WO2003006985A1

WO2003006985A1 - Procede d'examen pour le diagnostic du polyarthrite rhumatoide, et reactif pour cet examen de diagnostic

Info

Publication number: WO2003006985A1
Application number: PCT/JP2002/006931
Authority: WO
Inventors: Yasuyuki Ishizuka; Shunpei Niida
Original assignee: Applied Cell Biotechnologies, Inc.
Priority date: 2001-07-13
Filing date: 2002-07-09
Publication date: 2003-01-23
Also published as: JP2003024099A

Description

明細書慢性関節リゥマチの検査診断方法及び検査診断薬技術分野

本発明は、新規な慢性関節リウマチの検査診断技術に関する。詳細には、 γ—グノレタミノレトランスぺプチダーゼ ( γ - G Τ Ρ ) をマーカーとする慢性関節リゥマチの生化学的な検査診断方法及び慢性関節リゥマチの検査診断試薬に関する。背景技術

リゥマチ性疾患の代表的なものとして「慢性関節リゥマチ（ r h e u m a t o i d a r t h r i t i s )」力あり、現在日本国内で約 7 0万人の患者がいると言われている。

この慢性関節リゥマチは、関節を内張りしている滑膜の炎症である。具体的には、関節は、連続する二つの骨の骨端部と骨端部を覆う関節軟骨、及び両骨端部をつなぐ嚢状組織の関節包とそれを内側から内張りしている厚さ 1 mmにも満たない薄い滑膜で構成されている。慢性関節リウマチは、この滑膜の炎症（滑膜炎）であって、この炎症が慢性化して次第に全身の関節に広がっていく病気である。

現在におげる有力な慢性関節リゥマチの検査法及び診断法は、その特有の症状と検査所見との組み合わせによって行う方法によるものであって、一般に、アメリカリゥマチ学会の基準（ 1 9 8 7年改訂版）を参考にして行われる。より具体的には、慢性関節リウマチの検査及び診断は、尿、血液、 X線検査を 1ヶ月から数ケ月の間隔で定期的に行うのが一般的である。血液検査では、血沈値、 C R P (C反応性たんばく）値、リゥマチ反応（血中リウマイド因子： R h e um a t o i d F a c t o r ) の測定に加え、組織学的所見、臨床経過を勘案して総合的に行われ、とりわけ前記測定の値が高いときには慢性関節リゥマチの疑いを持つことになる。しかしながら、発病して早期の場合には、関節の痛みや腫れの症状が出ても、これらの測定値が正常値を示すことがあるため、この測定値が低いからといって、慢性関節リゥマチを一概に否定することはできなかった。

また、上記リウマチ反応は、慢性関節リウマチの患者のすべてが陽性になるとは言えず、陰性のまま症状が経過する場合もあり得る。また、リウマチ反応では、肝炎その他のウィルス感染症、マラリアなどの原虫感染症でも陽性となる場合があり、健康な人でも 5 %程度は陽性反応が出てしまう。このため、慢性関節リウマチの決定的な診断法とはなりえず、参考所見の一つに過ぎないものであった。

X線所見、組織学的所見は、関節部の X線写真や関節組織切片を観察して病状を判断するもので、その検査には時間がかかり、判断には熟練を要する。そして、その判断には、検査者の恣意が介入するおそれがあり、客観性に欠ける要素がある。

このように、現在、慢性関節リウマチの決定的な検查診断方法は存在しておらず、特に、慢性関節リウマチの生化学的な検査法とこの生化学的検査結果を利用した診断方法が確立されているとは言い難い状況にある。このため、慢性関節リウマチの早期発見、早期治療が困難であるという技術的課題がある。

ここで、先願の S本国 ·特開平 1 1 — 9 4 8 3 6号報には、抗アルドラーゼ A抗体を慢性関節リゥマチ用マーカーとして使用する慢性関節リウマチ診断用免疫試薬が開示されている。しかし、 y—グルタミルトランスぺプチダーゼをマーカーとして用いるという技術的思想については、全く開示されておらず、示唆すらもされていない。

