WO2003066800A2 - Procede pour la fabrication d'amides en presence d'une nitrile hydratase d'origine microbiologique et nouveau microorganisme - Google Patents
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- C12P13/02—Amides, e.g. chloramphenicol or polyamides; Imides or polyimides; Urethanes, i.e. compounds comprising N-C=O structural element or polyurethanes
Definitions
- the invention firstly relates to a process for the production of amides obtained by hydration of a nitrile in the presence of a nitrile hydratase of microbiological origin. More specifically, the invention relates to a process for the manufacture of amides in the presence of a nitrile hydratase produced by a bacterium belonging to the species Rhodococcus pyridinovorans. It then relates to a method of cultivating bacteria belonging to the species Rhodococcus pyridinovorans. The invention finally relates to a specific bacterial strain belonging to the species Rhodococcus pyridinovorans.
- Document FR-A-2 294 999 describes a process for the preparation of an amide by hydrolysis of the corresponding nitrile which consists in subjecting the nitrile in aqueous solution to the action of bacteria having a hydratasic nitrile activity.
- a bacterium with hydratasic nitrile activity the genus Brevibacterium, as defined in the sense of Bergey and more particularly the strain R312, is described in particular.
- Document EP-188 316 describes a process for the manufacture of amides in the presence of a nitrile hydratase of microbiological origin, in particular of acrylamide, from a mononitrile containing from two to six carbon atoms.
- a nitrile hydratase of microbiological origin in particular of acrylamide
- bacteria belonging to the genus Rhodococcus or to the genus Microbacterium are specifically described.
- the process as described in this document remains effective only for the hydration of lower aliphatic nitriles, the activity on aromatic nitriles remaining very low (see example 2).
- document EP-A-307 926 describes a specific strain belonging to the genus Rhodococcus, more precisely the strain
- Rhodococcus rhodochrous Jl (FERM BP-1478) which, in the presence of cobalt ions, hydrates nitriles.
- concentration of CoCl 2 -6H 2 0 in the culture media is 10 mg / 1.
- Patent EP-A-362829 presents a method for producing cells of the bacteria Rhodoccocus rhodochrous which makes it possible to obtain a high hydratasic nitrile activity by adding urea, or a derivative, to the culture medium of the bacteria.
- the culture of bacteria is systematically started in the presence of cobalt ion and urea, or its derivatives.
- Rhodococcus rhodochrous J-1 described in the two aforementioned documents, by virtue of its high activity, has become, for the person skilled in the art, the reference bacterium in terms of hydratasic nitrile activity.
- Document GB-A-2 290 295 also describes the use of a strain of Rhodococcus rhodochrous deposited with the Russian national collection of microorganisms under the number VKM Ac-1515D. This strain is used as a source of nitrile hydratase, for the biological manufacture of amides, in the absence of an inducer, which leads us to believe that the hydratasic nitrile activity of this bacterium is constitutive.
- Rhodococcus tested only 2 presents the nitrile hydratase gene and therefore a hydratasic nitrile activity.
- Rhodococcus pyridinovorans exhibited a high nitrile hydratase activity, by making a microorganism advantageously usable in a process for the biological manufacture of amides.
- the invention relates to a process for the manufacture of amides consisting in hydrating a nitrile into a corresponding amide, in the presence of a nitrile hydratase of microbiological origin characterized in that said nitrile hydratase is produced by a bacterium belonging to the 'Rhodococcus pyridinovorans.
- the Applicant has demonstrated that the hydratase nitrile activity can be improved by applying specific culture conditions, in particular by using concentrations and / or times of addition of a carbon source, of a metal ion. and a selective inductor.
- the bacteria of the invention are cultivated in a medium containing cobalt ions (Co 2+ and / or Co 3+ ).
- Cobalt can be added as cobalt salts or organic compounds. It can be added all at once or continuously, at the start or during cultivation, preferably sequentially.
- the final cobalt concentrations (CoCl 2 -6H 2 O base) are between 10 and 40 mg / L and preferably between 15 and 30 mg / L.
