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WO2003016564A2 - Utilisation d'associations entre polymorphismes du gene sh2 et des caracteristiques de qualite de la graine pour la selection de plantes - Google Patents

Utilisation d'associations entre polymorphismes du gene sh2 et des caracteristiques de qualite de la graine pour la selection de plantes Download PDF

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WO2003016564A2
WO2003016564A2 PCT/FR2002/002898 FR0202898W WO03016564A2 WO 2003016564 A2 WO2003016564 A2 WO 2003016564A2 FR 0202898 W FR0202898 W FR 0202898W WO 03016564 A2 WO03016564 A2 WO 03016564A2
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nucleic acid
gene
sequence seq
base
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Doménica MANICACCI
Dominique De Vienne
Mathilde Causse
Jean-Louis Prioul
Pascal Touzet
Matthieu Falque
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Genoplante-Valor S.A.S.
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Definitions

  • the present invention relates to the field of the selection of plant varieties having improved agronomic characteristics, in particular phenotypic quality characteristics of improved seeds. It relates to the detection of phenotypic characteristics of improved seed quality by analysis of the polymorphism of an Sh2 gene to select plants with improved seed quality as well as to means for the implementation of this detection.
  • the grain accumulates sufficient energy reserves to allow germination of the embryo. These reserves are in the form of carbohydrate, protein or oleic reserves. In cereals, the accumulated reserves are mainly of carbohydrate and protein forms. Carbohydrate stores are largely made up of polysaccharides such as starch. Starch is made up of two distinct polysaccharide fractions, amylose and amylopectin. Amylose constitutes the minority fraction of starch, it is a chain of glucose monomers linked in ⁇ 1-4 having less than 1% of branches. Amylopectin represents the majority fraction of starch. It consists of glucose monomers linked in ⁇ 1-4 and is branched to approximately 5% with glucose monomers linked to the main chain by ⁇ 1-6 bonds. Starch represents nearly 85% of the weight of the endosperm of grains, the remaining fraction of energy reserves being essentially made up of proteins. Agronomic and nutritional importance of cereals and starch
  • Starch is the major energy storage polysaccharide in plants. It is of particular importance in cereals. Thus, starch from rice, wheat or corn constitutes the main sugar intake in food and feed. The study of grain filling processes, the selection and creation of varieties of cereals with modified starch contents constitute one of the favored axes of research concerning cereals.
  • ADP Glucose Pyrophosphorylase (AGPase) is a key enzyme in the biosynthetic pathway of polysaccharides, both in bacteria and in plants. In plants, it makes it possible to dephosphorylate glucose-1-phosphate to ADP-glucose, the constituent monomer of starch.
  • the plant AGPase has a complex structure in the form of a heterotetramer composed of two types of similar but distinct subunits.
  • the two types of subunits with a molecular weight close to 50 kDa in the endosperm, are encoded, one by the Sh2 gene for Shrunken 2, (Bhave et al., 1990) and the other by the Bt2 gene for Brittle-2, (Bae et al., 1990).
  • the genome has polymorphism.
  • the main causes of these genetic variabilities are mutations occurring during DNA replication which precedes cell multiplication. It can be the insertion or deletion of one or more nucleotides (grouped under the term indel), or a transition type substitution (substitution of a purine base by another purine base or a pyrimidine base by another pyrimidine base) or transversion (substitution of a purine base by a pyrimidine base or vice versa).
  • Polymorphic sites are thus classified into two categories depending on whether it is the substitution of a base
  • SNP single nucleotide polymorphism
  • indel Insertion-Deletion
  • the invention provides for the first time a set of means for selecting plant varieties for their improved phenotypic characteristics of seed quality, by the analysis of polymorphisms newly identified in the Sh2 gene, polymorphisms which are statistically associated with a characteristic. specific phenotypic quality of the seed, or a combination of phenotypic characteristics of the quality of the seed.
  • the subject of the invention is the use of a probe or a nucleotide primer in a process for selecting plants having improved phenotypic characteristics of seed quality, characterized in that said probe or said nucleotide primer allows the detection of '' a polymorphic base or of a polymorphic nucleotide sequence defining an allele of a polymorphic site of the Sh2 gene of sequence SEQ ID No 1, said polymorphic base or said polymorphic nucleotide sequence being contained in an acid nucleic acid included in the Sh2 gene, chosen from nucleic acids comprising a polymorphic nucleotide site associated with a characteristic or a combination of phenotypic characteristics linked to the quality of the seed, in particular the number of seeds per ear, the mass of the mature seed , the protein content of the seed, the starch content of the seed, the amylose content of the seed or the protein / starch weight ratio of the seed.
  • It also relates to a method for determining the identity of the allele of a polymorphic site within a nucleic acid derived from an Sh2 gene with a view to selecting a plant possessing improved phenotypic characteristics of seed quality. , characterized in that it comprises a step of characterizing the identity of the polymorphic base or of the polymorphic nucleotide sequence present at at least one nucleotide position of said nucleic acid corresponding to at least one of the nucleotides included in a newly polymorphic nucleotide site identified from the Sh2 gene.
  • determining the identity of the allele of a polymorphic site or of a combination of polymorphic sites makes it possible to predict the quality phenotype of the seed of the plant analyzed, without requiring direct analysis of the characters. phenotypic themselves.
  • the invention also relates to nucleotide probes and primers for determining the allelic form of a polymorphic site of the Sh2 gene, useful in particular as means for determining the identity of the polymorphic base or of the polymorphic nucleotide sequence at the associated polymorphic site to a characteristic or a combination of phenotypic characteristics of seed quality.
  • nucleic acid derived from the Sh2 gene and comprising at least one polymorphic site as defined in the present description, as well as recombinant vectors comprising such a nucleic acid.
  • Figure 1 represents the nucleotide sequence of the Sh2 gene described by Shaw and Hannah (1992), which is identical to the sequence SEQ ID No. 1 of the sequence listing.
  • the first column on the left represents the numbering in nucleotides of the sequence SEQ ID No. 1 of the sequence listing of this description.
  • the first nucleotide is numbered 1.
  • the second column on the left represents the nucleotide numbering prescribed by Shaw and Hannah (1992), which is based on the position of the nucleotide of the transcription initiation site, numbered +1.
  • the nucleotide at position 1 of the sequence SEQ ID No. 1 is the nucleotide at position -1020 according to the nomenclature of Shaw and Hannah (1992).
  • the Applicant has identified, in the sequence of the Sh2 gene, a collection of polymorphisms which it has shown that they are each associated with at least one phenotypic characteristic defining the quality of the seed of a plant.
  • the identification of these polymorphisms has made it possible to develop methods for detecting these polymorphisms from the DNA of a plant individual, plant cell, plant at the seedling stage, plant at an early stage of development or plant at the vegetative stage, making it possible to predict what are or will be the phenotypic characteristics linked to the quality of the seed or of the future seed.
  • the association between the presence of a defined allele of a polymorphic site of the Sh2 gene and at least one grain-filling character makes it possible to relate a given allele or a combination of given alleles (haplotype) and a phenotypic character. or a combination of phenotypic traits defining the quality of the seed.
  • haplotype a combination of given alleles
  • phenotypic traits defining the quality of the seed.
  • the inventors have shown that the polymorphism of the Sh2 gene is statistically associated with quality characteristics of the seed, such as:
  • the identification of particular alleles of polymorphic sites associated with the quality characteristics of the seed, in the sequence of the Sh2 gene has made it possible to define oligonucleotide sequences specific for a given allele of one or more polymorphic sites of the Sh2 gene. and to use these sequences as probes or primers to facilitate the selection of plants assisted by markers, to generate favorable allelic sequences by site-directed mutagenesis, or to clone sequences bringing a favorable agronomic character, linked to the quality of the seed , to the plant transformed with these sequences. It has also been shown according to the invention that certain polymorphisms of the Sh2 gene cause modifications in the amino acid sequence.
  • the favorable alleles identified at these polymorphisms can be used to modify the structure or activity of the AGPase enzyme.
  • the Sh2 gene used as the reference nucleotide sequence from which the various newly identified polymorphic sites according to the invention are defined is the nucleotide sequence referenced in the GenBank database under the access number M81603 and which is reproduced as the sequence SEQ ID N ° 1 of the sequence listing.
  • the Sh2 gene of sequence SEQ ID No. 1 has 7320 nucleotides in length. It has 16 exons, respectively:
  • n ° 8 from the nucleotide in position 3546 to the nucleotide in position 3639 of the sequence SEQ ID N ° 1, which corresponds to the sequence going from the nucleotide in position 2526 to the nucleotide in position 2619 of the Sh2 gene according to the nomenclature of Shaw and Hannah (1992). ;
  • the numbering used to define the position of the polymorphic nucleotide or of the polymorphic nucleotide sequence of a polymorphic site of the Sh2 gene is exclusively that described by Shaw and Hannah (1992) and which is recalled in the first column on the left the Sh2 gene sequence shown in Figure 1.
  • the polymorphism of the Sh2 gene was determined from DNA from 33 inbred corn lines, whose phenotypic characteristics related to grain quality were simultaneously analyzed.
  • polymorphic site of the Sh2 gene is meant a region of the sequence of the Sh2 gene which, in the genome of certain plant lines, more specifically in certain corn lines, differs by one or more consecutive nucleotides with respect to the corresponding region of the Sh2 gene defined by the sequence SEQ ID No. 1.
  • a polymorphic site can consist of a variation of a single nucleotide which can take two meanings, for example a base A or a base T, such a polymorphic site being then designated polymorphism SNP (for “Single Nucleotide Polymorphism”).
  • a polymorphic site can also consist of the addition or deletion of one or more consecutive nucleotides, relative to the reference sequence SEQ ID No. 1. This second type of polymorphic site is designated "indel” (for "Insertion-Deletion").
  • the polymorphic sites of the Sh2 gene characterized in the present invention are defined below. They are characterized by their nucleotide difference compared to the reference Sh2 SEQ ID N ° 1 gene sequence and whose nucleotide positions are defined according to the nomenclature of Shaw and Hannah (1992). As defined below, the polymorphic sites of the Sh2 gene are characterized by their allele, the presence of which, in the genome of a plant, is associated with the expression of a modified phenotypic character of seed quality. . (a) a nucleic acid in which the nucleotide corresponding to the nucleotide in position -921 of the Sh2 gene is a G;
  • the presence of a base C constitutes a conservative base substitution causing no change in the amino acid sequence of the corresponding SH2 polypeptide, compared to the SH2 polypeptide of sequence SEQ ID No. 52 coded by the sequence SEQ ID N ° 1.
  • the presence of a base C results in the replacement, in the sequence of the SH2 polypeptide of sequence SEQ ID No. 52, of the amino acid Leucine, coded by the sequence SEQ ID No. 1 at this position, by the amino acid Serine.
  • the characterization according to the invention of informative polymorphic sites within the sequence of the Sh2 gene has made possible the construction of various means of detection of a given allele of each of the polymorphic sites, useful in particular in selection methods of lines of plants, specifically of corn, having phenotypic characteristics of seed quality sought.
  • Such methods of selecting plant lines can be carried out at early stages of plant development, before seed formation, at a time in plant development for which it is not possible to determine the phenotypic characteristics of seed.
  • the methods implementing an analysis of the polymorphic sites of the Sh2 gene of the invention therefore have a predictive value of great technical and economic interest.
  • the subject of the invention is the use of a probe or a nucleotide primer in a process for selecting plants having improved phenotypic characteristics of seed quality, characterized in that said probe or said nucleotide primer allows the detection of 'a polymorphic base or of a polymorphic nucleotide sequence defining an allele of a polymorphic site of the Sh2 gene of sequence SEQ ID No 1, said polymorphic base or said polymorphic nucleotide sequence being contained in a nucleic acid included in a Sh2 gene, chosen from the following nucleic acids:
  • nucleic acid comprising the insertion of the sequence 5'-GTTTTTATTTA-3 'after the nucleotide corresponding to the nucleotide in position +3123 of the Sh2 gene.
  • the expression “grain quality” includes the characters influencing the quality and the quantity of the seed such as for example: the number of seeds per ear, the mass of mature seeds, the content of protein, starch, amylose and the weight ratio protein content / starch content in the seed, as well as all the complex characters including one or more of these characters.
  • One of the methods which can be used to determine the phenotype of an individual at this or these sites may consist in: i) obtaining a DNA sample from an individual, ii) identify the allele at one or more of the positions mentioned above (with reference to the positions described according to the Genbank sequence no. M81603) in the Sh2 gene, iii) predict the quality of the grain of the individual with reference to l association of the Sh2 gene polymorphism as described above with the grain quality trait.
  • the DNA sample is obtained according to conventional methods of DNA extraction used in plants, in particular from young corn leaves (Dellaporta et al. 1983).
  • the DNA sample must contain at least the gene sequence
  • Sh2 that is to say a region of this sequence which can be amplified by any technique known from the prior art, such as for example, PCR.
  • the quality of the grain of the individual studied can be determined by reference to the presence of an allele at at least one, several or all of the positions described in combination with other polymorphisms in the Sh2 gene which are known or which will be characterized. later
  • mini-sequencing APEX (Arrayed primer extension), RFLP (Restriction fragment length polymorphism), PCR product restriction sites (CAPS), OLA (Oligonucleotide ligation assay), pyrosequencing (Nyrèn et al. 1997).
  • FRET Fluorescence resonance energy transfer
  • fluorescence quenching fluorescence polarization
  • fluorescence polarization UK 2228998, Zeneca Itd
  • chemiluminescence electrochemiluminescence
  • radioactivity colorimetry
  • hybridization protection assay mass spectrometry.
  • Other amplification techniques such as SSR (Self sustained replication), LCR (Ligase chain reaction), SDA (Strand displacement amplification) or leb-DNA (branched DNA).
  • SSR Self sustained replication
  • LCR Low-Ligase chain reaction
  • SDA String displacement amplification
  • leb-DNA branched DNA
  • said probe or said nucleotide primer can be characterized in that it makes it possible to discriminate between the presence of a first acid nucleic acid (1) and a second nucleic acid (2), said nucleic acids (1) and (2) being chosen from the following: Polymorphic sites
  • Site - 921 the nucleic acid (1) of sequence SEQ ID No 2 in which the nucleotide at position 41 is a base G and the nucleic acid (2) of sequence SEQ ID No 2 in which the nucleotide at position 41 is a base A;
  • Site - 438 the nucleic acid (1) of sequence SEQ ID No. 3 in which the nucleotide in position 41 is a base G and the nucleic acid (2) of sequence SEQ ID No. 3 in which the nucleotide at position 41 is a base A;
  • Site - 362 the nucleic acid (1) of sequence SEQ ID No. 4 in which the nucleotide at position 41 is a base A and the nucleic acid (2) of sequence SEQ ID No. 4 in which the nucleotide at position 41 is a base G;
  • Site - 347 the nucleic acid (1) of sequence SEQ ID No. 5 in which the nucleotide at position 41 is a base T and the nucleic acid
  • Site - 296 the nucleic acid (1) of sequence SEQ ID No. 6 in which the nucleotide in position 41 is a base T and the nucleic acid (2) of sequence SEQ ID No. 6 in which the nucleotide at position 41 is a base C;
  • Site - 277 the nucleic acid (1) of sequence SEQ ID No. 7 in which the nucleotide at position 41 is a base T and the nucleic acid (2) of sequence SEQ ID No. 7 in which the nucleotide at position 41 is a base C;
  • Site-266 the nucleic acid (1) of sequence SEQ ID No 8 in which the nucleotide at position 41 is a base C and the nucleic acid (2) of sequence SEQ ID No 8 in which the nucleotide at position 41 is a base T
  • Site - 168 the nucleic acid (1) of sequence SEQ ID No 9 in which the nucleotide in position 41 is a base A and the nucleic acid (2) of sequence SEQ ID No 9 in which the nucleotide at position 41 is a base G
  • Site - 15 the nucleic acid (1) of sequence SEQ ID No. 10 in which the nucleotide at position 41 is a base A and the nucleic acid (2) of sequence SEQ ID No. 10 in which the nucleotide at position 41 is a base G;
  • Site + 35 the nucleic acid (1) of sequence SEQ ID No 11 in which the nucleotide at position 41 is a base T and the nucleic acid (2) of sequence SEQ ID No 11 in which the nucleotide at position 41 is a base C;
  • (k) Site + 515 the nucleic acid (1) of sequence SEQ ID No 12 in which the nucleotide at position 41 is a base C and the nucleic acid (2) of sequence SEQ ID No 12 in which the nucleotide at position 41 is a base T;
  • Site + 587 the nucleic acid (1) of sequence SEQ ID No. 13 in which the nucleotide at position 41 is a base C and the nucleic acid
  • Site + 1059 the nucleic acid (1) of sequence SEQ ID No 16 in which the nucleotide in position 41 is a base G and the nucleic acid (2) of sequence SEQ ID No 16 in which the nucleotide at position 41 is a base C;
  • Site + 1068 the nucleic acid (1) of sequence SEQ ID No. 17 in which the nucleotide in position 41 is a base G and the nucleic acid (2) of sequence SEQ ID No. 17 in which the nucleotide at position 41 is a base T;
  • Site + 1473 the nucleic acid (1) of sequence SEQ ID No 18 in which the nucleotide at position 41 is a base C and the nucleic acid (2) of sequence SEQ ID No 18 in which the nucleotide at position 41 is a base T;
  • Site + 1867 the nucleic acid (1) of sequence SEQ ID No. 19 in which the nucleotide at position 41 is a base C and the nucleic acid
  • (t) Site + 2983 the nucleic acid (1) of sequence SEQ ID No. 21 in which the nucleotide at position 41 is a base C and the nucleic acid
  • Site + 304 the nucleic acid (1) of sequence SEQ ID No. 27 and the nucleic acid (2) of sequence SEQ ID No. 26;
  • Site + 1081 the nucleic acid (1) of sequence SEQ ID No. 29 and the nucleic acid (2) of sequence SEQ ID No. 28;
  • Site + 1542 the nucleic acid (1) of sequence SEQ ID No. 33 and the nucleic acid (2) of sequence SEQ ID No. 32;
  • Site + 2514 the nucleic acid (1) of sequence SEQ ID No 35 and the nucleic acid (2) of sequence SEQ ID No 34;
  • said nucleic acid is a nucleic acid which hybridizes specifically with a nucleic acid of sequence complementary to any one of the nucleic acids (1) or (2) defined in (a) to (ac) above.
  • the above use can also be characterized in that: a) the nucleotide probe hybridizes specifically with a nucleic acid of a first allelic form of the polymorphic base or of the polymorphic nucleotide sequence defining a first allele of a polymorphic site of the Sh2 gene and does not hybridize with an acid nucleic acid of a second allelic form of the polymorphic base or of the polymorphic nucleotide sequence defining a second allele of a polymorphic site of the Sh2 gene; or b) the nucleotide primer specifically hybridized with a nucleotide sequence contained in a Sh2 gene, said nucleotide sequence being located upstream of an allelic form of a polymorphic base or of a polymorphic nucleot
  • the polymorphism of the Sh2 gene once identified by one of the methods described above can be used, according to the invention, to carry out a predictive selection of plants with better grain quality, including the selection of plants at the seedling stage. and / or at the early stage and / or at the vegetative stage.
  • the nucleotide sequence of the corn Sh2 gene SEQ ID No. 1 has a strong nucleotide identity with the nucleotide sequences of many cereals, in particular many varieties of grasses, an identity which is almost complete in the open reading frame (ORF).
  • the sequence of the corn Sh2 gene has a very large nucleotide identity with the sorghum Sh2 gene, the greater identity between the two sequences being found in the open reading frame (ORF).
  • the SH2 polypeptide encoded by the sorghum Sh2 gene has a difference of a single amino acid with the SH2 polypeptide encoded by the corn Sh2 gene SEQ ID No. 1.
  • the inventors believe that the polymorphic sites found in the Sh2 gene of corn are also found in the Sh2 gene of the genome of other cereals, in particular grasses, and even more specifically in the Sh2 gene of sorghum.
  • the polymorphic sites located in the open reading frame of the corn Sh2 gene SEQ ID No. 1 are those which have statistically most likely to also be found in the Sh2 genes of other cereals, especially other grasses, such as sorghum.
  • Predictive selection therefore applies in particular to cereals such as, for example, corn and sorghum.
  • allelic polymorphism described in the invention applies particularly to the selection of varieties of corn.
  • SAM marker-assisted selection
  • Another advantage of SAM compared to phenotypic evaluation is that the analyzes are completely independent of climatic hazards.
