WO2003006410A1 - Method of producing reduced coenzyme q10 as oily product - Google Patents

Description

明細書

還元型補酵素 Q i。油状物の製造方法 技術分野

本発明は、 還元型補酵素 。の製造方法に関する。 還元型補酵素 。は、 酸 化型補酵素 。に対して高い経口吸収性を示し、 優れた食品、 栄養機能食品、 特定保健用食品、 栄養補助剤、 栄養剤、 動物薬、 飲料、 飼料、 化粧品、 医薬品、 治療薬、 予防薬等として有用な化合物である。 背景技術

還元型補酵素 。は、 例えば、 合成、 発酵、 天然物からの抽出等の従来公知 の方法により補酵素 。を得た後、 クロマトグラフィ一により流出液中の還元 型補酵素 Q i。区分を濃縮する方法等により得られることが知られている （特開 平 1 0— 1 0 9 9 3 3号公報） 。 この場合には、 上記還元型補酵素 0 。中に含 まれる酸化型補酵素 。を、 水素化ホウ素ナトリウム、 亜ジチオン酸ナトリウ ム （次亜硫酸ナトリウム） 等の一般的な還元剤を用いて還元した後、 クロマトグ ラフィ一による濃縮を行っても良く、 また、 還元型補酵素 Q _{1 0}は、 既存の高純 度補酵素 Q ₁。に上記還元剤を作用させる方法によっても得られることも、 該特 許公報中に記載ざれている。

また、 特開昭 5 7— 7 0 8 3 4公報には、 補酵素 。をへキサンに溶解し、 これに補酵素 Q _{1 0}の 2倍重量のハイ ドロサルファイ トソーダ （次亜硫酸ナトリ ゥム） を含有する水溶液を加えて攪拌し、 還元型補酵素 。を合成した例が開 示されている。

しかしながら、 従来の方法では、 生成した還元型補酵素 。の有機溶媒を用 いた抽出及び濃縮等の操作が必要であるため、 製造工程の所要時間は必然的に長 くなり、 又、 高価な製造装置や容量等を必要とする。

さらに、 還元型補酵素 Q _{1 0}を含有する有機相から溶媒を留去しようとすると、 溶媒留去中に還元型補酵素 。が半固体状或いは固体状に析出して、 撹拌の負 荷増大や撹拌不良を生じ、 その結果として溶媒留去が不完全になる傾向がある。 この現象は、 一般に、 還元型補酵素 。の純度が高い場合により顕著となる傾 向がある。

還元型補酵素 。のこのような性質は、 還元型補酵素 。を単離する場合の みならず、 晶析を行う場合など、 上記有機相の溶媒を他の溶媒に置換して、 還元 型補酵素 Q _{1 0}の溶液又はスラリーを調製する際にも問題となる。 溶媒置換には、 溶剤を補充して溶媒留去操作を繰り返すという煩雑な操作が必要であり、 以下の ように、 工業的規模における作業上、 経済上、 品質上の問題を生じる。

高沸点溶媒から低沸点溶媒への置換や用いる溶剤同士が共沸混合物を形成する 場合は、 多くの溶剤を用い、 又、 時間のかかる、 極めて非効率な溶媒置換となる。 また、 補充する溶剤中に共存する好ましくない成分や不純物 （例えば、 高沸点成 分や難揮発性成分） は溶液中に高濃度に蓄積される。 例えば、 高沸点のヘプタン 溶液から低沸点のテトラヒ ドロフラン溶液への溶媒の置換のように、 溶媒置換が 極めて非効率となり、 更に、 テトラヒ ドロフラン中に共存する 2， 6—ジ t e r tーブチルー 4—ヒ ドロキシトルエン （B H T) 等の安定剤は溶液中に必要以上 に高濃度に蓄積される可能性がある。

さらに、 還元型補酵素 。は、 分子酸素によって酸化型補酵素 Q _{1 0}に酸化さ れやすい。 工業的規模での製造においては、 完全な酸素の除去は極めて難しく、 更に、 個々の操作に要する時間はラボスケールでの製造とは異なりかなり長時間 になるため、 残存する酸素が大きな悪影響を及ぼす。 上記酸化は難除去性の酸化 型捕酵素 Q _{1 0}の副生及び製品への混入といった収率、 品質面の問題に直結する。 高純度の還元型補酵素 。を得るためには、 上記酸化から好適に防護する観点 から、 濃縮、 溶媒置換等の操作時間を短縮することが望ましい。

このように、 有機溶媒による抽出及び濃縮等の付加的な操作を必要とせず、 還 元型補酵素 Q _{1 ()}を直接かつ簡便に取得する方法、 及び Z又は、 還元型補酵素 Q ₁ 。を含有する有機相から、 攪拌不良を引き起こすことなく、 簡便かつ短時間で有 機溶媒を留去する方法が求められていた。 発明の要約

本発明は、 上記に鑑み、 工業的規模での製造に適した、 高品質の還元型補酵素 Q i。の簡便且つ効率的に得るための方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、 鋭意研究した結果、 酸化型補酵素 。の油状物を水中で還元 剤と反応させることにより、 意外にも、 高品質の還元型補酵素 。を製造でき ることを見出し、 これにより工業的規模での生産に優れた本発明を完成するに至 つた。 また、 還元型補酵素 。を融解温度以上 （溶媒や不純物が還元型補酵素 Q i。に含まれることによって還元型補酵素 Q i。の融解温度に幅がある場合は、 融解開始温度以上） にすることにより、 意外にも、 粘性が低く、 操作しやすい油 状物として還元型補酵素 Q _{1 0}を取得できることを見出し、 これにより工業的規 模での生産に優れた本発明を完成するに至った。

即ち、 本発明は、 酸化型補酵素 。の油状物を水中で還元剤と反応させ、 還 元型補酵素 Q ₁。の油状物を合成することからなる、 還元型補酵素 Q ,。の製造方 法である。

本発明の製造方法によれば、 得られた反応混合物から水相を分離することによ り、 還元型補酵素 。の油状物を取得することができ、 また、 得られた反応混 合物を冷却することにより、 還元型補酵素 Q _{1 0}を該反応系中において結晶化さ せ、 該結晶を取得することもできる。

本発明により、 酸化から防護された還元雰囲気にある反応系中で還元型補酵素 。を生成させ、 さらに該反応系中で、 結晶状態へ移行させることができ、 還 元型補酵素 Q ,。の有機相への抽出、 煩雑な溶媒置換等の付加的な操作を必要と せず、 操作時間を劇的に減少させ、 酸化型補酵素 Q _{1 0}の還元反応から還元型補 酵素 Q i。の採取までの一連の工程における酸化型補酵素 Q i。の副生を最小化し て、 高品質の還元型補酵素 Q i。結晶を効率よく製造することができる。

また、 本発明は、 還元型補酵素 。を含有する有機相から、 還元型補酵素 0の融解温度以上の温度で有機溶媒を留去することにより、 還元型補酵素 Q i。の 油状物を取得することからなる、 還元型補酵素 Q _{1 0}の取得方法でもある。

本発明の取得方法によれば、 攪拌不良を生じることなく、 簡便かつ短時間で、 還元型補酵素 。を含有する有機相から、 有機溶媒を留去し、 還元型補酵素 。の油状物を取得することができる。

また、 上記のいずれかの方法で得られる還元型補酵素 Q _{1 0}の油状物は、 所望 の溶媒を加えることにより、 簡便に、 還元型補酵素 Q₁₀を含有する溶液又はス ラリーとすることができる。 さらには、 得られた還元型補酵素 Q₁₀の油状物に、 前記油状物の融解温度未満の温度で還元型補酵素 。の種晶を接触させること により、 還元型補酵素 。を速やかに固化させ、 結晶として得ることもできる。 以上のように、 本発明の方法によれば、 還元型補酵素 。の有機相への抽出 等の付加的な操作を必要としないだけでなく、 還元型補酵素 Q₁₀を含有する有 機相を濃縮する場合においても、 攪拌負荷の増大や攪拌不良といった問題を生じ ることなく、 操作時間を劇的に短縮し、 還元型補酵素 Q₁₀の採取までの一連の 工程における酸化型補酵素 。の副生を最小化して、 高品質の還元型補酵素 。を効率よく取得することができる。

さらに、 本発明によれば、 還元型補酵素 。を所望の溶媒の溶液又はスラリ 一として容易に取得することができ、 沸点差の大きい溶媒置換 （即ち、 高沸点溶 媒から低沸点溶媒への置換） や、 用いる溶剤同士が共沸混合物を形成する場合に おいても、 極めて効率的に溶媒置換を実施することが可能である。 発明の詳細な開示

以下、 本発明を詳細に説明する。

本発明は、 酸化から還元型補酵素 Q₁₀を好適に防護する観点から、 濃縮、 溶 媒置換等の操作時間を短縮するために、 還元型補酵素 。の油状物を製造ある いは取得するものであり、 本発明には以下の二つが含まれる。

第一は、 酸化型補酵素 。の油状物を水中で還元剤と反応させ、 還元型補酵 素 Q₁₀の油状物を製造あるいは取得する発明であり、 第二は、 還元型補酵素 。を含有する有機相から、 還元型補酵素 Q₁₀の融解温度以上の温度で有機溶媒を 留去することにより、 還元型補酵素 Q₁₀の油状物を製造あるいは取得する発明 である。

まず、 酸化型補酵素 Q₁₀の油状物を水中で還元剤と反応させ、 還元型補酵素 Q₁₀の油状物を取得する第一の発明について説明する。

本発明においては、 酸化型補酵素 。を水中で還元剤と反応させ、 還元型補 酵素 Q₁₀を合成する。 本発明に用いる酸化型補酵素 Q i。は、 既存の高純度補酵素 Q 。のように酸化 型補酵素 。のみからなるものであってもよく、 酸化型補酵素 Q i。と還元型補 酵素 。の混合物であってもよい。

本発明に用いる酸化型補酵素 。の油状物は、 酸化型補酵素 。を融解させ て油状化したものであり、 反応に悪影響を及ぼさない程度に種々の不純物や溶媒 等を含んでいてもよいが、 単に酸化型補酵素 。を有機溶媒に溶かした溶液と は異なる。

