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WO2003067260A1 - Verfahren zur diagnose eines zystischen ovarialkarzinoms - Google Patents

Verfahren zur diagnose eines zystischen ovarialkarzinoms Download PDF

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WO2003067260A1
WO2003067260A1 PCT/AT2003/000031 AT0300031W WO03067260A1 WO 2003067260 A1 WO2003067260 A1 WO 2003067260A1 AT 0300031 W AT0300031 W AT 0300031W WO 03067260 A1 WO03067260 A1 WO 03067260A1
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WO
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calgranulin
concentration
ovarian cancer
individual
cell culture
Prior art date
Application number
PCT/AT2003/000031
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English (en)
French (fr)
Inventor
Karl Illmensee
Herbert Lindner
Bettina Sarg
Helmut Ott
Original Assignee
Tilak-Tiroler Landeskrankenanstalten Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by Tilak-Tiroler Landeskrankenanstalten Gmbh filed Critical Tilak-Tiroler Landeskrankenanstalten Gmbh
Priority to AU2003208154A priority Critical patent/AU2003208154A1/en
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57449—Specifically defined cancers of ovaries
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Definitions

  • the present application relates to a method for diagnosing cystic ovarian cancer in an individual or a cell culture.
  • Ovarian cancer is a tumor that is increasingly occurring in the white population in Europe. About 15 out of 100,000 women develop ovarian cancer each year, and this disease is the main cause of mortality among all gynecological diseases. The number of cases of ovarian cancer increases with age, with about 3% of women under 30, 25% of women between 40 and 50 and 35% of women over 50 having this type of tumor.
  • ovarian cancer is difficult to predict. Early symptoms that could be used to identify this condition at an early stage are not known. In most cases, the symptoms only appear at a late stage of the disease and are non-specific. There is usually an increase in the abdominal mass due to ascites.
  • the distribution of the tumor is classified according to FIGO (International Federation of Gynecology and Obstetrics) in stages I to IV, whereby stages I to III are divided into subgroups a, b and c.
  • FIGO International Federation of Gynecology and Obstetrics
  • the histological typing of ovarian tumors is carried out according to the HO (World Health Organization).
  • the three main categories are epithelial tumor, genital ridge - stroma and germ cell tumors. In addition to these groups, there are other histologically defined tumors, but these rarely occur in the area of the ovary.
  • the epithelial tumor is the most common of all ovarian tumors (55%). About 30% of all tumors are serous and 15% mucinous, 75% are benign, 15% align and 10% are borderline tumors. Histological and cytological evaluations of the ascites are necessary to classify and analyze the tumor tissue and tumor spread. Based on the cytogenetic results of ovarian tumors, it was found that this frequently occurs in connection with DNA amplification of the chromosomal region 20 ql2-gl3, similar to the already known amplification in breast cancer. In addition, gene amplification of c-erbB-2 and FGF-3 (INT-2) has been associated with oncogenic processes.
  • ovarian tumors can be detected with the help of various tumor markers, such as CA 125, CA 19-9, AFP, neopterin, interleukin-8, interleukin-12 and hCG.
  • tumor markers such as CA 125, CA 19-9, AFP, neopterin, interleukin-8, interleukin-12 and hCG.
  • Soluble cell adhesion molecules such as the sCD44 protein, sE-cadherin and sICAM-1 have been found in both ovarian cancer and patient serum.
  • sCD44 protein sE-cadherin and sICAM-1
  • Recent studies have shown that the absence of c-kit protein in ovarian cancer is associated with a very low survival rate, with c-kit patients showing a higher survival rate in tumor tissue.
  • cytosol values of uPA, PAI-1 and VEGF show a significant correlation with malignant developments and a low survival rate.
  • Increased VEGF and suPAR values were found in the serum of patients with malignant ovarian cancer.
  • further examination of the sera from patients with ovarian cancer for uPA, PAI-1, HER-2 and VEGF did not lead to the detection of a reliable tumor indicator that could be used for early diagnosis of tumor markings.
  • ARP apoptosis-associated proteins
  • cystic ovarian cancer it has now been found for the first time that there is a connection between the concentration of calgranulin A or calgranulin B in an individual and the diagnosis of cystic ovarian cancer: If cystic ovarian cancer is diagnosed, overexpression of calgranulin A and / or Calgranulin B found compared to healthy individuals or individuals with benign ovarian tumors. This is the first time that a marker for cystic ovarian cancer has been made available that can specifically and reproducibly distinguish not only between healthy people and people suffering from cystic ovarian cancer, but also between malignant and benign Ovarian tumors.
  • diagnosis also means the distinction between semimalignant and benign or semimalignant and malignant ovarian tumors: patients with semimalignant ovarian tumors show a higher concentration of calgranulin A and / or calgranulin B than patients with benign ovarian tumors or healthy patients. Similarly, patients with malignant ovarian cancer show a higher concentration of calgranulin A and / or calgranulin B than patients with semi-malignant ovarian cancer. Although semimalignant ovarian cancer is very rare, the diagnosis of such a borderline case is important. With the help of the determination of the Calgranulin A / B concentration the diagnosis is made much easier and a highly specific and quick diagnosis is now possible with the help of this new procedure.
  • Calgranulin A also called MRP8
  • Calgranulin B also called MRP14
  • MRP8 myeloid-related proteins and belong to the SlOO family of calcium binding proteins.
  • Calgranulin A and Calgranulin B are co-expressed and form a cell surface and cytoskeleton-associated heterodimer after calcium mobilization. This heterodimer is expressed in the cytoplasm of granulocytes and a subpopulation of blood monocytes.
  • Endress et al. (Lung-Cancer 1997 Aug .; 18 (l): 35-46) report the role of macrophages in human lung carcinoma, showing that MRP8 and MRP14 positive macrophages were present in fewer cases in lung carcinoma, while in 27 10 positive cells were increasingly present.
  • WO 00/26668 A2 discloses a method for diagnosing cancer, wherein values of S 100-AG, S 100-A7, S 100-A8 and S 100-A9 are measured in a sample of a person's biological fluid and with a Control value to be compared. An increased concentration, at least one of these proteins, indicates cancer, in particular breast, colon or Lung cancer, close.
  • calgranulin A and calgranulin B proteins of the SlOO family of calcium binding proteins relate to the proteins MRP8 (S100-A8) and MRP14 (S100-A9) as described, for example, in Eue et al. (Int-Immunol. 2000 Nov; 12 (11): 1593-604), the content of which is incorporated by reference into the present application.
  • “individual” is understood to mean, in particular, a human being but also a mammal which can develop cystic ovarian cancer.
  • the "cell culture” relates to any in vifcr ⁇ cultivation of cells, in particular ovarian cells, which may have been taken from a healthy individual, for example, and the development or development of a cystic ovarian carcinoma can be examined on the basis of this cell culture.
  • the cell culture can also be a culture of cells that have been removed from a patient with a positive diagnosis for cystic ovarian cancer.
  • the concentration of calgranulin A / B is determined in a sample taken from the individual, the sample preferably being a body or organ fluid or an organ or tissue sample, such as serum, cyst fluid, ovarian tissue but also urine, etc.
  • a sample taken from the individual preferably being a body or organ fluid or an organ or tissue sample, such as serum, cyst fluid, ovarian tissue but also urine, etc.
  • Cell culture becomes the tration determined either in the cell culture directly or in a sample taken from the cell culture, for example supernatant or the cells themselves.
  • the concentration is determined in accordance with a suitable method, the method being selected depending on the type of sample, the laboratory possibilities, the number of samples to be determined, but also on the desired accuracy.
  • the calgranulin A / B concentration can be carried out, for example, electrophoretically, chromatographically, immunologically, colorimetrically or by a combination of these methods. Since a number of anti-calgranulin A / B antibodies are already available, immunological tests are extremely suitable, which can either be carried out directly on the tissue sample or in the liquid, for example with the help of ELISA. Testing.
  • the reference value is the calgranulin A / B content in a corresponding "healthy” or “benign” sample or cell culture, i.e. a sample taken from an individual who is not suffering from cystic ovarian cancer or a cell culture which has no cystic ovarian cancer.
  • the reference value is the calgranulin A / B content e.g. in a corresponding "semimalignant" sample or cell culture or the limit calgranulin A / B content, i.e.