  • the above use is further characterized in that the improved phenotypic quality characteristics of the seed are selected from the number of seeds per ear, the mass of the seeds, the protein content of the seeds, the starch content of the seeds. , the amylose content of the seeds and the protein / starch weight ratio of the seeds, or a combination of these phenotypic characteristics.
  • a subject of the invention is also a method for determining the identity of the allele of a polymorphic site within a nucleic acid derived from an Sh2 gene with a view to selecting a plant having improved phenotypic quality characteristics.
  • the seed characterized in that it comprises a step of characterizing the identity of the polymorphic base or of the polymorphic nucleotide sequence present at at least one nucleotide position of said nucleic acid corresponding to at least one of the nucleotides in position - 921, -830 to -824, -580 to -573, -438, - 362, -347, -296, -277, -266, -168, - 15, +35, +304, +515, +587, +678 , +960, +1059, +1068, +1081, +1473, +1505, +1542, +1867, +2514, +2771, +2939, +2983 and +3123 of the Sh2 gene of sequence SEQ ID No.
  • the characterization of the identity of the polymorphic site is carried out by hybridization of a nucleotide probe hybridizing specifically with the sequence of a determined allele of the Sh2 gene.
  • the characterization of the identity of the polymorphic site is carried out by hybridization of a nucleotide probe hybridizing specifically with a polymorphic base or a polymorphic nucleotide sequence defining an allele of a determined polymorphic site of the Sh2 gene.
  • the characterization of the polymorphic site is carried out by elongation of a nucleotide primer which hybridizes specifically with a nucleotide sequence located upstream of an allelic form of a polymorphic base or of a sequence polymorphic nucleotide defining an allele of a determined polymorphic site of a Sh2 gene.
  • the characterization of the identity of the polymorphic site is carried out by hybridization of a nucleotide primer which hybridizes specifically with the sequence situated upstream, on the 5 ′ side of the polymorphic base or of the sequence polymorphic nucleotide defining a given allele of a polymorphic site of the Sh2 gene, then elongation of the primer.
  • the characterization of the polymorphic allele can be carried out by sequencing the product of the extension of the primer.
  • the nucleotide located at the 3 'end of the primer hybrid with the nucleotide located immediately upstream from the 5' side of the polymorphic base or of the polymorphic nucleotide sequence.
  • the identity of the allele of the polymorphic site considered can be determined directly by carrying out the step of elongation of the primer in the presence of fluorescent dideoxynucleotides blocking the elongation reaction.
  • the identity of the dideoxynucleotide added to the primer sequence, and therefore the identity of the allele of the polymorphic site, is determined directly by fluorescence analysis. This is the micro-sequencing technique, well known in the state of the art.
  • the primer hybrid with the DNA strand comprising the sequence coding for the SH2 polypeptide (the + strand) or with the complementary DNA strand, which carries a base complementary to the corresponding base carried by the “+” strand at the polymorphic site.
  • the method is characterized in that in order to select a plant having a modified number of seeds, the identity of the base or of a sequence of bases present at at least one nucleotide position of said nucleic acid corresponding to is determined. at least one of the nucleotides in position -168, +1473, +1542 and +2983 of the Sh2 gene of sequence SEQ ID No. 1.
  • the method is characterized in that in order to select a plant with a modified mass of seed, the identity of the base or of a sequence of bases present at at least one nucleotide position of said nucleic acid corresponding to is determined. at least one of the nucleotides in position -168, +1473, +1542 and +2983 of the Sh2 gene of sequence SEQ ID No. 1.
  • this method is characterized in that in order to select a plant having a modified protein content in the seed, the identity of the base or of a sequence of bases present at at least one nucleotide position of said acid is determined. nucleic acid corresponding to at least one of the nucleotides in position -
  • this method is characterized in that in order to select a plant having a modified starch content in the seed, the identity of the base or of a sequence of bases present at at least one nucleotide position of said acid is determined nucleic acid corresponding to at least one of the nucleotides in position -830 to -824, -362, -347, -296, -15, +515, +587, +1068, +1505 and +2939 of the S 72 gene of sequence SEQ ID # 1.
  • this method is characterized in that in order to select a plant having a modified amylose content in the seeds, the identity of the base or of a sequence of bases present at at least one nucleotide position of said acid is determined.
  • nucleic acid corresponding to at least one of the nucleotides in position - 438, -266, +678, +960, -921, -580 to -573, -277, +35, +304, +1059, +1081, +1867, +2514, +2771 and +3123 of the Sh2 gene sequence SEQ ID N ° 1.
  • this method is characterized in that to select a plant having a modified protein / starch ratio in the seed, the identity of the base or of a sequence of bases present at at least one nucleotide position of said said is determined. nucleic acid corresponding to at least one of the nucleotides in position -168, +1473, +1542, +2983, -830 to -824, -362, -347, -296, -15, +515, +587, +1068, +1505 and +2939 of the Sh2 gene of sequence SEQ ID No. 1.
  • said method is characterized in that it is carried out on DNA taken from plants at the seedling stage and / or at the early stage and / or at the vegetative stage.
  • the plant is a cereal, preferably a straw cereal.
  • the plant is chosen from corn and sorghum.
  • Nucleotide probes and primers The invention also relates to the primers and probes obtained from the nucleotide sequences described above and specific for an allele of the Sh2 gene.
  • One of the applications of the invention consists in using these probes and / or primers to detect the polymorphism of the Sh2 gene at at least one of the polymorphic sites as defined above.
  • the probes and primers obtained according to one aspect of the invention can be used as specific markers for an allele of the Sh2 gene.
  • the nucleotide primers specific for alleles, or making it possible to discriminate according to known alleles preferably consist of 8 to 40 nucleotides, more precisely from 17 to 25 nucleotides. The production of such primers is known to those skilled in the art.
  • primers comprise a sequence entirely complementary to the sequence defining the reference allele or the “variant” allele associated with a phenotypic character of improved quality of the seed, as defined previously in the description.
  • the primers objects of the invention thus produced bear one or more markings to facilitate their detection.
  • the labeling can be fluorimetric (digoxygenin, fluorescein, etc.), radioactive (for example 32 P), enzymatic (peroxidase, alkaline phosphatase, etc.), or produced by microbeads of gold, colored glass or plastic.
  • nucleic acids according to the invention are useful for the manufacture of probes or primers allowing, when they are used in hybridization, elongation or amplification reactions, to discriminate between them the two alleles of a given polymorphic site of the Sh2 gene characterized according to the invention.
  • nucleotide probes and primers hybridizing with a nucleic acid chosen from sequences SEQ ID No. 2 to SEQ ID No. 39, or with a nucleic acid of sequence complementary to one of the sequences SEQ ID n ° 2 to SEQ ID N ° 39.
  • the subject of the invention is also a probe or a nucleotide primer characterized in that it makes it possible to discriminate between them the different alleles of a polymorphic site at at least one of the positions-921, -830 to
  • the invention also relates to the use of a probe or a primer as defined above as a marker for at least one polymorphic site of the Sh2 gene.
  • the invention also relates to diagnostic kits comprising nucleotide sequences as defined above, specific for the favorable allele of the Sh2 gene for one or more of the agronomic characters chosen from the number of grains per ear, the mass of the mature grain , the starch, amylose or protein contents of the grain. It also relates to a kit or kit predicting the phenotypic quality characteristics of a plant seed, characterized in that it comprises: a) a probe or a plurality of probes or primers as defined above; b) where appropriate, the reagents necessary for carrying out a hybridization or amplification reaction.
  • the detection kit or kit is characterized in that the probe or probes are immobilized on a support.
  • the detection kit or kit is characterized in that the oligonucleotide probes comprise a detectable marker.
  • a primer or a nucleotide probe according to the invention can be prepared by any suitable method well known to those skilled in the art, including by cloning and action of restriction enzymes or also by direct chemical synthesis according to techniques such as the method to the phosphodiester of Narang et al. (1979) or Brown et al.
  • nucleic acids according to the invention can be labeled, if desired, by incorporating a detectable molecule, that is to say a marker detectable by spectroscopic, photochemical means. , biochemical, immunochemical or even chemical.
  • markers can consist of radioactive isotopes ( 32 P 3 H, 35 S), fluorescent molecules (5-bromodeoxyuridine, fluorescein, acetylaminofluorene) or also ligands such as biotin.
  • the labeling of the probes is preferably done by incorporating labeled molecules within the polynucleotides by extension of primers, or else by adding to the 5 ′ or 3 ′ ends.
  • the probes according to the invention can have structural characteristics such as to allow amplification of the signal, such as the probes described by Urdea et al;
  • oligonucleotide probes according to the invention can be used in particular in Southern type hybridizations to the DNA of the Sh2 gene or else in hybridizations to the messenger RNA of this gene when the expression of the corresponding transcript is sought in a sample.
  • the probes according to the invention can also be used for the detection of PCR amplification products or even for the detection of mismatches.
  • Nucleotide probes or primers according to the invention can be immobilized on a solid support.
  • Such solid supports are well known to those skilled in the art and include the surfaces of the wells of micro-titration plates, polystyrene beads, magnetic beads, nitrocellulose strips or even microparticles such as latex particles.
  • Means for expression of nucleic acids comprising a polymorphic site of the Sh2 gene.
  • the invention also relates to the use of the methods described above for isolating and / or cloning the particular and / or favorable allelic forms of the Sh2 gene, in particular in combination with molecular biology techniques such as for example PCR, RT- PCR, allele sequencing (for example pyrosequencing, ).
  • molecular biology techniques such as for example PCR, RT- PCR, allele sequencing (for example pyrosequencing, ).
  • a nucleic acid comprising the complete sequence of a determined allele of the Sh2 gene and comprising at least one polymorphic base of a polymorphic site as defined in the present description, or a nucleic acid comprising all of the exons of this determined allele of the Sh2 gene can be obtained according to techniques well known to those skilled in the art, for example by the PCR amplification technique using primers which hybridize specifically with the selected target nucleotide ends of the Sh2 gene, as described in particular in the examples.
  • a person skilled in the art can obtain a nucleic acid derived from the Sh2 gene and comprising at least one allele associated with a phenotypic characteristic of quantity or quality of the improved seed of at least one polymorphic site according to the invention by amplifying respectively the 5 ′ and 3 ′ part of the Sh2 gene based on the nucleotide sequence SEQ ID No. 1.
  • the subject of the invention is also a recombinant vector into which a nucleic acid has been inserted comprising the complete sequence of a determined allele of the Sh2 gene and comprising at least one polymorphic base of a polymorphic site as defined in the present description, or a nucleic acid comprising all of the exons of this determined allele of the Sh2 gene.
  • such a nucleic acid is a nucleic acid derived from the Sh2 gene of sequence SEQ ID No. 1 and comprising at least one polymorphic base or at least one polymorphic nucleotide sequence at at least one of the positions -921, -830 to -824, -580 to - 573, - 438, - 362, - 347, -296, -277, -266, -168, -15, +35, +304, +515, +587, +678, +960 , +1059, +1068, +1081, +1473, +1505, +1542, +1867, +2514, +2771, +2939, +2983 and +3123 of the Sh2 gene of sequence SEQ ID No.1.
  • a first nucleic acid which is the subject of the invention is a nucleic acid capable of imparting to a plant, preferably a cereal, in particular to a corn, a modified number of seeds, compared to the reference corn of the Black Mexican Sweet variety described. by Shaw and Hannah (1992), said nucleic acid comprising the allelic form associated with the expression of the modified phenotypic character of seed quality, as defined in the present description, at least one polymorphic site chosen from the polymorphic sites - 168 , + 1473, + 1542 and + 2983 of the Sh2 gene of sequence SEQ ID No. 1.
  • a second nucleic acid which is the subject of the invention is a nucleic acid capable of imparting to a plant, preferably a cereal, in particular to a corn, a modified mass of the seed compared to the reference corn of the Black Mexican Sweet variety described. by Shaw and Hannah (1992), said nucleic acid comprising the allelic form associated with the expression of the modified phenotypic character of seed quality, as defined in the present description, at at least one polymorphic site chosen from the polymorphic sites - 168. + 1473, + 1542 and + 2983 of the Sh2 gene of sequence SEQ ID No. 1.
  • a third nucleic acid which is the subject of the invention is a nucleic acid capable of imparting to a plant, preferably a cereal in particular to a corn, a modified protein content in the seeds, compared to the reference corn of the Black Mexican variety. Sweet described by Shaw and Hannah (1992), said nucleic acid comprising the allelic form associated with the expression of the modified phenotypic character of seed quality, as defined in the present description, at at least one polymorphic site chosen from the sites polymorphs - 168, + 1473, + 1542, + 2983, - 830 to - 824, - 362, - 347, - 296, - 15, + 515, + 1068, + 1505 and + 2939 of the Sh2 gene of sequence SEQ ID N 1.
  • a fourth nucleic acid which is the subject of the invention is a nucleic acid capable of imparting to a plant, preferably a cereal in particular to a corn, a modified starch content in the seeds, compared to the reference corn of the Black Mexican variety. Sweet described by Shaw and Hannah (1992), said nucleic acid comprising the allelic form associated with the expression of the modified phenotypic character of seed quality, as defined in the present description, at at least one polymorphic site chosen from the sites polymorphs - 830 to - 824, - 362, - 347, - 296, - 15, + 515, + 587, + 1068, + 1505 and + 2939 of the Sh2 gene of sequence SEQ ID No. 1.
  • a fifth nucleic acid which is the subject of the invention is a nucleic acid capable of imparting to a plant, preferably a cereal, in particular to a corn, a modified amylose content in the seeds, compared to the reference corn of the Black variety.
  • nucleic acid comprising the allelic form associated with the expression of the modified phenotypic character of seed quality, as defined in the present description, at at least one polymorphic site chosen from the polymorphic sites - 438, - 266, + 678, + 960, - 921, - 580 to - 573, - 277, + 35, + 304, + 1059, + 1081, + 1867, + 2514, + 2771 and + 3123 of Sh2 gene of sequence SEQ ID No. 1.
  • a sixth nucleic acid which is the subject of the invention is a nucleic acid capable of conferring on a plant, preferably a cereal in particular on a corn, a protein / starch ratio modified in the seed, compared to the reference corn of the Black Mexican variety.
  • nucleic acid comprising the allelic form associated with the expression of the modified phenotypic character of seed quality, as defined in the present description, at at least one polymorphic site chosen from the sites polymorphs-168, + 1473, + 1542, + 2983, - 830 to - 824, - 362, - 347, - 296, - 15, + 515, + 587, + 1068, + 1505 and + 2939 of the sequence Sh2 gene SEQ ID N ° 1.
  • the Black Mexican Sweet corn variety described by Shaw and Hannah (1992), which is the reference variety, may also be referred to as "wild" corn variety for the purposes of this description.
  • the invention also relates to a recombinant vector, for example a recombinant cloning vector or a recombinant expression vector, into which a nucleic acid as defined above has been inserted.
  • a recombinant vector for example a recombinant cloning vector or a recombinant expression vector, into which a nucleic acid as defined above has been inserted.
  • the nucleotide sequences constituting particular allelic forms of the Sh2 gene can be cloned, transferred into cells, in particular to produce transgenic plants.
  • the nucleotide sequences of the selected loci are introduced into plant cells, either in culture or in plant organs such as, for example, leaves, stems, seeds, roots, etc.
  • the natural or synthetic expression of these sequences can be carried out by operably linking these sequences of interest to a promoter, by including the construct in a vector and by introducing the vector into a host cell.
  • An endogenous promoter linked to the nucleotide sequence to be introduced can favorably be used.
  • the vectors usually used include initiator and terminator sequences for both transcription and translation, and promoters allowing the regulation of the expression of this particular nucleotide sequence.
  • the vectors may also include expression cassettes with at least one independent terminator sequence, sequences allowing replication of the cassette in eukaryotes or prokaryotes or both (shuttle vectors) and a selection marker for at least one.
  • transcription terminators which can be used, there may be mentioned the polyA 35S terminator of the cauliflower mosaic virus (Franck et al. 1980) or the polyA NOS terminator, which corresponds to the 3 ′ non-coding region of the nopaline synthase gene of the plasmid Ti - Agrobacterium tumefaciens nopaline strain.
  • a constitutive promoter allows a strong expression of the transcript in all the tissues of the regenerated plant and will be active in most environmental conditions, and in all of the cellular transformation and differentiation stages.
  • an inducible transcription promoter sequence capable of being controlled by environmental conditions or the development stage, such as, for example, the phenylalanine ammonia lyase (PAL), HMG-CoA reductase (HMG) promoters. ), chitinases, glucanases, proteinase inhibitors (PI), genes of the PR1 family, nopaline synthase (nos) or the vspB gene (US-5,670,349), all of these promoters being recalled with the references of the corresponding publications by Table 3 of US Pat. No. 5,670,349.
  • PAL phenylalanine ammonia lyase
  • HMG HMG-CoA reductase
  • PI proteinase inhibitors
  • tissue specific promoters such as for example seed specific tissue promoters (Datla, R. et al., 1997), in particular napine promoters (EP-0.255.378), glutenin, heliantinin (WO-92/17580), albumin (WO- 98/45460), oleosin (WO-98/45461), I ⁇ TS1 or I ⁇ TS3 (WO- 99/20775 ).
  • the most common methods for introducing nucleic acids into bacterial cells can be used in the context of this invention. It can be the fusion of receptor cells with bacterial protoplasts containing DNA, electroporation, projectile bombardment, infection with viral vectors, etc.
  • Bacterial cells are often used to amplify the number of plasmids containing the construct comprising the nucleotide sequence, object of the invention.
  • the bacteria are cultured and the plasmids are then isolated according to methods well known to those skilled in the art (see the manuals of protocols already cited), including the plasmid purification kits sold commercially such as EasyPrepI from Pharmacia Biotech or QIAexpress Expression System from Qiagen.
  • the plasmids thus isolated and purified are then manipulated to produce other plasmids which will be used to transfect plant cells.
  • the transformation of plant cells can be carried out by various methods such as, for example, the transfer of vectors mentioned above in plant protoplasts after incubation of the latter in a polyethylene glycol solution in the presence of divalent cations (Ca 2+), electroporation (Fromm et al. 1985), the use of a particle gun, or micro -cytoplasmic or nuclear injection (Neuhaus et al, 1987).
  • various methods such as, for example, the transfer of vectors mentioned above in plant protoplasts after incubation of the latter in a polyethylene glycol solution in the presence of divalent cations (Ca 2+), electroporation (Fromm et al. 1985), the use of a particle gun, or micro -cytoplasmic or nuclear injection (Neuhaus et al, 1987).
  • One of the methods of transformation of plant cells which can be used in the context of the invention is the infection of plant cells by a bacterial cell host comprising the vector containing the sequence of interest.
  • the cell host can be Agrobacterium tumefaciens (An et al. 1986), or A. rhizogenes (Guerche et al. 1987).
  • the transformation of plant cells is carried out by the transfer of the T region of the extrachromosomal circular plasmid inducing Ti tumors of A tumefaciens, using a binary system (Watson et al., 1994).
  • a binary system Wang et al., 1994.
  • two vectors are constructed. In one of these vectors, the T-DNA region was deleted, with the exception of the right and left edges, a marker gene being inserted between them to allow selection in plant cells.
  • the other partner in the binary system is a helper Ti plasmid, a modified plasmid which no longer has T-DNA but still contains the vir virulence genes necessary for the transformation of the plant cell. This plasmid is maintained in Agrobacterium.
  • the method described by Ishida et al. (1996) can be applied for the transformation of monocots, in particular maize.
  • the transformation is carried out according to the method described by Finer et al. (1992) using the tungsten or gold particle gun.
  • the subject of the invention is also the use of a nucleic acid derived from the Sh2 gene of sequence SEQ ID No. 1 as defined above to transform a host cell.
  • the host cell is a bacterial host cell, for example an Agrobacterium tumefaciens cell, or a plant cell, preferably a cereal cell, and most preferably a corn, rice, wheat cell, rye or barley.
  • the invention also relates to the transformed cells, with the nucleotide sequences constituting particular allelic forms of the Sh2 gene, including microorganisms (viruses and bacteria) and plant cells, in particular corn cells. It relates in particular to a host cell transformed by a nucleic acid derived from the Sh2 gene or by a recombinant vector, as defined above.
  • the invention also relates to plants regenerated from the transformed plant cells described above, as well as plants of which at least one of the parents has been regenerated from a transformed plant cell comprising at least one of the nucleotide sequences constituting a form. particular allelic of the Sh2 gene.
