting in applying to the skin an adequate amount of the above composition.
  • Other advantages and characteristics of the invention will appear from the following examples concerning the preparation and the properties of the essential oil of Helichrysum angustifolium DC
  • the extraction fluids are led into a cooling coil.
  • the final separation of the extraction fluids and the components of the essential oils is carried out at atmospheric pressure by density difference. This technique has often been described in the specialized literature.
  • the hydroxyl radical is a very reactive molecule whose production is activated by the various stresses experienced by the skin (pollution, UV, temperature variations, etc.). It is responsible for numerous damages in the cell and in particular for the degradation of membranes by the phenomenon of lipid peroxidation.
  • the objective of the present study was to assess the anti-free radical power of a cosmetic product by the in vitro method of conjugated dienes.
  • This method makes it possible to test the protective action of the product on liposomes (membrane analogues) subjected to an attack of hydroxyl radicals (OH).
  • antioxidants are therefore measured by their capacity to prevent the peroxidation of polyunsaturated fatty acids contained in liposomes (in vitro model which comes closest to reality in vivo).
  • This peroxidation is characterized by an absorption peak at 233 nm.
  • the method and protocol used are for example described in the literature.
  • an essential oil of lavender inhibits lipid peroxidation by 19% + 2%.
  • This anti-radical activity is essential in the fight against accelerated aging.
  • the preferred targets for free radicals are the lipids of cell membranes. By attacking them, they disrupt their meticulous organization, the membrane loses its fluidity and its cohesion.
  • connective tissue consisting mainly of collagen, is also affected, which accelerates aging.
  • An atom is a set of elements in balance, electrically neutral.
  • a free radical is an atom having a single electron giving it a very high reactivity in the search for another electron in order to find a stable state.
  • free radicals are very active and induce significant reaction modifications within the cell, modifications which can reach the DNA, the amino acids. They depolymerize the glucoprotein constituents of the fundamental substance such as hyaluronic acid.
  • the animal or plant cell protects itself against oxidizing agents thanks to enzymatic systems and by natural antioxidants.
  • Helichrysum italicum essential oil proves to be an effective natural antioxidant.
  • Example III Study of the biomechanical properties of the skin with the composition of Example III. Twenty users were contacted for daily application for four weeks.
  • Example III ensures good skin firmness.
  • the parameter RA Average roughness decreases by - 8.9%, which translates to a smoothing of the skin, which is a hydrating effect.
  • Demineralized water Q.S. A study of the skin relief by the imprint method was carried out. The experiments were carried out on 20 volunteer subjects. Any application of cosmetics or other topical products was stopped 48 hours before the start of the experiment. The product was applied every morning for 4 weeks and the following parameters were evaluated:
  • Example VI ensures good skin firmness.
  • the parameter RA Average roughness decreases by - 8.9%, which translates to a smoothing of the skin, which is a hydrating effect.
  • Dermis fibers include collagen fibers and elastic fibers. They quantitatively represent the most important structural proteins of the dermis, respectively 75% and 5% of their dry weight. Their relative proportion and their arrangement are different according to the superficial or deep zones of the dermis.
  • Fibroblasts Fibroblasts are responsible for the synthesis and maintenance of extracellular material. These are cells of mesenchymal origin, which synthesize collagen, elastin, the fundamental substance and structural glycoproteins.
  • Collagens form a very large family. These are molecules of the extracellular matrix composed of three polypeptide chains carrying the repetition of three amino acids: -Gly-X-Y, where X and Y are often prolines or hydroxyprolines.
  • the collagen fibers of the dermis consist respectively of collagen I and collagen III, around an axis composed of collagen V. These collagens belong to the group of fibrillar collagens. In adults, collagen I is on average six times more abundant than collagen III.
  • the fibroblast is a key cell of the connective tissue which is involved in the formation and stabilization of elastic fibers, but also in their dystrophy and their lysis. During aging, the fibroblast decreases its activity and this resting cell is called a fibrocyte. It becomes globular with a decrease in its cytoplasm and rarefaction of its endoplasmic reticulum, the vesicles of which are very dispersed. This cell is no longer in contact with collagen. 2) Principle of the study.
  • the experimental model chosen consists of a culture of normal human fibroblasts up to confluence.
  • the cells are incubated with the composition of Example III at 0.05% (concentration found to be non-cytotoxic for cells in the MTT test).
  • ELISA method Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay
  • fibroblast cultures were established by the explant method from samples of healthy Caucasian skin (abdominal plasty).
  • the fibroblasts are cultured to confluence, at 37 ° C. in a MEM (Minimum Essential Medium) medium containing 2 mM of L-Glutamine and 10% of fetal calf serum in an atmosphere saturated with humidity with 5% of CO 2.
  • MEM Minimum Essential Medium
  • the cells are seeded in 96-well microplates (Falcon) at 10 4 cells per well in the above-mentioned medium . After 24 hours, this medium is replaced, for a 48-hour incubation, by the same medium without serum containing 0.15 mM of sodium ascorbate (incubation medium) with or without the complex of active agents to be tested.
  • fibroblasts One type of fibroblast was chosen for the study. These are fibroblasts on the 4th pass or subculturing of culture, representing cells with normal characteristics (spindle or star appearance, good metabolic activity, good spreading capacity, etc. ).
  • the amount of type I collagen secreted into the medium after incubation with or without the active complex was determined using an ELISA test. This method makes it possible to detect certain non-radioactive molecules at very low doses.
