WO2003006989A1

WO2003006989A1 - Procede de quantification de lipoproteines denaturees, reactifs pour la quantification de lipoproteines denaturees, procede de detection de maladies du systeme circulatoire et reactifs pour la detection de maladies du systeme circulatoire

Info

Publication number: WO2003006989A1
Application number: PCT/JP2002/007116
Authority: WO
Inventors: Hiroaki Kohno; Takashi Yanagisawa; Toshiyuki Masunari
Original assignee: Kyowa Medex Co., Ltd.
Priority date: 2001-07-12
Filing date: 2002-07-12
Publication date: 2003-01-23
Also published as: EP1418429A4; CN1554024A; JP4904308B2; CA2453538A1; ATE479101T1; DE60237455D1; JP2008203269A; EP1418429A1; EP1418429B1; JP4179988B2; KR20040025931A; CN100516878C; JPWO2003006989A1; US20040241744A1

Description

明細書

変性リポ蛋白質の定量法、変性リポ蛋白質の定量用試薬、循環器疾患の検出方法およぴ循環器疾患の検出試薬抟術分睜

本発明は、生体試料中の変性リポ蛋白質をホスホコリンに対する抗体を用いて定量することを特徴とする生体試料中の変性リポ蛋白質の定量方法、生体試料中の変性リポ蛋白質をホスホコリンに対する抗体およびリポ蛋白質に対する抗体を用いて定量することを特徴とする生体試料中の変性リポ蛋白質の定量方法、生体試料中の変性リポ蛋白質をホスホコリンに対する抗体を用いて定量し、その定量値から循環器系疾患を検出することを特徴とする循環器系疾患の検出方法、生体試料中の変性リポ蛋白質をホスホコリンに対する抗体およびリポ蛋白質に対する抗体を用いて定量し、その定量値から循環器系疾患を検出することを特徴とする循環器系疾患の検出方法、ホスホコリンに対する抗体を含有する変性リポ蛋白質の定量用試薬およびホスホコリンに対する抗体およぴリポ蛋白質に対する抗体を含有する変性リポ蛋白質の定量用試薬に関する。

¾fe術

動脈硬化症は大動脈、冠状動脈、脳動脈及び頸動脈などの筋型動脈に多く発生し、狭心症、心筋梗塞、脳梗塞などの主因となる疾患である。その原因として血清コレステ口ールの上昇、血小板凝集、内皮傷害などが提唱されているが、その成因はほとんど解析されていない。

血清脂質は、心筋梗塞や狭心症などの冠動脈系疾患、脳梗塞や脳血管系痴呆などの脳動脈系疾患、あるいは腎症、糖尿病性腎症などの腎動脈系疾患および末梢動脈閉塞症などの末梢動脈系疾患などの各種循環器系疾患との関わりが強く示唆されており、その測定は、これら疾患の診断、病態の解明、治療の効果検出などに極めて重要であると考えられている。

しかしながら、最近の研究で、上記の疾患患者群と健常者群との血清脂質の絶対量の比較を行った結果、両群間でそれほど大きな違いはなく、むしろ変性されたリポ蛋白質（以下、変性リポ蛋白質と称す）の血清中の存在量が明確に両群間で異なつていることが報告された [例えば、 Circulation, 94. S醫 1 . T . 1288 (1996) ]。また、変性リポ蛋白質の一つである酸化リポ蛋白質と粥状硬化病巣の進展との関連性が、ス夕インバーグ (Steinberg)らにより指摘された [例えば、 N. Engl. J. Med. , m, 915 (1989)] 。

さらにスカベンジャー受容体などの、変性リポ蛋白質に対する受容体の存在が明らかにされ、変性リポ蛋白質がこれらの受容体を介して細胞内に取り込まれることによって、泡沫細胞となり粥腫形成のイニシエーションが起こるという仮説、また変性リポ蛋白質が内皮細胞を傷害することで、血小板の粘着凝集や、白血球の集結、血球成分の血管内への浸潤がおこり、これらが引き金になって、平滑筋細胞の遊走や増殖を引き起こすといつた仮説が提唱されている。

変性リポ蛋白質が病巣に蓄積していることは、例えば 1 9 8 8年にハーバーランド（Haberland)等がマロンジアルデヒドで修飾した低密度リポ蛋白質（L D L ) に対する抗体 [抗マロンジアルデヒド（MD A) —L D L抗体] により動脈硬化病巣部が染色されること [Science, l, 215 (1988)] 、また 1 9 8 9年にイラ一ハーテエアラ（Yla Herttuala)等が、抗 M D A— A p o B抗体によるィムノブロッティング法により、病巣部から抽出されたアポ B ( a p o B )を検出されること [J. Clin. Invest. , M, 1086 (1989)] などが報告されている。しかしながら、上述の抗 MD A— A p 0 B抗体はマロンジアルデヒドを用いて人工的に酸化修飾したリポ蛋白質を抗原として得られた抗体であるが、酸化生成物だけでなく他の変性蛋白質、例えば酸化アルブミンなどとも交叉反応を示すという性質を有するため、変性リポ蛋白質を測定しているかどうかは不明である。

上記のように、変性されたリポ蛋白質としては、ァセチル化リポ蛋白質、 $唐ィ匕リポ蛋白質、マロンジアルデヒド化リポ蛋白質、 4ーヒドロキシ一 2—ノネナール（ H N E )修飾リポ蛋白質、酸化リポ蛋白質等が知られているが、生体内での変性リポ蛋白質の実体は未だ不明確である。

また、リポ蛋白質が凝集をおこすことによって性質が変化し、マクロファージによって取り込まれやすくなることが知られており [J. Biol . Chem. , 231, 31700, (1997)]、これもリポ蛋白質の変性の一種と考えられる。この変性は酸化、チォ一ル化、ある種の酵素処理などによって引き起こされることが知られており [ Arterioscier. Thromb. , 1U 1209 (1991) 、 Arch. Biachem. Biophys. , 3JLQ, 489 (1994)、 Biochim. Biophys. Acta. , 1215, 79 (1994)、 Nutr. Metab. Cardiovasc. Dis. , 4, 70 (1994)、Proc. Nati. Acad. Sci. U. S.A. , Sfi, 2713 (細）、 Arterioscier. Thromb. , 11, 1643 (1991)、 J. Biol. Chem. , m, 20419 (1993)、 Circ. Res. , 11, 218 (1992)]、さらにボルテックス処理などの物理的処理においてもこのような変性は引き起こされる [Arteriosclerosis, 8, 348 (1988) ] 。またこのような変性を起こしたリポ蛋白質は、マクロファ一ジによって容易に取り込まれるようになる。そのため、マクロファージにコレステロールの蓄積を引き起こし、動脈硬化性病巣の発生 ·進展に深く関与していると考えられている。

以上のことから、動脈硬ィ匕をはじめとする循環器疾患の診断として、変性リポ蛋白質の測定方法が開発されている。

具体的には、ホスファチジルコリンの酸ィ匕物を認識する抗体を用いて酸ィ匕リポ蛋白質を測定する方法（特開平 8— 3 0 4 3 9 5号、特開平 9— 2 8 8 1 0 6号）、 HDLの酸化リン脂質 (特にリゾホスファチジルコリン）を認識する抗体である 9F5 - 3a と、抗 apo- A I抗体とを用いた酸化 HDLを測定する方法（特開平 9— 3 3 5 2 5号ァセチル化、マロンジアルデヒド化、酸ィ匕など化学処理した LDLをすベて認識する抗体と酸化剤とを組み合わせて酸化 LDLを測定する方法（特開平 9— 5 3 2 3号 )、プラスミノ一ゲン及び LDLと交差反応性がなく、リポ蛋白質 (a)の酸化、還元、加水分解などの分解、加熱、又は蛋白質変性剤などの変性剤等により、一次構造、高次構造若しくは立体構造の変化、分解又は化学的修飾を受け構造、組成又は立体的配置が変化する特定のぺプチドを認識する抗体を用いて変性又は修飾リポ蛋白質 (a)を測定する方法（特開平 9— 2 9 7 1 3 7号)、マロンジアルデヒド化されたリポ蛋白質に対する抗体と界面活性剤とを併用して変性リポ蛋白質類を測定する方法（特開平 8— 1 0 1 1 9 5号）などがこれまでに報告されているが、十分な成果を示しているものはない。

発昍の闘示

本発明の目的は、生体試料中の変性リポ蛋白質の定量方法、循環器系疾患の検出方法、変性リポ蛋白質の定量用試薬および循環器系疾患の検出試薬を提供することである。

本発明は、下記（1 ) 〜（3 6 ) に関する。

( 1 ) 生体試料とホスホコリンに対する抗体とを接触させ、生じる免疫複合体を定量することを特徴とする生体試料中の変性リポ蛋白質の定量方法。

( 2 ) 生体試料とホスホコリンに対する抗体およびリポ蛋白質に対する抗体とを接触させ、生じる免疫複合体を定量することを特徴とする生体試料中の変性リポ蛋白質の定量方法。

( 3 ) 生体試料とホスホコリンに対する抗体および低密度リポ蛋白質に対する抗体とを接触させ、生じる免疫複合体を定量することを特徴とする生体試料中の変性低密度リポ蛋白質の定量方法。

( 4 ) 低密度リポ蛋白質に特異的に結合する抗体が、アポ B蛋白質に対する抗体である上記（3 ) 記載の方法。

( 5 ) 生体試料とホスホコリンに対する抗体および高密度リポ蛋白質に対する抗体とを接触させ、生じる免疫複合体を定量することを特徴とする生体試料中の変性高密度リポ蛋白質の定量方法。

( 6 ) 高密度リポ蛋白質に特異的に結合する抗体が、アポ A蛋白質に対する抗体である上記（5 ) 記載の方法。

( 7 ) 生体試料とホスホコリンに対する抗体およびアポプロテイン（a ) に対する抗体とを接触させ、生じる免疫複合体を定量することを特徴とする生体試料中のリポプロティン（a)の定量方法。

( 8 ) 生体試料とホスホコリンに対する抗体、高密度リポ蛋白質に対する抗体および低密度リポ蛋白質に対する抗体とを接触させ、生じる免疫複合体を定量することを特徴とする生体試料中の変性高密度リポ蛋白質および変性低密度リポ蛋白質の定量方法。

( 9 ) 高密度リポ蛋白質に特異的に結合する抗体が、アポ A蛋白質に対する抗体である上記（8)記載の方法。

(10) 低密度リポ蛋白質に特異的に結合する抗体が、アポ B蛋白質に対する抗体である上記（ 8 ) 記載の方法。 '

(11) 生体試料とホスホコリンに対する抗体とを接触させ、生じる免疫複合体を定量することを特徴とする循環器系疾患の検出方法。

(12) 生体試料とホスホコリンに対する抗体およびリポ蛋白質に対する抗体とを接触させ、生じる免疫複合体を定量することを特徴とする循環器系疾患の検出方法。

(13) 生体試料とホスホコリンに対する抗体および低密度リポ蛋白質に対する抗体とを接触させ、生じる免疫複合体を定量することを特徴とする循環器系疾患の検出方法。

(14) 低密度リポ蛋白質に特異的に結合する抗体が、アポ B蛋白質に対する抗体である上記（13)記載の方法。

(15) 生体試料とホスホコリンに対する抗体および高密度リポ蛋白質に対する抗体とを接触させ、生じる免疫複合体を定量することを特徴とする循環器系疾患の検出方法。

(16) 高密度リポ蛋白質に特異的に結合する抗体が、アポ A蛋白質に対する抗体である上記（15)記載の方法。

( 17) 生体試料とホスホコリンに対する抗体およびアポプロティン（a)に対する抗体とを接触させ、生じる免疫複合体を定量することを特徴とする循環器系疾患の検出方法。

(18) 生体試料とホスホコリンに対する抗体、高密度リポ蛋白質に対する抗体および低密度リポ蛋白質に対する抗体とを接触させ、生じる免疫複合体を定量することを特徴とする循環器系疾患の検出方法。

(19) 高密度リポ蛋白質に特異的に結合する抗体が、アポ A蛋白質に対する抗体である上記（18)記載の方法。

(20) 低密度リポ蛋白質に特異的に結合する抗体が、アポ B蛋白質に対する抗体である上記（18)記載の方法。

(21) ホスホコリンに対する抗体を含有する変性リポ蛋白質の定量用試薬。

(22) ホスホコリンに対する抗体およびリポ蛋白質に対する抗体を含有する変性リポ蛋白質の定量用試薬。

(23) リポ蛋白質に対する抗体が、アポ B蛋白質に対する抗体、アポ A蛋白質に対する抗体およびアポプロテイン（a)に対する抗体からなる群から選ばれる上記（ 22 ) 記載の試薬。

(24) 凍結保護剤を含む、上記（ 21 )〜（ 23 ) のいずれか 1項に記載の試薬。

(25) ホスホコリンに対する抗体を含有する変性リポ蛋白質の定量用キヅト (26) ホスホコリンに対する抗体およびリポ蛋白質に対する抗体を含有する変性リポ蛋白質の定量用キット。

(27) リポ蛋白質に対する抗体が、アポ B蛋白質に対する抗体、アポ A蛋白質に対する抗体およびアポプロティン（a) に対する抗体からなる群から選ばれる上記（23)記載のキヅト。

(28) 凍結保護剤を含む、上記（ 25 )〜（ 27 ) のいずれか 1項に記載の変性リポ蛋白質の定量用キット。

(29) ホスホコリンに対する抗体を含有する循環器系疾患の検出試藥。

(30) ホスホコリンに対する抗体およびリポ蛋白質に対する抗体を含有する循環器系疾患の検出試薬。

(31) リポ蛋白質に対する抗体が、アポ B蛋白質に対する抗体、アポ A蛋白質に対する抗体およびアポプロテイン（ a)に対する抗体からなる群から選ばれる上記（30)記載の検出試薬。

(32) ホスホコリンに対する抗体を含有する循環器系疾患の検出用キット。

(33) ホスホコリンに対する抗体およびリポ蛋白質に対する抗体を含有する循環器系疾患の検出用キット。

(34) リポ蛋白質に対する抗体が、アポ B蛋白質に対する抗体、アポ Aに対する抗体およびアポプロテイン（a)に対する抗体からなる群から選ばれる上記（3 3)記載のキヅト。

(35) 凍結保護剤を含む、上記（32)〜（34)のいずれか 1項に記載の循環器系疾患の検出用キット。

(36) 糖類、高分子物質および親水性有機溶媒からなる群から選ばれる化合物を有効成分として含有する、生体試料のための凍結保護剤。変性リポ蛋白質としては、変性を受けていないリポ蛋白質であればいかなるものも包含される。具体的には、糖化変性リポ蛋白質、酸ィ匕変性リポ蛋白質、ァセチル化変性リポ蛋白質、マロンジアルデヒド等の作用によるアルデヒド化変性リポ蛋白質、 4—ヒドロキシー 2—ノネナ一ル修飾変性リポ蛋白質などの化学変化を受けた変性リポ蛋白質、酸化、チォ一ル化、リポプロテインリパーゼ等の酵素処理、ボルテヅクスなどの物理処理、凍結などの温度処理などにより引き起こされる凝集や結合といつた形態的変性を受けた変性リポ蛋白質、表面構造の変化や 3次元構造の変化といった構造的変性を受けた変性リポ蛋白質等があげられる。また、未変性のリポ蛋白質に比較して荷電の変化、分子量の変化、生体内リセプ夕一への親和性変化、マクロファ一ジなどの細胞への取り込まれ易さの変化などの生物学的変化が見られるリポ蛋白質も、変性リポ蛋白質に包含される。