- the bacteria are cultured in the presence also of an inducer chosen from the group of amides or nitriles.
- an inducer chosen from the group of amides or nitriles.
- Most amides can be used as an inducer of nitrile-hydratase activity.
- These inducers can be added alone or as a mixture, in 1 step, sequentially or continuously, at the start or during the culture.
- the inducer is chosen from the group comprising crotonamide, urea, propionamide, acetamide, n-butyramide, isobutyramide, n-valeramide, n-capronamide, methacrylamide and cyclohexanecarboxamide.
- nitrile-type inducers can also be used, such as: acetonitrile, propionitrile, isobutyronitrile.
- the final concentrations of urea or its derivatives are between 5 and 50 g / L, preferably greater than 10 g / L.
- the Applicant has demonstrated that the nitrile hydratase activity of the bacteria of the invention is improved under standard culture conditions (CoCl 2 -6H 2 0> 10 mg / 1; urea preferably> 10 g / 1 ) distinct from those used for Rhodococcus rhodochrous Jl (CoCl 2 -6H 2 O: 10mg / l; urea: 7.5 g / 1) [Optimum culture conditions for the production of cobalt-containing nitrile hydratase by Rhodococcus rhodochrous Jl, Appl. Microbiol. Biotechnol. (1991) 34: 783-788].
- the concentration of carbon source also influences the obtaining of a satisfactory nitrile-hydratasic activity.
- sources of C are used at nominal concentrations varying from 5 to 50 g / L, preferably from 12 to 30 g / L, added alone or as a mixture, in 1 batch, sequentially or continuously, at the start or during cultivation.
- a carbon source mention will be made of D-Glucose, Pyruvate, D-Sorbitol, etc.
- predetermined amounts of urea, cobalt and a carbon source are added to the basal medium.
- the culture is carried out at a temperature between 15 and 50 ° C, preferably around 28 ° C, at a pH between 6 and 9 lasting at least 96 hours (up to 200 hours).
- the bacterium used is the strain MW3 belonging to the species Rhodococcus pyridinovorans and deposited on January 24, 2002 at the CNCM (National Collection of Culture of Microorganisms), Institut Pasteur, 25 rue du Dr. ROUX, PARIS , France, under the number CNCM 1-2772, and the mutants of this strain.
- the mutants of the above strain indeed fall within the scope of the invention when they exhibit nitrile hydratase activity.
- the microorganism can be immobilized using methods and procedures known to those skilled in the art.
- the substrates on which Rhodococcus pyridinovorans act can be aliphatic nitriles as well as aromatic nitriles. Mention will be made, by way of example without limiting the invention, of compounds such as acetonitrile, propionitrile, methacrylonitrile, acrylonitrile, benzonitrile, 3-cyanopyridine, 3-hydroxy isovaleronitrile, 3-hydroxypropionitrile , 2-hydroxy 4- methylthiobutyronitrile ...
- the invention also relates to a method for cultivating bacteria belonging to the species Rhodococcus pyridinovorans.
- the culture medium contains cobalt ions Co2 + and / or Co3 + in concentrations of between 10 and 40 mg / L (base CoCl 2 -6H 2 O), preferably between 15 and 30 mg / L.
- the medium also contains urea or its derivatives in final concentrations of between 5 and 50 g / L, preferably greater than 10 g / L.
- the medium also contains a carbon source whose nominal concentrations vary between 5 and 50 g / L, preferably between 12 and 30 g / L.
- the invention also relates to the strain MW3 belonging to Rhodococcus pyridinovorans deposited on January 24, 2002 at the CNCM under the number CNCM 1-2772 and the mutants of this strain.
- Figure 1 is a liquid chromatography assay of acrylamide formed using M W3 as a nitrile hydratase.
- Figure 2 is a liquid chromatography assay of acrylamide formed using PBD9 as nitrile hydratase.
- Type of colony gram + colonies pigmented in pink Biochemical character oxidase - catalase + nitrate reductase + nitrite reductase -
- the reaction is triggered by adding 1 g of cell suspension (containing a predetermined quantity of cells centrifuged for 10 min at 10,000 g).
