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WO2003014364A1 - Verfahren zur beeinflussung der mineralstoffaufnahme in transgenen pflanzen - Google Patents

Verfahren zur beeinflussung der mineralstoffaufnahme in transgenen pflanzen Download PDF

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WO2003014364A1
WO2003014364A1 PCT/EP2002/008725 EP0208725W WO03014364A1 WO 2003014364 A1 WO2003014364 A1 WO 2003014364A1 EP 0208725 W EP0208725 W EP 0208725W WO 03014364 A1 WO03014364 A1 WO 03014364A1
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WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
fer
sequence
plants
dna
seq
Prior art date
Application number
PCT/EP2002/008725
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Petra Bauer
Martin Ganal
Beat Keller
Hong-Qing Ling
Original Assignee
Ipk - Institut Für Pflanzengenetik Und Kulturpflanzenforschung
Universität Zürich
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Filing date
Publication date
Application filed by Ipk - Institut Für Pflanzengenetik Und Kulturpflanzenforschung, Universität Zürich filed Critical Ipk - Institut Für Pflanzengenetik Und Kulturpflanzenforschung
Publication of WO2003014364A1 publication Critical patent/WO2003014364A1/de

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance

Definitions

  • the invention relates to a method for influencing the absorption of minerals and in particular the absorption of iron in transgenic plants. Furthermore, the invention relates to DNA sequences which code for FER proteins, in particular for the FER protein from tomato. Furthermore, the invention relates to transgenic plants and plant cells which contain a nucleic acid molecule comprising a DNA sequence according to the invention and, as a result thereof, have a changed mineral intake, in particular iron intake, compared to wild type plants or cells, as well as crop products and propagation material of the transgenic plants.
  • DNA sequence coding for an FER protein is suitable for a positive influence on the mineral balance and the accumulation and storage of minerals in transgenic plants.
  • the fer genes coding for FER proteins control the iron uptake and the reactions of iron deficiency stress in roots.
  • the FER protein is a DNA-binding regulator that controls the iron uptake at the transcriptional level in the root of Strategy I plants.
  • this is done by inducing genes for transporters of iron and other metal ions, such as nramp or irt, or also genes that code for iron reductase.
  • FER protein also means that the protein is encoded by a gene, namely the fer gene, which is located at the fer locus in the tomato line T3238fer (see Ling et al. (1996) Mol. Gen. Genet. 252: 87-92) is mutated.
  • This mutation leads to that of Ling et al. (1996, vide supra) described fer phenotype, which is expressed in that, in contrast to the wild type, the mutant is unable to activate the responses of strategy I plants to iron deficiency, ie the plants are, for example, unable to respond to iron deficiency stress by increasing Fe 3+ reductase activity.
  • FER protein or fer gene in the sense of the invention also means that the fer phenotype (as described, for example, by Ling et al. (1996, vide supra) for the tomato line T3238fer) by transforming plants which show this phenotype , with the fer gene according to the present invention, ie a functional sequence according to SEQ ID No. 1 or 2, can be complemented.
  • a fer gene in the sense of the present invention is a DNA sequence which, when planted with the fer phenotype and is expressed there, restores the fer wild type, that is to say functionally complements the fer phenotype.
  • the complemented plants, like the wild type, can be used for strategy I plants show typical iron deficiency stress reactions and therefore, for example, in contrast to the fer mutant on Fe 3+, survive in the soil or in the growth medium.
  • the targeted control of fer expression in transgenic plants offers diverse and promising possibilities for influencing the plant's mineral metabolism.
  • the activity of the FER protein is influenced e.g. by an altered expression of the fer gene in the transgenic plants.
  • FER in transgenic plants has various positive effects. On the one hand, this can increase the vitality of the plants, higher biomass production and ultimately better yields. Cultivars such as Cereals, potatoes can thus be better grown on mineral deficient soils, so that the expensive and environmentally harmful fertilization with minerals is no longer necessary.
  • plants with increased fer expression can be produced which, owing to an increased absorption of minerals, have better competition for minerals and are therefore preferred to pests and weed plants, so that these plants are more resistant to pests and weed plants are as wild type plants without increased fer expression. This would eliminate the costly and environmentally harmful pest and weed control, or could at least be reduced.
  • the plants can enrich minerals in certain parts of the plant, such as leaves, roots, tubers, fruits or seeds, and thus become more valuable for human nutrition.
  • the present invention provides the possibility of producing plants which, owing to their altered fer expression, can extract heavy metal ions from the soil and can therefore be used for the remediation of soils contaminated with heavy metals (phytoremediation) because, as a rule, heavy metals such as cadmium are similar or the same Use mechanisms like iron.
  • the DNA sequences according to the invention open up a fundamental new possibility of influencing the vegetable mineral metabolism. They can be transferred into the genome of plants by means of suitable vectors, whereby transgenic plants with modified synthesis of FER protein are produced. These changed amounts of FER protein have an effect on the regulation of fer target genes, such as genes for metal transporters and iron reductases, and lead to a changed efficiency of mineral absorption from the soil, in particular iron, zinc, manganese, copper, but also heavy metal ions such as for example cadmium and / or for a changed distribution and storage of these minerals in the various plant organs and cell compartments.
  • fer target genes such as genes for metal transporters and iron reductases
  • the new DNA sequences are suitable for transfer to any plants.
  • the use of fer-DNA sequences obtained from monocotyledon plants is therefore preferred for other monocotyledonous plants, for example the use of the fer gene from barley in gesture, Rice or other cereals.
  • Another object is to provide methods for changing the mineral uptake, in particular the iron uptake in transgenic plants. Further tasks result from the above or the following description.
  • the above and other objects of the invention are achieved by the subjects defined in the independent claims. Preferred embodiments are set out in the dependent claims.
  • a DNA sequence encoding an FER protein is disclosed for the first time.
  • the sequence preferably originates from Lycopersicon esculentum.
  • a preferred DNA sequence coding for a tomato FER protein is given in SEQ ID No. 1 and 2, with SEQ ID No. 1 shows the fer gene and SEQ ID No. 2 indicates the cDNA sequence derived from the fer mRNA.
  • SEQ ID No. Figure 3 shows the amino acid sequence of the tomato FER protein.
  • the term “fer gene” or “DNA sequence coding for an FER protein” is used for a nuclear acid sequence which codes for an active DNA-binding regulator protein, the regulator protein being in the root of strategy I- Plants control the iron uptake at the transcriptional level and the coding regions of the nucleic acid sequence with the coding sequence in SEQ ID No. 1 or 2 a sequence identity degree of at least 45%, 50%, 55%, 60%, preferably of at least 70%, 75%, 80%, 85%, particularly preferably of at least 90% and most preferably of at least 92%, 94%, 96%, 98%.
  • the iron uptake in transgenic plants can be positively influenced, this being done particularly preferably by overexpression of the fer gene in the transgenic plants or cells.
  • transformation systems The basic requirement for the production of such crops is the availability of suitable transformation systems.
  • a wide range of transformation methods have been developed and established here over the past two decades. These techniques include the transformation of plant cells with T-DNA using Agrobacterium tumefaciens or Agrobacterium rhizogenes as a transformation agent, the fusion of protoplasts, the direct gene transfer isolated DNA in protoplasts, the injection and electroporation of DNA into plant cells, the introduction of DNA using biolistic methods and other possibilities.
  • transformation techniques are known to the person skilled in the art or they can be found in overview articles or corresponding reference works.
  • the person skilled in the art can find further DNA sequences coding for FER proteins from organisms other than tomato by means of conventional molecular biological techniques and can use them in the context of the present invention.
  • the person skilled in the art can derive suitable hybridization probes from the fer sequences according to the invention and use them for the screening of cDNA and / or genomic banks of the desired organism, e.g. Use potatoes or cereals from which a new fer gene is to be isolated.
  • the person skilled in the art can familiarize with hybridization, cloning and
  • genes with a high level by comparing the fer gene sequence or the FER amino acid sequence with sequences from different sequence databases (genomic sequences, BAC sequences, EST sequences, cDNA sequences) from different organisms (e.g. from various genome projects) Identify similarity. These genes can then be used with conventional Methods of PCR and gene cloning are processed. In order to identify fer-like genes from organisms that are not in databases, oligonucleotides for PCR or RT-PCR can be derived from the fer sequence. Regions that are largely identical between the fer gene from tomato and the gene similar to this gene in Arabidopsis are suitable for the design of such oligonucleotides (see FIG. 3).
  • the coding nucleic acid sequence can be operated as in the native gene, ie in the 5 '-3' direction
  • downregulation of endogenous FER activity may also be desirable, e.g. For example, it may be useful to turn off mineral intake and transport in certain cells in order to better control these processes at another suitable location. To do this, one would have to switch off the fer activity in the cells where it is undesirable, e.g. B. by the antisense approach, the phenomenon of co-suppression or double hybrid RNA formation. In all cases, the entire nucleic acid sequence that naturally encodes an FER protein does not necessarily have to be transmitted and transcribed, but rather fragments of the encoding can
  • Regions are sufficient, as far as these fragments ensure the achievement of the desired effects, ie co-suppression on the one hand or antisense inhibition on the other.
  • the person skilled in the art can, for example, produce suitable deletion constructs and, by transferring them to transgenic plant cells, check whether a particular fragment of the coding region has the effect according to the invention, namely that Has or not inhibits endogenous FER activity.
  • the formulation “DNA sequence which codes for an FER protein” thus also includes those DNA sequences and fragments which do not code for an active protein, their presence and transcription in sense or Antisense orientation but causes a co-suppression or antisense inhibition in transgenic plant cells.
  • Such fragments can also be referred to in the context of the invention as “antisense or suppression active” FER-DNA fragments.
  • the entire genomic clone of an FER protein or parts thereof can also be transferred in order to achieve the desired inhibition of the endogenous FER.
  • RNA interference in which the formation of a specific protein, in the present case the FER protein, is formed by specifically switching off mRNA molecules. is prevented (Elbashir et al. (2001) Nature 411, 494-498; Waterhouse et al. (2001) Nature 411, 834-842).
  • RNA interference too, the specific RNA supplied from outside leads to the destruction of the corresponding target mRNA and thus to the absence of the corresponding protein.
  • the method therefore does not eliminate the gene, but only its functional product (mRNA and protein). It is therefore a method similar to the anti-sense method, with the anti-sense method using an RNA sequence which is complementary to the mRNA, while with the RNA interference, the anti-sense RNA is in the form a double-stranded RNA is added. It is currently believed that the RNA sequences form a complex with proteins in the cell that specifically recognizes and cleaves the target RNA. The synthesis of certain RNA double-strand chains can thus determine which target mRNA is to be destroyed in the cell.
  • antisense should be understood to mean that the sequence coding for an FER protein or an “antisense-active” fragment thereof in an antisense orientation, ie “upside down” in 3 ′ -> 5 ′ - Direction that is operatively linked to a promoter region that is active in plant cells and is transcribed.
  • the RNA that is produced when such an antisense gene is transcribed is complementary to the RNA of the endogenous gene and prevents the synthesis of the FER protein product by Hybridization comes between the native and the antisense RNA.
  • the sequence coding for an FER protein or a “co-suppression-active” fragment thereof is in the sense orientation (ie in the 5 ⁇ 3 direction) in operative association with one in plant cells
  • the endogenous gene is inactivated by additionally introduced identical (partial) copies of this gene, which is probably due to an RNA-dependent mechanism in which the RNA-directed RNA polymerase is involved is.
  • RNA coding for a FER protein sequence lies both in sense (5 ⁇ -> 3 ') - and antisense (3 ⁇ -> 5 ⁇ ) - orientation linked directly or operatively by an intron, or other sequence in front.
  • the execution of the method according to the invention only requires suitable regulatory sequences which control the transcription of an operatively linked fer-DNA sequence in the transformed plant or plant cell.
  • the person skilled in the art can easily find suitable sequences from the prior art or even isolate particularly suitable promoter sequences. Promoters suitable for various plants can be found in the literature. In addition, new promoters can be identified using current genome projects.
  • transgenic plant lines can be screened for new promoter activities that have integrated promoterless GUS constructs (Springer (2000) plans Cell 12: 1007-1020). Explosion analyzes of numerous or all of all EST sequences (RNA profiling, Affymetrix) can allow conclusions to be drawn about suitable promoters. In this way, promoters can be identified which are organ-specific (e.g. root, seeds, flowers, leaf, etc.), tissue-specific (e.g. gliding vessels, cortex, epidermis) or are development-specific or inducible.
  • organ-specific e.g. root, seeds, flowers, leaf, etc.
  • tissue-specific e.g. gliding vessels, cortex, epidermis
  • the DNA sequence coding for the FER protein is under the control of the 35S promoter.