本発明の変性リポ蛋白質の定量方法としては、ホスホコリンに対する抗体を用いて、変性リポ蛋白質を免疫学的に測定する方法であれば特に制限されるものではなく、測定方法の工程には生体試料とホスホコリンに対する抗体とを接触させる工程、反応により生じる変性リポ蛋白質—抗ホスホコリン抗体複合体（免疫複合体）量を測定する工程が含まれる。

測定方法としては、免疫学的測定方法があげられる。免疫学的測定方法としては、ィムノアヅセィ法、ィムノブロッテイング法、凝集反応、補体結合反応、溶血反応、沈降反応、金コロイド法、クロマトグラフィー法、免役染色法など抗原抗体反応を利用した方法であればいかなるものも包含されるが、好ましくはィムノアッセィ法があげられる。

ィムノアツセィ法は、各種標識を施した抗原または抗体を用いて、抗体または抗原を検出或いは定量する方法であり、抗原または抗体の標識方法に応じて、放射免疫検出法（RIA：)、酵素免疫検出法（EIAまたは ELISA)、蛍光免疫検出法（FIA)、発光免疫検出法（luminescent immunoassay) 物理化学的検出法（TIA， LAPIA, PCIA)、フロ一サイトメトリーなどがあげられるが、好ましくは酵素免疫検出法があげられる。

放射免疫検出法で用いる放射性標識体としては、任意の公知 [J.CLAUSEN著、佐々木實監訳、加藤泰治 ·戸谷敬子訳、生化学実験法 1 5 免疫化学的同定法、東京化学同人 (1993)] の放射性同位元素を用いることができる。例えば、 ³²P、 ¹²⁵1、 ^mI等を用いる.ことができる。

酵素免疫検出法で用いる酵素標識体としては、任意の公知（石川榮次ら編、酵素免疫測定法、医学書院）の酵素を用いることができる。例えば、アルカリフォスファ夕ーゼ、ペルォキシダーゼ、ルシフェラ一ゼ等を用いることができる。

発光免疫検出法で用いる発光標識体としては、任意の公知 [今井一洋編、生物発光と化学発光、廣川書店；臨床検査 42(1998)]の発光体を用いることができる。例えば、ァクリジニゥムエステル、ロフィン等を用いることができる。

蛍光免疫検出法で用いる蛍光標識体としては、任意の公知（川生明著、蛍光抗体法、ソフトサイエンス社製）の蛍光を用いることができる。例えば、 FIT RITC 等を用いることができる。

ィムノアッセィ法における測定方法としては、競合法、サンドイッチ法 [免疫学イラストレイテッド第 5版（南光堂） ]等があげられる

具体的には、生体試料とホスホコリンに対する抗体（以下、抗ホスホコリン抗体と称す）とを接触させたのちに、標識物質を結合させた抗ホスホコリン抗体に反応する抗体を反応させることにより、生体試料中の変性リポ蛋白質を検出または定量することができる。また、標識物質を結合させた抗ホスホコリン抗体と生体試料とを接触させて反応させることにより、生体試料中の変性リポ蛋白質を検出または定量することができる。

上述のィムノアヅセィ法で用いる抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクロ —ナル抗体のいずれを用いてもよく、 Fab、 Fab'、 F(ab)₂などの抗体フラグメントを用いてもよい。また、モノクローナル抗体としては、生体内において自然に生産された抗体、非ヒト動物を用いて取得されたハイプリドーマから生産された抗体、抗体分子を形成する重鎖および軽鎖の可変領域および定常領域のアミノ酸配列をコードする DNAをもとに遺伝子工学的な手法を用いて抗体分子を発現させる遺伝子組換え抗体などいかなるものでもよい。

本発明で用いられる抗ホスホコリン抗体としては、ホスホコリンに反応する性質を有すれば上記のいずれの抗体でもよい。具体的には、 T-15抗体 [J. Exp. Med., 132, 737 (1970) 、ハイプリドーマ KTM'285 (FERM BP-7589) により生産されたモノクローナル抗体 KTM-285、 .形質転換細胞 KTM-2001 (FERM BP-7549) により生産された遺伝子組換え抗体 KTM-2001などがあげられる。

また、本発明は、ホスホコリンに対する抗体およびリポ蛋白質に対する抗体を用いて、変性リポ蛋白質を免疫学的に測定する方法をも包含する。

具体的には、固相に第一の抗体（一次抗体）を固定した後、生体試料を第一の抗体と接触させ、試料中の非反応のサンプル成分を洗浄した後、生体試料中の目的物質と第一の抗体との免疫複合体に、第二の抗体（二次抗体）を反応させ、生体試料中の変性リポ蛋白質を検出または定量することもできる。

一次抗体および二次抗体として用いられる抗体としては、抗ホスホコリン抗体と抗リポ蛋白質抗体があげられる。一次抗体と二次抗体の組み合わせとしては、好ましくは一次抗体として抗ホスホコリン抗体、二次抗体として抗リポ蛋白質抗体があげられる。

リポ蛋白質とは、血中ではコレステロールエステル、トリグリセライドなどの脂質類が中心（core) をなし、それらの表面をリン脂質と遊離コレステロール、さらに蛋白質（アポ蛋白質）で覆われた構造で存在するものをいう。

リポ蛋白質としては、超低密度リポ蛋白質（以下、 V L D Lと略す）、低密度リポ蛋白質（以下、 L D Lと略す）、高密度リポ蛋白質（以下、 H D Lと略す）、中間比重リポ蛋白質（以下、 I D Lと略す）、リポ蛋白質（a ) (以下、（L p ( a ) と略す）などがあげられる。

V L D Lは、トリグリセライドを中心とする脂質とアポ B— 4 8、アポ C、アポ Eなどの蛋白質などから構成される比重 0 . 9 6〜1 . 0 0 6の粒子で、内因性脂肪の運搬体としての機能を有する。

L D Lは、コレステロールに富んだリポ蛋白質で、主要蛋白質としてアポ B— 1 0 0を持っ比重1 . 0 0 6から 1 . 0 6 3の粒子で、コレステロールを肝臓から末梢組織へ運搬する機能を有している。

H D Lは、脂質としてリン脂質やコレステロールを主に含み、アポ A— I、アポ A— I I、アポ Cなどが主な蛋白質として含まれる比重 1 . 0 6 3〜1 . 2 1の粒子で、末梢組織からコレステロールを運び出し肝臓で代謝する機能を有している。 IDiTは、 VLDLから LDLへの変換過程での中間代謝物で、 VLDLよりコレステロールに富み、アポ B— 100,アポ C、アポ Eなどが主な蛋白質として含まれた比重 1. 006〜； L. 019を持つ粒子である。

Lp (a) は、 LDL類似のリポ蛋白粒子に独特の構造を持つアポ蛋白質（a) が結合した比重 1. 03〜1. 08の粒子で、血液凝固に関連した機能を有している。

したがって、各種リポ蛋白質に対する抗体として、各種リポ蛋白質に含まれる主要なアポ蛋白質を用いることができ、抗ホスホコリン抗体と種々のリポ蛋白質に含まれる主要なアポ蛋白質に反応する抗体（以下、抗アポ蛋白質抗体ということもある）とを用いることにより、種々の変性リポ蛋白質の検出および定量を行うことができる。

変性リポ蛋白質に含まれるアポ蛋白質に反応する抗体としては、具体的には抗 A po— AI蛋白質抗体、抗 Apo—AI I蛋白質抗体、抗 Apo— AI V蛋白質抗体、抗 Ap o— B— 100蛋白質抗体、抗 Ap o—B— 48蛋白質抗体、抗 Apo — CI蛋白質抗体、抗 Apo— CI I蛋白質抗体、抗 Apo— CI I I蛋白質抗体、抗 Apo— D蛋白質抗体、抗 Ap o— E蛋白質抗体等があげられる。

例えば、変性リポ蛋白質として、変性 LDLを検出または定量する場合、使用する抗アポ蛋白質抗体としては、抗 Apo-B蛋白質抗体があげられる。変性 VLD Lを検出または定量する場合、使用する抗アポ蛋白質抗体としては、抗 Apo—E 蛋白質抗体があげられる。変性 HDLを検出または定量する場合、使用する抗アポ蛋白質抗体としては、抗 Apo— AI蛋白質抗体があげられる。変性 Lp (a)を検出または定量する場合、使用する抗アポ蛋白質抗体としては、抗アポプロテイン (a)抗体があげられる。

以上のように、特定のリポ蛋白質に対する抗体を用いることで、特定の種類の変性リポ蛋白質を定量または検出することができる。また、本方法は特定の変性リポ蛋白質のみを定量または検出できるだけではなく、いくつかの抗アポ蛋白質抗体を組み合わせることにより、 2種類以上の変性リポ蛋白質を同時に定量または検出することができる。

具体的には、 HDLに対する抗体、すなわち抗 Ap 0— A I蛋白質抗体と LDL に対する抗体、すなわち抗 Ap o—B蛋白質抗体とを用いることにより、変性 HD Lと変性 LD Lとを定量または検出することができる。

また、各種変性リポ蛋白質の定量方法としては、予め生体試料を ¾心分離処理等で精製し、精製試料にホスホコリンに対する抗体を反応させることにより、特定の種類の変性リポ蛋白質を定量または検出することもできる。

生体試料から遠心分離で LDLを精製する方法としては、正常ヒト血清に、ェチレンジアミン四酢酸ナトリウム（EDTA- 2Na) と、 NaBrとを用いた密度勾配遠心分離法を行い、 LD L画分を取得する方法（特開平 7— 238098号公報）、へパリン採血で得られたヒト血漿に ED T Aを添加して、遠心分離した後、さらに K B r溶液を添加して遠心分離して L D L画分を取得する方法（特開平 8— 304395号公報）、ヒト血漿から超遠心分離法で LDLを回収する方法（特開平 9— 288106号公報）などがあげられる。

また、生体試料から遠心分離で Lp (a)を精製する方法としては、へパリン採血で得たヒト血漿に EDTAを加え、 EDTA含有 NaC 1を重層して遠心分離したのち、 KB rを加えて遠心分離し、得られた溶液をゲル濾過、リジンセファロース 4Bに通塔し Lp (a)を分画する方法（特開平 8— 304395号公報）などがあげられる。

また、遠心分離で HDLを精製する方法としては、ヒト血清に、四酢酸ナトリウム（EDTA-2Na)、 NaClをそれそれ加え、溶媒密度を 1. 063とした溶液を用いて遠心分離して得られた溶液に、 NaB rを加えて溶媒密度を 1. 21 とした溶液を用いて遠心分離して HDL分画を取得する方法 [山村卓、新生化学実験講座脂質 I、 195(1993)、東京化学同人] などがあげられる。

さらに本発明の測定方法では、抗リポ蛋白質抗体の代わりに、例えばアポ蛋白質のレセプ夕一、アポ蛋白質結合蛋白質などを用いることができる。具体的には、 A p o -A Iを認識するレシチン ·コレステロール ·ァシルトランスフェラ一ゼ、 A po-B-100を認識する肝臓、小腸の細胞の LDLリセプ夕一、 Ap o— C I Iを認識するリポプロテインリパ一ゼ、 A p o— Eを認識する肝臓の Eレセプ夕一等があげられる。

以下に、具体例として、抗ホスホコリン抗体と抗アポ B蛋白質抗体を用いるィムノアヅセィ法について説明する。

96ウェルマイク口プレート等の固相に抗ホスホコリン抗体を緩衝液で希釈した溶液を添加し、低温で例えば 1〜24時間インキュベートしたのち溶液を捨て、 «(w/v)程度の BSAを含む Tris- HC1 (ρΗδ.Ο)等の緩衝液を加えて室温で例えば 1〜 12時間インキュベートすることによりブロッキングした後、 0.05%(v/v)Tween20 等の界面活性剤を含む PBS(pH7.4)等で洗浄し抗ホスホコリン抗体結合固相を作成する。

次に、血漿等の生体試料を 1%BSA、 5 ポリエーテル、 140腿 ol/L NaClを含む lOmmol/Lリン酸緩衝液 (pH7.4)等の検体希釈液で希釈しゥェルに添加し、室温で 1 〜 12時間ィンキュベートした後、 0.05(v/v)%Tween20を含む PBS(pH7.4)等で洗浄する。

さらに、各ゥエルに l%(w/v)BSAを含む PBS(pH7.4)で希釈されたペルォキシダーゼ等で標識した抗ヒトアポ B蛋白質抗体を二次抗体として加えて、室温で 10〜60 分間インキュベートする。次に、 0.05(v/v)%Tween20を含む PBS(pH7.4)等で洗浄した後、標識を測定する。予め既知濃度の標準物質を用いて得られる検量線から、検体中の変性 LD Lの定量を行うことができる。パーォキシダ一ゼの検出は例えば、 3, 3，， 5, 5，-テトラメチルペンジジン（TMBZ)液を用いることができる。

本アツセィにより、変性 L D Lを定量することができる。

本発明は、生体試料とホスホコリンに対する抗体とを接触させ、生じる免疫複合体を定量することを特徴とする循環器系疾患の検出方法に関する。

循環器系疾患としては、心筋梗塞や狭心症などの冠動脈系疾患、脳梗塞や脳血管系痴呆などの脳動脈系疾患、腎症ゃ糖尿病性腎症などの腎動脈系疾患および末梢動脈閉塞症のような末梢動脈系疾患などの各種循環器系疾患があげられる。

本発明では、変性リポ蛋白質の定量値、即ち生体試料中の変性リポ蛋白質を抗ホスホコリン抗体、または抗ホスホコリン抗体とリポ蛋白質に対する抗体とを用いて変性リポ蛋白質を定量することにより、循環器系疾患を検出することができる。上記の定量で用いられるリポ蛋白質に対する抗体としては、変性リポ蛋白質を構成するアポ蛋白質に対する抗体があげられ、例えば、変性 L D Lを構成する A p o -B蛋白質に対する抗体、変性 V L D Lを構成する A p o _ E蛋白質に対する抗体、変性 H D Lを構成する A p o—A I蛋白質に対する抗体、変性 L p ( a ) を構成するアポプロテイン（a ) に対する抗体があげられる。これらの抗体を組み合わせて用いることにより、各種変性リポ蛋白質を定量することが可能となり、循環器系疾患を検出することができる。

循環器系疾患患者の生体試料中に含まれる変性リポ蛋白質濃度は、健常人の生体試料中に含まれる変性リポ蛋白質に比べて有意に上昇している。したがって、変性リポ蛋白質に力ットオフ値を設けて、採取した生体試料中の変性リポ蛋白質を定量し、変性リポ蛋白質が力ットオフ値より高い場合に循環器系疾患であると検出することができる。

健常者の変性リポ蛋白質の値は、予め循環器系疾患でないことを臨床的に確認された健常者から生体試料を採取し、該生体試料中の変性リポ蛋白質を本発明の変性リポ蛋白質の定量方法で定量することにより得ることができる。

臨床的に各種循環器系疾患を確認する方法は特に制限がないが、例えば冠動脈造影法、負荷心電図および心ェコ一等の機器診断方法、胸痛症状等の自覚症状等から確認する方法等があげられる。

カツトオフ値とは、ある物質に着目して目的とする疾患群と非疾患群とを判定する場合に定める値をいう。目的とする疾患と非疾患とを判定する場合に、カツトォフ値以下であれば陰性、カツトオフ値以上であれば陽性として、またははカヅトォフ値以下であれば陽性、力ットオフ値以上であれば陰性として疾患を判定することができる（金井正光編、臨床検査法提要金原出版株式会社)。