本発明における反応溶媒は、 実質的に水のみからなるものである。 有機溶媒を わずかに含むものであってもよいが、 その含量は水に対して 1 O w/w %以下が 好ましく、 5 wZw %以下がより好ましく、 1 wZw %以下がさらに好ましい。 酸化型補酵素 。の還元反応に用いる還元剤としては特に限定されないが、 好ましくは、 鉄 （金属又は塩としての鉄） 、 亜鉛 （金属としての亜鉛） 、 次亜硫 酸類である。

鉄または亜鉛を用いる還元は、 酸を使用して実施されることが好ましい。 酸と しては特に制限されないが、 例えば、 酢酸等の脂肪酸、 メタンスルホン酸等のス ルホン酸、 塩酸や硫酸等の無機酸等を挙げることができる。 好ましくは無機酸で あり、 より好ましくは、 硫酸である。

鉄の使用量は特に制限されないが、 酸化型補酵素 Q _{1 0}の仕込み重量に対して、 例えば、 約 1 5重量以上で好適に実施できる。 上限は特に制限されないが、 経 済性の観点等から、 約 2倍重量が好ましい。 なお、 鉄は、 金属鉄のみならず、 硫 酸鉄 （Π) 等の塩の形態でも使用できる。

亜鉛の使用量は特に制限されないが、 酸化型補酵素 Q _{1 0}の仕込み重量に対し て、 例えば、 約 1 / 1 0重量以上で好適に実施できる。 上限は特に制限されない 、 経済性の観点等から、 約 2倍重量が好ましい。

次亜硫酸類としては特に制限されず、 通常、 次亜硫酸の塩である。 次亜硫酸の 塩としては特に限定されず、 アルカリ金属塩、 アルカリ土類金属塩、 アンモニゥ ム塩等が好ましく、 リチウム塩、 ナトリウム塩、 カリウム塩等のアルカリ金属塩 がより好ましく、 ナトリウム塩がさらに好ましい。

上記次亜硫酸類の使用量は特に制限されないが、 酸化型補酵素 。の仕込み 重量に対して、 約 1/5重量以上が好ましく、 より好ましくは約 2/ 5重量以上、 さらに好ましくは約 3Z5重量以上である。 多くても特に支障はないが、 経済的 に不利であるため、 好ましくは約 2倍重量以下、 より好ましくは同重量以下で用 いられる。 普通、 約 2 5重量〜約同重量の範囲で好適に実施できる。

上記還元剤のうち、 還元能力、 収率、 品質といった観点から、 亜鉛、 次亜硫酸 類が好ましく、 特に次亜硫酸類 （具体的には、 次亜硫酸塩） が好ましい。

上記次亜硫酸類を用いる還元は、 収率等の観点から、 pH 7以下で実施するの が好ましく、 より好ましくは pH3〜7、 さらに好ましくは pH3〜6で実施さ れる。 上記 pHは、 酸 （亜例えば、 塩酸や硫酸等の鉱酸） や塩基 （例えば、 水酸 化ナトリウム等のアルカリ金属水酸化物） を用いて調整することができる。

本発明における酸化型補酵素 。の仕込み濃度は特に限定されないが、 上限 は、 水に対して、 30wZw%が好ましく、 より好ましくは 20 wZw%である。 生産性等の観点から、 下限は、 l wZw%が好ましく、 より好ましくは 5w/w %、 さらに好ましくは 1 Ow_ w%である。

上記還元反応後、 生成した還元型補酵素 。を該反応系から結晶化する場合 には、 結晶化した還元型補酵素 Q 0のスラリ一濃度ゃスラリ一性状を好適な範 囲に調整，維持するために、 還元型補酵素 。の濃度を適宜増減できる。 スラ リー濃度、 スラリー性状の観点から、 水重量に対する反応後の還元型補酵素 。の重量として、 20 wZw%以下が好ましく、 より好ましくは 15 ％以 下である。

本発明における還元反応温度は、 酸化型補酵素 Q ,。の純度や酸化型補酵素 Q！ 。と還元型補酵素 。の比率等にもより、 一律には規定できないが、 普通 45°C 以上、 好ましくは 48 °C以上、 より好ましくは 50°C以上である。 上限は、 系の 沸点が好ましく、 100°Cがより好ましく、 80°Cがさらに好ましく、 60°Cが 特に好ましい。

本発明における還元反応は、 強制流動下に実施するのが好ましい。 単位容積当 たりの撹拌所要動力として、 通常約 0. 01 kW/m³以上、 好ましくは約 0. 1 kW/m³以上、 より好ましくは約 0. 3 kWZm³以上の流動が好ましい。 上記の強制流動は、 通常、 撹拌翼の回転により与えられるが、 上記流動が得られ れば必ずしも撹拌翼を用いる必要はなく、 例えば、 液の循環による方法などを利 用しても良い。

上記還元反応は、 通常、 4 8時間以内、 好ましくは 2 4時間以内、 より好まし くは 1 0時間以内、 とりわけ 5時間以内に完了させることができる。

上記還元反応、 特に次亜硫酸類を還元剤として用いる還元反応は、 脱酸素雰囲 気下で実施するのが極めて好ましく、 還元反応収率の向上や還元剤量の削減に大 きく寄与することも見い出した。 脱酸素雰囲気は、 不活性ガスによる置換、 減圧、 沸騰やこれらを組み合わせることにより達成できる。 少なくとも、 不活性ガスに よる置換、 即ち、 不活性ガス雰囲気を用いるのが好適である。 上記不活性ガスと しては、 例えば、 窒素ガス、 ヘリウムガス、 アルゴンガス、 水素ガス、 炭酸ガス 等を挙げることができ、 好ましくは窒素ガスである。

このようにして得られた反応混合物から、 引き続き、 水相を分離することによ り、 更に必要に応じ、 例えば水や食塩水等を用いて水洗を行い、 還元型補酵素 Q i。の油状物を取得することができるし、 或いは、 上記反応混合物を冷却するこ とにより、 生成した還元型補酵素 。を該反応系中において結晶化させること もできる。

還元型補酵素 Q _{1 0}を油状物として取得する場合は、 油状物と水相の分離や、 必要に応じ実施される油状物の水洗は、 加温下に行われることが好ましい。 その 温度は、 還元型補酵素 。の純度等にもより、 特に制限されないが、 約 4 5 °C 以上が好ましく、 より好ましくは約 4 8 °C以上、 さらに好ましくは 5 0 °C以上で ある。 上限は、 系の沸点が好ましく、 約 1 0 0 °Cがより好ましく、 約 8 0 °Cがさ らに好ましく、 約 6 0 °Cが特に好ましい。

さらに、 反応混合物を冷却することにより、 還元雰囲気下で、 還元型補酵素 Q _{1 0}の結晶として取得することもできる。 冷却温度は特に制限されないが、 約 5 0 °C未満が好ましく、 より好ましくは 4 8 °C未満、 さらに好ましくは 4 5 °C未 満である。 下限は、 系の固化温度が好ましく、 0でがより好ましい。 一般に、 0 〜4 0 °Cで好適に実施される。

結晶化のための冷却は特に制限されないが、 好ましくは約 4 0 °C/時間以下、 より好ましくは約 3 0 °じノ時間以下、 さらに好ましくは約 2 0 °C /時間以下の冷 却速度で実施される。 尚、 還元型補酵素 Q _{1 0}の有機溶媒系での晶析では、 一般 に濾過性やスラリー性状等が悪く、 操作性が良好ではない場合が多いが、 本発明 では、 大粒径の結晶を得ることも可能であり、 これら操作性を格段に向上させる ことができる。

還元型補酵素 。の結晶化は、 強制流動下に実施するのが好ましい。 単位容 積当たりの撹拌所要動力として、 通常約 0 . O l k WZm ³以上、 好ましくは約 0 . 1 k W/m ³以上、 より好ましくは約 0 . 3 k W/m ³以上の流動が好まし レ、。 上記の強制流動は、 通常、 撹拌翼の回転により与えられるが、 上記流動が得 られれば必ずしも撹拌翼を用いる必要はなく、 例えば、 液の循環による方法など を利用しても良い。

このように、 反応混合物から結晶化を行うことにより、 酸化型補酵素 。の 副生を最小にして、 高品質の還元型補酵素 Q！。結晶を得ることができる。

次に、 還元型補酵素 。を含有する有機相から、 還元型補酵素 。の融解温 度以上の温度で有機溶媒を留去することにより、 還元型補酵素 Q _{1 0}の油状物を 取得する第二の発明について説明する。

本発明に使用しうる還元型補酵素 。は、 先述のごとく、 例えば、 合成、 発 酵、 天然物からの抽出等の従来公知の方法により得ることができる。 好ましくは、 既存の高純度補酵素 Q！。などの酸化型補酵素 Q i。、 あるいは酸化型補酵素 Q！ _Q と還元型補酵素 Q _{1 0}の混合物を、 一般的な還元剤を用いて還元することにより 得ることができる。 まずは、 酸化型補酵素 。を還元する方法について説明す る。

還元型補酵素 Q ,。は分子酸素によって酸化され、 酸化型補酵素 Q 。を副生し やすいため、 還元工程の溶媒として、 還元型補酵素 Q _{1 0}を酸化から防護する作 用の高い溶媒を用いるのが好ましい。 このような溶媒としては、 炭化水素類、 月旨 肪酸エステル類、 エーテル類、 及び、 二トリル類のうち少なくとも一種を用いる のが好ましく、 最も好ましくは炭化水素類である。

炭化水素類としては特に制限されないが、 例えば、 脂肪族炭化水素、 芳香族炭 化水素、 ハロゲン化炭化水素等を挙げることができる。 特に、 脂肪族炭化水素、 芳香族炭化水素が好ましく、 とりわけ、 脂肪族炭化水素が好ましい。 脂肪族炭化水素としては、 環状、 非環状を問わず、 又、 飽和、 不飽和を問わず、 特に制限されないが、 通常、 炭素数 3〜2 0、 好ましくは、 炭素数 5〜 1 2のも のが用いられる。