  • a direct method was chosen consisting of the absorption of the antigen (collagen type I) in a solid phase (plastic of a microtiter plate reserved for 1 ELISA).
  • the incubation medium is collected and transferred to the wells of a microtiter plate. An incubation of 24 hours at + 4 ° C allows the adhesion of collagen to plastic. The plate is then rinsed with PBS (Phosphate Buffer Saline). After 24 hours of incubation at + 4 ° C with albumin serum (2% in PBS) to avoid non-specific antibody-plastic bonds, anti-collagen I mouse antibodies (sigma) (dilution 1: 2000) conjugated to a alkaline phosphatase (2 hours at RT), which in the presence of paranitrophenyl phosphate, will produce absorbent paranitrophenol at 405 nm (1 hour at RT). The optical densities obtained are converted into ng of collagen using a calibration curve established under the same experimental conditions with type I collagen.
  • PBS Phosphate Buffer Saline
  • Example III used at 0.05% in the culture medium allows the fibroblasts to synthesize up to 6 times more type I collagen compared to the control (culture medium alone).
  • Example III initiates and energizes the synthesis programs of one of the majority components of the extracellular matrix of the dermis, the collagen of type I. It therefore acts as an excellent "booster" for the reorganization of collagen fibers.
  • Example III makes it possible to improve the tone of the skin.
  • Angiogenesis is a fundamental process by which new blood vessels are formed. A large number of events are involved, including: the proteolytic degradation of the extracellular matrix
  • VEGF Vascular Endothelial Growth Factor
  • VEGF Vascular Endothelial Growth Factor
  • monocytes and osteoblasts a factor of monocytes and osteoblasts.
  • Factor for growth of the vascular endothelium it is a factor of vascular proliferation, of production of new vessels, which allows revascularization.
  • the in vitro model used for this study is the AngioKit kit (Biopredic - ref. ZHA-1000- lot n ° 25173T) which approaches a more global vision of angiogenesis.
  • human endothelial cells are seeded in a specific medium in coculture with another type of human cells.
  • the endothelial cells form small islets. They then begin to proliferate and then enter a phase of migration which leads to the formation of structures in the form of filamentous tubules in the matrix.
  • the established connections form a network of anastomosed tubules.
  • the coloring of the tubules is obtained by specific labeling of the CD 31 surface antigen (PECAM-1), which is expressed by endothelial cells.
  • PECAM-1 CD 31 surface antigen
  • test is validated by the coloring of the tubules and by verification of the inhibitory and activating action of 2 pharmacological compounds known to act on
  • angiogenesis The action on angiogenesis of the active ingredients tested is evaluated by quantitative image analysis.
  • the cells are cultured in a 24-well plate, in an incubator at 37 ° C. in a humid atmosphere containing 5% of CO 2. On the 1st day of the experiment, microscopic observation shows the cells at the initial stage of growth with a few small islets of endothelial cells (photo of the figure
  • Negative control SURAMINE, agent inhibiting the formation of tubules - final concentration: 20 ⁇ M - Positive control: VEGF, activator of angiogenesis - final concentration: 2 ng / ml
  • Example III This composition of essential oils not being miscible in the culture medium, it is dissolved in absolute ethanol and tested at 3 concentrations (the non-cytotoxic nature of which has been checked beforehand by 24H contact on normal human fibroblasts): 0.005% - 0.01% - 0.05% (v / v) - Solvent control: 1 ethanol can have effects on angiogenesis, it is tested at the final concentration required for solubilization of the composition of essential oils: 0.1% (v / v).
  • the cells are fixed and stained: after rinsing with PBS buffer, the cells are fixed in a solution of 70% ethanol cooled to -20 ° C for 30 minutes. The cells are then incubated for 1 hour at 37 ° C. with the anti-human CD-31 antibody ZIS -3090 (TCS Cell orks). After washing, a second one hour incubation at 37 ° C. is carried out with an anti-mouse IgG antibody conjugated with alkaline phosphatase. After rinsing, the addition of BCIP / NBT substrate causes the tubules to dark purple color after an incubation of 10 to 15 minutes.
  • the evaluation of the angiogenic power of the test compound is quantified by image analysis (OLYMPUS 1X70 Analysis Auto system) by measuring the length of the developed tubules (in ⁇ m) and the number of junctions established within the network anastomosing. The results correspond to the average values obtained by analyzing 8 images for each condition. 3) Results.
  • FIG. 3 presents for each condition an image taken on the 10th day of experimentation, of the anastomosed tubular network newly formed after fixation and staining.
  • the angiogenic power of the composition of Example III is evaluated by analyzing two criteria: the length of the tubular network and the number of junctions present in it.
  • FIG. 4 presents the results of the quantitative analysis relating to the length of the newly formed tubules.
  • Example III shows a slight stimulating effect as to the length of the tubular network formed compared to the solvent condition. It rises respectively by 6% at the 0.005% concentration, by 11% at the 0.01% concentration and by 6% for the 0.05% concentration. These variations are not statistically significant, however.
  • FIG. 5 presents the results of the quantitative analysis concerning the number of junctions established in the tubular network.
  • the number of junctions is reduced by a factor of 5.7 compared to the control.
  • VEGF it is increased by a factor of 1.7.
  • the solvent ethanol also interacts by reducing by a factor of 2 the number of junctions present in the network.