  • the reference value should preferably come from a corresponding sample, i.e. if the concentration in cyst fluid is determined, the reference value should also be from cyst fluid.
  • the determined concentration is above the reference value, this means an overexpression of calgranulin A / B compared to the reference or normal value, whereby this means a disease (malignant or semimalignant) of cystic ovarian cancer.
  • the concentration of calgranulin A or that of calgranulin B or the concentrations of of the proteins are determined, the reference value of course being the corresponding concentration, ie likewise either calgranulin A or calgranulin B or both together.
  • the calgranulin A concentration is particularly suitable for diagnosis.
  • a patient is not examined to determine whether he is generally suffering from cancer, but rather the patient can generally be examined as soon as he experiences pain or other abnormalities in a specific organ or body area feels.
  • the breast is examined, if the patient has difficulty breathing, the doctor would examine the lungs in a first step, and in the present case, for example, the patient would feel pain in the lower abdomen, so the doctor would presumably over in a first step Ultrasound examinations would determine whether cyst-like growths can be seen in the area of the ovaries, fallopian tubes or uterus.
  • the reference value is preferably the concentration of calgranulin A and / or calgranulin B in a sample taken from a healthy individual or in a carcinoma-free cell culture. door. This reference value is particularly useful for distinguishing between (semi) malignant and benign tumors or healthy people.
  • a healthy individual is understood to mean a corresponding individual who is free from cystic ovarian cancer.
  • the individual from whom the reference value is determined should be the same as that in which the calgranulin A / B concentration is determined. That is, if the concentration is determined in one person, the reference value should also be determined in another person in a corresponding sample.
  • Another aspect of the present application relates to a method for determining the positive or negative development of cystic ovarian cancer in an individual or a cell culture, which comprises the steps:
  • a positive development of the cystic ovarian cancer being determined if the determined concentration (s) is above the concentration value of the earlier one taken sample lies.
  • This method allows the development of the disease to be determined, a positive development meaning a spreading or growth of the cystic ovarian cancer, ie a worsening of the disease state, and a negative development a reduction or even disappearance of the cystic ovarian cancer, ie an improvement in the Disease state means.
  • the earlier point in time can be the concentration value a few days, a week, months or even years ago.
  • the concentration value can be that which was determined at the earlier point in time. In order to prevent possible inaccuracy of determination, however, it is also possible to carry out the concentration value simultaneously on both samples, the sample taken at the earlier point in time being preserved in a suitable form, for example in a frozen state.
  • the sample taken from the individual is preferably selected from the group consisting of cyst fluid, cyst tissue, serum and urine.
  • cyst fluid and serum have been found to be suitable for the method according to the invention, and these samples can be taken in a simple manner in the course of routine examinations, which is a very uncomplicated and inexpensive way of detecting or examining cystic ovarian cancer.
  • a particularly advantageous method is that the concentration of calgranulin A and / or calgranulin B is determined immunologically. These immunological determinations are particularly favorable since a number of polyclonal as well as monoclonal antibodies which are specific for calgranulin A and calgranulin B exist. Immunological procedures can be carried out both in liquid and on tissues. Examples of such methods are standard ELISA, sandwich ELISA, immunohistochemical methods, etc., these methods not only making it possible to detect calgranulin A / B, but also an accurate quantification.
  • the concentration of calgranulin A and / or calgranulin B is preferably determined using monoclonal antibodies.
  • Monoclonal antibodies are highly specific and can be produced in a very simple and cost-effective manner using standard methods.
  • monoclonal antibodies specific for calgranulin A / B already exist and are readily available.
  • concentration of calgranulin A and / or calgranulin B is determined by measuring the corresponding mRNA or fragments thereof.
  • the measurement of mRNA molecules can be carried out by any conventional method, in particular by hybridization reactions or PCR, it being sufficient to detect a specific region in the mRNA molecule. This method can also be carried out directly in the sample.
  • Another aspect of the present invention relates to a kit for the detection of cystic ovarian cancer in an individual or a cell culture, the
  • Calgranulin A includes a Calgranulin A and / or Calgranulin B reference agent.
  • the reagent for determining the concentration of calgranulin A / B naturally depends on the respective detection method, although the kit can of course also comprise two or more reagents if these are necessary for the detection method.
  • the reagent can e.g. Antibodies, buffers with detection substances and the like include.
  • further detection means such as fluorescent, radioactive or chromogenic substances or also secondary antibodies, can be provided.
  • the reference agent is, for example, a sample comprising a standardized concentration of calgranulin A / B, for example in a buffer or also in a solution corresponding to the respective body fluid or cell culture sample.
  • the reference means can also consist of a simple comparison value, a comparison table or a comparison curve.
  • the reagent for determining the concentration of calgranulin A and / or calgranulin B antibodies preferably comprises, in particular monoclonal antibodies. It is advantageous here if the antibodies are present in the reagent in a certain concentration, the anti-calgranulin A and anti-calgranulin B antibodies being able to be provided separately from one another but also together in the reagent.
  • the antibodies can be bound to markers, for example to fluorescent, radioactive or chromo- gene groups or secondary antibodies that are specific for the primary antibodies can also be provided in the kit.
  • the antibodies are preferably immobilized on a solid support. This makes it possible for the samples to be applied only to the solid support or to flow over it, with calgranulin A / B being immobilized on the solid support via the antibodies. Then washing steps can be carried out and the detection either directly on the solid support or after elution in the eluate.
  • the carrier can be, for example, a chromatography column, a filter, a microtiter plate, well, etc.
  • the kit comprises a solid support for immobilizing calgranulin A and / or calgranulin B.
  • This solid support can be provided, for example, with the natural binding partners of calgranulin A / B, their analogs, parts of antibodies and the like.
  • the detection can again be carried out either directly on the solid support, for example with the aid of labeled or unlabeled antibodies, or after an elution step in the eluate.
  • one of the carriers defined above can be provided as the carrier.
  • the reference agent particularly preferably comprises a standardized amount of calgranulin A and / or calgranulin B. This provides a kit which ensures parallel determination of the reference value, thereby eliminating possible inaccuracies in the determination method.
  • a further advantageous embodiment consists in the reference means comprising a series of standardized calgranulin A and / or calgranulin B samples. These samples can e.g. represent certain degrees of disease, so that the extent or stage of the disease can be determined with the help of only one determination method.
  • Another aspect of the present application relates to the use of calgranulin A and / or calgranulin B inhibitors for the manufacture of a medicament for the treatment of cystic ovarian cancer. Since the concentration of calgranulin A and / or calgranulin B is directly related to a disease of cystic ovarian cancer, a reduction in the concentration of calgranulin A / B or a complete switch-off of calgranulin A / B can prevent a disease or as Therapy for a patient already suffering from cystic ovarian cancer.
  • calgranulin A and / or calgranulin B inhibitors are understood to mean substances, molecules or proteins which, for example, prevent or reduce the expression of calgranulin A / B at the transcription level or translation level, specifically attack and, if appropriate, destroy proteins already expressed , blocks the activity of expressed calgranulin A / B proteins etc.
  • calgranulin A / B inhibitors mean calgranulin A / B antibodies, in particular monoclonal antibodies and also antibody fragments.
  • non-active calgranulin A / B analogs could also be used, which act competitively with natural calgranulin A / B.
  • calgranulin A / B inhibitors could be those which are used in gene silencing, knockout or antisense processes.
  • either calgranulin A or calgranulin B inhibitors can be used here. But it is also possible to use both in a coordinated relationship to each other in one drug.
  • Another aspect of the present application relates to a method for treating a patient with cystic ovarian cancer, which is characterized in that the patient is administered a sufficient amount of calgranulin A and / or calgranulin B inhibitors.
  • treatment means both the treatment of malignant or semi-malignant carcinomas and the prevention of a worsening of the disease in the case of a benign carcinoma. The prevention of a disease in a healthy patient is also understood.
  • FIGS. 1 to 3 the results of 2D gel electrophoresis examinations of various samples and FIGS. 4 and 5 show the amino acid sequences of MRP8 and MRP14.
  • example 1 the results of 2D gel electrophoresis examinations of various samples and FIGS. 4 and 5 show the amino acid sequences of MRP8 and MRP14.
  • Liquids from malignant, benign, and borderline ovarian tumors were collected during surgery or during routine examination. After centrifugation, these samples were aliquoted and frozen like the pellets. Blood samples from the same patients were also collected on the same day, and the supernatants were also divided into pellets and frozen after centrifugation.
