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WO2003011330A1 - Vesicules membranaires de fluide biologique preleve in vivo, leur preparation et utilisation dans la stimulation d'une reponse immunitaire - Google Patents

Vesicules membranaires de fluide biologique preleve in vivo, leur preparation et utilisation dans la stimulation d'une reponse immunitaire Download PDF

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WO2003011330A1
WO2003011330A1 PCT/FR2002/002740 FR0202740W WO03011330A1 WO 2003011330 A1 WO2003011330 A1 WO 2003011330A1 FR 0202740 W FR0202740 W FR 0202740W WO 03011330 A1 WO03011330 A1 WO 03011330A1
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WO
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membrane vesicles
cells
tumor
lymphocytes
antigen presenting
Prior art date
Application number
PCT/FR2002/002740
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English (en)
Inventor
Laurence Zitvogel
Fabrice Andre
Eric Angevin
Original Assignee
Institut Gustave Roussy
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Filing date
Publication date
Application filed by Institut Gustave Roussy filed Critical Institut Gustave Roussy
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57488—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds identifable in body fluids
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    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection

Definitions

  • the present invention relates to a method for preparing a suspension of membrane vesicles isolated from a sample of a biological fluid sample, such as an ascites liquid, in a mammal, in particular in humans and use of these isolated membrane vesicles for charging in vitro or in vivo cells presenting antigens, in particular dendritic cells, antigens carried by said membrane vesicles and / or for the stimulation in vitro or in vivo of T lymphocytes, NK cells or NKT specific for antigens carried by said membrane vesicles.
  • a biological fluid sample such as an ascites liquid
  • the invention also includes the use of such isolated membrane vesicles, antigen presenting cells loaded by these vesicles or T lymphocytes, NK or NKT cells stimulated by said antigen presenting cells charged according to the invention for prevention or treatment cancers as well as to induce tolerance in a recipient of an allogeneic graft.
  • the present invention further comprises a method for diagnosing a tumor based on the presence and characterization of such membrane vesicles.
  • the cross presentation of antigens allows the presentation of an epitope from a peripheral cell to a T lymphocyte (also called T cell) via antigen presenting cells (APC).
  • CPA in particular dendritic cells (CD)
  • CD dendritic cells
  • tumor peptides characterized as being recognized by cytotoxic T lymphocytes (CTL) restricted to MHC class I.
  • CTL cytotoxic T lymphocytes
  • epitopes presented by tumor cells and those presented by antigen presenting cells such as, for example, dendritic cells, which are probably not the same;
  • exosomes secreted by tumor cells are vesicles of 60 to 90 nm containing in particular tumor antigens, molecules of class I and / or II of MHC and proteins of thermal shock (“Heat Shock Protein” or HSP).
  • Tex from cell lines tumor cells are thus sources of tumor antigens which have been used for the loading of antigen presenting cells in vitro or in vivo.
  • one of the drawbacks of the use of cell lines lies in the use of serum, the random nature of cell expansion and above all the fact that the lines, by the occurrence of spontaneous mutations, do not necessarily represent the antigenic repertoire. patient's tumor cells.
  • the use of cell lines to produce antigenic material does not exploit the potential contribution of a ligand which can promote the uptake and cross presentation of the antigen by the presenting cell.
  • antigen including the dendritic cell. Indeed, it has already been reported that proteins such as immunoglobulins allow the acquisition of antigenic material by the dendritic cell.
  • the ideal sensitization method for APCs in particular dendritic cells, would be that this method can be applied to any tumor with minimal risk of immunoselection, not to be restricted to a small number. of identified tumor antigens and in which the tumor antigens need not be known. Likewise, such a method should be able to use intact protein antigens rather than peptides, in order to allow the dendritic cell to prepare them and to present the appropriate combination of peptides in association with MHC class I and class II molecules. , and this for any individual.
  • the inventors have surprisingly demonstrated in the examples below that the purification of membrane vesicles carried out from samples taken from a mammal, in particular from humans, made it possible to obtain not only a greater quantity of these vesicles (approximately 20 times more at equal volume) but also a source of antigens having the advantages described above compared to membrane vesicles purified from cultures of human cell lines.
  • the process for preparing membrane vesicles carried out from samples taken from a mammal according to the invention described below is a rapid process which does not require prior cell cultures, often long and tedious, not always possible, and required for the preparation of purified membrane vesicles from cultures of human cell lines.
  • the inventors have indeed demonstrated that the membrane vesicles isolated directly from the biological fluid of a mammal, in particular human, containing cells capable of secreting such membrane vesicles, such as tumor cells, are more numerous and have properties. particularly advantageous immunogens compared to texosomes from cell lines as described for example in document WO 99/03499.
  • membrane vesicles correspond to an internal vesicle contained in an endosome of a living dividing cell and secreted by said cell following the fusion of the external membrane of said endosome with the cytoplasmic membrane of the cell from which it originates. Because of this formation mechanism, their original cell and their original functional characteristics and properties, these vesicles are designated in the following by the general term “membrane vesicle” or “exosome” and in particular by the term “ texosome "when the cell from which the membrane vesicle is derived is a tumor cell.
  • the present invention therefore relates to a process for the preparation of membrane vesicles, or of a suspension of membrane vesicles, said membrane vesicles being isolated from their natural environment, characterized in that it comprises the following steps: a) direct sampling vivo of a sample in a mammal, in particular in humans, said sample being a biological fluid, or a sample capable of releasing a biological fluid containing in suspension membrane vesicles and / or cells capable of producing such membrane vesicles by exocytosis; b) in vitro isolation of said membrane vesicles from said sample.
  • the present invention relates to a process for the in vitro preparation of membrane vesicles according to the invention, characterized in that said membrane vesicles isolated in step a) are membrane vesicles contained in suspension in said fluid biological and secreted in vivo.
  • membrane vesicles by certain types of mammalian cells is a phenomenon described in the prior art (such as by cells of the type reticulocyte, B lymphocytes, CPA, such as macrophages or dendritic cells, or even tumor cells).
  • These membrane vesicles are generally designated by the generic term "exosome” which reflects their mechanism of production by exocytosis of internal vesicles.
  • the physiological role of these vesicles has not been really established.
  • the structural characteristics, properties and functions of these vesicles are variable depending on the cell type from which they originate.
  • the membrane vesicle is at least separated from the cell from which it originates by a physical treatment of the sample of the biological fluid taken.
  • said membrane vesicle prepared by the method according to the invention is at least partially isolated and / or purified so as to obtain a composition or suspension enriched in membrane vesicles, devoid of intact cells and cellular debris.
  • the sampling of the biological fluid sample, or capable of releasing a biological fluid, containing in suspension membrane vesicles and / or cells capable of producing such membrane vesicles by exocytosis is an in vivo sampling fluid sample chosen from the following biological fluids: an abdominal fluid, a peritoneal fluid, a pleural fluid, an encephalo-cerebrospinal fluid (CSF), whole blood, plasma, serum or urine; or an in vivo sample of tissue or organ sample capable of releasing after ex vivo treatment of said sample taken (when it is in particular a solid tumor sample).
  • an abdominal fluid a peritoneal fluid, a pleural fluid, an encephalo-cerebrospinal fluid (CSF), whole blood, plasma, serum or urine
  • CSF encephalo-cerebrospinal fluid
  • whole blood plasma
  • serum or urine or an in vivo sample of tissue or organ sample capable of releasing after ex vivo treatment of said sample taken (when it is in particular a
  • the sample of the biological fluid sample containing in suspension membrane vesicles and / or cells capable of producing such membrane vesicles by exocytosis is a sample of fluid sample, or sample capable to release a fluid, chosen from exudative or transsudative fluids, in particular exudative or transsudative fluid taken from a cavity and resulting from an inflammatory reaction, a phenomenon of cancerization or a transplant.
  • said transudative fluid taken from a cavity may result from an inflammation caused by a pretreatment of the cavity comprising bringing this cavity into contact with a abrasive chemical agent (irritant), or by pretreatment by chemotherapy of said cavity, or by transfer of suicide genes, such as the gene coding for TK (Thymidine Kinase) using for example the Herpes Simplex virus (HSV).
  • a abrasive chemical agent irritant
  • suicide genes such as the gene coding for TK (Thymidine Kinase) using for example the Herpes Simplex virus (HSV).
  • exudative or “exudate” fluid, is meant here designating a fluid escaped from a tissue, such as a liquid of ascites, or from blood vessels containing cells and / or cellular debris, and which can be found in a tissue or its surface, and which usually results from an inflammation, a phenomenon of cancerization or a phenomenon of rejection following a transplant (fluid whose protein concentration is greater than 40 g / 1, and whose pressure equals osmotic or hyperosmotic pressure).
  • transsudative or “transsudate” fluid is meant here a fluid of plasma origin having passed through a membrane or a fluid extruded from a tissue in which such a fluid is accumulated (for example during edema) and which can also result from a vascular hyperpressure (fluid whose protein concentration is lower than 30 g / 1, and whose pressure is hypo-osmotic protein content ⁇ 30 g / 1).
  • the biological fluid is a fluid, or a sample capable of releasing a fluid, containing in suspension membrane vesicles secreted by tumor cells and / or tumor cells capable of producing membrane vesicles
  • the sample can be taken: - a sample of tumor ascites fluid or, in general, of an effusion of the tumor; or
  • this sample will for example be a sample of approximately 20 to 50 ml of blood from the main efferent vein of the tumor organ, taken before l surgical removal of the tumor if this should be done.
  • the drainage product of a tumor-carrying organ excised surgically and treated ex vivo by an isolated-perfused circuit can be obtained in the following way in the case of an organ having an afferent artery and an efferent vein:
  • the artery is characterized by a plastic tube connected to a proclive pocket containing physiological saline with possibly other agents; then
  • the organ is drained and the biological fluid comes out through another tubing catheterizing the vein, in declivity (for example in the case of kidney cancer, or of a cerebral glioblastoma).
  • the supernatant of a tumor explant dissociated in vitro can be obtained mechanical dissociation of the tumor generally leading to a single-cell suspension containing tumor cells, cells of the tumor stroma and cells of the immune system.
  • the biological fluid directly taken in vivo, or obtained from the sample taken in vivo can be frozen and then thawed before step b) of isolation of the membrane vesicles of the process according to the invention.
  • hematopoietic tumors such as leukemias, Hodgkin's and non-Hodgkin's malignant lymphomas;
  • tumor cells generally encompasses any cell originating from a tumor, for example a solid or liquid tumor. It is preferably a solid, ascites or hematopoietic tumor.
  • the sampling of the biological fluid sample is a sampling of ascites fluid sample.
  • fluid or liquid "ascites” is meant here a fluid that can be found for example in the abdominal, peritoneal or pleural cavity of a mammal and which usually results from an effusion resulting from inflammation, venous tumor or hypertension.
  • the sampling of the biological fluid sample is an in vivo sampling of the sample of tumor ascites fluid from a patient suffering from cancer.
  • the biological fluid sample taken in vivo, or obtained from the in vivo sample can be treated if necessary before step b) of isolation in in vitro of said membrane vesicles by one or more agents stimulating the production of membrane vesicles, in particular texosomes if they are membrane vesicles derived from tumor cells.
  • This treatment can include, for example, in the case of tumor fluids, the addition of steroid agents (for example dexamethasone which aims to increase cellular stress and the exocystosis of the texosomes outside the tumor cell) , pharmacological agents (for example cytotoxic agents such as taxanes, cisplatin, etc.), agents capable of increasing the quantity of multivesicular endosomes and / or irradiation of the sample.
  • steroid agents for example dexamethasone which aims to increase cellular stress and the exocystosis of the texosomes outside the tumor cell
  • pharmacological agents for example cytotoxic agents such as taxanes, cisplatin, etc.
  • irradiation it must be sufficient to cause the cytostatic action of the tumor cells contained in the sample taken.
  • the irradiation of the tumor cells must be done when the tumor cells are alive, that is to say:
  • An advantageous method for preparing texosomes according to the invention from the biological fluid sampled in vivo containing a suspension of tumor cells will comprise, after step a) of in vivo sampling of the sample, the following step:
  • - irradiation at an intensity sufficient to cause the cytostatic action of the tumor cells and not exceeding 15,000 rads, advantageously at approximately 10,000 rads, of the suspension of tumor cells; or - a treatment of the suspension of tumor cells, using steroids, for example dexamethasone, or cytotoxic agents, for example 5-fluorouracil (5 Fu) or cis-platinum, docetaxel, anthracycline, poison of the spindle, antipyrimide, or interleukin for example IL-10, IL-2, IL-15, GM-CSF; or
  • steroids for example dexamethasone
  • cytotoxic agents for example 5-fluorouracil (5 Fu) or cis-platinum, docetaxel, anthracycline, poison of the spindle, antipyrimide, or interleukin for example IL-10, IL-2, IL-15, GM-CSF; or
  • step a) of in vivo sampling of the sample the following step:
  • steroids for example dexamethasone
  • cytotoxic agents for example 5-fluorouracil (5-Fu) or cis-platinum, taxanes, or interleukin for example IL-10, IL -2, GM-CSF.
  • the invention also relates to the use of a texosome as defined above, or of an antigen presenting cell as defined above, or of a dexosome as defined above, for the preparation of a medicament intended for the treatment of tumors, in particular solid, ascitic and hematopoietic.
  • step b) of isolation of the membrane vesicles is carried out by centrifugation, electrophoresis, chromatography and / or nanofiltration, or by capture using beads coupled to antibodies directed specifically against proteins expressed on the external surface of these vesicles.
  • the isolation of the membrane vesicles in step b) of the process according to the present invention can be carried out according to different techniques for the separation of biological materials. These techniques are generally based on the differences in size, mass, charge, density or on the immunological properties (i.e. specific recognition of antibodies) of the membrane vesicles compared to the other elements contained in the biological fluid.
  • the technique of isolation by centrifugation of the biological fluid taken in vivo, or obtained from the sample taken in vivo is preferred. It may, for example, be a differential centrifugation and / or a density gradient centrifugation, followed by recovery of the fraction (s) containing said membrane vesicles.
  • This type of methodology is based on the separation, by successive centrifugations, of membrane vesicles on the one hand and cells, cellular debris, internal vesicles, etc. on the other.
  • the fraction comprising the membrane vesicles is generally that obtained after ultracentrifugation at 100,000 g. This method is illustrated in particular in the examples below.
  • the step of isolating the membrane vesicles can also be carried out by chromatography, electrophoresis and / or nanofiltration, or else by capture on beads coated with specific antibodies.
  • Fluid phase electrophoresis which allows the separation of biological materials according to their charge, is quite advantageous.
  • Example 11 page 58, of document WO 99/03499 showing that this technique can be used for the isolation of membrane vesicles with good yields. This technique is also particularly advantageous from an industrial point of view.
  • Nanofiltration can be carried out according to known techniques, from the biological fluid, preferably from a supernatant obtained after a first differential ultracentrifugation.
  • the invention also relates to a process for the preparation of membrane vesicles comprising at least in step b) of isolation of the process according to the invention a step of separation by electrophoresis, chromatography or nanofiltration. Such a process will therefore be more particularly suitable for the preparation of membrane vesicles meeting the qualitative standards required for therapeutic administration.
  • the membrane vesicles obtained in step b) of the method according to the invention can be stored frozen, preferably at a temperature less than or equal to -80 ° C., then thawed before use.
  • the present invention relates to membrane vesicles isolated from their natural environment capable of being obtained by the process according to the invention as described above, in particular in frozen form.
  • said membrane vesicles according to the present invention are characterized in that they mainly contain membrane vesicles with a diameter between 30 and 150 nm, preferably between 50 and 100 nm and between 60 and 90 nm.
  • said membrane vesicles according to the present invention are characterized in that the flotation of these vesicles is obtained for a density between 1.14 and 1.18 g / ml in sucrose gradient, in particular for the membrane vesicles derived tumor cells.
  • said membrane vesicles according to the present invention are characterized in that they carry molecules involved in the presentation of antigens, in particular MHC class I and / or II molecules, and / or chaperone molecules of HSP type and / or antigens, in particular tumor, and / or adhesion molecules capable of targeting CPA and / or molecules of tetraspane type associated with class I or II with MHC molecules of class I or IL.
  • antigens in particular MHC class I and / or II molecules
  • chaperone molecules of HSP type and / or antigens in particular tumor
  • adhesion molecules capable of targeting CPA and / or molecules of tetraspane type associated with class I or II with MHC molecules of class I or IL.
  • adhesion or targeting molecules mention may in particular be made of lactadherin isoforms and human immunoglobulins (in particular of the IgG type).
  • lactadherin isoforms lactadherin isoforms and human immunoglobulins (in particular of the IgG type).
  • human immunoglobulins in particular of the IgG type.
  • CD63 molecule a molecule involved in lymphocytic co-stimulation.
  • said membrane vesicles according to the present invention are characterized in that they do not carry the gp96 glycoprotein.
  • the subject of the invention relates to a membrane vesicle isolated from an in vivo sample from a mammal of a sample of biological fluid, in particular ascites, preferably tumor, or of a sample capable of releasing such a fluid, having the following characteristics:
  • lipid bilayer which surrounds a cytosolic fraction
  • MHC class I and / or class II molecules it has on its surface MHC class I and / or class II molecules, optionally loaded with antigenic peptides, especially tumor peptides, and / or adhesion molecules and / or lymphocytic co-stimulation molecules, and / or,
  • cytosolic fraction In its cytosolic fraction, it contains antigenic, in particular, tumor molecules, and / or immunomodulators and / or chemo-attractors and / or hormones and / or nucleic acids.
  • the membrane vesicle (texosome) of the invention consists of a texosome as isolated by a process of the invention defined above and having on its surface MHC class I and / or II molecules, possibly loaded with antigenic peptides and containing in its cytosolic fraction tumor antigenic molecules.
  • the membrane vesicles (texosomes) of the invention when it is a membrane vesicle originating from tumor cells, have MHC class I and / or II molecules loaded with antigenic peptides and / or express adhesion molecules and / or express lymphocytic co-stimulation molecules, but are devoid, in their cytosolic fraction, of tumor antigenic molecules and of immunomodulators and nucleic acids.
  • the texosomes of the invention are such that the MHC molecules of class I and / or II are "empty", that is to say not loaded with antigenic peptides and the texosomes comprise, in their fraction cytosolic, tumor antigenic molecules, immunomodulators and / or nucleic acids.
  • Texosomes having empty MHC molecules can be obtained by elution with acid at pH 2 to 4 from the texosomes in order to elute the peptides associated with MHC molecules.
  • the texosomes of the invention are such that the MHC class I and / or II molecules are loaded with antigenic peptides and / or express adhesion and / or targeting molecules, and / or molecules of lymphocytic co-stimulation and the texosomes contain in their cytosolic fraction tumor antigenic molecules, immunomodulators and / or nucleic acids.
  • adhesion and / or cell targeting molecules mention may in particular be made of CD 11b molecules, tetaspanes, the various isoforms of lactadherin or alternatively immunoglobulins, in particular of the IgG type, which associate with the Fc gamma receptors present.
  • tumor antigen molecules capable of being contained in the cytosolic fraction or antigenic peptides capable of loading the MHC molecules may be specific for the cancerous nature and the type of tissue of the cell from which said membrane vesicle originates.
  • the tumor antigen molecules presented on their surface by the texosomes or contained in their cytosol will generally come from proteins expressed selectively and / or abundantly by the tumor cells.
  • tumor antigenic molecules which may be contained in the cytosolic fraction or as antigenic peptides capable of loading MHC class I and / or II molecules, those originating from melanomas such as: MART- 1, tyrosinase, MAGE-1-12, P53 (expressed in different tumors) or Her2 / Neu, PSA, CEA or even PSMA.
  • melanomas such as: MART- 1, tyrosinase, MAGE-1-12, P53 (expressed in different tumors) or Her2 / Neu, PSA, CEA or even PSMA.
  • Other tumor antigens are cited for example in the article by Rosenberg et al. (Immunology Today, 18, 175, 1997) incorporated herein by reference.
  • lymphocyte co-stimulation molecules denotes, for example, molecules which give T lymphocytes signals complementary to those given during the interaction of MHC class I and II molecules - peptide with the T cell receptor.
  • CD63, CD80, CD86, ICAM, LFA, CD40, certain members of the TNF R family and adhesion or chemo attraction molecules allowing contact between the professional antigen presenting cell and the effector lymphocytes, or transport intracellular / specific localization ("trafficking / homing") of other cells at the vaccine or inflammatory site.
  • the immunomodulators which can be present in the cytosol of the texosomes are for example: TNF-, IL-1, 1TL-15 or a C-CR (chemokine).
  • the nucleic acids which may be present in the cytosol of the texosomes come from the tumor cell itself. These nucleic acids are found in the cytosol of texosomes as a direct result of their formation mechanism.
  • heterologous nucleic acids or proteins may be introduced into said texosomes, in particular by electroporation, by fusion with a synthetic liposome, by recombinant viras or by chemical method.
  • a test making it possible to verify that the texosomes according to the invention carry on their membrane functional class I and / or II molecules charged with tumor antigenic peptides consists of an antigenic presentation to T lymphocytes specific for the antigens of the tumor concerned (as for example example the proliferation tests of T clones specific for antigens and MHC class I restricted as described in the examples below or in Example 4 of document WO 99/03499). It is also possible to use a cytokine secretion test (IFN ⁇ , GM, CSF,
  • TNF ⁇ by the aforementioned T clones described in the examples below or in FIG. 3 of document WO 99/03499).
  • a test which makes it possible to verify that there is sensitization in vivo or in vitro of dendritic cells capable of activating T cells specific for the tumor is given in the examples below (proliferation test and / or secretion of cytokines by T clones specific for antigens, by the cross-priming method: texosomes of a MART-1 +, HLA-A2-loaded tumor on a MART-1-, HLA-A2 + dendritic cell, as described in the examples below or in FIG. 5 of document WO 99/03499).
  • an injection of 10 to 40 ⁇ g of texosomes isolated from ascitic tumor fluid is performed intradermally on the side homolateral to the tumor established for 3 to 10 days; the animal carrying the tumor is observed and the progressive disappearance of the tumor established in 7 to 10 days (in rodents of the mouse type).
  • the present invention comprises the use of membrane vesicles according to the invention for the loading and / or activation (stimulation) in vitro or in vivo of antigen presenting cells, in particular dendritic cells.
  • antigen presenting cells or CPA will be understood to mean very particularly macrophages, monocytes or dendritic cells. In the present invention, it will advantageously be dendritic cells.
  • said membrane vesicles and said antigen presenting cells are autologous or syngeneic.
  • autologous is meant to mean that the two compositions are from the same individual.
  • said membrane vesicles and said antigen presenting cells are allogenic.
  • the invention also relates to the use of membrane vesicles according to the invention for in vitro or in vivo stimulation, and, where appropriate, amplification (here equivalent to proliferation or expansion) or anergization in vitro or in vivo T cells, or for stimulation in vitro or in vivo, and, if necessary, the amplification of NK or NKT cells specific for antigens contained in said membrane vesicles.
  • said membrane vesicles and said NK or NKT cell T lymphocytes are autologous or syngeneic.
  • said membrane vesicles and said T lymphocytes, NK or NKT cells are allogenic.
  • the invention relates to the use of a membrane vesicle according to the invention, for the transfer of biological material into a cell in vitro or in vivo.
  • the present invention relates to a method of in vitro preparation of antigen presenting cells, in particular of dendritic cells, loaded with membrane vesicles, characterized in that it comprises the following stages: a) incubation in in vitro of antigen presenting cells in the presence of membrane vesicles according to the invention (step of raising awareness of CPA); and b) recovering said antigen-presenting cells loaded with membrane vesicles thus obtained.
  • Step a) of the process for the preparation in vitro of antigen-presenting cells, loaded with membrane vesicles, generally requires a prior step of preparation of the CPA, in particular of dendritic cells.
  • This preliminary step comprises, in the case of dendritic cells, the provision of a (de) culture (s) of dendritic cells. They can be cell cultures enriched in dendritic cells, or even cell cultures essentially comprising dendritic cells. Advantageously, these are human dendritic cells.