- MW3 exhibits a moderate hydratasic nitrile activity.
- D / EXAMPLE 4 Variation of the culture conditions of MW3 as a function of the concentrations and / or the times of addition of the carbon source (glucose).
- MW3 exhibits nitrile hydratase activity on a wide variety of aliphatic, aromatic and unsaturated substrates.
- a MW-3 cell suspension (containing 15% w / w of dry cells in 50 mM phosphate buffer pH 7.0) obtained by fermentation on a nutrient medium as described by Example 6 (test 1) , is immobilized in a polyacrylamide gel according to a process well known to those skilled in the art.
- the gel thus obtained is ground in a mill in order to obtain after sieving particles of homogeneous size between 500 and 1500 ⁇ m. These particles are washed in the pH 7.0 phosphate buffer and then stored in this same buffer.
- Example 7 20 g of MW-3 immobilized and drained as described in Example 7 are added to 811 g of deionized water containing 148 ppm of sodium acrylate, pH 8.0. The temperature of the mixture being maintained at 20 ° C. with stirring of 200 rpm. 189 ml of methacrylonitrile are added at a constant rate for 24 h. After a total duration of 30 h of bioconversion, 19.1% of methacrylamide containing less than 100 ppm of methacrylonitrile are obtained. The product is separated from the catalyst by filtration through 0.2 ⁇ m, then crystallized with a yield of 46%.
- 3 g of a suspension of free cells of MW-3 (310 mg of dry cells in 0.85% NaCl) are added to 687 g of deionized water containing 148 ppm of sodium acrylate, pH 8.0. This mixture being maintained at 20 ° C. with stirring at 200 rpm, 389 ml of acrylonitrile are added at a constant rate during 16 h. After a total duration of 24 h bioconversion, a 42% solution of acrylamide containing less than 50 ppm of residual acrylonitrile is obtained. The cells are separated from the final product by filtration through 0.2 ⁇ m.
- nitrile hydratase activity of the strain PBD9 described by Yoon is compared with MW3, under the following standard conditions at 20 ° C:
- the reaction is started by adding 1 g of cell suspension (containing a predetermined quantity of cells centrifuged for 10 min at 10,000 g) 4 mL sample after 3 min incubation and reaction stopped with 30 ⁇ L of concentrated sulfuric acid.
- the amide formed is assayed by liquid phase chromatography.
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Abstract
Procédé de fabrication d'amides consistant à hydrater un nitrile en une amide correspondante, en présence d'une nitrile-hydratase d'origine microbiologique, caractérisé en ce que ladite nitrile hydratase est produite par une bactérie appartenant à l'espèce Rhodococcus pyridinovorans.
Description
PROCEDE POUR LA FABRICATION D'AMIDES EN PRESENCE D'UNE NITRILE HYDRATASE D'ORIGINE MICROBIOLOGIQUE ET NOUVEAU MICROORGANISME.
L'invention a tout d'abord pour objet un procédé de production d'amides obtenues par hydratation d'un nitrile en présence d'une nitrile hydratase d'origine microbiologique. Plus précisément, l'invention concerne un procédé de fabrication d'amides en présence d'une nitrile hydratase produite par une bactérie appartenant à l'espèce Rhodococcus pyridinovorans. Elle se rapporte ensuite à un procédé de culture de bactéries appartenant à l'espèce Rhodococcus pyridinovorans. L'invention concerne enfin une souche bactérienne spécifique appartenant à l'espèce Rhodococcus pyridinovorans.
Le document FR-A-2 294 999 décrit un procédé de préparation d'un amide par hydrolyse du nitrile correspondant consistant à soumettre le nitrile en solution aqueuse à l'action de bactéries présentant une activité nitrile hydratasique. En tant que bactérie à activité nitrile hydratasique, est notamment décrit le genre Brevibactérium, tel que défini au sens de Bergey et plus particulièrement la souche R312.