また、本願発明者は、日本国■ 特開平 1 1— 8 7 5 0 7号報において、 γ _グルタミルトランスぺプチダーゼ（ γ - G Τ Ρ ) 又はその誘導体の破骨細胞の分化誘導する活性があることを発見したことに基づき. 該酵素の破骨細胞分化促進剤等としての新用途を提案している。しかし、当該公開公報においては、 γ—グルタミルトランスぺプチダーゼと慢性関節リゥマチとの関連性に関する着想を抱くこともなく、示唆することさえもできなかった。

そこで、本発明では、慢性関節リウマチ患者から発現される新規なマーカー（指標物質）として γ—ダルタミルトランスぺプチダーゼを用いるという技術的思想に基づき、この酵素の検出に基づく新規かつ決定的な慢性関節リゥマチの生化学的検査診断方法及び検査診断試薬を提供することによって、慢性関節リウマチの早期発見、早期治療を実現し、医療分野や医薬産業分野の発展に寄与することを目的とする。発明の開示

上記目的を達成して技術的課題を解決するために、本発明では、以下の手段を採用する。

まず、本発明では、本願発明者が、ヒト慢性関節リウマチ疾患の滑膜組織等においては、 y—ダルタミルトランスぺプチダーゼ酵素が発現する又は該酵素の活性が高まるという事実を全く新規に見出したことに基づいて、この γ -G T Pをマーカーとして用いることを特徴とする慢性関節リゥマチの検査診断方法を提供する。

なお、前記 y _ダルタミルトランスぺプチダーゼ酵素を以下「y - GT P」と略称することにする。この γ- G T Pは、グルタチオンをはじめとする γ—グルタミルペプチドを加水分解するとともに、 γ— グルタミル基を他のアミノ酸ゃぺプチドに転移させる酵素として知られており、と略称されることも多い。

本発明においてマーカーとして用いる y- GT Pは、現在、肝疾患等の検査診断で一般的に用いられている y_GT P活性測定法、抗 γ - GT P抗体（γ - GT Ρと特異的に結合する抗体）と γ- GT P蛋白質との反応を活用した直接検出法、又は P C R (polymerase chain reaction:合成酵素連鎖反応）法によって γ - G T Pをコードする m R N Aの発現を確認する方法のいずれかから選択される一つの手法に基づいて、簡易かつ確実に検出することが可能である。即ち、 T/ - GT P の検出又は測定は確立された公知の手段で簡易かつ確実に行うことができるという利点がある。また、本発明では、抗 γ - G T Ρ抗体（γ - G T Ρと特異的に結合する抗体）を少なくとも含む慢性関節リゥマチの検査診断試薬を提供する。これによつて、ヒト慢性関節リウマチ疾患の滑膜組織等における γ - G Τ Ρの発現を簡便にかつ速やかに確認することが可能となる。なお、前記検査診断薬を備える慢性関節リゥマチの検査診断専用の検査キットも提供できる。

以上のように、 γ - G T Pをマーカーとして用いることを特徴とする本発明によれば、 γ - G T Pの慢性関節リゥマチのマーカーとしての全く新規な用途を提案できるという第 1の技術的意義、そして、 V - G T Ρの測定方法又は検出方法は既に医療分野等において確立されている技術があるので、慢性関節リゥマチの生化学的な検査診断方法を医療分野に容易かつ迅速に普及させることができるという第 2の技術的意義、更には、慢性関節リウマチの決定的な生化学的検査診断方法を提供できるという第 3の技術的意義を有する。図面の簡単な説明

第 1図は、実施例 1に関し、 1 %ァガロースゲル電気泳動により D Ν Αパンドを検出した結果を表す図（図面代用写真）である。

第 2図は、実施例 2に関し、フェーズ 2の組織切片を示す図（図面代用写真）である。

第 3図は、実施例 2に関し、フェーズ 4の組織切片を示す図（図面代用写真）である。

第 4図は、実施例 2に関し、フェーズ 5の組織切片を示す図（図面代用写真）である。

第 5図は、実施例 2に関し、フェーズ 6の組織切片を示す図（図面代用写真）である。

第 6図は、実施例 3に関し、ヒト R A滑膜組織における y - G T P の発現を示す図（図面代用写真）である。発明を実施するための最良の形態まず、本発明に係る慢性関節リゥマチの検査診断方法の好適な実施形態としては、ヒト慢性関節リウマチ疾患の炎症部位（滑膜、パンヌス、関節軟骨、形質細胞）や尿等に発現している y _GT P、特に好適には形質細胞、滑膜、パンヌス、関節軟骨に発現している GT Ρを、現在肝疾患等の検查診断で一般的に用いられている公知の _Ί— GT Ρ活性測定法によって確認する方法を挙げることができる。なお、パンヌスとは滑膜が病的に増殖したものを意味する。