具体例としては、 例えば、 プロパン、 ブタン、 イソブタン、 ペンタン、 2—メ チノレブタン、 シクロペンタン、 2—ペンテン、 へキサン、 2—メチノレペンタン、 2 , 2—ジメチ^/ブタン、 2， 3—ジメチノレブタン、 メチルシクロペンタン、 シ クロへキサン、 1一へキセン、 シクロへキセン、 ヘプタン、 2—メチノレへキサン、 3—メチルへキサン、 2、 3—ジメチルペンタン、 2 , 4 _ジメチルペンタン、 メチルシクロへキサン、 1一ヘプテン、 オクタン、 2， 2 , 3 _トリメチルペン タン、 イソオクタン、 ェチルシクロへキサン、 1—ォクテン、 ノナン、 2 , 2， 5—トリメチノレへキサン、 1一ノネン、 デカン、 1—デセン、 p—メンタン、 ゥ ンデカン、 ドデカン等を挙げることができる。

中でも、 炭素数 5〜 8の飽和脂肪族炭化水素が好ましく、 炭素数 5のペンタン、 2—メチルブタン、 シクロペンタン （ペンタン類と称す） ；炭素数 6のへキサン、 2—メチルペンタン、 2， 2—ジメチノレブタン、 2， 3—ジメチルブタン、 メチ ルシクロペンタン、 シクロへキサン （へキサン類と称す） ；炭素数 7のヘプタン、 2—メチルへキサン、 3—メチルへキサン、 2 , 3—ジメチルペンタン、 2 , 4 —ジメチルペンタン） 、 メチルシクロへキサン （ヘプタン類と称す） ；炭素数 8 のオクタン、 2 , 2， 3—トリメチノレペンタン、 イソオクタン、 ェチルシクロへ キサン （オクタン類と称す） 、 及びこれらの混合物が好ましく用いられる。 とり わけ、 上記ヘプタン類は酸化からの防護効果が特に高い傾向がありさらに好まし く、 ヘプタンが最も好ましい。

芳香族炭化水素としては、 特に制限されないが、 普通、 炭素数 6〜2 0、 特に 炭素数 6 ~ 1 2、 とりわけ炭素数 7〜1 0のものが好適に用いられる。 具体例と しては、 例えば、 ベンゼン、 トルエン、 キシレン、 o—キシレン、 m—キシレン、 p—キシレン、 ェチルベンゼン、 クメン、 メシチレン、 テトラリン、 ブチルベン ゼン、 p—シメン、 シクロへキシノレべンゼン、 ジェチノレべンゼン、 ペンチノレベン ゼン、 ジペンチルベンゼン、 ドデシルベンゼン、 スチレン等を挙げることができ る。 好ましくは、 トルエン、 キシレン、 o—キシレン、 m—キシレン、 p—キシ レン、 ェチノレベンゼン、 クメン、 メシチレン、 テトラリン、 ブチルベンゼン、 p ーシメン、 シクロへキシ/レベンゼン、 ジェチノレベンゼン、 ペンチルベンゼンであ り、 より好ましくは、 トルエン、 キシレン、 o—キシレン、 m—キシレン、 p— キシレン、 クメン、 テトラリンであり、 最も好ましくは、 クメンである。

ハロゲン化炭化水素としては、 環状、 非環状を問わず、 又、 飽和、 不飽和を問 わず、 特に制限されないが、 一般に、 非環状のものが好ましく用いられる。 普通、 塩素化炭化水素、 フッ素化炭化水素が好ましく、 特に塩素化炭化水素が好ましレ、。 炭素数 1〜6、 特に炭素数 1〜4、 とりわけ炭素数 1〜2のものが好適に用いら れる。

具体例としては、 例えば、 ジクロロメタン、 クロ口ホルム、 四塩化炭素、 1 , 1—ジクロロェタン、 1， 2—ジクロロェタン、 1 , 1， 1一トリクロロェタン、 1 , 1， 2—トリクロロェタン、 1 , 1 , 1 , 2—テトラクロロェタン、 1, 1 , 2 , 2—テトラクロロェタン、 ペンタクロロエタン、 へキサクロロェタン、 1 , 1—ジクロロエチレン、 1 , 2—ジクロロエチレン、 トリクロロエチレン、 テト ラクロ口エチレン、 1, 2—ジクロロプロノヽ⁰ン、 1 , 2， 3— トリクロロプロノ ン、 クロ口ベンゼン、 1, 1， 1， 2—テトラフルォロェタン等を挙げること力 S できる。

好ましくは、 ジクロロメタン、 クロ口ホルム、 四塩化炭素、 1， 1—ジクロ口 ェタン、 1 , 2—ジクロロェタン、 1， 1, 1—トリクロロェタン、 1 , 1， 2 一 トリクロロェタン、 1 , 1ージクロ口エチレン、 1 , 2—ジクロ口エチレン、 トリクロロエチレン、 クロ口ベンゼン、 1 , 1 , 1 , 2—テトラフノレォロェタン であり、 より好ましくは、 ジクロロメタン、 クロ口ホルム、 1 , 2—ジクロロェ チレン、 トリクロロエチレン、 クロ口ベンゼン、 1 , 1 , 1， 2—テトラフノレオ 口エタンである。

脂肪酸エステル類としては、 特に制限されないが、 例えば、 プロピオン酸エス テル、 酢酸エステル、 ギ酸エステル等を挙げることができる。 特に、 酢酸エステ ル、 ギ酸エステルが好ましく、 とりわけ、 酢酸エステルが好ましい。 特に制限さ れないが、 一般に、 エステル基としては、 炭素数 1〜8のアルキル基又はァラル キル基、 好ましくは炭素数 1〜 6のアルキル基、 より好ましくは炭素数 1〜 4の アルキル基が好ましく用いられる。

プロピオン酸エステルとしては、 例えば、 プロピオン酸メチル、 プロピオン酸 ェチル、 プロピオン酸ブチル、 プロピオン酸ィソペンチルを挙げることができる。 酢酸エステルとしては、 例えば、 酢酸メチル、 酢酸ェチル、 酢酸プロピル、 酢 酸イソプロピル、 酢酸ブチル、 酢酸イソブチル、 酢酸 s e c—ブチル、 酢酸ペン チル、 酢酸イソペンチル、 酢酸 s e c一へキシル、 酢酸シクロへキシル、 酢酸べ ンジル等を挙げることができる。 好ましくは、 酢酸メチル、 酢酸ェチル、 酢酸プ 口ピル、 酢酸ィソプロピル、 酢酸ブチル、 酢酸ィソブチル、 酢酸 s e c—ブチル、 酢酸ペンチノレ、 酢酸イソペンチノレ、 酢酸 s e c—へキシル、 酢酸シクロへキシノレ であり、 より好ましくは、 酢酸メチル、 酢酸ェチル、 酢酸プロピル、 酢酸イソプ 口ピル、 酢酸ブチル、 酢酸イソブチルであり、 最も好ましくは、 酢酸ェチルであ る。

ギ酸エステルとしては、 例えば、 ギ酸メチル、 ギ酸ェチル、 ギ酸プロピル、 ギ 酸イソプロピル、 ギ酸ブチル、 ギ酸イソブチル、 ギ酸 s e c—ブチル、 ギ酸ペン チル等を挙げることができる。 好ましくは、 ギ酸メチル、 ギ酸ェチル、 ギ酸プロ ピル、 ギ酸ブチル、 ギ酸イソブチル、 ギ酸ペンチルであり、 最も好ましくは、 ギ 酸ェチルである。

エーテル類としては、 環状、 非環状を問わず、 又、 飽和、 不飽和を問わず、 特 に制限されないが、 一般に、 飽和のものが好ましく用いられる。 普通、 炭素数 3 〜2 0、 特に炭素数 4〜1 2、 とりわけ炭素数 4〜8のものが好適に用いられる。 具体例としては、 例えば、 ジェチルエーテル、 メチル t e r t—ブチルェ一テ ノレ、 ジプロピルエーテル、 ジイソプロピルエーテル、 ジブチルエーテル、 ジへキ シノレエーテノレ、 ェチノレビニノレエーテノレ、 ブチノレビニノレエーテノレ、 ァニソ一ノレ、 フ エネ トーノレ、 ブチルフエニノレエ一テル、 メ トキシトノレェン、 ジ才キサン、 フラン、 2—メチルフラン、 テトラヒ ドロフラン、 テトラヒ ドロピラン、 エチレングリコ 一ノレジメチノレエーテノレ、 エチレングリ コーノレジェチノレエーテノレ、 エチレングリ コ 一ノレジブチノレエーテノレ、 エチレングリコーノレモノメチノレエーテノレ、 エチレングリ コールモノェチルエーテル、 エチレングリコールモノブチルエーテル等を挙げる ことができる。 好ましくは、 ジェチルエーテル、 メチル t e r t—ブチルエーテル、 ジプロピ ノレエーテノレ、 ジイソプロピノレエーテノレ、 ジブチノレエ一テ レ、 ジへキシノレエーテノレ、 ァニソール、 フエネトール、 ブチノレフエニノレエーテノレ、 メ トキシトルエン、 ジォ キサン、 2—メチルフラン、 テトラヒ ドロフラン、 テトラヒ ドロピラン、 ェチレ ングリコールジメチルェ一テル、 エチレングリ コールジェチルエーテノレ、 ェチレ ングリコーノレジブチノレエーテノレ、 エチレングリコーノレモノメチノレエーテノレ、 ェチ レングリコーノレモノェチルエーテルであり、 より好ましくは、 ジェチ /レエーテノレ、 メチノレ t e r t—ブチルエーテル、 ァニソール、 ジォキサン、 テトラヒ ドロフラ ン、 エチレングリコーノレモノメチノレエーテノレ、 エチレングリ コーノレモノェチノレエ —テルであり、 さらに好ましぐは、 ジェチルエーテル、 メチル t e r t—ブチル エーテル、 ァニソール等であり、 最も好ましくは、 メチル t e r t—ブチルエー テルである。