  • Example III In the presence of the composition of Example III, a large increase in the number of junctions is observed for each of the concentrations compared to the solvent condition: increase by a factor of 1.5 at the concentration 0.005%, by a factor 2 at 0.01% concentration, by a factor of 1.6 at 0.05% concentration. It should be noted that these stimulation effects have a near or even greater intensity than those obtained with the positive reference (VEGF).
  • VEGF positive reference
  • Example III does not inhibit angiogenesis, on the contrary it Induces a stimulation of a factor 2 of the number of anastomoses effect comparable if not superior to VEGF. It therefore exerts a stimulating role on one of the essential parameters of angiogenesis.

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Abstract

La présente invention concerne une composition cosmétique, notamment anti-rides ou anti-âge ou hydratante, comprenant une huile essentielle extraite des sommités fleuries d'Helichrysum italicum. Ladite composition est tout particulièrement destinée aux soins du corps et du visage.

Description

COMPOSITION COSMETIQUE COMPRENANT UNE HUILE ESSENTIELLE EXTRAITE D'HELICHRYSUM ITALICUM
La présente invention a pour objet une huile essentielle extraite Helichrysum italicum, sa préparation et les compositions cosmétiques et dermatologiques la contenant .
Il existe environ 500 espèces d' hélichryses . Très polymorphes, il est difficile de les distinguer les unes des autres. Elles sont encore très mal connues et l'extraction de l'essence par distillation est peu courante .
Il a toutefois déjà été rapporté dans l'art antérieur la préparation d'une huile essentielle d'Helichrysum italicum comprenant de l'acétate de néryle (28,9 %) (Satta M. et al., CAS, vol. 132, no.17, 24 Avril 2000) .
Il a par ailleurs été décrit l'isolement de flavonoides d'Helichrysum italicum et leur activité de protection vis-à-vis du processus de dégénération de la peau (Maffei Facino R. et al., CAS, vol . 115, no. 1991) . Mais les flavonoïdes n'ont rien à voir avec l'acétate de néryle .
Il a enfin été indiqué que l'huile essentielle d'Helichrysum italicum présente des propriétés antimicrobiennes (Chir ina N. N. et al., CAS, vol. 81, no. 9, 2 Septembre 1994) et peut être utilisée dans des compositions antiseptiques pour favoriser la cicatrisation (brevet US 5 785 972) Les travaux réalisés par la Demanderesse dans le cadre de la présente invention ont concerné la préparation de l'huile essentielle extraite par hydrodistillation ou à l'aide d'un fluide d'extraction de préférence à l'état super critique ou proche, de la matière végétale des sommités fleuries, d'une plante de la famille des astéracées : Helichrysum italicum variété serotinum aussi nommée Helichrysum angustifolium D.C.
La Demanderesse a maintenant mis en évidence les propriétés cosmétiques et dermatologiques remarquables d'une huile essentielle d'Helichrysum italicum. En effet, l'acétate de néryle présent à fort pourcentage dans l'huile essentielle d' helichrysum italicum, lui confère des propriétés très particulières dans ces domaines :
- activité anti-radicalaire très élevée ;
- multiplication très significative de la production de collagène I, de l'ordre de 6 fois ; - augmentation de la production de VEGF de l'ordre de 2 fois ;
- accroissement des échanges cellulaires ;
- activation de la micro-circulation cutanée ayant pour corollaire de faciliter l'élimination des déchets, donc revitaliser les cellules et dynamiser la biologie cutanée ; propriétés décongestionnantes et protectrices permettant de renforcer les équilibres et les défenses au niveau de la peau ; - action antiseptique et dermopurifiante contribuant à assainir l'environnement cellulaire.
L'invention a donc pour objet une composition cosmétique, notamment anti-rides ou anti-age ou hydratante, comprenant une huile essentielle extraite des sommités fleuries d'Helichrysum italicum, plus particulièrement de la variété serotinum aussi nommée Helichrysum angustifolium D.C. La composition selon l'invention est tout particulièrement destiné aux soins du visage et du corps. La composition de l'invention est utile pour le soin de la peau, elle présente un intérêt tout particulier pour lutter contre le vieillissement de la peau (anti-age) et notamment pour traiter ou prévenir les rides, pour hydrater la peau ou la protéger des effets néfastes de l'environnement comme le soleil (composition solaire).
Avantageusement, l'huile essentielle est obtenue par hydrodistillation ou à l'aide d'un fluide d'extraction de préférence à l'état super critique ou proche.
La composition de l'huile essentielle d'Helichrysum italicum de Corse est très originale. Son constituant principal, l'acétate de néryle, y est en forte proportion, de 40 à 50 % en moyenne et jusqu'à 70 % dans les monts de la Balagne, région située au nord-ouest de la Corse. Il est à remarquer que l'acétate de néryle est en forte proportion lorsqu'on distille les sommités fleuries ; lorsqu'on distille la plante entière, le taux tombe à 5 % environ.
Tout préfèrent iellement , l'invention concerne l'utilisation non thérapeutique de l'huile essentielle d' helichrysum italicum comme définie précédemment, dans une composition cosmétique pour le soin de la peau, notamment en luttant contre les rides et/ou en hydratant la peau et plus généralement en luttant contre les effets du vieillissement .
Plus particulièrement, l'invention se rapporte à l'utilisation de l'huile essentielle d' helichrysum italicum comme agent antiradicalaire polyvalent pour la préparation d'une composition cosmétique ou dermatologique pour le soin de la peau, notamment en luttant contre les rides et/ou en hydratant la peau et plus généralement en luttant contre les effets du vieillissement.