力ットオフ値の臨床的有用性を評価する目的で用いられる指標としては、感度と特異度があげられる。

ある母集団をカツトオフ値を用いて判定し、疾病患者のうち、判定で陽性とされたものを a (真陽性)、疾病患者でありながら判定で陰性とされたものを b (偽陰性)、疾病患者でないにも関わらず判定で陽性とされたものを C (偽陽性)、疾病患者でなく判定で陰性とされたものを d (真陰性）と表したときに、 aZ (a + b) で表される値を感度（真陽性率)、 d/ (c + d) で表される値を特異度（真陰性率）として表すことができる。

目的とする疾患群と非疾患群との測定値の分布は通常、一部重複する。したがつて、カツトオフ値を上下させることにより、感度と特異度は変化する。カットオフ値を下げることにより感度は高くなるが、特異度は低下し、カツトオフ値を上げることにより感度は低くなるが、特異度は上がる。判定方法としては、感度と特異度の両者の値が高いほうが好ましい。また、感度と特異度の値が 0. 5を超えない判定方法は、有用とは認められない。

カツトオフ値を設定する方法としては、非疾患群の分布の 95%を含む、中央からの両端のいずれかの値をカツトオフ値として設定する方法、非疾患群の分布が正規分布を示す場合、平均値 +2倍の標準偏差（SD)または平均値一 2 SDをカヅトオフ値として設定する方法などがあげられる。

生体試料としては、血液、尿、髄液、穿刺液などいかなるものでもよいが、好ましくは血液があげられる。血液としては、全血、血漿、血清、血球溶血液、血球内液などがあげられるが、好ましくは血清または血漿があげられる。

本発明の変性リポ蛋白質の定量用試薬および循環器系疾患の検出方法に用いる試薬としては、抗ホスホコリン抗体を含有する試薬があげられる。さらにリポ蛋白質に対する抗体、例えば、抗アポ蛋白質抗体を含有していてもよく、抗ホスホコリン抗体およびリポ蛋白質に対する抗体を含有する試薬は、各種変性リポ蛋白質を分別定量または検出が可能である。また、抗ホスホコリン抗体または抗アポ蛋白質抗体が、標識物質を結合した抗体であってもよい。

抗ホスホコリン抗体としては、ホスホコリンに反応する性質を有すれば上記のいずれの抗体でもよい。具体的には、 T-15抗体「J. Exp. Med., 132, 737 (1970)、ノ、ィプリド一マ KTM-285 (FERM BP-7589) により生産されたモノクローナル抗体 KTM-285、形質転換細胞 KTM-2001 (FERM BP-7549) により生産された遺伝子組換え抗体 KTM-2001などがあげられる。

リポ蛋白質に対する抗体としては、各種アポ蛋白質例えば Apo— AI、 Apo -Al ls Apo— AIV、 Ap o -B- 100s Apo— B— 48、 Apo— C I、 Apo— CI I、 Ap o-C I I I Apo— D、 Apo— E等に対する抗体があげられる。

本発明のキットとしては、機器または試薬の組み合わせにより構成されるが、以下に述べる各構成要素と本質的に同一、またはその一部と本質的に同一な物質が含まれていれば、構成または形態が異なっていても、本発明のキットに包含される。試薬としては抗ホスホコリン抗体、または抗ホスホコリン抗体および抗リポ蛋白質抗体を含み、また、必要に応じ、生体試料の希釈液、抗体固定ィ匕固相、反応緩衝液、洗浄液、標識された二次抗体またはその抗体断片、標識体の検出用試薬、変性リポ蛋白質などの標準物質なども含まれる。また、抗ホスホコリン抗体または抗リポ蛋白質抗体が、標識物質を結合した抗体であってもよい。

生体試料の希釈液としては、界面活性剤、緩衝剤などに B S Aやカゼインなどの蛋白質を含む水溶液などがあげられる。

抗体固定化固相としては、各種高分子素材を用途に合うように整形した素材に、抗ホスホコリン抗体あるいは抗リポ蛋白質抗体またはそれらの抗体断片を固相化したものが用いられる。形状としてはチューブ、ビーズ、プレート、ラテックスなどの微粒子、スティック等が、素材としてはポリスチレン、ポリカーボネート、ポリビニルトルエン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリメタクリレート、ゼラチン、ァガロース、セルロース、ポリエチレンテレフ夕レート等の高分子素材、ガラス、セラミックスや金属等があげられる。抗体の固相化の方法としては物理的方法と化学的方法またはこれらの併用方法等、公知の方法により調製することができる。例えば、ポリスチレン製 9 6ゥエルの免疫測定用マイク口夕一プレートに抗体または抗体断片等を疎水固相化したものがあげられる。反応緩衝液は、抗体固定化固相の抗体と生体試料中の抗原とが結合反応をする際の溶媒環境を提供するものであればいかなるものでもよいが、界面活性剤、緩衝剤、 B S Aやカゼインなどの蛋白質、防腐剤、安定化剤、反応促進剤等があげられる。標識された二次抗体またはその抗体断片としては、本発明に用いられる抗体または抗体断片に西洋ヮサビペルォキシダ一ゼ (鮮)ヽゥシ小腸アルカリホスファタ一ゼ、一ガラクトシダ一ゼなどの標識用酵素をラベルしたもの、緩衝剤、 B S Aやカゼインなどの蛋白質、防腐剤などを混合したものが用いられる。

標識体の検出用試薬としては前記の標識用酵素に応じて、例えば西洋ヮサビペルォキシダーゼであれば、テトラメチルベンジジンやオルトフエ二レンジァミンなどの吸光測定用基質、ヒドロキシフエニルプロピオン酸ゃヒドロキシフヱニル酢酸などの蛍光基質、ルミノールなどの発光基質が、アルカリホスファターゼであれば、 4—ニトロフエニルフォスフェートなどの吸光度測定用基質、 4—メチルゥンベリフェリルフォスフェートなどの蛍光基質等があげられる。

標準物質としては、超遠心分離法によりリポ蛋白質を単離 '精製し、これを銅ィオン等の金属イオンで酸化させる、無水酢酸と反応させてァセチル化する、あるいは、マロンジアルデヒド等と反応させるなどの方法等の方法により得られた変性リポ蛋白質、凍結融解して凝集した変性リポ蛋白質、物理的振動を与えて変性させた変性リポ蛋白質等があげられる。

生体試料中の変性リポ蛋白質の定量は、生体試料を採取後直ちに行うのが好ましいが、保存した生体試料を用いることもできる。生体試料の保存方法としては、変性リポ蛋白質の量が変化しない条件で有れば特に制琅は無いが、例えば 0〜 1 0 °c の凍結しない程度の低温条件、暗所条件および無振動条件下が好ましい。また、本発明で使用する生体試料としては凍結保存されたものであってもよい。生体試料を凍結するに際しては、以下にあげる凍結保護剤を共存させて凍結を行うのが好ましい。

凍結保存剤としては、例えばシュ一クロース、トレハロース、ラクト一ス、マン二トール、グルコースなどの糖類、デキストラン、デキストラン硫酸、プルラン、ポリエチレングリコ一ル、カルボキシメチルセルロースなどの高分子物質、グリセロールやジメチルスルフォキサイドなどの水溶性有機溶媒があげられる。これらの物質は生体試料中に例えば 0 . 1〜 5 0 %、好ましくは 1〜 3 0 %、さらに好ましくは 5〜 2 0 %で共存させて使用する。

凍結は、溶媒温度を氷結点以下にして行うが、温度降下は過冷却開始温度から過冷却温度まで急速冷却し、凝固潜熱を一気に回収することが望ましく、プログラムフリーザ一を使用することが好ましい。例えば冷却開始温度である 1 0 °Cまで冷却した後、この温度から過冷却開始温度である— 5〜一 1 0 °C付近まで— 1 °CZ分の速度で冷却し、この温度より過冷却温度である— 4 0 °Cまで急激に冷却する。この後必要に応じて— 1 8 °Cの自然昇温保持温度まで急速に昇温させ、以後目標到達温度まで— 1 °C/分で冷却する。また自然昇温温度にすることなく過冷却温度である一 4 0 °Cから目標到達温度まで— 1 °C/分で冷却してもよい。凍結温度降下速度は、 — 0 . 1 °C/分以上が好ましく、 — 1 . 0 °CZ分以上がより好ましい。到達温度は、 — 2 0 °C以下が好ましく、一 3 0 °C以下がより好ましく、液体窒素で達成できる一 1 9 6 °Cが特に好ましい。

凍結保存された生体試料中の変性リポ蛋白質を測定する際に、解凍試料の解凍方法は特に制限は無いが、例えば振動を加えながら水浴、湯浴する方法等があげられる。 '

したがって、本発明の変性リポ蛋白質の定量用試薬およびキット、循環器系疾患の検出試薬またはキットには、上記の凍結保護剤を含めてもよい。

以下に、本発明に用いるモノクローナル抗体の製造方法の一例を詳細に説明する

1 . モノクローナル抗体の製造方法

( 1 )抗原の調製

抗原としては、ホスホコリンを直接免疫抗原として用いてもよいが、ホスホコリンを他の高分子と結合させたものを免疫抗原として用いるのが好ましい。高分子としては、牛血清アルブミン、蛋白質、多糖体、核酸、合成高分子等があげられるが、例えばリポ蛋白質が好ましい。また、ホスホコリンは、ホスホコリンを含む化合物、例えばホスホコリン誘導体の形態が好ましい。ホスホコリン誘導体としては、ホスホコリン基がェピトープとして認識される誘導体で有れば特に制限はないが、例えば 1—パルミトイル一 2— ( 9—ォキソノナノィル）一グリセ口一 3—ホスホコリンゃ 1—パルミトイルー 2 - ( 5一ォキソパレロイル)ーグリセロー 3一ホスホコリンがあげられる。これらホスホコリン誘導体は、文献 [J. Biol. Chem. , 266(17), 11095 (1991)]に記載の方法により調製される。

また高分子としてのリポ蛋白質は、例えば L D L、 HD L、 V L D L、 I D Lなどがあげられるが、 L D Lが好ましい。 L D Lとしては特に制限はなく、例えばヒト、ゥマ、ゥシ、ゥサギ、ィヌ、ャギ、ヒヅジなど各種動物の血液、卵黄、ミルクなどに由来する L D Lがあげられ、ヒト血液由来の L D Lが好ましい。リポ蛋白質上にホスホコリン誘導体を結合させるには、リポ蛋白質溶液にホスホコリン誘導体を滴下混合する等両者をまぜあわせることにより行うことができる。

( 2 ) 動物の免疫と抗体生産細胞の調製

3〜2 0週令のマウス、ラヅト、ハムスター、ゥサギ、モルモット、ャギ、ヒヅジゃニヮトリに（1) で調製した抗原を免疫して、その動物の脾、リンパ節、末梢血中の抗体生産細胞を採取する。ポリクローナル抗体を作製する場合にはゥサギ、モルモット、ャギ、ヒヅジ、ニヮトリなどを用いるのが好ましく、モノクローナル抗体作製にはマウス、ラヅトを用いるのが好ましい。

免疫は、動物の皮下あるいは静脈内あるいは腹腔内に、適当なアジュバント〔例えば、フロインドの完全アジュバント（complete freund's adjuvant) や水酸化ァルミニゥムゲルと百日咳菌ワクチンなど〕とともに抗原を投与することにより行う _c 抗原が部分ペプチドである場合には、 B S A (ゥシ血清アルブミン）や K L H

(Keyhole Limpet Hemocyanin)などのキヤリア蛋白質とコンジュゲートを作製し、これを免疫原として用いる。

抗原の投与は、 1回目の投与の後 1〜 2週間おきに 3〜 1 0回行う。各投与後 3 〜 7日目に眼底静脈叢より採血し、その血清が抗原と反応することを酵素免疫測定法 (Antibodies - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988〕などで調べる。免疫に用いた抗原に対し、その血清が十分な抗体価を示したマウス、ラットまたはハムスターを抗体生産細胞の供給源として提供する。

ポリクローナル抗体の場合には、免疫を完成させた動物より、定期的に採血、または全採血により一回で血液を集める。通常血液は凝固防止を行わずに採血し、一旦血液を凝固させてから遠心分離などの方法を用いて血清画分を回収して用いる。血液中の抗体は必要に応じて精製して使用することができる。精製方法としては例えば硫酸アンモニゥムなどを用いた塩析分画法、イオン交換クロマトグラフィ一法、ゲル濾過カラムクロマトグラフィ法、プロティン Aやプロテイン Gを用いたァフィニティカラムクロマトグラフィ一法、および抗原を固相化したゲルを用いるァフィニティカラムクロマトグラフィ一法などがあげられ、これらの方法を単独または,組合せて用いることができる。

モノクローナル抗体作製に用いる抗体生産細胞の採取源としては免疫した動物の脾臓、リンノ、。節、末梢血液などがあげられる。また免疫を行っていない動物の脾臓、リンパ節、末梢血液等より抗体生産担当細胞を取り出し、これら細胞に対し直接免疫を行って抗体生産細胞とする所謂 in viim免疫 [新井、太田、実験医学、 6, 43 (1988)] を行った細胞を用いてもよい。

抗体生産細胞と骨髄腫細胞の融合に供するにあたって、抗原物質の最終投与後 3 〜7日目に、免疫したマウス、ラットまたはハムスターより脾臓を摘出し、脾細胞を採取する。脾臓を ME M培地（日水製薬社製）中で細断し、ピンセットでほぐし、遠心分離（1200rpm、 5分間）した後、上清を捨て、トリス一塩化アンモニゥム緩衝液（p H 7 . 6 5 )で 1〜2分間処理し赤血球を除去し、 ME M培地で 3回洗浄して融合用脾細胞として提供する。

( 3 ) 骨髄腫細胞の調製

骨髄腫細胞としては、マウスから得られた株ィ匕細胞を使用する。たとえば、 8— ァザグァニン耐性マウス（BALB/c由来）骨髄腫細胞株 P3-X63Ag8-m(P3-Ul ) [Current Topics in Microbiology and Immunology, IS, 1-7 (1978)]、 P3-NSl/l-Ag41 (NS-1) [European J. Immunology, £， 511-519 (1976)]、 SP2/0 -Agl4(SP-2) [Nature, m, 269-270 (1978)]、 P3-X63-Ag8653(653)[J. Immunology, m, 1548-1550 (1979)]、 P3-X63-Ag8(X63) [Nature, Ά 495-497 (1975)]などが用いられる。これらの細胞株は、 8—ァザグァニン培地〔R P M I - 1 6 4 0培地にグル夕ミン（1.5腿 oles/L)、 2—メルカプトエタノール（5xl0-⁵ moles/L)、ジェン夕マイシン（10〃g/mL)および牛胎児血清 (FCS)を加えた培地（以下、正常培地という。）に、さらに 8—ァザグァニン（15〃g/mL) を加えた培地〕で継代するが、細胞融合の 3〜4日前に正常培地に継代し、融合当日 2 X 1 0 ⁷個以上の細胞数を確保する。

( 4 )細胞融合

細胞融合は Kohlerと Milstein [Nature, , 495 (1975)] によって発明され、急速に発展し、様々に改良されてきた方法が用いられる。

