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WO2003068964A1 - Procede permettant de tester les aliments - Google Patents

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WO2003068964A1
WO2003068964A1 PCT/JP2002/009982 JP0209982W WO03068964A1 WO 2003068964 A1 WO2003068964 A1 WO 2003068964A1 JP 0209982 W JP0209982 W JP 0209982W WO 03068964 A1 WO03068964 A1 WO 03068964A1
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WO
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food
buckwheat
primer
pcr
gene
Prior art date
Application number
PCT/JP2002/009982
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English (en)
French (fr)
Inventor
Hirohito Yamakawa
Eriko Suzuki
Kiyoko Miyatake
Katsuyuki Hayakawa
Original Assignee
Nisshin Seifun Group Inc.
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Publication date
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Priority to JP2003568077A priority patent/JP4059851B2/ja
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Priority to AT02768095T priority patent/ATE459714T1/de
Priority to AU2002332325A priority patent/AU2002332325B2/en
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Definitions

  • the present invention relates to a method for testing food, and in particular, includes an allergic substance contained in food.
  • the present invention relates to a method of detecting the presence of a trace amount of a specific substance at all distribution stages of a food in order to indicate whether or not the substance is present.
  • the present invention provides a method for designing a primer based on information obtained from a part of the gene of a specific substance, performing PCR, and measuring the presence or absence of the specific substance in a food.
  • [2] in order to indicate the presence or absence of trace components in food, It provides a method for designing primers based on information obtained from a part of PCR and performing PCR, measuring the presence or absence of a specific substance, and displaying it on food.
  • primers are designed based on information obtained from some of the genes of specific substances, PCR is performed, and A method to determine the presence of a specific substance, a method to provide information on whether a food contains a specific substance containing an allergen that is harmful to or suspected of having a food allergy, or Can be provided.
  • Food includes not only human food but also animal food (feed).
  • the food may be a processed food or a food raw material.
  • the gene is a buckwheat gene represented by SEQ ID NO: 11 in the sequence listing, and the primer is
  • the primer is the complementary strand of the target gene and
  • the N-terminal sequence and the C-terminal sequence are selected in pairs.
  • the length of a pair may be the same or different.
  • FAG 3 (SEQ ID NO: 1) ZFAG4 (SEQ ID NO: 2), FAG 17 (SEQ ID NO: 5), ZFAG18 (SEQ ID NO: 6), FAG19 (SEQ ID NO: 7) ZFAG20 (SEQ ID NO: 8) ), FAG19 (SEQ ID NO: 7), ZFAG 22 (SEQ ID NO: 9), and FAG19 (SEQ ID NO: 7) / FAG24 (SEQ ID NO: 10).
  • Primers used for PCR may be the same as the corresponding region of type I DNA (for example, the sequence of SEQ ID NO: 11 in the case of buckwheat), if the relevant region is the same, '-Upstream, 3'-Downstream nucleotides have the same function even if they are on the same type III or shifted by several or more than 10 bases. Similar result (PCR product) Is known to be obtained.
  • preferred primer pairs are not limited to those in Table 1 above, and those that can achieve substantially the same function as the primer pairs in Table 1 by PCR are also preferred primer pairs. Included in one.
  • primers in which one or several bases of each primer have been deleted, substituted, added and / or inserted, and primers which hybridize to the corresponding region of the type III DNA are substantially the same as the above-mentioned primers.
  • primers which hybridize to the corresponding region of the type III DNA are substantially the same as the above-mentioned primers.
  • primers of SEQ ID NOs: 1 to 10 are identical.
  • Primers and the like are included in preferred primers of the present invention.
  • a primer for PCR designed based on information obtained from a part of the gene of the specific substance, and a set of reagents containing the primer for measuring the presence and / or concentration of the specific substance in food (kit ) I will provide a.
  • FIG. 1a is an electrophoresis image showing the results of buckwheat specificity of the buckwheat detection primer; FAG1922.
  • FIG. Lb is an electrophoresis image showing the specificity of FAG5ZFAG6.
  • FIG. 2 is an electrophoresis image showing the detection limit of the buckwheat detection system by PCR.
  • Figure 2a shows the measurement results of the DNA-level pseudo-contaminated sample
  • Figure 2b is the electrophoresis image showing the measurement results of the powder-level pseudo-contaminated sample.
  • Figure 3 is an electrophoresis image showing the results of detection of buckwheat from processed foods by PCR.
  • Figures 3a and 3b show that the measured processed foods differ for each lane.
  • the present invention is a method for determining the presence or absence of a specific substance in a food by designing a primer based on information obtained from a part of the gene of the specific substance and performing a PCR reaction.
  • the food to be measured as a sample may be a raw material, any of the processed stages, or a processed food.
  • the method of the present invention is preferably carried out in a food, for example, preferably in a volume ratio of DNA level or a mass ratio of a specific substance to the whole food, 0.1% or less, lOOppm or less, further 5Oppm or less, lOppm or less.
  • a method for detecting the presence or absence of a trace amount of a specific substance If the gene of the specific substance is contained in the food, the substance not intended by the producer can be used as a part of seasonings and additives.
  • DNA can be detected even in trace amounts.
  • DNA is relatively stable to food processing such as heating, and processing such as heating, cooking, etc. A trace amount of the food can be detected.
  • the gene sequence of the specific substance may be detected by a known gene detection method, but today, a large amount of known gene information can be used.
  • information on the entire sequence of a specific gene can be obtained from a database such as the National Institute of Genetics (DDBJ), and sense primers and antisense primers suitable for PCR (Polymerase Chain Reaction) can be obtained from partial sequence information.
  • DDBJ National Institute of Genetics
  • sense primers and antisense primers suitable for PCR Polymerase Chain Reaction
  • One pair (pair, pair) of sense primers can be selected as a primer (probe).
  • the primer has a GC content of 40-60%; Solution temperature (Tm value, see below) is 55-70 ° C, (iii) Tm values of the two primer pairs are close, (iv) Complementary sequence between the 3 'ends of the two primers (V)
  • the primer itself does not form a higher order structure such as a hairpin.
  • the total length of the primer should be 15 to 35 mer.
  • the GC content at the 3 'end of the primer should be reduced.
  • the primer does not have to completely match the sequence of one strand of the type I DNA to be amplified. And (X) there is no other sequence similar to that of the primer in the DNA sample used.