  • the invention also relates to the use of a nucleic acid, or of a recombinant vector or of a transformed host cell, defined according to the invention, for manufacturing a transformed plant capable of producing seeds with improved industrial or agrifood qualities. .
  • a transformed plant comprising a plurality of transformed host cells according to the invention.
  • the invention also relates to a process for obtaining a transformed plant capable of producing seeds with improved industrial or agrifood qualities, characterized in that it comprises the following steps: a) transformation of at least one cell vegetable by a nucleic acid or by a recombinant vector according to the invention; b) selection of the transformed cells obtained in step a) having integrated into their genome at least one copy of a nucleic acid according to the invention; c) regeneration of a transformed plant from the transformed cells obtained in step b).
  • the invention extends to a transformed plant or any part of a transformed plant as defined in the present description, such as the root, but also the aerial parts such as the stem, the leaf, the flower and especially the seed.
  • the invention also relates to a seed or a plant seed produced by a transformed plant as defined above.
  • a transformed seed or such a transformed grain comprises one or more cells comprising in their genome one or more copies of a nucleic acid defined according to the invention, if necessary in a controlled and inducible manner.
  • Also part of the invention is any transformation product of a seed as defined in the present description.
  • the invention also relates to the monoclonal or polyclonal antibodies specifically recognizing polypeptides corresponding to alleles of the Sh2 gene, these alleles comprising at least one of the forms described in positions Nos. -921, -830 to -824, -580 to -573, -438, -362, -347, -296, -277, -266, -168, -15, 35, 304, 515, 587, 678, 960, 1059, 1068, 1081, 1473, 1505, 1542, 1867, 2514, 2771, 2939, 2983, 3123.
  • Preferred antibodies according to the invention are the following antibodies:
  • the antibodies specifically recognizing the amino acid region of an SH2 polypeptide encoded by the nucleotides located near the +678 polymorphic site, these antibodies being capable of discriminating between the presence of an Alanine residue and the presence of a residue Threonine encoded by the codon comprising the polymorphic base of this polymorphic site;
  • the antibodies specifically recognizing the amino acid region of an SH2 polypeptide encoded by the nucleotides located near the polymorphic site +2983, these antibodies being capable of discriminating between the presence of a Leucine residue and the presence of a residue Serine encoded by the codon comprising the polymorphic base of this polymorphic site
  • the invention also relates to the diagnostic kit comprising a mixture of these antibodies.
  • the antibodies defined above are useful in particular for predicting the phenotypic characteristics of quantity or quality of the seed, without requiring a long and costly direct, for example biochemical, analysis of these phenotypic characteristics.
  • Antibodies against the SH2 polypeptides defined above can be prepared according to standard techniques well known to those skilled in the art.
  • antibody within the meaning of the present invention, is meant in particular polyclonal or monoclonal antibodies or fragments (for example the fragments F (ab) ' 2 , F (ab)) or any polypeptide comprising a domain of the antibody initial recognizing the polypeptide or the fragment of target polypeptide according to the invention.
  • Monoclonal antibodies can be prepared from hybridomas according to the technique described by Kohler and Milstein (1975)
  • the present invention also relates to antibodies directed against a polypeptide as described above or a fragment or a variant thereof, such that produced in the trioma technique or the hybridoma technique described by Kozbor et al. (1983).
  • the invention also relates to fragments of single chain Fv antibody (ScFv) as described in US Patent No. 4,946,778 or by Martineau et al. (1998).
  • the antibodies according to the invention also include fragments of antibodies obtained using phage libraries as described by Ridder et al. (1995) or humanized antibodies as described by Reinmann et al. (1997) and Léger et al. (1997).
  • the antibody preparations according to the invention are useful in immunological detection tests intended for the identification of the presence and / or the amount of a SH2 polypeptide as defined above or of a peptide fragment of that - present in a sample.
  • An antibody according to the invention may also comprise an isotopic or non-isotopic detectable marker, for example fluorescent, or else be coupled to a molecule such as biotin, according to techniques well known to those skilled in the art.
  • the subject of the invention is also a method for detecting the presence of a polypeptide in accordance with the invention in a sample, said method comprising the steps of: a) bringing the sample to be tested into contact with an antibody such as described above; b) detecting the antigen / antibody complex formed.
  • the invention also relates to a kit or diagnostic kit for detecting the presence of a polypeptide according to the invention in a sample, said kit comprising: a) an antibody as defined above; b) where appropriate, one or more reagents necessary for the detection of the antigen / antibody complex formed.
  • the invention also relates to a database comprising at least any one of the nucleotide sequences described, obtained, isolated or identified in at least one of the applications of the invention.
  • DNA was isolated from young leaves by a method described by Causse et al. (1995). Two overlapping fragments were amplified by PCR using primers drawn from the reference sequence of the Sh2 gene in the Black Mexican Sweet SEQ ID No. 1 line (Shaw and Hannah, 1992).
  • the first fragment (Sh2-I) of length close to 2653 bp covers approximately 1000bp upstream of the supposed TATA box, the first three introns, the first three exons as well as part of exon 4.
  • the second fragment (SH2 -II) has a length close to 2455 bp, and covers introns 3 to 12, exons 3 to 12 as well as about 30 bases of exon 13.
  • the primers used are the following (position on the reference sequence) : for Sh2-I:
  • the PCR amplifications were carried out in 100 ⁇ l (approximately 0.1 to 1.5 ⁇ g of DNA, 1.75u of Roche taq polymerase Expand High Fidelity, 0.5 ⁇ M of each primer, 0.3 ⁇ M dNTP, 1.875 mM Mg 2+ ) under the following conditions:
  • the PCR products were sequenced by the companies Génome Express or Genaxis. First, the PCR primers were used for the sequence, then the central part of the fragments was sequenced using the following new primers: - For Sh2-1:
  • Sequencing Analysis and Sequence Navigator from ABI The sequences were aligned either visually or using the alignment procedure Multiple Clustal of Sequence Navigator software. The fragments were sequenced on only one strand. Nevertheless, verifications have been carried out. First of all, the overlapping part of the sequence fragments never showed any inconsistency when performing the contigs. In addition, PCR amplification and sequencing were repeated over a total of around 10000bp in order to verify all of the singleton polymorphisms (case where only one line differs from all the others). Identical results have always been obtained for the two repetitions. The sites for which differences have been observed among the sequences of Sh2 are identified by their position relative to the reference sequence of the lines Black Mexican Sweet SEQ ID No.
  • Table 2 allelic forms with the 29 polymorphisms described, including 20 SNPs and 9 indels, named by their position on the reference sequence SEQ ID No. 1 of the line Black Mexican Sweet (BMS).
  • BMS Black Mexican Sweet
  • the haplotypes H1 to H6 correspond to the following lines:
  • Example 2 Identification of statistically significant associations between a given allele of polymorphic sites of the Sh2 gene and one or more phenotypic characteristics of the quality of the seed.
  • the 33 lines were randomized and repeated in three blocks. Each line was represented, in each block, by one to four plants sown side by side.
  • the plants were self-fertilized and the grains harvested at maturity.
  • Analyzes of associations with the molecular polymorphisms of Sh2 focused on average values of each character by experimentation. The protein, starch and amylose content of each line were measured manually for the year 1 test (see detailed methods in Sene et al.
  • NIRS near infrared reflectance spectrometry
  • the polymorphisms described above are statistically associated with grain characteristics such as the number of grains per ear, the mass of the mature grain, the protein, starch and amylose content of the grain, and the ratio of protein content to starch content of the grain. These associations were highlighted by multiple regression tests using SAS software (1990). When a trait is significantly associated with several sites, it is possible to define the proportion of variability of the trait explained by all of the sites involved (R 2 ⁇ , last column of Table 3). For example, we can note that, in the experiment of the first year, the combination of Indel -830 to -824 and SNP -168 allows to explain 64% of the variance of the protein / starch ratio among the set of lines.
  • the statistical associations described in the invention allow the use of the SNPs and indels described for the purpose of phenotypic prediction or of improving the genetic value of the grains. corn.
  • Table 3 results of association tests by multiple regressions between each characteristic of the grain and the polymorphic sites in the sequence of Sh2 for 25 to 33 lines. The sites indicated are in complete redundancy with other sites along the sequence of Sh2 (see Table 2).
  • the columns ni, moyl, n2, and moy2 contain the numbers and the average values of the characteristic for the two groups of lines discriminated by the corresponding polymorphic sites.
  • F Fisher test value
  • P degree of significance
  • R 2 share of phenotypic variation explained by a site
  • R 2 ⁇ share of phenotypic variation explained by a group of sites combined by multiple regression.

Landscapes

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Abstract

L'invention concerne l'utilisation d'une sonde ou d'une amorce nucléotidique dans un procédé de sélection de plantes possédant des caractéristiques phénotypiques améliorées de qualité des graines pour la détection d'une base polymorphe ou d'une séquence nucléotidique polymorphe définissant un allèle d'un site polymorphe du gène Sh2 de séquence SEQ ID N°1, ladite base polymorphe ou ladite séquence nucléotidique polymorphe étant contenue dans un acide nucléique inclus dans un gène Sh2. Application à l'obtention de plantes transformées susceptibles de produire des graines de qualités industrielles ou agroalimentaires améliorées.

Description

Utilisation d'associations entre au moins un polymorphisme de séquence nucléique du gène Sh2 et au moins une caractéristique de qualité de la graine, dans des procédés de sélection de plantes
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention se rapporte au domaine de la sélection de variétés de plantes possédant des caractéristiques agronomiques améliorées, en particulier des caractéristiques phénotypiques de qualité des graines améliorées. Elle est relative à la détection des caractéristiques phénotypiques de qualité des graines améliorées par analyse du polymorphisme d'un gène Sh2 pour sélectionner des plantes à qualité de graine améliorée ainsi qu'à des moyens pour la mise en œuvre de cette détection.
ART ANTERIEUR
Composition du grain
Le grain accumule des réserves énergétiques suffisantes pour permettre la germination de l'embryon. Ces réserves sont sous forme de réserves glucidiques, protéiques ou oléiques. Chez les céréales, les réserves accumulées sont principalement de formes glucidique et protéique. Les réserves glucidiques sont en grande partie constituées par des polyosides tels que l'amidon. L'amidon est composé de deux fractions polysaccharidiques distinctes, l'amylose et l'amylopectine. L'amylose constitue la fraction minoritaire de l'amidon, c'est une chaîne de monomères de glucose liés en α 1-4 présentant moins de 1 % de ramifications. L'amylopectine représente la fraction majoritaire de l'amidon. Elle est constituée de monomères de glucose liés en α 1-4 et est ramifiée à environ 5% avec des monomères de glucose liés à la chaîne principale par des liaisons α 1-6. L'amidon représente près de 85% du poids de l'albumen des grains, la fraction de réserves énergétiques restante étant essentiellement constituée de protéines. Importance agronomique et nutritive des céréales et de l'amidon
L'amidon est le polyoside majoritaire de stockage énergétique chez les végétaux. Il revêt une importance particulière dans les céréales. Ainsi, l'amidon de riz, de blé ou de maïs constitue le principal apport en sucre dans l'alimentation humaine et animale. L'étude des processus de remplissage du grain, la sélection et la création de variétés de céréales avec des teneurs en amidon modifiées constituent un des axes privilégiés des recherches concernant les céréales.
Enzyme ADP-Glucose Pyrophosphorylase
L'ADP Glucose Pyrophosphorylase (AGPase) est une enzyme clef de la voie de biosynthèse des polysaccharides, aussi bien chez les bactéries que chez les végétaux. Chez les plantes, elle permet de déphosphoryler le glucose-1 -phosphate en ADP-glucose, monomère constitutif de l'amidon.
L'AGPase végétale possède une structure complexe sous forme d'hétérotétramère composé de deux types de sous-unités similaires mais distincts. Les deux types de sous-unités, d'un poids moléculaire proche de 50 kDa dans l'albumen, sont codées, l'une par le gène Sh2 pour Shrunken 2, (Bhave et al., 1990) et l'autre par le gène Bt2 pour Brittle-2, (Bae et al., 1990).
Polymorphisme génétique
Au sein d'une même espèce, le génome présente du polymorphisme. Les principales causes de ces variabilités génétiques sont des mutations intervenant lors de la réplication de l'ADN qui précède la multiplication cellulaire. Ce peut être l'insertion ou la délétion de un ou plusieurs nucléotides (regroupés sous le terme d'indel), ou bien une substitution de type transition (substitution d'une base purique par une autre base purique ou d'une base pyrimidique par une autre base pyrimidique) ou transversion (substitution d'une base purique par une base pyrimidique ou vice versa). Les sites polymorphes sont ainsi classés en deux catégories selon qu'il s'agit de la substitution d'une base
(SNP pour single nucleotide polymorphism) ou bien d'un indel (Insertion- Délétion). Si les sites polymorphes sont retrouvés plus fréquemment dans les régions non codantes du génome, une partie des SNPs ou des indels est retrouvée dans les régions codantes du génome ou dans des régions impliquées dans la régulation de la transcription et/ou de la traduction, telles que les régions promotrices, les régions 5'-leader, voire même certains introns. Ce type de polymorphisme peut alors avoir un impact sur l'expression d'un gène, la structure ou l'activité d'une protéine, et par suite sur l'expression d'un phénotype donné par la plante.
L'analyse de la variabilité des séquences d'ADN permet de caractériser un individu ou un groupe d'individus par son génome. En effet, La connaissance de la variabilité génétique des individus permet de générer des marqueurs pour détecter la ou les forme(s) allélique(s) présente(s) chez d'autres individus. Ce peut être des amorces PCR, des sondes allèles spécifiques, ou toute autre séquence nucléotidique permettant de détecter un site polymorphe particulier du gène. Lorsqu'un marqueur spécifique à un locus est lié à un caractère agronomique particulier de la plante, la connaissance de la forme allélique du marqueur permet de prédire le phénotype d'un individu. Il est aussi possible d'utiliser les marqueurs définis grâce au polymorphisme de séquence pour introgresser ou intégrer, par transgénèse, un allèle favorable dans une plante.
Cas du maïs, enzyme AGPase et gène Sh2
Chez le maïs, plusieurs études ont révélé des QTLs (pour « Quantitative Trait Loci »), aussi désignés « loci contrôlant un caractère à variation quantitative », de caractères de remplissage du grain, dans la région du chromosome 3 qui porte le gène Sh2. Il s'agit, en particulier, de QTLs associés à la teneur en amidon et en protéines (Goldman, 1993), ainsi qu'à la teneur en amylose et au rapport amylose/amylopectine (Séné et al., 2000). De plus, des modifications de la région amont 3' du gène, sous l'effet de transposons de type Ac/Ds, peuvent induire une augmentation de la quantité d'amidon dans le grain (Giroux et al. 1996). II apparaît donc que la variabilité du gène Sh2 puisse rendre compte de la variation de caractères de remplissage du grain. Shaw et Hannah (1992) ont séquence le gène Sh2 de la variété de maïs Black Mexican Sweet, qui comprend environ 7200 paires de bases.
Toutefois, si les études publiées dans l'état de la technique sur le gène Sh2, suggèrent une certaine relation entre l'activité de ce gène et les qualités de la graine, elles ne décrivent aucun moyen technique précis prédictif des caractéristiques phénotypiques de la qualités des graines, utilisable à grande échelle, et permettant de discriminer, entre eux, les divers types ou niveaux de phénotypes caractérisant la qualité de la graine, tels que le nombre de grains par épi, la masse du grain mûr, la teneur en amidon du grain, la teneur en amylose du grain ou la teneur en protéines du grain ou encore une combinaison des caractéristiques phénotypiques pécitées
SOMMAIRE DE L'INVENTION
L'invention fournit pour la première fois un ensemble de moyens permettant de sélectionner des variétés de plantes pour leurs caractéristiques phénotypiques améliorées de qualité des graines, par l'analyse de polymorphismes nouvellement identifiés dans le gène Sh2, polymorphismes qui sont statistiquement associés à une caractéristique phénotypique précise de la qualité de la graine, ou à une combinaison de caractéristiques phénotypiques de la qualité de la graine.
Il a en effet été montré selon l'invention qu'un allèle donné de chacun des nouveaux sites polymorphes du gène Sh2 était statistiquement associé à l'expression d'un ou plusieurs caractères phénotypiques définissant la qualité de la graine.
L'invention a pour objet l'utilisation d'une sonde ou d'une amorce nucléotidique dans un procédé de sélection de plantes possédant des caractéristiques phénotypiques améliorées de qualité des graines, caractérisée en ce que ladite sonde ou ladite amorce nucléotidique permet la détection d'une base polymorphe ou d'une séquence nucléotidique polymorphe définissant un allèle d'un site polymorphe du gène Sh2 de séquence SEQ ID N°1, ladite base polymorphe ou ladite séquence nucléotidique polymorphe étant contenue dans un acide nucléique inclus dans le gène Sh2, choisi parmi les acides nucléiques comprenant un site nucléotidique polymorphe associé à une caractéristique ou à une combinaison de caractéristiques phénotypiques liées à la qualité de la graine, notamment le nombre de graines par épi, la masse de la graine mûre, la teneur en protéines de la graine, la teneur en amidon de la graine, la teneur en amylose de la graine ou le rapport pondéral protéines/amidon de la graine.
Elle est également relative à un procédé pour déterminer l'identité de l'allèle d'un site polymorphe au sein d'un acide nucléique dérivé d'un gène Sh2 en vue de sélectionner une plante possédant des caractéristiques phénotypiques améliorées de qualité de la graine, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de caractérisation de l'identité de la base polymorphe ou de la séquence nucléotidique polymorphe présente à au moins une position nucléotidique dudit acide nucléique correspondant à au moins un des nucléotides inclus dans un site nucléotidique polymorphe nouvellement identifié du gène Sh2.
Selon ce procédé, la détermination de l'identité de l'allèle d'un site polymorphe ou d'une combinaison de sites polymorphes permet de prédire le phénotype de qualité de la graine de la plante analysée, sans nécessiter d'analyse directe des caractères phénotypiques eux-mêmes.
L'invention concerne aussi des sondes et des amorces nucléotidiques permettant de déterminer la forme allélique d'un site polymorphe du gène Sh2, utiles notamment comme moyens de détermination de l'identité de la base polymorphe ou de la séquence nucléotidique polymorphe au site polymorphe associé à une caractéristique ou à une combinaison de caractéristiques phénotypiques de la qualité de la graine.
Elle a aussi pour objet un acide nucléique dérivé du gène Sh2 et comprenant au moins un site polymorphe tel que défini dans la présente description, ainsi que des vecteurs recombinants comprenant un tel acide nucléique.
Elle a également trait à une cellule hôte transformée par un acide nucléique ou un vecteur recombinant décrit ci-dessus, de préférence une cellule hôte bactérienne ou végétale. Elle concerne encore une plante transformée par un acide nucléique ou par un vecteur recombinant décrit ci-dessus.
Elle est aussi relative à des anticorps dirigés spécifiquement contre un polypeptide SH2 codé par un acide nucléique dérivé du gène Sh2 comprenant un site polymorphe tel que défini dans la présente description ainsi qu'à un nécessaire ou kit comprenant l'un de ces anticorps ou encore une combinaison de plusieurs de ces anticorps.
DESCRIPTION DES FIGURES
La Figure 1 représente la séquence nucléotidique du gène Sh2 décrite par Shaw et Hannah (1992), qui est identique à la séquence SEQ ID N°1 du listage de séquence.
La première colonne de gauche représente la numérotation en nucléotides de la séquence SEQ ID N° 1 du listage de séquences de la présente description. Le premier nucleotide est numéroté 1.
La seconde colonne de gauche représente la numérotation en nucléotides prescrite par Shaw et Hannah (1992), qui est basée sur la position du nucleotide du site d'initiation de la transcription, numéroté +1. Le nucleotide en position 1 de la séquence SEQ ID N°1 est le nucleotide en position -1020 selon la nomenclature de Shaw et Hannah (1992).