  • tissue-specific expression is preferred, for
  • any kind of regulatory sequences which ensure the transcription in plant cells is included here.
  • the promoter can be selected so that the expression is constitutive or only in specific tissues at a certain time
  • the promoter can be homologous or heterologous with respect to the plant to be transformed. If a constirutive promoter is used, cell-specific or tissue-specific expression can also be achieved in that the gene expression in the cells or Tissues in which it is not desired are inhibited, for example by expressing antibodies that bind the gene product and thus inhibit its activity, or by suitable inhibitors.
  • the person skilled in the art can find constitutive or tissue-specific or development-specific or inducible genes or promoters from the prior art, in particular from the relevant scientific journals and databases.
  • the average specialist is able to isolate other suitable promoters using routine methods.
  • the person skilled in the art can thus identify regulatory nucleic acid elements with the aid of common molecular biological methods, examples of which here are methods for the identification of genes with interesting promoters, transgenic plant lines with reporter gene contracts (see above), RNA profiling, affymetrix, in which Genes or promoters described in the literature, subtractive screening of banks for specifically expressed cDNA, and for cloning the promoters. Cloning via PCR products, genome walking, isolation of genomic clones, cosmids, BACs, lambda, inverse PCR or the like to obtain insertion points for transgenic lines, cloning: hybridization with probes.
  • transcription or termination sequences are available, which serve to correctly end the transcription, and can also be used to add a PolyA tail to the transcript, which is assigned a function in stabilizing the transcripts.
  • a PolyA tail is assigned a function in stabilizing the transcripts.
  • chimeric gene constructs in which fer-coding DNA sequences are under the control of regulatory sequences which ensure expression in plant cells, are produced by means of conventional cloning methods (see, for example, Sambrook et al. (1989), supra).
  • the present invention thus relates to a recombinant nucleic acid molecule comprising:
  • regulatory sequences of a promoter active in plant tissues, in particular in roots b) operatively linked to a DNA sequence that codes for an FER protein; and c) optionally operatively linked regulatory sequences which can serve as transcription, termination and / or polyadenylation signals in plant cells.
  • the DNA sequence encoding an FER protein can be isolated from natural sources or synthesized by known methods.
  • the DNA sequence according to the invention preferably originates from Lycopersicon esculentum.
  • the DNA sequence encoding an active FER protein is selected from the group consisting of: a) DNA sequences that the SEQ ID No. 1 or SEQ ID No. 2 comprise the specified coding nucleotide sequence or fragments thereof, the length of the fragments being sufficient to encode a protein with FER protein activity; b) DNA sequences comprising a nucleotide sequence that the in SEQ ID NO. 1 or SEQ ID No. 2 comprise the specified coding nucleotide sequence or fragments thereof, the length of the fragments being sufficient to encode a protein with FER protein activity; b) DNA sequences comprising a nucleotide sequence that the in SEQ ID
  • nucleotide sequence has a sequence identity of at least 60%, preferably at least 80%, particularly preferably at least 90% and most preferably at least 92, 94, 96, 98%; " e) DNA sequences that are a derivative, analogue or fragment of a
  • hybridization means hybridization under conventional hybridization conditions, preferably under stringent conditions, as described, for example, in Sambrook et al. (1989, vide supra).
  • hybridization in vitro will always be carried out under conditions that are stringent enough to ensure specific hybridization.
  • stringent hybridization conditions are known to the person skilled in the art and can be found in the literature (Sambrook et al., 2001, Molecular cloning: A laboratory manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press).
  • “specifically hybridize” means that a molecule binds preferentially to a certain nucleotide sequence under stringent conditions if this sequence is present in a complex mixture of (for example total) DNA or RNA.
  • stringent conditions generally stands for conditions under which a nucleic acid sequence will preferentially hybridize to its target sequence and to a significantly lesser extent or not at all to other sequences. Stringent conditions are in some cases sequence-dependent and will be different in different circumstances. longer sequences hybridize specifically at higher temperatures. in general, stringent conditions are selected so that the temperature is about 5 ° C lower than the thermal melting point (T m) for the specific sequence at a defined ionic strength and a defined pH.
  • T m thermal melting point
  • the T m is the Temperature (under defined ionic strength, pH and nucleic acid concentration) at which 50% of the molecules complementary to the target sequence hybridize to the target sequence in an equilibrium state
  • typically stringent conditions are those at which the salt concentration is at least approximately 0.01 to 1.0 M Na trium ion concentration (or another salt) at a pH between 7.0 and 8.3 and the temperature is at least about 30 ° C for short molecules (for example 10-50 nucleotides).
  • stringent conditions can be achieved by adding destabilizing agents such as formamide.
  • the DNA sequences according to the invention also include fragments, derivatives and allelic variants of the DNA sequences described above, which encode an FER protein.
  • derivative in this context means that the sequences differ from the DNA sequences described above in one or more positions, but a high degree of similarity to these Have sequences.
  • the deviations from the DNA sequences described above may have arisen, for example, through deletion, substitution, hisertion or recombination.
  • Similarity or homology means a sequence identity of at least 45%, 50%, 55%, in particular an identity of at least 60%, 64%, 68%. preferably an identity of at least 70%, 72%, 74%, 76%, 78% "particularly preferably of at least 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, even more preferably of at least 90%, 92%, 94% and most preferably at least 96% and at least 98%.
  • the proteins encoded by these DNA sequences have a sequence identity to that in SEQ ID No. 2 or 3 given amino acid sequence of at least 45%, 50%, 55%, in particular an identity of at least 60%, 64%, 66%, 68%, preferably an identity of at least 70%, 74%, 76%, 78% , 80%, particularly preferably of at least 82%, 86%, 90%, 92%, 94% and most preferably of at least 96%, 98%.
  • Degrees of homology or sequence identities are usually determined using various alignment programs, such as, for. B. CLUSTAL found. Generally stand that
  • Suitable algorithms for determining sequence identity / similarity are available to those skilled in the art, e.g. also the program, which is available at http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST (e.g. the link "Standard nucleotide-nucleotide BLAST [blastn]").
  • DNA sequences which are similar to the sequences described above and which are derivatives of these sequences, are usually variations of these sequences which represent modifications which have the same biological function. It can be both naturally occurring variations, for example sequences from others Organisms, or around mutations, these mutations may have occurred naturally or have been introduced by targeted mutagenesis.
  • allelic variants can be both naturally occurring variants and also synthetically produced variants or those produced by recombinant DNA techniques.
  • the DNA sequence described coding for an FER protein originates from Lycopersicon esculentum (as indicated in SEQ ID No. 1 or SEQ ID No. 2).
  • the invention further relates to vectors and microorganisms which contain nucleic acid molecules according to the invention and the use of which enables the production of plant cells and plants whose mineral content, in particular their iron absorption, is changed compared to wild-type plant cells or plants.
  • the vectors are in particular plasmids, cosmids, viruses, bacteriophages and other vectors which are common in genetic engineering.
  • the microorganisms are primarily bacteria, viruses, fungi, yeasts and algae.
  • a recombinant FER protein Lycopersicon esculentum in particular a recombinant protein with the in SEQ ID No. 2 and No. 3 amino acid sequence provided.
  • the invention further relates to a method for producing plants or plant cells with a mineral balance, in particular changed iron absorption, which is different from that of wild-type plants or plant cells, comprising the following steps: a) Production of a recombinant nucleic acid molecule which comprises the following sequences: regulatory sequences of a promoter active in plants;
  • the invention further relates to plant cells which contain the nucleic acid molecules according to the invention which encode an FER protein.
  • the invention also relates to crop products and propagation material of transgenic plants and the transgenic plants themselves which contain a nucleic acid molecule according to the invention. Because of the introduction of an FER-coding DNA sequence, transgenic plants of the present invention have an iron uptake which is different from that of wild-type plants.
  • cloning vectors which contain a replication signal for E. coli and a marker gene for the selection of transformed bacterial cells.
  • examples of such vectors are pBR322, pUC series, M13mp series, pACYC184 etc.
  • the desired sequence can be introduced into the vector at a suitable restriction site.
  • the plasmid obtained is then used for the transformation of E. cot ⁇ cells.
  • Transformed E. co / z cells are grown in a suitable medium and then harvested and lysed, and the plasmid is recovered.
  • the plasmid DNA As an analysis method for the characterization of the plasmid DNA obtained in the General restriction analyzes, gel electrophoresis and other biochemical-molecular biological methods are used. After each manipulation, the plasmid DNA can be cleaved and DNA fragments obtained can be linked to other DNA sequences.
  • Transformation medium the fusion of protoplasts, the injection, the electroporation, the direct gene transfer of isolated DNA into protoplasts, the introduction of DNA using biolistic methods as well as other possibilities that have been well established for several years and become the usual repertoire of the specialist in plant molecular biology or plant biotechnology.
  • plasmids When injecting and electroporation of DNA into plant cells, there are no special requirements per se for the plasmids used. The same applies to direct gene transfer. Simple plasmids such as e.g. pUC derivatives can be used. However, if whole plants are to be regenerated from such transformed cells, the presence of a selectable marker gene is recommended.
  • the usual selection markers are known to the person skilled in the art and it is not a problem for him to select a suitable marker.
  • the Ti or Ri plasmid is used for the transformation of the plant cell, at least the right boundary, but often the right and left boundary of the T-DNA contained in the Ti or Ri plasmid, must be used as a flank region with the genes to be introduced get connected.
  • the DNA to be introduced must be cloned into special plasmids, either in an intermediate or in a binary vector.
  • the intermediate vectors can be integrated into the Ti or Ri plasmid of the agrobacteria on the basis of sequences which are homologous to sequences in the T-DNA by homologous recombination.
  • intermediate vectors cannot replicate in agrobacteria. Using a helper plasmid, the intermediate vector can be transferred to Agrobacterium tumefaciens (conjugation).
  • Binary vectors can replicate in E. coli as well as in Agrobacteria. They contain a selection marker gene and a linker or polylinker, which are framed by the right and left T-DNA border region. They can be transformed directly into the agrobacteria.
  • the agrobacterium serving as the host cell is said to contain a plasmid which carries a fer sequence within the T-DNA which is transferred into the plant cell. Additional T-DNA may be present.
  • plant explants can expediently be cultivated with Agrobacterium tumefaciens or Agrobacterium rhizogenes. Whole plants can then be regenerated from the infected plant material (for example leaf pieces, stem segments, roots, but also protoplasts or suspension-cultivated plant cells) in a suitable medium, which can contain antibiotics or biocides for the selection of transformed cells.
  • Agrobacterium tumefaciens or Agrobacterium rhizogenes.
  • Whole plants can then be regenerated from the infected plant material (for example leaf pieces, stem segments, roots, but also protoplasts or suspension-cultivated plant cells) in a suitable medium, which can contain antibiotics or biocides for the selection of transformed cells.
  • the introduced DNA is integrated in the genome of the plant cell, it is generally stable there and is also retained in the progeny of the originally transformed cell. It usually contains a selection marker, which imparts resistance to a biocide or an antibiotic such as kanamycin, G 418, bleomycin, hygromycin, methotrexate, glyphosate, streptomycin, sulfonylurea, gentamycin or phosphinotricin, among others, to the transformed plant cells.
  • the individually selected marker should therefore allow the selection of transformed cells from cells that lack the inserted DNA.
  • Alternative markers are also suitable for this, such as nutritive markers and screening markers (such as GFP, green fluorescent protein).
  • selection markers can also be completely dispensed with, but this is associated with a fairly high need for screening. If marker-free transgenic plants are desired, strategies are available to the person skilled in the art which make a subsequent
  • Allow removal of the marker gene e.g. Cotransformation, sequence-specific recombinases.
  • the regeneration of the transgenic plants from transgenic plant cells is carried out according to customary regeneration methods using known nutrient media.
  • the plants obtained in this way can then be examined for the presence of the nucleic acid which codes for an FER protein or for the presence of the gene product, that is to say the FER protein, using customary methods, including molecular biological methods, such as PCR, blot analyzes.
  • the transgenic plant or the transgenic plant cells can be any monocotyledon or dicotyledonous plant or plant cell in which the mineral balance, in particular the iron absorption, should preferably be improved. They are preferably useful plants or cells of useful plants. Solanaceae such as are particularly preferred
  • the invention also relates to propagation material and harvest products of the plants according to the invention, for example fruits, seeds, tubers, rhizomes, seedlings, cuttings, etc.
  • the specific expression of the FER protein in the plants according to the invention or in the plant cells according to the invention can be detected and tracked using conventional molecular biological and biochemical methods. These techniques are known to the person skilled in the art and he is easily able to choose a suitable detection method, for example a Northern blot analysis for the detection of FER-specific RNA or for determining the level of accumulation of FER-specific RNA or a Southem Blot analysis for the detection of DNA sequences coding for FER.