  • the primer of the present invention needs to be usable not only for raw buckwheat but also for foods in the processing stage and foods after processing such as heating and conditioning. Therefore, the buckwheat ⁇ type DNA used is not intact, but is considered to be a very finely cleaved DNA fragment, and (xi) some of the genes amplified by the two primers are: It is a relatively short area. Furthermore, it is necessary to design a primer that satisfies all of the conditions (i) to (X i) in one gene region that is common to various buckwheat. However, it is very difficult to create a primer that satisfies all of these conditions with a DNA sequence consisting of only four nucleotides, A, C, G, and T.
  • primer design is very difficult for PCR. This is a difficult problem. Also, even if primers that satisfy all of these many conditions can be designed, they are only necessary conditions for performing PCR, and the only way to achieve the intended PCR is to actually perform PCR. I do not know.
  • the PCR method is not particularly limited, and includes various known improvement methods.
  • Repa pairs one primer, ⁇ (test) in addition to T ris- HC 1 of DNA, KC 1, MgC 1 2 , each dNTPs, a mixture of reagents such as T a QDN A polymerase Ichize P Use as a reaction solution for CR.
  • One cycle of PCR consists of three steps: heat denaturation, primer lining, and DNA polymerase-mediated DNA synthesis. Since each step requires a different and possibly the same reaction temperature and reaction time, the appropriate range should be selected according to the nucleotide sequence and length of the DNA region to be amplified. Thermal cyclers for such operations are commercially available. The following formula obtained from GC content and sequence length
  • T m (° C) 4 X (G + C) + 2 X (A + T)
  • the PCR amplification product is adjusted to be about 50 to 500 bp, more preferably about 100 to 150 bp. Within this range, it is also possible to detect fragmented DNA in processed foods.
  • the gene is the buckwheat gene shown in SEQ ID NO: 11, and the primer is selected from the sequence from the 121st g to the 360th c shown in SEQ ID NO: 11.
  • a sense primer or an antisense primer selected from information on at least 5 to 35 contiguous DNA fragments;
  • the primer is a complementary strand of the target gene, and the N-terminal sequence portion and the C-terminal sequence portion of the evening get gene are selected as a pair.
  • the length of a pair can be the same or different Is also good.
  • FAG3 (SEQ ID NO: 1) ZFAG4 (SEQ ID NO: 2), FAG 17 (SEQ ID NO: 5), ZFAG18 (SEQ ID NO: 6), FAG19 (SEQ ID NO: 7) / FAG20 (SEQ ID NO: 8), FAG in Table 1 below 1 (SEQ ID NO: 7) / ⁇ AG22 (SEQ ID NO: 9), FAG19 (SEQ ID NO: 7) / FAG24 (SEQ ID NO: 10), or a primer pair Primer pairs are preferred. As will be described later in Comparative Examples, even a primer pair [FAG5 (SEQ ID NO: 3) ZFAG6 (SEQ ID NO: 4)] having the same Tm value may not be suitable for detection, and selection of primers is important.
  • the PCR reaction can be identified using an immunological reaction, and can be identified in any way, but should be electrophoresed and, if necessary, be clearly imaged by electrophoresis using positive and negative controls. If a band is observed, the presence of the test substance in the sample can be confirmed.
  • the detection method of the present invention can be easily implemented by using a set of reagents (kits) containing primers designed based on information obtained from a part of the gene of the specific substance.
  • the reagent set (kit) may contain a known reagent widely used for PCR, or may be provided with another device such as an electrophoresis device.
  • examples of the reagent include dNTP, MgCl 2 , Taqpolymerase, Tris_HCl, glycerol, DMSO, DNA for positive control, DNA for negative control, distilled water and the like.
  • These reagents may be packaged independently and provided in a complete reagent kit (kit), or may be provided as a mixture of two or more reagents.
  • the concentration of each reagent in the set of reagents (kit) is not particularly limited, and may be any range as long as the PCR of the present invention can be performed. Further, information such as suitable PCR conditions may be further attached to the reagent set (kit), or only the primer reagent may be used.
  • the test substance is not limited as long as it is a food, but in the case of cereals, for example, wheat, rice, corn, corn, millet, hee, buckwheat, and beans are used. Including. Since DNA is heat-stable and can be detected in trace amounts in processed foods, the results obtained can be displayed on foods, used as information on food allergies, and by detecting the presence or absence of specific grains in foods. It is possible to detect trace amounts of food additives such as processing aids and carryover, or contamination that is not intended by the producer, such as the presence or absence of cross-contamination between production lines.
  • the present invention will be specifically described using sopa as an example, but the present invention is not limited thereto.
  • the inventors searched for candidate primer sequences using software “GENETYX MAC” for specific gene sequences.
  • GENETYX MAC was used because, among the above conditions for primer design, various conditions that were difficult to analyze by manual calculation, for example, (i) GC content, (ii) Tm value range could be set.
  • 67 pairs of candidate sequences were searched. I was able to.
  • the inventor independently searches for a sequence that satisfies all of the above conditions (i) to (xi) for primer design, and finds a primer sequence that can be used in the inspection method of the present invention.
  • Nine pairs of oligonucleotide DNA primers (synthesized by Biologica Co., Ltd.) containing the primer sequences thus found were prepared.
  • the PCR reaction solution was prepared as follows. That PCR buffer (PCR bu ffer II, Applied Biosystems), 200 ⁇ mo 1/1 ; d NTP, 1. 5mmo 1/1; MgC 1 2, 0. 5 mo 1/1; sense and antisense To the solution containing the sense primer and 0.625 un its Taq DNA polymerase (Amp 1 i Taq Gold, Apprite Biosystems), add 2.51 of the DNA sample solution adjusted to 10 ng / 1 and add the total amount. To 2 And Those in Table 3 where the amount of type III DNA is not described are the concentrations in this case. However, when the extracted concentration of DNA is 10 ns / 1 or less, or additives are often processed foods, the absorbance of the resulting DNA OD 2S. 00 28 .
  • the DNA concentration is 1.7 or less and the purity of the DNA is low, add the undiluted DNA extract or 1 OngZ1 dilution to the 2.5 l to 17.8a 1 PCR reaction mixture. The amount was adjusted using pure water so that the total amount was 25 n 1 according to the amount. In Table 3, the concentration of type III DNA is the concentration in this case.
  • Gene Amp PCR System 9600 (Applied Biosystems) was used as a PCR amplification apparatus, and the reaction conditions were set as follows. First, the reaction was started at 95 ° C for 10 minutes, and then PCR was amplified for 40 cycles, with 95 ° C for 30 seconds, 60 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 30 seconds as one cycle. Finally, the reaction was maintained at 4 ° C. for 727 minutes as a termination reaction, and the obtained reaction solution was used as a PCR amplification reaction solution.