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
La demanderesse a identifié, dans la séquence du gène Sh2, une collection de polymorphismes dont elle a montré qu'ils étaient, chacun, associés à au moins une caractéristique phénotypique définissant la qualité de la graine d'une plante. L'identification de ces polymorphismes a rendu possible la mise au point de procédés de détection de ces polymorphismes à partir de l'ADN d'un individu végétal, cellule végétale, plante au stade plantule, plante à un stade précoce de développement ou plante au stade végétatif, permettant de prédire quelles sont ou seront les caractéristiques phénotypiques liées à la qualité de la graine ou de la future graine. L'association entre la présence d'un allèle défini d'un site polymorphe du gène Sh2 et au moins un caractère de remplissage du grain permet de mettre en relation un allèle donné ou une combinaison d'allèles donnés (haplotype) et un caractère phénotypique ou une combinaison de caractères phénotypiques définissant la qualité de la graine. Les inventeurs ont montré que le polymorphisme du gène Sh2 est statistiquement associé à des caractères de qualité de la graine, tels que :
- le nombre de graines par épi - la masse de la graine mature
- la teneur en protéines de la graine
- la teneur en amidon de la graine
- la teneur en amylose de la graine
- le rapport teneur en protéines/teneur en amidon dans la graine.
L'identification d'allèles particuliers de sites polymorphes associés aux caractéristiques de qualité de la graine, dans la séquence du gène Sh2, a permis de définir des séquences oligonucléotidiques spécifiques d'un allèle donné d'un ou de plusieurs sites polymorphes du gène Sh2 et d'utiliser ces séquences en tant que sondes ou amorces pour faciliter la sélection de plantes assistée par marqueurs, pour générer des séquences alléliques favorables par mutagénèse dirigée, ou pour cloner des séquences apportant un caractère agronomique favorable, lié à la qualité de la graine, à la plante transformée avec ces séquences. II a aussi été montré selon l'invention que certains polymorphismes du gène Sh2 entraînaient des modifications dans la séquence d'acides aminés. Les allèles favorables repérés au niveau de ces polymorphismes peuvent être utilisés pour modifier la structure ou l'activité de l'enzyme AGPase. Le gène Sh2 utilisé comme séquence nucléotidique de référence à partir de laquelle sont définis les divers sites polymorphes nouvellement identifiés selon l'invention est la séquence nucléotidique référencée dans la base de données GenBank sous le numéro d'accès M81603 et qui est reproduite comme la séquence SEQ ID N°1 du listage de séquences. Le gène Sh2 de séquence SEQ ID N°1 possède 7320 nucléotides longueur. Il possède 16 exons, respectivement :
- Exon n°1 : du nucleotide en position 1021 jusqu'au nucleotide en position 1082 de la séquence SEQ ID N°1 , ce qui correspond à la séquence allant du nucleotide en position 1 jusqu'au nucleotide en position 62 du gène Sh2 selon la nomenclature de Shaw et Hannah (1992), telle qu'illustrée sur la Figure 1. ;
- Exon n°2 : du nucleotide en position 1521 jusqu'au nucleotide en position 1745 de la séquence SEQ ID N°1 , ce qui correspond à la séquence allant du nucleotide en position 501 jusqu'au nucleotide en position 725 du gène Sh2 selon la nomenclature de Shaw et Hannah (1992). ;
- Exon n°3 : du nucleotide en position 2222 jusqu'au nucleotide en position 2344 de la séquence SEQ ID N°1 , ce qui correspond à la séquence allant du nucleotide en position 1202 jusqu'au nucleotide en position 1324 du gène Sh2 selon la nomenclature de Shaw et Hannah (1992). ;
- Exon n°4 : du nucleotide en position 2629 jusqu'au nucleotide en position 2799 de la séquence SEQ ID N°1 , ce qui correspond à la séquence allant du nucleotide en position 1609 jusqu'au nucleotide en position 1779 du gène Sh2 selon la nomenclature de Shaw et Hannah (1992). ;
- Exon n°5 : du nucleotide en position 3036 jusqu'au nucleotide en position 3125 de la séquence SEQ ID N°1 , ce qui correspond à la séquence allant du nucleotide en position 2016 jusqu'au nucleotide en position 2105 du gène Sh2 selon la nomenclature de Shaw et Hannah (1992). ;
- Exon n°6 : du nucleotide en position 3217 jusqu'au nucleotide en position 3303 de la séquence SEQ ID N°1 , ce qui correspond à la séquence allant du nucleotide en position 2197 jusqu'au nucleotide en position 2283 du gène Sh2 selon la nomenclature de Shaw et Hannah (1992). ;
- Exon n°7 : du nucleotide en position 3388 jusqu'au nucleotide en position 3443 de la séquence SEQ ID N°1 , ce qui correspond à la séquence allant du nucleotide en position 2368 jusqu'au nucleotide en position 2423 du gène Sh2 selon la nomenclature de Shaw et Hannah (1992). ;
- Exon n°8 : du nucleotide en position 3546 jusqu'au nucleotide en position 3639 de la séquence SEQ ID N°1 , ce qui correspond à la séquence allant du nucleotide en position 2526 jusqu'au nucleotide en position 2619 du gène Sh2 selon la nomenclature de Shaw et Hannah (1992). ;
- Exon n°9 : du nucleotide en position 3805 jusqu'au nucleotide en position 3917 de la séquence SEQ ID N°1 , ce qui correspond à la séquence allant du nucleotide en position 2785 jusqu'au nucleotide en position 2897 du gène Sh2 selon la nomenclature de Shaw et Hannah (1992). ;
- Exon n°10 : du nucleotide en position 3986 jusqu'au nucleotide en position 4058 de la séquence SEQ ID N°1, ce qui correspond à la séquence allant du nucleotide en position 2966 jusqu'au nucleotide en position 3038 du gène Sh2 selon la nomenclature de Shaw et Hannah (1992). ;
- Exon n°1 1 : du nucleotide en position 4217 jusqu'au nucleotide en position 4297de la séquence SEQ ID N°1 , ce qui correspond à la séquence allant du nucleotide en position 3197 jusqu'au nucleotide en position 3277 du gène Sh2 selon la nomenclature de Shaw et Hannah (1992). ;
- Exon n°12 : du nucleotide en position 4463 jusqu'au nucleotide en position 4549 de la séquence SEQ ID N°1 , ce qui correspond à la séquence allant du nucleotide en position 3443 jusqu'au nucleotide en position 3529 du gène Sh2 selon la nomenclature de Shaw et Hannah (1992). ;
- Exon n°13 : du nucleotide en position 4620 jusqu'au nucleotide en position 4724 de la séquence SEQ ID N°1 , ce qui correspond à la séquence allant du nucleotide en position 3600 jusqu'au nucleotide en position 3704 du gène Sh2 selon la nomenclature de Shaw et Hannah (1992). ;
- Exon n°14 : du nucleotide en position 6546 jusqu'au nucleotide en position 6652 de la séquence SEQ ID N°1 , ce qui correspond à la séquence allant du nucleotide en position 5526 jusqu'au nucleotide en position 5632 du gène Sh2 selon la nomenclature de Shaw et Hannah (1992). ;
- Exon n°15 : du nucleotide en position 6735 jusqu'au nucleotide en position 6795 de la séquence SEQ ID N°1 , ce qui correspond à la séquence allant du nucleotide en position 5715 jusqu'au nucleotide en position 5775 du gène Sh2 selon la nomenclature de Shaw et Hannah (1992). ;
- Exon n°16 : du nucleotide en position 6912 jusqu'au nucleotide en position 7287 de la séquence SEQ ID N°1 , ce qui correspond à la séquence allant du nucleotide en position 5892 jusqu'au nucleotide en position 6267 du gène Sh2 selon la nomenclature de Shaw et Hannah (1992). ;
Dans la présente description, la numérotation utilisée pour définir la position du nucleotide polymorphe ou de la séquence nucléotidique polymorphe d'un site polymorphe du gène Sh2 est exclusivement celle décrite par Shaw et Hannah (1992) et qui est rappelée dans la première colonne de gauche de la séquence du gène Sh2 représentée à la Figure 1.
Sites polymorphes du gène Sh2 selon l'invention
Le polymorphisme du gène Sh2 a été déterminé à partir de l'ADN provenant de 33 lignées consanguines de maïs, dont les caractéristiques phénotypiques liées à la qualité du grain ont été simultanément analysées.
L'analyse de polymorphisme a permis de caractériser 72 sites polymorphes dans la séquence du gène Sh2.
Parmi ces 72 sites polymorphes, 19 d'entre eux ont présenté une différence nucléotidique pour une seule des lignées étudiées. Ces 19 sites polymorphes ne présentaient pas une distribution statistique informative pouvant être mise en œuvre dans une étude d'association entre la présence d'un allèle donné de ces sites polymorphes et la constatation d'un caractère phénotypique donné de la qualité de la graine. Parmi les 53 sites polymorphes informatifs, certains d'entre eux ont été considérés comme redondants en ce que les mêmes allèles de deux ou plus de ces sites étaient systématiquement retrouvés conjointement dans l'ADN de plusieurs lignées. Deux sites polymorphes redondants apportent la même information statistique concernant l'association de l'un de leurs allèles avec une caractéristique phénotypique déterminée de la qualité de la graine. Ils permettent une discrimination identique entre deux lignées ou deux groupes de lignées. Selon l'invention, 43 sites polymorphes du gène Sh2 ont été retenus comme constituant des polymorphismes ou des groupes de polymorphismes d'intérêt, dont un allèle déterminé et caractérisé est statistiquement associé à une caractéristique phénotypique de la qualité de la graine et parfois à plusieurs caractéristiques phénotypiques de la qualité de la graine. Par « site polymorphe » du gène Sh2, on entend une région de la séquence du gène Sh2 laquelle, dans le génome de certaines lignées végétales, plus spécifiquement dans certaines lignées de maïs, diffère par un ou plusieurs nucléotides consécutifs par rapport à la région correspondante du gène Sh2 défini par la séquence SEQ ID N°1. Un site polymorphe peut consister en une variation d'un seul nucleotide qui peut prendre deux significations, par exemple une base A ou une base T, un tel site polymorphe étant alors désigné polymorphisme SNP (pour « Single Nucleotide Polymorphism »). Un site polymorphe peut aussi consister en l'addition ou la délétion d'un ou plusieurs nucléotides consécutifs, par rapport à la séquence de référence SEQ ID N°1. Ce second type de sites polymorphes est désigné « indel » (pour « Insertion- Délétion »).
Les sites polymorphes du gène Sh2 caractérisés dans la présente invention sont définis ci-dessous. Ils sont caractérisés par leur différence nucléotidique par rapport à la séquence du gène Sh2 SEQ ID N°1 de référence et dont les positions de nucléotides sont définis selon la nomenclature de Shaw et Hannah (1992) . Tels qu'ils sont définis ci- dessous, les sites polymorphes du gène Sh2 sont caractérisés par leur allèle dont la présence, dans le génome d'une plante, est associée à l'expression d'un caractère phénotypique modifié de qualité de la graine. (a) un acide nucléique dans lequel le nucleotide correspondant au nucleotide en position -921 du gène Sh2 est un G ;
(b) un acide nucléique dans lequel les nucléotides correspondant aux nucléotides en positions -830 à -824, de séquence 5'-TGAGAAA-3', du-gène Sh2 sont absents ;
(c) un acide nucléique dans lequel les nucléotides correspondant aux nucléotides en positions -580 à -573, de séquence 5'-TCACCTAT-3', du gène Sh2 sont absents ; (d) un acide nucléique dans lequel le nucleotide correspondant au nucleotide en position -438 du gène Sh2 est un G ;
(e) un acide nucléique dans lequel le nucleotide correspondant au nucleotide en position -362 du gène Sh2 est un A ;
(f) un acide nucléique dans lequel le nucleotide correspondant au nucleotide en position —347 du gène Sh2 est un T ;
(g) un acide nucléique dans lequel le nucleotide correspondant au nucleotide en position -296 du gène Sh2 est un T ;
(h) un acide nucléique dans lequel le nucleotide correspondant au nucleotide en position -277 du gène Sh2 est un T ; (i) un acide nucléique dans lequel le nucleotide correspondant au nucleotide en position -266 du gène Sh2 est un C ;
(j) un acide nucléique dans lequel le nucleotide correspondant au nucleotide en position -168 du gène Sh2 est un A ;
(k) un acide nucléique dans lequel le nucleotide correspondant au nucleotide en position -15 du gène Sh2 est un A ;
(I) un acide nucléique dans lequel le nucleotide correspondant au nucleotide en position +35 du gène Sh2 est un T ;
(m) un acide nucléique dans lequel un T additionnel se trouve après le nucleotide en position +304 du gène Sh2 ; (n) un acide nucléique dans lequel le nucleotide correspondant au nucleotide en position +515 du gène Sh2 est un C ;
(o) un acide nucléique dans lequel le nucleotide correspondant au nucleotide en position +587 du gène Sh2 est un C ;
(p) un acide nucléique dans lequel le nucleotide correspondant au nucleotide en position +678 du gène Sh2 est un A ; (q) un acide nucléique dans lequel le nucleotide correspondant au nucleotide en position +960 du gène Sh2 est un A ;
(r) un acide nucléique dans lequel le nucleotide correspondant au nucleotide en position +1059 du gène Sh2 est un G ; (s) un acide nucléique dans lequel le nucleotide correspondant au nucleotide en position +1068 du gène Sh2 est un G ;
(t) un acide nucléique dans lequel le nucleotide A correspondant au nucleotide en position +1081 du gène Sh2 est absent;
(u) un acide nucléique dans lequel le nucleotide correspondant au nucleotide en position +1473 du gène Sh2 est un C ;
(v) un acide nucléique dans lequel un T additionnel est présent après le nucleotide en position +1505 du gène Sh2 ;
(w) un acide nucléique dans lequel un T additionnel est présent après le nucleotide en position +1542 du gène Sh2 ; (x) un acide nucléique dans lequel le nucleotide correspondant au nucleotide en position +1867 du gène Sh2 est un C ;
(y) un acide nucléique dans lequel le nucleotide T correspondant au nucleotide en position +2514 du gène Sh2 est absent;
(z) un acide nucléique dans lequel un T additionnel est présent après le nucleotide en position 2771 du gène Sh2;
(ab) un acide nucléique dans lequel le nucleotide correspondant au nucleotide en position +2939 du gène Sh2 est un G ;
(ac) un acide nucléique dans lequel le nucleotide correspondant au nucleotide en position +2983 du gène Sh2 est un C ; et (ad) un acide nucléique comprenant l'insertion de la séquence
5'-GTTTTTATTTA-3' après le nucleotide correspondant au nucleotide en position +3123 du gène Sh2.
Pour le site polymorphe +587, la présence d'une base C constitue une substitution de base conservative n'entraînant aucun changement dans la séquence d'acides aminés du polypeptide SH2 correspondant, par rapport au polypeptide SH2 de séquence SEQ ID N°52 codé par la séquence SEQ ID N°1.
Pour le site polymorphe +678, la présence d'une base A entraîne le remplacement, dans la séquence du polypeptide SH2 de séquence SEQ ID N° 52, de l'acide aminé Alanine, codé par la séquence SEQ ID N° 1 à cette position, par l'acide aminé Thréonine.
Pour le site polymorphe +2983, la présence d'une base C entraîne le remplacement, dans la séquence du polypeptide SH2 de séquence SEQ ID N°52, de l'acide aminé Leucine, codé par la séquence SEQ ID N° 1 à cette position, par l'acide aminé Serine.
Comme exposé précédemment, la caractérisation selon l'invention de sites polymorphes informatifs au sein de la séquence du gène Sh2 a rendu possible la construction de divers moyens de détection d'un allèle donné de chacun des sites polymorphes, utiles notamment dans des procédés de sélection de lignées de plantes, spécifiquement de maïs, possédant des caractéristiques phénotypiques de qualité de la graine recherchées.
De tels procédés de sélection de lignées de plantes peuvent être réalisés à des stades précoces du développement de la plante, avant la formation des graines, à un moment du développement de la plante pour lequel il n'est pas possible de déterminer les caractéristiques phénotypiques de la graine. Les procédés mettant en œuvre une analyse des sites polymorphes du gène Sh2 de l'invention ont donc une valeur prédictive d'un grand intérêt technique et économique.
Utilisations et procédés mettant en œuyre les caractéristiques des sites polymorphes selon l'invention.
L'invention a pour objet l'utilisation d'une sonde ou d'une amorce nucléotidique dans un procédé de sélection de plantes possédant des caractéristiques phénotypiques améliorées de qualité des graines, caractérisée en ce que ladite sonde ou ladite amorce nucléotidique permet la détection d'une base polymorphe ou d'une séquence nucléotidique polymorphe définissant un allèle d'un site polymorphe du gène Sh2 de séquence SEQ ID N°1 , ladite base polymorphe ou ladite séquence nucléotidique polymorphe étant contenue dans un acide nucléique inclus dans un gène Sh2, choisi parmi les acides nucléiques suivants :
(a) un acide nucléique dans lequel le nucleotide correspondant au nucleotide en position -921 du gène Sh2 est un G ; (b) un acide nucléique dans lequel les nucléotides correspondant aux nucléotides en positions -830 à -824, de séquence 5'-TGAGAAA-3', du gène Sh2 sont absents ;
(c) un acide nucléique dans lequel les nucléotides correspondant aux nucléotides en positions -580 à -573, de séquence 5'-TCACCTAT-3', du gène Sh2 sont absents ;
(d) un acide nucléique dans lequel le nucleotide correspondant au nucleotide en position -438 du gène Sh2 est un G ;
(e) un acide nucléique dans lequel le nucleotide correspondant au nucleotide en position -362 du gène Sh2 est un A ;
(f) un acide nucléique dans lequel le nucleotide correspondant au nucleotide en position —347 du gène Sh2 est un T ;
(g) un acide nucléique dans lequel le nucleotide correspondant au nucleotide en position -296 du gène Sh2 est un T ; (h) un acide nucléique dans lequel le nucleotide correspondant au nucleotide en position -277 du gène Sh2 est un T ;
(i) un acide nucléique dans lequel le nucleotide correspondant au nucleotide en position -266 du gène Sh2 est un C ;
(j) un acide nucléique dans lequel le nucleotide correspondant au nucleotide en position -168 du gène Sh2 est un A ;
(k) un acide nucléique dans lequel le nucleotide correspondant au nucleotide en position -15 du gène Sh2 est un A ;
(I) un acide nucléique dans lequel le nucleotide correspondant au nucleotide en position +35 du gène Sh2 est un T ; (m) un acide nucléique dans lequel un T additionnel est présent après le nucleotide en position +304 du gène Sh2 ;
(n) un acide nucléique dans lequel le nucleotide correspondant au nucleotide en position +515 du gène Sh2 est un C ;
(o) un acide nucléique dans lequel le nucleotide correspondant au nucleotide en position +587 du gène Sh2 est un C ;
(p) un acide nucléique dans lequel le nucleotide correspondant au nucleotide en position +678 du gène Sh2 est un A ;
(q) un acide nucléique dans lequel le nucleotide correspondant au nucleotide en position +960 du gène Sh2 est un A ; (r) un acide nucléique dans lequel le nucleotide correspondant au nucleotide en position +1059 du gène Sh2 est un G ;
(s) un acide nucléique dans lequel le nucleotide correspondant au nucleotide en position +1068 du gène Sh2 est un G ; (t) un acide nucléique dans lequel le nucleotide A correspondant au nucleotide en position +1081 du gène Sh2 est absent;
(u) un acide nucléique dans lequel le nucleotide correspondant au nucleotide en position +1473 du gène Sh2 est un C ;
(v) un acide nucléique dans lequel un T additionnel est présent après le nucleotide en position +1505 du gène Sh2;
(w) un acide nucléique dans lequel un T additionnel est présent après le nucleotide en position +1542 du gène Sh2 ;
(x) un acide nucléique dans lequel le nucleotide correspondant au nucleotide en position +1867 du gène Sh2 est un C ; (y) un acide nucléique dans lequel le nucleotide T correspondant au nucleotide en position +2514 du gène Sh2 est absent;
(z) un acide nucléique dans lequel un T additionnel est présent après le nucleotide en position 2771 du gène Sh2;
(ab) un acide nucléique dans lequel le nucleotide correspondant au nucleotide en position +2939 du gène Sh2 est un G ;
(ac) un acide nucléique dans lequel le nucleotide correspondant au nucleotide en position +2983 du gène Sh2 est un C ; et
(ad) un acide nucléique comprenant l'insertion de la séquence 5'-GTTTTTATTTA-3' après le nucleotide correspondant au nucleotide en position +3123 du gène Sh2.
L'expression «qualité du grain» englobe les caractères influant sur la qualité et la quantité de la graine tels que par exemple : le nombre de graines par épi, la masse des graines matures, la teneur en protéines, en amidon, en amylose et le rapport pondéral teneur en protéines/teneur en amidon dans la graine, ainsi que tous les caractères complexes incluant un ou plusieurs de ces caractères.