  • a suitable detection method for example a Northern blot analysis for the detection of FER-specific RNA or for determining the level of accumulation of FER-specific RNA or a Southem Blot analysis for the detection of DNA sequences coding for FER.
  • the invention further relates to a method for changing the mineral intake, in particular the iron intake in plants, comprising the following steps:
  • the tomato line T3238fer which is derived from the boron-inefficient tomato line T3238 as a mutant, is not able to activate the iron deficiency stress reactions typical of plant I plants under iron deficiency conditions (Brown et al. (1971) Physiol. Plant. 25: 48- 53; Brown et al. (1974) Physiol. Plant. 31: 221-224).
  • the mutated plants show neither increased reductase activity nor other physiological or morphological changes in the case of iron deficiency, which are switched on for the efficient absorption of iron in the case of iron deficiency. Since the fer mutation has numerous effects, fer probably acts centrally at the transcriptional level.
  • fer plants with fer mutations die during the vegetative phase. Plants with fer mutations can be partially or completely saved by continuously fertilizing them in soil with iron in the form of iron hydroxyethylenediamine triacetic acid (Fe-HEDTA) or by attracting them to MS medium.
  • Fe-HEDTA iron hydroxyethylenediamine triacetic acid
  • the fer mutant is a recessive mutant that affects a single gene that was mapped to chromosome 6 of the tomato 0.33 cM from TG590 and 2.0 cM from TG118 (Ling et al. (1996 ) Mol. Gen. Genet. 252: 87-92).
  • the marker-assisted gene cloning technique was used to isolate the fer gene. This technique has been used successfully several times in the tomato. In the case of the cloning of fer, the method was analogous to that of chloronerva, which was successfully completed two years ago and in Ling et al. (PNAS Prod. Natl. Acad. Sei. USA (1999) 96: 7098-7103) with all references.
  • the techniques for working with YAC, BAC and Cosmid clones are Birren et al. (Green et al., Eds, Genome Analysis, A laboratory Manual, CSHL Press, USA, 1997).
  • the beginning of gene mapping and chromosome walking in fer was described in Ling et al. (1996) Mol. Gen. Gent. 252: 87-92). In this publication, the mapping of fer on chromosome 6 between the two markers TG590 and TGl 18 was described.
  • BAC clones were identified, two of which were characterized in more detail.
  • the BAC clones were identified by filter hybridization. Filters and BAC clones were purchased from Research Genetics, Ine, USA.
  • the end of BAC 53M23 co-existed with fer. Starting from 53M23 and 337D, a cosmid contour was developed as in Ling et al. (1999) supra. Two BAC clones, BAC 56B23 and BAC 53M23 were completely sequenced using the shot gun method.
  • the sheared and fractionated in lkb BAC-DNA was cloned and sequenced using the Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit, Invitrogen. With the help of the cosmids and corresponding sequence analysis programs, the sequence of the fer region was completely put together. Probes were mapped at various points in the sequence so that the fer gene could finally be located in an area of 18 kb. This 18kb area contains two open reading frames, one of which codes for a transposase and therefore as a fer gene is out of the question. The second open reading frame codes for a 34 kD protein and is the fer gene.
  • the fer gene co-regulates with the fer mutation and has an RFLP polymorphism between the mutant line T3238fer and the mother line T3238FER. While the mother line T3238FER has an EcoRN fragment of 4.8 kb in an RFLP analysis, as can also be seen from the sequence analysis, the mutant line T3238fer has two fragments of 4.5 kb and 4.0 kb (see FIG. 2). This polymorphism indicates an insertion or a rearrangement which affect the fer region in the mutant.
  • Transcripts can be detected in cotyledons, leaves or flowers (see Figure 4b).
  • the expression of the fer gene in the root depends on the addition of trivalent iron. Plants grown in Hoagland solution (Scholz et al. (1987) Bioch. Physiol. Plant. (1987) 63: 99-104) with 100 ⁇ M Fe-HEDTA showed strong expression of fer in roots (4a). For wild-type and fer plants that are up to three weeks old in Hoagland solution
  • FER regulates nramp genes either directly by binding to nramp promoters or indirectly after switching on a signal cascade. FER is therefore a direct or indirect regulator of nramp genes in the root.
  • the coding sequence of the fer gene was inserted behind the 35S promoter
  • Plant transformation vector (pBINAR, Höfgen et al. (1990) Plant Science 66: 221-230) cloned and converted into mutant fer tomato plants. Transformation and regeneration of fer plants were not a problem in vitro because the fer phenotype is saved in vitro on MS medium.
  • Figure 1 illustrates the marker-assisted isolation of the fer gene.
  • top The coverage of the fer region with YAC and BAC clones is shown. Mapped ends of genomic BAC and YAC clones are shown and their distance from the fer gene based on the number of recombination events.
  • Genomic DNA from the mutant line T3238fer, the wild type lines T3238FER, Moneymaker, LA483 and TA56 was cut with the restriction enzyme EcoRV and cut in a Southem blot Analysis hybridized with the fer cDNA as a probe.
  • 3 a shows the comparison of the cDNA sequences from tomato and Arabidopsis thalianä.
  • 3b shows a comparison of the FER amino acid sequences from tomato and Arabidopsis thalianä.
  • the coding sequences of Lefer (Le stands for Lycopersicon esculentum) and Atfer (At stands for Arabidopsis thalianä) began with the ATG start codon and ended with the TAA stop codon using the Clustal program of DNASTAR Inc. (Meg Align 4.0) - Sequence analysis packages compared. Identical base positions have a black background.
  • the amino acid sequences FER (tomato) and ATFER were compared using the Clustal program. Identical amino acid positions are highlighted in black.
  • fer transcripts were carried out on total RNA from roots, leaves and stems of wild-type plants (Mm, Moneymaker) and fer plants (Tfer) in a Northem blot Analysis with radioactively labeled fer cDNA demonstrated. The plants were each grown in Hoagland solution with 100 ⁇ M Fe-NaEDTA or Fe-HEDTA, b) reverse transcription-PCR analysis: mRNA was reverse transcribed with oligodT primers in cDNA. With specific oligonucleotide primers, DNA fragments of fer and as a positive control of the elongation factor gene were ef-lo. amplified.
  • Figure 5 shows the expression of nramp genes in wild type and fer plants

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Beeinflussung der Mineralstoffaufnahme und insbesondere der Eisenaufnahme in transgenen Pflanzen. Des Weiteren betrifft die Erfindung DNA-Sequenzen, die für FER-Proteine, insbesondere für das FER-Protein aus Tomate, kodieren. Ferner betrifft die Erfindung transgene Pflanzen und Pflanzenzellen, die ein eine erfindungsgemässe DNA-Sequenz umfassendes Nukleinsäuremolekül enthalten und aufgrund dessen im Vergleich zu Wildtyppflanzen bzw. -zellen eine veränderte Mineralstoffaufnahme, insbesondere Eisenaufnahme, aufweisen, sowie Ernteprodukte und Vermehrungsmaterial der transgenen Pflanzen.

Description

Verfahren zur Beeinflussung der Mineralstoffaufiiahme in transgenen Pflanzen
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Beeinflussung der Mineralstoffaufiiahme und insbesondere der Eisenaufiiahme in transgenen Pflanzen. Des Weiteren betrifft die Erfindung DNA-Sequenzen, die für FER-Proteine, insbesondere für das FER- Protein aus Tomate, kodieren. Femer betrifft die Erfindung transgene Pflanzen und Pflanzenzellen, die ein eine erfindungsgemäße DNA-Sequenz umfassendes Nukleinsauremolekul enthalten und aufgrund dessen im Vergleich zu Wildtyppflanzen bzw. -zellen eine veränderte Mineralstoffaufiiahme, insbesondere Eisenaufiiahme, aufweisen, sowie Ernteprodukte und Vermehrungsmaterial der transgenen Pflanzen.
Eisen ist als Komponente vieler wichtiger Enzyme und Proteine ein notwendiges Nährelement für alle Organismen. Die effiziente Eisenaufiiahme der Pflanzen aus dem Boden ist ein komplexer und streng regulierter Prozess, der bei Eisenmangelstress induziert wird. Zwei aktive Eisenaufhahmemechanismen werden in höheren Pflanzen unterschieden: Strategie I (bei höheren Pflanzen mit Ausnahme der Gramineen) und Strategie II (Gramineen). Neben zahlreichen physiologischen und morphologischen Veränderungen ist der zentrale Kern der Strategie I die
Reduktion von Fe(III) zu Fe(II) an der Wurzeloberfläche (Briat and Lobreaux (1997) Trans. Plant Sei. 2:187-193). Dieses reduzierte Eisen wird von der Pflanze aufgenommen. Zu diesem Zweck aktivieren Strategie I-Pflanzen die Eisenchelatreduktase in Wurzeln, welche durch eine Farbreaktion in vielen Pflanzen nachgewiesen wurde, und Eisentransporter. Zu einem bedeutenden Teil werden diese Reaktionen auf transkriptioneller Ebene bei Eisenmangel in der Wurzel angeschaltet, wie Studien im Modellsystem Arabidopsis thaliana ergeben haben. In Arabidopsis ist eine Induktion bei Eisenmangel für das Gen der Felll-Chelatreduktase. fio2 (Robinson et al. (1999) Nature 397:694-697), und das Gen für einen Transporter von zweiwertigen Metallionen, irtl (Koshunova et al. (1999) Plant Mol. Biol. 40:37-44) beschrieben. Die Gene für NRAMP-Proteine mit Transportkapazitäten für Eisen, wie ATNRAMP3 und ATNRAMP4, werden in Arabidopsis thaliana-Wxxrzein bei Eisenmangel verstärkt exprimiert (Thomine et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 97:4991-4996), während andererseits die Expression des Gens von ATNRAMPl, das für ein Protein mit geringeren Eisentransportkapazitäten als ATNRAMP3 und ATNRAMP4 kodiert, nicht von Eisenmangel beeinflusst wird (Curie et al. (2000) Biochem. J. 347:749-755). Ein wichtiger Punkt aber ist, dass die bei Eisenmangel induzierten Transportmechanismen nicht für Eisen spezifisch sind, sondern auch von anderen zweiwertigen Metallionen verstärkt genutzt werden, beispielsweise Zink, Mangan, Cadmium (Nelson (1999) EMBO J., 18:4361-4371; Thomine (2000) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 97:4991-4996; Koshunova et al. (1999) Plant Mol. Biol. 40:37-44). Der zentrale Kern der Strategie II ist die erhöhte Produktion und Sekretion von Phytosiderophoren und die anschließende Aufnahme von Komplexen der Phytosiderophoren mit zweiwertigem Eisen über induzierte Transportmechanismen (Mori (1999) Curr. Opin. Plant Biol. 2:250-253).
Da eine positive Beeinflussung der Mineralstoffaufiiahme zu einer verstärkten Vitalität der Pflanzen, einer höheren Biomasseproduktion und somit zu besseren Erträgen führt, sind neue und effiziente Ansätze zur Beeinflussung des Mineralstoffhaushalts für die Landwirtschaft von großem Interesse. Bisher wurde in Pflanzen die Mineralstoffaufiiahme beeinflusst, indem Mineralstoffe zum Nährmedium, zum Boden oder auch direkt zu den Pflanzen gegeben wurden (Düngung). Zur Behebung von Eisenmangel wurden Pflanzen beispielsweise mit einer Lösung behandelt oder besprüht, die Eisen-Chelatkomplexe enthält. Gentechnologische Ansätze haben bislang nicht zum gewünschten Erfolg geführt i bzw. sind bisher nicht beschrieben worden.
Die bisher zur Behebung von Mineralstoffmangel oder zur Beeinflussung des Mineralstoffhaushalts herangezogenen Ansätze über Düngung sind sehr teuer, aufwendig und u.U. schädlich für die Umwelt.
Es ist jetzt überraschenderweise gelungen, erstmals eine für ein FER-Protein kodierende DNA-Sequenz bereitzustellen. Die in dieser Anmeldung offenbarte DNA-Sequenz eignet sich für eine positive Beeinflussung des Mineralstoffhaushalts und der Anreicherung und Speicherung von Mineralstoffen in transgenen Pflanzen.
Die für FER-Proteine kodierenden fer-Gene kontrollieren in Wurzeln die Eisen- aufiiahme und die Reaktionen des Eisenmangelstress. Beim FER-Protein handelt es sich um einen DNA-bindenden Regulator, der in der Wurzel von Strategie I-Pflanzen die Eisenaufiiahme auf transkriptioneller Ebene kontrolliert.