  • the PCR amplification reaction solution was subjected to electrophoresis on a 2% agarose gel (2% E-Gel, Invitrogen) containing ethidium bromide, and a positive control (DNA extracted from wheat flour) and a negative control ( ⁇ The appropriateness of PCR was determined based on the presence or absence of the amplification band in the blank reaction solution without type DNA), and the presence or absence of buckwheat contamination in the sample was determined by confirming the optimal size of DNA amplification band using each primer. .
  • PCR was performed using DNA obtained from buckwheat and other plant seeds. 7 for buckwheat sample kinds of buckwheat seeds [Mankan (US, Canada, China), Inner Mongolia (China), Yulin (China), Kiyose (Hokkaido), Aizu native (Fukushima)] and two types of commercial buckwheat flour A And B were used.
  • two kinds of wheat Agriculture and Forestry No.
  • Figure 1a shows an electrophoretic image of the detection results showing the specificity of the primer for detecting sopa; FAG19 / 22.
  • M lOO bp ladder car
  • NC No Template Control (blank without type I DNA) water.
  • Table 2 shows the lane numbers (sample names) in Figure la and the results.
  • FIG. 1b shows an electrophoretic image of the detection results showing the specificity of the primers shown in Table 1: FAG5ZFAG6.
  • Lane No. 1 Mankan (Canada), 2: Inner Mongolia (China), 3: Yulin (China), 4: Aizu native (Japan), 5: Commercial buckwheat flour A, M: indicates a 100 bp ladder marker.
  • FIG. 1b the appearance of a non-specific band was observed, indicating that it was not suitable as a primer for sono detection.
  • Table 2 Specificity of primers for detecting buckwheat; FAG 1922
  • FAG19 (sense primer): 5 '— AAC GCC ATA ACC AGC CCG ATT-3'
  • FAG22 (antisense primer): 5 CCT CCT GCC
  • the pseudo-contaminated sample at the DNA level was prepared by diluting the DNA extracted from wheat and buckwheat seeds to 10 ng Z1 respectively, and then reducing the buckwheat DNA contamination ratio in wheat DNA to 0.1, 10, 50, 100. , 1000 ppm and 1% by volume.
  • powdered pseudo-currant mixed at the powder level was mixed at a mass ratio such that the mixing ratio of buckwheat flour in wheat flour was 0.1, 10, 50, 100, lOppm and 1%.
  • the DNA was extracted after preparing the sample and pulverizing each mixed sample.
  • Figures 2a and 2b show the electrophoretic images of the detection results.
  • the numbers at the top indicate the percentage of buckwheat contamination
  • M l O Obp ladder
  • NC No Te immediate late control (type I DNA Blank) Indicates water.
  • Figure 2a shows a simulated sample of buckwheat DNA diluted with wheat DNA and a pseudo-contaminated sample of DNA level as a test subject
  • Figure 2b shows a simulated sample of buckwheat powder diluted with wheat powder and a powder-level pseudo-contaminated sample.
  • a subject shows a subject.
  • the detection limit was 10 ppm as the buckwheat contamination rate for both the simulated samples at the DNA level and the powder level ( Figure 2) .
  • the detection limit of several times was 50 ppm, suggesting that the limit of stable detection with this PCR was 50 ppm. Since food allergies may be caused by very small amounts of allergic substances in some people, foods containing designated ingredients are not included in the ⁇ Mandatory labeling of foods containing allergic substances '' according to the revision of the Food Sanitation Law. Regardless of the content, even a very small amount must be indicated.