  • a quantitative analysis of the aliquots of the liquid samples was carried out to determine the total amount of protein according to the Lowry method.
  • denaturing agents were added to the aliquots in order to dissociate the proteins and to reduce the disulfide bridge bonds.
  • the proteins were separated by means of IEF (isoelectric focusing) in an electrical field (pH 3-10).
  • IEF isoelectric focusing
  • an electrical field pH 3-10
  • a second separation of the proteins was then carried out in an acrylamide gradient gel (9-16%).
  • the protein spots that position in the second dimension are therefore characterized by two independent parameters, on the one hand by the isoelectric focusing and on the other hand by the molecular weight.
  • the protein spots on the 2D gel are made visible using a modified silver staining method according to Blum. This method allows the identification of more than 100 proteins in the fluid of various ovarian tumors and in the serum of the patients, so that the different protein patterns can be compared.
  • FIGS. 1 to 3 show samples from a patient with mucinous cystic carcinoma grade II / FIGO Ilb
  • FIG. 2a shows a sample from a patient with serous cystic carcinoma.
  • C means cyst fluid
  • S serum.
  • the results show that the protein patterns of the ovarian cancer fluids are significantly different compared to the ovarian cyst fluids. Particularly in the lower molecular range between 10 and 25 kD (see broad arrow in FIGS. 1 to 3), numerous additional protein spots can be seen both in the cyst fluid and in the serum of the patients with ovarian cancer (see FIGS. 1 a to 3 a) compared to patients with benign ovarian cysts (see figures lb to 3b).
  • protein spots 1 were identified as calgranulin A (FIG. 4) and 2 as calgranulin B (FIG. 5), the respective sequence with its amino acids and also as a schematic representation being shown, "M” the mean mass , "S” sequence and "P” position mean.
  • M the mean mass
  • the amount of protein present with 100-300 ng protein per spot, based on the total protein amount of 100 ⁇ g examined in the 2D gel, is also sufficient for immunological tests. The localization of these two proteins in the 2D gel was carried out for the first time.
  • additional proteins in the lower molecular range between 10 and 20 kD were found in the serum samples of the 13 patients with ovarian cancer. These additional proteins in the serum show strong similarities in their electrophoretic positioning to those found in the cyst fluids of the corresponding ovarian cancer patients. These additional proteins are not detectably present in the serum of patients with benign ovarian cysts.

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Abstract

Es wird ein Verfahren zur Diagnose eines zystischen Ovarialkarzinoms in einem Individuum oder einer Zellkultur zur Verfügung gestellt, wobei es die Schritte umfasst: - Bestimmen der Konzentration von Calgranulin A und/oder Calgranulin B in einer dem Individuum entnommenen Probe oder der Zellkultur, - Vergleichen der ermittelten Konzentration(en) mit zumindest einem Referenzwert, wobei ein zystisches Ovarialkarzinom diagnostiziert wird, wenn die ermittelten) Konzentration(en) über dem Referenzwert liegt (liegen) sowie ein Kit zur Detektion eines zystischen Ovarialkarzinoms in einem Patienten oder einer Zellkultur.

Description

Verfahren zur Diagnose eines zystischen Ovarialkarzinoms
Die vorliegende Anmeldung betrifft ein Verfahren zur Diagnose eines zystischen Ovarialkarzinoms in einem Individuum oder einer Zellkultur.
Das Ovarialkarzinom ist eine Tumorerkrankung, die vermehrt in der weißen Bevölkerung in Europa auftritt. Pro Jahr erkranken etwa 15 von 100 000 Frauen am Ovarialkarzinom, wobei diese Erkrankung die Hauptursache für die Mortalität unter allen gynäkologischen Erkrankungen darstellt. Die Zahl der Fälle der Erkrankungen an Ovarialkarzinomen nimmt mit dem Alter zu, wobei etwa 3% der Frauen unter 30, 25% der Frauen zwischen 40 und 50 und 35% der Frauen über 50 diese Tumorart aufweisen.
Trotz bereits gut entwickelter Verfahren zur Diagnose und Therapie, sind Ovarialkarzinomerkrankungen nur schlecht prognostizierbar. Frühe Symptome, die zur Identifizierung dieser Erkrankung in einem frühen Stadium herangezogen werden könnten, sind nicht bekannt. In den meisten Fällen treten die Symptome erst in einem späten Stadium der Krankheit auf und sind unspezifisch. Üblicherweise kommt es zu einer Vermehrung der Abdomenmasse aufgrund von Asziten. Die allgemein übliche therapeutische Behandlung umfasst operative Tumorentfernung zusammen mit einer Chemotherapie, wobei die Überlebensrate von dem Ausmaß, in dem sich der Tumor im Abdomen und Pelvis verbreitet hat, abhängt. Ovarialkarzinome werden aufgrund von histopathologischen Graden klassifiziert: Gl = stark differenziert, G2 = mäßig differenziert, G3 = wenig differenziert, GB = Grenztumor (border- line tumor) , Gx = der Grad kann nicht bestimmt werden. Die Verteilung des Tumors wird gemäß FIGO (International Federation of Gynecology and Obstetrics) in Stadien I bis IV klassifiziert, wobei die Stadien I bis III in Untergruppen a, b und c unterteilt werden. Die histologische Typisierung von Ovarialtumoren erfolgt entsprechend der HO (Weltgesundheitsorganisation) . Die drei Hauptkategorien sind Epitheltumor, Genitalgrat - Stroma- tu ore und Keimzellen-Tumore. Zusätzlich zu diesen Gruppen existieren andere histologisch definierte Tumore, wobei diese jedoch selten im Bereich des Eierstocks vorkommen.
Von allen Ovarialtumoren tritt der Epitheltumor am häufigsten auf (55%) . Etwa 30% aller Tumore sind serös und 15% muzinös, 75% sind benign, 15% align und 10% sind Grenztumore. Um das Tumorgewebe und die Tumorverbreitung zu klassifizieren und analysieren, sind histologische und zytologische Evaluierungen der Asziten notwendig. Aufgrund von zytogenetischen Ergebnissen von Eierstocktumoren konnte gefunden werden, dass diese häufig in Verbindung mit DNA-Amplifikation der chromosomalen Region 20 ql2-gl3 auftritt, ähnlich der bereits bekannten Ampli- fikation in Brustkrebs. Zusätzlich wurde die Genamplifikation von c-erbB-2 und FGF-3 (INT-2) mit onkogenen Prozessen in Verbindung gebracht .
Weiters können Ovarialtumore mit Hilfe verschiedener Tumor- marker, wie beispielsweise CA 125, CA 19-9, AFP, Neopterin, In- terleukin-8, Interleukin-12 und hCG, detektiert werden. Zusätzlich zu diesen recht unspezifischen Proteinmarkern wurde die Forschung auf neue Marker mit diagnostischem Wert konzentriert, um zwischen malignen und benignen Ovarialtumoren unterscheiden zu können und um Ovarialkrebs bereits in einem frühen Stadium detektieren zu können. Lösliche Zelladhäsionsmoleküle, wie das sCD44-Protein, sE-Cadherin und sICAM-1 wurden sowohl in Ovarialkrebs als auch im Serum von Patienten gefunden. Neuere Untersuchungen zeigten, dass die Abwesenheit des c-Kit-Proteins in Ovarialkrebs mit einer sehr niedrigen Überlebensrate in Zusammenhang gebracht wird, wobei Patienten mit c-Kit im Tumorgewebe eine höhere Überlebensrate zeigen.