  • dendritic cells will also be understood to include here the dendritic cells of the plasmacytoid type (exhibiting the CDU c- / CD4 + phenotype).
  • these cells can be obtained from stem cells of the immune system or from monocyte precursors, or isolated directly in differentiated form (Review by Hart, Blood, 90, 3245, 1997).
  • Obtaining dendritic cells from stem cells is illustrated for example by Inaba et al. (J. Exp. Med., 176, 1693, 1992), Caux et al. (Nature 360, 258, 1992) or Bernhard et al. (Cancer Res., 55, 1099, 1995).
  • Obtaining dendritic cells from monocyte precursors is illustrated for example by Romani et al. (J. Exp. Med. 180, 83, 1994), Sallusto et al. (J. Exp. Med. 179, 1109, 1994), Inaba et al. (J. Exp. Med. 175, 1157, 1992) or Jansen et al. (J. Exp. Med. 170, 577, 1989). These methodologies are essentially based on the collection of mononuclear cells in the blood (PBL) and the culture in the presence of different combinations of cytokines.
  • One particular method consists in treating the monocyte precursors of the blood in the presence of combinations of cytokines such as IL-4 with GM-CSF, or else 1TL-13 with GM-CSF for example. This technique is also illustrated by Mayordomo et al., 1995.
  • Another approach for obtaining dendritic cells consists in isolating, from biological samples, already differentiated plasmacytoid dendritic cells called ppDC (for "plasmacytoid precursor dendritic cells"). ). This approach has been described for example by Hsu et al. (Nature Medicine 2, 52, 1996). The methodology described by this team essentially consists of collecting peripheral blood samples and treating them with different gradients and centrifugations so as to extract the dendritic cells from them.
  • the preferred methodology in the context of the present invention is based on the production of dendritic cells from monocyte or bone marrow precursors. These methodologies are illustrated in the examples below or in document WO 99/03499. More particularly, it is preferred to use, in the context of the present invention, dendritic cells obtained by treatment of monocyte precursors (contained in the peripheral blood or the marrow) in the presence of a GM-CSF + IL-4 or GM-CSF + combination. IL-13.
  • a population of dendritic cells comprising immature dendritic cells.
  • a population of dendritic cells is mainly composed (ie, at least 60%, of preferably 70%) of immature dendritic cells.
  • the immature state of dendritic cells corresponds to an early stage of their development, at which they exhibit strong endocytic activity and express low levels of MHC class I and II molecules and of lymphocytic co-stimulation molecules on their surface.
  • the prior step of the process of the invention can therefore advantageously comprise the preparation of a population of dendritic cells comprising immature dendritic cells, in particular from monocyte precursors, more particularly by treatment with a combination of cytokines such as GM - CSF + IL-4 or GM-CSF + IL-13.
  • immortalized dendritic cell populations can be immortalized dendritic cell lines. It can also be dendritic cells prepared and then immortalized in vitro.
  • the advantage of immortalized dendritic cells lies in the constitution of banks of cells sensitized to groups of given antigens, usable industrially and capable of being administered (or their dexosomes) to entire families of patients.
  • the dendritic cells When the dendritic cells are prepared, they can be maintained in culture, further purified, stored or used directly in the following stages of the process.
  • the antigen presenting cells in step a) of the process for the in vitro preparation of antigen presenting cells, loaded with membrane vesicles, according to the invention are dendritic cells, in particular immature, dendritic cells obtained from monocyte or bone marrow precursors, or dendritic cells from immortalized dendritic cells.
  • said membrane vesicles and the antigen presenting cells in step a) of the method are autologous or syngeneic.
  • said membrane vesicles and the antigen presenting cells in step a) of the method are allogenic.
  • Step a) of the process for the in vitro preparation of antigen presenting cells, loaded with membrane vesicles, and consisting in incubating in vitro the CPA in the presence of membrane vesicles according to the invention corresponds to the stage of sensitization (or even stimulation) of CPA.
  • the incubation of CPA, in particular dendritic cells, with the membrane vesicles according to the present invention and containing antigenic or antigenic peptides is particularly advantageous insofar as it does not require the knowledge of particular antigens and where the charged antigenic peptides are in a native conformation.
  • the contacting is carried out for a period of 30 min to 5 h, preferably 1 h 30 min to 2 h 30 min.
  • the CPA thus sensitized in particular the dendritic cells, are generally washed in medium without serum (0.9% NaCl) by centrifugation.
  • the present invention relates to a process for the in vitro preparation of membrane vesicles secreted by antigen presenting cells (here called “dexosomes”) loaded with membrane vesicles, characterized in that it comprises the following steps: a) the in vitro incubation of antigen presenting cells in the presence of membrane vesicles according to the invention; b) a step of differential centrifugation of membrane fractions of culture supernatants of the above-mentioned cells presenting antigens loaded with membrane vesicles according to the invention; and c) recovering the fraction containing said isolated dexosomes.
  • said dexosomes can be isolated according to the methods described for example in document WO 99/03499 for the preparation of dexosomes isolated from dendritic cells previously sensitized.
  • this preparation comprises an optional first step of processing CPA cells, followed by a second step of isolating the dexosomes.
  • the first step in processing CPA cells results from the fact that the production of dexosomes by CPA, in particular dendritic cells, is a regulated phenomenon.
  • This stimulating treatment can be carried out either by cell culture in the presence of certain cytokines, or by cell irradiation, or by lowering the pH of the culture, or by combining these different types of treatment.
  • the dendritic cells are incubated in the presence of a cytokine preferably chosen from interferon gamma (IFN ⁇ ), rinterleukin-10 (IL-10) and interleukin-12 (IL-12), preferably gamma interferon and IL-10.
  • a cytokine preferably chosen from interferon gamma (IFN ⁇ ), rinterleukin-10 (IL-10) and interleukin-12 (IL-12), preferably gamma interferon and IL-10.
  • the cytokines are used at doses adaptable by a person skilled in the art according to (i) the cytokine, (ii) the cell population and (iii) the possible implementation of other treatments. . It is understood that the cytokines are preferably used at sub-toxic doses.
  • Interleukin doses are generally between 1 and 100 ng / ml, preferably between 1 and 50 ng / ml.
  • Interferon can be used at doses of between
  • the dendritic cells are subjected to irradiation.
  • the irradiation is generally carried out between 1,000 and 5,000 rads, preferably between 2,000 and 4,000 rads, advantageously around 3,000 rads.
  • the second step involves the isolation of dexosomes.
  • the purpose of this step is to separate the dexosomes from the dendritic cells and / or from the culture medium.
  • This step in particular makes it possible to obtain a composition enriched in dexosomes and essentially devoid of intact cells.
  • the isolation of the dexosomes at this second stage can be carried out by following the methods applied to the isolation of the membrane vesicles as described above (differential gradient centrifugation, fluid electrophoresis, nanofiltration and / or immunocapture).
  • Dexosomes indeed have remarkable immunogenic properties since they are capable of stimulating the proliferation and activity of cytotoxic T lymphocytes, both in vitro and in vivo, and that they make it possible to suppress the growth of established tumors in vivo. , in a T cell dependent manner and restricted to the type of MHC (cf. document WO 99/03499).
  • the dexosomes therefore constitute active principles which are particularly suitable for non-cellular approaches to immunotherapy.
  • the method for preparing dexosomes according to the present invention results in a composition comprising at least 70% of dexosomes, preferably at least 85%.
  • the present invention also includes the antigen presenting cells loaded with membrane vesicles capable of being obtained by the method of in vitro preparation of antigen presenting cells according to the invention.
  • the present invention further relates to the isolated dexosomes obtained by the process for the in vitro preparation of membrane vesicles secreted by antigen presenting cells loaded with membrane vesicles according to the invention.
  • the present invention comprises a process for the in vitro preparation of T lymphocytes, activated (stimulated) NK or NKT cells, characterized in that it comprises the following stages: a) the in vitro incubation of T lymphocytes, NK or NKT cells in the presence of antigen presenting cells loaded with membrane vesicles according to the invention or isolated dexosomes, secreted by antigen presenting cells loaded with membrane vesicles according to the invention; and b) recovering said T lymphocytes, NK or NKT cells thus activated.
  • the present invention comprises a process for the in vitro preparation of anergic T lymphocytes, characterized in that it comprises the following steps: a) the in vitro incubation of T lymphocytes in the presence of antigen presenting cells loaded with membrane vesicles according to the invention or isolated dexosomes, secreted by antigen presenting cells loaded with membrane vesicles according to the invention; and b) recovering said T cells thus anergized.
  • the term “anergy” is intended to denote the failure of the T response which can also be observed when the T cells are brought into contact with the antigen presented by the CPA.
  • the antigen presenting cells and the T lymphocytes are autologous or syngeneic.
  • the present invention furthermore comprises the T lymphocytes, NK or NKT cells capable of being obtained by the method of in vitro preparation of T lymphocytes, NK or NKT cells according to the invention described above.
  • the present invention comprises the use of membrane vesicles, in particular texosomes, according to the invention, antigen presenting cells or dexosomes secreted by antigen presenting cells according to the invention, or lymphocytes T according to the invention, for the preparation of a pharmaceutical composition intended to be administered to a patient and to induce or increase an immune response of CTL type specific for antigens contained in said membrane vesicles according to the invention, and in which use, said membrane vesicles, antigen presenting cells and T lymphocytes are autologous or syngeneic of the patient to be treated.
  • the present invention comprises the use of membrane vesicles, in particular texosomes, according to the invention, antigen presenting cells or dexosomes secreted by antigen presenting cells, or cells NK or NKT according to the invention, for the preparation of a pharmaceutical composition intended to be administered to a patient and to induce or increase an innate response of NK or NKT type specific for antigens contained in said membrane vesicles according to the invention , and in which use, said membrane vesicles, antigen presenting cells and NK or NKT cells are autologous or syngeneic to the patient to be treated.
  • said pharmaceutical composition is intended for the prevention or treatment of patients suffering from cancer.
  • the present invention includes the use of antigen presenting cells, in particular dendritic cells, taken from a first patient (the recipient) or from a patient whose antigen presenting cells are syngeneic (having haplotypes common HLA) to the antigen presenting cells of the first patient, for the preparation of a pharmaceutical composition intended to be administered to this first patient, characterized in that the said antigen presenting cells were previously loaded in vitro with membrane vesicles according to the invention isolated from a biological fluid, in particular ascites, preferably tumor, taken from a second patient (the donor), said recipient and donor being allogenic.
  • the present invention comprises the use of T lymphocytes taken from a first patient (the recipient) or from a patient whose T lymphocytes are syngeneic to the T lymphocytes of the first patient for the preparation of a pharmaceutical composition intended for be administered to this first patient, characterized in that said T lymphocytes have been previously activated in vivo with antigen presenting cells previously loaded with membrane vesicles according to the invention, said membrane vesicles having been isolated from a fluid biological sample taken from a second patient (the donor), said recipient and donor being allogenic.
  • the present invention further relates to the use of antigen presenting cells, or their dexosomes, or of T lymphocytes according to the invention, for the preparation of a pharmaceutical composition intended to induce tolerance by said recipient of an allogenic graft. taken from said donor.
  • the present invention further relates to the use of antigen presenting cells, or their dexosomes, or of T lymphocytes according to the invention, for the preparation of a pharmaceutical composition intended to induce tolerance by said recipient of an allogenic graft.
  • sampled from said donor by the method called “adoptive transfer of dendritic cells from the recipient previously loaded in vitro with membrane vesicles from the donor” or by the method called “adoptive transfer of T lymphocytes from the recipient previously activated in vivo by CD of the recipient previously loaded (pulsed) with membrane vesicles from the donor ”.
  • the present invention comprises the use of membrane vesicles, antigen presenting cells or dexosomes according to the invention, for the ex vivo selection of a repertoire of T lymphocytes and / or cells
  • NK or NKT capable of recognizing specific antigens, glycolipids or phospholipids contained in said membrane vesicles according to the invention.
  • the invention also comprises a medicament comprising, as active substance, one or more membrane vesicles, cells presenting antigens or dexosomes, or also T lymphocytes, of NK or NKT cells according to the present invention, in combination with a pharmaceutically acceptable vehicle. , especially for the treatment of cancers.
  • the membrane vesicles, cells presenting antigens or dexosomes, or even T lymphocytes according to the present invention can be contained in physiological saline, in an ampoule or any other appropriate means (syringe, pocket, etc.). . They can be prepared immediately or stored, for example in frozen form at - 80 ° C.
  • the solutions used can be composed of saline solutions, optionally supplemented with stabilizing agents and / or adjuvants.
  • the stabilizing agents can in particular be proteins or molecules of high molecular weight. Mention may more particularly be made of proteins such as human serum albumin, or of molecules such as dextran or poloxamer for example.
  • An appropriate mode of administration of the drugs or pharmaceutical compositions according to the invention consists of injections, and in particular intradermal or subcutaneous injections.
  • This mode of administration is particularly suitable when the active substance of the medicament consists of CPAs, in particular dendritic cells, loaded with membrane vesicles according to the invention (in particular texosomes) or by dexosomes according to the invention.
  • the appropriate dosages are 0.01 to 10 ⁇ g / kg, and in particular 0.10 to 5 ⁇ g / kg, even more particularly 0.15 to 2 ⁇ g / kg of body weight, and 10 pg for vaccinations and 100 times less for intradermal reaction tests (HSR).
  • said medicament according to the present invention will also comprise a synthetic or natural immunostimulating adjuvant.
  • compositions of the invention can also comprise or be used in combination with one or more adjuvants.
  • the adjuvant may more particularly be any immunostimulating pharmacological agent, such as for example a cytokine (in particular interleukin-12). Such agents are conventionally used in clinical protocols or in vaccine compositions.
  • the adjuvant according to the invention can also be an agent capable of stimulating the production of dendritic cells in vivo.
  • the compound Flt3L ⁇ 4-IBBL By way of example, mention may be made of the compound Flt3L ⁇ 4-IBBL. The combined use of this type of agent makes it possible to increase the number of dendritic cells, and therefore potentially to improve the effectiveness of the compositions of the invention.
  • Another subject of the invention also relates to a combination of membrane vesicles and / or cells presenting antigens (or their dexosomes) and of an adjuvant, with a view to simultaneous, separate or spaced-over use.
  • the invention also relates to the creation of texosome banks according to the invention derived from tumor cells of common or different histological type.
  • texosomes may be composed of mixtures of texosomes made from in vivo samples from patients with a given type of cancer. These texosome banks can make it possible to sensitize antigen-presenting cells, in particular dendritic cells, against all tumors of this type.
  • the invention also relates to mixtures of texosomes or dexosomes according to the present invention, in particular as medicaments.
  • Mention may be made, for example, of mixtures of texosomes according to the invention for genetically linked tumors (breast and ovarian cancer) or having known p53, pl6 mutations (breast cancer, melanomas, glioblasms, sarcomas).
  • the present invention relates to the use of texosomes, or of CPA, in particular of dendritic cells according to the invention, for the manufacture a delayed hypersensitivity test for cancer, or as a diagnostic tool for researching the frequency of specific precursors CTL, NK or NKT (immunomonitoring).
  • APCs in particular the dendritic, autologous or allogenic cells preincubated with the texosomes of the invention, as targets for peripheral lymphocytes of subjects carrying the tumor, before, during and after anti-tumor treatment ( conventional treatment or specific active immunization).
  • the present invention relates to a method of in vitro diagnosis of cancer and / or its development in a patient, characterized in that the presence of specific markers for cancer and / or its cancer is determined. evolution on the surface and / or in the cytosol of membrane vesicles obtained from biological fluid taken in vivo from said patient.
  • said biological fluid is a fluid of ascites or effusion, in particular emanating from a cavity, such as a peritoneal, abdominal or pleural cavity.
  • the determination of the presence of markers of a cancer and / or of its evolution is carried out by an immunoenzymatic technique of the immunocapture type, by Western Blot or ELIS A using antibodies specific for these markers.
  • the membrane vesicles according to the present invention in particular those derived from ascites fluid, can thus not only be used as a source of natural tumor antigens leading to new therapeutic pathways (as mentioned above and also as a source of antigens for active prophylactic immunization after the second "look" in Figo IIIc or mesothelial ovarian cancer, passive transfer into the peritoneal cavity of award-winning T cells activated in situ as an adjuvant therapy against residual disease (see examples 5 and following)) but also as a new entity in human pathophysiology that can be used to monitor the status of the tumor (diagnosis and prognosis, chemoresistance and detoxification).
  • the present invention relates to a process for the in vivo preparation of a bank of texosomes derived from peritoneal ascites fluid, characterized in that it comprises the following step: a) implantation by intraperitoneal route d 'a human tumor, tissue or tumor cells in a SCID mouse, especially SCID / NOD.
  • the present invention relates to a process for the in vitro preparation of a bank of antibodies of murine origin directed against human antigens, in particular tumor antigens, characterized in that it comprises the following steps: a) intraperitoneal implantation of a tumor, tissue or human tumor cells in a SCID mouse, in particular SCID / NOD; b) the in vivo removal from the SCID mouse of a sample of peritoneal ascites fluid resulting from implantation and containing said bank of antibodies; and c) where appropriate, the purification of the antibodies contained in said sample.
  • the lymphocytes secreting such antibodies contained in the sample of peritoneal ascites fluid taken in vivo from the SCID mouse in step b) may be used to obtain cell lines or hybridomas by fusion with for example a tumor cell according to the well-known technique of Kohler and Milstein for the production of monoclonal antibodies.
  • the present invention relates to a process for the in vitro preparation of a library of isolated texosomes of murine and human origin, characterized in that it comprises the following steps: a) implantation by intraperitoneal route of a human tumor, tissue or tumor cells in a SCID mouse; b) in vivo removal from SCID mice of a sample of peritoneal ascites fluid resulting from implantation; and c) in vitro isolation of said texosomes from said sample taken by centrifugation, electrophoresis, chromatography, nanofiltration and / or by immunocapture, said texosomes preferably being texosomes contained in suspension in said biological fluid taken and secreted in vivo.
  • the present invention relates to a process for preparing texosomes modified in vitro, characterized in that it comprises the following steps: a) the in vitro isolation of membrane vesicles (texosomes) from a sample of tumor ascites fluid by a process of in vitro preparation of membrane vesicles isolated from their natural environment according to the invention; b) the elution, in particular acidic, of said natural texosomes obtained in step a); c) bringing said eluted natural texosomes into contact with peptides, in particular synthetic, glycolipids or phospholipids of interest, preferably exogenous which it is desired to load into the texosomes; and d) recovering said texosomes thus modified.
  • the present invention relates to the use of texosomes:
  • Figure 1 Peritoneal carcinosis secretes vesicles from 50 to 100 nm in ascites.
  • FIG. 1 represents vesicles purified from ascites of a patient carrying melanoma with peritoneal extension seen by electron microscopy.
  • Figures 2A to 2D The ascites vesicles contain class I molecules, heat shock 80 proteins and tumor antigens.
  • FIGS. 2A to 2C show immunoblots produced on samples of ascites vesicles (5 to 20 ⁇ l / well).
  • Figure 2A shows the presence of molecules of the major histocompatibility class I complex and heat shock proteins (HSP80) in the vesicles of patients with ovarian cancer or melanoma.
  • Figure 2B shows the absence of gp96 protein in ascites vesicles, unlike the cell lysate.
  • Figure 2C shows the presence of the Marti protein in the melanoma ascites vesicles.
  • Figure 2D shows the presence of the two dimerized lactadherin isoforms in the ascites vesicles.
  • Figures 3A and 3B The ascites vesicles carry a cross presentation of Marti tumor antigen.
  • Figure 3A shows the experimental mode. Ascites vesicles (10 to 20 ⁇ l) from an HLA-A2 patient carrying a melanoma with peritoneal extension were loaded onto 10 A2 + dendritic cells. These dendritic cells were cocultivated for 24 h with 10 cells of a CD8 + T clone specific to Marti and restricted for the haplotype A2 (LT11). The activation of the clone was evaluated on the secretion of interferon- ⁇ .
  • FIG. 3B shows the levels of interferon- ⁇ secreted by the LT11 clones after 24 h of coculture with the uncharged dendritic cells, loaded with vesicles from patients carrying ovarian carcinoma or melanoma.
  • the positive control was represented by dendritic cells loaded with exosomes from a Martl + melanoma cell line, HLA-A2- (Mel 888). The rates are the triplicate average.
  • Figure 4 Experimental mode of in vitro stimulation of lymphocytes. The experimental mode of in vitro stimulation is shown in Figure 4. Monocytes and lymphocytes were taken from peripheral blood, vesicles and tumor cells were isolated from ascites.
  • the dendritic cells were derived from monocytes in GM-CSF and IL-4.
  • the circulating lymphocytes were stimulated 3 times (D0, D7, D14) with dendritic cells loaded or not with 10 or 20 ⁇ l of ascites vesicles.
  • the cocultures were carried out in 96-well plates with a round bottom. The specificity of the lymphocytes was evaluated on their capacity to lyse the autologous tumor and to secrete interferon- ⁇ in the presence of tumor cells.
  • Figures 5A and 5B Lymphocytes induced by ascites vesicles specifically recognize tumor cells via an interaction mediated by MHC I molecules.
  • FIG. 5A represents the lysis of tumor cells and K562 cells by the lymphocytes of patient 1 after 3 stimulations by dendritic cells loaded with ascites vesicles. Lysis against autologous tumor cells was assessed in the presence of cold K562 cells. Values represent the average of three wells.
  • FIG. 5B represents the inhibition of the lysis of tumor cells by an anti-class I antibody (w632).
  • the lymphocytes stimulated three times by dendritic cells loaded with 10/20 ⁇ l of vesicles were cocultivated in the presence of tumor cells marked with chromium 51, in the presence of cold K562.
  • the tumor cells were preincubated with 100 ⁇ l of w632 antibody for 1 h.
  • Figure 6 The injection of ascites vesicles increases the survival of DBA2 mice carrying L 1210 leukemia.
  • the L1210 vesicles were purified from ascites from mice carrying L1210 leukemia with peritoneal extension. These vesicles were injected subcutaneously into mice carrying L1210 leukemia. Survival was assessed on D12 and D24. ** TM "8MWI! (in gray) Tex injection of non-tumor peritoneal fluid
  • Figures 7A to 7C Panel A: Phenotype of lymphocytes after 3 stimulations
  • Figure 7A lymphocytes stimulated in the presence of CD loaded with ascites exosomes (DC / ExAs).
  • Figure 7B Lymphocytes stimulated in the presence of CD loaded by autologous irradiated tumor cells.
  • FIGS. 8A to 8C The stimulated lymphocytes recognize the tumor cells via an interaction mediated by the molecules of MCH I: Example 2.
  • FIGS. 8A and B show the phenotypes of the lymphocytes after 3 stimulations with CD loaded (panel A) or not (panel B) with ascites vesicles.
  • FIG. 8C represents a test for the secretion of interferon- ⁇ by lymphocytes in the presence of autologous tumor cells. Two lymphocyte conditions were tested. The first condition was patient 3's lymphocytes stimulated three times with uncharged dendritic cells. The second condition was the lymphocytes of the
  • Examples 1 to 4 relate to the detection of membrane vesicles in ascites liquids from patients with peritoneal carcinosis and the use of these vesicles for the cross presentation of antigens.
  • Example 1 Material and methods A) Cell cultures
  • Dendritic cells are obtained from monocytes differentiated into GM-CSF (1000 IU / ml) and IL-4 (1000 IU / ml, Shering Plow). They are used on D7 for in vitro stimulation and cross presentation tests.
  • the tumor cells used for the cytotoxicity tests are obtained by centrifugation of ascites and cultured in RPMI1640 medium, 10% fetal calf serum, 50 IU / ml of penicillin, 50 ⁇ g / ml of streptomycin, 2 mM L-glutamine, 1 mM Na pyruvate.
  • the first steps consist in recovering the supernatant from centrifugations carried out at 1,200 rpm (10 min), 3,000 rpm (15 ') twice, 10,000 rpm (30').
  • the vesicles are recovered after an ultracentrifugation at 29,000 rpm for 1 h.