  • buckwheat was detected from processed foods containing buckwheat as a raw material.
  • the samples used were two kinds of dried (10% Soba, Sanwari Soba), 4 types of confectionery (Soba Mochi A, B, Soba Karinto, Soba Bow Mouth, Baked Confectionery) and Soba Tea. After finely pulverizing each, the dried is Dn easy Plant Maxikit (Q iagen)
  • DNA was extracted using Genomic Tip 20 / G (Qiagen) and subjected to PCR.
  • Soba mochi B type DNA DNA amount 50ng / tube
  • Soba mochi B (type 1 DNA amount 1800ng / tube)
  • DNA Since DNA has higher heat resistance than proteins, it often remains in processed foods. For this reason, the method for detecting specific substances by PCR using DNA as an indicator as described in the present invention is extremely useful as an indirect means of analyzing allergenic substances in foods, which complements conventional methods for detecting proteins in processed foods. It is considered to be.

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Description

食品検査方法
技術分野 本発明は食品の検査方法に関し、 特にアレルギー物質が食品中に含まれている 明
か否かを表示するために、 食品の全ての流通段階において微量に含まれる特定物 の存在を検出する方法に関する。 書
背景技術 近年、 アレルギー物質を含む食品に起因する健康危害を防止するために、 表示 による情報提供の要望が高まり、 平成 1 3年 4月の食品衛生法関連法令の改正に 伴い、 アレルギー物質を含む食品の表示が義務づけられた。 特に症例数が 多い卵、 乳、 小麦と症状が重篤なそば、 落花生の 5品目 （特定原材料） について は、 食品の全ての流通段階において適切な表示を行うことが義務化されることに なつた。 ァレルギ一物質としてどの食品をァレルゲンとして認識するか否かは、 個体差により異なるので、 食品に含まれる特定物がごく微量であっても適切に表 示されていれば、 食品を摂取するものは自己にとってアレルゲンが含まれるか否 かを知ることができる。 しかし、 ごく微量の特定物の有無を加熱等の加工が行わ れた食品で検出することは、 従来公知の食品分析法では困難であった。 特定物を生産者が自社で用いていれば加工食品に表示できることは当然である が、 末端製品の中間原料として特定物質が用いられた場合、 特に購入される中間 原料に微量含まれているか否かについては確認できない場合がある。 また、 実際 に意図しない混入もありうる。
食品メ一力一では、 加工助剤やキヤリーオーバー等食品添加物のごく微量の残 存あるいは製造ライン間の相互汚染の実態を正確に把握し、 適切な対応をとると ともに、 消費者に対しては法律にもとずく正しい情報を提供することが重要であ り、 そのためにはアレルギー物質の正確な分析技術の提供が望まれていた。 わが国においてそばは日常的な食品であるが、 そのそばに対してアレルギー反 応を呈する患者がいる。 反応の多くがアナフィラキシー型であり、 最重症例では 死亡に至る。 食品衛生法のアレルギー物質を含む食品の表示においては、 そばは 特定原材料の 1つとして規定され、 食品中に混入がある場合はその旨を表示する ことが義務化された。 しかし適切な測定方法はなかった。 そのため微量成分の確 実な測定方法が望まれている。
そこで本発明では、 食品中のソバの混入の有無を正確に分析する方法の開発を 目的として、 ソバに特異的なプライマ一の構築ならびにその検出限界の確認、 お よび加工食品への応用を試みた知見により、 食品中の特定物の有無を測定する方 法を提供することを目的とする。 発明の開示
〔1〕 すなわち本発明は、 特定物の遺伝子の一部より得られる情報に基づき プライマ一を設計して P C Rを行い、 食品中の特定物の有無を測定する方法を提 供する。
〔2〕 また、 食品中の微量成分の有無を食品に表示するために、 特定物の遺伝子 の一部より得られる情報に基づきプライマーを設計して P C Rを行い、 特定物の 有無を測定し、 食品に表示する方法を提供する。
〔3〕 さらに、 食品摂取者にとって有害な特定物のアレルゲンを含む食品を識別 するために、 特定物の遺伝子の一部より得られる情報に基づきプライマ一を設計 して P C Rを行い、 食品中の特定物の有無を測定する方法、 食品アレルギー患者 またはその疑いがある者にとって有害なアレルゲンを含む特定物が食品に含まれ るか否かの情報を提供する方法、 または、 これらのいずれかを食品に表示する方 法を提供することができる。 食品は、 ヒトの食品のみならず動物用の食品 （ 飼料） を含む。
〔4〕 ここで、 前記特定物が、 特定の穀類である方法が、 好ましい。
〔5 , 6〕 また、 前記食品は、 加工処理された食品であってもよいし、 食品原料 であってもよい。
〔7〕 前記特定穀類が、 ソバである方法を提供する。
〔8〕 ここで、 前記遺伝子が、 配列表の配列番号 1 1に示すソバ遺伝子であり、 前記プライマ一が、 '
① 1 2 1番目の gから 3 6 0番目の cまでの配列から選択される少なくとも 5〜 3 5個の連続した D N A断片の情報から選択されるセンスプライマ一また は、 アンチセンスプライマ一である；あるいは、
② 1 3 8 1番目の tから 1 6 8 0番目の cまでの配列から選択される少なくとも 5〜3 5個の連続した D N A断片の情報から選択されるセンスプライマー または、 アンチセンスプライマーである方法が、 好ましい。
プライマーは、 ターゲットの遺伝子の相補鎖であり、 ターゲット遺伝子の N—末側の配列部分と C一末側の配列部分とがペア一で選択される。 ペア一の長 さは同じでもよいし異なっていても良い。
〔9〕 特に、 後に表 1で示す FAG 3 (配列番号 1) ZFAG4 (配列番 号 2) , FAG 17 (配列番号 5) ZFAG18 (配列番号 6) ， FAG19 ( 配列番号 7) ZFAG20 (配列番号 8) ， FAG19 (配列番号 7) ZFAG 22 (配列番号 9) ， FAG19 (配列番号 7) /FAG24 (配列番号 10) のプライマ一ペア一が好ましい。