Zum Beispiel erfolgt dies durch die Induktion von Genen für Transporter von Eisen und anderen Metallionen, wie nramp oder auch irt, oder auch von Genen, die für die Eisenreduktase kodieren.
FER-Protein bedeutet im Rahmen der vorliegenden Erfindung auch, dass das Protein von einem Gen kodiert wird, nämlich dem fer-Gen, welches am fer-Locus in der Tomatenlinie T3238fer (siehe Ling et al. (1996) Mol. Gen. Genet. 252:87-92) mutiert ist. Diese Mutation führt zu dem von Ling et al. (1996, vide supra) beschriebenen fer-Phänotyp, der sich dadurch äußert, dass die Mutante im Unterschied zum Wildtyp nicht in der Lage ist, die Antworten von Strategie I-Pflanzen auf Eisenmangel anzuschalten, d.h. die Pflanzen sind z.B. nicht in der Lage, durch eine Erhöhung der Fe3+-Reduktase- Aktivität auf den Eisenmangelstress reagieren.
Weiter bedeutet FER-Protein bzw. fer-Gen im Sinne der Erfindung auch, dass der fer-Phänotyp (wie z.B. von Ling et al. (1996, vide supra) für die Tomatenlinie T3238fer beschrieben) durch Transformation von Pflanzen, die diesen Phänotyp zeigen, mit dem fer-Gen gemäß der vorliegenden Erfindung, also einer funktionalen Sequenz gemäß SEQ ID No. 1 oder 2, komplementiert werden können. Anders gesagt, ein fer-Gen im Sinne der vorliegenden Erfindung ist eine DNA-Sequenz, die, wenn sie aufpflanzen mit fer-Phänotyp übertragen und dort exprimiert wird, den fer- Wildtyp wiederherstellt, also den fer-Phänotyp fimktionell komplementiert. Die komplementierten Pflanzen können wie der Wildtyp die für Strategie I-Pflanzen typischen Eisenmangelstress-Reaktionen zeigen und daher z.B. im Unterschied zu der fer-Mutante auf Fe3+ im Boden bzw. im Wachstumsmedium überleben.
Die gezielte Kontrolle der fer-Expression in transgenen Pflanzen bietet vielfältige und aussichtsreiche Möglichkeiten für die Beeinflussung des pflanzlichen Mineralstoffwechsels. Durch die Bereitstellung des fer-Gens für die Übertragung auf Pflanzen besteht nun die Möglichkeit, die Aktivität des FER-Proteins zu beeinflussen und damit positive Effekte auf den Mineralstoffwechsel und auf die Anreicherung und Speicherung von Mineralstoffen hervorzurufen. Die Beeinflussung der Aktivität des FER-Proteins erfolgt z.B. durch eine veränderte Expression des fer-Gens in den transgenen Pflanzen.
Hierdurch ist es möglich, im Unterschied zum Stand der Technik, den Mineralstoffhaushalt vorwiegend intern in der Pflanze zu beeinflussen, ohne dass eine wesentliche äußere Zugabe von Mineralstoffen notwendig ist. Die interne Beeinflussung erfolgt durch Veränderung des FER-Proteingehalts in transgenen Pflanzen.
Die veränderte Aktivierung von FER in transgenen Pflanzen hat verschiedene positive Effekte. Zum einen können hierdurch eine verstärke Vitalität der Pflanzen, eine höhere Biomasseproduktion und somit letztlich bessere Erträge erreicht werden. Kultursorten wie z.B. Getreide, Kartoffel können somit besser auf Mineralstoffmangelböden angebaut werden, so dass die teuere und umweltschädliche Düngung mit Mineralstoffen entfällt.
Zum anderen können dank der Bereitstellung des fer-Gens Pflanzen mit erhöhter fer- Expression erzeugt werden, die aufgrund einer verstärkten Mineralstoffaufiiahme eine bessere Kompetition um Mineralstoffe aufweisen und dadurch gegenüber Schädlingen und Unkraut-pflanzen bevorteilt werden, so dass diese Pflanzen resistenter gegenüber Schädlingen und Unkrautpflanzen sind als Wildtyppflanzen ohne erhöhte fer-Expression. Dadurch würde die teuere und umweltschädliche Schädlings- und Unkrautbekämpfung entfallen oder könnte zumindest verringert werden.
Darüber hinaus kann durch eine veränderte gewebespezifische Expression von fer- Genen erreicht werden, dass die Pflanzen Mineralstoffe in bestimmten Pflanzenteilen wie beispielsweise Blättern, Wurzeln, Knollen, Früchten oder Samen anreichern und dadurch für die menschliche Ernährung wertvoller werden.
Schließlich liefert die vorliegende Erfindung die Möglichkeit, Pflanzen zu erzeugen, die aufgrund ihrer veränderten fer-Expression dem Boden Schwermetallionen entziehen können und dadurch zur Sanierung von Schwermetall-belasteten Böden eingesetzt werden können (Phytoremediation), weil in der Regel Schwermetalle wie Cadmium ähnliche oder gleiche Aufhahmemechanismen benutzen wie Eisen.
Es ist jetzt erstmals gelungen, ein fer-Gen der Tomate zu isolieren und zu charakterisieren. Die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen eröffnen eine grundlegende neue Möglichkeit, den pflanzlichen Mineralstoffwechsel zu beeinflussen. Sie können mittels geeigneter Vektoren in das Genom von Pflanzen übertragen werden, wodurch transgene Pflanzen mit veränderter Synthese von FER- Protein erzeugt werden. Diese veränderten FER-Proteinmengen haben Auswirkung auf die Regulation von fer-Zielgenen, wie beispielsweise Genen für Metalltransporter und Eisenreduktasen, und führen zu einer veränderten Effizienz der Mineralstoffaufiiahme aus dem Boden, insbesondere von Eisen, Zink, Mangan, Kupfer, aber auch von Schwermetallionen wie beispielsweise Cadmium und/oder zu einer veränderten Verteilung und Speicherung dieser Mineralstoffe in den verschiedenen Pflanzenorganen und Zellkompartimenten.
Grundsätzlich sind die neuen DNA-Sequenzen für einen Transfer in beliebige Pflanzen geeignet. Bevorzugt ist jedoch der Einsatz des fer-Gens aus dikotylen Pflanzen für die gleichen oder für weitere dikotyle Pflanzen, z.B. Tomate, Kartoffel, Zuckerrübe etc. Der Einsatz von aus monokotylen Pflanzen erhaltenen fer-DNA- Sequenzen ist demzufolge für andere monokotyle Pflanzen bevorzugt, z.B. der Einsatz des fer-Gens aus Gerste in Geste, Reis oder anderen Getreidearten.
Die Übertragung zusätzlicher fer-Genkopien in das Genom von Pflanzen sowie die Organ- und Ontogenese-spezifische Expression des fer-Gens führen durch veränderte FER-Produktion in der transgenen Pflanze zu einer veränderten Expression der potentiellen Zielgene, wie Gene für Eisenreduktase und Mineralstofftransporter. Dadurch werden Mineralstoffe in einer veränderten Weise in Zielorgane transportiert, in denen fer in veränderter Weise exprimiert wird.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung liegt somit in der Bereitstellung von DNA- Sequenzen, die für FER-Regulatorproteine kodieren, sowie in der Bereitstellung von transgenen Pflanzen, die einen im Vergleich zu ihrer Wildtypeform veränderten Gehalt an FER-Regulatorprotein und aufgrund dessen einen veränderten Mineralstoffhaushalt, insbesondere eine veränderte Eisenaufhahme aufweisen.
Eine weitere Aufgabe besteht darin, Verfahren zur Veränderung der Mineralaufhahme, insbesondere der Eisenaufiiahme in transgenen Pflanzen bereitzustellen. Weitere Aufgaben ergeben sich aus dem oben gesagten bzw. der nachfolgenden Beschreibung. Die vorstehend genannten und weitere Aufgaben der Erfindung werden durch die in den unabhängigen Patentansprüchen definierten Gegenstände gelöst. Bevorzugte Ausführungsformen werden in den abhängigen Patentansprüchen dargestellt.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird erstmals eine DNA-Sequenz offenbart, die ein FER-Protein kodiert. Vorzugsweise stammt die Sequenz aus Lycopersicon esculentum. Eine bevorzugte, für ein FER-Protein aus Tomate kodierende DNA- Sequenz ist in SEQ ID No. 1 und 2 gezeigt, wobei SEQ ID No. 1 das fer-Gen zeigt und SEQ ID No. 2 die aus der fer mRNA abgeleitete cDNA-Sequenz angibt. SEQ ID No. 3 zeigt die Aminosäuresequenz des FER-Proteins aus Tomate.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird der Begriff „fer-Gen" oder „für ein FER-Protein kodierende DNA-Sequenz" für eine Nuklemsäuresequenz verwendet, die für ein aktives DNA-bindendes Regulatorprotein kodiert, wobei das Regulatorprotein in der Wurzel von Strategie I-Pflanzen die Eisenaufiiahme auf transkriptioneller Ebene kontrolliert und wobei die kodierenden Bereiche der Nuklemsäuresequenz mit der kodierenden Sequenz in SEQ ID No. 1 bzw. 2 eine Sequenzidentitätsgrad von mindestens 45%, 50%, 55%, 60%, vorzugsweise von mindestens 70%, 75%, 80%, 85%, besonders bevorzugt von mindestens 90% und am meisten bevorzugt von mindestens 92%, 94%, 96%, 98% aufweist.
Durch Bereitstellung der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen kann die Eisenaufiiahme in transgenen Pflanzen positiv beeinflusst werden, wobei dies besonders bevorzugt durch Überexpression des fer-Gens in den transgenen Pflanzen bzw. —zellen erfolgt.
Die Beobachtung, dass der Mineralstoffhaushalt durch die Übertragung und Expression exogener fer-DNA-Sequenzen positiv beeinflusst werden kann, lässt sich in idealer Weise für die Erzeugung von Pflanzen einsetzen, die aufgrund eines gegenüber Wildtyppflanzen verbesserten Mineralstoffhaushalts vitaler, ertragreicher und widerstandfähiger sind.
Grundvoraussetzung für die Erzeugung solcher Nutzpflanzen ist die Verfügbarkeit geeigneter Transformationssysteme. Hier wurde während der letzten zwei Jahrzehnte ein breites Spektrum an Transformationsmethoden entwickelt und etabliert. Diese Techniken umfassen die Transformation pflanzlicher Zellen mit T-DNA unter Verwendung Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes als Transformationsmittel, die Fusion von Protoplasten, den direkten Gentransfer isolierter DNA in Protoplasten, die Injektion und Elektroporation von DNA in Pflanzenzellen, die Einbringung von DNA mittels biolistischer Methoden sowie weitere Möglichkeiten. Diese Transformationstechniken sind dem Fachmann bekannt oder sie können in Übersichtsartikeln bzw. entsprechenden Nachschlage- werken gefunden werden.
Neben der Verwendung der hier erstmals offenbarten fer-DNA-Sequenzen kann der Fachmann weitere für FER-Proteine kodierende DNA-Sequenzen aus anderen Organismen als Tomate mittels herkömmlicher molekularbiologischer Techniken selbst auffinden und im Rahmen der vorliegenden Erfindung einsetzen. So kann der Fachmann beispielsweise geeignete Hybridisierungssonden von den erfindungsgemäßen fer-Sequenzen ableiten und für das Screening von cDNA- und/oder genomischen Banken des jeweils gewünschten Organismus, also z.B. Kartoffel oder Getreide, aus dem ein neues fer-Gen isoliert werden soll, einsetzen. Hierbei kann der Fachmann auf geläufige Hybridisierungs-, Klonierungs- und
Sequenzierungsmethoden zurückgreifen, die in jedem bio- oder gentechnologischen Labor wohlbekannt und etabliert sind (siehe z.B. auch Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, New York). Der Fachmann kann natürlich auch anhand der erfindungsgemäßen Sequenzen geeignete Oligonukliotide-Primer für PCR- Amplifikation von fer-Sequenzen synthetisieren und einsetzen. Selbstverständlich besteht auch die Möglichkeit, die gesamte, unten als SEQ ID NO:l bzw. SEQ ID No. 2 angegebene DNA-Sequenz als Hybridisierungssonde in herkömmlichen Hybridisierungstechniken einzusetzen.