  • the vesicles are isolated on a cushion of D20 + sucrose at a density of 1.077 during an ultracentrifugation of 23,500 rpm (duration: 1 hour 15 minutes).
  • the vesicles are then collected in the cushion and concentrated using ultracentrifugation at 49,000 rpm for 1 h.
  • the vesicles are fixed in 4% paraformaldehyde.
  • the vesicles are spread on microscopy grids and visualized (cf. FIG. 1) (cf. also example 5C).
  • a migration is made on Novex gel.
  • the migrated proteins are then transferred to a nitrocellulose membrane.
  • the proteins are then hybridized with an anti-MHC class I antibody (HC10, Soldano Ferrone, NY, USA), anti HSC-80 (SPA 815, Stressgen), anti-gp96 (SPA850, Stressgen, anti Marti (clone Al 03, Novocastra) or anti-lactadherin (cf. example 2D)
  • the revelation is made using an antibody coupled to peroxidase (cf. FIGS. 2A to 2D).
  • the vesicles are purified from ascites from an HLA-A2 patient with peritoneal carcinosis of melanoma.
  • the vesicles are incubated with 10,000 HLA-A2 + dendritic cells (30 ⁇ l) for 2 h.
  • 10,000 LTl 1 (clone restricted by HLA-A2 and specific for Marti) are cocultivated with the dendritic cells for 24 h.
  • the supernatant is removed and an ELISA assay of interferon- ⁇ is then carried out in order to evaluate the activation of the clone (cf. FIGS. 3A and 3B)).
  • the vesicles (20 ⁇ l of a liquid of ascites concentrated 2,000 times)) are loaded onto the autologous dendritic cells (30,000 / well) in 30 ⁇ l of medium (RPMI1640, 10% human serum AB ', 50 U / ml of penicillin, 50 ⁇ g / ml of streptomycin, 2 mM L-glutamine, 1 mM Na pyruvate). After 2 h of incubation, the dendritic cells are cocultivated with circulating autologous lymphocytes in 96-well round bottom culture plates. The lymphocytes are cultured at 100,000 per well.
  • the cultures are made in the presence of interleukin 2 (proleukin, Chiron) at 50 IU / ml and stimulation factors T.
  • the lymphocytes are stimulated by the cells dendritics three times on D0, D7, D15 and are tested for their ability to lyse autologous tumor cells (cf. table 1, also for FIG. 5 A).
  • Negative stimulation controls include irradiated tumor cells (30,000 cells / well) or uncharged autologous dendritic cells.
  • autologous tumor cells or K562 cells are chromated for 1 h with Cr. The cells are washed three times and 2,000 cells are placed in conical bottom wells. The tumor cells are incubated with 50,000 or 100,000 unchromed K562 cells. Lysis is the result of the following equation: (number of strokes-min) / (MAX-min) where min is the number of strokes released into the supernatants of autologous tumor cells and MAX is the number of strokes of the incubated tumor cells with cetrimide (see Table 1, also for Figure 5 A).
  • EXAMPLE 2 Demonstration of Membrane Vesicles Containing Tumor Antigens in the Ascites of Patients with Peritoneal Carcinosis
  • the study by electron microscopy shows that the differential centrifugation of the ascites makes it possible to obtain membrane vesicles (cf. . figure 1).
  • Microscopy studies also show that these vesicles are between 30 and 150 nm and have a tendency to aggregate.
  • Biochemical analysis of the vesicles highlights the presence of molecules of MHC I (see Figure 2A), HSP 70, HSP 80 (see Figure 2 A) and lactadherin (see Figure 2D). In the patient with melanoma, the presence of a Marti tumor antigen has also been demonstrated (cf.
  • FIG. 3B shows that the vesicles purified from ascites from an HLA-A2 patient carrying a MARTI + melanoma loaded on HLA-A2 + dendritic cells activate the clone LT11 (HLA-A2 restricted and Marti specific). This means that the ascites vesicles are effectively picked up by dendritic cells and induce cross presentation of antigen. In contrast, CD-A2 + pulsed by the texosomes (Tex) of Marti ovarian cancer ascites, do not induce stimulation of LT1 1.
  • EXAMPLE 4 The Ascites Vesicles Loaded on Dendritic Cells Induce Cytotoxic T Lymphocytes Recognizing the Epitopes Presented by Autologous Tumor Cells
  • lymphocytes stimulated by autologous tumor cells are not able to lyse tumor cells.
  • Lymphocytes induced by vesicles lyse the autologous tumor cell, but not significantly K562 (cf. FIG. 5A).
  • lysis can be blocked by an anti-MHC class I antibody (cf. FIG. 5B).
  • the ascites vesicles can therefore be used for therapeutic purposes as an autologous or allogenic vaccine, but also as a method of loading dendritic cells for therapeutic purposes.
  • Table 1 Proliferation (or amplification) of CD3 / CD8 + cells and percentage of lysis against the autologous tumor obtained with dendritic cells loaded with the ascites vesicles, or with the autologous tumor cells.
  • FIG. 6 shows the prolonged survival of DBA2 mice vaccinated with ascites texosomes according to the invention against autologous leukemia compared to a placebo type control vaccine (injection of "Tex" of peritoneal fluid from pristanized mice) .
  • Examples 5 and following relate to the detection of membrane vesicles in pleural or peritoneal ascites liquids from patients carrying adenocarcinomas (cf. table 2), their characterization and their uses.
  • Example 5 Patients and methods A) Patients
  • the ascites are centrifuged at 1,200 rpm to remove the cells in suspension.
  • the supernatants are collected and centrifuged successively at 3,000 rpm for 30 min, 10,000 rpm for 30 min and 29,000 rpm for 1 h.
  • the pellet is recovered, resuspended in 30% in a gradient of 30% sucrose / D2O and ultracentrifuged at 23,500 rpm for 1 h 15 min to allow unwanted cellular debris to be pelletized then eliminated.
  • the exosomes are contained in the 30% sucrose / D2O cushion and this is verified by analysis by electron microscopy, then washed in PB S and concentrated using a last step of 1 h of ultracentrifugation at 40,000 rpm.
  • the exosome pellet is resuspended in PBS and stored stably at -80 °. A similar process is performed to purify exosomes from the supernatant of the autologous cell line.
  • exosomes obtained after differential centrifugations are fixed in 4% paraformaldehyde and stored at 4 ° C.
  • the exosomes are loaded onto “formvar-carbon” electron microscopy grids and labeled with an immunogold.
  • the contrast is obtained as described in Raposo et al. (1996) (see also Zitvogel et al., 1998 and
  • CD-MD dendritic cells derived from monocytes
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • the PBMCs are isolated by centrifugation on a density gradient using Ficoll-Hypaque and then seeded at a concentration of 3 to 5 ⁇ 10 cells / ml in an AIMV medium (Gibco-BRL, France) supplemented with
  • the whole of the lymphocytes is depilitated by a step of adhesion of 3 h at 37 ° C, followed by three steps of washing in a saline buffer.
  • the adherent cells are propagated in a complete AIMV medium containing 1000 IU / ml of
  • GM-CSF and IL-4 Recombinant human GM-CSF and IL-4 (Novartis (Schering Plow NJ, Kenilsworth, USA). The "bulk" of lymphocytes and dentritic cells is frozen on day 0 and on day 5 respectively. CD-MD are used on day 6, one day after thawing, for in vitro stimulation.
  • LT11 (V ⁇ 9) is a cell clone of CD8 + T cell restricted Mart-1 (27-35) - specific, HLA-A2 + - propagated as previously described (Dufour et al., J. Of
  • CD-MD HLA-AA2 + are seeded at a concentration of 2 10 4 cells / well for 2 h with exosomes purified from ascites of HLA-A2- melanoma patients or from supernatants of Mel888 HLA-A2 negative melanoma cell line.
  • 2 10 4 LT11 are added to the 2 10 4 CD-MD in a final volume of 200 ⁇ l in 96-well plates with rounded wells. The 24 h supernatant is tested in an ELISA IFN ⁇ test (Immunotech, Marseille, France).
  • the autologous PBLs peripheral blood lymphocytes
  • the alternative culture conditions and negative controls include stimulations with irradiated autologous tumor cells (10 / well) for patient 1, stimulations with non-pulsed CD cells in the other six patients.
  • stimulated lymphocytes are recovered, counted with trypan blue and phenotyped by a Facscan analysis using anti-CD4, anti-CD8, anti-CD56 monoclonal antibodies (Coulter, Fullerton, USA) and tested for salting out.
  • Lymphocytes stimulated in vitro weekly after three stages of incubation with an autologous CD cell pulsed or not with exosomes are used as effectors.
  • the autologous tumor cells after three to five passages are labeled with 100 ⁇ Ci of Cr for 60 min and then washed three times before their use.
  • K562 cold cells are added at a ratio of 50 cold cells to a hot target cell.
  • the W6.32 antibodies are incubated for 1 h with Cr-labeled tumor cells before coculture with the lymphocytes. Effector cells are added to the corresponding targets at different E: T cell ratios.
  • These vesicles are, for the most part, aggregated, of heterogeneous size (from 30 to 150 nm, predominantly between 50 and 100 nm in diameter, and can be labeled with an anti-tetraspannin CD63 antibody and with a monoclonal anti-MHC class I antibody. (cf. FIG. 2A). No significant contamination with similar debris was observed in these preparations (cf. FIG. 2B).
  • the images obtained by western blotting reveal the typical characteristics of the texosomes obtained from cultures of cell lines, in particular, a significant level of MHC class I molecules and of Hsp70 and 80 molecules compared with the lysates of autologous tumor cells collected from ascites fluids or from autologous tumor cells of cell line (cf. FIG.
  • texosomes purified from two melanoma ascites contain the complete native MARTI / MelanA tumor antigen (cf. Figure 2C).
  • the presence of the MARTI tumor antigen can be attached to exosomes and not to cellular debris since no gp96 glycoprotein can be detected in exosome preparations from ascites.
  • exosomes secreted from murine dendritic cells propagated ex vivo As previously described for exosomes secreted from murine dendritic cells propagated ex vivo (Srivastava, PK, Methods, 12 (2): 165-71), the two lactadherin isoforms are overexpressed in exosomes derived from ascites compared to lysates tumor cells (see Figure 2D).
  • the exosomes as opposed to the lysates of tumor cells extracted from primary autologous tumor cells, have levels of MHC class II molecules detectable by Western blots. This suggests the presence of exosomes derived from professional CPA (B cells, macrophages, CD) in the ascites of these two patients.
  • exosomes derived from melanoma cell lines contain the native MARTI antigen and HSP 70-80 which could be transferred to CDs to stimulate specific MARTI HLA-A2 restricted CTLs. Therefore, it was tested whether the exosomes purified from ascites of an HLA-A2- melanoma patient, when loaded onto CD-MDs allowed such CDs to trigger CTL HLA-A2 restricted clones specific MARTI. As shown in FIG. 2A, unlike exosomes derived from ovarian ascites, the exosomes purified from melanoma ascites contain significant amounts of MARTI protein for the two patients tested.
  • CD-MDs loaded with the exosomes of ascites extracted from a patient with an HLA-A2- melanoma, but not from a patient suffering from ovarian cancer induce the activation of CTL for example by the production of IFN-gamma (cf. FIG. 3B).
  • Table 3 summarizes the functional results obtained with blood lymphocytes stimulated 2 or 3 times with CD loaded or not with ascites vesicles. For patients 5, 6, 7, an arm was added testing the stimulation of lymphocytes by CD loaded with exosomes of autologous cell lines coming from a liquid volume identical to that of ascites vesicles.
  • Cytotoxicity is achieved with stimulated lymphocytes.
  • the results presented are obtained at effector / target ratios equivalent to 50: 1, in the presence of cold K562. Standard deviations are written in parentheses.
  • Interferon- ⁇ secretion tests are obtained by co-cultivating stimulated lymphocytes with or without autologous tumor cells for 24 h. The rates are expressed in pg / ml.
  • the tumor-specific interferon- ⁇ levels are obtained by subtracting the interferon- ⁇ levels secreted spontaneously by lymphocytes from the interferon- ⁇ levels secreted by lymphocytes in the presence of tumor cells.
  • "Tum Auto" for autologous tumor
  • ExAs for exosome derived from ascites
  • ExLi for exosome derived from cell lines.
  • lymphocytes stimulated with CD loaded with ExAs an increase in the frequency and "priming" of the CTL precursor was demonstrated.
  • the lymphocytes stimulated with CD loaded with ExAs are able to lyse autologous tumor cells and secrete riFN-gamma after 24 h of mixed lymphocyte / tumor coculture significantly, these results n 'not observed for lymphocytes stimulated with uncharged CD.
  • the exosomes have been described as being membrane vesicles of approximately 60 to 90 nm in diameter, originating from multivesicular endosomes released spontaneously into the extracellular microenvironment after fusion of the multivesicular body with the plasma membrane.
  • the membrane vesicles purified from tumor ascites typically resemble exosomes derived from the tumor cell line ex vivo for example by their heterogeneous size, in the form of red blood cells on a grid, and sometimes aggregated, marked strongly by anti-CD63 antibodies and antibodies anti-MHC class I by immuno-electron microscopy.
  • biophysical properties such as for example their flotation at a density of between 1.14 and 1.18 g / ml in sucrose gradient are a characteristic property of these exosomes derived from ascites, characteristics used for their purification process.
  • Biochemical studies reveal classic molecular markers such as those previously reported for exosomes purified from CD-MD and tumor cell cultures.
  • HSP 70 found in exosomes derived from ascites was previously described by the Srivastava team as being strongly immunogenic in vivo and as being constitutive chaperone molecules overexpressed in late endosomes and exosomes derived from murine CD (Thery, C. et al., J.
  • exosomes derived from tumor cell lines (Raposo, G. et al.).
  • the exosomes derived from ascites also present a significant quantity of the two isoforms of lactadine, a membrane-associated protein having an affinity for CPA ligands ( ⁇ V ⁇ 3 and ⁇ V ⁇ 5), isoforms which could target the exosomes towards their effector cells, dendritic cells (Thery, C. et al.).
  • exosomes In reticulocytes, the secretion of exosomes eliminates transferin receptors and acetylcholinesterases which are necessary for the differentiation function of red blood cells. Exosomes derived from B cells carry in abundance tetraspannin and MHC class II molecules, and selectively bind to follicular CD which do not neosynthesize MHC class II molecules in vivo, suggesting a possible function of these lymphocyte exosomes B in humoral immune responses (Denzer, K. et al., J. Immunol., 165 (3): 1259-65, 1 August 2000).
  • exosomes derived from ascites may be a new strategy for the ex vivo loading of CD allowing the cross presentation of MHC class I and II restricted antigens, particularly in tumor models for which candidate tumor rejection antigens are scarce. Indeed, despite promising results obtained by the first tests cancer treatment clinics (Nestlé, FO et al., Nat. Med., 4: 328-32, 1998; Murphy, GP et al, Prostate, 39: 54-9, 1999; Hsu, FJ et al., Nat . Med., 2 (l): 52-8, January 1996; Kugler, A. et al., Nat.
  • New concepts such as the fusion of CDs with suspensions of tumor cells (Gong, J. et al., J. Immunol., 165: 1705-11, 2000) or of CDs loaded with tumor lysates (Santin, AD, and al., Am. J. Obstet. Gynecol. 183: 601-9, 2000) or with peptides eluted with acid (Santin, AD et al, Obstet. Gynecol., 96: 422-30, 2000) are in waiting for the outcome of clinical trials.
  • exosomes isolated derived from biological fluids taken in vivo, in particular derived from ascites fluids, according to the present invention have many advantages compared to the texosomes isolated from cell lines described in particular in document WO 99/03499, as in particular: - they are secreted naturally and in larger quantities in vivo and can be easily purified in vitro; - The proliferation (or amplification, or expansion) of T cells induced by CD loaded by membrane vesicles according to the present invention, is at least equal to or if not greater than that induced by CD loaded by texosomes derived from cell lines; - The percentage of specific lysis obtained against autologous tumor cells by T cells stimulated (pulsed) by CD charged by the membrane vesicles according to the present invention, is generally much higher (2 to 5 times more) than that obtained for effector cells drawn from CD loaded with texosomes derived from cell lines (see Table 3); - the MHC molecules carried by the membrane vesicles according to the present
  • the greater immunogenic power of the membrane vesicles according to the present invention is particularly demonstrated for patient 6 (cf. table 3); - the membrane vesicles according to the present invention secrete a greater number of targeting molecules, in particular the isoforms of lactadherin or IgG, than the texosomes derived from cell lines; and
  • the membrane vesicles according to the present invention have an antigenic repertoire more representative of the repertoire of the initial population of cells of the fluid from which they originate than the texosomes originating from cell lines. It has thus already been demonstrated that the immune response of tumor-specific cytotoxic type, obtained using tumor cell lines did not fully reflect the anti-tumor activity exerted in vivo by the tumor (Dufour et al., J. of Immunol ., 158 (8), 3787-95, 1997).
  • the membrane vesicles according to the present invention in particular those isolated from ascites fluid, can therefore and advantageously be used for therapeutic or diagnostic purposes, in particular as an autologous or allogenic vaccine, but also as a loading method. dendritic cells for therapeutic purposes.

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Abstract

La présente invention concerne un procédé de préparation d'une suspension de vésicules membranaires isolées à partir d'un prélèvement d'un échantillon de fluide biologique, tel qu'un liquide d'ascite, chez un mammifère, notamment chez l'homme et l'utilisation de ces vésicules membranaires isolées pour charger in vitro ou in vivo des cellules présentatrices d'antigènes, notamment des cellules dendritiques, avec des antigènes portés par lesdites vésicules membranaires et/ou pour la stimulation in vitro ou in vivo de lymphocytes T, cellules NK ou NKT spécifiques d'antigènes portés par lesdites vésicules membranaires. L'invention comprend également l'utilisation de telles vésicules membranaires isolées, cellules présentatrices d'antigènes chargés par ces vésicules ou lymphocytes T, cellules NK ou NKT stimulées par lesdites cellules présentatrices d'antigènes chargés selon l'invention pour la prévention ou le traitement des cancers ainsi que pour induire la tolérance chez un receveur d'un greffon allogénique. La présente invention comprend en outre une méthode de diagnostic de tumeur basée sur la présence et la caractérisation de telles vésicules membranaires.

Description

VESICULES MEMBRANAIRES DE FLUIDE BIOLOGIQUE PRELEVE IN VIVO, LEUR PREPARATION ET UTILISATION DANS LA STIMULATION D'UNE REPONSE IMMUNITAIRE.
La présente invention concerne un procédé de préparation d'une suspension de vésicules membranaires isolées à partir d'un prélèvement d'un échantillon de fluide biologique, tel qu'un liquide d'ascite, chez un mammifère, notamment chez l'homme et l'utilisation de ces vésicules membranaires isolées pour charger in vitro ou in vivo des cellules présentatrices d'antigènes, notamment des cellules dendritiques, antigènes portés par lesdites vésicules membranaires et/ou pour la stimulation in vitro ou in vivo de lymphocytes T, cellules NK ou NKT spécifiques d'antigènes portés par lesdites vésicules membranaires. L'invention comprend également l'utilisation de telles vésicules membranaires isolées, cellules présentatrices d'antigènes chargés par ces vésicules ou lymphocytes T, cellules NK ou NKT stimulés par lesdites cellules présentatrices d'antigènes chargés selon l'invention pour la prévention ou le traitement des cancers ainsi que pour induire la tolérance chez un receveur d'un greffon allogénique. La présente invention comprend en outre une méthode de diagnostic de tumeur basée sur la présence et la caractérisation de telles vésicules membranaires.
La présentation croisée d'antigènes permet la présentation d'un épitope d'une cellule périphérique à un lymphocyte T (appelé encore cellule T) par l'intermédiaire de cellules présentatrices d'antigènes (CPA). Les CPA, notamment les cellules dendritiques (CD), mises en présence d'antigène, peuvent en effet in vitro ou in vivo acquérir et présenter des peptides dérivés de ces antigènes L'immunothérapie basée sur l'utilisation des CPA, notamment les CD, a pu montrer par exemple son efficacité dans le traitement de certaines tumeurs par des études réalisées chez la souris.
Parmi les méthodes de sensibilisation de cellules dendritiques à des antigènes d'intérêt qui sont mises en oeuvre actuellement, on peut citer celles qui utilisent des peptides antigéniques correspondant à des épitopes présentés en association avec les molécules du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) de classe I et identifiés par exemple dans les cellules tumorales grâce à des clones de CTLs spécifiques de la tumeur. On peut citer par exemple le document Mayordomo et al. (Nature Médecine,
Vol. 1, 12, 1297-1302, 1995), qui décrit la protection conférée à des souris contre des tumeurs létales après injection de CD dérivées de moelle osseuse préalablement
« puisées » avec des peptides tumoraux caractérisés comme étant reconnus par les lymphocytes T cytotoxiques (CTL) restreint au CMH de classe I.
On peut citer également le document Zitvogel et al. (Nature Médecine, Vol. 4, 5, 594-600, 1998) qui décrit la régression de tumeurs établies chez des souris par injection d'exosomes isolés de CD syngéniques préalablement chargées avec des peptides isolés de tumeur. Cependant, ces méthodes ne sont vraisemblablement pas optimales car :
- soit, elles ne tiennent pas compte des épitopes reconnus dans le contexte des molécules de classe II qui sont critiques pour la prolifération des lymphocytes T auxiliaires nécessaires à l'obtention des réponses cytotoxiques optimales ;
- soit, des épitopes présentés par les cellules tumorales et ceux présentés par les cellules présentatrices d'antigènes (comme par exemple les cellules dendritiques), qui ne sont probablement pas les mêmes ; et
- enfin, dans la majorité des tumeurs, des antigènes spécifiques n'ont pas été identifiés. En effet, des antigènes spécifiques de la tumeur sont seulement connus dans des cas de tumeurs induites par des virus (carcinome du col utérin), dans des cas de mélanome (antigènes du soi, antigènes mutés, antigènes de différentiation) ou dans un petit pourcentage de tumeurs du sein (oncogènes, ou produits de gènes suppresseurs de tumeur ayant subi des mutations). Ainsi, des peptides isolés dérivés d'antigènes tumoraux reconnus par les CTL sont seulement disponibles pour un nombre limité de tumeurs et souvent pour un petit pourcentage de patients ayant des molécules de classe I d'haplotype approprié.
Parmi les méthodes de sensibilisation de cellules dendritiques à des antigènes d'intérêt qui sont mises en oeuvre actuellement, on peut citer également celles qui utilisent des exosomes sécrétés par des cellules tumorales issues de culture de lignées cellulaires. Les exosomes sécrétés par les cellules tumorales (désignés ci-après « Tex » ou « texosomes ») sont des vésicules de 60 à 90 nm contenant en particulier des antigènes tumoraux, des molécules de classe I et/ou II du CMH et des protéines de choc thermiques (« Heat Shock Protein » ou HSP). Les Tex issus de lignées cellulaires tumorales sont ainsi des sources d'antigènes tumoraux qui ont été utilisés pour le chargement de cellules présentatrices d'antigènes in vitro ou in vivo.
Parmi les documents de l'art antérieur décrivant de telles sources d'antigènes et méthodes de chargement de cellules présentatrices d'antigènes à partir de ces sources issues de lignées cellulaires tumorales, on peut notamment citer :
- la demande de brevet internationale publiée sous le numéro WO 99/03499 qui décrit un procédé de préparation de texosomes isolés à partir de culture de lignées cellulaires tumorales et l'utilisation de ces texosomes pour charger des cellules dendritiques et obtenir des lymphocytes T dirigés spécifiquement contre des antigènes contenus dans les texosomes ; et
- le document Wolfers et al. (Nature Médecine, vol. 7, 3, 297-303, 2001) qui décrit la régression de tumeurs établies chez des souris par injection de cellules dendritiques syngéniques préalablement chargées avec des texosomes isolés à partir de culture de lignées cellulaires tumorales. Néanmoins, ces sources antigéniques lorsqu'elles proviennent de lignées cellulaires tumorales, nécessitent la culture dans du sérum de cellules tumorales généralement collectées à partir de fluides d'ascites tumoraux, culture difficile à réaliser et qui aboutit généralement à une population cellulaire hétérogène dont le répertoire antigénique n'est plus représentatif du répertoire de la population initiale de cellules tumorales issues du fluide d'ascite prélevé.