Die Cytosolwerte von uPA, PAI-1 und VEGF zeigen eine signifikante Korrelation mit malignen Entwicklungen und einer geringen Überlebensrate. Es wurden im Serum von Patienten mit malignen Ovarialkarzinomen erhöhte VEGF- und suPAR-Werte gefunden. Dennoch führte eine weitere Untersuchung der Seren von Patienten mit Ovarialkarzinomen im Hinblick auf uPA, PAI-1, HER-2 und VEGF nicht zur Detektion eines verlässlichen Tumorindikators, der zur diagnostischen Tumormarkierung in einem frühen Stadium verwendet werden könnte. Die Aussagekraft von Apoptosis-assoziierten Proteinen (ARP) , wie FAS und dessen Liganden FAS-L, in Ovarialkrebs im Hinblick auf Tumorentwicklung und allgemeine Überlebensrate wurde untersucht. Es wurde dabei festgestellt, dass eine Korrelation zwischen den hohen Werten von FAS-L und einer geringen Überlebensrate besteht. Dasselbe scheint für den Fall eines erhöhten Serumgehalts von FAS zu gelten. Weiters waren die FAS-Se- rummengen höher in Patienten mit Ovarialkrebs als in Patienten mit benignen Ovarialzysten. Eine ähnliche Korrelation wurde für p53 (ein weiteres ARP) gezeigt, da erhöhte p53-Werte mit Ovarialkrebs in Zusammenhang gebracht wurden, und geringe p53-Werte mit Ovarialzysten. Der weite Bereich von p53-Konzentrationen erschwert jedoch die prognostische Evaluierung. Ähnliche Unterschiede der p53-Konzentrationen mit einem ähnlich weiten Konzentrationsbereich wurden im Serum von Patienten mit malignen Ovarialtumoren gefunden, verglichen mit dem Serum von Patienten mit benignen Ovarialzysten. Es wurde keine Korrelation zwischen der p53-Expression in Ovarialkrebs und der Expression des p21-Prote- ins (ein Cyclin-abhängiger Kinaseinhibitor) gefunden.
Es besteht somit die Notwendigkeit eines Tumormarkers, der auf zuverlässige Weise eine Ovarialtumorerkrankung bereits im frühen Stadium detektieren kann bzw. die Prognose der Entwicklung eines solchen Tumors erlaubt. Weiters ist es für eine sinnvolle Diagnose mit anschließender Therapie notwendig, rasch und zuverlässig mit Hilfe eines Markers zwischen benignen, malignen und semimalignen Ovarialtumoren zu unterscheiden.
Diese Aufgabe wird nun erfindungsgemäß durch das eingangs angeführte Verfahren gelöst, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es die Schritte umfasst:
- Bestimmen der Konzentration von Calgranulin A und/oder Calgranulin B in einer dem Individuum entnommenen Probe oder der Zellkultur,
- Vergleichen der ermittelten Konzentration (en) mit zumindest einem Referenzwert, wobei ein zystisches Ovarialkarzinom diagnostiziert wird, wenn die ermittelte (n) Konzentration(en) über dem Referenzwert liegt (liegen) .
Es wurde nun zum ersten Mal gefunden, dass ein Zusammenhang zwischen der Konzentration von Calgranulin A bzw. Calgranulin B in einem Individuum und der Diagnose eines zystischen Ovarialkarzinoms besteht: Wird ein zystisches Ovarialkarzinom diagnostiziert, so wurde in diesem Individuum ebenfalls eine Überexpression von Calgranulin A und/oder Calgranulin B gefunden im Vergleich zu gesunden Individuen bzw. Individuen mit benignen Ovarialtumoren. Damit wird nun erstmals ein Marker für ein zystisches Ovarialkarzinom zur Verfügung gestellt, der spezifisch und reproduzierbar nicht nur zwischen gesunden Personen und Personen, die an zystischen Ovarialkarzinomen erkrankt sind, unterscheiden kann, sondern auch zwischen malignen und benignen Ovarialtumoren.
Im Rahmen der vorliegenden Anmeldung wird unter "diagnostizieren" auch die Unterscheidung zwischen semimalignen und benignen bzw. semimalignen und malignen Ovarialtumoren verstanden: Patienten mit semimalignen Ovarialtumoren zeigen eine höhere Konzentration von Calgranulin A und/oder Calgranulin B als Patienten mit benignen Ovarialtumoren oder gesunden Patienten. Desgleichen zeigen Patienten mit malignen Ovarialkarzinomen eine höhere Konzentration an Calgranulin A und/oder Calgranulin B als Patienten mit semimalignen Ovarialkarzinomen. Obwohl semimaligne Ovarialkarzinome sehr selten vorkommen, ist die Diagnose eines solchen Grenzfalles wichtig. Mit Hilfe der Feststellung der Calgranulin A/B Konzentration wird die Diagnose wesentlich erleichtert und eine hochspezifische und rasche Diagnose wird nun mit Hilfe dieses neuen Verfahrens ermöglicht.
Calgranulin A, auch MRP8 genannt, und Calgranulin B, auch MRP14 genannt, sind Myeloid-verwandte Proteine (myeloid-related proteins) und gehören zu der SlOO-Familie der Calcium-Bindungs- proteine. Calgranulin A und Calgranulin B werden coexprimiert und bilden ein Zellenoberflächen- und Cytoskelett-assoziiertes Heterodimer nach Calciummobilisierung. Dieses Heterodimer wird im Cytoplasma von Granulozyten und einer Subpopulation von Blut- monozyten exprimiert .
Diese Proteine werden bereits in verschiedenen Analyseverfahren verwendet :
So beschreibt Hellmann et al. (Toxicol-Sci, 2001 Mai; 61 (1): 154-63), dass MRP8 und MRP14 in Lungenkarzinomen unterexpri- miert werden, verglichen mit normalen gesunden Lungenzellen.
In Fung et al . (Life-Sci. 2000 Juli 14; 67 (8) : 923-36) wird beschrieben, dass in malignen NPE-Zellen (nasopharyngealen Epithelzellen) die Expression von neuen Genen, u.a. von Calgranulin A und Calgranulin B, supprimiert war, wobei diese differenzierte Expression von Calgranulin A und Calgranulin B in nicht-malignen und malignen NPE-Zellen durch RT-PCR-Analysen bestätigt wurde.
In der Veröffentlichung von Jungblut et al. (Electrophoresis 1999 Juli; 20 (10) : 2100-10) wird offenbart, dass Calgranulin B in colorektalen Krebszellen überexprimiert wird.
In Stulik et al . (Clin-Chim-Acta. 1997 Sept. 8; 265(1) :41- 55) wird eine Studie beschrieben, in der gefunden wurde, dass Calgranulin B in entzündeten preneoplastischen und neoplasti- sehen Läsionen der Colonmucosa überexprimiert wird.
Endress et al. (Lung-Cancer 1997 Aug.; 18(l):35-46) berichten über die Rolle von Makrophagen im menschlichen Lungenkarzinom, wobei gezeigt wurde, dass MRP8 und MRP14 positive Makrophagen in Lungenkarzinom in geringerer Anzahl vorhanden waren, während diese in 2710 positiven Zellen vermehrt vorhanden waren.
In Schluesener et al . (Acta-Neuropathol- (Berl) . 1998 Dez.; 96 (6) :575-80) wird beschrieben, dass MRP8 und MRP14 in mikro- glialen Zellen in Patienten mit humaner zerebraler Malaria (CM) exprimiert werden.
Im Artikel von Schmid et al. (Hum-Pathol. 1995 März; 26(3) :334-7) wird eine Untersuchung beschrieben, in der festgestellt wurde, dass die Konzentrationen von MRP8 und MRP14 im Serum von Patienten mit aktiver Crohn-Krankheit erhöht sind, wobei angenommen wird, dass diese erhöhten Konzentrationen durch eine aktive Sekretion durch Granulozyten, Monozyten und Epithelzellen hervorgerufen werden.
In Koike et al. (J-Biochem- (Tokio) 1998 Juni; 123(6) :1079- 87) wird eine Studie beschrieben, in der die Proteine MRP8 und MRP14 (migration inhibitory factor-related proteins) in Zusammenhang mit 2 menschlichen Leukämie-Zellkulturen gebracht werden.
Die WO 00/26668 A2 offenbart ein Verfahren zur Diagnose von Krebs, wobei Werte von S 100-AG, S 100-A7, S 100-A8 bzw. S 100- A9 in einer Probe einer biologischen Flüssigkeit einer Person gemessen werden und mit einem Kontrollwert verglichen werden. Eine erhöhte Konzentration, zumindest eines dieser Proteine, lässt auf eine Krebserkrankung, insbesondere Brust-, Dickdarmbzw. Lungenkrebs, schließen.
In Y. LI et al . , "Study on dendritic cell phenotypic anti- gens in human ovarien ephital carcinoma", Zhongguo Mianyxue Zaz- hi, 17 (10), 2001, -seuteb 567-568, CAPLUS Zusammenfassung, AN 2001:859303, erhalten über die CAPLUS Datenbank, STN-International, Karlsruhe (DE) ; wird beschrieben, dass die Anzahl von positiven dendritischen Zellen in Ovarialkarzinomen signifikant erhöht ist und die Expressionsstärke von CDlc und S 100 geringer in Ovarialkarzinomen als in normalen Ovarialgeweben ist.