二トリル類としては、 環状、 非環状を問わず、 又、 飽和、 不飽和を問わず、 特 に制限されないが、 一般に飽和のものが好ましく用いられる。 普通、 炭素数 2〜 2 0、 特に炭素数 2〜1 2、 とりわけ炭素数 2〜8のものが好適に用いられる。 具体例としては、 例えば、 ァセトニトリル、 プロピオ二トリル、 マロノ二トリル、 ブチロニトリル、 イソブチロニトリル、 スクシノニトリル、 ノくレロニトリル、 グ ルタロニトリル、 へキサン二トリル、 へプチルシアニド、 ォクチルシアニド、 ゥ ンデカンニ ト リル、 ドデカンニトリル、 トリデカンニトリル、 ペンタデカンニ ト リル、 ステアロニトリル、 クロロアセ トニトリル、 ブロモアセトニトリル、 クロ 口プロピオ二トリル、 ブロモプロピオ二トリル、 メ トキシァセトニトリル、 シァ ノ酢酸メチル、 シァノ酢酸ェチノレ、 トル二トリル、 ベンゾニトリル、 クロ口ベン ゾニトリル、 ブロモベンゾニトリル、 シァノ安息香酸、 ニトロべンゾニトリル、 ァニソ二トリル、 フタロニトリル、 ブロモトル二トリル、 メチルシアノベンゾェ ート、 メ トキシベンゾニトリル、 ァセチルベンゾニトリル、 ナフ トニトリル、 ビ フエニルカルボ二トリル、 フエニルプロピオ二トリル、 フエ二ルブチロニトリル、 メチルフエ二ルァセトニトリル、 ジフエ二ルァセトニトリル、 ナフチルァセトニ トリノレ、 ニトロフエニノレアセトニトリノレ、 クロ口ペンジノレシアニド、 シクロプロ パンカノレボニトリノレ、 シクロへキサンカルボ二トリル、 シクロヘプタンカルボ二 トリル、 フエニノレシクロへキサンカルボ二トリル、 トリルシクロへキサンカノレボ 二トリル等を挙げることができる。

好ましくは、 ァセトニトリル、 プロピオ二トリル、 スクシノエトリル、 プチ口 二トリル、 イソブチロニトリル、 バレロ二トリル、 シァノ酢酸メチル、 シァノ酢 酸ェチル、 ベンゾニトリノレ、 トル二トリノレ、 クロ口プロピオ二トリルであり、 よ り好ましくは、 ァセトニトリル、 プロピオ二トリル、 ブチロニトリル、 イソブチ ロニトリルであり、 最も好ましくは、 ァセトニトリルである。

上記溶媒の中でも、 沸点、 粘性等の性質 （例えば、 溶解度を高めるための適度 な加温ができ、 且つ、 湿体からの溶剤の乾燥除去や晶析濾液等からの溶剤回収の 行いやすい沸点 （1気圧下、 約 3 0〜1 5 0 °C) 、 室温での取り扱い時及び室温 以下に冷却した時も固化しにくい融点 （約 2 0 °C以下、 好ましくは約 1 0 °C以下、 より好ましくは約 0 °C以下） を持ち、 粘性が低い （2 0 °Cにおいて約 1 0 c p以 下等） ） を考慮して選定するのが好ましい。 工業的な作業上の観点から、 常温で 揮発し難いものが好ましく、 一般に、 例えば、 沸点が約 8 0 °C以上、 更には約 9 0 °C以上のものが特に好ましい。

上記溶媒のうち、 還元反応の溶媒としては、 水と相溶性の低い溶媒を用いるの が特に好ましく、 後述する還元剤や還元剤に由来する不純物を水相に抽出、 除去 し、 還元型補酵素 。を効率的に精製、 取得するのを助成する。

還元型捕酵素 。は高濃度の溶液ほど酸化されにくい傾向にある。 上記溶媒 に対して還元型補酵素 。は高い溶解性を示し、 上記溶媒はこの点でも酸化防 護に好適である。 還元型補酵素 。の酸化を防護するために好ましい濃度は、 溶媒の種類などにより一律に規定できないが、 上記溶媒に対する還元型補酵素 Q i。の濃度として、 普通 l w/w %以上、 好ましくは 2 wZw %以上である。 上 限は、 特に制限されないが、 実際的な操作性という観点から、 4 0 0 wZw%、 好ましくは 2 0 0 wZw °/₀、 より好ましくは 1 0 O wZw %、 特に好ましくは 5 0 wZw %である。

しかして、 上記溶媒の使用によって、 望ましくない酸素の副反応は、 還元工程 を通して最小化される。

還元反応は、 上記の溶媒中、 水素化金属化合物、 鉄 （金属又は塩としての鉄） 、 亜鉛 （金属としての亜鉛） 、 次亜硫酸類、 ァスコルビン酸類等を還元剤として用 いて実施することができる。

水素化金属化合物としては特に制限されないが、 例えば、 水素化ホウ素ナトリ ゥム、 水素化リチウムアルミニウム等を挙げることができる。 上記水素化金属化 合物の使用量は、 水素化金属化合物の種類により異なり、 一律に規定できないが、 普通、 理論水素当量の 1〜 3倍量で好適に実施できる。

鉄または亜鉛を用いる還元は、 酸を使用して実施されることが好ましい。 酸と しては特に制限されないが、 例えば、 酢酸等の脂肪酸、 メタンスルホン酸等のス ルホン酸、 塩酸や硫酸等の無機酸等を挙げることができる。 好ましくは無機酸で あり、 より好ましくは、 硫酸である。

鉄の使用量は特に制限されないが、 酸化型補酵素 Q _{1 0}の仕込み重量に対して、 例えば、 約 1 5重量以上で好適に実施できる。 上限は特に制限されないが、 経 済性の観点等から、 約 2倍重量が好ましい。 なお、 鉄は、 金属鉄のみならず、 硫 酸鉄 （Π) 等の塩の形態でも使用できる。

亜鉛の使用量は特に制限されないが、 酸化型補酵素 。の仕込み重量に対し て、 例えば、 約 1ノ 1 0重量以上で好適に実施できる。 上限は特に制限されない 力 経済性の観点等から、 約 2倍重量が好ましい。

次亜硫酸類としては特に制限されず、 通常、 次亜硫酸の塩である。 次亜硫酸の 塩としては特に限定されず、 アルカリ金属塩、 アルカリ土類金属塩、 アンモニゥ ム塩等が好ましく、 リチウム塩、 ナトリウム塩、 カリウム塩等のアルカリ金属塩 がより好ましく、 ナトリウム塩がさらに好ましい。

上記次亜硫酸類の使用量は特に制限されないが、 酸化型補酵素 。の仕込み 重量に対して、 約 1 / 5重量以上が好ましく、 より好ましくは約 2 5重量以上、 さらに好ましくは約 3 5重量以上である。 多くても特に支障はないが、 経済的 に不利であるため、 好ましくは約 2倍重量以下、 より好ましくは同重量以下で用 いられる。 普通、 約 2 5重量〜約同重量の範囲で好適に実施できる。

ァスコルビン酸類としては特に制限されず、 例えば、 ァスコルビン酸のみなら ず、 rhamno—ァスコルビン酸、 arabo—ァスコルビン酸、 gluco—ァスコノレビン酸、 fuco—ァスコノレビン酸、 glucohepto—ァスコノレビン酸、 xylo—ァスコノレビン酸、 galacto—ァスコルビン酸、 gulo—ァスコルビン酸、 alio—ァスコルビン酸、 erythro—ァスコルビン酸、 6—デスォキシァスコルビン酸等のァスコルビン酸に 類するものを含み、 更に、 それらのエステル体や塩であってもかまわない。 これ らは、 L体、 D体、 或いは、 ラセミ体であっても良い。 具体的には、 例えば、 L —ァスコルビン酸、 Lーァスコルビン酸パルミテ一ト、 L—ァスコルビルステア レート、 D— arabo—ァスコルビン酸等を挙げることができる。 還元型補酵素 。の製造においては、 上記ァスコルビン酸類をいずれも好適に使用しうるが、 生 成した還元型補酵素 Q i。との分離のしゃすさ等を考慮すると、 上記のァスコル ビン酸類のうち、 特に水溶性のものが好適に用いられ、 最も好ましくは、 入手容 易性、 価格等の観点から、 L—ァスコルビン酸、 D— arabo—ァスコルビン酸等 のフリ一体である。

上記のァスコルビン酸類の使用量は特に制限されず、 酸化型補酵素 Q _{1 0}を還 元型補酵素 。に変換しうる有効量であればよく、 酸化型補酵素 。に対して、

1倍モル量以上が好ましく、 より好ましくは 1 . 2倍モル量以上である。 上限は 特に制限されないが、 経済性も考慮して、 1 0倍モル量が好ましく、 より好まし くは 5倍モル量、 さらに好ましくは 3倍モル量である。

上記還元剤のうち、 還元能力、 収率、 品質といった観点から、 亜鉛、 次亜硫酸 類、 及ぴァスコルビン酸類が好ましく、 特に次亜硫酸類 （具体的には、 次亜硫酸 塩） 、 ァスコルビン酸類が好ましい。

還元反応においては、 後述するアルコール類及び 又は水を好適に使用するこ とができる。 水は、 特に還元剤として鉄、 亜鉛、 次亜硫酸類を用いる場合に好適 である。 還元剤として水素化金属化合物ゃァスコルビン酸類を用いる場合にはァ ノレコール類を使用することができる。 水、 アルコール類の併用は、 これら水、 ァ ルコール類の特性が発揮され、 反応速度の向上や反応収率の向上等に寄与する。 以下に好ましい還元方法について詳細に述べる。

上記次亜硫酸類を用いる還元は、 水と、 上記の炭化水素類、 脂肪酸エステル類、 エーテル類、 及び、 二トリル類のうち少なくとも一種の有機溶媒 （好ましくは炭 化水素類、 より好ましくは脂肪族炭化水素、 なかでもヘプタン類、 特にヘプタン ) との混合溶媒系で実施するのが好ましい。 その際、 反応時の p Hは、 収率等の 観点から、 p H 7以下が好ましく、 より好ましくは p H 3〜7、 さらに好ましく は p H 3〜6で実施される。 上記 p Hは、 酸 （例えば、 塩酸や硫酸等の鉱酸） や 塩基 （例えば、 水酸化ナトリウム等のアルカリ金属水酸化物） を用いて、 調整す ることができる。