Une des méthodes pouvant être utilisée pour déterminer le phénotype d'un individu à ce ou ces sites peut consister à : i) obtenir un échantillon d'ADN d'un individu, ii) identifier l'allèle à une ou plusieurs des positions citées ci- dessus (en référence aux positions décrites selon la séquence Genbank n°M81603) dans le gène Sh2, iii) prédire la qualité du grain de l'individu en référence à l'association du polymorphisme du gène Sh2 tel que décrit ci-dessus et du caractère de qualité de grain. L'échantillon d'ADN est obtenu selon les méthodes classiques d'extractions d'ADN utilisées chez les plantes, en particulier à partir de jeunes feuilles de maïs (Dellaporta et al. 1983). L'échantillon d'ADN devra contenir au moins la séquence du gène
Sh2, c'est-à-dire une région de cette séquence pouvant être amplifiée par une quelconque technique connue de l'art antérieur, telle que par exemple, la PCR.
La qualité du grain de l'individu étudié peut être déterminée en référence à la présence d'un allèle à au moins une, plusieurs ou toutes les positions décrites en combinaison avec d'autres polymorphismes dans le gène Sh2 qui sont connus ou qui seront caractérisés ultérieurement
Il existe un grand nombre de procédures d'analyse connues dans l'état de la technique qui peuvent être utilisées par l'homme du métier pour détecter la forme allélique d'un ou plusieurs sites polymorphes du gène Sh2 de l'invention. En général, la détection des allèles requiert une technique de discrimination des polymorphismes. En général, les méthodes courantes impliquent l'amplification de la séquence cible puis l'identification des allèles par des hybridations de courtes sondes, par restriction par des endonucléases, par discrimination par polymérases ou ligases, en observant le nucleotide incorporé par la polymérase en fonction de la séquence-matrice, ou par détection de mésappariement sur de l'ADN double brin. Parmi ces techniques de détection d'allèles, il peut être cité les techniques suivantes : séquençage d'ADN, séquençage par hybridation,
SSCP (Single strand conformation polymorphism analysis), DGGE
(Denaturing gradient gel electrophoresis), TGGE (Température gradient gel electrophoresis), analyse d'hétéroduplex, CMC (Chemical mismatch cleavage), Dot blots, Reverse dot blots, oligonucleotide array (puce à ADN), Taqman™ (US 5210015 et US 5487972, Hoffmann-La Roche), ARMS™ (Amplification refractory mutation System), ALEX™ (Amplification refractory mutation System linear extension, EP 332435B1 , Zeneca Itd)), COPS (Gibbs et al. 1989), mini-séquençage, APEX (Arrayed primer extension), RFLP (Restriction fragment length polymorphism), sites de restriction sur produit de PCR (CAPS), OLA (Oligonucleotide ligation assay), pyroséquençage (Nyrèn et al. 1997).
Ces techniques peuvent être utilisées en combinaison avec des systèmes de générations de signaux comme, par exemple, les techniques suivantes : FRET (Fluorescence résonance energy transfer), fluorescence quenching, fluorescence polarisation (UK 2228998, Zeneca Itd), chimioluminescence, électrochimioluminescence, radioactivité, colorimétrie, hybridization protection assay, spectrométrie de masse. D'autres techniques d'amplification telles que la SSR (Self sustained replication), LCR (Ligase chain reaction), SDA (Strand displacement amplification) ou leb-DNA (branched DNA). La plupart de ces techniques de détection des variations alléliques sont récapitulées dans des ouvrages standard comme « Laboratory Protocols for mutation détection », Ed. by U.Landegren, Oxford University press, 1996 et « PCR », 2nd Edition by Newton et Graham, BIOS Scientific Publishers Ltd, 1997). D'autres protocoles de séquençage, de clonage et autres aspects de biologie moléculaire sont répertoriés dans «Gènes VII» (Lewin, 1999).
Ces techniques peuvent utiliser des oligonucléotides synthétisés à partir des séquences suivantes (la forme allélique du SNP ou indel détecté dans l'invention est indiquée entre parenthèses, et la différence entre la forme allélique de la variété de référence BMS et l'allèle décrit est indiquée en gras) :
Dans l'utilisation d'une sonde ou d'une amorce nucléotidique, telle qu'elle est définie ci-dessus, ladite sonde ou ladite amorce nucléotidique peut être caractérisée en ce qu'elle permet de discriminer entre la présence d'un premier acide nucléique (1 ) et d'un second acide nucléique (2), lesdits acides nucléiques (1 ) et (2) étant choisis parmi les suivants : Sites polymorphes
(a) Site - 921 : l'acide nucléique (1 ) de séquence SEQ ID N°2 dans lequel le nucleotide en position 41 est une base G et l'acide nucléique (2) de séquence SEQ ID N°2 dans lequel le nucleotide en position 41 est une base A ;
(b) Site - 438 : l'acide nucléique (1 ) de séquence SEQ ID N°3 dans lequel le nucleotide en position 41 est une base G et l'acide nucléique (2) de séquence SEQ ID N°3 dans lequel le nucleotide en position 41 est une base A ; (c) Site - 362 : l'acide nucléique (1 ) de séquence SEQ ID N°4 dans lequel le nucleotide en position 41 est une base A et l'acide nucléique (2) de séquence SEQ ID N°4 dans lequel le nucleotide en position 41 est une base G ;
(d) Site - 347 : l'acide nucléique (1) de séquence SEQ ID N°5 dans lequel le nucleotide en position 41 est une base T et l'acide nucléique
(2) de séquence SEQ ID N°5 dans lequel le nucleotide en position 41 est une base C ;
(e) Site - 296 : l'acide nucléique (1 ) de séquence SEQ ID N°6 dans lequel le nucleotide en position 41 est une base T et l'acide nucléique (2) de séquence SEQ ID N°6 dans lequel le nucleotide en position 41 est une base C ;
(f) Site - 277 : l'acide nucléique (1 ) de séquence SEQ ID N°7 dans lequel le nucleotide en position 41 est une base T et l'acide nucléique (2) de séquence SEQ ID N°7 dans lequel le nucleotide en position 41 est une base C ;
(g) Site- 266 : l'acide nucléique (1 ) de séquence SEQ ID N°8 dans lequel le nucleotide en position 41 est une base C et l'acide nucléique (2) de séquence SEQ ID N°8 dans lequel le nucleotide en position 41 est une base T ; (h) Site - 168 : l'acide nucléique (1) de séquence SEQ ID N°9 dans lequel le nucleotide en position 41 est une base A et l'acide nucléique (2) de séquence SEQ ID N°9 dans lequel le nucleotide en position 41 est une base G ; (i) Site - 15 : l'acide nucléique (1 ) de séquence SEQ ID N°10 dans lequel le nucleotide en position 41 est une base A et l'acide nucléique (2) de séquence SEQ ID N°10 dans lequel le nucleotide en position 41 est une base G ;
(j) Site + 35 : l'acide nucléique (1 ) de séquence SEQ ID N°11 dans lequel le nucleotide en position 41 est une base T et l'acide nucléique (2) de séquence SEQ ID N°11 dans lequel le nucleotide en position 41 est une base C ;
(k) Site + 515 : l'acide nucléique (1 ) de séquence SEQ ID N°12 dans lequel le nucleotide en position 41 est une base C et l'acide nucléique (2) de séquence SEQ ID N°12 dans lequel le nucleotide en position 41 est une base T ;
(1) Site + 587 : l'acide nucléique (1 ) de séquence SEQ ID N°13 dans lequel le nucleotide en position 41 est une base C et l'acide nucléique
(2) de séquence SEQ ID N°13 dans lequel le nucleotide en position 41 est une base T ; (m) Site + 678 : l'acide nucléique (1 ) de séquence SEQ ID N°14 dans lequel le nucleotide en position 41 est une base A et l'acide nucléique (2) de séquence SEQ ID N°14 dans lequel le nucleotide en position 41 est une base G ; (n) Site + 960 : l'acide nucléique (1 ) de séquence SEQ ID N°15 dans lequel le nucleotide en position 41 est une base A et l'acide nucléique
(2) de séquence SEQ ID N°15 dans lequel le nucleotide en position 41 est une base G ;
(o) Site + 1059 : l'acide nucléique (1 ) de séquence SEQ ID N°16 dans lequel le nucleotide en position 41 est une base G et l'acide nucléique (2) de séquence SEQ ID N°16 dans lequel le nucleotide en position 41 est une base C ;
(p) Site + 1068 : l'acide nucléique (1 ) de séquence SEQ ID N°17 dans lequel le nucleotide en position 41 est une base G et l'acide nucléique (2) de séquence SEQ ID N°17 dans lequel le nucleotide en position 41 est une base T ;
(q) Site + 1473 : l'acide nucléique (1 ) de séquence SEQ ID N°18 dans lequel le nucleotide en position 41 est une base C et l'acide nucléique (2) de séquence SEQ ID N°18 dans lequel le nucleotide en position 41 est une base T ; (r) Site + 1867 : l'acide nucléique (1 ) de séquence SEQ ID N°19 dans lequel le nucleotide en position 41 est une base C et l'acide nucléique
(2) de séquence SEQ ID N°19 dans lequel le nucleotide en position 41 est une base T ; (s) Site + 2939 : l'acide nucléique (1 ) de séquence SEQ ID N°20 dans lequel le nucleotide en position 41 est une base G et l'acide nucléique
(2) de séquence SEQ ID N°20 dans lequel le nucleotide en position 41 est une base T ;
(t) Site + 2983 : l'acide nucléique (1 ) de séquence SEQ ID N°21 dans lequel le nucleotide en position 41 est une base C et l'acide nucléique
(2) de séquence SEQ ID N°21 dans lequel le nucleotide en position 41 est une base T ;
(u) Site - 830 à -824 : l'acide nucléique (1 ) de séquence SEQ ID N°23 et l'acide nucléique (2) de séquence SEQ ID N° 22 ; (v) Site - 580 à - 573 : l'acide nucléique (1 ) de séquence SEQ ID
N°25 et l'acide nucléique (2) de séquence SEQ ID N° 24 ;
(w) Site + 304 : l'acide nucléique (1 ) de séquence SEQ ID N°27 et l'acide nucléique (2) de séquence SEQ ID N° 26 ;
(x) Site + 1081 : l'acide nucléique (1 ) de séquence SEQ ID N°29 et l'acide nucléique (2) de séquence SEQ ID N° 28 ;
(y) Site + 1505 : l'acide nucléique (1 ) de séquence SEQ ID N°31 et l'acide nucléique (2) de séquence SEQ ID N° 30 ;
(z) Site + 1542 : l'acide nucléique (1 ) de séquence SEQ ID N°33 et l'acide nucléique (2) de séquence SEQ ID N° 32 ; (aa) Site + 2514 : l'acide nucléique (1 ) de séquence SEQ ID N°35 et l'acide nucléique (2) de séquence SEQ ID N° 34 ;
(ab) Site + 2771 : l'acide nucléique (1 ) de séquence SEQ ID N°37 et l'acide nucléique (2) de séquence SEQ ID N° 36 ; et
(ac) Site + 3123 : l'acide nucléique (1 ) de séquence SEQ ID N°39 et l'acide nucléique (2) de séquence SEQ ID N° 38.
Selon un autre mode de réalisation préféré, ledit acide nucléique est un acide nucléique s'hybridant spécifiquement avec un acide nucléique de séquence complémentaire à l'un quelconque des acides nucléiques (1 ) ou (2) définis en (a) à (ac) ci-dessus. L'utilisation ci-dessus peut être aussi caractérisée en ce que : a) la sonde nucléotidique s'hybride spécifiquement avec un acide nucléique d'une première forme allélique de la base polymorphe ou de la séquence nucléotidique polymorphe définissant un premier allèle d'un site polymorphe du gène Sh2 et ne s'hybride pas avec un acide nucléique d'une seconde forme allélique de la base polymorphe ou de la séquence nucléotidique polymorphe définissant un second allèle d'un site polymorphe du gène Sh2 ; ou b) l'amorce nucléotidique hybride spécifiquement avec une séquence nucléotidique contenue dans un gène Sh2, ladite séquence nucléotidique étant localisée en amont d'une forme allélique d'une base polymorphe ou d'une séquence nucléotidique polymorphe dont la présence ou l'absence définit un allèle d'un site polymorphe du gène Sh2.
Le polymorphisme du gène Sh2 une fois identifié par l'une des méthodes décrites ci-dessus peut être utilisé, selon l'invention, pour réaliser une sélection prédictive de plantes avec une meilleure qualité de grain, y compris la sélection de plantes au stade plantule et/ou au stade précoce et/ou au stade végétatif.
La séquence nucléotidique du gène Sh2 de maïs SEQ ID N°1 présente une forte identité en nucléotides avec les séquences nucléotidiques de nombreuses céréales, en particulier de nombreuses variétés de graminées, identité qui est presque totale dans le cadre ouvert de lecture (ORF).
En particulier, la séquence du gène Sh2 de maïs possède une très grande identité en nucléotides avec le gène Sh2 de sorgho, l'identité la plus grande entre les deux séquences étant retrouvée dans le cadre ouvert de lecture (ORF). Ainsi, le polypeptide SH2 codé par le gène Sh2 de sorgho possède une différence d'un seul acide aminé avec le polypeptide SH2 codé par le gène Sh2 de maïs SEQ ID N°1. Sans vouloir être liés par une quelconque théorie, les inventeurs pensent que les sites polymorphes retrouvés dans le gène Sh2 de maïs sont également retrouvés dans le gène Sh2 du génome d'autres céréales, en particulier graminées, et encore plus spécifiquement dans le gène Sh2 du sorgho. Les sites polymorphes localisés dans le cadre ouvert de lecture du gène Sh2 de maïs SEQ ID N°1 sont ceux qui ont statistiquement le plus de probabilité de se retrouver aussi dans les gènes Sh2 d'autres céréales, en particulier d'autres graminées, comme le sorgho.
La sélection prédictive s'applique donc en particulier aux céréales telles que par exemple le maïs et le sorgho. L'utilisation du polymorphisme allélique décrit dans l'invention s'applique particulièrement à la sélection de variétés de maïs. Lorsqu'une population est ségrégeante sur plusieurs loci affectant plusieurs caractères de qualité de grain, la sélection assistée par marqueur (SAM) est plus efficace qu'une simple évaluation phénotypique puisqu'elle permet notamment des cycles de sélection beaucoup plus rapides que les techniques classiques de caractérisation directe du phénotype. Un autre avantage de la SAM par rapport à l'évaluation phénotypique est que les analyses sont complètement indépendantes des aléas climatiques.
L'utilisation ci-dessus est en outre caractérisée en ce que les caractéristiques phénotypiques améliorées de qualité de la graine sont choisies parmi le nombre de graines par épi, la masse des graines, la teneur en protéines des graines, la teneur en amidon des graines, la teneur en amylose des graines et le rapport pondéral protéines/amidon des graines, ou une combinaison de ces caractéristiques phénotypiques.
L'invention a aussi pour objet un procédé pour déterminer l'identité de l'allèle d'un site polymorphe au sein d'un acide nucléique dérivé d'un gène Sh2 en vue de sélectionner une plante possédant des caractéristiques phénotypiques améliorées de qualité de la graine, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de caractérisation de l'identité de la base polymorphe ou de la séquence nucléotidique polymorphe présente à au moins une position nucléotidique dudit acide nucléique correspondant à au moins un des nucléotides en position - 921 , -830 à -824, -580 à -573,-438,- 362, -347, -296, -277, -266, -168, - 15, +35, +304, +515, +587, +678, +960, +1059, +1068, +1081, +1473, +1505, +1542, +1867, +2514, +2771 , +2939, +2983 et +3123 du gène Sh2 de séquence SEQ ID N°1. Selon un premier aspect, le procédé ci-dessus est caractérisé en ce que la caractérisation du site polymorphe est réalisée par séquençage dudit acide nucléique.
Selon un second aspect du procédé ci-dessus, la caractérisation de l'identité du site polymorphe est réalisée par hybridation d'une sonde nucléotidique s'hybridant spécifiquement avec la séquence d'un allèle déterminé du gène Sh2. Selon cet aspect, la caractérisation de l'identité du site polymorphe est réalisée par hybridation d'une sonde nucléotidique s'hybridant spécifiquement avec une base polymorphe ou une séquence nucléotidique polymorphe définissant un allèle d'un site polymorphe déterminé du gène Sh2.
Selon un troisième aspect du procédé ci-dessus, la caractérisation du site polymorphe est réalisée par élongation d'une amorce nucléotidique s'hybridant spécifiquement avec une séquence nucléotidique localisée en amont d'une forme allélique d'une base polymorphe ou d'une séquence nucléotidique polymorphe définissant un allèle d'un site polymorphe déterminé d'un gène Sh2.
Selon une caractéristique particulière de ce troisième aspect, la caractérisation de l'identité du site polymorphe est réalisée par hybridation d'une amorce nucléotidique s'hybridant spécifiquement avec la séquence située en amont, du côté 5' de la base polymorphe ou de la séquence nucléotidique polymorphe définissant un allèle donné d'un site polymorphe du gène Sh2 , puis élongation de l'amorce. La caractérisation de l'allèle polymorphe peut être réalisée par séquençage du produit de l'élongation de l'amorce. Dans un mode de réalisation particulier, le nucleotide situé à l'extrémité 3' de l'amorce hybride avec le nucleotide situé immédiatement en amont du côté 5' de la base polymorphe ou de la séquence nucléotidique polymorphe. Dans ce mode de réalisation particulier, l'identité de l'allèle du site polymorphe considéré peut être déterminé directement en réalisant l'étape d'élongation de l'amorce en présence de didéoxynucléotides fluorescents bloquant la réaction d'élongation. L'identité du didéoxynucléotide ajouté à la séquence de l'amorce, et donc l'identité de l'allèle du site polymorphe, est déterminée directement par analyse de fluorescence. Il s'agit de la technique de micro-séquençage, bien connue dans l'état de la technique. L'amorce hybride avec le brin d'ADN comprenant la séquence codant le polypeptide SH2 (le brin+) ou avec le brin d'ADN complémentaire, qui porte une base complémentaire de la base correspondante portée par le brin « + » au site polymorphe. Selon un quatrième aspect, le procédé est caractérisé en ce que pour sélectionner une plante possédant un nombre modifié de graines, on détermine l'identité de la base ou d'une séquence de bases présentes à au moins une position nucléotidique dudit acide nucléique correspondant à au moins un des nucléotides en position -168, +1473, +1542 et +2983 du gène Sh2 de séquence SEQ ID N°1.
Selon un cinquième aspect, le procédé est caractérisé en ce que pour sélectionner une plante avec une masse modifiée de graine, on détermine l'identité de la base ou d'une séquence de bases présentes à au moins une position nucléotidique dudit acide nucléique correspondant à au moins un des nucléotides en position -168, +1473, +1542 et +2983 du gène Sh2 de séquence SEQ ID N°1.
Selon un sixième aspect, ce procédé est caractérisé en ce que pour sélectionner une plante ayant une teneur modifiée en protéines dans la graine, on détermine l'identité de la base ou d'une séquence de bases présentes à au moins une position nucléotidique dudit acide nucléique correspondant à au moins un des nucléotides en position -
168, +1473, +1542, +2983, -830 à -824, -362, -347, -296, -15, +515,
+587, +1068, +1505 et +2939 du gène Sh2 de séquence SEQ ID N°1.
Selon un septième aspect, ce procédé est caractérisé en ce que pour sélectionner une plante possédant une teneur modifiée en amidon dans la graine, on détermine l'identité de la base ou d'une séquence de bases présentes à au moins une position nucléotidique dudit acide nucléique correspondant à au moins un des nucléotides en position -830 à -824, -362, -347, -296, -15, +515, +587, +1068, +1505 et +2939 du gène S 72 de séquence SEQ ID N°1.
Selon un huitième aspect, ce procédé est caractérisé en ce que pour sélectionner une plante possédant une teneur modifiée en amylose dans les graines, on détermine l'identité de la base ou d'une séquence de bases présentes à au moins une position nucléotidique dudit acide nucléique correspondant à au moins un des nucléotides en position - 438, -266, +678, +960, -921 , -580 à -573, -277, +35, +304, +1059, +1081 , +1867, +2514, +2771 et +3123 du gène Sh2 de séquence SEQ ID N°1.
Selon un neuvième aspect, ce procédé est caractérisé en ce que pour sélectionner une plante possédant un rapport protéines/amidon modifié dans la graine, on détermine l'identité de la base ou d'une séquence de bases présentes à au moins une position nucléotidique dudit acide nucléique correspondant à au moins un des nucléotides en position -168, +1473, +1542, +2983, -830 à -824, -362, -347, -296, -15, +515, +587, +1068, +1505 et +2939 du gène Sh2 de séquence SEQ ID N°1.