E.C. ILG et al., "Expression Pattern of S 100 Calcium-Bin- ding Proteins in Human Tumors", Int. J. Cancer, 68, 1996, Seiten 325-332; betrifft die Expression von S 100 Proteinen in Tumoren, wobei jedoch lediglich S 100-Al, S 100-A2, S 100-A4, S 100-A6 und S 100-B getestet wurden, nicht jedoch S 100-A8 und S100-A9. Auch in A. Mueller et al., "Subcellular distribution of S 100 proteins in tumor cells and their relocation in response to calcium activation; Histochem. Cell. Biol., 111, 1999, Seiten 453-459; werden zwar S 100 Proteine im Zusammenhang mit Tumorzellen gebracht, jedoch werden hier lediglich S 100-A6, S 100-A4 und S100-A2 getestet, nicht jedoch S 100-A8 und S 100-A9.
Es sind demnach verschiedene Erkrankungen bekannt, die in einem Zusammenhang mit einer Über- oder Unterexpression von Calgranulin A bzw. Calgranulin B stehen. Es wurde jedoch ein Zusammenhang zwischen zystischen Ovarialkarzinomen und der Konzentration von Calgranulin A bzw. Calgranulin B bislang nicht erwähnt oder nahegelegt. Die nun neu entdeckte und überraschende Tatsache, dass in Patienten mit zystischem Ovarialkarzinom Calgranulin A bzw. Calgranulin B überexprimiert wird bzw. werden, kann nun als Basis für neue, effiziente und stabile Marker für zystische Ovarialkarzinome verwendet werden.
Im Rahmen der vorliegenden Anmeldung betreffen Calgranulin A- und Calgranulin B-Proteine der SlOO-Familie der Calciurnbin- dungsproteine, nämlich die Proteine MRP8 (S100-A8) und MRP14 (S100-A9) wie sie beispielsweise in Eue et al . (Int-Immunol . 2000 Nov; 12 (11) :1593-604) beschrieben sind, deren Inhalt durch Bezugnahme von der vorliegenden Anmeldung umfasst ist.
Unter "Individuum" wird im Rahmen der vorliegenden Anmeldung insbesondere ein Mensch aber auch ein Säugetier verstanden, das an zystischem Ovarialkarzinom erkranken kann.
Die "Zellkultur" betrifft jegliche in vifcrσ-Züchtung von Zellen, insbesondere Ovarialzellen, wobei diese beispielsweise aus einem gesunden Individuum entnommen worden sein können und die Entstehung bzw. Entwicklung eines zystischen Ovarialkarzinoms anhand dieser Zellkultur untersucht werden kann. Selbstverständlich kann die Zellkultur aber auch eine Kultur von Zellen sein, die aus einem Patienten mit einer positiven Diagnose für zystisches Ovarialkarzinom entnommen worden sind.
Die Konzentration von Calgranulin A/B wird in einer dem Individuum entnommenen Probe bestimmt, wobei die Probe vorzugsweise eine Körper- oder Organflüssigkeit bzw. eine Organ- oder Gewebeprobe ist, etwa Serum, Zystenflüssigkeit, Eierstockgewebe aber auch Urin, usw.. Im Falle der Zellkultur wird die Konzen- tration entweder in der Zellkultur direkt oder in einer der Zellkultur entnommenen Probe, z.B. Überstand oder die Zellen selbst, bestimmt.
Die Konzentration wird gemäß einem geeigneten Verfahren bestimmt, wobei das Verfahren je nach der Art der Probe, den labortechnischen Möglichkeiten, der Anzahl der zu bestimmenden Proben, aber auch nach der gewünschten Genauigkeit ausgewählt wird. Die Calgranulin A/B-Konzentration kann beispielsweise elektrophoretisch, chromatographisch, immunologisch, colorime- trisch bzw. durch eine Kombination dieser Verfahren durchgeführt werden. Da bereits eine Reihe von anti-Calgranulin A/B-Antikör- per zur Verfügung stehen, eignen sich immunologische Tests ausgesprochen gut, wobei diese entweder direkt an der Gewebsprobe durchgeführt werden können, oder aber auch in der Flüssigkeit, beispielsweise mit Hilfe von ELISA-Tests.
Zur Unterscheidung zwischen malignen bzw. semimalignen und benignen Ovarialtumoren bzw. gesunden Patienten ist der Referenzwert der Calgranulin A/B-Gehalt in einer entsprechenden "gesunden" oder "benignen" Probe oder Zellkultur, d.h. einer einem Individuum, das nicht an zystischem Ovarialkarzinom erkrankt ist, entnommenen Probe bzw. einer Zellkultur, die kein zystisches Ovarialkarzinom aufweist. Zur Unterscheidung zwischen malignen und semimalignen Ovarialkarzinomen ist der Referenzwert der Calgranulin A/B-Gehalt z.B. in einer entsprechenden "semimalignen" Probe oder Zellkultur bzw. der Grenz-Calgranulin A/B-Gehalt, d.h. der maximale semimaligne bzw. minimale maligne Calgranulin A/B-Gehalt in einer entsprechenden Probe bzw. Zellkultur. Solche Werte können beispielsweise aus Vergleichskurven oder -tabellen herausgelesen werden bzw. können auch durch eine früher oder parallel durchgeführte Bestimmung ermittelt werden. Dabei soll der Referenzwert vorzugsweise aus einer entsprechenden Probe stammen, d.h., wird die Konzentration in Zystenflüssigkeit bestimmt, so sollte der Referenzwert ebenfalls von Zystenflüssigkeit sein.
Liegt nun die ermittelte Konzentration über dem Referenzwert, so bedeutet dies eine Überexpression von Calgranulin A/B im Vergleich zum Referenz- bzw. Normalwert, wobei dies eine Erkrankung (malign oder semimalign) an zystischem Ovarialkarzinom bedeutet. Dabei kann entweder die Konzentration von Calgranulin A oder die von Calgranulin B oder auch die Konzentrationen bei- der Proteine bestimmt werden, wobei selbstverständlich der Referenzwert die entsprechende Konzentration sein soll, d.h. ebenfalls entweder Calgranulin A oder Calgranulin B oder beide zusammen. Es hat sich jedoch gezeigt, dass sich insbesondere die Calgranulin A-Konzentration für eine Diagnose eignet.
Insbesondere im Hinblick auf die WO 00/26668 A2 ist festzustellen, dass ein Patient nicht untersucht wird, ob dieser generell an Krebs erkrankt ist, sondern der Patient lässt sich in aller Regel untersuchen, sobald dieser Schmerzen oder sonstige Anormalitäten in einem bestimmten Organ oder Körperbereich fühlt. Im Fall eines Knotens oder von Schmerzen in der Brust wird die Brust untersucht, bei Atembeschwerden würde der Arzt in einem ersten Schritt die Lunge untersuchen und im vorliegenden Fall würde die Patientin beispielsweise Schmerzen im Unterleibsbereich fühlen, so dass der Arzt vermutlich in einem ersten Schritt über Ultraschall-Untersuchungen feststellen würde, ob im Bereich der Eierstöcke, Eileiter oder Gebärmutter zystenartige Wucherungen zu sehen sind. Keinesfalls wird ein Patient mit Schmerzen oder sonstigen Beschwerden gleich in einem Schritt dem erfindungsgemäßen in vitro Diagnoseverfahren unterzogen. Erst wenn der Arzt über Voruntersuchungen feststellt, dass die Patientin ein Risiko aufweist, an einem Ovarialkarzinom erkrankt zu sein, wird der Arzt das erfindungsgemäße in vitro Diagnoseverfahren durchführen, um festzustellen, ob die Patientin an einem zystischen Ovarialkarzinom leidet. Aus diesem Grund ist es völlig unrealistisch, nach einem positiven Ergebnis des erfindungsgemäßen in vitro Diagnoseverfahrens festzustellen, dass die Patientin möglicherweise auch an Lungenkrebs erkrankt ist. Da das vorliegende in vitro Diagnoseverfahren somit nur an ausgewählten Patientinnen und in spezifischen Fällen durchgeführt wird, wird notwendigerweise bei einem erhöhten Bestimmungswert von Calgranulin A/B ein zystisches Ovarialkarzinom prognostiziert.