Ainsi, un des inconvénients de l'utilisation des lignées cellulaires réside dans l'utilisation de sérum, le caractère aléatoire de l'expansion cellulaire et surtout le fait que les lignées, par la survenue de mutations spontanées, ne représentent pas forcément le répertoire antigénique des cellules tumorales du patient. D'autre part, l'utilisation de lignées cellulaires pour produire du matériel antigénique (corps apoptotiques ou exosomes) n'exploite pas l'apport potentiel d'un ligand pouvant favoriser la captation et la présentation croisée de l'antigène par la cellule présentatrice d'antigène, notamment la cellule dendritique. En effet, il a déjà été rapporté que des protéines comme les immunoglobulines permettent l'acquisition de matériel antigénique par la cellule dendritique.
Enfin, il serait avantageux de pouvoir disposer de matériel antigénique en quantité plus importante que celle obtenue à partir de culture de lignées cellulaires. Il existe donc un réel besoin de pouvoir disposer de méthodes de sensibilisation de CPA avec de nouvelles sources quantitativement plus importantes d'antigènes tumoraux présentant l'avantage essentiel d'être à la fois représentatives du répertoire antigénique de la tumeur du patient et d'exploiter en outre la présence potentielle d'un ligand naturel permettant la captation de l'antigène par les CPA, notamment les cellules dendritiques, ceci afin d'augmenter l'efficacité de ces approches et d'élargir leurs applications, ainsi que d'élaborer de nouveaux moyens de vectorisation d'antigènes ou autres molécules.
Appliquée à l'immunothérapie antitumorale, la méthode de sensibilisation idéale des CPA, notamment des cellules dendritiques, serait que cette méthode puisse être appliquée à n'importe quelle tumeur avec un risque minimal d'immunosélection, ne devant pas être restreinte à un petit nombre d'antigènes tumoraux identifiés et dans laquelle il n'est pas nécessaire que les antigènes tumoraux soient connus. De même, une telle méthode devrait pouvoir utiliser des antigènes protéiques intacts plutôt que des peptides, afin de permettre à la cellule dendritique de les préparer et de présenter la combinaison adéquate de peptides en association avec les molécules du CMH de classe I et de classe II, et cela pour tout individu.
Ceci est justement l'objet de la présente invention.
Les inventeurs ont de manière surprenante mis en évidence dans les exemples ci- après que la purification de vésicules membranaires réalisée à partir de prélèvements effectués chez un mammifère, notamment chez l'homme, permettait d'obtenir non seulement une quantité plus importante de ces vésicules (environ 20 fois plus à volume égal) mais également une source d'antigènes présentant les avantages décrits ci-avant par rapport à des vésicules membranaires purifiées à partir de cultures de lignées cellulaires humaines.
De plus, le procédé de préparation de vésicules membranaires réalisée à partir de prélèvements effectués chez un mammifère selon l'invention ci-après décrite est un procédé rapide qui ne nécessite pas de cultures cellulaires préalable, souvent longues et fastidieuses, pas toujours possible, et requises pour la préparation de vésicules membranaires purifiées à partir de cultures de lignées cellulaires humaines. Les inventeurs ont effet mis en évidence que les vésicules membranaires isolées directement à partir de fluide biologique d'un mammifère, notamment humain, contenant des cellules capables de sécréter de telles vésicules membranaires, telles que les cellules tumorales, sont plus nombreuses et présentent des propriétés immunogènes particulièrement avantageuses par rapport aux texosomes issus de lignées cellulaires tels que décrits par exemple dans le document WO 99/03499.
Ces vésicules membranaires correspondent à une vésicule interne contenue dans un endosome d'une cellule vivante en division et sécrétée par ladite cellule suite à la fusion de la membrane externe dudit endosome avec la membrane cytoplasmique de la cellule dont il est issu. En raison de ce mécanisme de formation, de leur cellule d'origine et de leurs caractéristiques et propriétés fonctionnelles originales, ces vésicules sont désignées dans ce qui suit par le terme général « vésicule membranaire » ou « exosome » et en particulier par le terme "texosome" lorsque la cellule dont la vésicule membranaire est issue est une cellule tumorale. La présente invention a donc pour objet un procédé de préparation de vésicules membranaires, ou d'une suspension de vésicules membranaires, lesdites vésicules membranaires étant isolées de leur environnement naturel, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) le prélèvement in vivo d'un échantillon chez un mammifère, notamment chez l'homme, ledit échantillon étant un fluide biologique, ou un échantillon capable de libérer un fluide biologique contenant en suspension des vésicules membranaires et/ou des cellules capables de produire de telles vésicules membranaires par exocytose ; b) l'isolement in vitro desdites vésicules membranaires à partir dudit échantillon prélevé.
Sous un aspect particulièrement préféré, la présente invention a pour objet un procédé de préparation in vitro de vésicules membranaires selon l'invention, caractérisé en ce que lesdites vésicules membranaires isolées à l'étape a) sont des vésicules membranaires contenues en suspension dans ledit fluide biologique et sécrétées in vivo.
La sécrétion de vésicules membranaires par certains types de cellules de mammifère est un phénomène décrit dans l'art antérieur (tels que par les cellules de type réticulocyte, lymphocytes B, CPA, comme les macrophages ou les cellules dendritiques, ou encore les cellules tumorales). Ces vésicules membranaires sont généralement désignées par le terme générique "exosome" qui reflète leur mécanisme de production par exocytose de vésicules internes. Cependant, le rôle physiologique de ces vésicules n'a pas été vraiment établi. De plus, les caractéristiques structurales, les propriétés et les fonctions de ces vésicules sont variables selon le type cellulaire dont elles sont issues.
Par l'expression "isolée de son environnement naturel", on entend désigner ici que la vésicule membranaire est au moins séparée de la cellule dont elle est issue par un traitement physique de l'échantillon du fluide biologique prélevé. Généralement, ladite vésicule membranaire préparée par le procédé selon l'invention est au moins partiellement isolée et/ou purifiée de manière à obtenir une composition ou suspension enrichie en vésicules membranaires, dépourvue de cellules intactes et de débris cellulaires.
Selon un mode de réalisation avantageux, le prélèvement de l'échantillon de fluide biologique, ou capable de libérer un fluide biologique, contenant en suspension des vésicules membranaires et/ou des cellules capables de produire de telles vésicules membranaires par exocytose est un prélèvement in vivo d'échantillon de fluide choisi parmi les fluides biologiques suivants : un fluide abdominal, un fluide péritonéal, un fluide pleural, un fluide encéphalo-céphalorachidien (LCR), du sang total, du plasma, du sérum ou de l'urine ; ou un prélèvement in vivo d'échantillon de tissu ou d'organe capable de libérer après traitement ex vivo dudit échantillon prélevé (lorsqu'il s'agit en particulier d'échantillon de tumeur solide).
Selon un mode de réalisation avantageux, le prélèvement de l'échantillon de fluide biologique contenant en suspension des vésicules membranaires et/ou des cellules capables de produire de telles vésicules membranaires par exocytose est un prélèvement d'échantillon de fluide, ou d'échantillon capable de libérer un fluide, choisi parmi les fluides exsudatifs ou transsudatifs, notamment de fluide exsudatif ou transsudatif prélevé dans une cavité et résultant d'une réaction inflammatoire, d'un phénomène de cancérisation ou d'une transplantation. Selon un mode de réalisation particulier, ledit fluide transsudatif prélevé dans une cavité, notamment péritonéale, pourra résulter d'une inflammation provoquée par un pré-traitement de la cavité comprenant la mise en contact de cette cavité avec un agent chimique abrasif (irritant), ou encore par le pré-traitement par chimiothérapies de ladite cavité, ou encore par transfert de gènes suicides, comme le gène codant pour la TK (Thymidine Kinase) en utilisant par exemple le virus de l'Herpès Simplex (HSV).
Par fluide « exsudatif » ou « exsudât », on entend désigner ici un fluide échappé d'un tissu, comme un liquide d'ascite, ou de vaisseaux sanguins contenant des cellules et/ ou débris cellulaires, et que l'on peut trouver dans un tissu ou à sa surface, et qui résulte habituellement d'une inflammation, d'un phénomène de cancérisation ou d'un phénomène de rejet suite à une transplantation (fluide dont la concentration protéique est supérieure à 40 g/1, et dont la pression est égale à la pression osmotique ou hyperosmotique).
Par fluide « transsudatif » ou « transsudat », on entend désigner ici un fluide d'origine plasmatique ayant traversé une membrane ou un fluide extradé d'un tissu dans lequel est accumulé un tel fluide (par exemple lors d'un œdème) et qui peut résulter également d'une hyperpression vasculaire (fluide dont la concentration protéique est inférieure à 30 g/1, et dont la pression est hypo-osmotique contenu protéique < 30 g/1).
Lorsque le fluide biologique est un fluide, ou un échantillon capable de libérer un fluide, contenant en suspension des vésicules membranaires sécrétées par des cellules tumorales et/ou des cellules tumorales capables de produire des vésicules membranaires, le prélèvement de l'échantillon peut être : - un prélèvement du liquide d'ascite tumoral ou, en général, d'une effusion de la tumeur ; ou
- un prélèvement de sang efférent de la veine de l'organe tumoral ciblé ; ou
- le produit de drainage d'un organe porteur de tumeurs excisé chirurgicalement et traité ex vivo par circuit isolé perfusé pour le drainage de la tumeur qu'il porte, ou encore
- le surnageant d'un explant tumoral prélevé in vivo et dissocié mécaniquement in vitro.
Lorsqu'il s'agit d'un prélèvement de sang efférent de l'organe tumoral ciblé, ce prélèvement sera par exemple un échantillon d'environ 20 à 50 ml de sang de la veine principale efférente de l'organe tumoral, prélevé avant l'intervention d'ablation chirurgicale de la tumeur si cette ablation devait être réalisée. Le produit de drainage d'un organe porteur de tumeurs excisé chirurgicalement et traité ex vivo par circuit isolé-perfusé peut être obtenu de la façon suivante dans le cas d'organe présentant une artère afférente et une veine efférente :
- on caractérise l'artère par une tubulure plastique branchée à une poche proclive contenant du sérum physiologique avec éventuellement d'autres agents ; puis
- on draine l'organe et le fluide biologique ressort par une autre tubulure cathétérisant la veine, en déclive (par exemple dans le cas du cancer du rein, ou d'un glioblastome cérébral).
Le surnageant d'un explant tumoral dissocié in vitro peut être obtenu dissociation mécanique de la tumeur conduisant généralement à une suspension unicellulaire contenant des cellules tumorales, des cellules du stroma tumoral et des cellules du système immunitaire.
Dans un mode de réalisation particulier, le fluide biologique directement prélevé in vivo, ou obtenu à partir de l'échantillon prélevé in vivo pourra être congelé puis décongelé avant l'étape b) d'isolement des vésicules membranaires du procédé selon l'invention.
Parmi les fluides biologiques, ou échantillons capables de libérer un fluide biologique, contenant en suspension des vésicules membranaires sécrétées par des cellules tumorales et/ou des cellules tumorales capables de produire des vésicules membranaires, on peut citer notamment :
- les échantillons de tumeurs solides ou d'effusion de ces tumeurs telles que celles observées dans le cancer du rein, du sein, du côlon, du poumon, de l'estomac, du foie, les mélanomes, les sarcomes, etc. ;
- les échantillons de fluide biologique issu de tumeur hématopoïétique telle que les leucémies, les lymphomes malins hodgkiniens ou non hodgkiniens ;
- les échantillons de fluide d'ascite tumoral, de fluide pleural, de LCR ou d'urine.
Le terme "cellules tumorales" englobe de manière générale toute cellule provenant d'une tumeur, par exemple une tumeur solide ou liquide. Il s'agit de préférence d'une tumeur solide, ascitique ou hématopoïétique.
Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux, le prélèvement de l'échantillon de fluide biologique est un prélèvement d'échantillon de fluide d'ascite. Par fluide ou liquide « d'ascite », on entend désigner ici un fluide que l'on peut trouver par exemple dans la cavité abdominale, péritonéale ou pleurale d'un mammifère et qui résulte habituellement d'une effusion résultant d'une inflammation, d'une tumeur ou d'un hypertension veineuse. Selon un mode de réalisation encore plus particulièrement avantageux, le prélèvement de l'échantillon de fluide biologique est un prélèvement in vivo d'échantillon de fluide d'ascite tumoral de patient atteint d'un cancer.
Dans un mode particulier de mise en oeuvre du procédé de l'invention, l'échantillon de fluide biologique prélevé in vivo, ou obtenu à partir du prélèvement in vivo, peut être traité le cas échéant avant l'étape b) d'isolement in vitro desdites vésicules membranaires par un ou plusieurs agents stimulant la production de vésicules membranaires, notamment de texosomes s'il s'agit de vésicules membranaires dérivées de cellules tumorales. Ce traitement peut comprendre par exemple, lorsqu'il s'agit de fluides tumoraux, l'addition d'agents stéroïdes (dexaméthasone par exemple qui a pour but d'augmenter le stress cellulaire et l'exocystose des texosomes hors de la cellule tumorale), d'agents pharmacologiques (par exemple des agents cytotoxiques tels que taxanes, cisplatine, etc.), d'agents susceptibles d'augmenter la quantité d'endosomes multivésiculaires et/ou une irradiation de l'échantillon.
S 'agissant de l'irradiation, elle doit être suffisante pour provoquer l'action cytostatique des cellules tumorales contenues dans l'échantillon prélevé. L'irradiation des cellules tumorales doit être faite quand les cellules tumorales sont vivantes, c'est-à- dire :
- soit sur le fluide biologique contenant les cellules tumorales en suspension,
- soit sur l'organe excisé porteur de tumeur avant la perfusion, - soit sur la suspension cellulaire obtenue après dissociation mécanique de la tumeur ;
- mais, dans tous les cas, avant souffrance cellulaire tumorale pour cause d'hypoxie et/ou nécrose vasculaire et/ou déshydratation.
S 'agissant du traitement à l'aide de stéroïdes, il permet de provoquer une activation cellulaire conduisant à l'exocytose des texosomes.
S'agissant du traitement à l'aide d'agents pharmacologiques, il permet de : - modifier le cytosquelette et réarranger les compartiments intracellulaires pour dérégler les phénomènes d'internalisation et d'exocytose, ou
- dépolymériser les microtubules.
Un procédé avantageux de préparation de texosomes selon l'invention à partir du fluide biologique prélevé in vivo contenant une suspension de cellules tumorales comprendra après l'étape a) de prélèvement in vivo de l'échantillon l'étape suivante :
- une irradiation, à une intensité suffisante pour provoquer l'action cytostatique des cellules tumorales et ne dépassant pas 15.000 rads avantageusement à environ 10.000 rads, de la suspension de cellules tumorales ; ou - un traitement de la suspension de cellules tumorales, à l'aide de stéroïdes, par exemple de dexaméthasone, ou d'agents cytotoxiques, par exemple du 5-fluorouracile (5 Fu) ou cis-platine, docétaxel, anthracycline, poison du fuseau, antipyrimidique, ou d'interleukine par exemple IL- 10, IL-2, IL-15, GM-CSF ; ou
- un traitement avec un agent susceptible d'augmenter la quantité d'endosomes multivésiculaires, par exemple le nocodazole (Gruenberg et al., Journal of Cell Biology,
108:1301-1316, 1989) et donc d'augmenter la production de texosomes.
Un procédé également avantageux de préparation de texosomes selon l'invention :
- soit à partir d'un prélèvement de sérum physiologique drainant un organe excisé chirurgicalement et traité ex vivo par circuit isolé-perfusé pour le drainage de la tumeur qu'il porte, ou
- soit à partir du surnageant d'un explant tumoral dissocié in vitro comprendra après l'étape a) de prélèvement in vivo de l'échantillon l'étape suivante :
- un traitement à l'aide de stéroïdes, par exemple de dexaméthasone, ou d'agents cytotoxiques, par exemple du 5-fluorouracile (5-Fu) ou cis-platine, taxanes, ou d'interleukine par exemple IL- 10, IL-2, GM-CSF.
L'invention concerne également l'utilisation d'un texosome tel que défini ci- dessus, ou d'une cellule présentatrice d'antigène telle que définie ci-dessus, ou d'un dexosome tel que défini ci-dessus, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de tumeurs, notamment solides, ascitiques et hématopoïétiques.
Selon un mode de réalisation préféré, l'étape b) d'isolement des vésicules membranaires est effectuée par centrifugation, électrophorèse, chromatographie et/ou nanofiltration, ou encore par capture à l'aide de billes couplées à des anticorps dirigés spécifiquement contre des protéines exprimée à la surface externe de ces vésicules.
L'isolement des vésicules membranaires à l'étape b) du procédé selon la présente invention peut être réalisé selon différentes techniques de séparation de matériels biologiques. Ces techniques sont généralement basées sur les différences de taille, de masse, de charge, de densité ou sur les propriétés immunologiques (i.e. reconnaissance spécifique d'anticorps) des vésicules membranaires par rapport aux autres éléments contenus dans le fluide biologique.
Parmi ces techniques, on préfère la technique d'isolement par centrifugation du fluide biologique prélevé in vivo, ou obtenu à partir de l'échantillon prélevé in vivo. Il peut s'agir par exemple d'une centrifugation différentielle et/ou d'une centrifugation en gradient de densité, suivie(s) d'une récupération de la ou des fraction(s) contenant lesdites vésicules membranaires. Ce type de méthodologie repose sur la séparation, par centrifugations successives, des vésicules membranaires d'une part et des cellules, débris cellulaires, vésicules internes, etc., d'autre part. Dans ce mode particulier de mise en oeuvre, la fraction comprenant les vésicules membranaires est généralement celle obtenue après ultracentrifugation à 100.000 g. Cette méthode est illustrée notamment dans les exemples ci-après.
L'étape d'isolement des vésicules membranaires peut également être réalisée par chromatographie, électrophorèse et/ou nanofiltration, ou encore par capture sur billes revêtues d'anticorps spécifiques.
Il peut s'agir avantageusement d'une électrophorèse en phase fluide et/ou en gradient de densité, que l'on pourra, le cas échéant, réaliser sur le surnageant obtenu après une première ultracentrifugation différentielle du fluide biologique. L'électrophorèse en phase fluide, qui permet la séparation de matériels biologiques d'après leur charge, est tout à fait avantageuse. Pour cette technique, on pourra avantageusement se référer à l'exemple 11, page 58, du document WO 99/03499 montrant que cette technique peut être utilisée pour l'isolement de vésicules membranaires avec de bons rendements. Cette technique est par ailleurs particulièrement avantageuse sur le plan industriel.
Il peut également s'agir d'une purification par chromatographie. On peut citer notamment les chromatographies d'échanges d'ions, de perméation de gel (ou d'exclusion) ou la chromatographie hydrophobe. Compte tenu de la nature lipidique des vésicules membranaires, la chromatographie d'échanges d'ions est particulièrement intéressante. La nanofiltration peut être réalisée selon les techniques connues, à partir du fluide biologique, de préférence à partir d'un surnageant obtenu après une première ultracentrifugation différentielle.
Le recours à ces techniques de chromatographie et/ou d'électrophorèse et/ou de nanofiltration permet, notamment par rapport aux technologies courantes de centrifugation, une production de qualité améliorée, dans des quantités adaptées à un usage industriel (notamment pharmacologique). A cet égard, l'invention concerne également un procédé de préparation de vésicules membranaires comprenant au moins à l'étape b) d'isolement du procédé selon l'invention une étape de séparation par électrophorèse, chromatographie ou nanofiltration. Un tel procédé sera donc plus particulièrement adapté à la préparation de vésicules membranaires répondant aux normes qualitatives requises pour une administration thérapeutique.
Selon un mode de réalisation également avantageux, les vésicules membranaires obtenues à l'étape b) du procédé selon l'invention pourront être conservées congelées, de préférence à une température inférieure ou égale à - 80°C, puis décongelées avant utilisation. Sous un autre aspect, la présente invention est relative à des vésicules membranaires isolées de leur environnement naturel susceptibles d'être obtenues par le procédé selon l'invention tel que décrit ci-avant, notamment sous forme congelée.
De manière préférée, lesdites vésicules membranaires selon la présente invention sont caractérisées en ce qu'elles contiennent en majorité des vésicules membranaires de diamètre compris entre 30 et 150 nm, de préférence entre 50 et 100 nm et entre 60 et 90 nm.
De manière également préférée, lesdites vésicules membranaires selon la présente invention sont caractérisées en ce que la flottation de ces vésicules est obtenue pour une densité comprise entre 1,14 et 1,18 g/ml en gradient de sucrose, notamment pour les vésicules membranaires issues de cellules tumorales.
De manière plus préférée, lesdites vésicules membranaires selon la présente invention sont caractérisées en ce qu'elles portent des molécules impliquées dans la présentation d'antigènes, notamment des molécules du CMH de classe I et/ou II, et/ou des molécules chaperonnes de type HSP et/ou des antigènes, notamment tumoraux, et/ou des molécules d'adhésion capables de cibler les CPA et/ou des molécules de type tétraspane associées de classe I ou II aux molécules du CMH de classe I ou IL Parmi les molécules de type HSP, on peut citer notamment la HSP 70, la HSP 80 ou la HSP 90.
Parmi les molécules d'adhésion ou de ciblage, on peut citer notamment les isoformes de la lactadhérine et les immunoglobulines humaines (notamment de type IgG). Parmi les molécules de type tétraspane associées au CMH, on peut citer la molécule CD63, molécule intervenant dans la co-stimulation lymphocytaire.
De manière plus préférée, lesdites vésicules membranaires selon la présente invention sont caractérisées en ce qu'elles ne portent pas de glycoprotéine gp96.
De manière générale, l'objet de l'invention concerne une vésicule membranaire isolée d'un prélèvement in vivo chez un mammifère d'un échantillon de fluide biologique, notamment d'ascite, de préférence tumoral, ou d'un échantillon capable de libérer un tel fluide, ayant les caractéristiques suivantes :
- elle est débarrassée de son environnement naturel,
- elle comprend en surface une bicouche lipidique qui entoure une fraction cytosolique,
- elle présente sur sa surface des molécules du CMH de classe I et/ou de classe II, éventuellement chargées en peptides antigéniques, notamment tumoraux, et/ou des molécules d'adhésion et/ou des molécules de co-stimulation lymphocytaire, et/ou,
- elle contient dans sa fraction cytosolique des molécules antigéniques, notamment, tumorales, et/ou des immunomodulateurs et/ou chémo-attracteurs et/ou hormones et/ou des acides nucléiques.
De manière préférée, lorsqu'il s'agit de vésicule membranaire issue de cellules tumorales, la vésicule membranaire (texosome) de l'invention est constituée par un texosome tel qu'isolé par un procédé de l'invention défini ci-dessus et présentant sur sa surface des molécules du CMH de classe I et/ou II, éventuellement chargées en peptides antigéniques et contenant dans sa fraction cytosolique des molécules antigéniques tumorales. De manière également préférée, lorsqu'il s'agit de vésicule membranaire issue de cellules tumorales, les vésicules membranaires (texosomes) de l'invention présentent des molécules du CMH de classe I et/ou II chargées en peptides antigéniques et/ou expriment des molécules d'adhésion et/ou expriment des molécules de co-stimulation lymphocytaire, mais sont dépourvues, dans leur fraction cytosolique, de molécules antigéniques tumorales et d'immunomodulateurs et d'acides nucléiques.
De manière également préférée, les texosomes de l'invention sont tels que les molécules du CMH de classe I et/ou II sont "vides", c'est-à-dire non chargées de peptides antigéniques et les texosomes comprennent, dans leur fraction cytosolique, des molécules antigéniques tumorales, des immunomodulateurs et/ou des acides nucléiques. Des texosomes ayant des molécules du CMH vides peuvent être obtenues par élution à l'acide à pH 2 à 4 des texosomes afin d'éluer les peptides associés aux molécules du CMH.