( 2 )で免疫した抗体生産細胞と（3 )で得られた骨髄腫細胞を ME M培地または P B S (リン酸ニナトリウム 1.83g、リン酸一力リウム 0.21g、食塩 7.65g、蒸留水 1リヅトル、 PH7.Z) でよく洗浄し、細胞数が、抗体生産細胞：骨髄腫細胞 = 5 - 1 0 : 1になるよう混合し、遠心分離（l，200r>pm、 5分間）した後、上清を捨て、沈澱した細胞群をよくほぐした後、攪拌しながら、 37°Cで、ポリエチレングライコール— 1,000 (PEG-1, 000) 2g_s MEM2mlおよびジメチルスルホキシド 0.7mLの混液 0.2〜lmL/10⁸抗体生産細胞を加え、 l〜2分間每にMEM培地l〜2mLを数回カロえた後、 MEM培地を加えて全量が 50mLになるようにする。遠心分離（900rpm、 5 分間）後、上清を捨て、ゆるやかに細胞をほく、した後、メスピペットによる吸込み、吹出しでゆるやかに細胞を HA T培地〔正常培地にヒポキサンチン（10—⁴moles/L)、チミジン (1.5xlO-¾oles/L) およびアミノプテリン (4xl(T¾oles/L) を加えた培地〕 ΙΟΟτηΙ中に懸濁する。この懸濁液を 96穴培養用プレートに 100〃L/穴ずつ分注し、 5 C0₂インキュベータ一中、 37°Cで？〜 14日間培養する。

培養後、培養上清の一部をとり下記に述べる酵素免疫測定法などにより、ホスホコリンに反応し、ホスホコリンを含まない抗原に反応しないものを選択する。ついで、限界希釈法によりクロ一ニングを 2回繰り返し〔1回目は、 HT培地（HAT培地からアミノプテリンを除いた培地)、 2回目は、正常培地を使用する〕、安定して強い抗体価の認められたものを抗ホスホコリンモノクローナル抗体生産ハイプリド一マ株として選択する。酵素免疫測定法

抗原あるいは抗原を発現した細胞などを 96ゥエルプレートにコートし、ハイプリドーマ培養上清もしくは精製抗体を第一抗体として反応させる。

第一抗体反応後、プレートを洗浄して第二抗体を添加する。

第二抗体とは、第一抗体のィムノグロブリンを認識できる抗体を、ピオチン、酵素、化学発光物質あるいは放射線化合物等で標識した抗体である。具体的にはハイブリドーマ作製の際にマウスを用いたのであれば、第二抗体としては、マウスィムノグロブリンを認識できる抗体を用いる。

反応後、第二抗体を標識した物質に応じた反応を行なレ、、抗原に特異的に反応するモノクローナル抗体を生産するハイプリドーマとして選択する。

( 5 ) モノクローナル抗体の調製

プリスタン処理〔2，6, 10，14-テトラメチルペン夕デカン（Pristane) 0.5mlを腹腔内投与し、 2週間飼育する〕した 8〜1 0週令のマウスまたはヌードマウスに、

( 3 ) で得られた抗ヒト SCGFモノクローナル抗体生産ハイプリドーマ細胞 2χ10⁶ 〜5χ10⁷細胞 Z匹を腹腔内注射する。 10〜21 日でハイプリド一マは腹水癌化する。このマウスから腹水を採取し、遠心分離（3, 000rpm、 5分間）して固形分を除去後、 40〜50%硫酸アンモニゥムで塩析した後、力プリル酸沈殿法、 D E A E—セファロースカラム、プロティン A—カラムあるいはゲル濾過カラムによる精製を行ない、 IgGあるいは、 IgM画分を集め、精製モノクローナル抗体とする。

抗体のサブクラスの決定は、サブクラスタイピングキットを用いて酵素免疫測定法により行う。蛋白量の定量は、ローリー法および 280nmでの吸光度より算出する以上の方法で製造される本発明の方法に使用するモノクローナル抗体を生産するハイプリドーマの具体例としては、ハイプリドーマ K T M— 2 8 5があげられる。ハイプリドーマ K T M— 2 8 5は、平成 1 3年 5月 1 6日付で、日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 305-8566)独立行政法人産業技術総. 合研究所特許生物寄託センターに F E R M B P - 7 5 8 9として寄託されている。以下、ハイプリドーマ K T M— 2 8 5の生産するモノクローナル抗体を、単に K T M— 2 8 5抗体と称する。

2 . ヒト化抗体の製造方法

(1) ヒト化抗体発現用ベクターの構築

本発明の方法に用いられたモノクローナル抗体は、前記 1のモノクローナル抗体の製造方法に従って取得する以外に、上述の細胞から遺伝子工学的手法を用いて該抗体の重鎖（H鎖）および軽鎖（L鎖）をコードする cDNAを取得し、抗体発現用ベクターのプロモーターの下流に H鎖および L鎖をコードする cDNAを揷入した組換えベクターを造成し、それを宿主細胞に導入することにより得られた該抗体発現細胞を適当な培地中で培養するか、動物に投与して該細胞を腹水癌化させ、該培養液または腹水を分離精製することにより調製することができる。また、ハイプリド一マにより生産されたモノクローナル抗体が IgA型、 IgM型などの多量体である場合に、本項の方法を用いて抗体を生産すれば、 IgG型の抗体を取得することができる。

このような抗体発現用べクタ一は、適当な動物抗体の定常領域（C領域）である定常領域重鎖（CH)および定常領域軽鎖 (CL)をコードする遺伝子が組み込まれた動物細胞用発現べクタ一であり、動物細胞用発瑰ベクタ一に適当な動物抗体の CHおよび CLをコードする遺伝子をそれそれ挿入することにより構築される。動物抗体の C領域としては、例えばヒト抗体 H鎖では Cァ 1や Cァ 4、マウス抗体 H鎖では Cァ 1や Cァ 2 a、 Cァ 2b、 Cァ 3、ヒト抗体 L鎖では C 、マウス抗体 L鎖では C 等の任意の動物抗体の C領域を用いることができる。抗体の C領域をコードする遺伝子としてはェキソンとイントロンよりなる染色体 DNAを用いることができ、また、 cDNAを用いることもできる。動物細胞用発現ベクターとしては、抗体 C領域をコードする遺伝子を組込み発現できるものであればいかなるものでも用いることができる。

該ベクタ—としては例えば、 pAGE 107 [Cytotechnology, ， 133 (1990) ] , pAGE 103 [J. Biochem, 101， 1307 (1987)]、 pHSG274 [Gene, 21, 223 (1984)]、 pKCR [Proc. Natl. Acad. Sci., IS, 1527 (1981)]、 pSG 1 d2— 4 [Cytotechnology, 4， 173 (1990)]等があげられる。動物は発現用ベクターに用いるプロモ一夕一とェンハンサ一としては、 S V40の初期プロモー夕一とェンハンサ一 [J. Biochem, 101, 1307 (1987)]、モロニ一マウス白血病ゥィルスの L TRプロモーターとェンハンサ一 [Biochen. Biophys. Res. Comun., 1 , 960 (1987)]、および免疫グロブリン H鎖のプロモ一夕一 [Cell， , 479 (1985) ]、ェンハンサ一 [Cell, , 717 (1983)]等があげられる。

発現用べクタ一は、抗体 H鎖、 L鎖が別々のベクター上に存在するタイプあるいは同一ベクター上に存在するタイプ（タンデム型）のどちらでも用いることができるが、発現ベクターの構築のし易さ、動物細胞への導入のし易さ、動物細胞内での抗体 H鎖および L鎖の発現量のバランスが取れる点でタンデム型の発現用ベクターの方が好ましい [J. Iimunol. Methods, 161, 271 (1994)] 。タンデム型のヒト化抗体発現用ぺク夕一としては、 PKANTEX93 (W097/10354)、 pEE18 (Hybridoma, II, 559-567, 1998) などがあげられる。

構築したヒト化抗体発現用べクタ一は、ヒト型キメラ抗体およびヒト型 CDII移植抗体の動物細胞での発現に使用できる。

( 2 ) 抗体の可変領域をコードする DNAの取得

抗体、例えばマウス抗ホスホコリン抗体の可変領域重鎖（VH)および可変領域軽鎖 (VL) をコードする cDNAは以下のようにして取得する。自然抗体であるマウス抗ホスホコリン抗体を生産する細胞、例えばマウス末梢血細胞あるいはマウス脾臓細胞等より、常法 [モレキュラー'クローニング第 2版（Molecular Cloning 2nd edition, Gold Spring Harbor Lab. Press New York(1989)；以下モレキユラ ― ·クロ一ニング第 2版と略す） ^カレント 'プロトコ一ルズ 'イン 'モレキュラ一 ·バイオロジー、サプルメント 1〜38 (Current Protocols in Molecular Biology Supplement 1-38；以下カレント ·プロトコ一ルズど略す） ] により cD N Aライブラリ一を作製する。

cDNAライブラリ一作製法としては、モレキュラー 'クロ一ニング第 2版 (1989年）、カレント 'プロトコ一ルズ 'イン 'モレキュラー ·バイオロジー（1987 年)および靈 Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University Press (1995)等に記載された方法、あるいは市販のキット、例えばス一パースクリプト ·プラスミド ·システム 'フォー' cDNA ·シンセシス •アンド 'プラスミド 'クロ一ニング [Superscript Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning； Gibco BRL社製] やザヅプ— c DNA ·シンセシス ·キット [ZAP- cDNA Synthesis Kit、ストラタジーン社製] を用いる方法などがあげられる。更に市販の c D N Aライブラリー、例えば宝酒造社製のマゥス脾臓細胞 cDNAライブラリー等を利用することもできる。

cDNAライブラリーを作成するためのクロ一ニングベクタ一としては、大腸菌 K 12株中で自立複製できるものであればファージベクター、プラスミヅドベクタ —等いずれでも使用できる。具体的には、 ZAP Express[Stratagene社製、 Strategies, 丘， 58 (1992)]、 pBluescript II SK ( + ) [Nucleic Acids Research, 11, 9494 (1989) ]、え zap II(Stratagene社製)、え gtlO、 Agtll [DNA Cloning, A Practical Approach, 1, 49 (1985)]、 λ TriplEx (クロ一ンテック社製）、え Bl eMid (クローンテツク社製）、え ExCell (フアルマシア社製）、 pT7T318U (フアルマシア社製)、 pcD2 [Mol. Cell. Biol., 280 (1983)]、 pUC18 [Gene, 103 (1985)] 等をあげることができる。

c DNAを組み込んだベクタ一を導入する大腸菌としては、大腸菌に属する微生物であればいずれでも用いることができる。具体的には、 Escherichia coli XLl-Blue MRF' [Stratagene社製、 Strategies, 5, 81 (1992)]、 Escherichia coll C600 [Genetics_N , 440 (1954)3、 Escherichia coli Y1088 [Science, WL, 778 (1983)]、 Escherichia coli Y1090 [Science, 778 (1983)]、 Escherichia coli NM522 [J. Mol. Biol., 166, 1 (1983)]、 Escherichia coli K8Q2 [J. Mol. Biol., 16, 118 (1966)]、 Escherichia coli JM105 [Gene, 275 (1985)]等を用いることができる。 cDN Aを上述クロ一ニングベクタ一に組み込み、該クローニングベクターを宿主細胞に導入することにより c D N Aライブラリ一を作製する。該ク口一ニングべク夕一がプラスミドの場合には、エレクトロボレ一シヨン法あるいはカルシウムクロライド法等により宿主細胞に導入する。該クローニングベクターがファージの場合には、インビトロパッケージング法等により宿主細胞に導入する。上述で取得された c D N Aライブラリーから、マウス抗ホスホコリン抗体の V H ならびに VLをコードする DNAを含む形質転換株については、例えば文献 [Proc . Natl. Acad. Sci. USA, ΊΆ , 2109 (1985)] に掲載されたマウス抗ホスホコリン抗体の VHならびに VLをコードする DNAの塩基配列を基にプローブを作製して、蛍光物質、放射線、酵素等で該プローブをラベル化し、プラークハイブリダィゼ一シヨン、コロ二一ハイブリダイゼ一シ 3ン、サザンハイプリダイゼーション等を行うことにより該プローブにハイプリダイズする形質転換株を選択することができる。

プローブは具体的には、配列番号 1に示される VHの塩基配列および配列番号 2 に示される VLの塩基配列の全部あるいは一部を有する DN Aがあげられる。

V Hをコードする D N Aは、例えば配列番号 3に示される塩基配列を有する合成 DNAをセンスプライマ一および配列番号 4に示される塩基配列を有する合成 D N Aをアンチセンスプライマーとして、マウス脾臓細胞 cDN Aライブラリーを錶型にしてポリメラ一ゼ 'チェイン ' リアクション（Polymerase Chain Reaction；以下 PCRと記す）により増幅することで取得できる。同様に VLをコードする DN Aは、配列番号 5に示される塩基配列を有する合成 DN Aをセンスプライマーおよび配列番号 6に示される塩基配列を有する合成 DN Aをアンチセンスプライマ一として、マウス脾臓細胞 c D N Aライブラリ一を錄型にして PCRにより増幅することで取得できる。また P C Rを利用することで V H並びに V Lの全配列を含む D NAを取得する事もできる。

上述で取得されたマウス抗ホスホコリン抗体の VHならびに VLをコードする D N Aの全塩基配列を決定し、塩基配列より VHおよび VLの全ァミノ酸配列を推定する。

(3) ヒト型キメラ抗体発現べクタ一の構築

前記で構築した抗体発現べクタ一の抗体 C Hおよび C Lをコードする遺伝子の上流にマウス抗ホスホコリン抗体の VHならびに VLをコードする cDNAを揷入し、発現ベクターを構築することができる。例えば、発現ぺク夕一の抗体の CH および CLをコードする遺伝子の上流にあらかじめマウス抗ホスホコリン抗体の VHならびに VLをコードする cDN Aをクローニングするための制限酵素の認識配列を設けておき、このクローニングサイトにマウス抗ホスホコリン抗体の VH ならびに VLをコードする cDNAを下記に述べる合成 DNAを介して挿入することにより、発現べクタ一を製造することができる。合成 DNAは、マウス抗ホスホコリン抗体の V領域の 3 '末端側の塩基配列と、発現べクタ一上の抗体の C領域の 5⁵末端側の塩基配列とからなるものであり両端に適当な制限酵素部位を有するように DN A合成機を用いて製造する。

(4) ヒト化抗体の発現

前記の発現べクタ一を適当な宿主細胞に導入することにより抗ホスホコリン抗体を安定に生産する形質転換株を得ることができる。宿主細胞への発現ベクターの導入方法としては、エレクト口ポレーシヨン法 [特開平 2— 257891号公報， Cytotechnology, 3, 133 (1990)]等があげられる。発現ベクターを導入する宿主細胞としては、抗体を発現させることができる宿主細胞であればいかなる細胞でも用いることができる。例えば、マウス SP 2/0— A g細胞（ATCCCRL1581)、マウス P3X63_Ag8. 653細胞 (ATCC CRL1580)、ジヒド口葉酸還元酵素遺伝子（以下、 DHFR遺伝子と称す）が欠損した CH0細胞 [Proc. Natl. Acad. Sci., TL, 4216 (1980)]、ラヅト YB2Z3HL. P 2. Gi l. 16 Ag. 20細胞

(ATCC CRL1662, 以下 YB2/0細胞と称す）等があげられる。

ベクターの導入後、抗体を安定に生産する形質転換株は、特開平 2— 25789 1号公報に開示されている方法に従い、 G418および FCSを含む RPMI 16 40培地により選択する。得られた形質転換株を培地中で培養することで培養液中に組換え抗体を生産蓄積させることができる。また、形質転換株は特開平 2— 25 7891に開示されている方法に従い、 DHFR遺伝子増幅系等を利用して組換え抗体の生産量を上昇させることができる。