Les travaux réalisés par la Demanderesse dans le cadre de l'invention ont également permis de mettre en évidence la capacité de cette huile essentielle à augmenter la production de collagène I et de VEGF ce qui s'est avéré particulièrement utile pour lutter contre les rides et plus généralement contre le vieillissement de la peau.
En effet, comme indiqué précédemment, l'huile essentielle, son utilisation et les compositions la contenant présente des propriétés remarquables pour : - hydrater la peau ;
- accroître les échanges cellulaires ; activer la micro-circulation cutanée et ainsi faciliter l'élimination des déchets et revitaliser les cellules ; - décongestionner, protéger et ainsi renforcer les équilibres et les défenses au niveau de la peau ;
- assainir l'environnement cellulaire.
Les compositions selon l'invention comprennent une quantité efficace de ladite huile pour obtenir les effets anti-radicalaires, pro collagène I et VEGF mis en évidence. Cette quantité représente de 0,1 à 5%, de préférence de 0,1 à 2,1% en poids de ladite huile par rapport au poids de la composition. Les compositions cosmétiques et dermatologiques selon l'invention peuvent comprendre d'autres actifs comme par exemple à titre non limitatif : perhydrosqualène naturel, sucroesters, huile de bourrache, huile d'onagre, huile de pépins de raisins, vitamine A, vitamine E, allantoïne.
Les compositions cosmétiques et dermatologiques selon l'invention comprennent généralement aussi un ou plusieurs agents de formulation, comme des agents tensioactifs, des agents conservateurs, des agents solubilisants, des agents gélifiants, des additifs gras non végétaux, du propylene glycol, du sorbitol, du glycérol, de la triéthanolamine, des bases de parfum, de l'eau en quantité suffisante pour 100.
Les compositions selon 1 ' invention peuvent se présenter sous toute forme connue de l'homme du métier dans le domaine de la cosmétique et de la dermatologie, comme par exemple, une crème, un lait, une lotion, un gel, un masque, sans aucune restriction galénique particulière autre que celles de la compatibilité avec l'huile de l'invention et pour l'application sur la peau.
L'huile selon l'invention peut être libre ou incluse dans des nanosphères à libération retardée de façon à créer un effet de rémanence. A titre d'exemples de telles nanosphères, on peut citer les sphérulites ou celles décrites dans la demande de brevet internationale O00/35577.
Ainsi, l'invention a pour objet une méthode de soin cosmétique consistant à appliquer sur la peau une quantité adéquate de la composition ci-dessus. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront des exemples qui suivent concernant la préparation et les propriétés de l'huile essentielle d'Helichrysum angustifolium D.C.
I - Préparation de l'huile essentielle d'Helichrysum angustifolium D.C.
L'extraction de l'huile essentielle pour ce type de végétal s'effectue classiquement à l'aide d'un générateur de vapeur d'où le fluide vaporisé est conduit par une tubulure dans le fond d'une chambre d'extraction dans laquelle sont enfermés les végétaux. Cette installation est reliée à un dispositif de maintien de pression régulée.
Les fluides d'extraction sont conduits dans un serpentin de refroidissement. La séparation finale des fluides d'extraction et des composants des huiles essentielles s'effectue à la pression atmosphérique par différence de densité. Cette technique a été souvent décrite dans la littérature spécialisée.
II - Pouvoir anti-radicalaire de l'huile essentielle d'Helichrysum angustifolium D.C.
Le radical hydroxyle est une molécule très réactive dont la production est activée par les différents stress subits par la peau (pollution, UV, variations de température, etc.) . Il est responsable de nombreux dégâts dans la cellule et notamment de la dégradation des membranes par le phénomène de péroxydation lipidique. L'objectif de la présente étude a été d'apprécier le pouvoir anti-radicalaire d'un produit cosmétique par la méthode in vitro des diènes conjugués.
Cette méthode permet de tester l'action protectrice du produit sur des liposomes (analogues de membrane) soumis à une attaque de radicaux hydroxyles (0H-)
1) Principe.
L'action des radicaux libres sur les acides gras polyinsaturés des membranes est une peroxydation qui conduit à la formation de diènes conjugués absorbant à 233 nm.
L'activité des antioxydants est donc dosée par leur capacité à empêcher la peroxydation d'acides gras polyinsaturés contenus dans des liposomes (modèle in vitro se rapprochant le plus de la réalité in vivo) .
Cette peroxydation est caractérisée par un pic d'absorption à 233 nm. La méthode et le protocole utilisés sont par exemple décrits dans la littérature.
2) Résultats . Au terme de l'essai, il apparaît que le produit Huile essentielle d'Helichrysum italicum inhibe la peroxydation lipidique de 82 % + 2 % dans les conditions expérimentales.
Ce résultat est remarquablement satisfaisant.
Testée dans les mêmes conditions opératoires une huile essentielle de lavande inhibe la peroxydation lipidique de 19 % + 2 %.
Cette activité anti-radicalaire est essentielle dans la lutte contre le vieillissement accéléré.
Les cibles privilégiées des radicaux libres sont les lipides des membranes cellulaires. En les agressant, ils viennent perturber leur minutieuse organisation, la membrane perd de sa fluidité et de sa cohésion.
A la longue, elle finit par se fissurer et ne peut plus jouer son rôle de barrière protectrice. Le tissu conjonctif, constitué essentiellement de collagène, se trouve également touché, ce qui accélère le vieillissement.