上記次亜硫酸類を用いる還元において、 水の使用量は特に制限されず、 還元剤 である次亜硫酸類を適度に溶解する量であれば良く、 上記次亜硫酸類の水に対す る重量が、 好ましくは 3 0 wZw %以下、 より好ましくは 2 0 w/w %以下にな るように調整する。 また、 生産性等の観点から、 好ましくは 1 wZw%以上、 よ り好ましくは 5 w/w %以上、 さらに好ましくは 1 O w/w o/o以上である。

上記ァスコルビン酸類を用いる還元は、 上記の炭化水素類、 脂肪酸エステル類、 エーテル類、 及び、 二トリル類のうち、 特に水と相溶性の高い溶媒、 なかでも、 水と相溶性の高いエーテル類及び二トリル類、 具体的には、 テトラヒ ドロフラン、 ジォキサン、 ァセトニトリル等を用いて実施することができる。 後述するアルコ ール類及び/又はケトン類 （好ましくは、 水と相溶性の高いアルコール類及び Z 又はケトン類 （具体的には、 アルコール類としては、 炭素数 1〜5、 好ましくは 炭素数 1〜4、 より好ましくは炭素数 1〜3の 1価又は 2価 （好ましくは 1価） のアルコール、 ケトン類としては、 アセトン、 メチルェチルケトン等） ） を使用 するのが特に好ましい。 すなわち、 ァスコルビン酸類を用いる還元においては、 アルコール類及び /又は水溶性有機溶媒を用いるのが好ましい。 又、 還元型補酵 素 Q _{1 0}の製造における反応促進の観点から （例えば、 反応温度の低下、 反応時 間の短縮等） 、 塩基性物質や亜硫酸水素塩等の反応促進効果を有する添加剤を共 存させて実施することができる。

上記の塩基性物質としては特に制限されず、 例えば、 無機化合物、 有機化合物 を問わず使用しうる。 上記無機化合物としては特に制限されないが、 例えば、 金 属 （好ましくは、 アルカリ金属、 アルカリ土類金属等） の水酸化物、 炭酸塩、 炭 酸水素塩やアンモニア等を挙げることができる。 その代表的なものとして、 例え ば、 水酸化ナトリゥム等のアルカリ金属水酸化物、 炭酸ナトリゥム等のアル力リ 金属炭酸塩、 炭酸水素ナトリウム等のアルカリ金属炭酸水素塩、 炭酸マグネシゥ ム等のアル力リ土類金属炭酸塩等を挙げることができる。 上記有機化合物として は特に制限されないが、 例えば、 トリェチルァミン等のアミン等を挙げることが できる。 上記の塩基性物質のうち、 金属 （好ましくは、 アルカリ金属、 アルカリ 土類金属等） の炭酸塩、 炭酸水素塩、 アンモニア等の無機化合物； トリェチルァ ミン等のァミン等の有機化合物といった弱い塩基性物質 （弱塩基又は弱アル力リ ) を特に好ましく使用できる。 より好ましくは、 上記の弱塩基性の無機化合物で ある。

また、 亜硫酸水素塩としては、 例えば、 亜硫酸水素ナトリウム等のアルカリ金 属亜硫酸水素塩等を好適なものとして挙げることができる。

上記添加剤の量は、 期待する程度の反応促進効果を発揮しうる量 （有効量） で あればよく、 特に制限されないが、 一般的に、 経済性も考慮して、 ァスコルビン 酸類に対して、 好ましくは 20倍モル量以下、 より好ましくは 10倍モル量以下、 さらに好ましくは 5倍モル量以下、 特に好ましくは 2倍モル以下である。 下限は 特に制限されないが、 好ましくは 0. 01倍モル量、 より好ましくは 0. 05倍 モル量、 さらに好ましくは 0. 1倍モル量、 特に好ましくは 0. 2倍モル量であ る。

還元反応は、 強制流動下に実施するのが好ましい。 単位容積当たりの撹拌所要 動力として、 好ましくは約 0. 0 1 kWZm³以上、 より好ましくは約 0. I k WZm³以上、 さらに好ましくは約 0. 3 kWZm³以上の流動が好ましい。 上 記の強制流動は、 通常、 撹拌翼の回転により与えられるが、 上記流動が得られれ ば必ずしも撹拌翼を用いる必要はなく、 例えば、 液の循環による方法などを利用 しても良レ、。

還元温度は、 還元剤の種類や量によって異なり、 一律に規定できない。 例えば、 次亜硫酸類を用いる還元においては、 好ましくは 10 o°c以下、 より好ましくは 80°C以下、 さらに好ましくは 60°C以下で実施される。 下限は、 系の固化温度 が好ましい。 通常、 0〜1 00°C程度、 好ましくは 0〜80°C程度、 より好まし くは 0〜60°C程度で好適に実施できる。 ァスコルビン酸類を用いる還元におい ては、 好ましくは 30°C以上、 より好ましくは 40°C以上、 さらに好ましくは 5 0°C以上で実施される。 上限は系の沸点が好ましい。 通常、 30〜1 50°C程度、 好ましくは 40〜 120 °C程度、 より好ましくは 50〜 100 °C程度で好適に実 施できる。

反応濃度は特に制限はないが、 一般に、 溶媒の重量に対する酸化型補酵素 。の重量として、 好ましくは約 1 wZw%以上、 より好ましくは 3 wZw O/o以上、 さらに好ましくは 1 O wZw %以上、 特に好ましくは 1 5 w/w %以上である。 上限は、 特に制限されないが、 好ましくは約 6 O w/w %以下、 より好ましくは 5 0 wZw %以下、 さらに好ましくは 4 0 wZw %以下、 特に好ましくは 3 0 w Zw %以下である。 一般に、 約 l〜6 0 w/w %、 好ましくは約 3〜5 0 w/w %、 より好ましくは約 1 0〜 4 0 wZw %で好適に実施できる。

還元反応は、 通常、 4 8時間以内、 好ましくは 2 4時間以内、 より好ましくは 1 0時間以内、 とりわけ 5時間以内に完了させることができる。

このようにして得られた還元反応液は、 生成した還元型補酵素 。を含有す る有機相を採取し、 必要に応じ （好ましくは） 、 有機相を更に、 繰り返し、 例え ば、 水や食塩水等を用いて水洗して夾雑物を完全に除去することができる。

なお、 上記還元反応おょぴ後処理は、 脱酸素雰囲気下で実施するのが極めて好 ましく、 驚くべきことには、 特に次亜硫酸類を用いた還元反応では、 還元反応収 率向上や還元剤量の削減に大きく寄与することも見い出した。 脱酸素雰囲気は、 不活性ガスによる置換、 減圧、 沸騰やこれらを組み合わせることにより達成でき る。 少なくとも、 不活性ガスによる置換、 即ち、 不活性ガス雰囲気を用いるのが 好適である。 上記不活性ガスとしては、 例えば、 窒素ガス、 ヘリウムガス、 アル ゴンガス、 水素ガス、 炭酸ガス等を挙げることができ、 好ましくは窒素ガスであ る。

次いで、 このようにして得られた還元型補酵素 Q _{1 0}を含有する有機相からの 還元型補酵素 。の油状物、 溶液及びスラリーの取得方法について説明する。 還元型補酵素 Qェ。の油状物を取得するために用いる還元型補酵素 Q i。を含有 する有機相は特に制限されないが、 望ましくない酸素による副反応を抑制して高 品質の還元型補酵素 。の油状物を得るために、 還元型補酵素 。を酸化から 防護する作用の高い有機溶媒、 即ち、 炭化水素類、 脂肪酸エステル類、 エーテル 類、 及び、 二トリル類のうち少なくとも一種の溶液であるのが好ましい。 なかで も、 有機溶媒として、 炭化水素類、 脂肪酸エステル類が好ましく、 より好ましく は炭化水素類であり、 最も好ましくはヘプタン類である。 なお、 本発明に用いる 還元型補酵素 。を含有する有機相は、 上記溶液であっても良く、 また、 該溶 液を通常の方法で濃縮した濃縮物であってもよい。

本発明においては、 還元型補酵素 。を含有する有機相の濃縮に際して、 共 存する溶媒を完全に或いはほぼ完全に留去するために、 還元型補酵素 Q _{1 0}の融 解温度以上の温度に高めて有機溶媒を留去することにより、 還元型補酵素 Q！。 の油状物を取得する。 なお、 還元型補酵素 。に溶媒や不純物が含まれること によって融解温度に幅がある場合は、 融解開始温度以上であればよい。

本発明において、 還元型補酵素 0，。の油状物を得るための上記温度は、 共存 する有機溶媒の量にもよる為、 一律には規定できないが、 好ましくは 4 0 °C以上、 より好ましくは 4 5 °C以上、 さらに好ましくは 5 0 °C以上、 特に好ましくは 6 0 °C以上である。 溶媒の種類や量にもよるが、 好ましくは 4 0〜1 4 0 °C、 より好 ましくは 4 0〜1 0 0 °C、 さらに好ましくは 5 0〜8 0 °Cの範囲で好適に実施で きる。 上記濃縮は、 常圧下、 或いは、 減圧下に実施される。

上記の方法によれば、 有機相中の還元型補酵素 。の純度が、 好ましくは約 8 0重量％以上、 より好ましくは約 9 0重量％以上、 さらに好ましくは約 9 5重 量％以上の場合でも、 攪拌不良を生じることなく有機溶媒を完全に留去して、 還 元型補酵素 。を好適に油状物として取得できる。 上記純度は、 後述のように H P L Cにて求めることができる。

尚、 溶媒を留去して還元型補酵素 Q _{1 0}の油状物を取得する態様に関して記載 される上記還元型補酵素 。油状物中の溶媒の含有量は、 好ましくは 1 0重量 %以下、 より好ましくは 5重量％以下、 さらに好ましくは 2重量％以下である。 このように、 上記二種類の態様を用いることにより、 極めて簡便に、 且つ、 効 率的に還元型補酵素 Q i。の油状物を取得することができる。

さらに、 上記の態様により取得した還元型補酵素 Q _{1 0}の油状物は、 所望の溶 剤を加えることによって、 極めて効率的に、 且つ、 還元型補酵素 。の酸化型 補酵素 Q i。への酸化を好適に防護して、 高品質の還元型補酵素 Q i。の溶液又は スラリーとすることもできる。