De manière également préférée, les texosomes de l'invention sont tels que les molécules du CMH de classe I et/ou II sont chargées en peptides antigéniques et/ou expriment des molécules d'adhésion et/ou de ciblage, et/ou en molécules de co- stimulation lymphocytaire et les texosomes contiennent dans leur fraction cytosolique des molécules antigéniques tumorales, des immunomodulateurs et/ou des acides nucléiques. Parmi les molécules d'adhésion et/ou de ciblage cellulaire, on peut citer notamment les molécules CD 11b, les tétraspanes, les différentes isoformes de la lactadhérine ou encore des immunoglobulines, notamment de type IgG, qui s'associent aux récepteurs Fc gamma présents sur les cellules cibles, ou encore des récepteurs Fc gamma (Cassard et al., Immunol. Lett., 75 (1), 1-8, 2000). Bien entendu, ces molécules antigéniques tumorales susceptibles d'être contenues dans la fraction cytosolique ou peptides antigéniques susceptibles de charger les molécules du CMH pourront être spécifiques du caractère cancéreux et du type de tissu de la cellule dont est issue ladite vésicule membranaire. Les molécules antigéniques tumorales présentées à leur surface par les texosomes ou contenues dans leur cytosol proviendront en général de protéines exprimées de façon sélective et/ou abondante par les cellules tumorales. On peut citer, à titre d'exemple comme molécules antigéniques tumorales susceptibles d'être contenues dans la fraction cytosolique ou comme peptides antigéniques susceptibles de charger les molécules du CMH de classe I et/ou II, ceux provenant de mélanomes tels que : MART-1, tyrosinase, MAGE-1-12, P53 (exprimés dans différentes tumeurs) ou Her2/Neu, PSA, CEA ou encore PSMA. D'autres antigènes tumoraux sont cités par exemple dans l'article de Rosenberg et al. (Immunology Today, 18, 175, 1997) incorporé à la présente par référence.
Par molécules de co-stimulation lymphocytaire, on désigne par exemple des molécules qui donnent aux lymphocytes T des signaux complémentaires à ceux donnés lors de l'interaction des molécules du CMH de classe I et II - peptide avec le récepteur des cellules T.
On peut citer, à titre d'exemple :
- CD63, CD80, CD86, ICAM, LFA, CD40, certains membres de la famille TNF R et des molécules d'adhésion ou de chemo attraction (permettant le contact entre la cellule professionnelle présentatrice d'antigène et les lymphocytes effecteurs, ou le transport intracellulaire/localisation spécifique ("trafficking/homing") d'autres cellules au site vaccinal ou inflammatoire.
Les immunomodulateurs qui peuvent être présents dans le cytosol des texosomes sont par exemple : le TNF- , l'IL- 1, 1TL-15 ou une C-CR (chémokine). Les acides nucléiques susceptibles d'être présents dans le cytosol des texosomes proviennent de la cellule tumorale elle-même. Ces acides nucléiques se trouvent dans le cytosol des texosomes en conséquence directe de leur mécanisme de formation.
Dans un mode de réalisation particulier, des acides nucléiques ou protéines hétérologues pourront être introduits dans lesdits texosomes, notamment par électroporation, par fusion avec un liposome synthétique, par viras recombinant ou par méthode chimique.
Des caractéristiques plus particulières des texosomes de l'invention sont les suivantes :
- ce sont de petites vésicules membranaires de diamètre compris entre 30 et 150 nm, de préférence entre 50 et 100 nm et entre 60 et 90 nm sécrétées par les cellules tumorales, - ils contiennent des antigènes tumoraux, comme par exemple MART-1 dans le cas de cellules de mélanome,
- ils sont dépourvus de cellules mortes, et/ou débris cellulaires,
- ils sont dépourvus de contaminants tels que contaminants membranaires, réticulum endoplasmique, appareil de Golgi, mitochondries ou constituants de noyaux,
- ils portent à leur membrane des molécules de classe I et/ou II fonctionnelles chargées de peptides antigéniques tumoraux,
- ils peuvent stimuler in vitro la prolifération de lymphocytes T spécifiques,
- ils peuvent sensibiliser in vivo et in vitro des cellules dendritiques autologues capables ensuite d'activer des cellules T autologues spécifiques de la tumeur,
- ils portent des molécules d'adhésion de type lactadhérine,
- ils portent des molécules de type tétraspane CD63 associé au CMH de classe II,
- ils contiennent la protéine HSP70 et/ou HSP80, et
- ils sont dépourvus de la protéine gp96. Les techniques d'analyses permettant de vérifier que lesdites vésicules membranaires selon l'invention expriment ou n'expriment pas les marqueurs moléculaires attendus, tels que la présence d'HSP, CD63, molécules du CMH de classe I et/ou II, des antigènes spécifiques de tumeurs, ou encore la non présence de gp96, sont bien connus de l'homme de l'art et ne seront pas ici développés ici de manière exhaustive. On pourra par exemple se référer à la technique utilisant la microscopie électronique et l'immunoempreinte (technique de Western Blotting) à l'aide d'anticorps spécifiques de ces différents marqueurs telle que décrite dans les exemples ci-après ou dans les exemples 2 et 3 et à la figure 2 du document WO 99/03499.
Un test permettant de vérifier que les texosomes selon l'invention portent à leur membrane des molécules de classe I et/ou II fonctionnelles chargées de peptides antigéniques tumoraux consiste en une présentation antigénique à des lymphocytes T spécifiques des antigènes de la tumeur concernée (comme par exemple les tests de prolifération de clones T spécifiques d'antigènes et CMH classe I restreints tels que décrits dans les exemples ci-après ou à l'exemple 4 du document WO 99/03499). On peut également utiliser un test de sécrétion de cytokines (IFNγ, GM, CSF,
TNFα) par les clones T sus-cités décrits dans les exemples ci-après ou à la figure 3 du document WO 99/03499). Un test permettant de vérifier qu'il y a sensibilisation in vivo ou in vitro des cellules dendritiques capables d'activer des cellules T spécifiques de la tumeur est donné dans les exemples ci-après (test de prolifération et/ou sécrétion de cytokines par les clones T spécifiques d'antigènes, par la méthode de sensibilisation croisée ("cross- priming") : texosomes d'une tumeur MART-1+, HLA-A2-chargés sur une cellule dendritique MART-1-, HLA-A2+), tel que décrit dans les exemples ci-après ou à la figure 5 du document WO 99/03499).
Un test permettant de vérifier que les texosomes selon l'invention présentent la capacité, lorsqu'ils sont inoculés, notamment en intradermique, de faire régresser des tumeurs solides établies est donné à l'exemple 6 et aux figures 6A, 6B, et 7 du document WO 99/03499.
A titre d'exemple, on pratique une injection de 10 à 40 μg de texosomes isolés de fluide ascitique tumoral en intradermique du côté homolatéral à la tumeur établie depuis 3 à 10 jours ; on observe l'animal porteur de la tumeur et la disparition progressive de la tumeur établie en 7 à 10 jours (chez les rongeurs de type souris).
Sous un autre aspect, la présente invention comprend l'utilisation de vésicules membranaires selon l'invention pour le chargement et/ou l'activation (stimulation) in vitro ou in vivo de cellules présentatrices d'antigènes, notamment de cellules dendritiques. Par « cellules présentatrices d'antigènes » ou CPA, on entendra désigner tout particulièrement les macrophages, monocytes ou cellules dendritiques. II s'agira avantageusement dans la présente invention de cellules dendritiques.
De manière préférée, lesdites vésicules membranaires et lesdites cellules présentatrices d'antigènes sont autologues ou syngéniques. Par « autologue », on entend désigner que les deux compositions sont issues du même individu.
De manière également préférée, lesdites vésicules membranaires et lesdites cellules présentatrices d'antigènes sont allogéniques.
Par « allogénique », on entend désigner que les deux compositions sont issues d'individus présentant une variation génétique (en général, à l'intérieur d'une même espèce). L'invention concerne également l'utilisation de vésicules membranaires selon l'invention pour la stimulation in vitro ou in vivo, et, le cas échéant, l'amplification (équivalent ici à prolifération ou expansion) ou l'anergisation in vitro ou in vivo de lymphocytes T, ou encore pour la stimulation in vitro ou in vivo, et, le cas échéant, l'amplification de cellules NK ou NKT spécifiques d'antigènes contenus dans lesdites vésicules membranaires.
De manière préférée, lesdites vésicules membranaires et lesdits lymphocytes T cellules NK ou NKT sont autologues ou syngéniques.
De manière également préférée, lesdites vésicules membranaires et lesdits lymphocytes T, cellules NK ou NKT sont allogéniques.
Sous un autre aspect, l'invention concerne l'utilisation d'une vésicule membranaire selon l'invention, pour le transfert de matériel biologique dans une cellule in vitro ou in vivo.
Sous encore un autre aspect, la présente invention concerne un procédé de préparation in vitro de cellules présentatrices d'antigènes, notamment de cellules dendritiques, chargées en vésicules membranaires, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) l'incubation in vitro de cellules présentatrices d'antigènes en présence de vésicules membranaires selon l'invention (étape de sensibilisation des CPA) ; et b) la récupération desdites cellules présentatrices d'antigènes chargées en vésicules membranaires ainsi obtenues.
L'étape a) du procédé de préparation in vitro de cellules présentatrices d'antigènes, chargées en vésicules membranaires, nécessite en général une étape préalable de préparation des CPA, notamment de cellules dendritiques. Cette étape préalable comprend, lorsqu'il s'agit de cellules dendritiques, la mise à disposition d'une (de) culture(s) de cellules dendritiques. Il peut s'agir de cultures de cellules enrichies en cellules dendritiques, voire de cultures cellulaires comprenant essentiellement des cellules dendritiques. Avantageusement, il s'agit de cellules dendritiques humaines. Par cellules dendritiques, on entendra également inclure ici les cellules dendritiques de type plasmacytoïde (présentant le phénotype CDU c-/ CD4+).
La préparation de cellules dendritiques a été bien documentée dans la littérature.
Ainsi, il est connu que ces cellules peuvent être obtenues à partir de cellules souches du système immunitaire ou à partir de précurseurs monocytes, ou encore isolées directement sous forme différenciée (Revue par Hart, Blood, 90, 3245, 1997).
L'obtention de cellules dendritiques à partir de cellules souches est illustrée par exemple par Inaba et al. (J. Exp. Med., 176, 1693, 1992), Caux et al. (Nature 360, 258, 1992) ou Bernhard et al. (Cancer Res., 55, 1099, 1995).
L'obtention de cellules dendritiques à partir de précurseurs monocytes est illustrée par exemple par Romani et al. (J. Exp. Med. 180, 83, 1994), Sallusto et al. (J. Exp. Med. 179, 1109, 1994), Inaba et al. (J. Exp. Med. 175, 1157, 1992) ou encore Jansen et al. (J. Exp. Med. 170, 577, 1989). Ces méthodologies reposent essentiellement sur le prélèvement de cellules mononucléées dans le sang (PBL) et la mise en culture en présence de différentes combinaisons de cytokines. Une méthode particulière consiste à traiter les précurseurs monocytes du sang en présence de combinaisons de cytokines telles que l'IL-4 avec GM-CSF, ou encore 1TL-13 avec GM-CSF par exemple. Cette technique est également illustrée par Mayordomo et al., 1995. Une autre approche pour l'obtention de cellules dendritiques consiste à isoler, à partir d'échantillons biologiques, des cellules dendritiques plasmacytoïdes déjà différenciées appelées ppDC (pour « plasmacytoid precursor dendritic cells »). Cette approche a été décrite par exemple par Hsu et al. (Nature Médecine 2, 52, 1996). La méthodologie décrite par cette équipe consiste essentiellement à récolter des échantillons de sang périphérique et à les traiter par différents gradients et centrifugations de manière à en extraire les cellules dendritiques.
La méthodologie privilégiée dans le cadre de la présente invention repose sur la production de cellules dendritiques à partir de précurseurs monocytes ou de moelle osseuse. Ces méthodologies sont illustrées dans les exemples ci-après ou dans le document WO 99/03499. Plus particulièrement, on préfère utiliser dans le cadre de la présente invention des cellules dendritiques obtenues par traitement de précurseurs monocytes (contenus dans le sang périphérique ou la moelle) en présence d'une combinaison GM-CSF+IL-4 ou GM-CSF+IL-13.
Par ailleurs, pour la mise en oeuvre du procédé de la présente invention, il est tout particulièrement avantageux d'utiliser une population de cellules dendritiques comprenant des cellules dendritiques immatures. Avantageusement, on utilise une population de cellules dendritiques composée principalement (i.e., au moins 60 %, de préférence 70 %) de cellules dendritiques immatures. L'état immature des cellules dendritiques correspond à un stade précoce de leur développement, auquel elles présentent une forte activité endocytique et expriment des niveaux faibles de molécules de classe I et II du CMH et de molécules de co-stimulation lymphocytaire à leur surface. Ainsi, l'étape préalable du procédé de l'invention peut donc comprendre avantageusement la préparation d'une population de cellules dendritiques comprenant des cellules dendritiques immatures, notamment à partir de précurseurs monocytes, plus particulièrement par traitement avec une combinaison de cytokines telle que GM- CSF+IL-4 ou GM-CSF+IL-13. Par ailleurs, il est également possible d'utiliser dans le cadre de la présente invention des populations de cellules dendritiques immortalisées. Il peut s'agir de lignées de cellules dendritiques immortalisées. Il peut également s'agir de cellules dendritiques préparées puis immortalisées in vitro. L'intérêt de cellules dendritiques immortalisées réside dans la constitution de banques de cellules sensibilisées à des groupes d'antigènes donnés, utilisables industriellement et susceptibles d'être administrés (ou leurs dexosomes) à des familles entières de patients.
Lorsque les cellules dendritiques sont préparées, elles peuvent être maintenues en culture, purifiées davantage, stockées ou utilisées directement dans les étapes suivantes du procédé. Ainsi, selon un mode de réalisation préféré, les cellules présentatrices d'antigènes à l'étape a) du procédé de préparation in vitro de cellules présentatrices d'antigènes, chargées en vésicules membranaires, selon l'invention, sont des cellules dendritiques, notamment immatures, des cellules dendritiques obtenues à partir de précurseurs monocytes ou de moelle osseuse, ou encore des cellules dendritiques issues de cellules dendritiques immortalisées.
Selon un mode de réalisation également préféré, lesdites vésicules membranaires et les cellules présentatrices d'antigènes à l'étape a) du procédé sont autologues ou syngéniques.
Selon un mode de réalisation également préféré, lesdites vésicules membranaires et les cellules présentatrices d'antigènes à l'étape a) du procédé sont allogéniques.
L'étape a) du procédé de préparation in vitro de cellules présentatrices d'antigènes, chargées en vésicules membranaires, et consistant à incuber in vitro les CPA en présence de vésicules membranaires selon l'invention correspond à l'étape de sensibilisation (ou encore stimulation) des CPA.
L'incubation des CPA, notamment des cellules dendritiques, avec les vésicules membranaires selon la présente invention et contenant des antigènes ou peptides antigéniques (notamment les texosomes de cellules tumorales selon la présente invention) est particulièrement avantageuse dans la mesure où elle ne nécessite pas la connaissance des antigènes particuliers et où les peptides antigéniques chargés sont dans une conformation native.
Pour les conditions de mise en œuvre de cette étape d'incubation, on pourra se référer aux exemples ci-après ou aux exemples décrits dans le document WO 99/03499 pour l'étape d'incubation de cellules dendritiques en présence de texosomes obtenus à partir de cultures de lignées cellulaires tumorales. En général, la mise en contact est réalisée pendant une durée de 30 mn à 5 h, de préférence 1 h 30 mn à 2 h 30 mn.
Après l'étape a) de sensibilisation, les CPA ainsi sensibilisées, notamment les cellules dendritiques, sont en général lavées en milieu sans sérum (NaCl 0,9 %) par centrifugation.
Sous encore un autre aspect, la présente invention concerne un procédé de préparation in vitro de vésicules membranaires sécrétées par des cellules présentatrices d'antigènes (dénommées ici « dexosomes ») chargées en vésicules membranaires, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) l'incubation in vitro de cellules présentatrices d'antigènes en présence de vésicules membranaires selon l'invention ; b) une étape de centrifugation différentielle de fractions membranaires de surnageants de culture des susdites cellules présentatrices d'antigènes chargées en vésicules membranaires selon l'invention ; et c) la récupération de la fraction contenant lesdits dexosomes isolés.
Il a en effet déjà été démontré (cf. le document WO 99/03499) que les CPA, notamment les cellules dendritiques, produisent des vésicules membranaires et que ces vésicules constituent des vésicules immunogènes puissantes pour l'immunisation antitumorale. Ces vésicules sont particulièrement avantageuses puisqu'elles permettent d'éviter l'étape d'injection in vivo des cellules dendritiques entières dont elles proviennent. Préparation in vitro de vésicules membranaires sécrétées par des cellules présentatrices d'antigènes (dénommées ici « dexosomes ») chargées en vésicules membranaires selon l'invention.
Lorsque les populations de cellules dendritiques sont sensibilisées, lesdits dexosomes peuvent être isolés suivant les procédés décrits par exemple dans le document WO 99/03499 pour la préparation de dexosomes isolés de cellules dendritiques préalablement sensibilisés.
Brièvement, cette préparation comporte une première étape, facultative, de traitement des cellules CPA, suivie d'une seconde étape d'isolement des dexosomes. La première étape de traitement des cellules CPA résulte du fait que la production de dexosomes par les CPA, notamment les cellules dendritiques, est un phénomène régulé. Ainsi, en l'absence de traitement, les quantités de dexosomes produites sont relativement faibles, en particulier, lorsque l'on utilise une population de cellules dendritiques matures non préalablement stimulées. Ce traitement stimulant peut être réalisé soit par culture des cellules en présence de certaines cytokines, soit par irradiation des cellules, soit en diminuant le pH de la culture, soit en combinant ces différents types de traitement.
Par exemple, dans le premier mode de mise en oeuvre, les cellules dendritiques sont incubées en présence d'une cytokine choisie de préférence parmi l'interféron gamma (IFNγ), rinterleukine-10 (IL- 10) et l'interleukine-12 (IL- 12), de préférence l'interféron gamma et l'IL-10. Dans ce mode de mise en oeuvre, les cytokines sont utilisées à des doses adaptables par l'homme du métier en fonction (i) de la cytokine, (ii) de la population cellulaire et (iii) de la réalisation éventuelle d'autres traitements. Il est entendu que les cytokines sont préférentiellement utilisées à des doses sub-toxiques. Les doses d'interleukine sont généralement comprises entre 1 et 100 ng/ml, de préférence entre 1 et 50 ng/ml. L'interféron peut être mis en oeuvre à des doses comprises entre 1 et 1 000 Ul/ml, de préférence entre 100 et 1 000 Ul/ml.
Dans le second mode de mise en oeuvre, les cellules dendritiques sont soumises à une irradiation. L'irradiation est généralement effectuée entre 1 000 et 5 000 rads, de préférence entre 2 000 et 4 000 rads, avantageusement autour de 3 000 rads.
La seconde étape comprend l'isolement des dexosomes. Cette étape a pour but de séparer les dexosomes des cellules dendritiques et/ou du milieu de culture. Cette étape permet en particulier d'obtenir une composition enrichie en dexosomes et essentiellement dépourvue de cellules intactes. L'isolement des dexosomes à cette seconde étape peut être réalisé en suivant les méthodes appliquées à l'isolement des vésicules membranaires telles que décrites précédemment (centrifugation différentielle en gradient, électrophorèse fluidique, nanofiltration et/ou immunocapture).
Les dexosomes possèdent en effet des propriétés immunogènes remarquables puisqu'ils sont capables de stimuler la prolifération et l'activité de lymphocytes T cytotoxiques, à la fois in vitro et in vivo, et qu'ils permettent de supprimer in vivo la croissance de tumeurs établies, d'une manière dépendante des lymphocytes T et restreinte au type de MHC (cf. document WO 99/03499). Les dexosomes constituent donc des principes actifs particulièrement adaptés pour des approches non cellulaires d'immunothérapie.
Préférentiellement, le procédé de préparation de dexosomes selon la présente invention conduit à une composition comprenant 70 % au moins de dexosomes, de préférence 85 % au moins.
La présente invention comprend également les cellules présentatrices d'antigènes chargées en vésicules membranaires susceptibles d'être obtenues par le procédé de préparation in vitro de cellules présentatrices d'antigènes selon l'invention.
La présente invention concerne en outre les dexosomes isolés, obtenus par le procédé de préparation in vitro de vésicules membranaires sécrétées par des cellules présentatrices d'antigènes chargées en vésicules membranaires selon l'invention.
Sous encore un autre aspect, la présente invention comprend un procédé de préparation in vitro de lymphocytes T, cellules NK ou NKT activés (stimulés) caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) l'incubation in vitro de lymphocytes T, cellules NK ou NKT en présence de cellules présentatrices d'antigènes chargées en vésicules membranaires selon l'invention ou de dexosomes isolés, sécrétés par des cellules présentatrices d'antigènes chargées en vésicules membranaires selon l'invention ; et b) la récupération desdits lymphocytes T, cellules NK ou NKT ainsi activés. Dans un mode de réalisation particulier, la présente invention comprend un procédé de préparation in vitro de lymphocytes T anergiques, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) l'incubation in vitro de lymphocytes T en présence de cellules présentatrices d'antigènes chargées en vésicules membranaires selon l'invention ou de dexosomes isolés, sécrétés par des cellules présentatrices d'antigènes chargées en vésicules membranaires selon l'invention ; et b) la récupération desdits lymphocytes T ainsi anergisés.
Par anergie, on entend désigner la défaillance de la réponse T qui peut être également observée lorsque les cellules T sont mises en présence de l'antigène présenté par les CPA.
Selon un mode de réalisation préféré du procédé de préparation in vitro de lymphocytes T, cellules NK ou NKT selon l'invention ci-avant décrit, les cellules présentatrices d'antigènes et les lymphocytes T sont autologues ou syngéniques.
La présente invention comprend en outre les lymphocytes T, cellules NK ou NKT susceptibles d'être obtenus par le procédé de préparation in vitro de lymphocytes T, cellules NK ou NKT selon l'invention ci-avant décrit. Sous un autre aspect, la présente invention comprend l'utilisation de vésicules membranaires, notamment de texosomes, selon l'invention, de cellules présentatrices d'antigènes ou de dexosomes sécrétés par des cellules présentatrices d'antigènes selon l'invention, ou de lymphocytes T selon l'invention, pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à être administrée chez un patient et à induire ou à augmenter une réponse immune de type CTL spécifique d'antigènes contenus dans lesdites vésicules membranaires selon l'invention, et dans laquelle utilisation, lesdites vésicules membranaires, cellules présentatrices d'antigènes et lymphocytes T sont autologues ou syngéniques du patient à traiter.
Sous un autre aspect, la présente invention comprend l'utilisation de vésicules membranaires, notamment de texosomes, selon l'invention, de cellules présentatrices d'antigènes ou de dexosomes sécrétés par des cellules présentatrices d'antigènes selon l'invention, ou de cellules NK ou NKT selon l'invention, pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à être administrée chez un patient et à induire ou à augmenter une réponse innée de type NK ou NKT spécifique d'antigènes contenus dans lesdites vésicules membranaires selon l'invention, et dans laquelle utilisation, lesdites vésicules membranaires, cellules présentatrices d'antigènes et cellules NK ou NKT sont autologues ou syngéniques du patient à traiter. De préférence, ladite composition pharmaceutique est destinée à la prévention ou au traitement de patients atteints d'un cancer.
Sous un autre aspect, la présente invention comprend l'utilisation de cellules présentatrices d'antigènes, notamment de cellules dendritiques, prélevées chez un premier patient (le receveur) ou chez un patient dont ses cellules présentatrices d'antigènes sont syngéniques (ayant des haplotypes d'HLA communs) aux cellules présentatrices d'antigènes du premier patient, pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée a être administrée chez ce premier patient, caractérisée en ce que lesdites cellules présentatrices d'antigènes ont été préalablement chargées in vitro avec des vésicules membranaires selon l'invention isolées à partir d'un fluide biologique, notamment ascitique, de préférence tumoral, prélevé chez un deuxième patient (le donneur), ledit receveur et donneur étant allogéniques.