Selon un dixième aspect, ledit procédé est caractérisé en ce qu'il est réalisé sur l'ADN prélevé à partir de plantes au stade plantule et/ou au stade précoce et/ou au stade végétatif. De préférence, la plante est une céréale, de préférence une céréale à paille.
Préférentiellement, la plante est choisie parmi le maïs et le sorgho.
Sondes et amorces nucléotidiques L'invention concerne également les amorces et les sondes obtenues à partir des séquences nucléotidiques décrites ci-dessus et spécifiques d'un allèle du gène Sh2. Une des applications de l'invention consiste à utiliser ces sondes et/ou amorces pour détecter le polymorphisme du gène Sh2 à au moins l'un des sites polymorphes tels qu'ils ont été définis ci-dessus. Les sondes et les amorces obtenues selon un des aspects de l'invention peuvent être employées comme marqueurs spécifiques d'un allèle du gène Sh2. Les amorces nucléotidiques spécifiques d'allèles, ou permettant de discriminer selon les allèles connus, sont constituées préférentiellement de 8 à 40 nucléotides, plus précisément de 17 à 25 nucléotides. La réalisation de telles amorces est connue de l'homme du métier. En général, de telles amorces comprennent une séquence entièrement complémentaire à la séquence définissant l'allèle de référence ou l'allèle « variant » associé à un caractère phénotypique de qualité améliorée de la graine, tel que défini précédemment dans la description. Les amorces objets de l'invention ainsi réalisées portent un ou plusieurs marquages pour faciliter leur détection. Par exemple, le marquage peut être fluorimétrique (digoxygénine, fluoresceine, etc.), radioactif (par exemple 32P), enzymatique (peroxydase, phosphatase alkaline, etc.), ou réalisé par des microbilles d'or, de verre coloré ou de plastique.
Les acides nucléiques selon l'invention, et en particulier les séquences nucléotidiques SEQ ID N°2 à SEQ ID N°39, ainsi que les acides nucléiques de séquences complémentaires aux séquences SEQ ID N°2 à SEQ ID N°39, sont utiles pour la fabrication de sondes ou d'amorces permettant, lorsqu'elles sont mises en œuvre dans des réactions d'hybridation, d'élongation ou d'amplification, de discriminer entre eux les deux allèles d'un site polymorphe donné du gène Sh2 caractérisé selon l'invention.
Font également partie de l'invention les sondes et amorces nucléotidiques hybridant avec un acide nucléique choisi parmi les séquences SEQ ID N°2 à SEQ ID N°39, ou avec un acide nucléique de séquence complémentaire à l'une des séquences SEQ ID n°2 à SEQ ID N°39.
L'invention a aussi pour objet une sonde ou une amorce nucléotidique caractérisée en ce qu'elle permet de discriminer entre eux les différents allèles d'un site polymorphe à au moins l'une des positions-921 , -830 à
-824, -580 à -573, -438, -362, -347, -296, -277, -266, -168, -15, +35, +304, +515, +587, +678, +960, +1059, +1068, +1081 , +1473, +1505, +1542, +1867, +2514, +2771 , +2939, +2983 et +3123 du gène Sh2 de séquence SEQ ID N°1.
Elle est également relative à l'utilisation d'une sonde ou d'une amorce telle que définie ci-dessus comme marqueur d'au moins un site polymorphe du gène Sh2. L'invention concerne également les kits de diagnostic comportant des séquences nucléotidiques telles que définies ci-dessus, spécifiques de l'allèle favorable du gène Sh2 pour un ou plusieurs des caractères agronomiques choisis parmi le nombre de grains par épi, la masse du grain mûr, les teneurs en amidon, en amylose ou en protéines du grain. Elle a aussi pour objet une trousse ou kit prédictif des caractéristiques phénotypiques de qualité d'une graine de plante, caractérisé en ce qu'il comprend : a) une sonde ou une pluralité de sondes ou d'amorces telles que définies ci-dessus ; b) le cas échéant, les réactifs nécessaires à la réalisation d'une réaction d'hybridation ou d'amplification.
Selon un premier aspect, le nécessaire ou kit de détection est caractérisé en ce que la ou les sondes sont immobilisées sur un support. Selon un second aspect, le nécessaire ou kit de détection est caractérisé en ce que les sondes oligonucléotidiques comprennent un marqueur détectable.
Une amorce ou une sonde nucléotidique selon l'invention peut être préparée par toute méthode adaptée bien connue de l'homme du métier, y compris par clonage et action d'enzymes de restriction ou encore par synthèse chimique directe selon des techniques telles que la méthode au phosphodiester de Narang et al. (1979) ou de Brown et al.
(1979), la méthode au diéthylphosphoramidites de Beaucage et al.
(1980) ou encore la technique sur support solide décrite dans le brevet européen n° EP-0.707.592. Chacun des acides nucléiques selon l'invention, y compris les sondes et amorces oligonucléotidiques décrites ci-dessus, peut être marqué, si désiré, en incorporant une molécule détectable, c'est-à-dire un marqueur détectable par des moyens spectroscopiques, photochimiques, biochimiques, immunochimiques ou encore chimiques.
Par exemple, de tels marqueurs peuvent consister en des isotopes radioactifs (32P 3H, 35S), des molécules fluorescentes (5- bromodéoxyuridine, fluoresceine, acétylaminofluorène) ou encore des ligands tels que la biotine. Le marquage des sondes est fait de préférence par incorporation de molécules marquées au sein des polynucléotides par extension d'amorces, ou bien par rajout sur les extrémités 5' ou 3'.
Des exemples de marquage non radioactif de fragments d'acides nucléiques sont décrits notamment dans le brevet français n° FR- 78.10975 ou encore dans les articles de Urdea et al. (1988) ou Sanchez
Pescador et al. (1988).
De manière avantageuse, les sondes selon l'invention peuvent avoir des caractéristiques structurelles de nature à permettre une amplification du signal, telles que les sondes décrites par Urdea et al;
(1991 ) ou encore dans le brevet européen n° EP-0.225.807 (Chiron).
Les sondes oligonucléotidiques selon l'invention peuvent être utilisées notamment dans des hybridations de type Southern à l'ADN du gène Sh2 ou encore dans des hybridations à l'ARN messager de ce gène lorsque l'expression du transcrit correspondant est recherchée dans un échantillon.
Les sondes selon l'invention peuvent aussi être utilisées pour la détection de produits d'amplification PCR ou encore pour la détection de mésappariements. Des sondes ou amorces nucléotidiques selon l'invention peuvent être immobilisées sur un support solide. De tels supports solides sont bien connus de l'homme du métier et englobent les surfaces des puits de plaques de micro-titration, les billes de polystyrène, les billes magnétiques, les bandes de nitrocellulose ou encore les microparticules telles que les particules de latex.
Moyens d'expression des acides nucléiques comprenant un site polymorphe du gène Sh2.
L'invention concerne également l'utilisation des méthodes décrites ci-dessus pour isoler et /ou cloner les formes alléliques particulières et/ou favorables du gène Sh2, notamment en combinaison avec des techniques de biologie moléculaire comme par exemple la PCR, la RT- PCR, le séquençage d'allèles (par exemple pyroséquençage,...). L'homme de l'art pourra trouver la description des principales techniques de clonage dans des ouvrages généraux tels que « Guide to Molecular Cloning Techniques » (Berger et Kimmel, ref), « Molecular Cloning A- laboratory manual » (Sambrook et al., 2001 ), « Current protocols in molecular biology » (Ausubel ét al., 1997).
Un acide nucléique comprenant la séquence complète d'un allèle déterminé du gène Sh2 et comprenant au moins une base polymorphe d'un site polymorphe tel que défini dans la présente description, ou un acide nucléique comprenant l'ensemble des exons de cet allèle déterminé du gène Sh2, peut être obtenu selon des techniques bien connues de l'homme du métier, comme par exemple par la technique d'amplification PCR à l'aide d'amorces s'hybridant spécifiquement avec les extrémités nucléotidiques cibles choisies du gène Sh2, comme cela est décrit notamment dans les exemples.
Notamment, l'homme du métier peut se baser sur la séquence SEQ ID N°1 pour synthétiser des sondes et des amorces nucléotidiques permettant d'isoler et de cloner n'importe quel acide nucléique allélique du gène Sh2.
Par exemple, l'homme du métier peut obtenir un acide nucléique dérivé du gène Sh2 et comprenant au moins un allèle associé à une caractéristique phénotypique de quantité ou de qualité de la graine améliorée d'au moins un site polymorphe selon l'invention en amplifiant respectivement la partie 5' et la partie 3' du gène Sh2 en se basant sur la séquence nucléotidique SEQ ID N°1.
L'invention a aussi pour objet un vecteur recombinant dans lequel a été inséré un acide nucléique comprenant la séquence complète d'un allèle déterminé du gène Sh2 et comprenant au moins une base polymorphe d'un site polymorphe tel que défini dans la présente description, ou un acide nucléique comprenant l'ensemble des exons de cet allèle déterminé du gène Sh2.
De préférence, un tel acide nucléique est un acide nucléique dérivé du gène Sh2 de séquence SEQ ID N°1 et comprenant au moins une base polymorphe ou au moins une séquence nucléotidique polymorphe à au moins l'une des positions -921 ,-830 à -824,-580 à - 573, - 438, - 362, - 347, -296, -277, -266, -168, -15, +35, +304, +515, +587, +678, +960, +1059, +1068, +1081 , +1473, +1505, +1542, +1867, +2514, +2771 , +2939, +2983 et +3123 du gène Sh2 de séquence SEQ ID N°1.
Un premier acide nucléique objet de l'invention est un acide nucléique susceptible de conférer à une plante, de préférence une céréale, en particulier à un maïs, un nombre modifié de graines, par rapport au maïs de référence de la variété Black Mexican Sweet décrite par Shaw et Hannah (1992), ledit acide nucléique comprenant la forme allélique associée à l'expression du caractère phénotypique modifié de qualité de la graine, tel que défini dans la présente description à au moins un site polymorphe choisi parmi les sites polymorphes - 168, + 1473, + 1542 et + 2983 du gène Sh2 de séquence SEQ ID N°1.
Un second acide nucléique objet de l'invention est un acide nucléique susceptible de conférer à une plante, de préférence une céréale, en particulier à un maïs, une masse modifiée de la graine par rapport au maïs de référence de la variété Black Mexican Sweet décrite par Shaw et Hannah (1992), ledit acide nucléique comprenant la forme allélique associée à l'expression du caractère phénotypique modifié de qualité de la graine, tel que défini dans la présente description, à au moins un site polymorphe choisi parmi les sites polymorphes - 168.+1473, + 1542 et + 2983 du gène Sh2 de séquence SEQ ID N°1. Un troisième acide nucléique objet de l'invention est un acide nucléique susceptible de conférer à une plante, de préférence une céréale en particulier à un maïs, une teneur modifiée en protéines dans les graines, par rapport au maïs de référence de la variété Black Mexican Sweet décrite par Shaw et Hannah (1992), ledit acide nucléique comprenant la forme allélique associée à l'expression du caractère phénotypique modifié de qualité de la graine, tel que défini dans la présente description, à au moins un site polymorphe choisi parmi les sites polymorphes - 168, + 1473, + 1542, + 2983, - 830 à - 824, - 362, - 347, - 296, - 15, + 515, + 1068, + 1505 et + 2939 du gène Sh2 de séquence SEQ ID N°1.
Un quatrième acide nucléique objet de l'invention est un acide nucléique susceptible de conférer à une plante, de préférence une céréale en particulier à un maïs, une teneur modifiée en amidon dans les graines, par rapport au maïs de référence de la variété Black Mexican Sweet décrite par Shaw et Hannah (1992), ledit acide nucléique comprenant la forme allélique associée à l'expression du caractère phénotypique modifié de qualité de la graine, tel que défini dans la présente description, à au moins un site polymorphe choisi parmi les sites polymorphes - 830 à - 824, - 362 , - 347, - 296, - 15, + 515, + 587, + 1068, + 1505 et + 2939 du gène Sh2 de séquence SEQ ID N°1. Un cinquième acide nucléique objet de l'invention est un acide nucléique susceptible de conférer à une plante, de préférence une céréale, en particulier à un maïs, une teneur modifiée en amylose dans les graines, par rapport au maïs de référence de la variété Black Mexican Sweet décrite par Shaw et Hannah (1992), ledit acide nucléique comprenant la forme allélique associée à l'expression du caractère phénotypique modifié de qualité de la graine, tel que défini dans la présente description, à au moins un site polymorphe choisi parmi les sites polymorphes - 438, - 266, + 678 , + 960, - 921 , - 580 à - 573, - 277, + 35, + 304, + 1059, + 1081 , + 1867, + 2514, + 2771 et + 3123 du gène Sh2 de séquence SEQ ID N°1.
Un sixième acide nucléique objet de l'invention est un acide nucléique susceptible de conférer à une plante, de préférence une céréale en particulier à un maïs un rapport protéines/amidon modifié dans la graine, par rapport au maïs de référence de la variété Black Mexican Sweet décrite par Shaw et Hannah (1992), ledit acide nucléique comprenant la forme allélique associée à l'expression du caractère phénotypique modifié de qualité de la graine, tel que défini dans la présente description, à au moins un site polymorphe choisi parmi les sites polymorphes-168, + 1473, + 1542, + 2983, - 830 à - 824, - 362, - 347, - 296, - 15, + 515, + 587, + 1068, + 1505 et + 2939 du gène Sh2 de séquence SEQ ID N°1.
La variété de maïs Black Mexican Sweet décrite par Shaw et Hannah (1992), qui est la variété de référence, peut aussi être désignée variété de maïs « sauvage », aux fins de la présente description.
Les techniques de mesure du nombre de graines, de la masse de la graine, de la teneur en protéines de la graine, de la teneur en amidon dans la graine, de la teneur en amylose dans la graine et le calcul du rapport teneur en protéines/teneur en amidon font partie des connaissances générales techniques de l'homme du métier.
L'invention concerne aussi un vecteur recombinant, par exemple un vecteur recombinant de clonage ou un vecteur recombinant d'expression, dans lequel a été inséré un acide nucléique tel que défini ci-dessus. Selon une des applications de l'invention, les séquences nucléotidiques constituant des formes alléliques particulières du gène Sh2 peuvent être clonées, transférées dans des cellules, en particulier pour produire des plantes transgéniques. Les séquences nucléotidiques des loci sélectionnés sont introduites dans les cellules végétales, soit en culture soit dans des organes de plantes comme par exemple les feuilles, les tiges, les graines, les racines, etc .. L'expression naturelle ou synthétique de ces séquences peut être réalisée en liant de manière opérationnelle ces séquences d'intérêts à un promoteur, en incluant le construit dans un vecteur et en introduisant le vecteur dans une cellule hôte. Un promoteur endogène lié à la séquence nucléotidique à introduire peut favorablement être employé. Les vecteurs habituellement utilisés comprennent des séquences initiatrices et terminatrices à la fois de transcription et de traduction, et des promoteurs permettant la régulation de l'expression de cette séquence nucléotidique particulière. Les vecteurs peuvent également comprendre des cassettes d'expression avec au moins une séquence terminatrice indépendante, des séquences permettant la replication de la cassette chez les eucaryotes ou les procaryotes ou les deux (vecteurs navettes) et un marqueur de sélection pour au moins l'un des deux systèmes procaryotiques ou eucaryotiques (Giliman et Smith, 1979 ; Roberts et al., 1987 ; Schneider et al., 1995 ; Sambrook et al., 2001 ; Ausubel et al., 1997).
Parmi les terminateurs de transcription pouvant être utilisés, on peut citer le terminateur polyA 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur (Franck et al. 1980) ou le terminateur polyA NOS, qui correspond à la région en 3' non-codante du gène de la nopaline synthase du plasmide Ti û'Agrobacterium tumefaciens souche à nopaline.
Parmi les promoteurs de transcription pouvant être utilisés, on peut citer notamment les promoteurs dits constitutifs, les promoteurs dits inductifs ainsi que les promoteurs tissus spécifiques. Un promoteur constitutif permet une expression forte du transcrit dans l'ensemble des tissus de la plante régénérée et sera actif dans la plupart des conditions environnementales, et dans l'ensemble des étapes de transformation et de différentiation cellulaires. Par exemple, le promoteur 35S ou le promoteur double pd35S du CaMV décrit dans l'article de Kay et al., (1987), ou le promoteur de l'actine du riz suivi de l'intron actine de riz contenu dans le plasmide pAct1-F4 décrit par Me Elroy et al. 1991 ; ou encore le promoteur ubiquitine 1 de maïs (Christensen et al., 1996). Alternativement, il peut être intéressant d'utiliser une séquence promotrice de transcription inductible capable d'être contrôlée par les conditions environnementales ou le stade de développement, comme par exemple les promoteurs phénylalanine ammoniac lyase (PAL), d'HMG- CoA réductase (HMG), de chitinases, de glucanases, d'inhibiteurs de protéinase (PI), de gènes de la famille PR1 , de la nopaline synthase (nos) ou du gène vspB (US-5.670.349), tous ces promoteurs étant rappelés avec les références des publications correspondantes par le Tableau 3 du brevet US-5.670.349. Une autre catégorie de promoteurs pouvant être utilisée regroupe les promoteurs tissus spécifiques, comme par exemple les promoteurs tissus spécifiques des graines (Datla, R. et al., 1997), notamment les promoteurs de la napine (EP-0.255.378), de la glutenine, de l'héliantinine (WO-92/17580), de l'albumine (WO- 98/45460), de l'oléosine (WO-98/45461 ), de IΑTS1 ou de IΑTS3 (WO- 99/20775).
Les méthodes les plus répandues pour introduire des acides nucléiques dans des cellules bactériennes peuvent être utilisées dans le cadre de cette invention. Ce peut être la fusion de cellules réceptrices avec des protoplastes bactériens contenant l'ADN, l'électroporation, le bombardement par projectiles, l'infection par des vecteurs viraux, etc. Les cellules bactériennes sont souvent utilisées pour amplifier le nombre de plasmides contenant le construit comprenant la séquence nucléotidique, objet de l'invention. Les bactéries sont mises en culture et les plasmides sont ensuite isolés selon des méthodes bien connus de l'homme du métier (se reporter aux manuels de protocoles déjà cités), incluant les kits de purification de plasmides vendus dans le commerce comme par exemple EasyPrepI de Pharmacia Biotech ou QIAexpress Expression System de Qiagen. Les plasmides ainsi isolés et purifiés sont ensuite manipulés pour produire d'autres plasmides qui seront utilisés pour transfecter les cellules végétales.
La transformation de cellules végétales peut être réalisée par diverses méthodes telles que, par exemple, le transfert des vecteurs susmentionnés dans les protoplastes végétaux après incubation de ces derniers dans une solution de polyéthylèneglycol en présence de cations divalents (Ca 2+), l'électroporation (Fromm et al. 1985), l'utilisation d'un canon à particules, ou la micro-injection cytoplasmique ou nucléaire (Neuhaus et al, 1987).
Une des méthodes de transformation de cellules végétales pouvant être utilisée dans le cadre de l'invention est l'infection des cellules végétales par un hôte cellulaire bactérien comprenant le vecteur contenant la séquence d'intérêt. L'hôte cellulaire peut être Agrobacterium tumefaciens (An et al. 1986), ou A. rhizogenes (Guerche et al. 1987).
De manière préférentielle, la transformation des cellules végétales est réalisée par le transfert de la région T du plasmide circulaire extrachromosomique inducteur de tumeurs Ti d'A tumefaciens, en utilisant un système binaire (Watson et al., 1994). Pour ce faire, deux vecteurs sont construits. Dans un de ces vecteurs, la région d'ADN-T a été éliminée par délétion, à l'exception des bords droit et gauche, un gène marqueur étant inséré entre eux pour permettre la sélection dans les cellules de plantes. L'autre partenaire du système binaire est un plasmide Ti auxiliaire, plasmide modifié qui n'a plus d'ADN-T mais contient toujours les gènes de virulence vir nécessaires à la transformation de la cellule végétale. Ce plasmide est maintenu dans Agrobacterium.
Selon un mode préféré, la méthode décrite par Ishida et al. (1996) peut être appliquée pour la transformation des monocotylédones, en particulier le maïs. Selon un autre protocole, la transformation est réalisée selon la méthode décrite par Finer et al. (1992) utilisant le canon à particules de tungstène ou d'or.