特に、 還元型補酵素 Q _{1 0}を含有する有機相から他の溶媒へと置換するとき、 以下の態様のいずれかによつて、 又は、 以下の態様の二以上を組み合わせること によって、 本発明の効果を最大限に発揮することができる。

第一の態様は、 還元型補酵素 Q _{1 0}の溶液又はスラリーを得るために添加する 溶媒が、 留去される有機溶媒よりも沸点が低い態様である。 通常、 高沸点溶媒か ら低沸点溶媒への置換は非効率であるが、 本発明により、 効率的に実施できる。 例えば、 ヘプタンからアセトンへの置換、 トルエンからエタノールへの置換、 酢 酸ェチルからジェチルエーテルへの置換、 ヘプタンからエタノールへの置換等が 挙げられる。

第二の態様は、 還元型補酵素 。の溶液又はスラリーを得るために添加する 溶媒が、 留去される有機溶媒と共沸混合物を形成する態様である。 通常、 共沸混 合物の形成 *留去により、 溶媒置換が非効率であるが、 本発明により、 効率的に 実施できる。 例えば、 ヘプタンからエタノールへの置換、 クロ口ホルムからァセ トンへの置換、 酢酸ェチルからエタノールへの置換等が挙げられる。

第三の態様は、 還元型補酵素 Q _{1 0}の溶液又はスラリーを得るために添加する 溶媒が、 難揮発成分を含有する態様である。 難揮発成分とは、 通常の溶媒留去、 溶媒置換条件では留去されにくい成分をさし、 例えば、 エーテル中に安定化剤と して含まれる 2， 6—ジ t e r t—ブチル _ 4—ヒ ドロキシトルエン （B H T ) 等が挙げられる。 溶媒の補充、 留去を繰り返す非効率な溶媒置換においては、 難 揮発成分は溶液中に高濃度に蓄積される傾向にある。 例えば、 ヘプタンからテト ラヒ ドロフランに溶媒置換する場合に、 置換が非効率であると、 上記 B H Tが溶 液中に必要以上に高濃度に蓄積する可能性があるが、 本発明の方法によれば、 難 揮発成分の蓄積を抑制して、 溶媒置換を好適に実施できる。

第四の態様は、 還元型補酵素 Q _{1 0}の溶液又はスラリーを得るために添加する 溶媒が、 留去される有機溶媒よりも、 還元型補酵素 Q _{1 0}を酸化から防護する効 果が低い態様である。 非効率な溶媒置換においては、 酸化防護効果の必ずしも高 くない溶媒の共存下での長時間にわたる溶媒置換操作中に、 望ましくない酸素の 副反応を受けやすいが、 本発明により、 酸化防護効果の必ずしも高くない溶媒と の接触時間を最小化することにより望ましくない酸素の副反応を抑制して、 溶媒 置換を好適に実施できる。 例えば、 ヘプタンからメチルイソプチルケトンへの置 換、 キシレンからジメチルホルムアミ ドへの置換等が挙げられる。

還元型補酵素 Q i。の溶液又はスラリーを得るために添加する溶媒は特に制限 されないが、 前記の炭化水素類、 脂肪酸エステル類、 エーテル類、 二トリル類の 他、 水、 アルコール類、 脂肪酸類、 ケトン類、 窒素化合物類 （二トリル類を除く ) 、 硫黄化合物類等のうちの少なくとも一種が好ましい。 アルコール類、 二トリ ル類、 ケトン類、 エーテル類及び、 水のうちの少なくとも一種がさらに好ましく、 アルコール類及び / 又はケトン類はスラリーの性状や結晶の性状がさらに良好と なるため、 特に好ましい。

アルコール類としては、 環状、 非環状を問わず、 又、 飽和、 不飽和を問わず、 特に制限されないが、 一般に、 飽和のものが好ましく用いられる。 普通、 炭素数 ：!〜 2 0、 特に炭素数 1〜1 2、 とりわけ炭素数 1〜6、 なかでも炭素数 1〜5 の 1価アルコールが好ましく、 又、 炭素数 2〜 5の 2価アルコールが好ましく、 又、 炭素数 3の 3価アルコールが好ましい。

1価のアルコールとしては特に限定されず、 例えば、 メタノール、 エタノール、 1—プロパノーノレ、 2—プロノヽ。ノール、 1—ブタノ一ノレ、 2—ブタノーノレ、 イソ ブチルアルコール、 t e r t—ブチルアルコール、 1—ペンタノール、 2—ペン タノ一ノレ、 3—ペンタノ一ノレ、 2—メチノレ一 1ーブタノ一ノレ、 イソペンチノレアル コーノレ、 t e r t—ペンチルアルコール、 3—メチルー 2—ブタノール、 ネオペ ンチルアルコール、 1—へキサノール、 2—メチルー 1一ペンタノール、 4—メ チル一 2—ペンタノール、 2—ェチルー 1—ブタノール、 1—ヘプタノール、 2 一へプタノール、 3—へプタノール、 1ーォクタノーノレ、 2—ォクタノーノレ、 2 —ェチノレー 1一へキサノ一ノレ、 1ーノナノ一ノレ、 1—デカノーノレ、 1 _ゥンデ力 ノーノレ、 1一ドデカノール、 ァリルアルコーノレ、 プロパルギルアルコール、 ベン ジノレアノレコーノレ、 シクロへキサノーノレ、 1ーメチノレシクロへキサノーノレ、 2—メ チルシクロへキサノール、 3—メチノレシクロへキサノール、 4—メチルシクロへ キサノール等を挙げることができる。

好ましくは、 メタノール、 エタノール、 1 _プロパノール、 2—プロパノール、 1—ブタノール、 2—ブタノール、 イソブチルァノレコール、 t e r t—ブチルァ ノレコーノレ、 1—ペンタノ一ノレ、 2—ペンタノ一ノレ、 3 _ペンタノ一ノレ、 2—メチ ノレ一 1ーブタノ一ル、 イソペンチルアルコール、 t e r t—ペンチルアルコー レ、 3—メチルー 2—ブタノール、 ネオペンチルアルコール、 1—へキサノール、 2 —メチル一 1一ペンタノール、 4—メチルー 2 _ペンタノール、 2—ェチノレー 1 ーブタノール、 シクロへキサノールであり、 より好ましくは、 メタノール、 エタ ノール、 1—プロパノール、 2—プロパノール、 1—ブタノーノレ、 2—ブタノ一 ル、 イソブチルアルコール、 t e r t—ブチルアルコール、 1—ペンタノール、 2—ペンタノ一ノレ、 3—ペンタノ一ノレ、 2—メチノレ一 1—ブタノ一ノレ、 イソペン チルアルコール、 t e r t—ペンチルアルコール、 3—メチル一 2—ブタノール、 ネオペンチルアルコールであり、 さらに好ましくは、 メタノール、 エタノール、 1一プロパノール、 2—プロパノール、 1—ブタノーノレ、 2—ブタノーノレ、 イソ ブチルアルコール、 2—メチル一 1—ブタノール、 イソペンチルアルコールであ り、 最も好ましくは、 エタノールである。

2価のアルコールとしては特に限定されず、 例えば、 1， 2—エタンジオール、 1 , 2—プロパンジオール、 1 , 3—プロパンジオール、 1， 2 _ブタンジォー ノレ、 1 , 3—ブタンジォーノレ、 1 , 4一ブタンジォーノレ、 2 , 3—ブタンジォー ル、 1 , 5—ペンタンジオール等を挙げることができる。 好ましくは、 1 , 2— エタンジオール、 1 , 2—プロハ⁰ンジォ一ノレ、 1 , 3—プロパンジォーノレであり、 最も好ましくは、 1 , 2—エタンジオールである。

3価のアルコールとしては特に限定されず、 例えば、 グリセリン等を好適に用 いることができる。

ケトン類としては特に制限されず、 普通炭素数 3〜 6のものが好適に用いられ る。 具体例としては、 例えば、 アセトン、 メチルェチルケトン、 メチルブチルケ トン、 メチルイソプチルケトン等を挙げることができ、 好ましくは、 アセトン、 メチルェチルケトンであり、 最も好ましくは、 アセトンである。

また、 本発明に関わる一連の検討において、 還元型補酵素 。は融解温度が 低いために、 工業的規模での製造において結晶の乾燥中に溶融する、 或いは、 乾 燥に時間がかかる等の可能性があり、 還元型補酵素 Q _{1 0}の結晶を取得すること が必ずしも容易ではないことが分かった。 しかしながら、 上記の還元型補酵素 Q _{1 ()}の油状物に、 前記油状物の融解温度未満の温度で、 種晶 （自結晶） を接触さ せることにより速やかに好適に固化させう'ることを見出した。 従って、 本発明の 効果を更に発揮するための態様として、 還元型補酵素 。の油状物に、 前記油 状物の融解温度未満の温度で、 還元型補酵素 。の種晶を接触させることによ り速やかに好適に固化させる還元型補酵素 Q i 0の固化法を挙げることができる。 この方法により、 試剤、 時間のロスを回避できるとともに通常の有機溶媒での晶 析で生じる口スを回避し、 高収率で好適に還元型補酵素 Q i。の固形物を得るこ とができる。

この場合、 上記油状物を融解温度未満の温度に下げて望みの形状にし、 種晶を 接触させることにより固化物を得ることができる。 種晶との接触は該油状物の形 状をつくる前でも後でも差し支えない。 固化温度は、 前記油状物の融解温度未満 であれば良く、 特に制限されないが、 通常 4 8 °C未満、 好ましくは 4 5 °C未満、 より好ましくは 4 0 °C未満である。 望ましくは 0 °C以上である。

上記のようにして得られる還元型補酵素 。の結晶は、 好ましくは、 例えば、 遠心分離、 加圧濾過、 減圧濾過等による固液分離、 更に、 ケーキ洗浄を行い、 湿 体として採取される。 また、 更に内部を不活性ガスに置換した減圧乾燥器 （真空 乾燥器） に湿体を仕込み、 減圧下、 乾燥し、 乾体として取得することができるし、 乾体として取得するのが好ましい。