Sous un autre aspect, la présente invention comprend l'utilisation de lymphocytes T prélevées chez un premier patient (le receveur) ou chez un patient dont ses lymphocytes T sont syngéniques aux lymphocytes T du premier patient pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée a être administrée chez ce premier patient, caractérisée en ce que lesdits lymphocytes T ont été préalablement activés in vivo avec des cellules présentatrices d'antigènes préalablement chargées avec des vésicules membranaires selon l'invention, lesdites vésicules membranaires ayant été isolées à partir d'un fluide biologique prélevé chez un deuxième patient (le donneur), ledit receveur et donneur étant allogéniques.
La présente invention concerne en outre l'utilisation de cellules présentatrices d'antigènes, ou leurs dexosomes, ou de lymphocytes T selon l'invention, pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à induire la tolérance par ledit receveur d'un greffon allogénique prélevé chez ledit donneur.
La présente invention concerne en outre l'utilisation de cellules présentatrices d'antigènes, ou leurs dexosomes, ou de lymphocytes T selon l'invention, pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à induire la tolérance par ledit receveur d'un greffon allogénique prélevé chez ledit donneur par la méthode dite de « transfert adoptif de cellules dendritiques du receveur préalablement chargées in vitro par des vésicules membranaires du donneur » ou par la méthode dite de « transfert adoptif de lymphocytes T du receveur préalablement activés in vivo par des CD du receveur préalablement chargées (puisées) par des vésicules membranaires du donneur ».
Sous encore un autre aspect, la présente invention comprend l'utilisation de vésicules membranaires, de cellules présentatrices d'antigènes ou de dexosomes selon l'invention, pour la sélection ex vivo d'un répertoire de lymphocytes T et/ou de cellules
NK ou NKT, susceptibles de reconnaître des antigènes spécifiques, glycolipides ou phospholipides contenus dans lesdites vésicules membranaires selon l'invention.
L'invention comprend aussi un médicament comprenant à titre de substance active une ou plusieurs vésicules membranaires, cellules présentatrices d'antigènes ou dexosomes, ou encore des lymphocytes T, de cellules NK ou NKT selon la présente invention, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable, notamment pour le traitement des cancers.
Comme forme galénique appropriée, les vésicules membranaires, cellules présentatrices d'antigènes ou dexosomes, ou encore des lymphocytes T selon la présente invention peuvent être contenus dans du sérum physiologique, dans une ampoule ou tout autre moyen approprié (seringue, poche, etc.). Ils peuvent être préparés extemporanément ou stockés, par exemple sous forme congelée à - 80°C. Les solutions utilisées peuvent être composées de solutions salines, éventuellement supplémentées d'agents stabilisants et/ou d'adjuvants. Les agents stabilisants peuvent être notamment des protéines ou des molécules de haut poids moléculaire. On peut citer plus particulièrement des protéines telles que la sérum-albumine humaine, ou des molécules telles que le dextran ou le poloxamer par exemple.
Un mode d'administration approprié des médicaments ou compositions pharmaceutiques selon l'invention est constitué par des injections, et notamment des injections intradermiques ou sous-cutanées. Ce mode d'administration est particulièrement adapté lorsque la substance active du médicament est constituée par des CPA, notamment des cellules dendritiques, chargées en vésicules membranaires selon l'invention (notamment en texosomes) ou par des dexosomes selon l'invention.
Les posologies appropriées sont de 0,01 à 10 μg/kg, et notamment 0,10 à 5 μg/kg, encore plus particulièrement de 0,15 à 2 μg/kg de poids corporel, et de 10 pg pour les vaccinations et 100 fois moins pour les tests de réaction intradermiques (HSR). De manière préférée, ledit médicament selon la présente invention comprendra en outre un adjuvant immunostimulant synthétique ou naturel.
Les compositions de l'invention peuvent également comprendre ou être utilisées en association avec un ou plusieurs adjuvants. L'adjuvant peut être plus particulièrement tout agent pharmacologique immunostimulant, tel que par exemple une cytokine (notamment Pinterleukine-12). De tels agents sont classiquement utilisés dans les protocoles cliniques ou dans des compositions de vaccins. Par ailleurs, l'adjuvant selon l'invention peut également être un agent capable de stimuler la production de cellules dendritiques in vivo. On peut citer à titre d'exemple le composé Flt3L ± 4-IBBL. L'utilisation combinée de ce' type d'agent permet d'augmenter le nombre de cellules dendritiques, et donc d'améliorer potentiellement l'efficacité des compositions de l'invention.
Un autre objet de l'invention concerne aussi une association de vésicules membranaires et/ou cellules présentatrices d'antigènes (ou leurs dexosomes) et d'un adjuvant, en vue d'une utilisation simultanée, séparée ou espacée dans le temps.
L'invention concerne également la création de banques de texosomes selon l'invention dérivés de cellules tumorales de type histologique commun ou différent.
Celles-ci pourront être composées de mélanges de texosomes faits à partir de prélèvement in vivo chez des patients atteints d'un type de cancer donné. Ces banques de texosomes peuvent permettre de sensibiliser des cellules présentatrices d'antigènes, notamment des cellules dendritiques, contre toutes les tumeurs de ce type.
L'invention concerne également des mélanges de texosomes ou dexosomes selon la présente invention, notamment à titre de médicament.
On peut citer par exemple des mélanges de texosomes selon l'invention pour des tumeurs génétiquement reliées (cancer du sein et de l'ovaire) ou présentant des mutations p53, pl6 connues (cancer du sein, mélanomes, glioblasmes, sarcomes).
On peut également mentionner des mélanges de texosomes selon l'invention avec des vésicules membranaires provenant de cellules immortalisées et transfectées pour exprimer des molécules de co-stimulation, des molécules d'adhésion, des chemokines attractantes (différentes de celles exprimées sur les texosomes).
Sous un autre aspect, la présente invention concerne l'utilisation de texosomes, ou de CPA, notamment de cellules dendritiques selon l'invention, pour la fabrication d'un test d'hypersensibilité retardé du cancer, ou comme outil de diagnostic de recherche de fréquence de précurseurs spécifiques CTL, NK ou NKT (immunomonitoring) .
Il s'agit ici d'utiliser les CPA, notamment les cellules dendritiques, autologues ou allogéniques préincubées avec les texosomes de l'invention, comme cibles de lymphocytes périphériques de sujets porteurs de la tumeur, avant, pendant et après traitement anti-tumoral (traitement classique ou immunisation active spécifique).
Sous un autre aspect, la présente invention concerne un procédé de diagnostic in vitro d'un cancer et/ou de son évolution chez un patient, caractérisé en ce qu'on détermine la présence de marqueurs spécifiques d'un cancer et/ou de son évolution à la surface et/ou dans le cytosol de vésicules membranaires obtenues à partir de fluide biologique prélevé in vivo chez ledit patient.
De manière préférée, ledit fluide biologique est un fluide d'ascite ou une effusion, notamment émanant d'une cavité, telle qu'une cavité péritonéale, abdominale ou pleurale.
De manière préférée, la détermination de la présence de marqueurs d'un cancer et/ou de son évolution est réalisée par une technique immunoenzymatique de type immunocapture, par Western Blot ou ELIS A à l'aide d'anticorps spécifiques de ces marqueurs. Les vésicules membranaires selon la présente invention, notamment celles dérivées de fluide d'ascite, peuvent ainsi non seulement être utilisées comme une source d'antigènes tumoraux naturels conduisant à de nouvelles voies thérapeutiques (comme ci-avant citées et également comme source d'antigènes pour l'immunisation prophylactique active après le second « look » dans le cancer des ovaires Figo IIIc ou de mésothélium, transfert passif dans la cavité péritonéale de lymphocytes T primés activés in situ comme une thérapie adjuvante contre la maladie résiduelle (cf. exemples 5 et suivants)) mais également comme une nouvelle entité de la physiopathologie humaine qui peut être utilisée pour contrôler le statut de la tumeur (diagnostic et pronostic, chimiorésistance et détoxification). L'ensemble de ces utilisations est bien entendu compris dans la présente invention. Sous un autre aspect, la présente invention concerne un procédé de préparation in vivo d'une banque de texosomes dérivés de fluide d'ascite péritonéal, caractérisé en ce qu'il comprend l'étape suivante : a) l'implantation par voie intrapéritonéale d'une tumeur, tissu ou cellules tumorales humaines dans une souris SCID, notamment SCID/NOD.
Sous un autre aspect, la présente invention concerne un procédé de préparation in vitro d'une banque d'anticorps d'origine murine dirigés contre des antigènes humains, notamment tumoraux, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) l'implantation par voie intrapéritonéale d'une tumeur, tissu ou cellules tumorales humaines dans une souris SCID, notamment SCID/NOD ; b) le prélèvement in vivo chez la souris SCID d'un échantillon de fluide d'ascite péritonéal résultant de l'implantation et contenant ladite banque d'anticorps ; et c) le cas échéant, la purification des anticorps contenus dans ledit prélèvement.
Dans un mode de réalisation particulier, les lymphocytes sécrétant de tels anticorps contenus dans l'échantillon de fluide d'ascite péritonéal prélevé in vivo chez la souris SCID à l'étape b) pourront être utilisés pour obtenir des lignées cellulaires ou hybridomes par fusion avec par exemple une cellule tumorale selon la technique bien connue de Kohler et Milstein pour la production d'anticorps monoclonaux.
Sous un autre aspect, la présente invention concerne un procédé de préparation in vitro d'une banque de texosomes isolés d'origine murine et humaine, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) l'implantation par voie intrapéritonéale d'une tumeur, d'un tissu ou de cellules tumorales humaines dans une souris SCID ; b) le prélèvement in vivo chez la souris SCID d'un échantillon de fluide d'ascite péritonéal résultant de l'implantation ; et c) l'isolement in vitro desdits texosomes à partir dudit échantillon prélevé par centrifugation, électrophorèse, chromatographie, nanofiltration et/ou par immunocapture, lesdits texosomes étant de préférence des texosomes contenus en suspension dans ledit fluide biologique prélevé et sécrété in vivo. Sous un autre aspect, la présente invention concerne un procédé de préparation de texosomes modifiés in vitro, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) l'isolement in vitro de vésicules membranaires (texosomes) à partir d'un échantillon de fluide d'ascite tumoral par un procédé de préparation in vitro de vésicules membranaires isolées de leur environnement naturel selon l'invention ; b) l'élution, notamment acidique, desdits texosomes naturels obtenus à l'étape a) ; c) la mise en contact desdits texosomes naturels élues avec des peptides, notamment synthétiques, glycolipides ou phospholipides d'intérêt, de préférence exogène que l'on désire charger dans les texosomes ; et d) la récupération desdits texosomes ainsi modifiés.
Sous un dernier aspect, la présente invention concerne l'utilisation de texosomes :
- isolés de leur environnement naturel à partir d'un échantillon de fluide d'ascite tumoral par un procédé de préparation in vitro de vésicules membranaires selon l'invention ; ou
- obtenus par un procédé de préparation de texosomes isolés in vitro dérivés de fluide d'ascite péritonéal après implantation d'une tumeur, tissu ou cellules tumorales humaines dans une souris SCID selon l'invention ; ou encore
- obtenus par un procédé de préparation de texosomes modifiés in vitro selon l'invention, pour la préparation d'anticorps ou de banques d'anticorps dirigés contre des antigènes tumoraux contenus dans ou portés par lesdits texosomes.
La présente invention sera décrite plus en détails à l'aide des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.
LEGENDES DES FIGURES
Figure 1 : Les carcinoses péritonéales sécrètent des vésicules de 50 à 100 nm dans les ascites.
La figure 1 représente des vésicules purifiées à partir d'ascite d'un patient porteur de mélanome avec extension péritonéale vues en microscopie électronique. Figures 2A à 2D : Les vésicules d'ascite contiennent des molécules de classe I, des protéines du choc thermique 80 et des antigènes tumoraux. Les figures 2A à 2C présentent des immunoempreintes réalisées sur des échantillons de vésicules d'ascite (5 à 20 μl/puits). La figure 2 A montre la présence de molécules du complexe majeur d'histocompatibilité de classe I et de protéines du choc thermique (HSP80) dans des vésicules de patients porteurs de cancer de l'ovaire ou de mélanome. La figure 2B montre l'absence de protéine gp96 dans les vésicules d'ascite, à la différence du lysat cellulaire. La figure 2C montre la présence de la protéine Marti dans les vésicules d'ascite de mélanome.
La figure 2D montre la présence des deux isoformes de lactadhérine dimérisées dans les vésicules d'ascite. Figures 3A et 3B : Les vésicules d'ascite véhiculent une présentation croisée d'antigène de tumeur Marti .
La figure 3 A présente le mode expérimental. Des vésicules d'ascite (10 à 20 μl) de patient HLA-A2- porteur d'un mélanome avec extension péritonéale étaient chargées sur 10 cellules dendritiques A2+. Ces cellules dendritiques étaient cocultivées pendant 24 h avec 10 cellules d'un clone T CD8+ spécifique de Marti et restreint pour l'haplotype A2 (LT11). L'activation du clone était évaluée sur la sécrétion d'interféron-γ.
La figure 3B montre les taux d'interféron-γ sécrétés par les clones LT11 après 24 h de coculture avec les cellules dendritiques non chargées, chargées avec des vésicules de patients porteurs de carcinome ovarien ou de mélanome. Le contrôle positif était représenté par les cellules dendritiques chargées avec des exosomes issus d'une lignée cellulaire de mélanome Martl+, HLA-A2- (Mel 888). Les taux sont la moyenne de triplicate. Figure 4 : Mode expérimental des stimulations in vitro des lymphocytes. Le mode expérimental des stimulations in vitro est représenté sur la figure 4. Les monocytes et les lymphocytes étaient prélevés dans le sang périphérique, les vésicules et les cellules tumorales étaient isolées à partir de l'ascite. Les cellules dendritiques étaient dérivées des monocytes en GM-CSF et IL-4. Les lymphocytes circulant étaient stimulés 3 fois (J0, J7, J14) avec des cellules dendritiques chargées ou non avec 10 ou 20 μl de vésicules d'ascite. Les cocultures étaient réalisées en plaques de 96 puits à fond rond. La spécificité des lymphocytes était évaluée sur leur capacité à lyser la tumeur autologue et à sécréter de l'interféron-γ en présence de cellules tumorales. Figures 5A et 5B : Les lymphocytes induits par les vésicules d'ascite reconnaissent spécifiquement les cellules tumorales via une interaction médiée par les molécules du CMH I.
La figure 5A représente la lyse des cellules tumorales et des cellules K562 par les lymphocytes du patient 1 après 3 stimulations par des cellules dendritiques chargées avec des vésicules d'ascite. La lyse contre les cellules tumorales autologues était évaluée en présence de cellules K562 froides. Les valeurs représentent la moyenne de trois puits.
La figure 5B représente l'inhibition de la lyse des cellules tumorales par un anticorps anti-classe I (w632). Les lymphocytes stimulés trois fois par des cellules dendritiques chargées avec 10/20 μl de vésicules étaient cocultivés en présence de cellules tumorales marquées par du chrome 51, en présence de K562 froides. Les cellules tumorales étaient préincubées avec 100 μl d'anticorps w632 pendant 1 h. Figure 6 : L'injection de vésicules d'ascite augmente la survie des souris DBA2 porteuses de leucémie L 1210.
Les vésicules L1210 étaient purifiées à partir d'ascite de souris porteuses de leucémie L1210 avec extension péritonéale. Ces vésicules étaient injectées en sous- cutané à des souris porteuses de leucémie L1210. Les survies étaient évaluées à J12 et J24. **™«8MWI! (en gris) Injection de Tex de liquide péritonéal non tumoral
(souris pristanisées).
••""""""•» (en noir) Injection d'exosomes purifiés à partir d'ascites de L1210.
Figures 7A à 7C : Panel A : Phénotype des lymphocytes après 3 stimulations Figure 7A : lymphocytes stimulés en présence de CD chargées par des exosomes d'ascites (DC/ExAs).
Figure 7B : lymphocytes stimulés en présence de CD chargées par des cellules tumorales irradiées autologues.
Figure 7C : Test fonctionnel de lymphocytes stimulés 3 fois. Figures 8A à 8C : Les lymphocytes stimulés reconnaissent les cellules tumorales via une interaction médiée par les molécules du MCH I : Exemple 2. Les figures 8A et B montrent les phénotypes des lymphocytes après 3 stimulations avec des CD chargées (panel A) ou non (panel B) avec des vésicules d'ascite. La figure 8C représente un test de sécrétion d'interféron-γ par les lymphocytes en présence de cellules tumorales autologues. Deux conditions de lymphocytes étaient testées. La première condition était les lymphocytes du patient 3 stimulés trois fois avec des cellules dendritiques non chargées. La deuxième condition était les lymphocytes du
4 patient 3 stimulés par les cellules dendritiques chargées avec des vésicules d'ascite. 10 lymphocytes étaient cocultivés avec 10 cellules tumorales préincubées ou non 1 h avec de l'anticorps w632 (100 μl/ puits). Les valeurs représentent la moyenne de trois puits. Les écarts types sont représentés sous forme de barres.
EXEMPLES
Les exemples 1 à 4 concernent la mise en évidence de vésicules membranaires dans des liquides d'ascite de patients porteurs de carcinoses péritonéales et l'utilisation de ces vésicules pour la présentation croisée d'antigènes. Exemple 1 : Matériel et méthodes A) Cultures cellulaires
Les cellules dendritiques sont obtenues à partir de monocytes différenciés en GM-CSF (1 000 Ul/ml) et IL-4 (1 000 Ul/ml, Shering Plough). Elles sont utilisées à J7 pour les stimulations in vitro et les tests de présentation croisée.
Les cellules tumorales utilisées pour les tests de cytotoxicité sont obtenues par centrifugation de l'ascite et cultivées en milieu RPMI1640, 10 % sérum de veau foetal, 50 Ul/ml de pénicilline, 50 μg/ml de streptomycine, 2 mM L-glutamine, 1 mM Na pyruvate. B) Obtention de l'ascite et purification des vésicules d'ascite
L'ascite est prélevé sur des patients porteurs de carcinoses péritonéales diagnostiquées sur la présence de cellules tumorales dans le culot de centrifugation et une teneur en protéines supérieure à 30 g/1.
Les premières étapes consistent à récupérer le surnageant des centrifugations faites à 1 200 trs/min (10 min), 3 000 trs/min (15') à deux reprises, 10 000 trs/min (30'). Les vésicules sont récupérées après une ultracentrifugation à 29 000 trs/min pendant 1 h. Les vésicules sont isolées sur un coussin de D20 + sucrose à une densité de 1,077 au cours d'une ultracentrifugation de 23 500 trs/min (durée : 1 h 15). Les vésicules sont alors récupérées dans le coussin et concentrées grâce à une ultracentrifugation à 49 000 trs/min pendant 1 h.
L'ensemble de ce procédé permet d'obtenir ce qui sera appelé par la suite les vésicules d'ascite (ou texosomes selon l'invention).
C) Microscopie électronique
Les vésicules sont fixées en 4 % paraformaldéhyde. Les vésicules sont étalées sur des grilles de microscopie et visualisées (cf. figure 1) (cf. également l'exemple 5C).
D) Western blot Les vésicules sont réduites en DMSO 5 % et chauffées à 96°C pendant 10 mn.
Une migration est faite sur gel Novex. Les protéines migrées sont ensuite transférées sur une membrane de nitrocellulose. Les protéines sont alors hybridées avec un anticorps anti-MHC classe I (HC10, Soldano Ferrone, NY, USA), anti HSC-80 (SPA 815, Stressgen), anti-gp96 (SPA850, Stressgen, anti Marti (clone Al 03, Novocastra) ou anti- lactadhérine (cf. exemple 2D). La révélation est faite à l'aide d'un anticorps couplé à la péroxidase (cf. figures 2 A à 2D).
E) Tests de présentation croisée in vitro
Les vésicules sont purifiées à partir d'ascite d'un patient HLA-A2- porteur d'une carcinose péritonéale de mélanome. Les vésicules sont incubées avec 10 000 cellules dendritiques HLA-A2+ (30 μl) pendant 2 h. Après 2 h, 10 000 LTl 1 (clone restreint par HLA-A2 et spécifique de Marti) sont cocultivées avec les cellules dendritiques pendant 24 h. Le surnageant est prélevé et un dosage ELISA d'interféron-γ est alors réalisé afin d'évaluer l'activation du clone (cf. figures 3A et 3B)).
F) Tests de stimulation in vitro Les vésicules (20 μl d'un liquide d'ascite concentré 2 000 fois)) sont chargées sur les cellules dendritiques autologues (30 000 / puits) dans 30 μl de milieu (RPMI1640, 10 % sérum humain AB', 50 U/ml de pénicilline, 50 μg/ml de streptomycine, 2 mM L-glutamine, 1 mM Na pyruvate). Après 2 h d'incubation, les cellules dendritiques sont cocultivées avec des lymphocytes circulants autologues dans des plaques de cultures de 96 puits fond rond. Les lymphocytes sont cultivés à 100 000 par puits. Les cultures sont faites en présence d'interleukine 2 (proleukine, Chiron) à 50 Ul/ml et de facteurs de stimulation T. Les lymphocytes sont stimulés par les cellules dendritiques à trois reprises à J0, J7, J15 et sont testés pour leur aptitude à lyser les cellules tumorales autologues (cf. tableau 1, également pour figure 5 A).
Les contrôles négatifs des stimulations comprennent les cellules tumorales irradiées (30 000 cellules / puits) ou les cellules dendritiques autologues non chargées. Pour les cytotoxicités, les cellules tumorales autologues ou les cellules K562 sont chromées pendant 1 h avec du Cr. Les cellules sont lavées à trois reprises et 2 000 cellules sont platées dans des puits à fond conique. Les cellules tumorales sont incubées avec 50 000 ou 100 000 cellules K562 non chromées. La lyse est le résultat de l'équation suivante : (nombre de coups-min) / (MAX-min) ou min est le nombre de coups relargués dans les surnageants de cellules tumorales autologues et MAX est le nombre de coups des cellules tumorales incubées avec du cétrimide (cf. tableau 1, également pour figure 5 A).
Exemple 2 : Mise en évidence de vésicules membranaires contenant des antigènes de tumeur dans l'ascite de patients porteurs de carcinose péritonéale L'étude en microscopie électronique met en évidence que la centrifugation différentielle de l'ascite permet d'obtenir des vésicules membranaires (cf. figure 1). Les études de microscopie mettent également en évidence que ces vésicules mesurent entre 30 et 150 nm et ont une tendance à l'agrégation. L'analyse biochimique des vésicules met en évidence la présence de molécules du CMH I (cf. figure 2A), HSP 70, HSP 80 (cf. figure 2 A) et lactadhérine (cf. figure 2D). Chez le patient porteur de mélanome, il a également été mis en évidence la présence d'un antigène de tumeur Marti (cf. figure 2C). En revanche, les vésicules d'ascite ne contiennent pas de gρ96 (cf. figure 2B) ce qui signifie qu'il n'existe pas de contamination par des débris cellulaires. Exemple 3 : Les vésicules membranaires de type texosome induisent une présentation croisée d'antigène par les cellules dendritiques
La figure 3B montre que les vésicules purifiées à partir d'ascite de patient HLA- A2- porteur de mélanome MARTI + chargé sur des cellules dendritiques HLA-A2+ activent le clone LT11 (restreint HLA-A2 et spécifique de Marti). Ceci signifie que les vésicules d'ascite sont captées efficacement par les cellules dendritiques et induisent une présentation croisée d'antigène. Au contraire, les CD-A2+ puisées par les texosomes (Tex) des ascites de cancer ovarien Marti-, n'induisent pas de stimulation de LTl 1. Exemple 4 : Les vésicules d'ascite chargées sur des cellules dendritiques induisent des lymphocytes T cytotoxiques reconnaissant les épitopes présentés par les cellules tumorales autologues
Afin d'évaluer leur immunogénicité, les vésicules d'ascite d'une patiente porteuse d'un adénocarcinome ovarien ont été chargées sur des cellules dendritiques autologues, et une coculture avec les lymphocytes circulants a été réalisée (cf. figure 4). Le tableau 1 de résultats (cf. ci-après) met en évidence d'une part :
- la prolifération importante des lymphocytes obtenue en présence des cellules dendritiques autologues chargées par les vésicules d'ascite d'une patiente porteuse d'un adénocarcinome ovarien comparée à la coculture obtenue en présence de la tumeur autologue ; et d'autre part
- la lyse de la tumeur autologue par les lymphocytes stimulés par les cellules dendritiques chargées avec les vésicules d'ascites.