Im Allgemeinen kann der Fachmann durch Vergleich der fer-Gensequenz oder FER- Aminosäuresequenz mit Sequenzen aus verschiedenen Sequenzdatenbanken (genomische Sequenzen, BAC-Sequenzen, EST-Sequenzen, cDNA-Sequenzen) verschiedener Organismen (z. B. aus diversen Genomprojekten) Gene mit hoher Ähnlichkeit zu fer identifizieren. Diese Gene können dann mit herkömmlichen Methoden der PCR und Genklonierung bearbeitet werden. Um fer-ähnliche Gene aus Organismen zu identifizieren, die sich nicht in Datenbanken befinden, können aus der fer-Sequenz Oligonukleotide zur PCR oder RT-PCR abgeleitet werden. Zum Design solcher Oligonukleotide eignen sich beispielsweise Regionen, die zwischen dem fer-Gen aus Tomate und dem zu diesem Gen ähnlichen Gen in Arabidopsis weitestgehend identisch sind (siehe Figur 3).
In den erfindungsgemäßen rekombinanten Nukleinsäuremolekülen, die eine für ein FER-Protein kodierende DNA-Sequenz enthalten, kann die kodierende Nuklemsäuresequenz wie im nativen Gen, also in 5 '-3 '-Richtung in operativer
Verknüpfung mit einem in Pflanzen aktiven Promotors vorliegen. Auf diese Weise kann eine Überexpression der kodierenden Sequenz in den transgenen Pflanzen erreicht werden, und somit eine Erhöhung der FER- Aktivität. Eine erhöhte Aktivität kann auch mit Teilsequenzen der gesamten cDNA erreicht werden, wenn die Teilfragmente die notwendigen Eigenschaften zur Regulation aufweisen.
Auf der anderen Seite kann auch eine Downregulierung der endogenen FER- Aktivität erstrebenswert sein, z. B. kann es nützlich sein, in bestimmten Zellen die Mineralstoffaufiiahme und den Mineralstofftransport auszuschalten, um diese Vorgänge an einer anderen geeigneten Stelle besser kontrollieren zu können. Dazu müsste man die fer- Aktivität in den Zellen ausschalten, wo sie unerwünscht ist, z. B. durch den antisense- Ansatz, das Phänomen der Co-Suppression oder Doppelhybrid- RNA-Bildung. In sämtlichen Fällen muss nicht zwingend die gesamte natürlicherweise für ein FER-Protein kodierende Nuklemsäuresequenz übertragen und transkribiert werden, es können vielmehr auch Fragmente der kodierenden
Region ausreichen, soweit diese Fragmente die Erzielung der gewünschten Effekte, d.h. Co-Suppression einerseits bzw. Antisense-Inhibierung andererseits gewährleisten. Der Fachmann kann z.B. geeignete Deletionskonstrukte herstellen und durch Übertragung auf transgene Pflanzenzellen prüfen, ob ein bestimmtes Fragment der kodierenden Region den erfindungsgemäßen Effekt, nämlich die Inhibierung der endogenen FER- Aktivität hat oder nicht. Wie im Rahmen dieser Anmeldung verwendet, schließt die Formulierung „DNA-Sequenz, die für ein FER- Protein kodiert" somit auch solche DNA-Sequenzen und Fragmente ein, die zwar nicht für ein aktives Protein kodieren, deren Anwesenheit und Transkription in Sense- oder Antisense-Orientierung aber eine Co-Suppression respektive Antisense- Inhibierung in transgenen Pflanzenzellen bewirkt. Man kann solche Fragmente im Zusammenhang mit der Erfindung auch als „Antisense- oder Suppressions-aktive" FER-DNA-Fragmente bezeichnen. Auch der vollständige genomische Klon eines FER-Proteins oder Teile davon können übertragen werden, um die gewünschte Inhibierung des endogenen FER zu erreichen.
Eine weitere Möglichkeit, die h hibierung der endogenen FER- Aktivität zu erreichen, besteht in dem als RNA-Interferenz bekannten Verfahren, bei dem über das gezielte Ausschalten von mRNA-Molekülen die Bildung eines bestimmten Proteins, im vorliegenden Fall also des FER-Proteins, unterbunden wird (Elbashir et al. (2001) Nature 411, 494 - 498; Waterhouse et al. (2001) Nature 411, 834 - 842).
Auch bei der RNA-Interferenz führt die von außen zugeführte spezifische RNA zu einer Zerstörung der entsprechenden Ziel-mRNA und damit zum Fehlen des entsprechenden Proteins. Die Methode eliminiert somit nicht das Gen, sondern nur sein funktionelles Produkt (mRNA und Protein). Es handelt sich somit um ein der anti-sense-Methode ähnliches Verfahren, wobei man bei der anti-sense-Methode eine RNA-Sequenz verwendet, die komplementär zur mRNA ist, während bei der RNA- Interferenz die anti-sense-RNA in Form einer Doppelstrang-RNA zugegeben wird. Gegenwärtig wird angenommen, dass die RNA-Sequenzen mit Proteinen in der Zelle einen Komplex bilden, der spezifisch die vorgegebene Ziel-RNA erkennt und spaltet. Durch die Synthese von bestimmten RNA-Doppelstrangketten kann somit festgelegt werden, welche Ziel-mRNA in der Zelle zerstört werden soll. Im Falle der RNA-Interferenz-Methode kann der Literatur entnommen werden, welche Fragmentlängen sich für die Inhibierung des FER-Proteins eignen. Häufig sind kurze, etwa 21 Basenpaare lange Doppelstrang-RNA-Moleküle vorteilhaft (Elbashir et al. (2001) vide supra). Auch hier ist der Fachmann in der Lage, geeignete Fragmente auszuwählen und auf ihre Eignung im RNA-Interferenz- Verfahren zu testen.
In jedem Fall ist der Begriff „antisense" dahingehend zu verstehen, dass die für ein FER-Protein kodierende Sequenz bzw. ein „antisense-aktives" Fragment davon in antisense-Orientierung, also „verkehrt" herum in 3 '->5 '-Richtung, in operativer Verknüpfung mit einer in Pflanzenzellen aktiven Promotorregion vorliegt und transkribiert wird. Die RNA, die bei der Transkription eines derartigen Antisense- Gens entsteht, ist komplementär zur RNA des endogenen Gens und kami die Synthese des FER-Proteinprodukts verhindern, indem es zur Hybridisierung zwischen der nativen und der Antisense-RNA kommt.
Im Falle des alternativ einsetzbaren Co-Suppressionskonstrukts liegt die für ein FER- Protein kodierende Sequenz bzw. ein „Co-Suppressions-aktives" Fragment davon in sense-Orientierung (also in 5 ->3 -Richtung) in operativer Verknüpfung mit einer in Pflanzenzellen aktiven Promotorregion vor. Bei dem Phänomen der Co-Suppression wird das endogene Gen durch zusätzlich eingeführte, identische (Teil)Kopien dieses Gens inaktiviert. Diese Inaktivierung ist vermutlich auf einen RNA-abhängigen Mechanismus zurückzuführen, an dem die RNA-dirigierte RNA-Polymerase beteiligt ist.
Im Falle der Doppelhybrid-RNA liegt die für ein FER-Protein kodierende Sequenz sowohl in sense (5Λ->3") - als auch antisense (3Λ->5Λ) - Orientierung direkt oder durch ein Intron oder andere Sequenz operativ verknüpft vor. Weiter bedarf es zur Ausführung der erfindungsgemäßen Verfahren lediglich geeigneter regulatorischer Sequenzen, die die Transkription einer operativ verknüpften fer-DNA-Sequenz in der transformierten Pflanze bzw. Pflanzenzelle steuern. Auch hier kann der Fachmann geeignete Sequenzen problemlos dem Stand der Technik entnehmen oder selbst besonders geeignete Promotorsequenzen isolieren. Für diverse Pflanzen geeignete Promotoren lassen sich der Literatur entnehmen. Außerdem können neue Promotoren mittels aktueller Genomprojekte identifiziert werden. Z. B. können transgene Pflanzenlinien nach neuen Promotoraktivitäten gescreent werden, welche promotorlose GUS-Konstrukte integriert haben (Springer (2000) plant Cell 12:1007-1020). Explosionsanalysen von zahlreichen oder der Gesamtheit aller EST-Sequenzen (RNA-Profiling, Affymetrix) können Rückschlüsse auf geeignete Promotoren zulassen. Dadurch können Promotoren identifiziert werden, die organspezifisch (z. B. Wurzel, Samen, Blüten, Blatt etc.), gewebespezifisch (z. B. Gleitgefäße, Cortex, Epidermis) entwicklungsspezifisch oder auch induzierbar sind.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform steht die für das FER-Protein kodierende DNA-Sequenz unter der Kontrolle des 35S-Promotors.
Obwohl eine gewebespezifische Expression bevorzugt wird, kommt für die
Expression des erfmdungsgemäßen DNA-Sequenz in pflanzlichen Zellen jede Art von regulatorischer Sequenzen in Frage, die die Transkription in pflanzlichen Zellen gewährleisten. Hier ist jeder in pflanzlichen Zellen aktive Promotor eingeschlossen. Dabei kann der Promotor so gewählt sein, dass die Expression konstitutiv erfolgt oder nur in spezifischem Geweben zu einem bestimmten Zeitpunkt der
Pflanzenentwicklung und/oder zu einem durch äußere Einflüsse, biotische oder abiotische Stimuli bestimmten Zeitpunkt (induzierte Genexpression). In bezug auf die zu transformierende Pflanze kann der Promotor homolog oder heterolog sein. Bei Verwendung eines konstirutiven Promotors kann eine zell- bzw. gewebespezifische Expression auch dadurch erreicht werden, dass die Genexpression in den Zellen bzw. Geweben, in denen sie nicht erwünscht ist, gehemmt wird, beispielsweise durch Ausprägung von Antikörpern, die das Genprodukt binden und somit seine Aktivität unterbinden, oder durch geeignete Inhibitoren.
Konstitutive oder gewebe- bzw. entwicklungsspezifische oder induzierbare Gene bzw. Promotoren kann der Fachmann dem Stand der Technik, insbesondere den einschlägigen wissenschaftlichen Journalen und Datenbanken entnehmen. Darüber hinaus ist der Durchschnittsfachmami in der Lage, mittels Routinemethoden weitere geeignete Promotoren zu isolieren. So kann der Fachmann mit Hilfe gängiger molekularbiologischer Methoden regulatorische Nukleinsäureelemente identifizieren, wobei hier als Methoden beispielhaft zu nennen sind für die Identifizierung von Genen mit interessanten Promotoren transgene Pflanzenlinien mit Reporter-Gen- Konstrakten (siehe oben), RNA-Profiling, Affymetrix, in der Literatur beschriebene Gene bzw. Promotoren, subtraktives Screening von Banken nach spezifisch exprimierten cDNA, und für die Klonierung der Promotoren. Die Klonierung über PCR-Produkte, Genom- Walking, die Isolierung von genomischen Klonen, Cosmiden, BACs, Lambda, inverse PCR o. ä. zum Erhalt von Insertionspunkten bei transgenen Linien, Klonierung: Hybridisierung mit Sonden.
Femer sind optional Transkriptions- bzw. Termmationssequenzen vorhanden, die der korrekten Beendigung der Transkription dienen, sowie der Addition eines PolyA- Tails an das Transkript dienen können, dem eine Funktion bei der Stabilisierung der Transkripte beigemessen wird. Derartige Elemente sind in der Literatur beschrieben und beliebig austauschbar.
Schließlich erfolgt die Herstellung chimärer Genkonstrukte, in denen fer-kodierende DNA-Sequenzen unter Kontrolle von regulatorischen Sequenzen stehen, die eine Expression in Pflanzenzellen gewährleisten, mittels konventioneller Klonierungsmethoden (siehe beispielsweise Sambrook et al. (1989), supra). Die vorliegende Erfindung betrifft somit ein rekombinantes Nukleinsauremolekul, umfassend:
a) regulatorische Sequenzen eines in Pflanzengeweben, insbesondere in Wurzeln, aktiven Promotors; b) operativ daran gebunden eine DNA-Sequenz, die für ein FER-Protein kodiert; und c) ggf. operativ daran gebunden regulatorische Sequenzen, die als Transkriptions-, Terminations- und/oder Polyadenylierungssignale in Pflanzenzellen dienen können.
Die DNA-Sequenz, die ein FER-Protein kodiert, kann aus natürlichen Quellen isoliert oder nach bekannten Verfahren synthetisiert werden. Vorzugsweise stammt die erfindungsgemäße DNA-Sequenz aus Lycopersicon esculentum.