Pour mieux comprendre ce phénomène du vieillissement accéléré, il convient de rappeler deux notions simples :
- Un atome est un ensemble d'éléments en équilibre, électriquement neutre.
- Un radical libre est un atome possédant un électron célibataire lui donnant une très grande réactivité dans la recherche d'un autre électron afin de retrouver un état stable. Dans la recherche d'un état stable, les radicaux libres sont très actifs et induisent d'importantes modifications réactionnelles au sein de la cellule, modifications pouvant atteindre l'ADN, les acides aminés. Ils dépolymérisent les constituants glucoprotéiniques de la substance fondamentale comme l'acide hyaluronique .
Les radicaux libres provoquent de profondes altérations des lipides, des protéines et des autres composants des membranes cellulaires.
Les agressions des membranes cellulaires, dues au processus de peroxydation, augmentent avec l'âge.
Les travaux étudiant l'interférence de l'auto- oxydation des tissus cérébraux et rénaux de 24 espèces animales montrent l'existence d'une relation directe entre la longévité de chaque espèce et le potentiel de production des peroxydes et des radicaux libres. Ces travaux montrent également toute l'importance des anti-oxydants dans ce processus de longévité.
En effet, la cellule animale ou végétale se protège contre les agents d'oxydation grâce à des systèmes enzymatiques et par des anti-oxydants naturels.
L'huile essentielle d'Helichrysum italicum se révèle être un efficace anti-oxydant naturel.
III - Exemple de composition pour le visage. Pour mettre en avant l'activité anti-rides, la formule suivante d'un produit pour le visage contenant 0,7 % d'huile essentielle d'Helichrysum italicum a été préparée :
Huile essentielle Helichrysum italicum 0,7 Huile de pépins de raisin 80,02 Huile de Bourrache 1
Perhydrosqualène naturel 18
Vitamine E naturelle 0,2 Extrait de romarin 0,05
Huile essentielle Géranium 0,03 L'étude du relief cutané a été réalisée par la méthode des empreintes. Le test a été réalisé sur 20 sujets volontaires. Toute application de cosmétiques ou autres produits topiques a été arrêtée 48 heures avant le début de l'expérimentation. On a procédé chaque matin à une application du produit durant 4 semaines et l'on a évalué les paramètres suivants : . Surface totale ridée :
Ce paramètre donne une information sur la surface totale des rides (mm.2)
Moyenne T 0 = 4,571 mm.2 Moyenne T 4s = 2,843 mm2 Soit : - 37,8% . Nombre de rides : Moyenne T 0 = 61,3 Moyenne T 4s = 52,7 Soit : - 14 %
. Profondeur moyenne des rides (en tenant compte du nombre de rides disparues après traitement) : - 19,8 %
Ces trois paramètres sont très satisfaisants et montrent la propriété anti-rides remarquable des compositions selon l'invention.
IV - Étude des propriétés biomécanique de la peau avec la composition de l'exemple III. Vingt utilisatrices ont été sollicitées pour une application quotidienne durant quatre semaines.
Résultat : UR/UB = R5 : fermeté à une contrainte : + 14,7% + 0,11
La composition de l'exemple III ci-dessus assure une bonne fermeté cutanée.
V - Évaluation de l'hydratation par la méthode des empreintes avec la composition de l'exemple III.
Vingt utilisatrices ont été sollicitées pour une application quotidienne durant quatre semaines. Résultat : Le paramètre RA = Rugosité moyenne diminue de - 8,9 %, ce qui traduit un lissage cutané, soit un effet hydratant .
VI - Encapsulation de l'huile essentielle helichrysum italicum dans des nanosphères.
Pour optimiser l'activité de l'huile essentielle helichrysum italicum, celle-ci a été incorporée dans des nanosphères. Cette méthode présente l'avantage d'augmenter la biodisponibilité des actifs. La libération contrôlée des actifs augmente la chronodisponibilité au niveau des cellules cutanées. Pratiquement, l'huile essentielle d' helichrysum italicum a été encapsulée dans des Sphérulites. Les sphérulites sont des vésicules multilamellaires d'environ un micron qui imitent la structure d'un oignon. La centaine de membranes qui les composent est formée d'une alternance de bicouches contenant des sucroester et un taux d'huile essentielle optimisé. Les sphérulites grâce à une libération lente et contrôlée de l'actif permettent de réduire le pourcentage d'huile essentielle tout en gardant la même efficacité. Le bénéfice est une tolérance très améliorée, une hypoallergénicité, une activation de la micro-circulation. La formule de crème pour le visage ci-dessous a été élaborée :
Sphérulites Helichrysum italicum 2
Alcool gras 4
Huile de pépins de raisin 5 Glycérol 5 Extrait de romarin 0,05 Vitamine A 0,2
Vitamine E naturelle 0,2 Agents tensioactifs 5
Agents conservateurs 0 , 9
Base parfumée 0,5
Eau déminéralisée Q.S. Une étude du relief cutané par la méthode des empreintes a été réalisée. Les expérimentations ont été menées sur 20 sujets volontaires. Toute application de cosmétiques ou autres produits topiques a été arrêtée 48 heures avant le début de l'expérimentation. On a procédé chaque matin à une application du produit durant 4 semaines et 1 ' on a évalué les paramètres suivants :
- Surface totale ridée :
Ce paramètre donne une information sur la surface totale des rides (mm2) . Moyenne T 0 = 4,571 mm2 Moyenne T 4s = 2,843 mm2 Soit : - 37,8%
- Nombre de rides : Moyenne T 0 = 61,3 Moyenne T 4s = 52,7 Soit : - 14 %
- Profondeur moyenne des rides (en tenant compte du nombre de rides disparues après traitement) :
19,8 % Ces trois paramètres sont très satisfaisants et montrent la propriété anti-rides remarquable des compositions selon l'invention.