なお、 本発明は、 脱酸素雰囲気下にて実施することにより、 更に、 酸化防護効 果を高めることができる。 脱酸素雰囲気は、 不活性ガスによる置換、 減圧、 沸騰 やこれらを組み合わせることにより達成できる。 少なくとも、 不活性ガスによる 置換、 即ち、 不活性ガス雰囲気を用いるのが好適である。 上記不活性ガスとして は、 例えば、 窒素ガス、 ヘリウムガス、 アルゴンガス、 水素ガス、 炭酸ガス等を 挙げることができ、 好ましくは窒素ガスである。 発明を実施するための最良の形態

以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、 本発明はこれら実施 例のみに限定されるものではない。 また、 実施例中の還元型補酵素 Q _{1 C)}の純度、 還元型補酵素 Q i。と酸化型補酵素 Q i。との重量比は下記 H P L C分析により求 めたが、 得られた還元型補酵素 Q _{1 0}の純度は本発明における純度の限界値を規 定するものではなく、 また、 同様に、 還元型補酵素 。と酸化型補酵素 Q₁₀と の重量比も、 その上限値を規定するものではない。

(H PLC分析条件）

カラム ： SYMMETRY C 18 (Wa t e r s製） 25 Omm (長さ） 4. 6 mm (内径） 、 移動相； C₂H₅OH： CH₃OH=4 ： 3 (v ： ν) , 検出波 長； 2 10 nm、 流速； 1 m 1 i n、 還元型補酵素 Q i。の保持時間； 9. lm i n、 酸化型補酵素 。の保持時間； 13. 3m i n。

(実施例 1 )

100 gの酸化型補酵素 Q₁₀ (純度 99. 4%) を攪拌しながら 50°Cで融 解させた。 この油状物に、 攪拌 （攪拌所要動力 0. S kWZm³) しながら、 還 元剤として次亜硫酸ナトリウム （純度 75%以上） 100 gに 1000m lの水 を加えて溶解させた水溶液を、 徐々に添加し、 50°C、 pH4〜6で還元反応を 行った。 2時間後、 攪拌 （攪拌所要動力 0. 3 kWZm³) しながら、 2°Cまで 冷却することにより白色のスラリーを得た。 なお、 以上すベての操作は窒素雰囲 気下で実施した。 得られたスラリーを減圧ろ過し、 湿結晶を、 冷水、 冷エタノー ルで順に洗浄 （洗浄に用いた冷溶媒の温度は 2 °C) して、 さらに、 湿結晶を減圧 乾燥 （20〜40°C、 ：！〜 30mmHg) することにより、 白色の乾燥結晶 98 gを得た （有姿収率 98モル％) 。 得られた結晶の還元型補酵素 Q₁₀Z酸化型 補酵素 。の重量比は 99. 5/0. 5、 還元型補酵素 。の純度は 99. 2 %であった。

(実施例 2)

100 gの酸化型補酵素 Q₁₀ (純度 99. 4%) を攪拌しながら 50°Cで融 解させた。 この油状物に、 攪拌 （攪拌所要動力 0. S kW/m³) しながら、 還 元剤として次亜硫酸ナトリウム （純度 75 %以上） 100 gに 1000m lの水 を加えて溶解させた水溶液を、 徐々に添加し、 50°C、 pH4〜6で還元反応を 行った。 2時間後、 油状物を含む反応液より水相を除去し、 50°Cに加温したェ タノ一ルを 1400 g添加後、 攪拌 （攪拌所要動力 0. 3 kWZm³) しながら、 2°Cまで冷却して白色のスラリーを得た。 なお、 以上すベての操作は窒素雰囲気 下で実施した。 得られたスラリーを減圧ろ過し、 湿結晶を、 冷エタノール、 冷水、 冷エタノールで順に洗浄 （洗浄に用いた冷溶媒の温度は 2 °C) して、 さらに、 湿 結晶を減圧乾燥 （20〜40°C、 l〜30mmHg) することにより、 白色の乾 燥結晶 9 5 gを得た （有姿収率 9 5モル％) 。 得られた結晶の還元型補酵素 。ノ酸化型補酵素 。の重量比は 99. 4/0. 6、 還元型補酵素 。の純度は 9 9. 2%、 であった。

(実施例 3)

1 00 gの酸化型補酵素 Q₁₀ (純度 9 9. 4%) を攪拌しながら 5 0°Cで融 解させた。 この油状物に、 攪拌 （攪拌所要動力 0. 3 kW/m³) しながら、 還 元剤として次亜硫酸ナトリウム （純度 Ί 5 %以上） 1 00 gに 1 000m lの水 を加えて溶解させた水溶液を、 徐々に添加し、 50°C、 pH4〜6で還元反応を 行った。 油状物を含む反応液から水相を除去し、 脱気し 50°Cに加熱した飽和食 塩水 1 000 gで油状物を 6回洗浄し、 還元型補酵素 。の油状物を得た。 な お、 すべての操作は窒素雰囲気下で実施した。 この油状物に 2 5°Cのエタノール を添加し、 還元型補酵素 Q₁₀の白色スラリーを得た。 得られたスラリーを 2°C まで冷却した後、 減圧ろ過し、 湿結晶を、 冷エタノール、 冷水、 冷エタノールで 順に洗浄 （洗浄に用いた冷溶媒の温度は 2 °C) して、 さらに、 湿結晶を減圧乾燥 (20〜40°C、 1〜3 OmmHg) することにより、 白色の乾燥結晶 9 5 gを 得た （有姿収率 9 5モル％) 。 得られた結晶の還元型補酵素 。/酸化型補酵 素 。の重量比は 9 9. 4/0. 6、 還元型補酵素 。の純度は 9 9. 2%、 であった。 (実施例 4)

1 0 0 gの酸化型補酵素 。を攪拌しながら 4 8 °Cで融解させた。 この油状 物に、 攪拌 （攪拌所要動力 0. 3 kW/m³) しながら、 還元剤として次亜硫酸 ナトリウム （純度 7 5%以上） 1 00 gに 1 00 Om 1の水を加えて溶解させた 水溶液を、 徐々に添加し、 50°C、 pH4〜6で還元反応を行った。 油状物を含 む反応液から水相を除去し、 脱気し、 4 8°Cに加熱した飽和食塩水 1 0 0 0 gで 油状物を 6回洗浄し、 還元型補酵素 。の油状物を得た。 なお、 すべての操作 は窒素雰囲気下で実施した。 この油状物にトルエンを添加し、 還元型補酵素 。を含有したトルエン溶液を調整した。 なお、 このトルエン溶液に含まれる還元 型補酵素 。/酸化型補酵素 。の重量比は 9 9. 5/0. 5であった。

(実施例 5 )

実施例 2で得た還元型補酵素 Q ,。の油状物を自結晶を敷いたプレートの上 （ 4 0°C) に滴下したところ、 油状物は速やかに固化し、 半球状の固形物を得るこ とができた。

(比較例 1 )

実施例 2で得た還元型補酵素 。の油状物を、 自結晶を敷かないプレートの 上 （4 0°C) に滴下し、 1時間温度を維持したが固化しなかった。

(実施例 6 )

1 0 0 gの酸化型補酵素 。を 5 0°Cで融解させた。 得られた油状物に、 攪 拌 （攪拌所要動力 0. 3 kW//m³) しながら、 還元剤として次亜硫酸ナトリウ ム （純度 7 5 %以上） 6 0 gに 1 0 0 Om 1の水を加えて溶解させた水溶液を、 徐々に添加し、 5 0°C、 p H4〜6で還元反応を行った。 2時間後、 反応液から 水相を除去し、 還元型補酵素 。の油状物を得た。 得られた油状物の還元型補 酵素 Q Z酸化型補酵素 。の重量比は 9 9. 3/0. 7であった。 なお、 す ベての操作は窒素雰囲気下で実施した。 (実施例 7 )

1 0 0 gの酸化型補酵素 Q ₁₀ (純度 9 9. 4 %) を 2 5°Cで 1 0 0 0 gのへ ブタンに溶解させた。 攪拌 （攪拌所要動力 0. 3 kW/m³) しながら、 還元剤 として次亜硫酸ナトリウム （純度 7 5%以上） 1 0 0 gに 1 0 0 Om 1 の水を加 えて溶解させた水溶液を、 徐々に添加し、 2 5° ( 、 p H4〜6で還元反応を行つ た。 2時間後、 反応液から水相を除去し、 脱気した飽和食塩水 1000 gでヘプ タン相を 6回水洗した。 なお、 以上すベての操作は窒素雰囲気下で実施した。 こ のヘプタン溶液から、 50°C、 減圧下にてヘプタンを留去し、 油状物の還元型補 酵素 。を得た。 この油状物は容易に攪拌および払い出しが可能であった。 こ の油状物の還元型補酵素 。 酸化型補酵素 。の重量比は 99. 5/0. 5 であった。 また、 ヘプタン残量は 1. 3%であり、 ヘプタンを除いた還元型補酵 素 。の純度は 99. 2%であった。

(比較例 2)

実施例 7と同様にして、 還元型補酵素 。のヘプタン溶液を得た。 このヘプ タン溶液から 30°C、 減圧下にてヘプタンを留去した。 還元型補酵素 。は容 器壁面に固着し、 払い出しが困難であった。

(実施例 8 )

実施例 7と同様して、 還元型補酵素 。のヘプタン溶液を得た。 このへプタ ン溶液から 48°C、 減圧下にてヘプタンを留去し、 油状物の還元型補酵素 Q_{1 ()} を得た。 l O O O gのテトラヒ ドロフランを添加することにより、 還元型補酵素

。のテトラヒ ドロフラン溶液を得た。 なお、 溶液中の還元型補酵素 Q₁₀Z酸 化型補酵素 。の重量比は 99. 5/0. 5であった。

(実施例 9 )

100 gの酸化型補酵素 Q₁₀ (純度 99. 4%) を 25°Cで 1000 gのへ キサンに溶解させた。 攪拌 （攪拌所要動力 0. S kWZm³) しながら、 還元剤 として次亜硫酸ナトリウム （純度 75%以上） 100 gに 1000m 1の水を加 えて溶解させた水溶液を、 徐々に添加し、 25°C、 pH4〜6で還元反応を行つ た。 2時間後、 反応液から水相を除去し、 脱気した飽和食塩水 1000 gでへキ サン相を 6回水洗した。 なお、 以上すベての操作は窒素雰囲気下で実施した。 こ のへキサン溶液から 50°C、 減圧下にてへキサンを留去し、 油状物の還元型補酵 素 。を得た。 この油状物に 50°Cのエタノールを 1 000 g添加することに より、 還元型補酵素 。のエタノール溶液を得た。 なお、 溶液中の還元型補酵 素 QioZ酸化型補酵素 。の重量比は 99. 4/0. 6であった。