Mittels gängiger molekularbiologischer Techniken (siehe beispielsweise Sambrook et al. (1989) supra), ist es möglich, gewünschte Konstrukte für die Transformation von Pflanzen vorzubereiten bzw. herzustellen. Die für die gentechnologische Manipulation in prokaryontischen Zellen üblicherweise eingesetzten Klonierungs-, Mutagenisierungs-, Sequenzanalyse-,
Restriktionsanalyse- und weitere biochemisch-molekularbiologische Methoden sind dem Durchschnittsfachmann wohl bekannt. So können nicht nur geeignete chimäre Genkonstrukte mit der gewünschten Fusion von Promotor und fer-DNA-Sequenz hergestellt werden, vielmehr kann der Fachmann mittels Routinetechniken, falls erwünscht, verschiedenartige Mutationen oder Deletionen in die FER-kodierende DNA-Sequenz einführen.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die DNA-Sequenz, die ein aktives FER- Protein kodiert, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: a) DNA-Sequenzen, die die in SEQ ID No. 1 oder SEQ ID No. 2 angegebene kodierende Nukleotidsequenz oder Fragmente davon umfassen, wobei die Länge der Fragmente ausreicht, um ein Protein mit FER-Protein- Aktivität zu kodieren; b) DNA-Sequenzen, die eine Nukleotidsequenz umfassen, die die in SEQ ID
No. 2 angegebene Aminosäuresequenz oder Fragmente davon kodieren, wobei die Länge der Fragmente ausreicht, um FER-Protein- Aktivität zu besitzen; c) DNA-Sequenzen, die eine Nukleotidsequenz umfassen, die zu einer Nukleotidsequenz von a) oder b) degeneriert ist oder mit einem komplementären Strang der Nukleotidsequenz von a) oder b) hybridisiert, oder Teile dieser Nukleotidsequenz umfassen, wobei die Länge dieser Teile ausreicht, um ein Protein mit FER-Protein- Aktivität zu kodieren; d) DNA-Sequenzen, die zu der in SEQ ID No. 1 bzw. SEQ ID No. 2 angegebenen Nukleotidsequenz eine Sequenzidentität von mindestens 60%, vorzugsweise mindestens 80%, besonders bevorzugt mindestens 90% und am meisten bevorzugt mindestens 92, 94, 96, 98% aufweist; " e) DNA-Sequenzen, die ein Derivat, Analog oder Fragment einer
Nukleotidsequenz von a), b), c) oder d) darstellen, wobei die Länge des Fragments ausreicht, um ein Protein mit FER-Protein- Aktivität zu kodieren.
Der Begriff "Hybridisierung" bedeutet im Zusammenhang dieser Erfindung eine Hybridisierung unter konventionellen Hybridisierungsbedingungen, vorzugsweise unter stringenten Bedingungen, wie sie beispielsweise in Sambrook et al. (1989, vide supra) beschrieben sind.
Erfindungsgemäß wird eine Hybridisierung in vitro immer unter Bedingungen durchgeführt werden, die stringent genug sind, um eine spezifische Hybridisierung zu gewährleisten. Solche stringenten Hybridisierungsbedingungen sind dem Fachmann bekannt und können der Literatur entnommen werden (Sambrook et al., 2001, Molecular cloning: A laboratory manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press).
Allgemein bedeutet "spezifisch hybridisieren", dass ein Molekül unter stringenten Bedingungen präferenziell an eine bestimmte Nukleotidsequenz bindet, wenn diese Sequenz in einem komplexen Gemisch von (z.B. Gesamt-) DNA oder RNA vorliegt. Der Begriff „stringente Bedingungen" steht allgemein für Bedingungen, unter denen eine Nuklemsäuresequenz präferenziell an ihre Zielsequenz hybridisieren wird, und zu einem deutlich geringeren Ausmaß oder überhaupt nicht an andere Sequenzen. Stringente Bedingungen sind z.T. Sequenz-abhängig und werden unter verschiedenen Umständen unterschiedlich sein. Längere Sequenzen hybridisieren spezifisch bei höheren Temperaturen. Im Allgemeinen werden stringente Bedingungen so ausgewählt, dass die Temperatur etwa 5 °C unter dem thermischen Schmelzpunkt (Tm) für die spezifische Sequenz bei einer definierten lonenstärke und einem definierten pH liegt. Die Tm ist die Temperatur (unter definierter lonenstärke, pH und Nukleinsäurekonzentration), bei der 50% der zu der Zielsequenz komplementären Moleküle zu der Zielsequenz im Gleichgewichtszustand hybridisieren. Typischerweise sind stringente Bedingungen solche, bei denen die Salzkonzentration mindestens ungefähr 0,01 bis 1,0 M Natriumionen-Konzentration (oder ein anderes Salz) bei einem pH zwischen 7,0 und 8,3 beträgt und die Temperature mindestens ungefähr 30 °C für kurze Moleküle (also z.B. 10-50 Nukleotide) beträgt. Zusätzlich können stringente Bedingungen, wie oben bereits erwähnt, durch Zugabe destabilisierender Agenzien, wie beispielsweise Formamid, erreicht werden.
Die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen umfassen auch Fragmente, Derivate und allelische Varianten der oben beschriebenen DNA-Sequenzen, die ein FER-Protein kodieren. Der Ausdruck "Derivat" bedeutet in diesem Zusammenhang, dass die Sequenzen sich von den oben beschriebenen DNA-Sequenzen an einer oder mehre- ren Positionen unterscheiden, aber einen hohen Grad an Ähnlichkeit zu diesen Sequenzen aufweisen. Die Abweichungen zu den oben beschriebenen DNA- Sequenzen können dabei beispielsweise durch Deletion, Substitution, hisertion oder Rekombination entstanden sein.
Ähnlichkeit bzw. Homologie bedeutet dabei eine Sequenzidentität von mindestens 45%, 50%, 55%, insbesondere eine Identität von mindestens 60%, 64%, 68%. vorzugsweise eine Identität von mindestens 70%, 72%, 74%, 76%, 78%„ besonders bevorzugt von mindestens 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, noch mehr bevorzugt von mindestens 90%, 92%, 94% und am meisten bevorzugt von mindestens 96% und mindestens 98%.
Dabei weisen die durch diese DNA-Sequenzen kodierten Proteine eine Sequenzidentität zu der in SEQ ID No. 2 bzw. 3 angegebenen Aminosäuresequenz von mindestens 45%, 50%, 55%, insbesondere eine Identität von mindestens 60%, 64%, 66%, 68%, vorzugsweise eine Identität von mindestens 70%, 74%, 76%, 78%, 80%, besonders bevorzugt von mindestens 82%, 86%, 90%, 92%, 94% und am meistens bevorzugt von mindestens 96%, 98% auf.
Homologiegrade bzw. Sequenzidentitäten werden üblicherweise über verschiedene Alignment-Programme, wie z. B. CLUSTAL festgestellt. Allgemein stehen dem
Fachmann zur Bestimmung der Sequenzidentität/-ähnlichkeit geeignete Algorithmen zur Verfügung, z.B. auch das Programm, das unter http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST (z.B. der Link „Standard nucleotide-nucleotide BLAST [blastn]") zugänglich ist.
Bei den DNA-Sequenzen, die ähnlich zu den oben beschriebenen Sequenzen sind und Derivate dieser Sequenzen darstellen, handelt es sich in der Regel um Variationen dieser Sequenzen, die Modifikationen darstellen, die dieselbe biologische Funktion ausüben. Es kann sich dabei sowohl um natürlicherweise auftretende Variationen handeln, beispielsweise um Sequenzen aus anderen Organismen, oder um Mutationen, wobei diese Mutationen auf natürliche Weise aufgetreten sein können oder durch gezielte Mutagenese eingeführt wurden.
Femer kann es sich bei den Variationen um synthetisch hergestellte Sequenzen handeln. Bei den allelischen Varianten kann es sich sowohl um natürlich auftretende Varianten handeln als auch um synthetisch hergestellte oder durch rekombinante DNA-Techniken erzeugte Varianten.
In einer besonders bevorzugten Ausfuhrungsform stammt die beschriebene, für eine FER-Protein kodierende DNA-Sequenz aus Lycopersicon esculentum (wie in SEQ ID No. 1 bzw. SEQ ID No. 2 angegeben).
Die Erfindung betrifft weiterhin Vektoren und Mikroorganismen, die erfindungsgemäße Nukleinsäuremoleküle enthalten und deren Verwendung die Herstellung von Pflanzenzellen und Pflanzen ermöglicht, deren Mineralstoffhaushalt, insbesondere deren Eisenaufiiahme gegenüber Wildtyp-Pflanzenzellen bzw. - Pflanzen verändert ist. Dabei handelt es sich bei den Vektoren insbesondere um Plasmide, Cosmide, Viren, Bakteriophagen und andere in der Gentechnik gängige Vektoren. Bei den Mikroorganismen handelt es sich in erster Linie um Bakterien, Viren, Pilze, Hefen und Algen.
Des Weiteren wird bei der vorliegenden Erfindung ein rekombinantes FER-Protein Lycopersicon esculentum, insbesondere ein rekombinantes Protein mit der in SEQ ID No. 2 und No. 3 angegebenen Aminosäuresequenz bereitgestellt.
Weiter betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Erzeugung von Pflanzen bzw. Pflanzenzellen mit einem gegenüber Wildtyp-Pflanzen bzw. -Pflanzenzellen veränderte Mineralstoffhaushalt, insbesondere veränderte Eisenaufiiahme, umfassend die folgenden Schritte: a) Herstellung eines rekombinanten Nukleinsäuremoleküls, das folgende Sequenzen umfasst: regulatorische Sequenzen eines in Pflanzen aktiven Promotors;
- operativ daran gebunden eine DNA-Sequenz, die ein FER-Protein kodiert; und
- optional operativ daran gebunden regulatorische Sequenzen, die als Transkriptions-, Terminations- und/oder Polyadenylierungssignale in Pflanzenzellen dienen können; b) Übertragung des Nukleinsäuremoleküls aus a) auf pflanzliche Zellen; und c) gegebenenfalls die Regeneration intakter Pflanzen aus den transformierten
Pflanzenzellen.
Die Erfindung betrifft femer Pflanzenzellen, die die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle, die ein FER-Protein kodieren, enthalten. Die Erfindung betrifft ebenfalls Emteprodukte und Vermehrungsmaterial transgener Pflanzen sowie die transgenen Pflanzen selbst, die ein erfindungsgemäßes Nukleinsauremolekul enthalten. Transgene Pflanzen der vorliegenden Erfindung weisen aufgrund der Einführung einer FER-kodierenden DNA-Sequenz eine gegenüber Wildtyppflanzen veränderte Eisenaufiiahme auf.
Zur Vorbereitung der Einführung fremder Gene in höhere Pflanzen bzw. deren Zellen stehen eine große Anzahl von Klonierungsvektoren zur Verfügung, die ein Replikationssignal für E. coli und ein Markergen zur Selektion transformierter Bakterienzellen enthalten. Beispiele für derartige Vektoren sind pBR322, pUC- Serien, M13mp-Serien, pACYC184 usw. Die gewünschte Sequenz kann an einer passenden Restriktionsschnittstelle in den Vektor eingeführt werden. Das erhaltene Plasmid wird dann für die Transformation von E. cotϊ-Zellen verwendet. Transformierte E. co/z-Zellen werden in einem geeigneten Medium gezüchtet und anschließend geemtet und lysiert, und das Plasmid wird wiedergewonnen. Als Analysenmethode zur Charakterisierung der gewonnenen Plasmid-DNA werden im Allgemeinen Restriktionsanalysen, Gelelektrophoresen und weitere biochemisch- molekularbiologische Methoden eingesetzt. Nach jeder Manipulation kann die Plasmid-DNA gespalten und gewonnene DNA-Fragmente mit anderen DNA- Sequenzen verknüpft werden.
Wie bereits erwähnt, stehen für die Einführung von DNA in eine pflanzliche Wirtszelle eine Vielzahl von Techniken zur Verfügung, wobei der Fachmann die jeweils geeignete Methode ohne Schwierigkeiten ermitteln kann. Diese Techniken umfassen die Transformation pflanzlicher Zellen mit T-DNA unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes als
Transformationsmedium, die Fusion von Protoplasten, die Injektion, die Elektroporation, den direkten Gentransfer isolierter DNA in Protoplasten, die Einbringung von DNA mittels biolistischer Methoden sowie weitere Möglichkeiten, die bereits seit mehreren Jahren gut etabliert sind und zum üblichen Repertoire des Fachmanns in der pflanzlichen Molekularbiologie bzw. Pflanzenbiotechnologie gehören.
Bei der Injektion und Elektroporation von DNA in Pflanzenzellen werden per se keine speziellen Anforderungen an die verwendeten Plasmide gestellt. Ähnliches gilt für den direkten Gentransfer. Es kömien einfache Plasmide, wie z.B. pUC-Derivate verwendet werden. Sollen aber aus derartig transformierten Zellen ganze Pflanzen regeneriert werden, ist die Anwesenheit eines selektierbaren Markergens empfehlenswert. Dem Fachmann sind die gängigen Selektionsmarker bekannt, und es stellt für ihn kein Problem dar, einen geeigneten Marker auszuwählen.