Selbstverständlich ist es möglich, zusätzlich eine weitere Diagnose, etwa ein immunologisches Verfahren, Ultraschall oder Röntgenbilder oder die Herausnahme von Gewebsproben vorzunehmen, um das Ergebnis zu bestätigen. Hierbei kommen die verschiedenen herkömmlichen Verfahren in Frage.
Vorzugsweise ist der Referenzwert die Konzentration von Calgranulin A und/oder Calgranulin B in einer einem gesunden Individuum entnommenen Probe oder in einer Karzinom-freien Zellkul- tur. Dieser Referenzwert ist insbesondere günstig zur Unterscheidung von (semi)malignen und benignen Tumoren bzw. gesunden Personen. Dabei wird unter "einem gesunden Individuum" wie oben bereits festgestellt ein entsprechendes Individuum verstanden, das frei von zystischem Ovarialkarzinom ist. Selbstverständlich soll das Individuum, aus dem der Referenzwert bestimmt wird, dasselbe sein, wie das, in dem die Calgranulin A/B-Konzentration ermittelt wird. Das heißt, wird in einem Menschen die Konzentration bestimmt, so soll der Referenzwert ebenfalls in einem (anderen) Menschen in einer entsprechenden Probe bestimmt werden. Dasselbe gilt für die Zellkultur, wobei hier auf die Art des Gewebes bzw. das WachstumsStadium der Zellen geachtet werden soll, um eine möglichst aussagekräftige und reproduzierbare Feststellung hinsichtlich des Krankheitsgrades durchführen zu können. Um Untersuchungsfehler auszuschalten, ist es dabei günstig, beide Bestimmungen gleichzeitig in Parallelversuchen durchzuführen. Dabei können auch mehrere Proben zur Bestimmung des Referenzwertes herangezogen werden, um einen Referenz-Mittelwert zu bilden. Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Anmeldung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der positiven oder negativen Entwicklung eines zystischen Ovarialkarzinoms in einem Individuum oder einer Zellkultur, das die Schritte umfasst:
- Bestimmen der Konzentration von Calgranulin A und/oder Calgranulin B in einer dem Individuum oder der Zellkultur entnommenen Probe,
- Vergleichen der ermittelten Konzentration (en) mit dem entsprechenden Konzentrationswert einer zu einem früheren Zeitpunkt demselben Individuum oder derselben Zellkultur entnommenen Probe, wobei eine positive Entwicklung des zystischen Ovarialkarzinoms bestimmt wird, wenn die ermittelte (n) Konzentration(en) über dem Konzentrationswert der früher entnommenen Probe liegt (liegen) . Hier gelten dieselben Definitionen und bevorzugten Ausführungsformen wie oben bereits beschrieben. Dieses Verfahren erlaubt die Feststellung der Entwicklung der Erkrankung, wobei eine positive Entwicklung ein Ausbreiten bzw. Wachstum des zystischen Ovarialkarzinoms bedeutet, d.h. eine Verschlechterung des Krank- heitszustandes, und eine negative Entwicklung eine Verkleinerung bzw. gar Verschwinden des zystischen Ovarialkarzinoms, d.h. eine Verbesserung des Krankheitszustandes bedeutet. Der frühere Zeitpunkt kann etwa der Konzentrationswert vor ein paar Tagen, einer Woche, Monaten oder gar Jahren sein. Dabei kann der Konzentrationswert jener sein, der zu dem früheren Zeitpunkt ermittelt wurde. Um mögliche Bestimmungsungenauigkeit zu verhindern, ist es jedoch auch möglich, den Konzentrationswert gleichzeitig an beiden Proben durchzuführen, wobei die zu dem früheren Zeitpunkt entnommene Probe in einer geeigneten Form, etwa in gefrorenem Zustand, konserviert wurde.
Mit diesem Verfahren ist es möglich, nicht nur die Entwicklung des zystischen Ovarialkarzinoms an sich zu bestimmen, sondern auch den Einfluss von verschiedenen Substanzen, etwa Medikamenten, auf das zystische Ovarialkarzinom. Auf diese Weise können Therapien überwacht werden. Im Fall von Zellkulturen ist es weiters auch möglich, krebserregende Substanzen zu detektie- ren bzw. zu untersuchen.
Vorzugsweise ist die dem Individuum entnommene Probe ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Zystenflüssigkeit, Zystengewebe, Serum und Harn. Insbesondere Zystenflüssigkeit und Serum haben sich als geeignet für das erfindungsgemäße Verfahren herausgestellt, wobei diese Proben auf einfache Weise im Laufe von Routineuntersuchungen entnommen werden können, was eine sehr unkomplizierte und nicht aufwendige Art der Detektion bzw. Untersuchung von zystischen Ovarialkarzinomen darstellt.
Ein besonders vorteilhaftes Verfahren besteht darin, dass die Konzentration von Calgranulin A und/oder Calgranulin B immunologisch bestimmt wird. Diese immunologischen Bestimmungen sind besonders günstig, da eine Reihe von polyklonalen als auch monoklonalen Antikörpern, die spezifisch für Calgranulin A und Calgranulin B sind, existieren. Immunologische Verfahren können sowohl in Flüssigkeit als auch auf Geweben durchgeführt werden. Beispiele solcher Verfahren sind Standard-ELISA, Sandwich-ELISA, immunohistochemische Verfahren, etc., wobei diese Verfahren nicht nur ein Detektieren von Calgranulin A/B ermöglichen, sondern auch ein genaues Quantifizieren.
Vorzugsweise wird die Konzentration von Calgranulin A und/ oder Calgranulin B unter Verwendung von monoklonalen Antikörpern bestimmt. Monoklonale Antikörper sind hochspezifisch und können gemäß gängigen Methoden auf sehr einfache und kostengünstige Weise hergestellt werden. Andererseits existieren monoklonale Antikörper, die spezifisch für Calgranulin A/B sind, bereits und sind leicht erhältlich.
Ein weiteres bevorzugtes Verfahren besteht darin, dass die Konzentration von Calgranulin A und/oder Calgranulin B durch Messen der entsprechenden mRNA oder Fragmenten davon bestimmt wird. Das Messen von mRNA-Molekülen kann nach jedem gängigen Verfahren durchgeführt werden, insbesondere durch Hybridisie- rungsreaktionen oder PCR, wobei es genügt, eine spezifische Region im mRNA-Molekül nachzuweisen. Auch dieses Verfahren kann direkt in der Probe durchgeführt werden.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Kit zur Detektion eines zystischen Ovarialkarzinoms in einem Individuum oder einer Zellkultur, das
- ein Reagens zum Bestimmen der Konzentration von Calgranulin A und/oder Calgranulin B und
- ein Calgranulin A und/oder Calgranulin B Referenzmittel um- fasst .
Das Reagens zur Bestimmung der Konzentration von Calgranulin A/B hängt dabei natürlich von dem jeweiligen Detektionsverfahren ab, wobei der Kit selbstverständlich auch zwei oder mehr Reagenzien umfassen kann, wenn diese für das Detektionsverfahren notwendig sind. Das Reagens kann z.B. Antikörper, Puffer mit NachweisSubstanzen und Ähnliches, umfassen. Zusätzlich können weitere Detektionsmittel, etwa fluoreszierende, radioaktive oder chromogene Substanzen bzw. auch sekundäre Antikörper vorgesehen sein.
Das Referenzmittel ist beispielsweise eine Probe umfassend eine standardisierte Konzentration von Calgranulin A/B, beispielsweise in einem Puffer oder auch in einer der jeweiligen Körperflüssigkeits- oder Zellkultur-Probe entsprechenden Lösung. Das Referenzmittel kann aber auch aus einem einfachen Vergleichswert, einer Vergleichstabelle oder einer Vergleichskurve bestehen.
Vorzugsweise umfasst das Reagens zur Bestimmung der Konzentration von Calgranulin A- und/oder Calgranulin B-Antikörper, insbesondere monoklonale Antikörper. Dabei ist es von Vorteil, wenn die Antikörper in einer bestimmten Konzentration im Reagens vorliegen, wobei die anti-Calgranulin A- und anti-Calgranulin B- Antikörper getrennt voneinander aber auch zusammen im Reagens vorgesehen werden können. Die Antikörper können dabei an Marker gebunden sein, etwa an fluoreszierende, radioaktive oder chromo- gene Gruppen bzw. können im Kit weiter Sekundärantikörper, die spezifisch für die Primärantikörper sind, vorgesehen sein.