Le document EP-188 316 décrit un procédé de fabrication d'amides en présence d'une nitrile hydratase d'origine microbiologique, en particulier d'acrylamide, à partir d'un mononitrile contenant de deux à six atomes de carbone. En tant que microorganismes, sont spécifiquement décrits les bactéries appartenant au genre Rhodococcus ou au genre Microbacterium. Cependant, le procédé tel que décrit dans ce document ne reste efficace que pour l'hydratation de nitriles aliphatiques inférieurs, l'activité sur les nitriles aromatiques restant très faible (voir exemple 2).
Pour résoudre ce problème, le document EP-A-307 926 décrit une souche spécifique appartenant au genre Rhodococcus, plus précisément la souche
Rhodococcus rhodochrous J-l (FERM BP-1478) qui, en présence d'ions cobalt, hydrate les nitriles. La concentration en CoCl2-6H20 des milieux de culture est de 10 mg/1.
Le brevet EP-A-362829 présente une méthode de production de cellules de la bactérie Rhodoccocus rhodochrous permettant d'obtenir une activité nitrile hydratasique élevée en additionnant de l'urée, ou un dérivé, au milieu de culture de la bactérie. La culture des bactéries est de façon systématique commencée en présence d'ion cobalt et d'urée, ou de ses dérivés.
En conséquence, la bactérie Rhodococcus rhodochrous J-l décrite dans les deux documents précités, de par son activité élevée, est devenue, pour l'homme du métier, la bactérie de référence en matière d'activité nitrile hydratasique.
Le document GB-A-2 290 295 décrit également l'utilisation d'une souche de Rhodococcus rhodochrous déposée auprès de la collection nationale russe de microorganismes sous le numéro VKM Ac-1515D. Cette souche est utilisée comme source de nitrile hydratase, pour la fabrication biologique d'amides et ce, en l'absence d'inducteur ce qui amène à penser que l'activité nitrile hydratasique de cette bactérie est constitutive.
YOON & al. décrit dans le document Int J Syst. Evol. Microbiol. 2000 Nov., 50 Pt, 6:2173-80, une nouvelle souche bactérienne désignée "PDB9T" ayant donné lieu à l'identification d'une nouvelle espèce, à savoir l'espèce pyridinovorans appartenant au genre Rhodococcus. La souche PDB9 a été déposée auprès de la collection coréenne des cultures sous le numéro KCTC 0647 BP de même qu'auprès du centre coréen de culture de microorganisme sous le numéro KCCM 80005. La séquence partielle de TARN 16S ribosomal est en outre
disponible dans la banque de gènes GENBANK sous le numéro d'accession AF 173005. Le document YOON indique que Rhodococcus pyridinovorans est apte à dégrader la pyridine. Comme il sera démontré dans les exemples, il s'avère que la souche PDB9 ne présente pas d'activité nitrile hydratase.
Le document Précigou et al « rapid and spécifie identification of nitrile hydratase (NHase)-encoding gènes in soil samples by polymerase chain reaction »
FEMS Microbiology letters 204 (2001) 155-161 indique que sur 13 souches
Rhodococcus, testées seulement 2 présente le gène nitrile hydratase et donc une activité nitrile hydratasique.
Or, le Demandeur a découvert que, de manière tout à fait surprenante, Rhodococcus pyridinovorans présentait une activité nitrile hydratase élevée, en faisant un microorganisme avantageusement utilisable dans un procédé de fabrication biologique d'amides.
En conséquence, l'invention concerne un procédé de fabrication d'amides consistant à hydrater un nitrile en une amide correspondante, en présence d'une nitrile hydratase d'origine microbiologique caractérisé en ce que ladite nitrile hydratase est produite par une bactérie appartenant à l'espèce Rhodococcus pyridinovorans.
Même si les bactéries d'espèce pyridinovorans appartiennent au même genre Rhodococcus que les bactéries d'espèce rhodochrous, lesquelles présentent une activité nitrile hydratase élevée, il n'était pas pour autant évident que pyridinovorans soit également douée d'une activité nitrile hydratase élevée. En effet, à ce jour, seule l'espèce rhodochrous a permis un développement industriel pour la production d'amides tels que l'acrylamide. Les autres espèces majeures du genre Rhodoccocus comme erythropolis ou equi ne présentent que des activités marginales notamment pour la production d' acrylamide.