L'invention a aussi pour objet l'utilisation d'un acide nucléique dérivé du gène Sh2 de séquence SEQ ID N°1 tel que défini ci-dessus pour transformer une cellule hôte.
De préférence, la cellule hôte est une cellule hôte bactérienne, par exemple une cellule de Agrobacterium tumefaciens, ou une cellule végétale, de préférence une cellule de céréale, et de manière tout à fait préférée une cellule de maïs, de riz, de blé, de seigle ou d'orge. L'invention concerne également les cellules transformées, avec les séquences nucléotidiques constituant des formes alléliques particulières du gène Sh2, y compris les micro-organismes (virus et bactéries) et les cellules végétales, en particulier des cellules de maïs. Elle a trait en particulier à une cellule hôte transformée par un acide nucléique dérivé du gène Sh2 ou par un vecteur recombinant, tels que définis ci-dessus.
L'invention concerne également les plantes régénérées à partir des cellules végétales transformées décrites ci-dessus, ainsi que les plantes dont au moins un des parents a été régénéré à partir d'une cellule végétale transformée comprenant au moins une des séquences nucléotidiques constituant une forme allélique particulière du gène Sh2.
L'invention concerne également l'utilisation d'un acide nucléique, ou d'un vecteur recombinant ou d'une cellule hôte transformée, définis selon l'invention, pour fabriquer une plante transformée capable de produire des graines à qualités industrielles ou agroalimentaires améliorées.
Rentre également dans le cadre de l'invention une plante transformée comprenant une pluralité de cellules hôtes transformées selon l'invention.
L'invention a également pour objet un procédé pour l'obtention d'une plante transformée susceptible de produire des graines à qualités industrielles ou agroalimentaires améliorées, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes : a) transformation d'au moins une cellule végétale par un acide nucléique ou par un vecteur recombinant selon l'invention ; b) sélection des cellules transformées obtenues à l'étape a) ayant intégré dans leur génome au moins une copie d'un acide nucléique selon l'invention ; c) régénération d'une plante transformée à partir des cellules transformées obtenues à l'étape b). L'invention s'étend à une plante transformée ou toute partie d'une plante transformée telle que définie dans la présente description, telle que la racine, mais aussi les parties aériennes comme la tige, la feuille, la fleur et surtout la graine. L'invention a encore pour objet une semence ou une graine de plante produite par une plante transformée telle que définie ci-dessus. Typiquement, une telle semence transformée ou un tel grain transformé comprend une ou plusieurs cellules comprenant dans leur génome une ou plusieurs copies d'un acide nucléique définie selon l'invention, le cas échéant de manière contrôlée et inductible.
Fait également partie de l'invention tout produit de transformation d'une semence telle que définie dans la présente description.
Anticorps dirigés spécifiquement contre les protéines SH2 produites par un acide nucléique comprenant un site dont le polymorphisme est décrit selon l'invention
L'invention concerne également les anticorps monoclonaux ou polyclonaux reconnaissant spécifiquement des polypeptides correspondant à des allèles du gène Sh2, ces allèles comprenant au moins l'une des formes décrites aux positions n°-921 , -830à-824, -580à- 573, -438, -362, -347, -296, -277, -266, -168, -15, 35, 304, 515, 587, 678, 960, 1059, 1068, 1081 , 1473, 1505, 1542, 1867, 2514, 2771 , 2939, 2983, 3123.
Des anticorps préférés selon l'invention sont les anticorps suivants :
- les anticorps reconnaissant spécifiquement la région d'acides aminés d'un polypeptide SH2 codée par les nucléotides localisés à proximité du site polymorphe +678, ces anticorps étant capables de discriminer entre la présence d'un résidu Alanine et la présence d'un résidu Thréonine codé par le codon comprenant la base polymorphe de ce site polymorphe ; et
- les anticorps reconnaissant spécifiquement la région d'acides aminés d'un polypeptide SH2 codée par les nucléotides localisés à proximité du site polymorphe +2983, ces anticorps étant capables de discriminer entre la présence d'un résidu Leucine et la présence d'un résidu Serine codé par le codon comprenant la base polymorphe de ce site polymorphe
L'invention concerne également le kit de diagnostic comportant un mélange de ces anticorps. Les anticorps définis ci-dessus sont utiles notamment pour prédire les caractéristiques phénotypiques de quantité ou de qualité de la graine, sans nécessiter d'analyse directe, par exemple biochimique, longue et coûteuse de ces caractéristiques phénotypiques. Des anticorps contre les polypeptides SH2 définis ci-dessus peuvent être préparés selon les techniques classiques bien connues de l'homme du métier.
Par " anticorps " au sens de la présente invention, on entendra notamment des anticorps polyclonaux ou monoclonaux ou des fragments (par exemple les fragments F(ab)'2, F(ab)) ou encore tout polypeptide comprenant un domaine de l'anticorps initial reconnaissant le polypeptide ou le fragment de polypeptide cible selon l'invention.
Des anticorps monoclonaux peuvent être préparés à partir d'hybridomes selon la technique décrite par Kohler et Milstein (1975) La présente invention concerne également des anticorps dirigés contre un polypeptide tel que décrit ci-dessus ou un fragment ou un variant de ce dernier, tel que produit dans la technique du trioma ou encore la technique d'hybridome décrite par Kozbor et al. (1983).
L'invention a également trait à des fragments d'anticorps simple chaîne Fv (ScFv) tels que décrits dans le brevet US N°4,946,778 ou encore par Martineau et al. (1998).
Les anticorps selon l'invention comprennent également des fragments d'anticorps obtenus à l'aide de banques de phages telles que décrites par Ridder et al. (1995) ou encore des anticorps humanisés tels que décrits par Reinmann et al. (1997) et Léger et al. (1997). Les préparations d'anticorps selon l'invention sont utiles dans des tests de détection immunologiques destinés à l'identification de la présence et/ou de la quantité d'un polypeptide SH2 tel que défini ci-dessus ou d'un fragment peptidique de celui-ci, présent dans un échantillon. Un anticorps selon l'invention pourra comprendre en outre un marqueur détectable isotopique ou non isotopique, par exemple fluorescent, ou encore être couplé à une molécule telle que la biotine, selon des techniques bien connues de l'homme du métier. Ainsi, l'invention a en outre pour objet un procédé pour détecter la présence d'un polypeptide conforme à l'invention dans un échantillon, ledit procédé comprenant les étapes de: a) mettre en contact l'échantillon à tester avec un anticorps tel que décrit ci-dessus; b) détecter le complexe antigène/anticorps formé.
L'invention est également relative à un nécessaire ou kit de diagnostic pour la détection de la présence d'un polypeptide conforme à l'invention dans un échantillon, ledit nécessaire comprenant: a) un anticorps tel que défini ci-dessus; b) le cas échéant, un ou plusieurs réactifs nécessaires à la détection du complexe antigène/anticorps formé.
De surcroît, l'invention a également pour objet une base de données comportant au moins l'une quelconque des séquences nucléotidiques décrites, obtenues, isolées ou identifiées dans au moins l'une des applications de l'invention.
La présente invention est en outre illustrée, sans pour autant être limitée, par les figures et les exemples suivants:
EXEMPLES
Exemple 1 : Identification de sites polymorphes dans le gène Sh2. 1.1 Matériel végétal
Au total, 33 lignées consanguines de maïs ont été analysées pour, d'une part, le séquençage du gène Sh2, et d'autre part les mesures de phénotypes du grain. Ces lignées sont d'origine européenne, américaine ou tropicale, et leur apparentement, sur la base de données RFLP, est faible (Dubreuil et al. 1996, et données non publiées). Les caractéristiques du grain des lignées A à Z et a à e sont présentées dans le tableau 1. Tableau 1 : Caractéristiques des lignées
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Tableau 1 : Caractéristiques des lignées (suite)
Figure imgf000042_0001
1.2 Détection du polymorphisme du gène Sh2
L'ADN a été isolé à partir de jeunes feuilles par une méthode décrite par Causse et al. (1995). Deux fragments chevauchants ont été amplifiés par PCR à l'aide de primers dessinés à partir de la séquence de référence du gène Sh2 chez la lignée Black Mexican Sweet SEQ ID N°1 (Shaw and Hannah, 1992). Le premier fragment (Sh2-I) de longueur voisine de 2653 bp couvre environ 1000bp en amont de la boite TATA supposée, les trois premiers introns, les trois premiers exons ainsi qu'une partie de l'exon 4. Le second fragment (SH2-II) a une longueur voisine de 2455 bp, et recouvre les introns 3 à 12, les exons 3 à 12 ainsi qu'environ 30 bases de l'exon 13. Les amorces utilisées sont les suivants (position sur la séquence de référence) : pour Sh2-I :
- 5'-CTGGGCAGGGAGAGCTAT (position -1008) (SEQ ID N° 40) - 3'-GGATATCAATAAGCCTGTAACAT (position 1623) (SEQ ID N°41) pour Sh2-ll :
- 5'-TGCAGCATTCTCAAACACAG (position 1197) (SEQ ID N°42)
- 3'-CGATGTTGCATTCTCTCAGTAA (position 3630) (SEQ ID N° 43) Pour les deux fragments et toutes les lignées, les amplifications par PCR ont été réalisées dans 100μl (environ 0.1 à 1.5μg d'ADN, 1.75u de taq polymérase Roche Expand High Fidelity, 0.5μM de chaque amorce, 0.3μM de dNTP, 1.875 mM de Mg2+) dans les conditions suivantes :
- dénaturation à 94°C : 2 min
- 9 cycles : dénaturation à 94°C : 30 s hybridation de 60 à 52°C (diminution de 1°C par cycle) : 30 s élongation à 72°C : 2 min
- 25 cycles : dénaturation à 94°C : 30 s hybridation à 51 °C : 30 s élongation à 72°C : 2 à 10 min (augmentation de 20 s par cycle)
- élongation à 72°C : 7 min
Après purification sur gel grâce au kit QIAEX de Quiagen, les produits de PCR ont été séquences par les sociétés Génome Express ou Genaxis. Tout d'abord, les amorces de PCR ont été utilisées pour la séquence, puis la partie centrale des fragments a été séquencée grâce aux nouvelles amorces suivantes : - Pour Sh2-l :
5'-ATGTCCTGCACCTAGGGAGC (position -424), (SEQ ID N° 44) 5'-CCACCAGTATGCCCTCCTCA (position -58), (SEQ ID N° 45) 3'-GACCCTATTTGAACAAATCTT (position 852), (SEQ ID N° 46) 3'-GCAGCAACTCTAAGGTCTATTT (position 961 ), (SEQ ID N° 47)
5'-TTTGGGAGACTTCCAGTCAA (position 1503), (SEQ ID N° 48) - Pour Sh2-ll :
3'-CATCGTCCTCGACATGTTT (position 2365), (SEQ ID N° 49) 3'-GGAAAGCAGATTAGACCATAT (position 2486), (SEQ ID N° 50) 3'-TGGAAACTGGAAACAAAAACAAC (position 3098) (SEQ ID N° 51 )
Une première correction des séquences, les contigs et l'alignement des séquences ont été réalisés grâce aux logiciels
Sequencing Analysis et Séquence Navigator de ABI. Les séquences ont été alignées soit visuellement, soit en utilisant la procédure d'alignement multiple Clustal du logiciel Séquence Navigator. Les fragments n'ont été séquences que sur un seul brin. Néanmoins, des vérifications ont été réalisées. Tout d'abord la partie chevauchante des fragments de séquences n'a jamais montré d'incohérence lors de la réalisation des contigs. De plus, l'amplification par PCR et le séquençage ont été répétés sur un total d'environ 10000bp afin de vérifier l'ensemble des polymorphismes singletons (cas où une seule lignée diffère de toutes les autres). Des résultats identiques ont toujours été obtenus pour les deux répétitions. Les sites pour lesquels des différences ont été observées parmi les séquences de Sh2 sont identifiés par leur position par rapport à la séquence de référence de la lignées Black Mexican Sweet SEQ ID N°1 (Shaw et Hannah, 1992). Sur l'ensemble de la région séquencée, 72 sites polymorphes ont été observés. Parmi ces polymorphismes, 19 présentent une différence pour une seule lignées, toutes les autres étant identiques. Ces singletons ne seront pas utilisables dans la recherche d'associations avec la variabilité phénotypique des grains. Parmi les 53 sites informatifs restants, certains sont parfaitement redondants entre eux, c'est à dire qu'ils apportent une information identique quant aux similarités entre lignées et permettent donc une discrimination identique en deux groupes de lignées. Parmi les 20 sites ou groupes de sites informatifs et non redondants, ceux trouvés statistiquement associés à des mesures phénotypiques sont indiqués dans la présentation détaillée de l'invention. Le tableau 2 présente la forme allélique de chaque lignée, ou groupe de lignées, pour ces polymorphismes.
Tableau 2 : formes alléliques aux 29 polymorphismes décrits, dont 20 SNP et 9 indels, nommés par leur position sur la séquence de référence SEQ ID N°1 de la lignée Black Mexican Sweet (BMS). Les notes 1 à indiquent les sites redondants: le site -168 est redondant avec les sites 1473, 1542 et 2983; l'indel -830à-824 est redondant avec les sites -362, -347, -296, -15, 515, 587, 1068, 1505 et 2939; le site -438 est redondant avec les sites -266, 678 et 960; le site -921 est redondant avec les sites -580à-573, -277, 35, 304, 1059, 1081 , 1867, 2514, 2771 et 3123. Les haplotypes H1 à H6 correspondent aux lignées suivantes :
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Figure imgf000045_0002
Exemple 2 : Identification des associations statistiquement significatives entre un allèle donné des sites polymorphes du gène Sh2 et une ou plusieurs caractéristigues phénotypiques de la qualité de la graine.
2.1 Mesures phénotypiques du grain
Trois essais au champ ont été réalisés. La première année (année 1 ) 30 lignées ont été étudiées, c'est à dire les lignées présentées dans le tableau 1 à l'exception des lignées RX01 , RX02 et RX03. Pour les essais mis en place les années 2 et 3, les 33 lignées ont été randomisées et répétées dans trois blocs. Chaque lignée a été représentée, dans chaque bloc, par une à quatre plante semées côte à côte. Pour chacune des trois expérimentations, les plantes ont été autofécondées et les grains récoltés à maturité. Les analyses d'associations avec les polymorphismes moléculaires de Sh2 ont porté sur des valeurs moyennes de chaque caractère par expérimentation. Les teneurs en protéines, amidon et amylose de chaque lignée ont été dosées manuellement pour l'essai de l'année 1 (voir détail des méthodes dans Sene et al. 2000) et prédites par spectrométrie en réflectance dans le proche infrarouge (NIRS) au CIRAD-Montpellier par C. Mestres et F. Davrieux pour les essais des années 2 et 3. L'acquisition des spectres a été effectuée sur grains entiers par un appareil Nirsystem 6500. Les données spectrales, pour une gamme de longueurs d'onde de 400 à 2500 nm, ont été collectées et analysées grâce au logiciel NIRS 2 version 4.0 (Infrasoft Intemationnal). La gamme de valeurs prédites n'étant pas parfaitement superposable à la gamme de valeurs ayant permis le calibrage des équations, une trentaine d'échantillons issue de nos deux essais a été utilisée pour affiner le calibrage.
2.2 Associations entre polymorphismes du gène Sh2 et caractères phénotypiques d'intérêt.
Les polymorphismes décrits ci-dessus sont statistiquement associés à des caractères du grains tels que le nombre de grains par épi, la masse du grain mûr, la teneur en protéines, amidon et amylose du grain, et le rapport de la teneur en protéines sur la teneur en amidon du grain. Ces associations ont été mises en évidence par des tests de régressions multiples grâce au logiciel SAS (1990). Lorsqu'un caractère est significativement associé à plusieurs sites, il est possible de définir la part de variabilité du caractère expliquée par l'ensemble des sites impliqués (R2τ, dernière colonne du Tableau 3). Par exemple, on peut noter que, dans l'expérimentation de la première année, la combinaison de l' Indel -830 à -824 et du SNP -168 permet d'expliquer 64% de la variance du rapport protéine/amidon parmi l'ensemble des lignées. La redondance des sites (voir tableau 2) rend l'interprétation de causalité fine entre un site et un caractère difficile. De plus, il est possible que des polymorphismes non décrits dans l'invention et présents à proximité de la région séquencée, soit dans la région promotrice soit dans la partie 3' non séquencée du gène, soient aussi redondants avec les sites décrits et donc associés aux mêmes caractères. Chez la pomme de terre, une zone importante pour la régulation de l'expression du gène se trouve à plus de 2kb en amont de la TATA box (Muller-Rober et al., 1994). Néanmoins, que la relation de causalité entre polymorphisme moléculaire et phénotypique soit connue ou non, les associations statistiques décrites dans l'invention permettent l'utilisation des SNP et indels décrits à des fins de prédiction phénotypique ou d'amélioration de la valeur génétique des grains de maïs.
Tableau 3 : résultats des tests d'associations par régressions multiples entre chaque caractère du grain et les sites polymorphes dans la séquence de Sh2 pour 25 à 33 lignées. Les sites indiqués sont en redondance totale avec d'autres sites le long de la séquence de Sh2 (voir Tableau 2). Les colonnes ni , moyl , n2, et moy2 contiennent les effectifs et les valeurs moyennes du caractère pour les deux groupes de lignées discriminées par les sites polymorphes correspondants. F: valeur du test de Fisher, P: degré de signification, R2: part de variation phénotypique expliquée par un site, R2γ: part de variation phénotypique expliquée par un groupe de sites combinés par régression multiple. Tableau 3
Figure imgf000048_0001
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Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation d'une sonde ou d'une amorce nucléotidique dans un procédé de sélection de plantes possédant des caractéristiques phénotypiques améliorées de qualité des graines, caractérisée en ce que ladite sonde ou ladite amorce nucléotidique permet la détection d'une base polymorphe ou d'une séquence nucléotidique polymorphe définissant un allèle d'un site polymorphe du gène Sh2 de séquence SEQ ID N°1 , ladite base polymorphe ou ladite séquence nucléotidique polymorphe étant contenue dans un acide nucléique inclus dans un gène Sh2, choisi parmi les acides nucléiques suivants :
(a) un acide nucléique dans lequel le nucleotide correspondant au nucleotide en position -921 du gène Sh2 est un G ; (b) un acide nucléique dans lequel les nucléotides correspondant aux nucléotides en positions -830 à -824, de séquence 5'-TGAGAAA-3', du gène Sh2 sont absents ;
(c) un acide nucléique dans lequel les nucléotides correspondant aux nucléotides en positions -580 à -573, de séquence 5'-TCACCTAT-3', du gène Sh2 sont absents ;
(d) un acide nucléique dans lequel le nucleotide correspondant au nucleotide en position -438 du gène Sh2 est un G ;
(e) un acide nucléique dans lequel le nucleotide correspondant au nucleotide en position -362 du gène Sh2 est un A ; (f) un acide nucléique dans lequel le nucleotide correspondant au nucleotide en position —347 du gène Sh2 est un T ;
(g) un acide nucléique dans lequel le nucleotide correspondant au nucleotide en position -296 du gène Sh2 est un T ;
(h) un acide nucléique dans lequel le nucleotide correspondant au nucleotide en position -277 du gène Sh2 est un T ;
(i) un acide nucléique dans lequel le nucleotide correspondant au nucleotide en position -266 du gène Sh2 est un C ;
(j) un acide nucléique dans lequel le nucleotide correspondant au nucleotide en position -168 du gène Sh2 est un A ; (k) un acide nucléique dans lequel le nucleotide correspondant au nucleotide en position -15 du gène Sh2 est un A ;
(I) un acide nucléique dans lequel le nucleotide correspondant au nucleotide en position +35 du gène Sh2 est un T ; (m) un acide nucléique dans lequel un T additionnel se trouve après le nucleotide en position +304 du gène Sh2 ;
(n) un acide nucléique dans lequel le nucleotide correspondant au nucleotide en position +515 du gène Sh2 est un C ;
(o) un acide nucléique dans lequel le nucleotide correspondant au nucleotide en position +587 du gène Sh2 est un C ;
(p) un acide nucléique dans lequel le nucleotide correspondant au nucleotide en position +678 du gène Sh2 est un A ;
(q) un acide nucléique dans lequel le nucleotide correspondant au nucleotide en position +960 du gène Sh2 est un A ; (r) un acide nucléique dans lequel le nucleotide correspondant au nucleotide en position +1059 du gène Sh2 est un G ;
(s) un acide nucléique dans lequel le nucleotide correspondant au nucleotide en position +1068 du gène Sh2 est un G ;
(t) un acide nucléique dans lequel le nucleotide A correspondant au nucleotide en position +1081 du gène Sh2 est absent;
(u) un acide nucléique dans lequel le nucleotide correspondant au nucleotide en position +1473 du gène Sh2 est un C ;
(v) un acide nucléique dans lequel un T additionnel se trouve après le nucleotide en position +1505 du gène Sh2 ; (w) un acide nucléique dans lequel un T additionnel se trouve après le nucleotide en position +1542 du gène Sh2 ;
(x) un acide nucléique dans lequel le nucleotide correspondant au nucleotide en position +1867 du gène Sh2 est un C ;
(y) un acide nucléique dans lequel le nucleotide T correspondant au nucleotide en position +2514 du gène Sh2 est absent;
(z) un acide nucléique dans lequel un T additionnel se trouve après le nucleotide en position 2771 du gène Sh2;
(ab) un acide nucléique dans lequel le nucleotide correspondant au nucleotide en position +2939 du gène Sh2 est un G ; (ac) un acide nucléique dans lequel le nucleotide correspondant au nucleotide en position +2983 du gène Sh2 est un C ; et
(ad) un acide nucléique comprenant l'insertion de la séquence 5'-GTTTTTATTTA-3' après le nucleotide correspondant au nucleotide en position +3123 du gène Sh2.