この測定値が高い場合には、慢性関節リゥマチ疾患であるとの検査及び診断を行うことができる。なお、 γ - GT Ρ活性測定法の原理は、 Ν - (D L-γ -glutamyl) aniline ( I ) を基質にし、了クセプターとしてアミノ酸（ I I ) を加え、反応生成物のァゾ色素を比色するというものであり、市販キットを適宜利用して実施することができる。また、本発明では、 "V - GT P活性が同じでも蛋白質が異なるものも存在し得ることから、抗 y_G T P抗体と特定の γ-GT P蛋白質との特異的な抗原抗体反応を利用した直接検出法（免疫学的手法）によつて、直接この y - GT P蛋白質の発現を確認し、慢性関節リウマチ疾患の検査及び診断を確実に行う実施形態を採用することができる。

ここで、 y- GT P蛋白質は、破骨細胞の形成活性や骨破壌との関連で発現するものが、慢性関節リゥマチのマーカーとして好適と考えられる。

具体的には、添付する配列表（Sequencing List) の配列番号 1に示された DNA ( c D N A) 塩基配列（鎖の数：二本鎖、ハイポセティカル配列： N o、アンチセンス： N o、配列の特徴を決定した方法： S)及び同配列表の配列番号 2に示されたアミノ酸配列（トポロジー：直線状，配列の種類：タンパク質、配列の特徴を決定した方法： S) で特定される y - GT P蛋白質をマーカーとして選択し、抗 γ - GT P 抗体との反応性を確認する。

なお、抗 γ- GT Ρ抗体は、 GT Ρ蛋白質と特異的に結合するものであればよく、特に限定されない。慢性関節リウマチ患者から特異的に発現される特定の γ- GT Ρ蛋白質を直接検出することにより、慢性関節リゥマチの診断を確実に行うことが可能となる。

更には、 R T— P C R (polymerase chain reaction:合成酵素連鎖反応）法により γ -GT P蛋白質をコードする mRNA発現を確認する方法に基づいて、 y_GT Pの発現を確認し、慢性関節リゥマチ疾患であるとの検査及ぴ診断を行う実施形態も採用することができる。なお、上記以外の方法でも、 γ- GT Ρ蛋白質を確実に検出できる方法であれば、本発明の実施形態の一つとして採用できる。例えば、抗体を用いたィムノアッセィ法としては、ラジオィムノアッセィ（R I Α) 並びに酵素抗体法（E L I S Α) 、ラジオアイソトープを使わない競合的酵素抗体法（Ε Ι Α) などがある。また、ビアコア等のバイォセンサー装置を用いた γ - GT Ρ蛋白質の検出も可能である。

次に、本発明に係る慢性関節リゥマチの検査診断試薬の好適な実施形態としては、例えば "v-GT Ρと特異的に結合する抗 V - GT Ρ抗体を少なくとも含有する構成を備える試薬が考えられる。

なお、この試薬の具他的形態は広く解釈されるものであり、更には、この試薬を備える検査診断キットゃ抗 y _G T P抗体等をリガンドに備える検出表面を持つバイオセンサーチップ等も提供することができる。

ぐ実施例 1 >

慢性関節リウマチ（以下、「RA」と略称する。）のモデル動物の炎症部位における T/ - GT P遺伝子の発現を確認する実験を行った。

R Aのモデル動物である C I A (Collagen induced arthritis) マウスの RA様炎症部位（主に足関節）に γ - GT Pの mRNA発現を R T— P C R法により確認した。通常のマウス及び R A様炎症の発症前には、 γ- GT Ρの mR Ν Αの発現は全く確認されなかった。