(実施例 10 )

100 gの酸化型補酵素 Q₁₀ (純度 99. 4%) を 25°Cで 1000 gのへ キサンに溶解させた。 攪拌 （攪拌所要動力 0. 3 kW/m³) しながら、 還元剤 として次亜硫酸ナトリウム （純度 75%以上） 100 gに 100 Om 1の水を加 えて溶解させた水溶液を、 徐々に添加し、 25°C、 pH4〜6で還元反応を行つ た。 2時間後、 反応液から水相を除去し、 脱気した飽和食塩水 1000 gでへキ サン相を 6回水洗した。 なお、 以上すベての操作は窒素雰囲気下で実施した。 こ のへキサン溶液から 50°C、 減圧下にてへキサンを留去し、 油状物の還元型補酵 素 。を得た。 この油状物に 25°Cのエタノール 1000 gをゆつく りと添加 することにより、 還元型補酵素 Q₁₀の白色のスラリーを得た。 得られたスラリ 一を 2°Cまで冷却した後、 減圧ろ過し、 湿結晶を冷エタノール、 冷水、 冷ェタノ ールで順に洗浄 （洗浄に用いた冷溶媒の温度は 2 °C) して、 さらに、 湿結晶を減 圧乾燥 （20〜40° (：、 l〜30mmHg) することにより、 白色の乾燥結晶 9 5 gを得た （有姿収率 95モル。 /。） 。 得られた結晶の還元型補酵素 Q_1C)Z酸化 型補酵素 。の重量比は 99. 3/0. 7であり、 還元型補酵素 。の純度は 99. 0%であった。

(実施例 1 1 )

還元剤として、 次亜硫酸ナトリウムの代わりに亜鉛粉末 15 gおよび 2. 9N 硫酸 1 100 gを使用する以外は、 実施例 7と同様に還元、 濃縮を行った。 得ら れた油状物の還元型補酵素 。は、 容易に攪拌および払い出しが可能であった。 なお、 この油状物の還元型補酵素 酸化型補酵素 。の重量比は 99. 4 /0. 6であった。 また、 ヘプタン残量は 1. 9%であり、 ヘプタンを除いた還 元型補酵素 Q₁₀の純度は 99. 1%であった。

(実施例 12) 1000 gのエタノール中に、 100 gの酸化型補酵素 Q₁₀ (純度 99. 4 %) 、 60 gの L—ァスコルビン酸を加え、 50°Cにて攪拌し、 還元反応を行つ た。 24時間後、 反応液を 50°Cまで冷却し、 同温度で、 減圧下、 エタノールを 留去し、 油状物の還元型補酵素 。を得た。 この油状物を 48°Cの 1000 g の脱気した飽和食塩水で 6回水洗した後、 1000 gのアセトンを添加すること により、 還元型補酵素 。のアセ トン溶液を得た。 溶液中の還元型補酵素 Q₁₍₎ Z酸化型補酵素 。の重量比は 99. 5/0. 5であった。

(実施例 13 )

実施例 7で得た還元型補酵素 。の油状物を、 自結晶を敷いたプレートの上 ( 40 °C) に滴下したところ、 油状物は速やかに固化し、 半球状の固形物を得る ことができた。

(比較例 3 )

実施例 7で得た還元型補酵素 。の油状物を、 自結晶を敷かないプレートの 上 （40°C) に滴下し、 1時間温度を維持したが固化しなかった。

(参考例 1 )

表 1に示す各種溶媒 20 gに 1 gの還元型補酵素 Q₁₀ (還元型補酵素 Q₁₍₎Z 酸化型補酵素 。の重量比は 99. 6/0. 4) を、 25°C下で溶解した。 大 気中、 25°Cで 24時間の攪拌後、 液中の還元型補酵素 。 酸化型補酵素 。の重量比を測定した結果を表 1に示す。

R

へフグ、

ノ 99. 1 / 0. 9

-t J- へ ノ 98. 7/1. 3

トルエン 98. 8/1. 2

ク口口ホスレム 98. 9/1. 1

酢酸ェチル 98. 9/1. 1

メチノレ t e r t—ブチノレエ一テノレ 98. 6/1. 4

テトラヒ ドロフラン 98. 5/1. 5

R：還元型捕酵素 Q！。Z酸化型補酵素 Q！ 0の重量比

(参考例 2)

表 2に示す各種溶媒 1 00 gに 1 gの還元型補酵素 Q _x。 （還元型補酵素 Q丄 。 Z酸化型補酵素 。の重量比は 99. 6/0. 4) を、 35°C下で溶解した。 大気中、 35°Cで 24時間の攪拌後、 液中の還元型補酵素 。ノ酸化型補酵素 Q！。の重量比を測定した結果を表 2に示す。 表 2

R：還元型補酵素 Q！。Z酸化型補酵素 Q i。の重量比 産業上の利用の可能性

本発明は、 上述の構成よりなるので、 工業的規模での作業性、 経済性に優れた 方法で、 高品質の還元型補酵素 。の油状物、 結晶、 スラリー又は溶液を簡便 且つ効率的に製造することができる。

Claims

請求の範囲

1. 酸化型補酵素 Q₁₍₃の油状物を水中で還元剤と反応させ、 還元型補酵素 Q

！。の油状物を合成することを特徴とする、 還元型補酵素 Q！。の製造方法。

2. 還元反応は、 45 °C以上の温度で実施する請求の範囲第 1項記載の製造方 法。

3. 還元剤は、 鉄、 亜鉛、 又は、 次亜硫酸類である請求の範囲第 1又は 2項記 載の製造方法。

4. 還元剤は、 次亜硫酸類である請求の範囲第 3項記載の製造方法。

5. 次亜硫酸類を用いる還元反応は、 pH3〜 7で実施される請求の範囲第 4 項記載の製造方法。

6. 還元反応は、 脱酸素雰囲気下で実施される請求の範囲第 1〜 5項のいずれ かに記載の製造方法。

7. 還元反応後、 反応混合物を冷却することにより、 還元型補酵素 。を該 反応系中において結晶化させ、 該結晶を取得する請求の範囲第 1〜 6項のいずれ かに記載の製造方法。

8. 結晶化は脱酸素雰囲気下で実施される請求の範囲第 7項記載の製造方法。

9. 還元反応後、 反応混合物から水相を分離し、 還元型補酵素 。の油状物 を取得する請求の範囲第 1〜 6項にいずれかに記載の製造方法。

10. 取得した還元型補酵素 。の油状物に溶媒を加えて、 還元型補酵素 Q t oの溶液又はスラリ一を取得する請求の範囲第 9項記載の製造方法。

1 1. 取得した還元型補酵素 。の油状物に、 前記油状物の融解温度未満の 温度で還元型補酵素 Q！。の種晶を接触させることにより、 前記油状物を固化さ せ、 還元型補酵素 。の固形物を取得する請求の範囲第 9項記載の製造方法。

1 2. 還元型補酵素 。の油状物、 溶液、 スラリー、 又は、 固形物の取得を 脱酸素雰囲気下で実施する請求の範囲第 9〜 1 1項のいずれかに記載の製造方法。

1 3. 還元型補酵素 。を含有する有機相から、 還元型補酵素 。の融解温 度以上の温度で有機溶媒を留去することにより、 還元型補酵素 。の油状物を 取得することを特徴とする、 還元型補酵素 Q₁₀の取得方法。

14. 有機相中の還元型補酵素 0ェ。の純度が、 80重量％以上である請求の 範囲第 1 3項記載の取得方法。

1 5. 有機溶媒の留去を 40°C以上で行う請求の範囲第 1 3又は 14項記載の 取得方法。

16. 取得した還元型補酵素 。の油状物に溶媒を加えて、 還元型補酵素

。の溶液又はスラリーを得る請求の範囲第 1 3〜1 5項のいずれかに記載の取得 方法。

1 7. 添加する溶媒が、 留去される有機溶媒よりも沸点が低いものである請求 の範囲第 1 6項記載の取得方法。

18. 添加する溶媒が、 留去される有機溶媒と共沸混合物を形成するものであ る請求の範囲第 16項記載の取得方法。

1 9 . 添加する溶媒が、 難揮発成分を含有するものである請求の範囲第 1 6項 記載の取得方法。

2 0 . 還元型補酵素 。を含有する有機相は、 還元剤を用いて酸化型補酵素 。を含有する有機相を還元して得られたものである請求の範囲第 1 3〜1 9 項のいずれかに記載の取得方法。

2 1 . 還元剤は次亜硫酸類又はァスコルビン酸類である請求の範囲第 2 0項記 載の取得方法。

2 2 . 添加する溶媒が、 留去される有機溶媒よりも、 還元型補酵素 Q _{1 0}を酸 化から防護する作用が低いものである請求の範囲第 1 6項記載の取得方法。

2 3 . 留去される有機溶媒が、 炭化水素類、 脂肪酸エステル類、 エーテル類、 及び、 二トリル類からなる群より選択される少なくとも 1種である請求の範囲第 1 3〜2 2項のいずれかに記載の取得方法。

2 4 . 添加する溶媒がアルコール類である請求の範囲第 1 6〜 2 3項のいずれ かに記載の取得方法。

2 5 . 添加する溶媒がケトン類である請求の範囲第 1 6〜2 3項のいずれかに 記載の取得方法。

2 6 . 取得した還元型補酵素 。の油状物を、 前記油状物の融解温度未満の 温度で還元型補酵素 。の種晶と接触させることにより、 前記油状物を固化さ せ、 還元型補酵素 。の固形物を得る請求の範囲第 1 3〜1 5項のいずれかに 記載の取得方法。

2 7 . 脱酸素雰囲気下に実施する請求の範囲第 1 3〜 2 6項のいずれかに記載

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