2. Utilisation selon la revendication 1 , caractérisée en ce que la sonde ou l'amorce nucléotidique permet de discriminer entre la présence d'un premier acide nucléique (1 ) et d'un second acide nucléique (2), lesdits acides nucléiques (1 ) et (2) étant choisis parmi les suivants :
(a) Site - 921 : l'acide nucléique (1 ) de séquence SEQ ID N°2 dans lequel le nucleotide en position 41 est une base G et l'acide nucléique (2) de séquence SEQ ID N°2 dans lequel le nucleotide en position 41 est une base A ; (b) Site - 438 : l'acide nucléique (1) de séquence SEQ ID N°3 dans lequel le nucleotide en position 41 est une base G et l'acide nucléique (2) de séquence SEQ ID N°3 dans lequel le nucleotide en position 41 est une base A ;
(c) Site - 362 : l'acide nucléique (1 ) de séquence SEQ ID N°4 dans lequel le nucleotide en position 41 est une base A et l'acide nucléique
(2) de séquence SEQ ID N°4 dans lequel le nucleotide en position 41 est une base G ;
(d) Site - 347 : l'acide nucléique (1 ) de séquence SEQ ID N°5 dans lequel le nucleotide en position 41 est une base T et l'acide nucléique (2) de séquence SEQ ID N°5 dans lequel le nucleotide en position 41 est une base C ;
(e) Site - 296 : l'acide nucléique (1 ) de séquence SEQ ID N°6 dans lequel le nucleotide en position 41 est une base T et l'acide nucléique (2) de séquence SEQ ID N°6 dans lequel le nucleotide en position 41 est une base C ;
(f) Site - 277 : l'acide nucléique (1 ) de séquence SEQ ID N°7 dans lequel le nucleotide en position 41 est une base T et l'acide nucléique (2) de séquence SEQ ID N°7 dans lequel le nucleotide en position 41 est une base C ; (g) Site - 266 : l'acide nucléique (1 ) de séquence SEQ ID N°8 dans lequel le nucleotide en position 41 est une base C et l'acide nucléique (2) de séquence SEQ ID N°8 dans lequel le nucleotide en position 41 est une base T ; (h) Site — 168 :l 'acide nucléique (1 ) de séquence SEQ ID N°9 dans lequel le nucleotide en position 41 est une base A et l'acide nucléique (2) de séquence SEQ ID N°9 dans lequel le nucleotide en position 41 est une base G ; (i) Site - 15 : l'acide nucléique (1 ) de séquence SEQ ID N°10 dans lequel le nucleotide en position 41 est une base A et l'acide nucléique
(2) de séquence SEQ ID N°10 dans lequel le nucleotide en position 41 est une base G ;
(j) Site + 35 : l'acide nucléique (1 ) de séquence SEQ ID N°1 1 dans lequel le nucleotide en position 41 est une base T et l'acide nucléique (2) de séquence SEQ ID N°1 1 dans lequel le nucleotide en position 41 est une base C ;
(k) Site + 515 : l'acide nucléique (1 ) de séquence SEQ ID N°12 dans lequel le nucleotide en position 41 est une base C et l'acide nucléique (2) de séquence SEQ ID N°12 dans lequel le nucleotide en position 41 est une base T ;
(1) Site + 587 : l'acide nucléique (1 ) de séquence SEQ ID N°13 dans lequel le nucleotide en position 41 est une base C et l'acide nucléique
(2) de séquence SEQ ID N°13 dans lequel le nucleotide en position 41 est une base T ; (m) Site + 678 : l'acide nucléique (1 ) de séquence SEQ ID N°14 dans lequel le nucleotide en position 41 est une base A et l'acide nucléique (2) de séquence SEQ ID N°14 dans lequel le nucleotide en position 41 est une base G ; (n) Site + 960 : l'acide nucléique (1 ) de séquence SEQ ID N°15 dans lequel le nucleotide en position 41 est une base A et l'acide nucléique
(2) de séquence SEQ ID N°15 dans lequel le nucleotide en position 41 est une base G ;
(o) Site + 1059 : l'acide nucléique (1 ) de séquence SEQ ID N°16 dans lequel le nucleotide en position 41 est une base G et l'acide nucléique (2) de séquence SEQ ID N°16 dans lequel le nucleotide en position 41 est une base C ;
(p) Site + 1068 : l'acide nucléique (1 ) de séquence SEQ ID N°17 dans lequel le nucleotide en position 41 est une base G et l'acide nucléique (2) de séquence SEQ ID N°17 dans lequel le nucleotide en position 41 est une base T ;
(q) Site + 1473 : l'acide nucléique (1 ) de séquence SEQ ID N°18 dans lequel le nucleotide en position 41 est une base C et l'acide nucléique
(2) de séquence SEQ ID N°18 dans lequel le nucleotide en position 41 est une base T ;
(r) Site + 1867 : l'acide nucléique (1 ) de séquence SEQ ID N°19 dans lequel le nucleotide en position 41 est une base C et l'acide nucléique
(2) de séquence SEQ ID N°19 dans lequel le nucleotide en position 41 est une base T ; (s) Site + 2939 : l'acide nucléique (1 ) de séquence SEQ ID N°20 dans lequel le nucleotide en position 41 est une base G et l'acide nucléique
(2) de séquence SEQ ID N°20 dans lequel le nucleotide en position 41 est une base T ;
(t) Site + 2983 : l'acide nucléique (1 ) de séquence SEQ ID N°21 dans lequel le nucleotide en position 41 est une base C et l'acide nucléique
(2) de séquence SEQ ID N°21 dans lequel le nucleotide en position 41 est une base T ;
(u) Site - 830 à - 824 : l'acide nucléique (1 ) de séquence SEQ ID
N°23 et l'acide nucléique (2) de séquence SEQ ID N° 22 ; (v) Site - 580 à - 573 : l'acide nucléique (1 ) de séquence SEQ ID
N°25 et l'acide nucléique (2) de séquence SEQ ID N° 24 ;
(w) Site + 304 : l'acide nucléique (1 ) de séquence SEQ ID N°27 et l'acide nucléique (2) de séquence SEQ ID N° 26 ;
(x) Site + 1081 : l'acide nucléique (1 ) de séquence SEQ ID N°29 et l'acide nucléique (2) de séquence SEQ ID N° 28 ;
(y) Site + 1505 : l'acide nucléique (1 ) de séquence SEQ ID N°31 et l'acide nucléique (2) de séquence SEQ ID N° 30 ;
(z) Site + 1542 : l'acide nucléique (1 ) de séquence SEQ ID N°33 et l'acide nucléique (2) de séquence SEQ ID N° 32 ; (aa) Site + 2514 : l'acide nucléique (1) de séquence SEQ ID N°35 et l'acide nucléique (2) de séquence SEQ ID N° 34 ;
(ab) Site + 2771 : l'acide nucléique (1 ) de séquence SEQ ID N°37 et l'acide nucléique (2) de séquence SEQ ID N° 36 ; et (ac) Site + 3123 : l'acide nucléique (1) de séquence SEQ ID N°39 et l'acide nucléique (2) de séquence SEQ ID N° 38.
3. Utilisation selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que : a) la sonde nucléotidique s'hybride spécifiquement avec un acide nucléique d'une première forme allélique de la base polymorphe ou de la séquence nucléotidique polymorphe définissant un premier allèle d'un site polymorphe du gène Sh2 et ne s'hybride pas avec un acide nucléique d'une seconde forme allélique de la base polymorphe ou de la séquence nucléotidique polymorphe définissant un second allèle d'un site polymorphe du gène Sh2 ; ou b) l'amorce nucléotidique hybride spécifiquement avec une séquence nucléotidique contenue dans un gène Sh2, ladite séquence nucléotidique étant localisée en amont d'une forme allélique d'une base polymorphe ou d'une séquence nucléotidique polymorphe dont la présence ou l'absence définit un allèle d'un site polymorphe du gène Sh2.
4. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que les caractéristiques phénotypiques améliorées de qualité de la graine sont choisies parmi le nombre de graines par épi, la masse des graines, la teneur en protéines des graines, la teneur en amidon des graines, la teneur en amylose des graines et le rapport pondéral protéines/amidon des graines, ou une combinaison de ces caractéristiques phénotypiques.
5. Procédé pour déterminer l'identité de l'allèle d'un site polymorphe au sein d'un acide nucléique dérivé d'un gène Sh2 en vue de sélectionner une plante possédant des caractéristiques phénotypiques améliorées de qualité de la graine, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de caractérisation de l'identité de la base polymorphe ou de la séquence nucléotidique polymorphe présente à au moins une position nucléotidique dudit acide nucléique correspondant à au moins un des nucléotides en position -921 , -830 à -824, -580 à -573, -438, -362, -347, -296, -277, -266, -168, -15, +35, +304, +515, +587, +678, +960, +1059, +1068, +1081 , +1473, +1505, +1542, +1867, +2514, +2771 , +2939, +2983 et +3123 du gène Sh2 de séquence SEQ ID N°1.
6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que la caractérisation de l'identité du site polymorphe est réalisée par séquençage dudit acide nucléique.
7. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que la caractérisation de l'identité du site polymorphe est réalisée par hybridation d'une sonde nucléotidique s'hybridant spécifiquement avec une base polymorphe ou une séquence nucléotidique polymorphe définissant un allèle d'un site polymorphe déterminé du gène Sh2.
8. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que la caractérisation du site polymorphe est réalisée par élongation d'une amorce nucléotidique s'hybridant spécifiquement avec une séquence nucléotidique localisée en amont d'une base polymorphe ou d'une séquence nucléotidique polymorphe définissant un allèle d'un site polymorphe déterminé d'un gène Sh2.
9. Procédé selon l'une des revendications 5 à 8, caractérisé en ce que pour sélectionner une plante possédant un nombre modifié de graines, on détermine l'identité de la base ou d'une séquence de bases présentes à au moins une position nucléotidique dudit acide nucléique correspondant à au moins un des nucléotides en position -168, +1473, +1542 et +2983 du gène Sh2 de séquence SEQ ID N°1.
10. Procédé selon l'une des revendications 5 à 8, caractérisé en ce que pour sélectionner une plante avec une masse modifiée de graine, on détermine l'identité de la base ou d'une séquence de bases présentes à au moins une position nucléotidique dudit acide nucléique correspondant à au moins un des nucléotides en position -168, +1473, +1542 et +2983 du gène Sh2 de séquence SEQ ID N°1.
11. Procédé selon l'une des revendications 5 à 8, caractérisé en ce que pour sélectionner une plante ayant une teneur modifiée en protéines dans la graine, on détermine l'identité de la base ou d'une séquence de bases présentes à au moins une position nucléotidique dudit acide nucléique correspondant à au moins un des nucléotides en position - 168, +1473, +1542, +2983, -830 à -824, -362, -347, -296, -15, +515, +587, +1068, +1505 et +2939 du gène Sh2 de séquence SEQ ID N°1.
12. Procédé selon l'une des revendications 5 à 8, caractérisé en ce que pour sélectionner une plante possédant une teneur modifiée en amidon dans la graine, on détermine l'identité de la base ou d'une séquence de bases présentes à au moins une position nucléotidique dudit acide nucléique correspondant à au moins un des nucléotides en position -830 à -824, -362, -347, -296, -15, +515, +587, +1068, +1505 et +2939 du gène Sh2 de séquence SEQ ID N°1.
13. Procédé selon l'une des revendications 5 à 8, caractérisé en ce que pour sélectionner une plante possédant une teneur modifiée en amylose dans les graines, on détermine l'identité de la base ou d'une séquence de bases présentes à au moins une position nucléotidique dudit acide nucléique correspondant à au moins un des nucléotides en position - 438, -266, +678, +960, -921 , -580 à -573, -277, +35, +304, +1059, +1081 , +1867, +2514, +2771 et +3123 du gène Sh2 de séquence SEQ ID N°1.
14. Procédé selon l'une des revendications 5 à 8, caractérisé en ce que pour sélectionner une plante possédant un rapport protéines/amidon modifié dans la graine, on détermine l'identité de la base ou d'une séquence de bases présentes à au moins une position nucléotidique dudit acide nucléique correspondant à au moins un des nucléotides en position -168, +1473, +1542, +2983, -830 à -824, -362, -347, -296, -15, +515, +587, +1068, +1505 et +2939 du gène Sh2 de séquence SEQ ID N°1.
15. Procédé selon l'une des revendications 5 à 14, caractérisé en ce qu'il est réalisé sur l'ADN prélevé à partir de plantes au stade plantule et/ou au stade précoce et/ou au stade végétatif.
16. Procédé selon l'une des revendications 5 à 15, caractérisé en ce que la plante est une céréale.
17. Procédé selon la revendication 16, caractérisé en que la plante est choisie parmi le maïs et le sorgho.
18. Sonde ou une amorce nucléotidique caractérisée en ce qu'elle permet de discriminer entre les différents allèles d'un site polymorphe à au moins l'une des positions -921 , -830 à -824, -580 à -573, -438, -362, -347, -296, -277, -266, -168, -15, +35, +304, +515, +587, +678, +960, +1059, +1068, +1081 , +1473, +1505, +1542, +1867, +2514, +2771 , +2939, +2983 et +3123 du gène Sh2 de séquence SEQ ID N°1.
19. Utilisation d'une sonde ou d'une amorce selon la revendication 18 comme marqueur d'au moins un site polymorphe du gène Sh2.
20. Trousse ou kit de diagnostic prédictif des caractéristiques phénotypiques de qualité d'une graine de plante, caractérisé en ce qu'il comprend : a) une sonde ou une pluralité de sondes ou d'amorces selon la revendication 18. b) le cas échéant, les réactifs nécessaires à la réalisation d'une réaction d'hybridation ou d'amplification.
21. Acide nucléique susceptible de conférer à une plante un nombre modifié de graines par rapport au maïs « sauvage » de référence, caractérisé en ce que ledit acide nucléique comprend la forme allélique associée à l'expression du caractère phénotypique modifié de qualité de la graine, tel que défini dans la présente description, à au moins un site polymorphe choisi parmi les sites polymorphes - 168, +1473, +1542 et + 2983 du gène Sh2 de séquence SEQ ID N°1.
22. Acide nucléique susceptible de conférer à une plante une masse modifiée de la graine par rapport au maïs « sauvage » de référence, caractérisé en ce que ledit acide nucléique comprend la forme allélique associée à l'expression du caractère phénotypique modifié de qualité de la graine, tel que défini dans la présente description, à au moins un site polymorphe choisi parmi les sites polymorphes - 168, + 1473, + 1542 et + 2983 du gène Sh2 de séquence SEQ ID N°1.
23. Acide nucléique susceptible de conférer à une plante une teneur modifiée en protéines dans les graines, par rapport au maïs « sauvage » de référence, caractérisé en ce que ledit acide nucléique comprend la forme allélique associée à l'expression du caractère phénotypique modifié de qualité de la graine, tel que défini dans la présente description, à au moins un site polymorphe choisi parmi les sites polymorphes -168,+ 1473, + 1542, + 2983, -830 à - 824, -362, - 347, - 296, - 15, + 515, + 1068, + 1505 et + 2939 du gène Sh2 de séquence SEQ ID N°1.
24. Acide nucléique susceptible de conférer à une plante une teneur modifiée en amidon dans les graines, par rapport au maïs « sauvage » de référence, caractérisé en ce que ledit acide nucléique comprend la forme allélique associée à l'expression du caractère phénotypique modifié de qualité de la graine, tel que défini dans la revendication 1 , à au moins un site polymorphe choisi parmi les sites polymorphes - 830 à -824,-362,-347,-296, -15, + 515, + 587, + 1068, + 1505 et + 2939 du gène Sh2 de séquence SEQ ID N°1.
25. Acide nucléique susceptible de conférer à une plante une teneur modifiée en amylose dans les graines, par rapport au maïs « sauvage » de référence, caractérisé en ce que ledit acide nucléique comprend la forme allélique associée à l'expression du caractère phénotypique modifié de qualité de la graine, tel que défini dans la revendication 1 , à au moins un site polymorphe choisi parmi les sites polymorphes - 438, - 266, + 678, + 960, - 921 , - 580 à - 573, - 277, + 35, + 304, + 1059, + 1081 , + 1867, + 2514, + 2771 et + 3123 du gène Sh2 de séquence SEQ ID N°1.
26. Acide nucléique susceptible de conférer à une plante un rapport protéines/amidon modifié dans la graine, par rapport au maïs « sauvage » de référence, caractérisé en ce que ledit acide nucléique comprend la forme allélique associée à l'expression du caractère phénotypique modifié de qualité de la graine, tel que défini dans la revendication 1, à au moins un site polymorphe choisi parmi les sites polymorphes -168,+ 1473, + 1542, + 2983, - 830 à - 824, - 362, - 347, - 296, - 15, + 515, + 587, + 1068, + 1505 et + 2939 du gène Sh2 de séquence SEQ ID N°1.
27. Vecteur recombinant comprenant un acide nucléique selon l'une des revendications 21 à 26.
28. Utilisation d'un acide nucléique selon l'une des revendications 21 à 26 ou d'un vecteur recombinant selon la revendication 27 pour transformer une cellule hôte.
29. Utilisation selon la revendication 28, caractérisée en ce que la cellule hôte est un cellule hôte bactérienne ou une cellule hôte végétale.
30. Cellule hôte transformée par un acide nucléique selon l'une des revendications 21 à 26 ou par un vecteur recombinant selon la revendication 27.
31. Cellule hôte transformée selon la revendication 30, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une cellule bactérienne ou d'une cellule végétale.
32. Utilisation d'un acide nucléique selon l'une des revendications 21 à 26, d'un vecteur recombinant selon la revendication 27 ou d'une cellule hôte transformée selon l'une des revendications 30 ou 31 pour fabriquer une plante transformée capable de produire des graines à qualités industrielles ou agroalimentaires améliorées.
33. Plante transformée comprenant une pluralité de cellules hôtes selon la revendication 30 ou 31.
34. Procédé pour l'obtention d'une plante transformée susceptible de produire des graines à qualités industrielles ou agroalimentaires améliorées, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes : a) transformation d'au moins une cellule végétale par un acide nucléique selon l'une des revendications 21 à 26 ; ou par un vecteur recombinant selon la revendication 27 ; b) sélection des cellules transformées obtenues à l'étape a) ayant intégré dans leur génome au moins une copie d'un acide nucléique selon l'une des revendications 21 à 26 ; c) régénération d'une plante transformée à partir des cellules transformées obtenues à l'étape b).
35. Plante transformée ou partie de plante transformée, notamment graine ou semence, susceptible d'être obtenue par le procédé selon la revendication 34.
36. Produit de transformation d'une graine ou semence selon la revendication 35.
37. Anticorps spécifique d'un polypeptide SH2 codé par un acide nucléique selon l'une des revendications 21 à 26.
38. Nécessaire ou kit de diagnostic des caractéristiques phénotypiques de qualité d'une graine de plante, caractérisé en ce qu'il comprend : a) un anticorps ou une combinaison d'anticorps selon la revendication 37; b) le cas échéant, les réactifs nécessaires à la détection d'un complexe formé entre ledit ou lesdits anticorps et un polypeptide SH2.
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