VII - Étude des propriétés biomécanique de la peau avec la composition de l'exemple VI.
Vingt utilisatrices ont été sollicitées pour une application quotidienne durant quatre semaines.
Résultat : UR/UB = R5 : fermeté à une contrainte. + 14,7% + 0,11
La composition de l'exemple VI ci-dessus assure une bonne fermeté cutanée .
VIII - Étude des propriétés biomécanique de la peau avec la composition de l'exemple VI.
Vingt utilisatrices ont été sollicitées pour une application quotidienne durant quatre semaines.
Résultat : Le paramètre RA = Rugosité moyenne diminue de - 8,9 %, ce qui traduit un lissage cutané, soit un effet hydratant.
IX - Étude de l'effet de la composition de l'exemple III sur la synthèse de collagène de type 1.
1) Introduction . - Les fibres du derme : Les fibres du derme comprennent les fibres de collagène et les fibres élastiques. Elles représentent quantitativement les protéines de structure les plus importantes du derme, soit respectivement 75 % et 5 % de leur poids sec. Leur proportion relative et leur disposition sont différentes selon les zones superficielles ou profondes du derme. Les fibroblastes : Les fibroblastes sont responsables de la synthèse et de l'entretien du matériel extracellulaire. Ce sont des cellules d'origine mésenchymateuse, qui synthétisent le collagène, l'élastine, la substance fondamentale et les glycoprotéines de structure.
- Les fibres de collagène : Les collagènes forment une très grande famille. Ce sont des molécules de la matrice extracellulaire composées de trois chaînes polypeptidiques portant la répétition de trois acides aminés : -Gly-X-Y, où X et Y sont souvent des prolines ou des hydroxyprolines . Les fibres de collagène du derme sont constituées respectivement de collagène I et de collagène III, autour d'un axe composé du collagène V. Ces collagènes appartiennent au groupe des collagènes fibrillaires . Chez l'adulte, le collagène I est en moyenne six fois plus abondant que le collagène III.
- Collagènes et vieillissement : Le rapport collagène I /collagène III diminue au cours du vieillissement. On assiste à une augmentation exponentielle de pontages chimiques entre les fibres de collagène dus à la réaction de glycation non enzymatique de Maillard. Ce pontage chimique du collagène aboutit à une rigidification des fibres. Sa dégradation et son renouvellement sont ainsi ralentis.
- Modification des fibroblastes : Le fibroblaste est une cellule clef du tissu conjonctif qui intervient dans la formation et la stabilisation des fibres élastiques, mais aussi dans leur dystrophie et leur lyse. Lors du vieillissement, le fibroblaste diminue son activité et cette cellule au repos est appelé fibrocyte. Il devient globuleux avec diminution de son cytoplasme et raréfaction de son reticulum endoplasmique dont les vésicules sont très dispersées. Cette cellule n'est plus en contact avec le collagène. 2) Principe de l'étude.
La modification favorisant la perte d'élasticité et de fermeté de la peau du fait de la désorganisation et la raréfaction du collagène a été étudiée de façon à démontrer l'efficacité des compositions de l'invention.
Ainsi, l'activité de la composition de l'exemple II sur la sécrétion du collagène I dans le milieu de culture par les fibroblastes a été évaluée.
Le modèle expérimental retenu consiste en une culture de fibroblastes humains normaux jusqu'à confluence. Les cellules sont incubées avec la composition de l'exemple III à 0,05 % (concentration révélée non cytotoxique pour les cellules au test MTT) . Par la méthode ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay) , qui présente l'avantage d'une mise en œuvre facile, sensible et spécifique, nous dosons le collagène de type 1 au niveau du milieu de culture.
- Matériel et méthode : Dans un premier temps des cultures de fibroblastes ont été établies par la méthode des explants à partir de prélèvements de peau caucasienne saine (plastie abdominale) . Les fibroblastes sont cultivés jusqu'à confluence, à 37°C dans un milieu MEM (Minimum Essential Médium) contenant 2 mM de L-Glutamine et 10 % de sérum de veau fœtal dans une atmosphère saturée en humidité avec 5 % de C02. Puis, après décollement par une solution isotonique tamponnée pH 7.2 de trypsine à 0,1 % et d'EDTA 0,02 %, les cellules sont ensemencées dans des microplaques de 96 puits (Falcon) à 104 cellules par puits dans le milieu susnommé. Après 24 heures, ce milieu est remplacé, pour une incubation de 48 heures par le même milieu sans sérum contenant 0,15 mM d'ascorbate de sodium (milieu d'incubation) avec ou sans le complexe d'actifs à tester.
Un type de fibroblastes a été choisi pour l'étude. Il s'agit de fibroblastes au 4ème passage ou repiquage de culture, représentant des cellules ayant des caractéristiques normales (aspect fusiforme ou étoile, bonne activité métabolique, bonne capacité d'étalement, etc. ) .
- Dosage du collagène : La quantité de collagène de type I sécrétée dans le milieu après incubation avec ou sans le complexe d'actifs a été déterminée à l'aide d'un test ELISA. Cette méthode permet de détecter certaines molécules non radioactives à de très faibles doses. Une méthode directe a été choisie consistant en l'absorption de l'antigène (collagène de type I) à une phase solide (plastique d'une plaque de microtitration réservée à 1' ELISA) .