Je nach Einfuhrungsmethode der gewünschten Gene in die Pflanzenzelle können weitere DNA-Sequenzen erforderlich sein. Werden z.B. für die Transformation der Pflanzenzelle das Ti- oder Ri-Plasmid verwendet, so muss mindestens die rechte Begrenzung, häufig jedoch die rechte und linke Begrenzung der im Ti- bzw. Ri- Plasmid enthaltenen T-DNA als Flankenbereich mit den einzuführenden Genen verbunden werden. Werden für die Transformation Agrobakterien verwendet, muss die einzuführende DNA in spezielle Plasmide Moniert werden, und zwar entweder in einen intermediären oder in einen binären Vektor. Die intermediären Vektoren können aufgrund von Sequenzen, die homolog zu Sequenzen in der T-DNA sind, durch homologe Rekombination in das Ti- oder Ri-Plasmid der Agrobakterien integriert werden. Dieses enthält außerdem die für den Transfer der T-DNA notwendige fer-Region. Intermediäre Vektoren können allerdings nicht in Agrobakterien replizieren. Mittels eines Helferplasmids kann der intermediäre Vektor auf Agrobacterium tumefaciens übertragen werden (Konjugation). Binäre Vektoren dagegen können sowohl in E. coli als auch in Agrobakterien replizieren. Sie enthalten ein Selektionsmarkergen und einen Linker oder Polylinker, welche von der rechten und linken T-DNA-Grenzregion eingerahmt werden. Sie können direkt in die Agrobakterien transformiert werden. Das als Wirtszelle dienende Agrobakterium soll ein Plasmid enthalten, welches eine fer-Sequenz innerhalb der T-DNA trägt, welche in die Pflanzenzelle übertragen wird. Zusätzliche T-DNA kann vorhanden sein. Das derartig transformierte Agrobakterium wird zur Transformation von Pflanzenzellen verwendet. Die Verwendung von T-DNA für die Transformation von Pflanzenzellen ist intensiv untersucht und ausreichend in allseits bekannten Übersichtsartikeln und Handbüchern zur Pflanzentransformation beschrieben worden. Für den Transfer der DNA in die Pflanzenzelle können Pflanzen-Explantate zweckmäßigerweise mit Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes kultiviert werden. Aus dem infizierten Pflanzenmaterial (z.B. Blattstücke, Stengelsegmente, Wurzeln, aber auch Protoplasten oder Suspensions-kultivierte Pflanzenzellen) können dann in einem geeigneten Medium, welches Antibiotika oder Biozide zur Selektion transformierter Zellen enthalten kann, wieder ganze Pflanzen regeneriert werden.
Ist die eingeführte DNA einmal im Genom der Pflanzenzelle integriert, so ist sie dort in der Regel stabil und bleibt auch in den Nachkommen der ursprünglich transformierten Zelle erhalten. Sie enthält normalerweise einen Selektionsmarker, der den transformierten Pflanzenzellen Resistenz gegenüber einem Biozid oder einem Antibiotikum wie Kanamycin, G 418, Bleomycin, Hygromycin, Methotrexat, Glyphosat, Streptomycin, Sulfonylharnstoff, Gentamycin oder Phosphinotricin u.a. vermittelt. Der individuell gewählte Marker sollte daher die Selektion transformierter Zellen gegenüber Zellen, denen die eingeführte DNA fehlt, gestatten. Hierzu sind auch alternative Marker geeignet, wie nutritive Marker, Screeningmarker (wie GFP, green fluorescent protein). Selbstverständlich kann auch vollkommen auf Selektionsmarker verzichtet werden, was allerdings mit einem ziemlich hohen Screeningbedarf einhergeht. Falls markerfreie transgene Pflanzen erwünscht sind, stehen dem Fachmann auch Strategien zur Verfügung, die eine nachträgliche
Entfernung des Markergens erlauben, z.B. Cotransformation, Sequenz-spezifische Rekombinasen.
Die Regeneration der transgenen Pflanzen aus transgenen Pflanzenzellen erfolgt nach üblichen Regenerationsmethoden unter Verwendung bekannter Nährmedien. Die so erhaltenen Pflanzen können dann mittels üblicher Verfahren, einschließlich molekularbiologischer Methoden, wie PCR, Blot- Analysen, auf Anwesenheit der eingeführten Nukleinsäure, die ein FER-Protein kodiert bzw. auf Anwesenheit des Genprodukts, also des FER-Proteins untersucht werden.
Bei der transgenen Pflanze bzw. den transgenen Pflanzenzellen kann es sich um jede beliebige monokotyle oder dikotyle Pflanze bzw. Pflanzenzelle handeln, in der der Mineralstoffhaushalt, insbesonder die Eisenaufiiahme verändert, vorzugsweise verbessert werden soll. Vorzugsweise handelt es sich um Nutzpflanzen bzw. Zellen von Nutzpflanzen. Besonders bevorzugt handelt es sich um Solanaceen wie
Kartoffel, Tabak, Tomate, Paprika, aber auch andere dikotyle (z. B. Zuckerrübe) bzw. monokotyle Pflanzen (z. B. Reis, Mais, Weizen). Prinzipiell ist jede Nutzpflanze für die Umsetzung der Erfindung erstrebenswert, die für Emährungszwecke unmittelbar oder mittelbar geeignet ist. Die Erfindung betrifft ebenfalls Vermehrungsmaterial und Ernteprodukte der erfindungsgemäßen Pflanzen, beispielsweise Früchte, Samen, Knollen, Wurzelstöcke, Sämlinge, Stecklinge usw.
Die spezifische Expression des FER-Proteins in den erfindungsgemäßen Pflanzen bzw. in den erfindungsgemäßen Pflanzenzellen kann mit Hilfe herkömmlicher molekularbiologischer und biochemischer Methoden nachgewiesen und verfolgt werden. Dem Fachmann sind diese Techniken bekannt und er ist problemlos in der Lage, eine geeignete Nachweismethode zu wählen, beispielsweise eine Northern- Blot- Analyse zum Nachweis FER-spezifischer RNA bzw. zur Bestimmung der Höhe der Akkumulation von FER-spezifischer RNA oder eine Southem-Blot-Analyse zum Nachweis von für FER kodierende DNA-Sequenzen.
Femer betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Veränderung der Mineralstoffaufiiahme, insbesondere der Eisenaufiiahme in Pflanzen, umfassend die folgenden Schritte:
a) die Übertragung eines rekombinanten Nukleinsäuremoleküls oder Vektors, der eine DNA-Sequenz enthält, die für ein FER-Protein kodiert, auf Pflanzenzellen; b) die Regeneration von Pflanzen aus den transformierten Pflanzenzellen.
Die vorliegende Erfindung wird in den nachfolgenden Beispielen, die nur der Veranschaulichung der Erfindung dienen und keiner Weise als Einschränkung zu verstehen sind, erläutert. Beispiele
Die Tomatenlinie T3238fer, die aus der Bor-ineffizienten Tomatenlinie T3238 als Mutante stammt, ist nicht in der Lage, unter Eisenmangelbedingungen die für Strategie I Pflanzen-typischen Eisenmangelstressreaktionen zu aktivieren (Brown et al. (1971) Physiol. Plant. 25:48-53; Brown et al. (1974) Physiol. Plant. 31:221-224). Die mutierten Pflanzen zeigen bei Eisenmangel weder erhöhte Reduktaseaktivität noch andere physiologische oder morphologische Veränderungen, die für die effiziente Aufnahme von Eisen bei Eisenmangel angeschaltet werden. Da die fer- Mutation zahlreiche Auswirkungen hat, agiert fer vermutlich zentral auf transkriptioneller Ebene. Bei Wachstum in Erde sterben fer-Pflanzen mit fer- Mutation noch während der vegetativen Phase ab. Pflanzen mit fer-Mutation können partiell oder vollständig gerettet werden, indem sie in Erde ständig mit Eisen in Form von Eisenhydroxyethylendiamintriessigsäure (Fe-HEDTA) gedüngt oder auf MS- Medium angezogen werden. Bei der fer-Mutante handelt es sich um eine rezessive Mutante, bei der ein einziges Gen betroffen ist, das auf Chromosom 6 der Tomate 0,33 cM von TG590 und 2,0 cM von TG118 entfernt kartiert wurde (Ling et al. (1996) Mol. Gen. Genet. 252:87-92).
Marker-gestützte Isolierung des fer-Gens
Zur Isolierung des fer-Gens wurde die Marker-gestützte Genklonierungstechnik eingesetzt (Chromosome Walk). Diese Technik wurde in der Tomate bereits mehrfach erfolgreich angewandt. Im Falle der Klonierung von fer erfolgte die Methode analog derjenigen von chloronerva, das vor zwei Jahren erfolgreich abgeschlossen wurde und in Ling et al. (PNAS Prod. Natl. Acad. Sei. USA (1999) 96:7098-7103) mit allen Referenzen beschrieben ist. Die Techniken zum Arbeiten mit YAC, BAC und Cosmid Klonen sind Birren et al. (Green et al., Eds, Genome Analysis, A laboratory Manual, CSHL Press, USA, 1997) entnommen. Der Beginn der Genkartierung und des Chromosome Walking bei fer wurde in Ling et al. (1996) Mol. Gen. Gent. 252: 87-92) beschrieben. In dieser Publikation wurde die Kartierung von fer auf Chromosom 6 zwischen den beiden Markern TG590 und TGl 18 beschrieben.
Für die Marker-gestützte Genklonierungstechnik wurde die in Ling et al. (1996) supra beschriebene Kartierungspopulation von 1244 F2-Pflanzen auf 1815 F2- Pflanzen der Kreuzung L. esculentum T3238fer x L. pennellii ausgeweitet. 6 rekombinante Pflanzen wurden zwischen TG590 und fer gefunden, sowie 35 rekombinante Pflanzen zwischen fer und TGl 18. Der in Ling et al. (1996) supra begonnene Chromosome Walk wurde fortgesetzt wie in Abb. 1 dargestellt. Zunächst wurden ausgehend von den in Ling et al. (1996) supra beschriebenem YAC-Ende 149AR zwei weitere YAC-Klone isoliert und deren Ende kartiert (267L und 328N1). Mit 267L und 328N1 gelang die Isolierung des YAC 337, der die gesamte fer Region umspannt und auf beiden Seiten des fer Gens nach je zwei
Rekombinationsereignissen endet. Mit dem Ende Y337D konnten BAC Klone identifiziert werden, von denen zwei näher charakterisiert wurden. Die BAC-Klone wurden durch Filterhybridisierung identifiziert. Filter und BAC-Klone wurden von Research Genetics, Ine, USA bezogen. Das Ende von BAC 53M23 kosegrierte mit fer. Ausgehend von 53M23 und 337D wurde ein Kosmidkontig wie in Ling et al. (1999) supra beschrieben erstellt. Zwei BAC-Klone, BAC 56B23 und BAC 53M23 wurden mit Hilfe der Shot-Gun-Methode vollständig sequenziert. Dazu wurde die gescherte und in lkb fraktionierte BAC-DNA mittels des Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit, Invitrogen, kloniert und sequenziert. Mit Hilfe der Kosmidenden sowie entsprechenden Sequenzanalyseprogrammen wurde die Sequenz der fer-Region vollständig zusammengestellt. An verschiedenen Stellen der Sequenz wurden Sonden zum Kartieren abgeleitet, so dass das fer-Gen schliesslich auf einem Bereich von 18kb lokalisiert werden konnte. Dieser 18kb grosse Bereich enthält zwei offene Leserahmen, von denen einer für eine Transposase kodiert und als fer-Gen daher nicht in Frage kommt. Der zweite offene Leserahmen kodiert für ein 34kD-Protein und ist das fer-Gen.
Molekulare Analyse des fer-Gens in T3238FER- Wildtyp- und T3238fer- Mutantenlinie
Das fer-Gen kosegregiert mit der fer-Mutation und weist einen RFLP- Polymorphismus zwischen der Mutantenlinie T3238fer und der Mutterline T3238FER auf. Während die Mutterlinie T3238FER in einer RFLP-Analyse ein EcoRN-Fragment von 4,8kb aufweist, wie es sich auch aus der Sequenzanalyse ergibt, weist die mutante Linie T3238fer zwei Fragmente von 4,5kb und 4,0kb auf (siehe Figur 2). Dieser Polymorphismus weist auf eine Insertion oder ein Rearrangement hin, welche die fer-Region in der Mutante betreffen.