En revanche, les lymphocytes stimulés par les cellules tumorales autologues ne sont pas capables de lyser les cellules tumorales. Les lymphocytes induits par les vésicules lysent la cellule tumorale autologue, mais pas significativement K562 (cf. figure 5A). De plus, la lyse peut être bloquée par un anticorps anti-MHC classe I (cf. figure 5B). Ceci signifie que les cellules dendritiques chargées par des vésicules d'ascite ont induit des lymphocytes T cytotoxiques reconnaissant des épitopes présentés par les cellules tumorales autologues. Les vésicules d'ascite peuvent être de ce fait utilisées à des fins thérapeutiques comme vaccin autologue ou allogénique, mais aussi comme méthode de chargement des cellules dendritiques à visée thérapeutique.
Tableau 1 : Prolifération (ou amplification) des cellules CD3/CD8+ et pourcentage de lyse contre la tumeur autologue obtenus avec des cellules dendritiques chargées avec les vésicules d'ascite, ou avec les cellules tumorales autologues.
Figure imgf000039_0001
Rapport Effecteur / Cible (E:T): 50/1 ; PBL J21 : lymphocytes après trois stimulation in vitro ;*Lyse non spécifique inhibée par les cellules K562 non chromées (K562 froides).
La figure 6 met en évidence la survie prolongée de souris DBA2 vaccinées par des texosomes d'ascites selon l'invention contre la leucémie autologue par rapport à un vaccin de contrôle de type placebo (injection de "Tex" de liquide péritonéal de souris pristanisées).
Les exemples 5 et suivants concernent la mise en évidence de vésicules membranaires dans des liquides d'ascite pleuraux ou péritonéaux de patients porteurs d'adénocarcinomes (cf. tableau 2), leur caractérisation et leurs utilisations. Exemple 5 : Patients et méthodes A) Patients
Les patients présentant une carcinomatose péritonéale associée avec une ascitis ont été inclus dans la présente étude. La présence de cellules tumorales dans les ascites non hémorragiques était un critère de sélection des patients pour cette étude. Les caractéristiques cliniques des patients sont résumées dans le tableau 2 ci-après. La plupart étaient des femmes présentant un cancer des ovaires au stade IIIc Figo. Les ascites sont récupérées soit durant la première intervention (« debulking ») et observation par les chirurgiens ou dans le cas de l'apparition de symptômes associés aux ascites. Les patients étaient exclus de l'étude si a) ils reçoivent une chimiothérapie dans les quatre semaines avant la récupération des ascites ou si b) le taux de protéines dans les exsudats est inférieur à 30 g/1 ou si c) une hémorragie est associée à la carcinomatose. Les patients ont donné leur consentement éclairé suite à l'approbation par le conseil d'éthique de l'Institut Gustave-Roussy de ce protocole (Comité Consultatif pour la Protection des Personnes en Recherche Biomédical (CCPPRB)). Un patient (patient 5) présentant un cancer du poumon associé à une effusion pleurale maligne a également été inclus.
Tableau 2 : Caractéristiques des patients
Figure imgf000041_0001
B) Purification d'exosomes (vésicules membranaires ou ici texosomes)
Les ascites sont centrifugées à 1 200 trs/mn pour éliminer les cellules en suspension. Les surnageants sont récupérés et centrifugés successivement à 3 000 trs/mn durant 30 min, 10 000 trs/mn durant 30 min et 29 000 trs/mn durant 1 h. Suite à la dernière étape de centrifugation, le culot est récupéré, resuspendu dans 30 % dans un gradient de 30 % sucrose / D2O et ultracentrifugé à 23 500 trs/mn durant 1 h 15 min pour permettre aux débris cellulaires non désirés d'être culottés puis éliminés. Les exosomes sont contenus dans le coussin de 30 % sucrose / D2O et ceci est vérifié par une analyse en microscopie électronique puis lavé dans du PB S et concentré en utilisant une dernière étape de 1 h de ultracentrifugation à 40 000 rpm. Le culot d'exosomes est resuspendu dans du PBS et stocké de manière stable à - 80°. Un procédé similaire est réalisé pour purifier les exosomes du surnageant de la lignée cellulaire autologue.
C) Microscopie électronique
Les exosomes obtenus après les centrifugations différentielles sont fixés dans du paraformaldéhyde 4 % et stockés à 4°C. Les exosomes sont chargés sur des grilles de microscopie électronique « formvar-carbon » et marqués à l'immunogold. Le contraste est obtenu tel que décrit dans Raposo et al. (1996) (cf. également Zitvogel et al., 1998 et
Wolfers et al., 2001).
D) Analyse par Western blot Les protéines exosomales et de lysats cellulaires sont extraites telles que précédemment décrites puis analysées en Western blotting en utilisant un anticorps monoclonal dirigé contre le HLA humain de classe I (HC10, généreusement offert par Soldano Ferrone, Roswell Park Cancer Institute, NY, USA), un anticorps anti-HSP 70 (SPA 815, Stressgen, Canada), un anticorps anti-gp96 (SPA 850, Stressgen, Canada), et un anticorps anti-MHC de classe II ou un anticorps anti-Mart-1/MelanA (clone A103, Novocastra, Royaume Uni) aux dilutions recommandées par le fabriquant suivies par une révélation utilisant des anticorps secondaires couplés à la péroxidase de raifort et par une révélation à la chémoluminescence (Boehringer Mannheim, Penzberg, Germany). Des anticorps anti-lactadhérine sont produits par des lapins immunisés avec la lactadhérine humaine.
E) Cultures cellulaires a) Lignées tumorales primaires autologues et cellules tumorales Les cellules tumorales sont culottées par une centrifugation à 1 200 trs/mn des ascites puis cultivées dans du RPMI 1640 supplémenté avec 50 U/ml de pénicilline,
50 μg/ml de streptomycine, 2 mM L-glutamine, 1 mM de Na pyruvate (Gibco-BRL,
France) et 10 % de sérum de veau foetal décomplémenté (Seromed, France). Ces cellules sont caractérisées avant la congélation par May-Grunwald-Giemsa et une coloration avec un anticorps anti-cytokératine par les pathologistes sur cytospins. La plupart des tests de relargage de Cr sont réalisés en utilisant des cellules tumorales dérivées d'ascites autologues ayant subi trois à cinq passages. Après six passages, les lignées tumorales sont congelées pour un usage ultérieur. La lignée Mel888 est une lignée cellulaire de mélanome établie MARTI + et HLA-A2 négative qui a été généreusement offerte pas le Dr. Markus Maeurer, Université de Meinz (Germany). b) Cellules dendritiques et lymphocytes (MD-DC)
Les CD-MD (cellules dendritiques dérivées de monocytes) sont obtenues à partir de la fraction adhérente de cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC), ou à partir d'effusion de tumeur portée par les patients décrits dans le tableau 1 après leur consentement éclairé. Brièvement, les PBMC sont isolés par centrifugation sur un gradient de densité en utilisant du Ficoll-Hypaque puis ensemencés à une concentration de 3 à 5x10 cellules/ml dans un milieu AIMV (Gibco-BRL, France) supplémenté avec
50 U/ml de pénicilline, 50 μg/ml de streptomycine, 2 mM de L-glutamine, 1 mM de Na pyruvate (Gibco-BRL, France), 10 % de sérum de veau foetal décomplémenté
(Seromed, France). L'ensemble des lymphocytes est dépiété par une étape d'adhérence de 3 h à 37°C, suivie par trois étapes de lavage dans un tampon salin. Les cellules adhérentes sont propagées dans un milieu complet AIMV contenant 1 000 IU/ml de
GM-CSF recombinant humain et d'IL-4 (Novartis(Schering Plough NJ, Kenilsworth, USA). Le "bulk" de lymphocytes et de cellules dentritiques est congelé au jour 0 et au jour 5 respectivement. Les CD-MD sont utilisées au jour 6, un jour après la décongélation, pour des stimulations in vitro.
F) Tests in vitro de présentation croisée
LT11 (Vβ9) est un clone cellulaire de cellule T CD8+ restreint Mart- 1(27-35)- spécifique, HLA-A2+-propagé tel que précédemment décrit (Dufour et al., J. Of
Immunology, 158, 8, 3787-95, 1997) Au jour 6, les CD-MD HLA-AA2+ sont ensemencées à une concentration de 2 104 cellules/puits pendant 2 h avec des exosomes purifiés à partir d'ascites de patients de mélanome HLA-A2- ou à partir de surnageants de lignée cellulaire de mélanome Mel888 HLA-A2 négatif. 2 104 LT11 sont ajoutés aux 2 104 CD-MD dans un volume final de 200 μl dans des plaques de 96 puits ayant des puits arrondis. Le surnageant de 24 h est testé dans un test ELISA IFNγ (Immunotech, Marseille, France).
G) Stimulations de PBLs in vitro
Des microcultures in vitro mixtes sont réalisées dans des microplaques de 96 puits présentant des puits arrondis dans un milieu RPMI complet supplémenté avec 10 % de sérum humain AB poolé, 100 Ul/ml d'IL2 (Proleukine, Chiron), des facteurs de croissance des cellules T (Dufour et al., 1997). 3x10 cellules CD autologues sont puisées avec des exosomes autologues dérivés d'ascites ou des exosomes dérivés de cellules tumorales autologues pendant 2 h dans 50 μl. La quantité d'exosomes puisés dans les puits contenant les CD est équivalente à 30 ml d'effusion pleurale / péritonéale ou de surnageant de culture. Les PBL (lymphocytes de sang périphérique) autologues sont ensuite ajoutés à un ratio de trois lymphocytes pour une CD dans un volume final de 200 μl/puits. Trois stimulations in vitro hebdomadaires de PBL sont réalisées. Les conditions de culture alternative et des contrôles négatifs incluent des stimulations avec des cellules tumorales autologues irradiées (10 /puits) pour le patient 1, des stimulations avec des cellules CD non puisées chez les six autres patients. Au jour 21, des lymphocytes stimulés sont récupérés, comptés au bleu trypan et phénotypés par une analyse au Facscan en utilisant des anticorps anti-CD4, anti-CD8, anti-CD56 monoclonaux (Coulter, Fullerton, USA) et testés pour le relargage au Cr et pour des tests de sécrétion d'IFNγ contre les cellules tumorales autologues avec ou sans un anticorps W6.32 monoclonal ou des cellules tumorales sans rapport. H) Test de relargage de l'IFNγ
5x10 lymphocytes stimulés in vitro de manière hebdomadaire après trois étapes d'incubation avec des cellules autologues CD puisées ou non avec des exosomes sont incubés avec ou sans 10 cellules tumorales autologues. Pour vérifier la restriction du CMH de classe I sur la reconnaissance des tumeurs, l'anticorps W6.32 est incubé 1 h avec les cellules tumorales avant la coculture avec des lymphocytes. Des surnageants de 24 h sont testés par un test ELISA IFNγ (Immunotech, Marseille, France). Pour les tests IFNγ ELISPOT, les cellules sont cocultivées avec un anticorps monoclonal anti-IFNγ présent à la surface des microplaques 96 puits. Après 24 h les plaques sont lavées et un anticorps secondaire est ajouté. Les spots sont comptés en utilisant un lecteur automatique ELISPOT (Bioreader 2000, Biosys). I) Test de cytotoxicité
Des lymphocytes stimulés in vitro de manière hebdomadaire après trois étapes d'incubation avec une cellule autologue CD puisée ou non avec des exosomes sont utilisés comme effecteurs. Les cellules tumorales autologues après trois à cinq passages sont marquées avec 100 μCi de Cr pendant 60 mn puis lavées trois fois avant leur utilisation. Pour inhiber la lyse non spécifique, les cellules froides K562 sont ajoutées à un ratio de 50 cellules froides pour une cellule cible chaude. Pour vérifier la restriction par les CMH de classe I au cours de la reconnaissance tumorale, les anticorps W6.32 sont incubés 1 h avec les cellules tumorales marquées au Cr avant la coculture avec les lymphocytes. Les cellules effectrices sont ajoutées aux cibles correspondantes à différents ratios cellulaires E:T. Après 4 h, 50 μl de chaque surnageant sont récupérés et le relargage du Cr est déterminé (compteur gamma ; Packard Top-Count, Zurich, Suisse). La moyenne des échantillons en triplicate est calculée et le pourcentage de relargage de Cr spécifique est déterminé de la façon suivante : pourcentage de lyse spécifique = (relargage expérimental du Cr - relargage du Cr contrôle) / (relargage maximum du Cr - relargage du Cr contrôle) x 100. Le relargage expérimental du
Cr représente les coups pour les cellules cibles mélangées avec les cellules effectrices, le relargage du Cr contrôle représente les coups des cellules cibles incubées avec un milieu seul (le relargage spontané), et le relargage du Cr maximum représente les coups des cellules cibles exposées à 5 % de Triton X-100. Exemple 6 : Les exosomes dérivés de cellules tumorales sont naturellement sécrétées dans les effusions pleurales ou péritonéales
Ces résultats montrent également que le procédé standard remanié décrit dans le matériel et méthodes de la demande WO 99/03499 a pu être appliqué avec succès aux effusions péritonéales pour isoler les exosomes. Comme indiqué par les études d'immunoélectronmicroscopie les culots obtenus après ultracentrifugation ont une flottation à une densité comprise entre 1,14 et 1,18 g/ml dans un gradient de sucrose/D20 et contiennent un nombre important de vésicules membranaires ressemblant à celles décrites pour les texosomes issus de cultures de lignée cellulaire (cf. figure 1). Ces vésicules sont, pour la plupart, agrégées, de taille hétérogène (de 30 à 150 nm, comprises majoritairement entre 50 à 100 nm de diamètre, et peuvent être marquées avec un anticorps antitétraspannine CD63 et avec un anticorps monoclonal anti-CMH de classe I (cf. figure 2A). Aucune contamination significative avec des débris similaires n'a été observée dans ces préparations (cf. figure 2B). Les images obtenues par western blotting révèlent les caractéristiques typiques des texosomes obtenus à partir de cultures de lignées cellulaires, en particulier, un niveau important de molécules CMH de classe I et de molécules Hsp70 et 80 comparées avec les lysats de cellules tumorales autologues recueillies à partir des fluides ascitiques ou à partir de cellules tumorales autologues de lignée cellulaire (cf. figure 2A). Comme décrit antérieurement dans la demande WO 99/03499 pour les texosomes dérivés de cultures de lignées cellulaires de mélanome in vitro, les texosomes purifiés à partir de deux ascites de mélanome contiennent l'antigène tumoral natif complet MARTI /MelanA (cf. figure 2C). La présence de l'antigène tumoral MARTI peut être attaché aux exosomes et non pas aux débris cellulaires dans la mesure où aucune glycoprotéine gp96 ne peut être détectée dans les préparations d'exosomes à partir d'ascites. Comme antérieurement décrit pour les exosomes sécrétés à partir de cellules dendritiques murines propagées ex vivo (Srivastava, P.K., Methods, 12(2): 165-71), les deux isoformes de lactadhérine sont surexprimées dans les exosomes dérivés d'ascites comparés aux lysats de cellules tumorales (cf. figure 2D). Pour deux des cinq patients testés, les exosomes par opposition aux lysats de cellules tumorales extraits de cellules tumorales autologues primaires, ont des niveaux d'expression de molécules du CMH de classe II détectables par Western blots. Ceci suggère la présence d'exosomes dérivés de CPA professionnelles (cellules B, macrophages, CD) dans les ascites de ces deux patients. Les analyses quantitatives utilisant la méthode d'immunocapture avec un anticorps anti- CMH de classe I révèlent que plus de 1010 ± 109 molécules exosomales CMH de classe I peuvent être récupérés dans 1 ml d'ascites tumorales. L'ensemble de ces résultats démontre ainsi la faisabilité et la reproductibilité de l'isolement d'une quantité importante d'exosomes tumoraux authentiques à partir d'ascites de patients atteints de cancer. Les exosomes dérivés d'ascites véhiculent les antigènes de tumeur pour leur chargement dans les CD et leur présentation croisée aux lymphocytes TCD8+.
Il a été antérieurement montré que les exosomes dérivés de lignées cellules de mélanome contenaient l'antigène MARTI natif et les HSP 70-80 qui pouvaient être transférés aux CD pour stimuler les CTL spécifiques MARTI restreints HLA-A2. Par conséquent, il a été testé si les exosomes purifiés à partir d'ascites d'un patient mélanome HLA-A2-, lorsqu'ils étaient chargés sur des CD-MD permettaient à de tels CD de déclencher des clones CTL restreints HLA-A2 spécifiques MARTI. Comme représenté à la figure 2A, au contraire d'exosomes dérivés d'ascite ovarien, les exosomes purifiés à partir d'ascite de mélanome contiennent des quantités importantes de protéine MARTI pour les deux patients testés. De manière intéressante, les CD-MD chargés avec les exosomes d'ascite extraits de patient avec un mélanome HLA-A2-, mais pas à partir de patient atteint d'un cancer ovarien, induisent l'activation de CTL par exemple par la production d'IFN-gamma (cf. figure 3B). Ces résultats suggèrent que les exosomes dérivés d'ascite transfèrent leur antigène aux CD pour leur présentation croisée aux lymphocytes T CD8+ spécifiques.
Exemple 7 : Les CD-MD chargées avec des exosomes dérivés d'ascite induisent l'activation de CTL contre la tumeur autologue
Afin de tester la capacité des exosomes dérivés d'ascite à induire in vitro des réponses CTL spécifiques de tumeur, l'expérience suivante a été réalisée : des PBL d'ascite tumoraux portés par des patients atteints de cancer ont été stimulés chaque semaine avec soit des cellules tumorales autologues irradiées, soit avec des CD-MD chargés avec soit des exosomes dérivés d'ascite autologue, ou avec soit des exosomes dérivés de cellules tumorales autologues. Après trois séries de stimulations in vitro, les PBL ont été phénotypés par analyse FACScan et comptés par la technique d'exclusion au bleu trypan avant d'être testés contre les cellules tumorales au moyen de la technique de relargage en Cr et de la sécrétion d'IFN-gamma. Ces résultats sont présentés et résumés au tableau 3 (cf. ci-après). Tableau 3 : Les CD chargées avec des vésicules membranaires issues de fluide ascétique (Ex / As) induisent l'activation de CTL dirigées contre les cellules tumorales autologues.
Figure imgf000048_0001
Légende du Tableau 3: Le tableau 3 résume les résultats fonctionnels obtenus avec des lymphocytes sanguins stimulés 2 ou 3 fois avec des CD chargées ou non avec des vésicules d'ascite. Pour les patients 5, 6, 7, il a été rajouté un bras testant la stimulation des lymphocytes par des CD chargées avec des exosomes de lignées cellulaires autologues provenant d'un volume liquide identique à celui des vésicules d'ascite.
La cytotoxicité est réalisée avec les lymphocytes stimulés. Les résultats présentés sont obtenus à des ratio effecteurs/cibles équivalents à 50:1, en présence de K562 froides. Les écarts types sont écrits entre parenthèses. Les tests de sécrétion d'interféron-γ sont obtenus en cocultivant les lymphocytes stimulés avec ou sans cellules tumorales autologues pendant 24 h. Les taux sont exprimés en pg/ml. Les taux d'interféron-γ spécifiques de la tumeur sont obtenus en soustrayant les taux d'interféron-γ sécrétés spontanément par les lymphocytes aux taux d'interféron-γ sécrétés par les lymphocytes en présence de cellules tumorales. « Tum Auto » pour tumeur autologue ; « ExAs » pour exosome dérivé d'ascite ; « ExLi » pour exosome dérivé de lignées cellulaires.
Sur l'ensemble des patients, une augmentation de cinq à douze fois du nombre absolu de cellules CD3/CD8+ a été observée après trois stimulations réalisées avec des CD chargés par des exosomes dérivés d'ascite (ExAs). Pour six des sept patients, des lymphocytes stimulés avec des CD chargés d'ExAs une augmentation de la fréquence et du « priming » de précurseur CTL a été mise en évidence. Pour cinq des patients, il a été observé que les lymphocytes stimulés avec des CD chargées en ExAs sont capables de lyser des cellules tumorales autologues et de sécréter de riFN-gamma après 24 h de coculture mixte lymphocyte / tumeur de manière significative, ces résultats n'ayant pas été observés pour les lymphocytes stimulés avec des CD non chargées. Ces résultats ont été confirmés par analyse ELISPOT de riFN-gamma énumérant de 0,3 % à 0,15 % de lymphocytes spécifiques de la tumeur après stimulation avec des CD chargés en ExAs dans les patients 5, 6 et 7. La reconnaissance des cellules tumorales autologues était spécifique de la tumeur et restreint au CMH de classe I puisque la lyse a été réalisée avec des quantités saturantes de K562 froides et complètement annulée par un anticorps anti-CMH de classe I (W6.32, cf. figure 5B). La lyse directe de K562 a été essayée pour un des patients mais aucune lyse significative n'a été obtenue (cf. figure 5A). De manière similaire, la sécrétion d'INF-gamma par des lymphocytes stimulés in vitro (IVS) dirigés contre les cellules de tumeur homologue pourrait être bloquée avec succès par W6.32 (cf. figure 5B). Des résultats similaires ont été obtenus dans les tests de prolifération contre les cellules tumorales autologues pour certains patients (non montrés). La reconnaissance des cellules tumorales est spécifique de la tumeur puisque pour les patients 1 et 2, les CTL ne sont pas capables de lyser des lignées cellulaires tumorales irrlevantes et allogéniques ni non plus d'induire le relargage d'IFN-gamma après coculture en présence de ces cellules irrelevantes (résultats non montrés). Au jour 0, les lymphocytes avant IVS ne présentaient aucune caractéristique de reconnaissance spécifique de tumeur. De plus, les lymphocytes stimulés avec les exosomes seuls en absence de CD ne proliféraient pas (résultats non montrés). De manière intéressante, les exosomes dérivés d'ascite apparaissent plus immunogènes que les exosomes dérivés de lignées tumorales autologues pour induire des réponses CTL in vitro. En effet, pour deux des trois patients testés, les niveaux spécifiques de cytotoxicité et de sécrétion d'IFN-gamma obtenus en utilisant les exosomes dérivés ExAs sont significativement plus élevés que ceux obtenus en utilisant les exosomes dérivés de cellules tumorales. Les surnageants de culture et d'ascite contenant 10 cellules/ml ont été ultracentrifugés pour recueillir les exosomes utilisés dans l'IVS.
Par ces résultats, il a été mis en évidence de nouvelles entités antigéniques endogènes trouvées en abondance dans des ascites et effusions tumoraux de patients atteints de cancer, ces entités ressemblent aux vésicules membranaires exosomales décrites pour les surnageants de culture propagés ex vivo montrés comme étant antigéniques et immunogéniques chez des souris porteuses de tumeurs (Raposo, G. et al., J. Exp. Med., 183(3):1161-72, 1 Mars 1996). In vivo, les exosomes pourraient être relevants sur le plan immunologique pour des conditions physiopathologiques données puisqu'il a été mis en évidence que ces exosomes naturellement sécrétés sont bioactifs, transférant les antigènes tumoraux aux CD-DM pour activer efficacement in vitro les CTL des patients atteints de cancer.