PCRに用いられるプライマーは、 铸型となる DNA (ソバの場合を例示すれ ば、 配列番号 1 1の配列が挙げられる） の該当領域が同様の領域であれば、 プライマ一の個々の配列の 5' —上流側、 3' —下流側の塩基の位置が、 対応す る同一铸型上で、 または数塩基ないしは 10数塩基ずれても同様の機能を有し、 同様の結果 （P CR産物） が得られることが知られている。
したがって、 好ましいプライマ一ペア一は、 上記表 1のものに限定されず、 実 質的に上記表 1のプライマーペア一と同一の機能を P C Rで達成することができ るものも、 好ましいプライマ一ペア一に含まれる。
上記プライマ一については、 各プライマーの 1または数塩基を欠失、 置換、 付 加および/または挿入したプライマ一で、 铸型となる D N Aの該当領域へ ハイブリダィズするプライマ一も上記プライマーと実質的に同一である。 具体的 には、 例えば、 配列番号 1〜10の各プライマーについて、 対応する錶型 DNA に対し 5' —上流側および/または 3' —下流側に 1または数塩基ないしは 10 数塩基ずれているもので、 配列番号 1〜： L 0の配列のうち、 連続した少なくとも 80%、 より好ましくは 90%以上、 さらに好ましくは 95%以上の配列を含む プライマ一等が、 本発明の好ましいプライマーに含まれる。
〔10〕 また、 前記プライマーを用いて、 遺伝子増幅反応を行い、 電気 泳動像で、 明瞭な増幅パンドが、 ダッタンソバ （F a g o p y r um t a t a r i c u m) および · また ソノ (F a g o p y r um e s cu l en t urn) を含む （ソバカズラを含まない） タデ科ソパ属被検体に おいて認められるが、 ソバカズラ （Fa 1 10 p i a) を含む （ダッタンソバぉ よび ·またはソバを含まない） ソバ属以外の夕デ科被検体、 ソバ以外の動植物 ( 由来食品原料） を含む被検物質において認められない方法が提供される。
〔11〕 特定物の遺伝子の一部より得られる情報に基づいて設計された PCR用 プライマ一およびこれを含有する、 食品中の特定物の有無および/または濃度を 測定するための試薬一式 （キット） を提供する。 図面の簡単な説明
図 1 aは、 ソバ検出プライマー； F AG 19 22のソバ特異性の結果を示す 電気泳動像である。 図 l bは、 FAG5ZFAG6の特異性を示す電気泳動像で ある。
図 2は、 PCRによるソバ検出系の検出限界を示す電気泳動像である。 図 2 a は、 DNAレベルの擬似混入サンプルの測定結果であり、 図 2 bは、 粉体レベル の擬似混入サンプルの測定結果を示す電気泳動像である。
図 3は、 P CRによる加工食品からのソバの検出結果を示す電気泳動像で ある。 図 3 a、 図 3 bはそれぞれ測定した加工食品がレーン毎に異なって いる。 発明を実施するための最良の形態
以下に、 本発明を詳細に説明する。
本発明は、 特定物の遺伝子の一部より得られる情報に基づきプライマーを設計 して PCR反応を行い、 食品中の特定物の有無を測定する方法である。
検体として測定される食品は、 原材料であっても、 加工段階のいずれかであつ ても、 加工後の食品であってもよい。 本発明方法は、 食品中のたとえば、 DNA レベルの体積比または特定物の全食品に対する質量比で好ましくは 0. 1 % 以下、 l O O ppm以下、 さらには 5 O p pm以下、 l O ppm以下の微量の特 定物の存在の有無を検出する方法であり、 特定物の遺伝子が食品中に含まれる場 合は、 生産者が意図していない物が、 調味料や添加物の一部として微量存在して も検出することができる. さらに DN Aは夕ンパク質等の生物由来の他の物質に 比べて、 加熱等の食品加工に対して比較的安定であり、 加熱、 調理等、 加工され た食品中の微量の存在が検出できる。
特定物の遺伝子配列は、 未知の場合は公知の遺伝子検出法によって検出しても よいが、 今日では多くの既知の遺伝子情報を用いることができる。 例えば国立遺 伝学研究所 （DDBJ) 等のデータ一ベースから特定物の遺伝子の全配列の情報 を得て、 配列の一部の情報から PCR (Polymerase Chain reaction)反応に適し たセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーのペア一 （対、 組） を選択し てプライマ一 （プローブ） とすることができる。
プライマーの設計は、 本発明の検査方法を考慮して以下の事項に留意した。 ま ず、 （ i) プライマーの GC含量が 40〜60%である、 （ii) プライマーの融 解温度 （Tm値、 下記参照） が、 55〜70°Cである、 （iii) 2つのプライマー 対の Tm値が近い、 （iv) 2つのプライマーの 3' 末端間で相補的配列を保有し ていない、 （V) プライマー自身がヘアピンのような高次構造を形成しない、 （ vi) プライマーの全長は 15〜35me rとする、 （vii) プライマ一の 3' 末端 側の GC含量を低くする、 （viii) プライマ一内で同一ヌクレオチドが多数連続 する配列は回避する、 （ix) プライマーは増幅したい铸型 DNAの片側 1本鎖の 配列と完全に一致している必要はないが、 3' 末端側の相補性を高くする、 （X ) 使用する DN Aサンプルにおいて、 他にプライマ一と同様の配列がない、 等で ある。
本発明のプライマーは、 原材料のソバだけでなく、 加工段階の食品や加熱、 調 理等の加工後の食品にも使用可能であることを必要とする。 したがって、 使用さ れるソバの铸型 DN Aはィンタクトなものではなく、 非常に細かく切断さ れた DNA断片であると考えられ、 （x i) 2つのプライマ一によって増幅され る遺伝子の一部は、 比較的短い領域である。 さらに、 各種のソバが共通して有す る 1つの遺伝子領域の中で、 （i ) 〜 （X i ) の全ての条件を満たすプライマ一 を設計する必要がある。 しかし、 A、 C, G、 Tわずか 4つのヌクレオチドから なる DNA配列で、 これらの条件を全て満たすプライマーを作成することは非常 に難しく、 それ故、 プライマーの設計は、 PCRを行う上で非常に困難な問題と なっている。 また、 仮にこれらの多数の条件を全て満たすプライマーを設計でき たとしても、 それは PCRを行う上での必要条件でしかなく、 意図した PCRを 成功させることは実際に PC Rを行ってみないと判らない。
PCR法は特に限定されず、 公知である種々の改良方法を含むが、 1例を挙げ れぱ、 プライマーのペア一、 铸型 （被検） DNAの他に T r i s— HC 1、 KC 1、 MgC 12 、 各 dNTP、 T a QDN Aポリメラ一ゼ等の試薬類を混合 して P CRの反応液とする。 P CRの 1サイクルは、 熱変性、 プライマ一 のァ二一リング、 DNAポリメラ一ゼによる DN A合成反応の 3つのステップか らなっている。 各ステップはそれぞれ異なった、 場合によっては同じ反応温度と 反応時間を必要とするので増幅しょうとする DN A領域の塩基配列とその長さに よって適切な範囲とする。 このような操作のための thermal cycler が市販され ている。 GC含量と配列の長さから得られる下記式
Tm (°C) =4 X (G+C) + 2 X (A + T)
を、 アニーリング温度の指標とする。 PCR増幅産物が 50〜500 bp、 より 好ましくは 100〜150 b p程度になるようにする。 この範囲とすれば、 加工 食品中で断片化している DN Aの検出もできるからである。