C I Aマウスの作製は、鈴木らの方法（Yu Suzuki at al. , J Rheumatol.， 1998； 25： 1154-60) に従って行った。

即ち、 5— 7週齢、ォスの D B AZ 1 Jマウス（日本チヤ一ルスリバー）に 0. 1 111 _§のゥシ 1 I型コラーゲン（コラーゲン技術研修会）と Freund' s complete adjuvant, H- 37 Ra (Difco) を混合して、尾の付け根に免疫した。更に、 3週間後前回と等量のゥシ I I型コラーゲンを Freund s incomplete adjuvant と混合して追カロ免し 7こ。

発症の 1 0 日後に炎症のピークとなるので、 C O ₂ガスにより安楽死させ、炎症部位（主に関節）を採取し、 RNAを調製した。この際、採取した部位は直ちに液体窒素で凍結させ、フリ一ザ一ミルにて粉砕し、 AG P C法等の RN A抽出法にて、 T o t a l RNAを分離■精製した。

比較のために、 D B A/ 1 Jマウスの腎臓（k i d n e y) 、免疫前関節（ c o n t r o l j o i n t ) 、免疫後関節おょぴ炎症を起こしたマウスの骨格筋肉（S k e l e t a l mu s c l e ) を上記と同様の方法で採取し、 T o t a l RNAを調製した。

これら 4種類の T o t a 1 RNA ( 0. 5 μ g) をテンプレートとして、 RT— P C R (Perkin Elraer 社製キット）を行った。 γ - G T P の増幅には 2種類のプライマーとして、フォワードプライマー ( 5' -ATCATCGGCCTCTGTATCTG-3' ) とリバースプライマー (5' -GCTGTTGTAGATGGTGAAGA-3' ) を用レヽた。これ^:よって増幅される DNAは 2 2 8塩基対である。

また、コントローノレとして G 3 P D Η (または DAP DH： Clontech 社製）を用いた。このプライマーによって増幅される DNAは 9 8 3 塩基対である。 R T— P C R反応は、キット添付の条件に従って行つた。反応終了後に反応生成物の 1 / 1 0容量を 1 %ァガロースゲル電気泳動により、目的の DN Aバンドを検出した。添付した図 1は、この結果を表している。

ここで、図 1 (図面代用写真）に示されているように、 4種類の組織ではほぼ等量の G 3 P D HmRN Aの発現量であり、全 RN Aもほぼ等しいと考えられる。よって、 y- GT Pは、定常的に発現している腎臓以外では、 R A様炎症部位に発現していることが明らかになった。ぐ実施例 2 >

「慢性関節リゥマチのモデル動物の炎症部位における γ-GT P蛋白質の発現」（炎症や骨破壌の進行と破骨細胞、 γ - GT Pとの関係） C I Aマウス（実施例 1 ) は、ゥシ I I型コラーゲンを免疫後、次のように分類した。初回免疫前日をフェーズ 1、追加免疫前日をフエーズ 2、肉眼的に腫脹が認められた時斯をフェーズ 3、発症の 1 0 日後をフェーズ 4、発症の 2 0日後をフェーズ 5、発症の 6 0 日後をフエーズ 6 とした。

各フェーズのマウスを co₂ガスにより安楽死させ、関節部位を採取して免疫化学的に検討した。即ち、採取した関節をパラフィン包埋後、下肢長軸方向に切片を連続的に作製した。

トラップ（T R A P )染色は Endocrinology, 122， 1373 (1988)に従い、脱パラフィン後、酒石酸存在下で基質（Naphthol AS- MXphosphate) と色素（Fast redviolet LB salt) を 3 7 °Cで反応させて染色した。以後の操作は脱水、透徹、封入して組織切片とする。また、核をメチルグリーンにて染色した。抗 γ - G T P抗体を用いた免疫染色（ i mm u n o s t a i n ) を定法に従い、ャギ抗ラット γ - G T P抗体を用いて行った。図 2 (図面代用写真）に示すように、フェーズ 2の組織切片では、 T RAP陽性の破骨細胞はなく、 γ - G T Ρ蛋白質も殆んど認められなかった。