Les exosomes ont été décrits comme étant des vésicules membranaires d'environ 60 à 90 nm de diamètre, issus d'endosomes multivésiculaires relargués spontanément dans le micro-environnement extracellulaire après fusion du corps multivésiculaire avec la membrane plasmique. Sur le plan morphologique, les vésicules membranaires purifiées à partir d'ascites tumoraux ressemblent de manière typique aux exosomes dérivés de lignée cellulaire tumorale ex vivo par exemple par leur taille hétérogène, en forme d'hématies sur grille, et parfois agrégées, marquées fortement par des anticorps anti-CD63 et des anticorps anti-CMH de classe I par microscopie immuno-électronique. Les propriétés biophysiques comme par exemple leur flottation à une densité comprise entre 1,14 et 1,18 g/ml en gradient de sucrose sont une propriété caractéristique de ces exosomes dérivés d'ascites, caractéristiques utilisées pour leur procédé de purification. Les études biochimiques révèlent les marqueurs moléculaires classiques comme ceux antérieurement reportés pour les exosomes purifiés à partir de CD-MD et de cultures de cellules tumorales. En effet, l'HSP 70 retrouvée dans les exosomes dérivés d'ascites a été préalablement décrite par l'équipe de Srivastava comme étant fortement immunogénique in vivo et comme étant des molécules chaperonnes constitutives surexprimées dans les endosomes tardifs et les exosomes dérivés de CD murines (Thery, C. et al., J. Cell Biol., 147:599-610, 1999) et d'exosomes dérivés de lignées cellulaires tumorales (Raposo, G. et al.). Les exosomes dérivés d'ascites présentent également une quantité importante des deux isoformes de la lactadérine, une protéine associée à la membrane ayant une affinité pour des ligands de CPA (αVβ3 et αVβ5), isoformes qui pourraient cibler les exosomes vers leurs cellules effectrices, les cellules dendritiques (Thery, C. et al.). La détection systématique de l'antigène tumoral MARTI, déjà décrite comme étant contenue dans les exosomes sécrétés de lignées cellulaires de mélanome et la détection le cas échéant de molécules de CMH classe II supportent le fait que la plupart des exosomes dérivés d'ascites sont sécrétés naturellement par les cellules tumorales plutôt que par les CPA. Les fonctions biologiques des exosomes et leur relevance restent peu détaillées.
Dans les réticulocytes, la sécrétion des exosomes élimine des récepteurs transférines et acétylcholinestérases qui sont nécessaires dans la fonction de différentiation des globules rouges. Les exosomes dérivés de lymphocytes B portent en abondance des molécules de type tétraspannine et de CMH de classe II, et se fixent sélectivement aux CD folliculaires qui ne néosynthétisent pas de molécules de CMH classe II in vivo, suggérant une possible fonction de ces exosomes de lymphocytes B dans les réponses immunes humorales (Denzer, K. et al., J. Immunol., 165(3): 1259-65, 1 Août 2000). Récemment, il a été mis en évidence qu'à la fois les exosomes dérivés de CD et de cellules tumorales véhiculent et transfèrent des antigènes (complexe fonctionnel CMH classe I et/ou II - peptide et/ou HSP) vers les CD pour activer efficacement les cellules T in vitro ou in vivo (André, F., article soumis pour publication). En cas de signal de danger délivré à la périphérie (tumeur, pathogènes), les CD présentent toutes les caractéristiques biologiques pour être attirées chimiquement pour acquérir et processer des antigènes à la périphérie et de migrer vers les aires riches en cellule T des ganglions afin d'activer les cellules T naïves (Banchereau, J. et al., Nature, 392:245-52, 1998). Cependant, les mécanismes moléculaires ou les voies cellulaires appliquées dans le transfert des antigènes tumoraux vers les CD restent inconnus. Il a été montré in vitro de manière évidente que les corps apoptotiques (Albert, M.L. et al., Nature, 392:86-9, 1998), les complexes immuns (Regnault, A. et al., J. Exp. Med., 189:371-80, 1999) les ARNm (Nair, S.K. et al., Nat. Med., 6(9): 1011-7, Septembre 2000), l'HSP (Singh- Jasuja, H. et al., J. Exp. Med., 191(11):1965-74, 5 Juin 2000) et les exosomes dérivés de tumeurs (Raposo, G. et al.) participent au transfert d'antigènes des cellules périphériques vers les CD. Néanmoins, le transfert d'antigènes permettant la présentation croisée restreint CMH de classe I n'a jamais été décrit à partir de matériaux biologiques purifiés directement d'échantillons prélevés in vivo. Ici ces résultats montrent à partir d'un modèle d'antigène tumoral MARTI que les exosomes dérivés d'ascites portant un haplotype HLA non relevant peuvent induire l'activation de clone CTL une fois chargés sur les CD portant l'allèle HLA-A2 approprié. De plus, dans un système de modèle autologue pour lequel les antigènes tumoraux ne sont pas caractérisés (cancer des ovaires, du poumon ou du rein), les CD chargés avec des exosomes dérivés d'ascites induisent l'activation de CTL pour six des sept patients testés. Par conséquent, il est concevable que le transfert antigénique puisse être médié par de tels exosomes dérivés de tumeur locale, supportant l'hypothèse que les exosomes pourraient être une voie potentielle de transfert d'antigènes du compartiment tumoral vers le réseau de CPA.
Sans tenir compte de leur intérêt in vivo, les exosomes dérivés d'ascites peuvent être une nouvelle stratégie pour le chargement ex vivo de CD permettant la présentation croisée d'antigènes restreints CMH de classes I et II, particulièrement dans les modèles de tumeurs pour lesquelles des antigènes candidats de rejet de tumeurs sont peu disponibles. En effet, en dépit de résultats prometteurs obtenus par les premiers essais cliniques de traitement du cancer (Nestlé, F.O. et al., Nat. Med., 4:328-32, 1998 ; Murphy, G.P. et al, Prostate, 39:54-9, 1999 ; Hsu, F.J. et al., Nat. Med., 2(l):52-8, Janvier 1996 ; Kugler, A. et al., Nat. Med., 6:332-6, 2000), une stratégie optimale pour la sensibilisation de CD est requise pour les vaccins anticancéreux à large spectre. Jusqu'ici, dans les cancers des ovaires, peu d'antigènes tumoraux et de clones CTL ont été obtenus, et peu d'individus ont pu bénéficier d'immunothérapies basées sur le transfert adoptif de TIL ou de cellules LAK stimulés par l'IL-2 ou de macrophages activés (Steis, R.G. et al., J. Clin. Oncol. 8:1618-29, 1990 ; Aoki, Y. et al, Cancer Res., 51:1934-9, 1991 ; Freedman, R.S. et al., J. Immunother. Emphais Tumo. Immunol., 16:198-210, 1994 ; Soda, H. et al., Oncol., 72:211-17, 1999). De nouveaux concepts comme la fusion de CD avec des suspensions de cellules tumorales (Gong, J. et al., J. Immunol., 165:1705-11, 2000) ou de CD chargés avec des lysats tumoraux (Santin, A.D., et al., Am. J. Obstet. Gynecol. 183:601-9, 2000) ou avec des peptides élues à l'acide (Santin, A.D. et al, Obstet. Gynecol., 96:422-30, 2000) sont en attente de l'issue d'essais cliniques. Ici, il a été montré que l'utilisation d'exosomes dérivés d'ascites pour sensibiliser des CD est une méthode applicable nouvelle et efficace puisque capable d'induire l'activation de CTL dirigée contre des cellules tumorales autologues pour six des sept patients testés, ceci en utilisant un procédé compatible avec les bonnes pratiques des laboratoires. Des résultats obtenus (non présentés) révèlent d'une part que cette stratégie peut être implémentée pour cloner de nouveaux CTL et ainsi d'isoler de nouveaux antigènes tumoraux attachés à des modèles de tumeurs rares, et d'autre part révèlent l'efficacité d'exosomes péritonéaux comme vaccin intradermique prophylactique contre l'établissement de leucémie L1210 syngénique.
En conclusion, ces résultats montrent que les vésicules membranaires
(exosomes) isolés dérivés de fluides biologiques prélevés in vivo, notamment dérivés de fluides d'ascite, selon la présente invention, présentent de nombreux avantages par rapport aux texosomes isolés de lignées cellulaires décrit en particulier dans le document WO 99/03499, comme en particulier : - elles sont sécrétés de manière naturelle et en plus grande quantité in vivo et peuvent être purifiés facilement in vitro ; - la prolifération (ou amplification, ou expansion) des cellules T induite par des CD chargées par les vésicules membranaires selon la présente invention, est au moins égale ou sinon supérieure à celle induite par des CD chargées par des texosomes dérivés de lignées cellulaires ; - le pourcentage de lyse spécifique obtenu contre les cellules tumorales autologues par les cellules T stimulées (puisées) par des CD chargées par les vésicules membranaires selon la présente invention, est en général très supérieure (2 à 5 fois plus) que celui obtenu pour des cellules effectrices puisées par des CD chargées par des texosomes dérivés de lignées cellulaires (cf. tableau 3) ; - les molécules du CMH portées par les vésicules membranaires selon la présente invention sont en nombre très supérieures à celles portées par des texosomes dérivés de lignées cellulaires. Le plus grand pouvoir immunogène des vésicules membranaires selon la présente invention est particulièrement mis en évidence pour le patient 6 (cf. tableau 3) ; - les vésicules membranaires selon la présente invention sécrètent en plus grand nombre des molécules de ciblage, notamment les isoformes de la lactadhérine ou des IgG, que les texosomes dérivés de lignées cellulaires ; et
- les vésicules membranaires selon la présente invention possèdent un répertoire antigénique plus représentatif du répertoire de la population initiale de cellules du fluide dont elles sont issues que les texosomes issus de lignées cellulaires. Il a ainsi déjà été mis en évidence que la réponse immune de type cytotoxique spécifique de tumeur, obtenue en utilisant des lignées cellulaires tumorales ne reflétait pas totalement l'activité antitumorale exercée in vivo par la tumeur (Dufour et al., J. of Immunol., 158 (8), 3787-95, 1997). Les vésicules membranaires selon la présente invention, notamment celles isolées à partir de fluide d'ascite, peuvent de ce fait et de manière avantageuse être utilisées à des fins thérapeutiques ou diagnostics, en particulier comme vaccin autologue ou allogénique, mais aussi comme méthode de chargement des cellules dendritiques à visée thérapeutique.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de préparation in vitro de vésicules membranaires isolées de leur environnement naturel à partir d'un échantillon préalablement prélevé in vivo d'un échantillon chez un mammifère, notamment chez l'homme, caractérisé en ce qu'il comprend l'étape suivante : a) l'isolement in vitro desdites vésicules membranaires à partir dudit échantillon prélevé, ledit échantillon étant un échantillon d'un fluide biologique susceptible de contenir en suspension des vésicules membranaires.
2. Procédé de préparation in vitro de vésicules membranaires selon la revendication 1, caractérisé en ce que lesdites vésicules membranaires isolées à l'étape a) sont des vésicules membranaires contenues en suspension dans ledit fluide biologique et sécrétées in vivo.
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que l'échantillon est un échantillon choisi parmi les fluides biologiques suivants : un fluide abdominal, un fluide péritonéal, un fluide pleural, un fluide céphalorachidien, du sang total, de l'urine ou tout fluide, effusion ou épanchement émanant d'une cavité dudit mammifère.
4. Procédé l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'échantillon est un échantillon de fluide exsudatif ou transsudatif.
5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l'échantillon est un échantillon de fluide exsudatif ou transsudatif prélevé dans une cavité et résultant d'un cancer, d'une réaction inflammatoire, d'une transplantation, ou d'un transfert de gène ou d'une substance chimique.
6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l'échantillon biologique est un échantillon de fluide d'ascite.
7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que l'échantillon biologique est un échantillon de fluide d'ascite tumoral de patients atteints d'un cancer.
8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que l'isolement des vésicules membranaires est effectué par centrifugation, électrophorèse, chromatographie, nanofiltration et/ou par immunocapture.
9. Vésicules membranaires isolées de leur environnement naturel susceptibles d'être obtenues par un procédé selon l'une des revendications 1 à 8.
10. Vésicules membranaires selon la revendication 9, caractérisées en ce qu'elles contiennent en majorité des vésicules membranaires de diamètre compris entre 30 et 150 nm, de préférence entre 50 et 100 nm et entre 60 et 90 nm.
11. Vésicules membranaires selon la revendication 9 ou 10, caractérisées en ce que lesdites vésicules membranaires portent des molécules impliquées dans la présentation d'antigènes, notamment des molécules du CMH de classe I et/ou II, et/ou des HSP et/ou des antigènes, notamment tumoraux, et/ou des molécules impliquées dans le ciblage d'antigène.
12. Vésicules membranaires selon l'une des revendications 9 à 11, caractérisées en ce qu'elles ne contiennent pas de glycoprotéine gp96.
13. Utilisation de vésicules membranaires selon l'une des revendications 9 à 12 pour le chargement et/ou l'activation in vitro de cellules présentatrices d'antigènes, notamment de cellules dendritiques.
14. Utilisation de vésicules membranaires selon la revendication 13, caractérisée en ce que lesdites vésicules membranaires et lesdites cellules présentatrices d'antigènes sont autologues ou syngéniques.
15. Utilisation de vésicules membranaires selon la revendication 14, caractérisée en ce que lesdites vésicules membranaires et lesdites cellules présentatrices d'antigènes sont allogéniques.
16. Utilisation de vésicules membranaires selon l'une des revendications 9 à
12 pour la stimulation in vitro et, le cas échéant, l'amplification ou l'anergisation in vitro de lymphocytes T, ou encore pour la stimulation in vitro et, le cas échéant, l'amplification in vitro de cellules NK ou NKT spécifiques d'antigènes contenus dans lesdites vésicules membranaires.
17. Utilisation de vésicules membranaires selon la revendication 16, caractérisée en ce que lesdites vésicules membranaires et lesdits lymphocytes T ou cellules NK ou NKT sont autologues ou syngéniques.
18. Utilisation d'une suspension de vésicules membranaires selon la revendication 16, caractérisée en ce que lesdites vésicules membranaires et lesdits lymphocytes T ou cellules NK ou NKT sont allogéniques.
19. Procédé de préparation in vitro de cellules présentatrices d'antigènes chargées en vésicules membranaires, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) l'incubation in vitro de cellules présentatrices d'antigènes en présence de vésicules membranaires selon l'une des revendications 9 à 12 ; et b) la récupération desdites cellules présentatrices d'antigènes chargées en vésicules membranaires ainsi obtenues.
20. Procédé de préparation de cellules présentatrices d'antigènes selon la revendication 19, caractérisé en ce que les cellules présentatrices d'antigènes à l'étape a) sont des cellules dendritiques, notamment immatures.
21. Procédé de préparation de cellules présentatrices d'antigènes selon la revendication 19, caractérisé en ce que les cellules présentatrices d'antigènes à l'étape a) sont des cellules dendritiques obtenues à partir de précurseurs monocytes ou de moelle osseuse.
22. Procédé de préparation de cellules présentatrices d'antigènes selon la revendication 19, caractérisé en ce que les cellules présentatrices d'antigènes à l'étape a) sont des cellules dendritiques issues de cellules dendritiques immortalisées.
23. Procédé de préparation de cellules présentatrices d'antigènes selon l'une des revendications 19 à 22, caractérisé en ce que lesdites vésicules membranaires et lesdites cellules présentatrices d'antigènes sont autologues ou syngéniques.
24. Procédé de préparation de cellules présentatrices d'antigènes selon l'une des revendications 18 à 21, caractérisé en ce que lesdites vésicules membranaires et lesdites cellules présentatrices d'antigènes sont allogéniques.
25. Cellule présentatrice d'antigènes chargée en vésicules membranaires susceptible d'être obtenue par un procédé selon l'une des revendications 19 à 24.
26. Dexosomes isolés, sécrétés par des cellules présentatrices d'antigènes selon la revendication 25.
27. Procédé de préparation in vitro de lymphocytes T, cellules NK ou NKT activés ou de lymphocytes T anergiques, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) l'incubation in vitro de lymphocytes T, cellules NK ou NKT en présence de cellules présentatrices d'antigènes chargées en vésicules membranaires selon la revendication 25 ou dexosomes selon la revendication 26 ; et b) la récupération desdits lymphocytes T, cellules NK ou NKT ainsi activés ou desdits lymphocytes T anergiques.
28. Procédé de préparation in vitro de lymphocytes T, cellules NK ou NKT selon la revendication 27, caractérisé en ce que les cellules présentatrices d'antigènes, ou leurs dexosomes, et lesdits lymphocytes T, ou cellules NK ou NKT, sont autologues ou syngéniques.
29. Lymphocytes T, cellules NK ou NKT susceptibles d'être obtenus par le procédé selon la revendication 27 ou 28.
30. Utilisation de vésicules membranaires selon l'une des revendications 9 à 12, de cellules présentatrices d'antigènes selon la revendication 25, de dexosomes selon la revendication 26, ou de lymphocytes T selon la revendication 29, pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à être administrée chez un patient et à induire ou à augmenter une réponse immune de type CTL spécifique d'antigènes contenus dans lesdites vésicules membranaires selon l'une des revendications 9 à 12 et dans laquelle utilisation, lesdites vésicules membranaires, cellules présentatrices d'antigènes et lymphocytes T sont autologues ou syngéniques du patient à traiter.
31. Utilisation de vésicules membranaires selon l'une des revendications 9 à
12, de cellules présentatrices d'antigènes selon la revendication 25, de dexosomes selon la revendication 26, ou de cellules NK ou NKT selon la revendication 29, pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à être administrée chez un patient et à induire ou à augmenter une réponse innée de type NK ou NKT spécifique d'antigènes contenus dans lesdites vésicules membranaires selon l'une des revendications 9 à 12 et dans laquelle utilisation, lesdites vésicules membranaires, cellules présentatrices d'antigènes et cellules NK ou NKT sont autologues ou syngéniques du patient à traiter.
32. Utilisation selon la revendication 30 ou 31, pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à la prévention ou au traitement de patient atteint d'un cancer.
33. Utilisation de cellules présentatrices d'antigènes, notamment de cellules dendritiques, prélevées chez un premier patient (le receveur) ou chez un patient dont ses cellules présentatrices d'antigènes sont syngéniques aux cellules présentatrices d'antigènes du premier patient, pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à être administrée chez ce premier patient, caractérisée en ce que lesdites cellules présentatrices d'antigènes ont été préalablement chargées in vitro avec des vésicules membranaires selon l'une des revendications 9 à 12 isolées à partir d'un fluide biologique prélevé chez un deuxième patient (le donneur), ledit receveur et donneur étant allogéniques.
34. Utilisation de lymphocytes T prélevées chez un premier patient (le receveur) ou chez un patient dont ses lymphocytes T sont syngéniques au lymphocytes T du premier patient pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à être administrée chez ce premier patient, caractérisée en ce que lesdits lymphocytes T ont été préalablement activés in vivo avec des cellules présentatrices d'antigènes préalablement chargées avec des vésicules membranaires selon l'une des revendications 9 à 12, lesdites vésicules membranaires ayant été isolées à partir d'un fluide biologique prélevé chez un deuxième patient (le donneur), ledit receveur et donneur étant allogéniques.
35. Utilisation de cellules présentatrices d'antigènes selon la revendication 33 ou de lymphocytes T selon la revendication 34, pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à induire la tolérance par ledit receveur d'un greffon allogénique prélevé chez ledit donneur.
36. Utilisation de cellules présentatrices d'antigènes selon la revendication 35 pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à induire la tolérance par ledit receveur d'un greffon allogénique prélevé chez ledit donneur par la méthode dite de « transfert adoptif de cellules dendritiques du receveur préalablement chargées in vitro par des vésicules membranaires du donneur ».
37. Utilisation de lymphocytes T selon la revendication 35 pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à induire la tolérance par ledit receveur d'un greffon allogénique prélevé chez ledit donneur par la méthode dite de « transfert adoptif de lymphocytes T du receveur préalablement activés in vivo par des cellules dendritiques du receveur préalablement chargées (puisées) par des vésicules membranaires du donneur ».
38. Utilisation de vésicules membranaires selon l'une des revendications 9 à 12, de cellules présentatrices d'antigènes selon la revendication 25 ou de dexosomes selon la revendication 26, pour la sélection ex vivo d'un répertoire de lymphocytes T, susceptibles de reconnaître des antigènes spécifiques contenus dans lesdites vésicules membranaires selon l'une des revendications 9 à 12.
39. Médicament comprenant à titre de substance active une ou plusieurs vésicules membranaires selon l'une des revendications 9 à 12, cellules présentatrices d'antigènes selon la revendication 25, de dexosomes selon la revendication 26 ou des lymphocytes T, cellules NK ou NKT selon la revendication 29, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
40. Médicament selon la revendication 39 pour le traitement des cancers.
41. Médicament selon la revendication 39 ou 40, caractérisé en ce qu'il comprend en outre un adjuvant immunostimulant synthétique ou naturel.
42. Procédé de diagnostic in vitro d'un cancer et/ou de son évolution chez un patient, caractérisé en ce qu'on détermine la présence de marqueurs ou précurseurs spécifiques d'un cancer et/ou de son évolution à la surface et/ou dans le cytosol de vésicules membranaires selon l'une des revendications 9 à 12.
43. Procédé de diagnostic in vitro selon la revendication 42, caractérisé en ce que les vésicules membranaires issues d'un fluide biologique prélevé chez le patient, sont issues d'un fluide d'ascite ou d'une effusion, notamment émanant d'une cavité, telle qu'une cavité péritonéale, abdominale ou pleurale.
44. Procédé de diagnostic in vitro selon la revendication 42 ou 43, caractérisé en ce que la détermination de la présence de marqueurs ou précurseurs spécifiques d'un cancer et/ou de son évolution est réalisée par une technique immunoenzymatique de type ELISA, Western Blot, immunocapture ou immunoélispot à l'aide d'anticorps spécifiques de ces marqueurs.
45. Utilisation de vésicules membranaires (texosomes) dérivant d'échantillon de fluide d'ascite tumoral selon l'une des revendications 9 à 12, de CPA, notamment de cellules dendritiques, selon la revendication 25, pour la fabrication d'un test d'hypersensibilité retardé du cancer.
46. Utilisation de vésicules membranaires (texosomes) dérivant d'échantillon de fluide d'ascite tumoral selon l'une des revendications 9 à 12, de CPA, notamment de cellules dendritiques, selon la revendication 25, comme outil de diagnostic de recherche de fréquence de précurseurs spécifiques CTL.
47. Procédé de préparation in vitro d'une banque d'anticorps d'origine murine dirigés contre des antigènes humains portés par des vésicules membranaires selon l'une des revendications 9 à 12, notamment tumoraux, à partir d'un échantillon préalablement prélevé in vivo chez une souris SCID, notamment SCID/NOD, d'un échantillon de fluide d'ascite péritonéal résultant de l'implantation par voie intrapéritonéale d'une tumeur, d'un tissu ou de cellules tumorales humaines, ledit prélèvement contenant ladite banque d'anticorps, caractérisé en ce qu'il comprend l'étape suivante : a) la purification des anticorps contenus dans ledit prélèvement.
48. Procédé de préparation in vitro d'une banque de texosomes isolés d'origine murine et humaine à partir d'un échantillon préalablement prélevé in vivo chez une souris SCID, ledit échantillon étant un échantillon de fluide d'ascite péritonéal résultant de l'implantation par voie intrapéritonéale d'une tumeur, d'un tissu ou de cellules tumorales humaines, caractérisé en ce qu'il comprend l'étape suivante : a) l'isolement in vitro desdits texosomes à partir dudit échantillon prélevé par centrifugation, électrophorèse, chromatographie, nanofiltration et/ou par immunocapture, lesdits texosomes étant de préférence des texosomes contenus en suspension dans ledit fluide biologique et sécrétés in vivo.
49. Procédé de préparation de texosomes modifiés in vitro, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) l'isolement in vitro de vésicules membranaires (texosomes) à partir d'un échantillon de fluide d'ascite tumoral par un procédé selon l'une des revendications 1 à 8 ; b) l'élution, notamment acidique, desdits texosomes naturels obtenus à l'étape a) ; c) la mise en contact desdits texosomes naturels élues avec des peptides, glycolipides ou phospholipides d'intérêt que l'on désire charger dans les texosomes ; et d) la récupération desdits texosomes ainsi modifiés.
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