Vorzugsweise sind die Antikörper an einem festen Träger immobilisiert. Dadurch wird ermöglicht, dass die Proben lediglich auf den festen Träger aufgetragen bzw. über diesen darüber fließen können, wobei Calgranulin A/B über die Antikörper an dem festen Träger immobilisiert werden. Anschließend können Waschschritte durchgeführt werden und die Detektion entweder direkt am festen Träger oder nach einem Eluieren im Eluat. Der Träger kann beispielsweise eine Chromatographiesäule, ein Filter, eine Mikrotiterplatte, Well, etc. sein.
Weiters ist es günstig, wenn der Kit einen festen Träger zur Immobilisierung von Calgranulin A und/oder Calgranulin B um- fasst. Dieser feste Träger kann beispielsweise mit den natürlichen Bindungspartnern von Calgranulin A/B, deren Analogen, Teilen von Antikörpern und Ähnlichem vorgesehen werden. Nach Immobilisierung von Calgranulin A/B kann die Detektion wiederum entweder direkt auf dem festen Träger, etwa mit Hilfe von markierten oder unmarkierten Antikörpern, oder nach einem Elutions- schritt im Eluat durchgeführt werden. Auch hier kann als Träger einer der oben definierten Träger vorgesehen sein.
Besonders bevorzugt umfasst das Referenzmittel eine standardisierte Menge an Calgranulin A und/oder Calgranulin B. Dadurch wird ein Kit zur Verfügung gestellt, der eine Parallelbestimmung des Referenzwertes gewährleistet, wodurch mögliche Un- genauigkeiten beim Bestimmungsverfahren ausgeschaltet werden.
Eine weitere vorteilhafte Ausführungsform besteht darin, dass das Referenzmittel eine Reihe von standardisierten Calgranulin A- und/oder Calgranulin B-Proben umfasst. Diese Proben können z.B. bestimmte Krankheitsgrade darstellen, so dass mit Hilfe lediglich eines BestimmungsVerfahrens das Ausmaß bzw. Stadium der Erkrankung festgestellt werden kann.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Anmeldung betrifft die Verwendung von Calgranulin A- und/oder Calgranulin B-Inhibitoren zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von zystischen Ovarialkarzinomen. Da die Konzentration von Calgranulin A und/ oder Calgranulin B im direkten Zusammenhang mit einer Erkrankung an zystischen Ovarialkarzinomen steht, kann eine Verminderung der Konzentration von Calgranulin A/B bzw. ein völliges Ausschalten von Calgranulin A/B eine Erkrankung verhindern bzw. als Therapie für einen bereits an zystischen Ovarialkarzinomen erkrankten Patienten herangezogen werden. Im Rahmen der vorliegenden Anmeldung werden unter Calgranulin A- und/oder Calgranulin B-Inhibitoren Substanzen, Moleküle oder Proteine verstanden, die beispielsweise die Expression von Calgranulin A/B auf Transkriptionsebene bzw. Translationsebene verhindert oder vermindert, bereits exprimierte Proteine spezifisch angreifen und gegebenenfalls zerstören, die Aktivität von exprimierten Calgranulin A/B- Proteinen blockiert etc.. Insbesondere werden unter Calgranulin A/B-Inhibitoren Calgranulin A/B-Antikörper verstanden, insbesondere monoklonale Antikörper sowie auch Antikörper-Fragmente. Weiters könnten auch nicht-aktive Calgranulin A/B-Analoga eingesetzt werden, die kompetitiv mit dem natürlichen Calgranulin A/B wirken. Weiters könnten als Calgranulin A/B-Inhibitoren solche eingesetzt werden, die in Gene-silencing, Knockout bzw. Anti- sense-Verfahren eingesetzt werden. Selbstverständlich können hier wiederum entweder Calgranulin A- oder Calgranulin B-Inhibitoren verwendet werden. Es ist aber auch möglich, beide in einem abgestimmten Verhältnis zueinander in einem Medikament zu verwenden.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Anmeldung betrifft ein Verfahren zur Behandlung eines Patienten mit zystischem Ovarialkarzinom, das dadurch gekennzeichnet ist, dass dem Patienten eine ausreichende Menge an Calgranulin A- und/oder Calgranulin B- Inhibitoren verabreicht wird. Hier gelten wiederum die oben genannten Definitionen und bevorzugten Ausführungsformen, wobei die Verabreichung insbesondere oral oder intravenös geschieht. Unter "Behandlung" wird im Rahmen der vorliegenden Anmeldung sowohl die Behandlung von malignen oder semimalignen Karzinomen verstanden als auch die Verhinderung einer Verschlechterung der Erkrankung im Falle eines benignen Karzinoms. Weiters wird auch die Verhinderung einer Erkrankung an einem gesunden Patienten verstanden.
Die vorliegende Erfindung wird nun anhand der nachfolgenden Figuren und Beispiele, auf die sie jedoch nicht beschränkt sein soll, noch näher erläutert, wobei die Figuren 1 bis 3 die Ergebnisse von 2D-Gel-Elektrophorese-Untersuchungen verschiedener Proben und die Fig. 4 und 5 die Aminosäureseguenzen von MRP8 und MRP14 zeigen. Beispiel 1
Flüssigkeiten von malignen, benignen und grenzwertigen Ovarialtumoren wurden während der Operation bzw. im Laufe einer Routineuntersuchung gesammelt. Nach dem Zentrifugieren wurden diese Proben in Aliquote eingeteilt und wie die Pellets eingefroren. Am selben Tag wurden weiters Blutproben derselben Patienten gesammelt, wobei die Überstände nach Zentrifugation ebenfalls in Pellets geteilt und eingefroren wurden.
Es wurde eine quantitative Analyse der Aliquoten der Flüssigkeitsproben durchgeführt, um die Gesamtmenge an Protein gemäß dem Lowry-Verfahren zu bestimmen. Für die analytischen Untersuchungen der Flüssigkeiten und der Seren mittels 2D-Gel-Elektro- phorese wurden denaturierende Agenzien zu den Aliquoten zugesetzt, um die Proteine zu dissoziieren und die Disulfidbrücken- Bindungen zu reduzieren.
In einem ersten Schritt wurde die Trennung der Proteine mittels IEF (isoelektrischer Fokussierung) in einem elektrischen Feld (pH 3-10) durchgeführt. Anschließend wurde eine zweite Trennung der Proteine in einem Acrylamidgradientengel (9-16%) durchgeführt. Die Proteinspots, die in der zweiten Dimension positionieren, sind somit durch zwei unabhängige Parameter charakterisiert, einerseits durch die isoelektrische Fokussierung und andererseits durch das Molekulargewicht. Die Proteinspots auf dem 2D-Gel werden mit Hilfe einer modifizierten Silberfärbungs- methode gemäß Blum sichtbar gemacht. Dieses Verfahren erlaubt die Identifizierung von mehr als 100 Proteinen in der Flüssigkeit verschiedener Ovarialtumore und in dem Serum der Patienten, so dass die unterschiedlichen Proteinmuster miteinander verglichen werden können.