抗体は、形質転換株の培養上清よりプロテイン Aカラムを用いて精製することができる (アンチボディズ、第 8章）。また、その他に通常の蛋白質に用いられる精製方法を使用することができる。例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィ —および限外濾過等を組み合わせて精製することができる。精製した組換え抗体の H鎖、 L鎖あるいは抗体分子全体の分子量は、ポリアクリルアミド電気泳動（SD S-PAGE) [Nature, 221, 680 (1970)]やウエスタンブロッテイング法（ァンチボディズ第 12章）等で測定する。

本発明の方法に使用する抗体を生産する抗体生産細胞の具体例としては、例えば抗体生産細胞 KTM— 2001があげられる。抗体生産細胞 KTM— 2001は、平成 13年 4月.18日付で、日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6 ( 郵便番号 305- 8566)独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託セン夕一に FE RM BP— 7549として寄託されている。抗体生産細胞 KTM— 2001の生産する抗体を、以下、単に KTM— 2001抗体と称する。のな ^

第 1図組換えプラスミド pB SP CVHの構造を示す。

組換えプラスミド p B S P C V Lの構造を示す。発現ベクター PKANTEX93の構造を示す。

第 4図プラスミド pBSVH— 2の構造を示す。

プラスミド pB S VL— 2の構造を示す。

プラスミド pKANTEXP CVHの構造を示す

第 7図プラスミド pKANTEXPChCァ 1の構造を示す。

第 8図健常者ならびに冠動脈硬化疾患患者の血漿、さらにコントロールとして検体希釈液を 5段階希釈し、測定した結果を示す。 —き—は、動脈硬化患者の血漿、 —▲—は、健常人の血漿および—〇—は、検体希釈液のみの結果をそれそれ示す。

第 9図健常者ならびに冠動脈狭窄疾患患者の血漿中の変性リポ蛋白質の測定値を ζρ;す。

第 10図健常者ならびに狭心症患者の血漿中の変性リポ蛋白質の測定値を示す。

第 Π図健常者ならびに心筋梗塞患者の血漿中の変性リポ蛋白質の測定値を示す。

第 12図健常者ならびに冠動脈硬化疾患患者の血漿由来のリポ蛋白質に種々物理的変性を加えて測定した結果を示す。一〇—は、健常人の血漿、 —秦一は、患者の血漿について測定した結果をそれそれ示す。

第 13図健常者のリポ蛋白質にリポプロティンリパーゼを作用させて酵素的変性を加えて測定した結果を示す。

第 14図精製リポ蛋白質に変性を加えて、 ΚΤΜ— 285抗体および ΚΤΜ— 2001抗体との反応性を測定した結果を示す。

第 15図精製リポ蛋白質に変性を加えて、 ΚΤΜ— 285抗体との反応性を測定した結果を示す。以下に本発明を実施例により具体的に説明する。ただし、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。昍》赛施するめの暴 ϋの形熊

実施例 1 抗ホスホコリン抗体の製造（丁1^—2001抗体）

( 1 ) マウス抗ホスホコリン抗体遺伝子の取得

1) マウス脾臓細胞 cDNAライブラリ一の作製

通常に飼育した B a 1 b/cマウスを脱血死させた後、開腹手術を施して脾臓を摘出した。脾臓を RPMI 1640培地（日水製薬社製）中で、裁断し、ビンセヅトでほぐし、遠心分離（1200r.p.m.、 5分間）した後、上清を捨て、トリス一塩ィ匕アンモニゥム緩衝液（PH 7.65) で 1〜2分間処理し赤血球を除去し、 RPMI1640培地で 3回、さらに生理食塩水で 3回洗浄し、 mRNAの抽出に用いた。 mRNA抽出キヅトである Quick Prep. mRNA purification kit (商品番号 27- 9254- 01、アマシャム■フアルマシア社製) を用い、キットに添付の使用説明書に従って、上記脾臓細胞 5.0x10 '個より mRNAを取得した。

mRNA5 zgから、 cDNA Synthesis Kit (商品番号 27 - 9260- 01、フアルマシア社製) を用い、キットに添付の使用説明書に従って、両端に Eco BJ- Not Iアダプターを有する c D N Aを合成した。作製したそれそれの c D NA約 6〃 gを 10 Lの滅菌水に溶解後、ァガロースゲル電気泳動にて分画し、抗体の H鎖に対応する約 1.8kbp の c D NA断片と L鎖に対応する約 l. Okbpの c D NA断片をそれそれ約 0.1〃L回収した。次に、各々 H鎖に対応する約 1.8kbpの c D NA断片 0.1〃Lおよび L鎖に対応する約 l. Okbpの c D NA断片 0.1〃Lと、 Lambda ΖΑΡΠベクター [Lambda ZAPII ベクタ一を Eco RIで切断後、ゥシ腸アルカリフォスファターゼ（Calflntestine Alkaline Phosphataseで）処理したもの：ストラ夕ジーン社製] 1〃Lを T4 リガ一ゼ緩衝液 11.5〃Lに溶解し、 T4 DNAリガ一ゼ 175単位を加えて、 12 にて2 4時間ィンキュベートし、さらに室温にて 2時間ィンキュぺ一トした。各々の反応液のうち 4〃Lを常法 [マニアテイス（Maniatis)ら編集、モレキュラー 'クロ一ニング (Molecular Cloning)、 2. 95、 Cold Spring Harbor Laboratoryl989刊行] に従い、ギガパックゴールド（ストラタジーン社製、商品番号 SC200201) を使用してラムダファ一ジにパヅケ一ジングし、これらを常法 [マニアテイス（Maniatis)ら編集、モレキュラー 'クロ一ニング (Molecular Cloning)、 Z, 95-107、 Cold SpringHarbor Laboratory 1989刊行] に従って、ギガパヅクゴ一ルドに付属の大腸菌株 XL1- Blue MRF， [バイオテクニクス（Biotechniques)、 376 (1987)] に感染させて、マウス脾臓細胞 c D NAライブラリ一としてファージクロ一ンを取得した。次にファージを常法に従い、ハイバンド N⁺フィル夕一（商品番号 RPN87B、アマシャム 'フアルマシァ社製)上に固定した [マニアテイス（Maniatis)ら編集、モレキュラー 'クローニング (Molecular Cloning) 、 Z, 112、 Cold Spring HarborLaboratory 1989刊行

] o

2 ) VH用プロ一ブ D NAの調製

配列番号 7および配列番号 8で表される塩基配列を有するプライマ一 12.5pmole、前記 1 ) で作製したマウス脾臓細胞 cDNA 10ng、および、 200 mol/Lデォキシヌクレオチド三リン酸を含む Ex Taq.ポリメラーゼ反応液（宝酒造社製）中に 1単位の Ex Taq.ポリメラ一ゼ (商品番号 RR001A、宝酒造社製）を加えて、 9 5 °Cで 5分間の前処理をした後に、 9 5 °Cで 2分間、 5 5 °Cで 2分間、 7 2 °Cで 2分間のポリメラーゼ ·チエイン ·リアクション（P C R) を 3 0回繰り返し、約 260bpの DNA断片を回収した。

PCR反応は全て GeneAmpPCR system 9700 (Perkin Elmer社製）を用いて行った。増幅断片は、下記 5に示した方法で配列を決定し、マウス抗ホスホコリン抗体 H鎖 cDNAの塩基配列（GENBA Kァクセッションナンバー M16334) と一致することを確認した。

3 ) V L用プロ一ブ DNAの調製

配列番号 9および配列番号 1 0で表される塩基配列を有するプライマー

12.5pmole、上記 1 )で作製したマウス脾臓細胞 cDNA 10ng、および、 200 zmol/Lデォキシヌクレオチド三リン酸を含む Ex Taq.ポリメラ一ゼ反応液（宝酒造社製）中に 1単位の Ex Taq.ポリメラ一ゼ（商品番号 RR001A、宝酒造社製）を加えて、 9 5 °Cで 5分間の前処理をした後に、 9 5 °Cで 2分間、 5 5 °Cで 2分間、 7 2 °Cで 2分間の PCR反応を 3 0回繰り返し、約 220bpの DNA断片を回収した。増幅断片は、下記 5に示した方法で配列を決定し、マウス抗ホスホコリン抗体 L鎖 c D NAの塩基配列（GENBA Kァクセッションナンバー U29423) と一致することを確認した。

4 ) マウス抗ホスホコリン抗体 c D NAのクローニング

前記 1 )で作製したマウス脾臓細胞 c D NAライブラリーを転写したメンプレンより、常法 [マニアテイス（Maniatis)ら編集、モレキュラー 'クロ一ニング (Molecular Cloning)、 2.108、 Cold Spring Harbor Laboratory 1989年刊行] に従い、前記 2 )および 3 )で作製したプローブを ECL Direct Labelling and detection Kit (商品番号 RPN3000、アマシャム 'フアルマシア社製）に添付のプロトコ一ルに従い標識したプローブに強く結合したファージクローンを選択した。次に、 cDNA合成キヅトである ZAP- cDNA Synthesis Kit (商品番号 SC200400、ストラ夕ジーン社製) を用いて、ファージクローンをプラスミド pBluescript SK (-)にサブクロ一ニンク" し、マウス抗ホスホ ±1リン抗体の H鎖 c D NAを含む組換えプラスミド pBSPCVH ( 第 1図）およびマウス抗ホスホコリン抗体の L鎖 c D N Aを含む組換えプラスミド pBSPCVL (第 2図）を取得した。 pBSPCVHおよび pBSPCVLを EcoRIで切断したところ、 pBSPCVHには約 1.8kbpの cDNA断片が、 pBSPCVLには約 1. Ikbpの cDNA断片がそれそれ揷入されていた。

( 2 ) H鎖 cDNAおよび L鎖 cDNAの可変領域の塩基配列

前記 4 ) で得られた H鎖 cDNAおよび L鎖 cDNAの可変領域の塩基配列を Dye

Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit (Perkin Elmer社製、商品番号 402123) を用いてダイデォキシ法 [マニアテイス（Maniatis)ら編集、モレキユラ一クロ一二ング (Molecular Cloning) _s 13.42 _N Cold Spring Harbor Laboratory 1989年刊行] により決定した。すべて 5，末端に開始コドン ATGと推定されるメチォニンが存在し、リーダー配列を含む完全長の cDNAであった。配列番号 1に VHの塩基配列、配列番号 2に VLの塩基配列をそれそれ示した。

( 3 ) 組換え抗体発現ベクターの構築

1 ) ヒト IgGl型組換え抗体発現べク夕一の構築

W097/10354に記載のヒト IgGl型キメラ化抗体発現べクタ一 PKANTEX93 (第 3図）に、上記 4 ) で得られた H鎖 cDNAおよび L鎖 cDNAの可変領域を下記の手順に従って、挿入した。 2 ) マウス抗ホスホコリン抗体 V H領域の揷入

マウス VH領域の cDNAをヒト定常領域と遺伝子工学的に融合させるために、配列番号 3および配列番号 4で表され ¾ 2種の合成 DNAの 25pmoleずつを 10腿 ol/L トリス一塩酸（PH7.5) 、 10腿 ol/L塩ィ匕マグネシウム、 1腿 ol/L DTTおよび 50顧 ol/L塩ィ匕ナトリウムからなる緩衝液に溶解し、 70°Cの水浴中で 10分間反応させた後、 . 徐冷することにより会合反応を行い、二本鎖合成 D N Aカセットを作製した。

一方、 H鎖全長 cDNAを含むプラスミド pBSPCVH l〃gを 30〃Lの 10扁 ol/L トリスー塩酸（pH7.5) 、 10雇 ol/L塩ィ匕マグネシウム、 1顧 ol/L DTTおよび 50醒 ol/L塩化ナトリゥムからなる緩衝液に溶解し、 10単位の PIと 10単位の SE£lを加えて 37°Cで 2時間消化反応を行った。該反応液をァガロースゲル電気泳動後、 cDNAの VH領域および Ap耐性遺伝子を含む約 3.4kbpの DNA断片を回収した。

上記で得られたプラスミド pBSPCVH由来の PI-≤E£l断片（3.4kbp) 0. 1〃gおよび二本鎖合成 DNAカセット（lOfmole) を滅菌水 9 Lに溶解し、 DNAライゲーシヨンキット ver.2 Solution I (商品番号 6022、宝酒造社製） 9〃Lを加え、 16°Cで 1時間結合反応を行った。このようにして得られた組換えプラスミド DNAを用いて大腸菌皿 5ひ株を形質転換し、第 4図に示したプラスミド pBSVH- 2を得た。

次に、上記で得られた pBSVH - 2 1〃gを 30〃Lの; 10腿 ol/L トリス—塩酸 (pH7.5) 、 10腿 ol/L塩化マグネシウム、 1讓 ol/L DTTからなる緩衝液に溶解し、 10単位の AESJ を加えて 37°Cで 2時間消化反応を行った。該反応液に終濃度が 50藤 ol/L トリス—塩酸（pH7.5) 、 10廳 ol/L塩化マグネシウム、 1腿 ol/L DTT, 100腿 ol/L塩化ナトリゥム 0.01° Triton X- 100および 0.01% BSAとなるように緩衝液 60〃Lを調製し、 10 単位の lを加えて 37°Cで 2時間消化反応を行った。該反応液をァガロースゲル電気泳動後、 VH領域の cDNAを含む約 0.5kbpの DNA断片を回収した。

一方、第 3図に示されるヒト型キメラ抗体発現ベクター pKANTEX93 l〃gを 30〃L の 10腿 ol/L トリス一塩酸 (pH7.5) 、 10雇 ol/L塩化マグネシウム、 1腿 ol/L DTT からなる緩衝液に溶解し、 10単位の AEalを加えて 37°Cで 2時間消化反応を行った。該反応液に終濃度が 50雇 ol/L トリス—塩酸 (pH7.5) 、 10匪 ol/L塩化マグネシゥム、 1腿 ol/L DTTヽ 100腿 ol/L塩化ナトリウム、 0.01% Triton X-100および 0.01% BSA となるように緩衝液 60 zLを調製し、 10単位の Moilを加えて 37°Cで 2時間消化反応を行った。該反応液をァガロースゲル電気泳動後、ヒトァ 1 H鎖定常領域 cDNA、ヒト κ L鎖定常領域 cMA、二力所のモロニ一マウス白血病ウィルスプロモ一夕一、二力所のスプライシングシグナル、デヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、および G418耐性遺伝子を含む約 13.2kbpの DNA断片を回収した。

上記で得られたブラスミド pBSVH- 2 (第 4図）由来の I- Eal断片（0.5kbp) 0.05 および PKA TEX93由来の MI- AEal断片（13.2kbp) 0. 1 zgを滅菌水 9〃Lに溶解し、 DNAライゲ一シヨンキヅト ver.2 Solution I (宝酒造社製） 9〃Lを加え、 16°Cで 1時間結合反応を行った。このようにして得られた,組換えプラスミド DNAを用いて大腸菌 DH5 株を形質転換し、第 6図に示したプラスミド pKANTEXPCVHを得た。 3 ) マウス抗ホスホコリン抗体 V L領域の揷入

マウス VL領域の cDNAをヒト定常領域と遺伝子工学的に融合させるために、配列番号 5および配列番号 6で表される 2種の合成 DNAの 25pmoleずつを 10顧 ol/L トリス —塩酸（PH7.5) 、 10腿 ol/L塩ィ匕マグネシウム、 1腿 ol/L DTTおよび 50腿 ol/L塩ィ匕ナトリゥムからなる緩衝液 10 Lに溶解し、 70°Cの水浴中で 10分間反応させた後、徐冷することにより会合反応を行い、二本鎖合成 DNAカセヅトを作製した。