- Procédure : Le milieu d'incubation est collecté et transféré dans les puits d'une plaque de microtitration. Une incubation de 24 heures à + 4°C permet l'adhésion du collagène au plastique. La plaque est ensuite rincée au PBS (Phosphate Buffer Saline). Après 24 heures d'incubation à + 4°C avec de la sérum albumine (2% dans PBS) pour éviter les liaisons anticorps-plastique non spécifiques, des anticorps de souris anticollagène I (sigma) (dilution 1:2000) conjugués à une phosphatase alcaline (2 heures à TA) , qui en présence du phosphate de paranitrophényl , produira du paranitrophénol absorbant à 405 nm (1 heure à TA) . Les densités optiques obtenues sont converties en ng de collagène grâce à une courbe d'étalonnage établie dans les mêmes conditions expérimentales avec du collagène de type I.
3) Résultats (figure 1) .
La composition de l'exemple III utilisée à 0,05% dans le milieu de culture permet aux fibroblastes de synthétiser jusqu'à 6 fois plus de collagène de type I par rapport au témoin (milieu de culture seul) .
La composition de l'exemple III initie et dynamise les programmes de synthèse d'un des composants majoritaires de la matrice extracellulaire du derme, le collagène de type I. Il agit donc en excellent "booster" de la réorganisation des fibres de collagène.
La composition de l'exemple III permet d'améliorer la tonicité de la peau.
X - Étude de la capacité angiogène de la composition de l'exemple III.
1) Introduction.
L' angiogénèse est un processus fondamental par lequel de nouveaux vaisseaux sanguins sont formés. Un grand nombre d'événements y sont impliqués parmi lesquels : la dégradation protéolytique de la matrice extracellulaire
- la migration et la prolifération des cellules endothéliales
- la formation d'une nouvelle matrice extracellulaire la formation de tubules et d'anastomoses des vaisseaux néoformés.
Ces actions dépendent du VEGF. Le VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) est un facteur angiogenique et un mitogène pour les cellules endothéliales. C'est un facteur chimiotact ique pour les monocytes et les ostéoblastes . Facteur de croissance de 1 ' endothélium vasculaire, c'est un facteur de prolifération vasculaire, de production de nêovaisseaux, ce qui permet une revascularisation .
2) Principe de l'étude.
Les modèles in vi tro d'approche expérimentale de 1 ' angiogénèse considèrent seulement de manière individualisée les différents composants du processus d ' angiogénèse en étudiant la prolifération des cellules endothéliales ou leur migration ou encore leur capacité à s'associer en tubules lorsqu'elles sont au contact des protéines de la matrice extracellulaire. Aucun de ces modèles n'est cependant le reflet de 1 ' angiogénèse dans sa globalité .
Le modèle in vitro utilisé pour cette étude est le kit AngioKit (Biopredic - réf . ZHA-1000- lot n° 25173T) qui approche une vision plus globale de 1 ' angiogénèse .
Dans ce modèle, des cellules endothéliales humaines sont ensemencées dans un milieu spécifique en co-culture avec un autre type de cellules humaines. Dans la phase initiale, les cellules endothéliales forment de petits îlots. Ils commencent ensuite à proliférer puis entrent dans une phase de migration qui conduit à la formation de structures en forme de tubules filamenteux dans la matrice.
Au bout de 10 à 12 jours, les connexions établies forment un réseau de tubules anastomosés. La coloration des tubules est obtenue par marquage spécifique de l'antigène de surface CD 31 (PECAM-1) , qui est exprimé par les cellules endothéliales .
Le test est validé par la coloration des tubules et par vérification de l'action inhibitrice et activatrice de 2 composés pharmacologiques connus pour agir sur
1 'angiogénèse. L'action sur 1 ' angiogénèse des actifs testés est évaluée par analyse d'images quantitative.
Matériel et méthode : Les cellules sont cultivées en plaque de 24 puits, dans un incubateur à 37°C sous atmosphère humide contenant 5% de C02. Au 1er jour de l'expérimentation, l'observation microscopique montre les cellules au stade initial de croissance avec quelques petits îlots de cellules endothéliales (photo de la figure
2) . Le milieu de culture spécifique est éliminé et les cellules sont placées dans les différentes conditions de l'expérimentation :
- Témoin : milieu de culture
- Contrôle négatif : SURAMINE, agent inhibant la formation des tubules - concentration finale : 20 μM - Contrôle positif : VEGF, agent activateur de 1 ' angiogénèse - concentration finale : 2 ng/ml
- Composition de l'exemple III : Cette composition d'huiles essentielles n'étant pas miscible dans le milieu de culture, elle est solubilisée dans 1 ' éthanol absolu et testée à 3 concentrations (dont on a vérifié au préalable le caractère non cytotoxique par contact 24H sur fibroblastes humains normaux) : 0,005% - 0,01% - 0,05% (v/v) - Contrôle solvant : 1 ' éthanol pouvant avoir des effets sur 1 ' angiogénèse, il est testé à la concentration finale requise pour la solubilisation de la composition d'huiles essentielles : 0,1% (v/v).
Chaque condition est réalisée en duplicate. Chaque jour, l'observation microscopique des cellules permet de contrôler l'évolution de la formation des tubules comme montré sur la photo de la figure 2.