特定穀類がソバである場合は、 前記遺伝子が、 配列番号 11に示すソバ遺伝子 であり、 前記プライマ一が、 配列番号 11に示す① 121番目の gから 360番 目の cまでの配列から選択される少なくとも 5〜 35個の連続した DNA断片の 情報から選択されるセンスプライマーまたは、 アンチセンスプライマ一である； あるいは、
② 1381番目の tから 1680番目の cまでの配列から選択される少なくとも 5〜35個の連続した DNA断片の情報から選択されるセンスプライマーま たは、 アンチセンスプライマ一であるのが好ましい。 プライマーは、 ターゲット の遺伝子の相補鎖であり、 夕一ゲット遺伝子の N—末側の配列部分と C一末側の 配列部分とがペア一で選択される。 ペア一の長さは同じでもよいし異なっていて も良い。
特に、 下記表 1の FAG3 (配列番号 1) ZFAG4 (配列番号 2) , FAG 17 (配列番号 5) ZFAG18 (配列番号 6) , FAG19 (配列番号 7) / FAG2 0 (配列番号 8) , F AG 1 9 (配列番号 7 ) /¥ AG2 2 (配列 番号 9 ) , F AG 1 9 (配列番号 7 ) /F AG 2 4 (配列番号 1 0 ) の プライマーペア一、 またはこれらと実質的に同一なプライマーペア一が好 ましい。 後に比較例で説明するように同じ Tm値をとるプライマ一ペア一 [FAG5 (配列番号 3) ZFAG6 (配列番号 4) ] でも検出に不適当な場合 があり、 プライマーの選択が重要である。
配列 プライ 設定部位 *
名 前 番号 配 列 Tm G C % START END sense FAG 3 1 0 CCA GCA ATT CCA GCA TCA GTG 3' 64 52 149 169 an t i -s en s p FAG 4 2 5 TTG GAG TAG GAA GGA AGC AAG A 3' 6 45 334 313 sense FAG 5 3 5' TGT CGC CGT CCG TGT CGT AA 3 64 60 278 297 ant i -sense FAG 6 4 5' GGA TTC TTC GCT CTC ACT CTG 3' 64 52 530 510 sense FAG 17 5 5' TGG AGT GGG TGG AGT TGA AGA 3' 64 52 1435 1455 an t i -sense FAG 18 6 5' TCA TCT CGG GAC TGG AAT GGT 3' 64 52 1624 1604 sense FAG 19 7 5' AAC' GCC ATA ACC AGC CCG ATT 3' 64 52 1464 1484 ant i -sense FAG20 8 5' TCT CAT CTC GGG ACT GGA ATG 3 64 52 1626 1606 sense FAG 19 7 5' AAC GCC ATA ACC AGC CCG ATT 3' 64 52 1464 1484 ant i -sense FAG22 9 5' CCT CCT GCC TCC CAT TCT TC 3' 64 60 1590 1571 sense FAG 19 7 5' AAC GCC ATA ACC AGC CCG ATT 3' 64 52 1464 1484 an t i -sense FAG24 10 5' AAC CTC CTG CCT CCC ATT CTT 3' 64 52 1592 1572
T a qDNAポリメラーゼ、 MgC l 2 の濃度や反応サイクル数等好適な PCR条件の検討、 あるいは ne s t e dPCRを用いれば、 更に検出感度が向 上する可能性;^ある。
PCRの反応物は、 免疫反応を用いて同定しても、 どのように同定してもよい が、 電気泳動させて、 必要な場合は陽性コントロールや、 陰性コントロールを用 いて電気泳動像で明瞭なバンドが認められれば、 検体中に被検物質が存在するこ とが確認できる。
本発明の検出方法は、 特定物の遺伝子の一部より得られる情報に基づいて設計 されたプライマ一を、 試薬として含有した試薬一式 （キット） を用いて行えば、 容易に実施することもできる。 試薬一式 （キット） は、 P CRに広く用い られる公知の試薬を含有していても、 電気泳動装置等の他の装置が付属し ていてもよい。 具体的に試薬としては、 dNTP、 MgC l 2 、 T a q p o l yme r a s e、 T r i s _HC l、 グリセロール、 DMS O、 ポジティブコントロール用 DNA、 ネガティブコントロール用 DNA、 蒸留水等 が挙げられる。 これらの試薬は試薬一式 （キット） の中で、 それぞれ独立に梱包 されて提供されてもよいし、 2種以上の試薬が混合された形で提供されても よい。 試薬一式 （キット） 中のそれぞれの試薬の濃度に特に制限はなく、 本発明 の P CRを実施するについて可能な範囲であればよい。 また、 試薬一式 （ キット） には、 好適な P CR条件等の情報がさらに添付されていてもよい し、 プライマー試薬のみであってもよい。
本発明の方法は、 被検物質は食品であれば限定されないが、 穀類を例にと れば、 コムギ、 イネ、 トウモロコシ、 ァヮ、 キビ、 ヒェ、 ソバ、 およびマメ類を 含む。 DNAは熱に安定であり加工食品中でも微量で検出できるので得られた結 果は食品に表示したり、 食品のアレルギ一情報として利用できるほか、 食品中の 特定の穀類の有無を検出することにより加工助剤やキャリーオーバー等食品添加 物のごく微量の残存、 あるいは製造ライン間の相互汚染の有無等の生産者の意図 していない混入を検出することができる。 以下にソパを 1例に用いて本発明を具体的に説明するが、 本発明はこれらに限 定されるものではない。
(1) ソバ検知のためのプライマ一の構築
ソバ由来 DNAを検知するためのプライマ一を構築するにあたって、 まず国立 遺伝学研究所 （DDB J) のデータベースにアクセスし、 ソバ （Fagopy r urn e s c u l en t urn) の既知遺伝子の検索を行い、 得られたソバに関す る遺伝子' 1肓報の中力、ら F a g o p y r um e s c u l e n t um ma j o r a l l e r g e n i c s t o r a g e p r o t e i n gene (Ac c e s s i on#AF 152003、 全長 1825 b p) を選択 した。 次に、 DDB Jの BLAST検索によって、 選択したソバの遺伝子配列と 類似の配列がソバ以外の植物にはないことを確認した。
発明者は、 プライマーを設計するために、 特定物の遺伝子配列についてソフト ウェア" GENETYX MAC" を使用して、 プライマーの候補となる配列の 検索を行った。 GENETYX MACは、 プライマー設計の上記条件のうち、 手計算では解析困難な種々の条件、 例えば （i) GC含量、 （ii) Tm値の範囲 設定を行えることから使用した。 その結果、 候補となる配列を 67対検索するこ とができた。 その中で上記 （i) 〜 （x i) のプライマ一設計のための条件を全 て満たす配列を、 発明者が独自に検索することにより、 本発明の検査方法で使用 可能なプライマ一配列を見出した。 このようにして発見したプライマー配列を含 む、 9対のオリゴヌクレオチド DN Aプライマ一 （バイオロジカ （株） で合成） を作製した。
(2) DNAの抽出