一方、 L鎖全長 cDNAを含むプラスミド pBSPCVL 1 gを 30 iLの 50腿 ol/L トリス— 塩酸 (pH7.5) 、 10腿 ol/L塩化マグネシウム、 1顧 ol/L DTTおよび 100腿 ol/L塩ィ匕ナトリゥムからなる緩衝液に溶解し、 10単位の Ε£βΜと 10単位の Sfdを加えて 37°C で 2時間消化反応を行った。該反応液をァガロースゲル電気泳動後、 cDNAの VL領域を含む約 0.4kbpの DNA断片を回収した。

また、クロ一ニングベクタ一 pBluescript SK (-) (STRATAGENE社製） l〃gを 30 〃Lの 20腿 ol/L トリス一塩酸 (pH8.5) 、 10腿 ol/L塩ィ匕マグネシウム、 1腿 ol/L DTT および 100麗 ol/L塩化カリウムからなる緩衝液に溶解し、 10単位の ECQRIと 10単位の lを加えて 37°Cで 2時間消化反応を行つた。該反応液をァガ口ースゲル電気泳動後、クロ一ニングベクタ一 pBluescript SK (-)を含む約 2.9kbpの DNA断片を回収した。

上記で得られたプラスミド pBSPCVL由来の ECQRI- Sfiil断片（0.4kbp) 0. 1 ig, プラスミド pBluescript SK (-)由来の Eco M- Bam HI断片（2.9kbp) 0.1〃gおよび二本鎖合成 D NAカセヅト（lOfmole)を滅菌水 9〃Lに溶解し、 DNAライゲ一シヨンキッ hver.2 Solution I (商品番号 6022、宝酒造社製） 9〃Lを加え、 16°Cで 1時間結合反応を行った。このようにして得られた組換えプラスミド DNAを用いて大腸菌 DH5 ひ株を形質転換し、第 5図に示したプラスミド pBSVL- 2を得た。また、次に、上記で得られた pBSVL- 2 1 gを 30 zLの 50腿 ol/L トリス—塩酸 (pH7.5) 、 10腿 ol/L塩化マグネシウム、 1腿 ol/L DTT, 100腿 ol/L塩ィ匕ナトリウムからなる緩衝液に溶解し、 10単位の E£QRIと 10単位の WIを加えて 37°Cで 2時間消化反応を行った。該反応液をァガロースゲル電気泳動後、 VL領域の cDNAを含む約 3.4kbpの DNA断片を回収した

一方、上記（3 ) の 2 ) で得られた発現プラスミド pKANTEXPCVH l〃gを 50腿 ol/L トリスー塩酸 (pH7.5) 、 10腿 ol/L塩ィ匕マグネシウム、 1腿 ol/L DTTヽ 100腿 ol/L塩化ナトリゥムからなる緩衝液に溶解し、 10単位の ECQRIと 10単位の WIを加えて 37 °Cで 2時間消化反応を行った。該反応液をァガロースゲル電気泳動後、マウス抗ホスホコリン抗体 H鎖可変領域 cDNA、ヒトァ 1 H鎖定常領域 c D N A、ヒト L鎖定常領域 cDNA、二力所のモロニ一マウス白血病ウィルスプロモーター、二力所のスプライシングシグナル、デヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、および G418耐性遺伝子を含む約 13.7kbpの DNA断片を回収した。上記で得られた pBSPCVL由来の I- MWI断片（0.5kbp) 0.05〃gおよび pKA TEXPCVH由来の断片（13.7kbp) 0.1〃を滅菌水9〃1^こ溶解し、 DNAライゲーシヨンキット ver.2 Solution I (宝酒造社製） 9 zLを加え、 16°Cで 1時間結合反応を行った。このようにして得られた組換えプラスミド DNAを用いて大腸菌 DH5ひ株を形質転換し、第 7図に示したプラスミド pKANTEXPChCァ 1を得た。

( 4 ) 組換え抗ホスホコリン抗体発現べクタ一の発現

マウスキメラ化抗ホスホコリン抗体発現べクタ一の YB2/0細胞への導入は、 Miyajiらの方法に従い、エレクトロボレ一シヨン法 [サイトテクノロジ一

(Cytotechnology), 133 (1990)] にて行った。キメラ化抗ホスホコリン抗体発現ベクターの 4 zgを 4X 10⁶個の YB2/0細胞 (ATCC CRL1581)へ導入後、 40mlの

RPMI1640-FCS( 10) [FCS を 10%含む RPMI1640培地 (ギブコ社製) ] に懸濁し、 96 ウェルマイク口タイ夕一プレートに 200 /Lずつ分注した。（0₂ィンキュベ一夕一で 37°C、 24時間培養した後、 G418 (ギブコ社製）を 0.5mg/mlになるように添加して 1〜2 週間培養した。形質転換株のコ口ニーが出現し、コンフルェントになったゥエルより培養液を回収し、組換え抗体の発現量を以下に示す酵素免疫測定法 (ELISA法 )にて測定した。

( 5 ) 酵素免疫測定法（ELISA法）

1 ) 抗体活性測定用 ELISA

実施例 2 © ( 2 )で調製した PC9CH0- LDLコンジユゲートを PBSにて l〃g/mLに調製した。この溶液 50 /Lまたはこの溶液の希釈液 50 を 96ゥヱルマイクロタイ夕ープレート（ファルコン社製）の各ゥエルにそれそれ分注し、風乾後、 0.1% BSAを含む PBSでブロッキングを行った。これに形質転換株の培養上清、あるいは精製した組換え抗ホスホコリン抗体を 50〜100〃L加え、 1〜 2時間室温で反応させた。反応後、各ゥエルを PBSで洗浄後、ペルォキシダ一ゼ標識抗ヒトァ 1抗体（商品番号 A110P0D 、アメリカン力レックス社製）を 50〜； 100〃L加え、 1〜2時間室温で反応させた。 PBSで洗浄後、 ABTS基質液 [2，2' -アジノビス（3-ェチルベンゾチアゾリン- 6-スルホン酸）二アンモニゥムの 550mgを 0.1mol/L クェン酸緩衝液（pH4.2) に溶解し、使用直前に過酸化水素 Ι L/mLを加えた溶液]を 50〜100 L加えて発色させ、 415nm の吸光度を測定した。

2 ) 抗体量測定用 ELISA

抗ヒト L鎖抗体（ザィメヅド社製、商品番号 05-3900) 溶液の希釈液 50〃Lを 96 ウェルマイク口タイ夕一プレート (ファルコン社製)の各ゥエルにそれそれ分注し、風乾後、 0.1% BSAを含む PBSでブロッキングを行った。これに形質転換株の培養上清、あるいは精製した組換え抗ホスホコリン抗体を 50〜； 100〃L加え、 1〜2時間室温で反応させた。反応後、各ゥエルを PBSで洗浄後、ペルォキシダ一ゼ標識抗ヒトァ 1抗体（商品番号 A110P0D、ァメリカンカレックス社製) を 50〜； 100〃L加え、 1〜2 時間室温で反応させた。 PBSで洗浄後、 ABTS基質液 [2, -アジノビス（3-ェチルベンゾチアゾリン- 6-スルホン酸）二アンモニゥムの 550mgを O. lmol/L クェン酸緩衝液（pH4.2) に溶解し、使用直前に過酸ィヒ水素 l L/mLを加えた溶液]を 50〜； 100 /L 加えて発色させ、 415皿の吸光度を測定した。

( 6 ) 遺伝子増幅による高発現株の取得

上記で得られたクロ一ンについて、 G418を 0.5mg/mL、メソトレキセ一ト（以下、 MTXと略記する）を501111101/1^含む11? 11640^03(10)培地に1.0〜2. (^ 10⁵細胞/]111になるように懸濁し、 24ゥエルプレートに lmL分注した。 C0₂インキュべ一夕一で 37°C で 1〜2週間培養して、 50nmol/L MTX耐性クローンを誘導した。得られた 50 ol/L MTX耐性クロ一ンについて、 G418を 0.5mg/mL、 100皿 ol/L MTXを含む

¾¾1164(^03( 10)培地に1.0〜2.0 10⁵細胞/1111になるょぅに懸濁し、 2 4ゥエルプレートに lmL分注した。（¾ィンキュベー夕一で 37°Cで 1〜2週間培養して、 100皿 ol/L MTX耐性クローンを誘導した。得られた 100nmol/L MTX耐性クローンについて、 G418を 0.5mg/mL、 200皿ol/L MTXを含むIlPMI1640-FCS(10)培地に1.0〜2.0 x 10⁵細胞/ m Lになるように懸濁し、 2 4ゥエルプレートに l mL分注した。

C0₂ィンキュベ一夕一で 37°Cで 1〜2週間培養して、 200nmol/L MTX耐性クローンを誘導した。コンフルェントになった時点で、培養液中の各キメラ化抗体発現量を ELISA法にて測定した。得られたクローンの中で、最も高い発現量を示した

200謹 1/L MTX耐性クローンを限界希釈法により、シングルセルクローニングを行つた。コンフルェントになった時点で、培養液中の各キメラ化抗体発現量を ELISA 法にて測定した。得られたクローンの中で、最も高い発現量を示した 200nmol/L MTX 耐性クローンのキメラ化抗体量は約 10〃g/mLであった。 pKANTEXPChCァ 1導入 YB2/0 細胞から得られた 200nmol/L MTX耐性クロ一ンを形質転換株 K T M— 2 0 0 1 (ヒト型キメラ化抗体 K T M— 2 0 0 1生産株）と命名した。

実施例 2 抗ホスホコリン抗体の製造 ( K T M - 2 8 5抗体)

( 1 ) ヒト血漿中の L D L画分の調製

へパリン採血で得られたヒト血漿に最終濃度で 0.25麗 ol/Lとなるように EDTAを加えて、その 0.75mLずつを超遠心分離用試験管 (4mL容）に採り、 0.3顧 ol/L EDTAを含む 0.15mol/L NaClを 250 L重層して 185, 000xgにて 10°Cで 2.5時間遠心分離した。上層 150〃Lを捨て、下層 750 zLを分取して、 KBr溶液（50w/v%)150 /Lを加えて、密度 1.063とした。超遠心分離用試験管（4mL容）の底に密度調整した血漿を移して 240, 000xgにて 10°Cで 16時間遠心分離し、上層の橙色バンド（約 100〜150〃L)を注意深く回収し、 0.25腿 ol/Lの EDTAを含む PBSに対して 4°C；、 6時間（3リヅトルを 2時間間隔で 3回交換)透析した。得られた LDL試料は、ァガロース電気泳動法と脂質染色法に単一のバンドを与えることで LDL純度を確認した後、口一リー法にて BSAを標準物質として蛋白質を定量し、この値を LDL濃度とした。

( 2 ) 免疫用抗原および固相用抗原の調製

1一パルミトイル一 2— ( 9—ォキソノナノィル）一グリセ口一 3—ホスホコリンは、文献 [J. Biol . Chem. , 266( 17) . 11095 ( 1991 ) ]に記載の方法に従って調製した。 1 —パルミトイルー 2—ォレオイル 10—グリセ口一 3—ホスホコリン (Avanti社製）のクロ口ホルム溶液にオゾンガスを吹き込み、生成したジァシルグリセ口ホスホコリンのォゾニド体をジメチルスルフイドにより還元して合成した。得られた酸化物を薄層クロマトグラフ法により展開溶媒（クロ口ホルム：メタノール:水 = 1 0 ： 5 ：

1 )の条件で展開し、 1—パルミトイル一 2— ( 9—ォキソノナノィル）—グリセロー 3 一ホスホコリン（以下、 PC9CH0と略す）を単離した。 PC9CH0の純度は、逆相 HPLC(0DS カラム、メタノール： 2 O mm o 1 /L塩化コリン水溶液：ァセトニトリル = 8 7 5 : 1 0 0 : 2 5 )にて単一ピークを与えることを確認し、クロ口ホルム一ェ夕ノ —ル（1 ： 1 ) 溶液中にて— 2 0 °Cで保存した。

( 1 ) 項で取得した精製 LDLを lmg/mLになるように 0.25腿 ol/Lの EDTAを含む PBS 溶液を用いて調整し、この溶液 lmLに対し、 5，000ngの上記 PC9CH0を溶解した DMS0 溶液 IOO Lを加えて撹拌し、 PC9CH0- LDLコンジュゲ一トを得た。

( 3 ) モノクローナル抗体の調製

6週令の雄 Balb/cマウスの背中皮下にフロインドの完全アジュバントと等量混合したホスホコリン— LDLを O. lmg/匹投与した。以後該等量混合物 O. lmg/匹を背中皮下に 3週間毎に 2回投与し、その 3週間後、尾静脈より PBSに溶解した PC9CH0- LDL コンジユゲートを O. lmg/匹投与し、 3日後に抗体生産細胞を下記のとおり脾臓より採取した。

免疫動物から脾臓を無菌的に摘出し、血清を含まない RPMI- 1640培地（日水製薬社製）中にて角牟し、 100メッシュの網を通過させて単独細胞化し、低張液中に懸濁し赤血球を溶解した後、血清を含まない RPMI-1640培地で 3回遠心洗浄し抗体生産細胞を得た。

一方マウスミエローマ細胞 P3X- Ag8-Ulを 10%牛胎児血清（FCS) 含有 RPMI- 1640培地で培養して対数増殖期で細胞を回収し、血清を含まない RPMI- 1640培地で 3回遠心洗浄した。

上記で得られた抗体生産細胞懸濁液とマウスミエ口一マ細胞 P3X-Ag8- U1懸濁液を 10 : 1の比率で混合し、 1200rpmで 5分間遠心分離し、培養液を取り除いた。残った細胞に 50%ポリエチレングリコ一ル 1500液（ぺ一リンガー■マンハイム社製） lmL をゆつくり加え、さらに血清を含まない RPMI - 1640培地 50mLを徐々に加えてから 1200rpmで 5分間遠心分離して培地を取り除き、残った細胞を HAT培地 (lxl0-^fmol/L ヒポキサンチン、 4xlO- ol/Lァミノプテリン、 2xlO-^smol/Lチミジンを含む 10%FCS 含有 RPMI-1640培地）に bdO⁶細胞/ Lとなるよう懸濁し、懸濁液を 96ウェルマイク口タイ夕一プレートに各ゥエルずつ分注した。細胞はこのままの状態で C0₂ インキュベータ一にて 5%C0₂を含む空気中、 37°Cで培養した。 10日後全ゥエルにハイブリドーマのコロニーが観察された。

目的抗体を生産している細胞を含むゥエルを選択する目的で、下記のとおり培養上清中の抗体価を ELISA法で定量した。 96ウェルマィクロタイ夕一プレートに 50 zL の PC9CH0- LDLコンジュゲート溶液 O. lmol/L炭酸緩衝液、 pH9.5) または LDL溶液（コントロール、 20〃g/mL 0.1mol/L炭酸緩衝液、 pH9.5) を分注し、 4°Cで一夜静置した。プレートを PBSで 3回洗浄した後、 1%BSA/PBS溶液 250 /Lを分注して室温で 1時間静置し、 PBSで各ゥエルを 3回洗浄して反応用プレートとした。反応用プレートに 0.1%の BSAを含む PBSで 11倍に希釈した培養上清 50 Lを入れ、室温で 3時間静置反応させた。反応終了後プレートを 0.05%Tween20を含む PBSで 5回洗浄した後、 50〃Lのペルォキシダーゼ（POD)標識—抗マウスィムノグロブリンズーゥサギ IgG (ダコ社製）を加え、室温で 1時間反応させた。反応後プレートを