En outre, le Demandeur a démontré que l'activité nitrile hydratasique pouvait être améliorée en appliquant des conditions de culture spécifiques, en particulier en employant des concentrations et/ou des temps d'ajouts d'une source de carbone, d'un ion métallique et d'un inducteur sélectif.
Ainsi et selon une première caractéristique, les bactéries de l'invention sont cultivées dans un milieu contenant des ions cobalt (Co2+ et/ou Co3+). Le cobalt peut être ajouté sous forme de sels de cobalt ou de composés organiques. Il peut être ajouté en 1 fois ou en continu, en début ou en cours de culture, de préférence séquentiellement. En pratique, les concentrations finales en cobalt (base CoCl2-6H2O) sont comprises entre 10 et 40 mg/L et préférentiellement entre 15 et 30 mg/L.
Pour améliorer davantage l'activité, les bactéries sont cultivées en présence également d'un inducteur choisi dans le groupe des amides ou des nitriles. La plupart des amides (y compris l'urée et ses dérivés) peuvent être utilisés comme inducteur de l'activité nitrile-hydratasique. Ces inducteurs peuvent être ajoutés seuls ou en mélange, en 1 fois, séquentiellement ou en continu, en début ou en cours de culture.
En pratique, l'inducteur est choisi dans le groupe comprenant crotonamide, urée, propionamide, acétamide, n-butyramide, isobutyramide, n-valéramide, n- capronamide, méthacrylamide et cyclohexanecarboxamide.
Certains inducteurs de type nitrile peuvent également être utilisés, comme par exemple : acétonitrile, propionitrile, isobutyronitrile.
On utilisera de préférence un inducteur peu onéreux qui n'est pas ou peu métabolisé (urée ou ses dérivés). En pratique, les concentrations finales en urée ou
ses dérivés sont comprises entre 5 et 50 g/L, préférentiellement supérieures à 10 g/L.
En d'autres termes, le Demandeur a démontré que l'activité nitrile hydratase des bactéries de l'invention était améliorée dans des conditions standards de cultures (CoCl2-6H20 > 10 mg/1 ; urée préférentiellement > 10 g/1) distinctes de celles utilisées pour Rhodococcus rhodochrous J-l (CoCl2-6H2O : 10mg/l ; urée : 7,5 g/1) [Optimum culture conditions for the production of cobalt-containing nitrile hydratase by Rhodococcus rhodochrous Jl, Appl. Microbiol. Biotechnol. (1991) 34 : 783-788].
La concentration en source de carbone influence également l'obtention d'une activité nitrile-hydratasique satisfaisante. En pratique, on utilise des sources de C à des concentrations nominales variant de 5 à 50 g/L, de préférence de 12 à 30 g/L, ajoutées seules ou en mélange, en 1 fois, séquentiellement ou en continu, en début ou en cours de culture. De façon non limitative, on citera en tant que source de carbone le D-Glucose, le Pyruvate, le D-Sorbitol...
En pratique, des quantités pré-déterminées d'urée, de cobalt et d'une source de carbone sont ajoutées au milieu basai. La culture est menée à une température comprise entre 15 et 50 °C, préférentiellement autour de 28 °C, à un pH compris entre 6 et 9 durant au minimum 96 heures (jusqu'à 200 heures).
Dans un mode de réalisation particulier, la bactérie utilisée est la souche MW3 appartenant à l'espèce Rhodococcus pyridinovorans et déposée le 24 janvier 2002 à la CNCM (Collection Nationale de Culture de Microorganismes), Institut Pasteur, 25 rue du Dr. ROUX, PARIS, France, sous le numéro CNCM 1-2772, et les mutants de cette souche. Les mutants de la souche ci-dessus entrent en effet dans le cadre de l'invention dès lors qu'ils présentent une activité nitrile hydratase.