Beispiel 2
Es wurden 13 maligne und 13 benigne Ovarialtumore untersucht, wobei einerseits die zystische Flüssigkeit und andererseits das Serum dieser 26 Patienten durch 2D-Gel-Elektrophorese analysiert wurden. Um reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten, wurden die Proben mehrmals unter einzelnen Bedingungen durch 2D- Gel-Elektrophorese untersucht, insgesamt wurden 235 Gele durchgeführt (s. Tabellen 1 und 2) . Tabelle 1: Maligne zystische Ovarialtumore
Nr. Diagnose Malignitäts-Grad 2D-Gele Gesamtprotein:mg/ml (FIGO) Zysten Serum Zysten Serum
Figure imgf000017_0001
1 16191229 Seröses Zystadenokarzinom II Ilb 1 1 55 61
Muzinöses Zystadenokarzinom II Ilb 23 2 65 61
2 40020252 Endometriotisches ZystadenokarII Ia 1 1 45 50 zinom
3 36130461 Seröses Zystadenokarzinom I Ib 2 2 19 49
4 04010221 Undifferenziertes ZystadenokarII Ib 1 2 19 38 zinom
5 77270223 Seröses Zystadenokarzinom III Ia 2 3 43 47
6 94240661 Muzinöses Zystadenokarzinom I Ia 1 2 36 55
7 95080861 Muzinöses Zystadenokarzinom I Ia 2 3 50 60
8 63211146 Undifferenziertes ZystadenokarII Ilb 27 2 63 42 zinom
9 67230452 Muzinöses Zystadenokarzinom II Ha 8 5 79 80
10 45291053 Seröses Zystadenokarzinom I Illb 9 3 62 53
11 97280346 Seröses Zystadenokarzinom II ia 19 5 69 70
12 62070158 Seröses Zystadenokarzinom II nie 10 2 75 76
13 77030522 Seröses Zystadenokarzinom III nie 9 5 75 70
Total 2D-Gele 115 38
Tabelle 2 : Nicht-maligne zystische Ovarialtumore
Nr. Diagnose histologische 2D-Gele Gesamtproteine:mg/ml Untersuchung Zysten Serum Zysten Serum
1 87150523 Seröses Zystadenokarzinom keine Malignität 3 2 60 65
2 24291249 Seröses Zystadenokarzinom keine Malignität 5 78 63
3 7310362 Seröses Zystadenokarzinom keine Malignität 2 2 70 60
4 40270616 Seröses Zystadenokarzinom keine Malignität 4 1 60 76
5 55170949 Seröses Zystadenokarzinom keine Malignität 5 1 47 60
6 58060165 Seröses Zystadenokarzinom keine Malignität 10 1 79 71
7 72110223 Seröses Zystadenokarzinom keine Malignität 6 2 74 67
8 65201072 Seröses Zystadenokarzinom keine Malignität 3 1 70 65
I
9 26060978 Seröses Zystadenokarzinom keine Malignität 4 4 47 44
10 77270135 Seröses Zystadenokarzinom keine Malignität 2 4 106 81
11 29191274 Sactosalpinx keine Malignität 7 3 47 60
12 69130175 Seröses Zystadenokarzinom keine Malignität 1 1 90 65
13 56030868 Dermoide Zysten keine Malignität 6 2 41 63
Total 2D-Gele 38 24
In Fig.l bis 3 sind die Ergebnisse gezeigt, wobei Fig.la und 3a Proben aus einem Patienten mit muzinösem Zystenkarzinom Grad II/FIGO Ilb, Fig.2a eine Probe aus einem Patienten mit serösem Zystenkarzinom zeigen. "C" bedeutet Zystenflüssigkeit und "S" Serum. Die Ergebnisse zeigen, dass die Proteinmuster der Ovari- alkrebs-Flüssigkeiten signifikant verschieden sind im Vergleich zu den Ovarialzysten-Flüssigkeiten. Insbesondere im unteren Molekularbereich zwischen 10 und 25 kD (s. breiter Pfeil in Figuren 1 bis 3) sind zahlreiche zusätzliche Proteinspots sowohl in der Zystenflüssigkeit als auch im Serum der Patienten mit Ovarialkrebs zu sehen (s. Figuren la bis 3a) verglichen mit Patienten mit benignen Ovarialzysten (s. Figuren lb bis 3b). Mittels partieller Aminosäure-Sequenzanalyse wurden die Proteinspots 1 als Calgranulin A (Fig.4) und 2 als Calgranulin B (Fig.5) identifiziert, wobei die jeweilige Sequenz mit ihren Aminosäuren als auch als schematische Darstellung gezeigt ist, "M" die mittlere Masse, "S" Sequenz und "P" Position bedeuten. Die mit 100-300 ng Protein pro Spot vorliegende Proteinmenge bezogen auf die im 2D- Gel untersuchte Gesamt-Proteinmenge von 100 μg ist auch für immunologische Tests ausreichend. Die Lokalisierung dieser beiden Proteine im 2D-Gel wurde erstmalig durchgeführt.
Die Untersuchungen an Proben von Patienten zeigen zusätzliche Proteinspots, die nur bei Patienten mit malignen Tumoren vorkommen. In einem der Patienten haben sich Abdomenasziten zusätzlich zum serösen Zystadenokarzinom im Laufe der Erkrankung entwickelt. In dieser Untersuchung der Proteine mittels 2D-Gel- Elektrophorese sind die Zystenflüssigkeit und die Aszitenflüs- sigkeit einander sehr ähnlich.
Weiters wurden zusätzliche Proteine im unteren Molekularbereich zwischen 10 und 20 kD in den Serumproben der 13 Patienten mit Ovarialkrebs gefunden. Diese zusätzlichen Proteine im Serum zeigen starke Ähnlichkeiten in ihrer elektrophoretischen Positionierung mit denen, die in den Zystenflüssigkeiten der entsprechenden Ovarialkrebs-Patienten gefunden wurden. Im Serum von Patienten mit gutartigen Ovarialzysten sind diese zusätzlichen Proteine nicht nachweisbar vorhanden.

Claims

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Diagnose eines zystischen Ovarialkarzinoms in einem Individuum oder einer Zellkultur, dadurch gekennzeichnet, dass es die Schritte umfasst:
- Bestimmen der Konzentration von Calgranulin A und/oder Calgranulin B in einer dem Individuum entnommenen Probe oder der Zellkultur,
- Vergleichen der ermittelten Konzentration (en) mit zumindest einem Referenzwert, wobei ein zystisches Ovarialkarzinom diagnostiziert wird, wenn die ermittelte (n) Konzentration (en) über dem Referenzwert liegt (liegen) .
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Referenzwert die Konzentration von Calgranulin A und/oder Calgranulin B in einer einem gesunden Individuum entnommenen Probe oder in einer Karzinom-freien Zellkultur ist.
3. Verfahren zur Bestimmung der positiven oder negativen Entwicklung eines zystischen Ovarialkarzinoms in einem Individuum oder einer Zellkultur, dadurch gekennzeichnet, dass es die Schritte umfasst:
- Bestimmen der Konzentration von Calgranulin A und/oder Calgranulin B in einer dem Individuum oder der Zellkultur entnommenen Probe,
- Vergleichen der ermittelten Konzentration (en) mit dem entsprechenden Konzentrationswert einer zu einem früheren Zeitpunkt demselben Individuum oder derselben Zellkultur entnommenen Probe, wobei eine positive Entwicklung des zystischen Ovarialkarzinoms bestimmt wird, wenn die ermittelte (n) Konzentration (en) über dem Konzentrationswert der früher entnommenen Probe liegt (liegen) .
4. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3 , dadurch gekennzeichnet, dass die dem Individuum entnommene Probe ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Zystenflüssigkeit, Zystengewebe, Serum und Harn.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4 , dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration von Calgranulin A und/oder Calgranulin B immunologisch bestimmt wird.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration von Calgranulin A und/oder Calgranulin B unter Verwendung von monoklonalen Antikörpern bestimmt wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration von Calgranulin A und/oder Calgranulin B durch Messen der entsprechenden mRNA oder Fragmenten davon bestimmt wird.
8. Kit zur Detektion eines zystischen Ovarialkarzinoms in einem Individuum oder einer Zellkultur, dadurch gekennzeichnet, dass er
- ein Reagens zum Bestimmen der Konzentration von Calgranulin A und/oder Calgranulin B und
- ein Calgranulin A- und/oder Calgranulin B-Referenzmittel umfasst.
9. Kit nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Reagens zur Bestimmung der Konzentration von Calgranulin A und/oder Calgranulin B Antikörper, insbesondere monoklonale Antikörper, umfasst.
10. Kit nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Antikörper an einem festen Träger immobilisiert sind.
11. Kit nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass er weiters einen festen Träger zur Immobilisierung von Calgranulin A und/oder Calgranulin B umfasst.
12. Kit nach einem der Ansprüche 8 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Referenzmittel eine standardisierte Menge an Calgranulin A und/oder Calgranulin B umfasst.
13. Kit nach einem der Ansprüche 8 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Referenzmittel eine Reihe von standardisierten Calgranulin A- und/oder Calgranulin B-Proben umfasst.
14. Verwendung von Calgranulin A- und/oder Calgranulin B-Inhibitoren zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von zys- tischen 0varialkarzinomen.
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