Les milieux sont éliminés et les conditions renouvelées au 3ème, 6ème et 9ème jour de l'expérimentation.
Au lOè e jour, les cellules sont fixées et colorées : après rinçage au tampon PBS, les cellules sont fixées dans une solution d'éthanol à 70% refroidie à -20°C pendant 30 minutes. Les cellules sont ensuite incubées 1 heure à 37°C avec l'anticorps ZIS -3090 (TCS Cell orks) anti-CD-31 humain. Après lavages, une seconde incubation d'une heure à 37°C est effectuée avec un anti-corps anti-igG de souris conjugué à la phosphatase alcaline. Après rinçage, l'ajout de substrat BCIP/NBT provoque la coloration violet foncé des tubules après une incubation de 10 à 15 minutes.
- Évaluation du pouvoir angiogène : L'évaluation du pouvoir angiogène du composé testé est quantifiée par analyse d'images (OLYMPUS 1X70 système Analysis Auto) en mesurant la longueur des tubules développés (en μm) et le nombre de jonctions établies au sein du réseau anastomosé. Les résultats correspondent aux valeurs moyennes obtenues en analysant 8 images pour chaque condition. 3) Résultats.
La figure 3 présente pour chaque condition une image prise au lOème jour d'expérimentation, du réseau tubulaire anastomosé néoformé après fixation et coloration.
L'évaluation du pouvoir angiogène de la composition de l'exemple III est réalisée par l'analyse de deux critères : la longueur du réseau tubulaire et le nombre de jonctions présentes dans celui-ci.
La figure 4 présente les résultats de l'analyse quantitative relative à la longueur des tubules néoformés.
Les résultats obtenus pour les composés pharmacologiques utilisés comme référence interne montrent en présence de suramine une inhibition de 49 % quant à la longueur du réseau tubulaire par rapport au témoin. Le VEGF a quant à lui un effet stimulateur de 54 %. Le solvant éthanol interagit également sur 1 ' angiogénèse avec un effet inhibiteur de 11 % par rapport au témoin. Les résultats obtenus avec la composition Elixir "Immortelle" seront donc calculés par rapport au témoin solvant .
La composition de l'exemple III montre un léger effet de stimulation quant à la longueur du réseau tubulaire formé par rapport à la condition solvant. Il s'élève respectivement de 6 % à la concentration 0,005 %, de 11% à la concentration 0.01 % et de 6 % pour la concentration 0,05 %. Ces variations ne sont cependant pas statistiquement significatives.
La figure 5 présente les résultats de 1 ' analyse quantitative concernant le nombre de jonctions établies dans le réseau tubulaire.
En présence de suramine, le nombre de jonctions est diminué d'un facteur 5,7 par rapport au témoin. Avec le VEGF, il est au contraire augmenté d'un facteur 1,7. Le solvant éthanol interagit également en diminuant d'un facteur 2 le nombre de jonctions présentes dans le réseau.
En présence de la composition de l'exemple III, on observe, pour chacune des concentrations une forte augmentation du nombre de jonctions par rapport à la condition solvant : augmentation d'un facteur 1,5 à la concentration 0,005%, d'un facteur 2 à la concentration 0,01%, d'un facteur 1,6 à la concentration 0,05%. Il convient de noter que ces effets de stimulation ont une intensité proche voir supérieure à ceux obtenus avec la référence positive (VEGF) .
La composition de l'Exemple III n'inhibe pas 1 ' angiogénèse , au contraire elle Induit une stimulation d'un facteur 2 du nombre d'anastomoses effet comparable sinon supérieur au VEGF. Elle exerce donc un rôle dynamisant sur un des paramètres essentiels de 1 ' angiogénèse .

Claims

REVENDICATIONS
1) Composition cosmétique, notamment anti-rides ou anti-age ou hydratante, caractérisée en ce qu'elle comprend une huile essentielle extraite des sommités fleuries d'Helichrysum italicum.
2) Composition cosmétique selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est destinée aux soins du corps et du visage.
3) Composition cosmétique selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que l'huile essentielle est obtenue par hydrodistillation ou à l'aide d'un fluide d'extraction de préférence à l'état super critique ou proche.
4) Composition cosmétique selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que l'huile essentielle comprend en poids de 40 à 70 % d'acétate de néryle .
5) Composition cosmétique selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce qu'elle comprend de 0,1 à 5% et de préférence de 0,1 à 2,1% en poids de ladite huile par rapport au poids de la composition.
6) Composition cosmétique selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que l'huile essentielle est incluse dans des nanosphères à libération retardée .
7) Utilisation non thérapeutique d'une l'huile essentielle d' elichrysum italicum comme définie dans l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans une composition cosmétique pour le soin de la peau en luttant contre les rides et/ou en hydratant la peau ou plus généralement en luttant contre les effets du vieillissement.
8) Utilisation non thérapeutique d'une l'huile essentielle d'helichrysum italicum comme définie dans l'une quelconque des revendications 1 à 6, comme agent antiradicalaire polyvalent pour la préparation d'une composition cosmétique ou dermatologique pour le soin de la peau, notamment en luttant contre les rides et/ou en hydratant la peau ou plus généralement en luttant contre les effets du vieillissement.
9) Utilisation selon la revendication 8, caractérisée en ce que l'huile essentielle constitue en outre un agent capable d'augmenter la production de collagène I et de VEGF.
10) Méthode de soin cosmétique consistant à appliquer sur la peau une quantité adéquate d'une composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 6.
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