Beschreibung der fer-DΝA und FER- Aminosäuresequenzen
Ein Vergleich der Sequenz des fer-Gens mit Sequenzen aus der Gendatenbank zeigte, dass das fer-Gen für ein Protein mit konservierter basischer Helix-Loop- Helix-DΝA-Bindedomäne kodiert. Die höchste Sequenzähnlichkeit weist das fer- Gen mit einem Gen aus Arabidopsis thaliana auf, das auf Chromosom II lokalisiert ist (DΝA-Accession Νo. AC005851 kodierende Sequenz von 72093 bis 73201bp, Gen=At2g28160, hier im folgenden Atfer genannt, Protein- Accession Νo. AAC984501.1). Für das Arabidopsis-Gen wurde bisher keine Funktionsanalyse beschrieben. Es kann somit nicht gesagt werden, ob die Sequenzen zwischen fer und Atfer lediglich ähnlich sind oder ob die Gene tatsächlich homolog sind, d. h. die Funktionen homolog sind. Außerhalb der konservierten Helix-Loop-Helix-Domäne bestehen zwischen fer und Atfer Sequenzähnlichkeiten im N-terminalen als auch C-terminalen Bereich, sowohl auf DNA- als auch auf Proteinebene (siehe Figur 3a). Im Gegensatz dazu weisen andere Helix-Loop-Helixproteine keine Sequenzähnlichkeiten außerhalb des konservierten Motifs auf. Ein Vergleich von cDNA und genomischer Sequenz zeigt, dass das fer-Gen über drei hitrons verfügt. Die Positionen der ersten beiden Introns sind in fer und Atfer konserviert (siehe Figur 3b), was möglicherweise eine enge Verwandschaft von fer und Atfer bedeutet.
Expressionsanalysen des fer-Gens
Northern-Blot- Analysen gesamter RNA von Wurzeln, Blättern und Stengel zeigen, dass das fer-Gen nur in Wurzelgeweben exprimiert wird (Figur 4a). Mit Hilfe von reverser Transkription-PCR konten keine bzw. nur sehr geringe Mengen an
Transkripten in Kotyledonen, Blättern oder Blüten nachgewiesen werden (siehe Figur 4b). Die Expression des fer-Gens in der Wurzel ist abhängig von der Zugabe von dreiwertigem Eisen. In Hoagland-Lösung (Scholz et al. (1987) Bioch. Physiol. Plant. (1987) 63:99-104) mit 100 μM Fe-HEDTA angezogene Pflanzen wiesen eine starke Expression von fer in Wurzeln auf (4a). Bei Wildtyp- und fer-Pflanzen, die bis zum Alter von drei Wochen in Hoagland-Lösung mit
10 μM Fe-NaEDTA, danach jedoch in Hoagland-Lösung mit je 0,1 μM, 10 μM und 50 μM Fe-NaEDTA angzogen wurden, erfolgte die Expression des fer-Gens in den Wurzeln konstitutiv (Figur 4b). Hingegen waren keine Transkripte durch Northern- Blot- Analyse in Wurzeln von Wildtyp-Pflanzen nachweisbar, die in Hoagland- Lösung mit 100 μM Fe-HEDTA angezogen wurden.
Expression von Zielgenen in fer-Mutanten Eine Analyse der Expression von Transportergenen im Beispiel "Expressionsanalysen des fer-Gens" beschriebenen Wildtyp-fer-Pflanzen, die in Hoagland-Lösung mit je 0,1 μM, 10 μM und 50 μM Fe-NaEDTA angezogen wurden, ergab, dass nramp-Gene in den Wurzeln von fer-Pflanzen nicht exprimiert wurden. Im Gegensatz dazu werden diese nramp-Gene in Wildtyp-Wurzeln konstitutiv exprimiert.
FER reguliert nramp-Gene entweder direkt durch Bindung an nramp-Promotoren oder indirekt nach Anschalten einer Signalkaskade. FER ist somit ein direkter oder indirekter Regulator von nramp-Genen in der Wurzel.
Erzeugung transgener Pflanzen mit Expression des fer-Gens aus Tomate
Die kodierende Sequenz des fer-Gens wurde hinter den 35S-Promotor in einen
Pflanzentransformationsvektor (pBINAR, Höfgen et al. (1990) Plant Science 66:221- 230) Moniert und in mutante fer-Tomatenpflanzen überführt. Transformation und Regeneration von fer Pflanzen stellten in vitro kein Problem dar, weil der fer Phänotyp in vitro auf MS Medium gerettet wird.
Bei Überführung in Erde wurde beobachtet, dass nicht-transgene Kontrollpflanzen schon bald Blattchlorosen und Nekrosen entwickelten, während die mit dem 35S-fer Konstrukt transformierten Pflanzen gerettet wurden. Das fer-Gen kann somit zur Behebung von Mineralstoffchlorosen eingesetzt werden. Die Transformation und Regeneration wurde nach üblichen Protokollen durchgeführt.
Beschreibung der Figuren
Figur 1 erläutert die Marker-gestützte Isolierung des fer-Gens. (oben) Dargestellt ist die Abdeckung der fer-Region mit YAC- und BAC-Klonen. Kartierte Enden von genomischen BAC- und YAC-Klonen sind eingezeichnet sowie deren Abstand von fer-Gen anhand der Anzahl der Rekombinationsereignisse.
(mitte) Vergrößerte Ansicht der fer-Region mit eingezeichneten Kosmiden. (unten) Darstellung von offenen Leserahmen der 18 kb fer-Region.
Fig. 2 zeigt das Ergebnis einer Southem-Blot-Hybridisierung des fer-Gens in Tfer und schiedenen Wildtyplinien Genomische DNA von der Mutantenlinie T3238fer, den Wildtyplinien T3238FER, Moneymaker, LA483 und TA56 wurde mit dem Restriktionsenzym EcoRV geschnitten und in einer Southem-Blot-Analyse mit der fer-cDNA als Sonde hybridisiert.
Fig. 3 a zeigt den Vergleich der cDNA-Sequenzen aus Tomate und Arabidopsis thalianä.
Fig. 3b zeigt einen Vergleich der FER- Aminosäuresequenzen aus Tomate und Arabidopsis thalianä. Die kodierenden Sequenzen von Lefer (Le steht für Lycopersicon esculentum) und Atfer (At steht für Arabidopsis thalianä) beginnt mit dem ATG-Startkodon und endend mit dem TAA-Stopkodon wurden mit Hilfe des Clustal Programms des DNASTAR Inc. (Meg Align 4.0) - Sequenzanalysepakets verglichen. Identische Basenpositionen wurden schwarz unterlegt. Die Aminosäuresequenzen FER (Tomate) und ATFER wurden mit Hilfe des Clustal Programms verglichen. Identische Aminosäurepositionen sind schwarz unterlegt.
Fig. 4 zeigt Expressionsanalysen des fer-Gens a) Northem-Blot- Analyse: fer Transkripte wurden auf Gesamt RNA von Wurzeln, Blättern und Stengeln von Wildtyppflanzen (Mm, Moneymaker) und fer-Pflanezn (Tfer) in einer Northem-Blot- Analyse mit radioaktiv markierter fer cDNA nachgewiesen. Die Pflanzen wurden jeweils in Hoagland-Lösung mit 100 μM Fe-NaEDTA oder Fe-HEDTA angezogen, b) Reverse Transkription-PCR- Analyse: mRNA wurde revers mit oligodT-Primern in cDNA transkribiert. Mit spezifischen Oligonukleotidprimem wurden DNA-Fragmente von fer und als Positivkontrolle vom Elongationsfaktorgen ef-lo. amplifiziert. Die PCR-Produkte wurden im Agarosegel aufgetrennt und durch Southem-Blot-Hybridisierung nachgewiesen. Für die Expressionsanalyse in verschiedenen Geweben wurde RNA von zwei Wochen alten Keimlingen isoliert (r = Wurzel, rt = Wurzelspitzen, hy = Hypokotyl, cot = Kotyledonen, 1= erste Blatt). Zwei Wochen alte Pflanzen wurden in Hoagland-Lösung mit entweder 0,1, 10 oder 50 μM Fe-EDTA überführt. Wurzelproben zur RNA-Präparation wurden vor Beginn des Experiments (0) nach sechs Stunden (6h), acht Stunden (8H), zwei, vier und acht Tagen (2-8d) entnommen.
Fig. 5 zeigt die Expression von nramp-Genen in Wildtyp- und fer-Pflanzen
Die reverse Transkription-PCR- Analyse wurde wie im Zusammenhang mit Fig. 4b durchgeführt, jedoch mit nramp-spezifischen Oligonukleotiden.

Claims

P A T E N T A N S P R Ü C H E
1. DNA-Sequenz, die für ein FER-Protein kodiert, ausgewählt aus der
Gruppe bestehend aus a) DNA-Sequenzen, die die in SEQ ID No. 1 oder SEQ ID No. 2 angegebene kodierende Nukleotidsequenz oder Teile davon umfassen, b) DNA-Sequenzen, die eine Nukleotidsequenz umfassen, die die in SEQ ID No. 2 oder SEQ ID No. 3 angegebene Aminosäuresequenz oder Fragmente davon kodieren; c) DNA-Sequenzen, die eine Nukleotidsequenz, die zu einer Nukleotidsequenz von a) oder b) degeneriert ist, oder Teile dieser Nukleotidsequenz umfassen; d) DNA-Sequenzen, die zu der in SEQ ID No. 1 bzw. SEQ ID No. 2 angegebenen Nukleotidsequenz eine Sequenzidentität von mindestens 45%, 50%, 55%, vorzugsweise mindestens 60%, 70%, 80%, besonders bevorzugt mindestens 90% und am meisten bevorzugt mindestens 92, 94, 96, 98% aufweist; e) DNA-Sequenzen, die ein Derivat, Analog oder Fragment einer Nukleotidsequenz von a), b), c) oder d) darstellen.
2. DNA-Sequenz nach Anspruch 1, die aus Tomate stammt.
3. Rekombinantes Nukleinsauremolekul, umfassend die folgenden Elemente: - regulatorische Sequenzen eines in Pflanzenzellen aktiven Promotors,
- operativ daran gebunden eine DNA-Sequenz nach Anspruch 1 oder 2,
- ggf. operativ daran gebunden regulatorische Sequenzen, die in der Pflanzenzelle als Transkriptions-, Terminations- und/oder Polyadenylierungssignale dienen können.
4. Rekombinantes Nukleinsauremolekul nach Anspruch 1, wobei die DNA- Sequenz in sense- und/oder antisense-Orientierung vorliegen kann.
5. Rekombinantes FER-Protein, das durch eine DNA-Sequenz nach Anspruch 1 oder 2 kodiert wird oder das eine Aminosäuresequenz aufweist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: a) Aminosäuresequenz wie in SEQ ID No. 2 oder 3 angegeben oder Fragmente davon, und b) Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID No. 2 oder 3 angegebenen Aminosäuresequenz eine Sequenzidentität von mindestens 45%, 50%, 55%, vorzugsweise mindestens 60%, 70%, 80%, besonders bevorzugt mindestens 90% und am meisten bevorzugt mindestens 92, 94, 96, 98% aufweist.
6. Rekombinantes FER-Protein nach Ansprach 5, das aus Tomate stammt.
7. Verfahren zur Veränderung des Mineralstoffhaushalts, insbesondere zur Veränderung der Mineralstoffaufiiahme und zur Veränderung der Eisenaufiiahme in transgenen Pflanzen, umfassend die folgenden Schritte: a) Herstellung eines rekombinantes Nukleinsäuremoleküls nach Ansprach 3 oder 4, b) Übertragung des Nukleinsäuremoleküls aus a) auf transgene Pflanzen bzw. Pflanzenzellen; und c) ggf. Regeneration von Pflanzen aus den transformierten Pflanzenzellen.
8. Pflanzenzelle, enthaltend eine DNA-Sequenz nach Ansprach 1 oder 2 oder ein rekombinantes Nukleinsauremolekul nach Ansprach 3 oder 4, oder hergestellt nach Anspruch 7.
9. Transgene Pflanzenzelle nach Anspruch 8, die einen gegenüber Wildtypzellen erhöhten FER-Protein-Gehalt aufweist.
10. Transgene Pflanzenzelle nach Anspruch 8 oder 9, die eine gegenüber Wildtypzellen erhöhte Mineralstoffaufiiahme, insbesondere Eisenaufiiahme, aufweist.
11. Transgene Pflanze, enthaltend eine Pflanzenzelle nach einem der Ansprüche 8 bis 10 oder hergestellt nach einem Verfahren nach Ansprach 7, sowie Teile dieser Pflanzen, transgene Emteprodukte und transgenes Vermehrangsmaterial dieser Pflanzen, wie Protoplasten, Pflanzenzellen, Kalli, Samen, Knollen, Stecklinge, sowie die transgenen Nachkommen dieser Pflanzen.
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