ソバおよびその他の植物の種子については表面を l%Tr i t onX (和光純 薬） により洗浄した後蒸留水ですすぎ、 よく乾燥させた後マルチビーズショッ力 一 （安井機械） で微粉碎した。 次に粉砕サンプル 1〜1. 5 gを Dne a s y P l an t Max i k i t (Q i a g e n) を用いて DN Aを抽出した。 ま た加工食品については水分含量の高いものは 24時間凍結乾燥後 1 gを、 水分含 量の低いものについてはそのまま l gから Ge n om i c T i p 2 0 / G (Q i agen) を用いて DNAを抽出した。 抽出された DNAは吸光度の測 定により濃度を求めた後、 純水を用いて 1 OngZ 1に希釈し、 これを PCR の铸型 （被検） DN A試料液として用いた。
(3) PCRと電気泳動像によるソバの検出
PCRの反応液は以下のように調整した。 すなわち PCR緩衝液 （PCR bu f f e r II, アプライドバイオシステムズ社） ， 200 ^mo 1/ 1 ； d NTP, 1. 5mmo 1/1 ； MgC 12 , 0. 5 mo 1 / 1 ； センスおよ びアンチセンスプライマー、 および 0. 625 un i t s TaqDNAポリメ ラ一ゼ （Amp 1 i Ta q Go l d, アプライトバイオシステムズ社） を含む 液に 10 ng/ 1に調整した DNA試料液 2. 5 1を加え、 全量を 2 とした。 表 3で铸型 DNA量の記載のないものはこの場合の濃度である。 但し、 抽出された DNAの濃度が 10 n s/ 1以下の場合、 または添加物が多い加工 食品等で、 得られた DNAの吸光度 OD2S。 0028。 の値が 1. 7以下と夾雑 物が多く DNAの純度が低い場合には、 抽出 DNA原液または 1 OngZ 1希 釈液を 2. 5 l〜17. 8 a 1 PCRの反応液に添加し、 その量に応じて全 量が 25 n 1となるように純水を用いて調整した。 表 3で铸型 DNA量が付記さ れているものはこの場合の濃度である。
PCR増幅装置には Ge n e Amp PCR Sy s t em 9600 ( アプライドバイオシステムズ社） を用い、 反応条件は次のように設定した。 まず 95 °Cに 10分間保ち反応を開始させ、 次に 95 °C 30秒間、 60°C 30秒 間、 72°C 30秒間を 1サイクルとして、 40サイクルの PC Rの増幅を行つ た。 最後に終了反応として 72 7分間保った後 4°Cで保存し、 得られた反応 液を P C R増幅反応液とした。
PCR増幅反応液はェチジゥムブロミドを含む 2%ァガロースゲル （2%E— Ge l、 I nv i t r og en) による電気泳動に供し、 陽性コントロール （騫 麦粉より抽出した DNA) および陰性コントロール （铸型 DN Aなしのブランク 反応液） の増幅バントの有無によって P C Rの妥当性を判断すると共に、 各プライマーによる至適サイズの D N A増幅パンドを確認することによって サンプル中のソバの混入の有無を判定した。
(4) 実験 1. ソバ検知プライマーの特異性の確認
ソバを特異的に検出するプライマーの選抜を目的として、 ソバおよびその他の 植物の種子から得た D N Aを用いて P C Rを行った。 ソバのサンプルとしては 7 種類のソバの種子 [マンカン (アメリカ、 カナダ、 中国） 、 内蒙古 （中国） 、 楡 林 （中国） 、 キ夕ヮセ （北海道） 、 会津在来 （福島） ] および 2種類の業務 用ソバ粉 A、 Bを用いた。 また、 他の植物としてコムギ 2種 （農林 6 1号、 C a n a d i an Amb e r Du r um) ^ ライムギ （カナダ） 、 ォォムギ (ミノリムギ） 、 コメ （コシヒカリ） 、 トウモロコシ （飼料用 nonGMO) 、 ダイズ （ムラユタカ） 、 ァヮ （熊本） 、 ナタネ （Cano 1 a) 、 オーツムギ （ 競争馬向け飼料用） およびソバカズラ （岡山大学資源生物科学研究所より入手） の種子を用いた。
P CR後電気泳動を行い、 至適サイズの明瞭な増幅バンドがソバサンプルにお いてのみ認められ、 他の植物では認められないプライマーをソバを特異的に検知 するプライマーとして選抜した。
図 1 aにソパ検知用プライマー； FAG19/22の特異性を示す検出結果の 電気泳動像を示す。 図 l aで、 M : l O O b pラダーマ一カー、 N C ： No Template Control (铸型 DNAなしのブランク） 水を示す。 図 l aのレーン番 号 （サンプル名） およびその結果を下記表 2に示す。
図 1 bに表 1に示すプライマー： FAG 5 ZF AG 6の特異性を示す検出結果 の電気泳動像を示す。 図 l bで、 レーン番号 1 ：マンカン種 （カナダ） 、 2 ：内 蒙古種 （中国） 、 3 ：楡林種 （中国） 、 4 ：会津在来種 （日本） 、 5 ：業務 用ソバ粉 A、 M： 1 00 b pラダ一マーカーを示す。 図 1 bでは、 非特異 的バンドの出現が認められソノ検知用プライマーとして適当ではないことがわか る。 表 2 . ソバ検知用プライマー； F A G 1 9 2 2の特異性
P C Rによる 図 1の サンプル名 ロロ 産 地 検知結果 レーン番号 玄ソバ マンカン アメリカ + 1 玄ソバ マンカン カナダ + 2 、ノ）クヾ
/ ヽ マヽ ノ、 ノ ~1 ノ、ノ Q 玄ソパ 内蒙古 中国 + 4 玄ソパ 賴《 个 中国 + 5 玄ソバ • キ夕ヮセ 北海道 + 6 玄ソパ 会津在来 福島 + 7 ソパ粉 A + 8 ソバ粉 B + 9 コムギ 農林 61号 日本 ― 1 0 コムギ (デュラム) CAD (Canadi an Amber Durum) カナダ ― 1 1 ライムギ カナダ ― 1 2 ォォムギ ミノリムギ 日本 一 1 3
~ 1ハ ~1シ L 1 ' ) 口牛
卜ゥモロコシ nonGMO (飼料用） オーストラリア 1 5 ダイズ ムラユタカ 日本 1 6 ァヮ 熊本産 日本 1 7 ナタネ Cano l a カナダ 1 8 オーツムギ 競走馬 i lけ飼料用 カナダ 1 9 ソパカズラ 岡山大学資源生物科学研究所 日本 2 0
実験 1の結果、 以下の実験のプライマ一として、 FAG 19ノ 22 (増幅 サイズ 127 bp) のセットを選抜した。
FAG19 (センスプライマー） ： 5' — AAC GCC ATA A CC AGC CCG ATT- 3'
FAG22 (アンチセンスプライマー) ： 5， 一 CCT CCT GCC
TCC CAT TCT TC- 3 '
ソパ以外の植物の内ソバカズラはソバと同じ夕デ科植物であるが、 この プライマ一セットにおいて交差反応は認められなかった （図 l a、 表 2) 。 (5) 実験 2. PCRによるソバの検出限界の碓認
実験 2では F AG 19/22プライマ一を用いた P CRによるソバの検出限界 を調べることを目的として、 DN Aレベルおよび粉体レベルでソバの擬似 混入サンプルを作製し、 それらの DNA試料液を用いて PC Rを行いソバの検出 限界を確認した。
DN Aレベルの擬似混入サンプルは、 コムギおよびソバの種子より抽出された DNAをそれぞれ 10 n gZ 1に希釈し、 それらをコムギ D N A中のソバ DNAの混入率が 0. 1、 10、 50、 100、 1000 p pmおよび 1 %とな るように体積比で混合して作製した。 また、 粉体レベルの擬似混入サンカレは、 コムギ粉中のソバ粉の混入率が 0. 1、 10、 50、 100、 l O O O ppmお よび 1 %となるように質量比で混合してサンプルを作製し、 各混入サンプルを微 粉枠した後 DNAを抽出した。