図 3 (図面代用写真）に示すように、フェーズ 4になると関節軟骨の関節側表面と軟骨と骨髄の境目に顕著に破骨細胞が認められた。また、 S重脹した滑膜（S y n o v i a l m e m b r a n e ) やパンヌス（P a n n u s ) に γ— G T Pが認められる。

図 4 (図面代用写真），図 5 (図面代用写真）にそれぞれ示すように、フェーズ 5、 6では破骨細胞と γ - G Τ Ρの検出部位が広がると共に増加していることがわかった。特に、 γ- GT Ρは滑膜やパンヌス内部の毛細血管（C a p i l l a r y)や形質細胞（P l a s m a c e l l s ) にも明らかに発現が認められた。

このようにして、症状（骨破壊）の進行に比例して γ - GT Pの発現量も増えていることがわかった。ぐ実施例 3 >

「慢性関節リゥマチ患者の滑膜組織における γ-GT Pの発現」 RA患者の同意を得て、関節置換術の際、摘出された不要な滑膜組織をパラフィン包埋後、実施例 2の方法により、抗ヒト γ - GT P抗体を用いた免疫染色と HE (へマトキシリン ' ェォジン）染色を行つた。

HE染色は、脱パラフィン後へマトキシリン液で染色し、水洗した後、軽く 8 0 %エタノールに通した後、ェォジン液で染色し、軽く水洗する。その後、脱水、透徹、封入して組織切片とした。

ポロ。

図 6 (図面代用写真）に示すように、滑膜組織に炎症系細胞が多数浸潤し、その中の滑膜細胞と形質細胞に y _GT Pが顕著に発現していることが明らかになつた。

上記実施例 1〜 3によって、本願発明の実施可能性が充分実証された。なお、実施例 1 と同様に R T_ P C Rによって、ヒト滑膜組織での y _GT Ρの mRNAの発現を確認する実施例、ヒト滑液（関節腔に溜まったリンパ液）の T/ - GT P活性を測定し R A症状と γ-GT P 活性の関係を確認する実施例、ヒト滑液中の V - GT P蛋白質の発現を抗体を用いた免疫沈降で検出する実施例、 R A患者の尿中 Y -G T P活性の検出により R A症状と γ - GT Ρ活性の関係を明らかにする実施例、 RA患者の滑液中の V - GT P蛋白質及び部分分解物に対して抗体を用いた E L I S Α·法による検出することにより、 R Α症状と γ _G T P蛋白質量の関係を明らかにする実施例等も挙げることができる。産業上の利用可能性

本発明によって、 γ - G T Ρに関し、慢性関節リゥマチのマーカーとしての全く新規な用途を提案できる。そして、 γ - G T Pの測定方法又は検出方法は、既に医療分野等において確立されている技術を用いて、慢性関節リゥマチの生化学的な検査診断方法及び検査診断試薬を医療分野に容易かつ迅速に普及させることができる。更には、慢性関節リゥマチの決定的な生化学的検査診断技術を提供できるので、慢性関節リウマチの早期診断、早期治療に役立てることができる。

Claims

請求の範囲

1 . γ 一グルタミルトランスぺプチダーゼをマーカーとする慢性関節リゥマチの検査診断方法。

2 . γ - G Τ Ρ活性測定法に基づいて前記 y—グルタミルトランスぺプチダーゼを検出することを特徴とする請求の範囲第 1項に記載された慢性関節リゥマチの検査診断方法。

3 . 抗 γ —グルタミルトランスぺプチダーゼ抗体を用いた直接検出法に基づいて γ 一グルタミルトランスぺプチダーゼ蛋白質を検出することを特徴とする請求の範囲第 1項に記載された慢性関節リウマチの検査診断方法。

4 . P C R法に基づいて前記 γ -グルタミノレトランスぺプチダーゼの m R N Α発現を確認することを特徴とする請求の範囲第 1項に記载された慢性関節リゥマチの検査診断方法。

5 . 一グルタミルトランスぺプチダーゼと反応する物質を少なくとも含有する慢性関節リゥマチの検査診断試薬。