0.05%Tween20を含む PBSで 5回洗浄した後、 50 zLの TMB発色試薬溶液（イン夕一ジヱン社製）を加え、 30分間室温で反応させ、最後に 50〃Lの lmol/L硫酸水溶液を加え、マイクロプレートリーダ一 (MTP-120, コロナ電気）で 450nmの吸光度を測定した。コントロールに比較し、 1.0以上の吸光度を示したゥヱルの細胞を選択した。クローニングは限界希釈法でおこなった。上記で得られたゥエル内の細胞を 1 X 10'個/ mLの胸腺細胞を含む lOyjCS含有 RPMI -1640培地にて 0.5個/ mLになるよう希釈し、 96ウェルマイク口夕イタ一プレートの各ゥエルに 200 zL分注し、 5%C0₂インキュべ一夕一にて 37°Cで培養を行った。培養開始 10〜14日後に各ゥエルを観察し、生育コロニーが 1個 Zゥエルのゥエルを選び出し、その培養上清中抗体価を上記 ELISA 法にて定量し、目的抗体を生産している細胞株を含むゥヱルを選択した。さらに同様の操作を 2回繰り返し、安定して目的抗体を生産するモノクローナル抗体生産細胞株を得た。得られた株が生産する抗体の免疫グロブリンクラスをモノクロ一ナル抗体夕イビングキット（ザィメット社製）を用い、培養上清中の抗体について同定し、採取した。取得された抗体は IgMタイプであった。

8週令以上の雄 Balb/cマゥスの腹腔内に 0.5mL/匹のプリスタン（2, 6， 10， 14-テトラメチルペン夕デカン）を注入し、 2週間飼育した。

このマウスに lxlO⁶/匹のモノク口一ナル抗体生産細胞を腹腔内接種した。

7〜1 4日後、マウス腹腔に十分腹水が貯留した時点で、腹腔から 18Gの注射針を用いて腹水を回収し、 3，000rpmで 10分間遠心分離して上清を回収した。この上清を PBSで 3倍に希釈した後、この希釈腹水と等量の飽和硫酸アンモニゥム /PBS溶液を撹拌しながら滴下混合し、滴下し終わった後もしばらくの間撹拌を継続した。この混合液を回収して 3，000rpmで 10分間遠心分離し、残査を回収した後、この残査を 3 倍希釈腹水と等量の PBSで溶解し、上記と同様の操作を繰り返した。回収した残査を腹水量と等量の 0.5mol/Lの NaClを含む PBSで溶解した。 0.5mol/Lの NaClを含む PBS で平衡化したセファクリル S-300カラムに前記溶解液を通塔した後、 0.5mol/Lの NaClを含む PBSで溶出し、溶出液の 280nm吸光度をモニタ一しながら分子量 800KD付近のピーク部分を回収し、これを精製抗体とした。

( 4 ) 抗体の選択 96ゥヱルマイクロタイ夕—プレート（ヌンク社製）に 50//Lの上記（2 ) で作製した PC9CH0-LDL溶液（20 g/mL O. lmol/L炭酸緩衝液、 pH9, 5) を分注し、 4°Cで一夜静置した。プレートを PBSで 3回洗浄した後、 1%BSA/PBS溶液 250 Lを分注して室温で 1時間静置し、 PBSで各ゥヱルを 3回洗浄して反応用プレ一トとした。該反応用プレートに、種々の種類および濃度の物質を加えた 0.1%BSA含有 O. lniol/1リン酸緩衝液（PH7.4) または 0.1°/。BSA含有 O. lmol リン酸緩衝液（pH7.4) のみ（コント口 —ル：阻害 0 %) を 50〃L加え、これに、上記（3 ) で得られた抗体を 0. BSA含有 O. lmol/Lリン酸緩衝液（PH7.4) で lOOng/mLに希釈したものをプレートを撹拌しながら 50 /L分注し、混合して 4°Cで一夜静置反応させた。反応終了後プレートを 0.05%Tween20を含む PBSで 5回洗浄した後、 POD標識ー抗マウスィムノグロプリンズ —ゥサギ IgGを 50 L加え、室温で 1時間反応させた。反応後プレートを

0.05%Tween20を含む PBSで 5回洗浄した後、 50〃Lの TMB発色溶液（ィン夕一ジェン社製）を加え、 30分間室温で反応させ、最後に 50 Lの反応停止液を加え、マイクロプレートリーダ一で 450皿の吸光度を測定した。反応性は、反応に用いたホスホコリンの濃度/吸光度曲線を作成し、コントロールの吸光度を 100%としたときの、各物質、各濃度の反応阻害率から相対決定した。この結果をもとに、上記（3 ) で得られたモノクローナル抗体生産株からホスホコリンによる阻害が最も低濃度で得られたものを選択し、当該生産株を K T M— 2 8 5と命名した。

実施例 3 抗体の特異性

96ウェルマイク口タイ夕一プレート（ヌンク社製）に 50〃Lの実施例 2の（2 ) で作製した PC9CH0-LDL溶液（20 g/mL O. lmol/L炭酸緩衝液、 _PH9.5) を分注し、 4 °Cで一夜静置した。プレートを PBSで 3回洗浄した後、 1%BSA/PBS溶液 250 ^Lを分注して室温で 1時間静置し、 PBSで各ゥヱルを 3回洗净して反応用プレートとした。該反応用プレートに、種々の種類 ·濃度の物質を加えた 0.1%BSA含有 O. lmol/Lリン酸緩衝液（PH7.4) または 0.1%BSA含有 O. lmolAリン酸緩衝液（pH7.4) のみ（コントロール：阻害 0 %) を 50 L加え、これに、実施例 2で得られた K T M— 2 8 5抗体およぴ実施例 1で得られた K T M— 2 0 0 1抗体を 0.1%BSA含有 0. lmol/Lリン酸緩衝液（pH7.4)で lOOng/mLに希釈したものをプレートを撹拌しながら 50〃L分注し、混合して 4°Cで一夜静置させ反応させた。反応終了後プレートを 0.05%Tween20 を含む PBSで 5回洗浄した後、 POD標識一抗マウスィムノグロブリンズ—ゥサギ IgG を 50 L加え、室温で 1時間反応させた。反応後プレートを 0.05%Tween20を含む PBS で 5回洗浄した後、 50〃Lの TMB発色溶液（イン夕一ジヱン社製）を加え、 30分間室温で反応させ、最後に 50〃 Lの反応停止液を加え、マイクロプレートリ一ダ一で 450nmの吸光度を測定した。反応性は、反応に用いたホスホコリンの濃度/吸光度曲線を作成し、コントロールの吸光度を 100%としたときの、各物質、各濃度の反応阻害率から相対決定した。 K T M— 2 8 5抗体、 K T M- 2 0 0 1抗体ともにホスホコリンにのみ低濃度で阻害が観察され、ホスフォセリン、ホスフォスレオニン、ニトロフエニルホスホコリン、ホスファチジルコリン、ホスフォリルエタノールァミン、精製ヒト LDL、精製ヒト HDLには実質的に阻害されなかった。

実施例 4 K T M- 2 0 0 1抗体を用いた生体内変性リポ蛋白質の測定および疾患との相関

( 1 ) パーォキシダーゼ標識抗体の作製

精製抗ヒトアポ B抗体（ャギ、カッペル社製）溶液（5mg/mL、 O. lmol/L ホウ酸緩衝液、 PH8.0) lmLに、 50 /Lの 2—ィミノチオラン一 HC1溶液（60腿 ol/L、 O. lmol/L ホウ酸緩衝液、 PH8.0) を加え、 30°Cで 30分間反応させた後、 5腿 ol/Lの EDTAを含む O. lmol/Lのリン酸緩衝液（pH6.0) で平衡化したセフアデヅクス G-25カラム（1cm x30cm、 Amersham- Pharmacia社製）にかけ、溶出された抗体画分を回収した。西洋ヮサビペルォキシダ一ゼ（HRPと略す。東洋紡社製）溶液 (lOmg/mL O. lmol/L リン酸緩衝液、 PH7.0) lmLに 50〃Lの EMCS溶液（同人化学社製、 50腿 ol/L、 DMS0溶液）を加え、 30°Cで 30分間反応させた後、 O. lmol/Lのリン酸緩衝液（pH6.5) で平衡ィ匕したセフアデヅクス G-25カラム（lcmx30cm、Amersham-Pharmacia社製）にかけ、溶出された HRP画分を回収した。上記回収した抗体画分および HRP画分を混合し、 30 でで 30分間反応させた後、 O. lmol/Lのリン酸緩衝液（pH7.0) で平衡化したセファデヅクス G-200カラム（lcmxl00cm、 Amersham-Pharmacia社製）にかけ、溶出された抗体- HRPコンジユゲート画分を回収し、これをペルォキシダ一ゼ標識抗ヒトアポ B 抗体とした。回収した画分は直ちに終濃度 1 %になるように BSAを添加し、使用するまで- 50°Cで保存した。

( 2 ) ELISA法

96ウェルマイク口プレート（ヌンク社製）の各ゥエルに、実施例 1で作製した K T M- 2 0 0 1抗体を Tris- HC1 (pH8.0) で 10 zg/mLに希釈したものを、 100 L/ ゥエルとなるように加えて、 4 °Cで 16時間インキュベートした。溶液を捨て、 1 %(w/v)BSAを含む Tris-HCl (pH8.0) 350〃Lを加えて室温で 2時間ィンキュペートすることによりブロヅキングした後、 0.05%(v/v)Tween20を含む PBS (pH7.4) で 4回洗浄した。

次に、新鮮な動脈硬ィ匕患者血漿ならびに健常者血漿を検体希釈液（1%BSA、 5%ポリエ一テル、 140腿 ol/L NaClを含む 10腿 ol/L リン酸緩衝液、 H7.4) で 1,000倍に希釈し、さらにこれを同検体希釈液で 4/5、 3/5、 2/5、 1/5にそれそれ希釈して、検体希釈液のみと合わせてそれそれ 100〃Lずつゥエルに分注し、室温で 2時間ィンキュべ一トした後、 0.05(v/v)%Tween20を含む PBS (_PH7.4) で 4回洗浄した。

さらに、各ゥエルに l %(w/v)BSAを含む PBS (pH7.4) で 1, 000倍に希釈されたぺルォキシダーゼ標識抗ヒトアポ B抗体 100 zLを加えて、室温で 30分間インキュべ一トした。次に、 0.05(v/v)%Tween20を含む PBS (pH7.4) で 4回洗浄した後、発色液 (TMBZ液、 TSI社製） 100〃Lを加えて 30分間 37°Cで発色させた後、 lmol/L硫酸 50〃L を加えて反応を停止させ、 450nmの吸光度を測定した。結果を第 8図に示す。第 8図より、動脈硬ィ匕患者血漿中には K T M— 2 0 0 1抗体と親和性を持つ変性リポ蛋白質が含まれ、また本発明の方法はこの変性リポ蛋白質を定量的に測定できることが明らかとなった。

実施例 5 K T M- 2 8 5抗体を用いた生体内変性リポ蛋白質の測定および疾患との相関

96ウェルマイク口プレート（ヌンク社製）の各ゥエルに、実施例 2で作製した K T M— 2 8 5抗体を Tris- HC1 (pH8.0) で 10〃g/mLに希釈したものを、 100〃L/ゥエルとなるように加えて、 4°Cで 16時間インキュベートした。溶液を捨て、 1% (w/v ) BSAを含む Tris- HC1 (pH8.0) 350〃Lを加えて室温で 2時間インキュベートすることによりブロッキングした後、 0.05% (v/v) Tween20を含む PBS (pH7.4)で 4回洗浄した。

次に健常人と冠動脈造影法にていずれかの冠動脈に 75%以上の狭窄が観察される患者の血中変性リポ蛋白質を本発明の測定法にて測定した。生体試料としては血清を用いた。被検者に対し、 10時間以上の絶食を課した後、早朝空腹状態で全血 lOmL を真空採血管で採血し、室温で 30分間放置して凝固させた後、 3，000rpmで 10分間遠心分離し、上清の液体成分を回収し血清とした。

この血清を検体希釈液（1%BSA、 5%ポリエーテル、 140麗 ol/L NaClを含む 10腿 ol/L リン酸緩衝液、 PH7.4) で 1，000倍に希釈し、それそれ 100 Lずつゥエルに分注し、室温で 2時間インキュベートした後、 0.05(v/v) Jween20を含む PBS (pH7.4) で 4 回洗浄した。

さらに、各ゥエルに 1 % (w/v) BSAを含む PBS (pH7.4) で 1, 000倍に希釈されたペルォキシダーゼ標識抗ヒトアポ B抗体 100 Lを加えて、室温で 30分間ィンキュぺトした。次に、 0.05 (v/v) %Tween20を含む PBS (pH7.4) で 4回洗浄した後、発色液（TMBZ液、 TSI社製） 100〃Lを加えて 30分間 37°Cで発色させた後、 lmol/L硫酸 50 Lを加えて反応を停止させ、 450皿の吸光度を測定した。結果を第 9図に示す。健常人に比較し、冠動脈に 75%以上の狭窄のある患者の測定値が有意に高く、本発明により得られる変性リポ蛋白質の定量値から循環器系器官である冠動脈の疾患が検出できる。

実施例 6 狭心症患者の本発明生体内物質の測定

健常人と狭心症発作をおこし、負荷心電図にて ST波の低下を認めた狭心症患者に対し全血 10mLを EDTA入り真空採血管で採血し、直ちに 3, OOOrpmで 10分間遠心分離し、上清の液体成分を回収し血漿とした。回収した血清を実施例 4と同様にして K T M- 2 0 0 1抗体を用いて ELISA法にて測定した。結果を第 10図に示す。第 10図に示した通り健常人に比較し、狭心症患者の変性リポ蛋白質の測定値が有意に高く、本発明により得られる変性リポ蛋白質の定量値から循環器系器官の疾患が検出できる。

実施例 7 心筋梗塞患者の本発明生体内物質の測定胸痛症状を示し、心電図にて ST波の上昇が確認された心エコーにて局所壁運動異常が観察された心筋梗塞患者と健常人より全血 lOmLを EDTA入り真空採血管で採血し、直ちに 3, 000rpmで 10分間遠心分離し、上清の液体成分を回収し血漿とした。各血漿にエチレンジァミン四酢酸ナトリゥム（EDTA-2Na)水溶液（10醒 ol/L) を加え、最終濃度を 1雇 ol/Lとし、これに NaBrを加え、密度 1.000に合わせた。遠心チューブに分注し、その上に NaBrで、密度 1.150、 1.063、 1.019及び 1.006に合わせた緩衝液を順に重層し、これを 4°Cで 24時間遠心分離 (120, 000g) した。上端から順に分画し、各画分の密度を屈折計で測定し、密度 1.019〜1.063の画分を1^)1^画分として採取した。このようにして得られた LDL分画を、採取後直ちに、 0.25顧 ol/L EDTA を含む PBSで透析した。回収した LDL画分を実施例 4と同様にして ELISA法にて測定した。結果を第 11図に示す。第 U図に示したとおり健常人に比較し、心筋梗塞患者の変性 LDLの測定値が有意に高く、本発明により得られる変性 LDLの定量値から循環器系器官の疾患が検出できる。

実施例 8 変性 LDLの測定 (1)