図 2 aおよび図 2 bに検出結果の電気泳動像を示す。 上部の数字はソバの混入 率を示し、 M : l O Obpラダー、 NC： No Te即 late Control (铸型 DNAな しのブランク） 水を示す。 ここで図 2 aは、 ソバ DNAをコムギ DNAで希釈し た、 DN Aレベルの擬似混入サンプルを被検体とし、 図 2 bは、 ソバ粉をコムギ 粉で希釈した、 粉体レベルの擬似混入サンプルを被検体とした。
実験 2において F AG 19/22を用いた PC Rによるソバ検出限界を確認し た結果、 DNAレベルおよび粉体レベルのいずれの擬似混入サンプルにおいても ソバ混入率として 10 ppmが検出限界であった （図 2) 。 但し複数回行った実 験の内、 数回の検出限界は 50 ppmであり、 この PC Rで安定して検出される 限界は 50 ppmであることが示唆された。 食物アレルギーは人によってはごく 微量のアレルギー物質によって発症することがあるため、 食品衛生法の改正によ る 「アレルギー物質を含む食品の表示の義務化」 においては指定原材料が含まれ る食品は、 含有量にかかわらず微量でも表示しなくてはならないとしている。 厚 生労働省のアレルギー表示検討会の中間報告 （平成 13年 10月 17日） におい て表示の必要性を判断する基準が示されているが、 そこでは加工食品中に特定原 材料の総タンパク量として数 gZml (g) 以上 （l〜9 ppm以上） が含ま れる場合に表示が必要であると報告している。 そば全層粉のタンパク質含量は約 1 2質量％ (五訂食品成分表より） であることから、 本 P CRの検出限界 50 p pmはソバのタンパク質の混入率に換算すると 6 p pmとなる。 すなわち ここで示した P CRによるソバの検知法は、 表示検討会の示した表示のための基 準を検知するために十分な分析方法であると考えられる。
(6) 実験 3. PCRによる加工食品からのソバの検知
ソノ検知プライマ一として F AG 19/22を用いて、 原料としてソバが含ま れる加工食品からのソバの検知を行った。 用いたサンプルは乾麵 2種 （十割 そば、 三割そば） 、 菓子 4種類 （そば餅 A、 B、 そばかりんとう、 そばボウ口、 焼き菓子） およびそば茶で、 それぞれ微粉砕後、 乾麵は Dn e a s y P l a n t Ma x i k i t (Q i a g e n) , 菓子およびそば茶は Ge n om i c T i p 20 /G (Q i a g e n) を用いて DNAを抽出 し、 PCRに供した。 そば餅 Bについては得られた DNAの純度が 1. 2と低か つたので、 PCRの反応チューブ当たり 50〜1800 n g (吸光度からの計算 値） の DN Aを添加した。 図 3 a、 図 3 bのレーン番号 （サンプル名） を以下の表 3に示す。
表 3 レーン番号 サ ン プ ル 名
図 3 a 1 そば餅 A
2 そば餅 B (铸型 DNA量 50ng/tube)
3 そば餅 B (铸型 DNA量 120ng/tube)
4 そばかりんとう
5 そばボウ口
6 そば麒子
7 そば茶
8 玄そば （そば種子）
9 水
M lOOb ラダー 図 3 b 1 そば餅 B (铸型 DNA量 50ng/tube)
2 そば餅 B (铸型 DNA量 120ng/tube)
3 そば餅 B (铸型 DNA量 1800ng/tube)
4 玄そば （そば種子）
5 水
M lOObp ラダー F AG 1 9/22を用いて加工食品からのソバの検知を行った結果 （実験 3) 、 そば餅 Bを除いて錶型 DNA量が PCRの反応当たり 25ngの規定量で ソバが検出された （図 3 a) 。 一方そば餅 Bにおいては、 铸型 DNA量の添加量 を 50 ngまたは 120 ngに増やしても PC R増幅バントが認められなかった が、 1 80 0 n gまで増量することによってソバの検出が可能となった （ 図 3b) 。
現在食品アレルギの検査として臨床現場では、 誘発試験やブリック · スクラッチ試験、 R AST法等が実施されているが、 これらの方法はアレルギー 患者自身あるいは血液を対象として実施する検查であり、 食品分析への適用は困 難である。 一方、 アレルゲンそのものを検出、 定量するための特定タンパク質の 分離検出法として、 電気泳動法 （SDS— PAGE) やウエスタンブロッテイン グ法、 免疫化学的手法 （EL I SA法） が使われているが、 これらは既知の主要 アレルゲンの検出のためには有効であるが、 未知のアレルゲンの検出あるいは加 熱工程によってタンパク質が変性している可能性のある加工食品においては必ず しも適当ではない。 産業上の利用可能性
DNAはタンパク質よりも加熱耐性が高いため加工食品中でも残存している場 合が多い。 このため本発明で示した DNAを指標とした PCR法による特定物の 検出法は、 特に加工食品において従来からのタンパク質の検出法を補う間接的な 食品中のアレルギー原因物質の分析手段として極めて有用であると考えられる。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 特定物の遺伝子の一部より得られる情報に基づきプライマ一を設計して P C Rを行い、 食品中の特定物の有無を測定する方法。
2 . 食品中の微量成分の有無を食品に表示するために、 特定物の遺伝子の一部よ り得られる情報に基づきプライマーを設計して P C Rを行い、 特定物の有無を測 定し、 食品に表示する方法。
3 . 食品摂取者にとって有害な特定物のアレルゲンを含む食品を識別する ために、 特定物の遺伝子の一部より得られる情報に基づきプライマーを設計して 遺伝子増幅反応 P C Rを行い、 食品中の特定物の有無を測定する方法。
4. 前記特定物が、 特定の穀類である請求項 1〜 3のいずれかに記載の方法。
5 . 前記食品が、 加工処理された食品である請求項 1〜4のいずれかに記載 の方法。
6 . 前記食品が、 食品原料である請求項 1〜4のいずれかに記載の方法。
7 . 前記特定穀類が、 ソバである請求項 1〜6のいずれかに記載の方法。
8 . 前記遺伝子が、 配列表の配列番号 1 1に示すソバ遺伝子であり、 前記 プライマーが、
① 1 2 1番目の gから 3 6 0番目の cまでの配列から選択される少なくとも 5〜 3 5個の連続した D N A断片の情報から選択されるセンスプライマ一また は、 アンチセンスプライマ一である；もしくは、
② 1 3 8 1番目の tから 1 6 8 0番目の cまでの配列から選択される少なくとも 5〜3 5個の連続した D N A.断片の情報から選択されるセンスプライマ一 または、 アンチセンスプライマーである請求項 1〜 7のいずれかに記載の 方法。
9. 前記プライマーを用いて、 PCRを行い、 電気泳動像で、 明瞭な増幅バンド が、 ダッタンソバ （F a g o p y r urn t a t a r i c um) および ·または ソバ （Fagopy rum e s c u l en t um) を含む被検体において認め られるが、 ソバカズラ （Fa 1 1 o p i a) を含む被検体において認められない 請求項 1 ~ 8のいずれかに記載の方法。
10. 特定物の遺伝子の一部より得られる情報に基づいて設計された、 食品中の 特定物の有無および Zまたは濃度を測定するための PC R用プライマー。
11. 特定物の遺伝子の一部より得られる情報に基づいて設計された PCR 用プライマ一を含有する、 食品中の特定物の有無および Zまたは濃度を測定する ためのキッ卜。
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