健常人と健常人と冠動脈造影法にて主要冠動脈に 75%以上の狭窄が観察される患者を 10時間以上の絶食を課した後、早朝空腹状態で全血 10mLを EDTA入り真空採血管で採血し、直ちに 3, 000rpmで 10分間遠心分離し、上清の液体成分を回収し血漿とした。各血漿にエチレンジァミン四酢酸ナトリゥム（EDTA- 2Na)水溶液（10顧 ol/L) を加え、最終濃度を 1画 ol/Lとし、これに NaBrを加え、密度 1.000に合わせた。遠心チュ一ブに分注し、その上に NaBrで、密度 1.150、 1.063、 1.019及び 1.006に合わせた緩衝液を順に重層し、これを 4°Cで 24時間遠心分離 (120, 000g) した。上端から順に分画し、各画分の密度を屈折計で測定し、密度 1.019〜1.063の画分を1^1^画分として採取した。このようにして得られた LDL分画を、採取後直ちに、 0.25藤 ol/L EDTA を含む PBSで透析した。回収した精製 LDLを 15mLのコニカルチューブに各 4分割し、所定の時間ポルテックスで撹拌してリポ蛋白質を変性させた。変性は披検体の 680nmの吸光度が上昇していくことで確認した。変性操作後、この精製 LDLを実施例 4と同様にして ELISA法にて測定した。結果を第 12図に示す。

第 12図に示した通り、ボルテックスで撹拌して変性させることによりその測定値は健常人、患者ともに高くなり、また変性時間を長くしてより大きな変性をさせることにより、さらに測定値は高くなることが示された。

実施例 9 変性 L D Lの測定 (2)

健常人に 10時間以上の絶食を課した後、早朝空腹状態で EDTA入り真空採血管で採血し、採血後 5〜50U/kgのドーズでへパリンを静脈投与し、さらに投与 15分後、全血 lOmLを EDTA入り真空採血管で採血し、直ちに 3，000rpmで 10分間遠心分離し、上清の液体成分を回収し血漿として一部を- 50°Cで凍結保存した。回収した各血漿にエチレンジァミン四酢酸ナトリゥム（EDTA-2Na)水溶液（10腿 ol/L) を加え、最終濃度を 1腿 ol/Lとし、これに NaBrを加え、密度 1.000に合わせた。遠心チューブに分注し、その上に NaBrで、密度 1.150、 1.063、 1.019及び 1.006に合わせた緩衝液を順に重層し、これを 4 °Cで 24時間遠心分離（120，000g) した。上端から順に分画し、各画分の密度を屈折計で測定し、密度 1.019〜； 1.063の画分を精製 LDLとして採取した。このようにして得られた精製 LDLを、採取後直ちに、 0.25腿 ol/L EDTAを含む PBS で透析した。この精製 LDLを実施例 4と同様にして ELISA法にて測定した。一方凍結保存してあつた血漿中のリポプロティンリパ一ゼ濃度をリポプロティンリパーゼ測定試薬（第一化学社製）にて測定し、血漿中のリポプロテインリパーゼ濃度とその血漿由来の精製 LDLの ELISA測定値とを比較検討した。結果を第 13図に示す。

第 13図に示した通り、リポプロテインリパーゼ濃度が高い血漿由来の精製 LDLほど高い測定値が得られ、本発明の定量方法によりリポプロティンリパ一ゼによって変性された変性リポ蛋白質を測定することができる。

実施例 1 0 変性 LDLおよび変性 HDLの測定 ―

( 1 ) ヒト血漿中の H D L画分の調製

へパリン採血で得られたヒト血漿に最終濃度で 0.25腿 ol/Lとなるように EDTAを加えて、その 0.75mLずつを超遠心分離用試験管 (4mL容）に採り、 0.3腿 ol/L EDTAを含む 0. 15mol/L ¾ を250 ^重層して185, 000 にて10°〇で2. 5時間遠心分離した。上層 150 zLを捨て、下層 750 Lを分取して、 KBr溶液 (50w/v%)150 zLを加えて、密度 1.063とした。超遠心分離用試験管（4mL容）の底に密度調整した血漿を移して 240，000 x gにて 10°Cで 16時間遠心分離し、上層の橙色バンド（約 100〜150 L)を捨て、残った画分を注意深く回収した。この回収した分画に KBr溶液 (50w/v%)を加えて密度 1.21に調整し、超遠心分離用試験管に分注して 244, 000 xgで 10時間遠心分離し、上層 750〃Lを回収して、 0.25腿 ol/Lの EDTAを含む PBSに対して 4°C、 6時間（3リットルを 2時間間隔で 3回交換)透析した。得られた HDL試料は、ァガロース電気泳動法と脂質染色法に単一のバンドを与えることで HDL純度を確認した後、口一リー法にて BSAを標準物質として蛋白質を定量し、この値を HDL濃度とした。

( 2 ) 変性 LDLおよび変性 HDLの調製

実施例 2 ( 1 ) で精製した LDLおよび上記（1 ) で精製した HDLを共に PBSで平衡化したセフアデヅクス G— 2 5カラム（lcmx 30cm、 Amersham- Pharmac ia社製）に通筒し、含まれている EDTAを除いた後、ローリー法にて BSAを標準物質として蛋白質を定量し、 PBSにて lmg/mLとなるよう調整した。この溶液に最終濃度 5 zmol/Lとなるよう CuS0₄を添加し、 37°Cで 3時間空気下酸化を行った。 3時間後、 0.01%となるよう EDTAを加えて酸化反応を停止させ、直ちに 0.01%EDTAを含む PBSにて 4°Cで透析し、回収してローリ一法にて BSAを標準物質として蛋白質定量し、変性 LDL、変性 HDL 溶液の濃度をそれぞれ決定した。

( 3 ) 変性 LDLおよび変性 HDLの測定

96ウェルマイク口タイ夕一プレート（ヌンク社製）に 50〃Lの上記で作製した変性 LDLおよび変性 HDLならびに酸ィヒする前の LDLおよび HDL溶液（10〃g/mL PBS) を分注し、 4°Cで一夜静置した。プレートを PBSで 3回洗浄した後、 1%BSA/PBS溶液 250〃L を分注して室温で 1時間静置し、 PBSで各ゥエルを 3回洗浄して反応用プレートとした。該反応用プレートに実施例 2で得られた K T M— 2 8 5抗体および実施例 1で得られた K T M— 2 0 0 1抗体を 0.1%BSA含有 O. lmol/Iリン酸緩衝液（pH7.4) で lOOng/mLに希釈したものを 50〃L分注、混合して 4°Cで一夜静置し反応させた。反応終了後プレートを 0.05%Tween20を含む PBSで 5回洗浄した後、 POD標識—抗マウスィムノグロプリンズ—ゥサギ IgGを 50〃L加え、室温で 1時間反応させた。反応後プレ ―トを 0.05%Tween20を含む PBSで 5回洗浄した後、 50〃Lの TMB発色溶液（イン夕ージェン社製）を加え、 30分間室温で反応させ、最後に 50〃Lの反応停止液を加え、マイク口プレートリーダ一で 450nmの吸光度を測定した。結果を第 14図に示す。第 14 図に示した通り、 K T M— 2 8 5抗体および K T M— 2 0 0 1抗体は変性操作前の LDLおよび HDLとは反応しないが、変性 LDLおよび変性 HDLとは反応することが示された。これにより、変性 LDLおよび変性 HDLの測定ができることが確認された。

実施例 1 1 変性リポ蛋白質の測定

実施例 1 0で作製した変性 LDLをウェルマイク口タイ夕一プレート (ヌンク社製 ) の各ゥエルに 1%BSA/PBS溶液 250〃Lを分注して室温で 1時間静置し、 PBSで各ゥエルを 3回洗浄して反応用プレートとした。この反応用プレートのゥエルに実施例 1 0で作製した変性 LDL、変性させる前の LDL溶液（170〃g/mL PBS) および変性 LDLをそれぞれ 1/2希釈、 1/4希釈、 1/8希釈した溶液を 100 L/ゥヱル分注し、さらに各ゥエルに実施例 2で得られた K T M— 2 8 5抗体を 0.1%BSA含有 0. Imo Lリン酸緩衝液（pH7.4) で 970 u g/mLに希釈したものを 50〃L分注、混合して 24。Cで 20分間静置し反応させた。反応終了後、プレートをマイク口プレートリーダ—で _450nmの吸光度を測定した。結果を第 15図に示す。第 15図に示した通り、 K T M— 2 8 5抗体は変性させる前の LDLとは反応しないが、これらに変性操作を加えた変性 L D Lとは反応することが示され、本発明により変性 L D Lの測定ができることが確認された。さらに同様の結果は実施例 1 0で作製した変性 H D L を用いても再現された。産業卜の禾 II用可能' I '牛

本発明により、生体試料中の変性リポ蜜白質をホスホコリンに対する抗体を用いて定量することを特徴とする生体試料中の変性リポ蛋白質の定量方法、生体試料中の変性リポ蛋白質をホスホコリンに対する抗体およびリポ蛋白質に対する抗体を用いて定量することを特徴とする生体試料中の変性リポ蛋白質の定量方法、生体試料中の変性リポ蛋白質をホスホコリンに対する抗体を用いて定量し、その定量値から循環器系疾患を検出することを特徴とする循環器系疾患の検出方法、生体試料中の変性リポ蛋白質をホスホコリンに対する抗体およびリポ蛋白質に対する抗体を用いて定量し、その定量値から循環器系疾患を検出することを特徴とする循環器系疾患の検出方法、ホスホコリンに対する抗体を含有する変性リポ蛋白質の定量用試藥およホスホコリンに対する抗体およびリポ蛋白質に対する抗体を含有する変性リポ蛋白質の定量用試薬が提供される。

—配列表フリ —テス M

配列番号 3—人工配列の説明合成 DNA

配列番号 4一人工配列の説明合成 DNA

配列番号 5—人工配列の説明合成 DNA

配列番号 6一人工配列の説明合成 DNA

配列番号 7一人工配列の説明合成 DNA

配列番号 8一人工配列の説明合成 DNA

配列番号 9—人工配列の説明合成 DNA

配列番号 10—人工配列の説明合成 DNA

Claims

請求の範囲

I . 生体試料とホスホコリンに対する抗体とを接触させ、生じる免疫複合体 'を定量することを特徴とする生体試料中の変性リポ蛋白質の定量方法。

2 . 生体試料とホスホコリンに対する抗体およびリポ蛋白質に対する抗体とを接触させ、生じる免疫複合体を定量することを特徴とする生体試料中の変性リポ蛋白質の定量方法。

3 . 生体試料とホスホコリンに対する抗体および低密度リポ蛋白質に対する抗体とを接触させ、生じる免疫複合体を定量することを特徴とする生体試料中の変性低密度リポ蛋白質の定量方法。

4 . 低密度リポ蛋白質に特異的に結合する抗体が、アポ B蛋白質に対する抗体である請求項 3記載の方法。

5 . 生体試料とホスホコリンに対する抗体および高密度リポ蛋白質に対する抗体とを接触させ、生じる免疫複合体を定量することを特徴とする生体試料中の変性高密度リポ蛋白質の定量方法。

6 . 高密度リポ蛋白質に特異的に結合する抗体が、アポ A蛋白質に対する抗体である請求項 5記載の方法。

7 . 生体試料とホスホコリンに対する抗体およびアポプロティン（a) に対する抗体とを接触させ、生じる免疫複合体を定量することを特徴とする生体試料中のリポプ口ティン（a)の定量方法。

8 . 生体試料とホスホコリンに対する抗体、高密度リポ蛋白質に対する抗体および低密度リポ蛋白質に対する抗体とを接触させ、生じる免疫複合体を定量することを特徴とする生体試料中の変性高密度リポ蛋白質および変性低密度リポ蛋白質の定量方法。 .

9 . 高密度リポ蛋白質に特異的に結合する抗体が、アポ A蛋白質に対する抗体である請求項 8記載の方法。

1 0 . 低密度リポ蛋白質に特異的に結合する抗体が、アポ B蛋白質に対する抗体である請求項 8記載の方法。

I I . 生体試料とホスホコリンに対する抗体とを接触させ、生じる免疫複合体を定量することを特徴とする循環器系疾患の検出方法。

' 1 2 . 生体試料とホスホコリンに対する抗体およびリポ蛋白質に対する抗体とを接触させ、生じる免疫複合体を定量することを特徴とする循環器系疾患の検出方法。

1 3 . 生体試料とホスホコリンに対する抗体および低密度リポ蛋白質に対する抗体とを接触させ、生じる免疫複合体を定量することを特徴とする循環器系疾患の検出方法。

1 4 . 低密度リポ蛋白質に特異的に結合する抗体が、アポ B蛋白質に対する抗体である請求項 1 3記載の方法。

1 5 . 生体試料とホスホコリンに対する抗体および高密度リポ蛋白質に対する抗体とを接触させ、生じる免疫複合体を定量することを特徴とする循環器系疾患の検出方法。

1 6 . 高密度リポ蛋白質に特異的に結合する抗体が、アポ A蛋白質に対する抗体である請求項 1 5記載の方法。

1 7 . 生体試料とホスホコリンに対する抗体およびアポプロテイン（a ) に対する抗体とを接触させ、生じる免疫複合体を定量することを特徴とする循環器系疾患の検出方法。

1 8 . 生体試料とホスホコリンに対する抗体、高密度リポ蛋白質に対する抗体および低密度リポ蛋白質に対する抗体とを接触させ、生じる免疫複合体を定量することを特徴とする循環器系疾患の検出方法。

1 9 . 高密度リポ蛋白質に特異的に結合する抗体が、アポ A蛋白質に対する抗体である請求項 1 8記載の方法。

2 0 . 低密度リポ蛋白質に特異的に結合する抗体が、アポ B蛋白質に対する抗体である請求項 1 8記載の方法。

2 1 . ホスホコリンに対する抗体を含有する変性リポ蛋白質の定量用試薬。 ■2 2 . ホスホコリンに対する抗体およびリポ蛋白質に対する抗体を含有する変性リポ蛋白質の定量用試薬。

2 3 . リポ蛋白質に対する抗体が、アポ B蛋白質に対する抗体、アポ A蛋白質に対する抗体およびアポプロテイン（a )に対する抗体からなる群から選ばれる請求項 2 2記載の試薬。

2 4 . 凍結保護剤を含む、請求項 2 1〜 2 3のいずれか 1項に記載の試薬。 2 5 . ホスホコリンに対する抗体を含有する変性リポ蛋白質の定量用キット

2 6 . ホスホコリンに対する抗体およびリポ蛋白質に対する抗体を含有する変性リポ蛋白質の定量用キット。

2 7 . リポ蛋白質に対する抗体が、アポ B蛋白質に対する抗体、アポ A蛋白質に対する抗体およびアポプロティン（a) に対する抗体からなる群から選ばれる請求項 2 3記載のキット。

2 8 . 凍結保護剤を含む、請求項 2 5〜 2 7のいずれか 1項に記載の変性リポ蛋白質の定量用キット。

2 9 . ホスホコリンに対する抗体を含有する循環器系疾患の検出試薬。

3 0 . ホスホコリンに対する抗体およびリポ蛋白質に対する抗体を含有する循環器系疾患の検出試薬。

3 1 . リポ蛋白質に対する抗体が、アポ B蛋白質に対する抗体、アポ A蛋白質に対する抗体およびアポプロティン（a)に対する抗体からなる群から選ばれる請求項 3 0記載の検出試薬。

3 2 . ホスホコリンに対する抗体を含有する循環器系疾患の検出用キット。 3 3 . ホスホコリン.に対する抗体およびリポ蛋白質に対する抗体を含有する循環器系疾患の検出用キット。

3 4 . リポ蛋白質に対する抗体が、アポ B蛋白質に対する抗体、アポ Aに対する抗体およびアポプロティン（a) に対する抗体からなる群から選ばれる請求項

3 3記載のキット。

3 5 . 凍結保護剤を含む、請求項 3 2〜 3 4のいずれか 1項に記載の循環器系疾患の検出用キット。

3 6 . 糖類、高分子物質および親水性有機溶媒からなる群から選ばれる化合物を有効成分として含有する、生体試料のための凍結保護剤。