Dans un mode de réalisation avantageux, le microorganisme peut être immobilisé en utilisant des méthodes et des procédures connues de l'homme du métier. Ces méthodes comprennent, par exemple, les immobilisations par inclusion sur gel (polyacrylamide, extraits d'algues, alginates...) ainsi que les immobilisations sur support par adsorption ou par liaisons covalentes (supports d'origine minérale (alumine, brique, verre, argile...) ou organique (résines échangeuses, collagène, cellulose...).
Selon une autre caractéristique, les substrats sur lesquels agissent Rhodococcus pyridinovorans peuvent aussi bien être des nitriles aliphatiques que les nitriles aromatiques. On citera à titre d'exemple sans toutefois limiter l'invention, des composés tels que l'acétonitrile, le propionitrile, le méthacrylonitrile, l'acrylonitrile, le benzonitrile, la 3-cyanopyridine, le 3-hydroxy isovaleronitrile, le 3-hydroxypropionitrile, le 2-hydroxy 4- methylthiobutyronitrile...
On notera que la production d' amide obtenues par hydratation d'un nitrile en présence de la nitrile hydratase produite par le microorganisme de la présente demande peut se faire aussi bien par le biais de procédés continus que discontinus (appelés " batch ").
L'invention se rapporte aussi à un procédé de culture de bactéries appartenant à l'espèce Rhodococcus pyridinovorans. Selon une première caractéristique, le milieu de culture contient des ions cobalt Co2+ et/ou Co3+ dans des concentrations comprises entre 10 et 40 mg/L (base CoCl2-6H2O), préférentiellement entre 15 et 30 mg/L. Selon un mode de réalisation avantageux, le milieu contient en outre de l'urée ou ses dérivés dans des concentrations finales comprises entre 5 et 50 g/L, préférentiellement supérieures à 10 g/L. Selon une forme de réalisation préférée, le milieu contient en outre une source de carbone
dont les concentrations nominales varient entre 5 et 50 g/L, de préférence entre 12 et 30 g/L.
L'invention concerne également la souche MW3 appartenant à Rhodococcus pyridinovorans déposée le 24 janvier 2002 à la CNCM sous le numéro CNCM 1-2772 et les mutants de cette souche.
L'invention et les avantages qui en découlent ressortiront mieux des exemples de réalisation suivants.
La figure 1 est un dosage par chromatographie phase liquide d'acrylamide formé en utilisant M W3 en tant que nitrile hydratase.
La figure 2 est un dosage par chromatographie phase liquide d'acrylamide formé en utilisant PBD9 en tant que nitrile hydratase.
1/ Caractérisation de la souche MW3 a/ Milieu de culture
MUieu basai :
K2HPO4 0.5 g KH2PO4 0.5 g MgSO4, 7H2O 0.5 g Extrait de levure 1.0 g Tryptone de caséine 7.5 g Eau déionisée q.s.p. 1 litre (pH 7.2) Ion métallique Co2+ : 10 mg/L (CoCl2-6H2O) Inducteur Urée : 7,5 g/L Source de carbone D-Glucose monohydrate 10 g/L
b/ Propriétés de MW3
Type de colonie : gram + colonies pigmentées en rose Caractère biochimique oxydase - catalase + nitrate réductase + nitrite réductase -
Métabolisme respiratoire aérobie stricte
c/ Identification
Méthode utilisée : - Amplification du gène rrs codant l'ARNr 16S
Séquençage du gène rrs
L'analyse de la séquence d'ARNr 16S de MW3 montre un pourcentage d'homologie égal à 100% avec la séquence de l'ARNr 16S de la souche PDB9 accessible dans la banque GENBANK sous le numéro AF173005. L'homologie étant de 100%, on en conclut que MW3 appartient à Rhodococcus pyridinovorans.
2/ Activité nitrile hydratase de MW3
Descriptif des mesures de l'activité nitrile-hydratasique effectuées :
Définitions
Activité spécifique :. μmol d'amide produit . min"1 . mg"1 de poids sec bactérien.
Activité relative : activité exprimée en pourcent correspondant à l'activité spécifique ou totale obtenue rapportée à l'activité spécifique ou totale de référence (100%).
Activité totale : μmol d'amide produit . min'1 . g"1 de milieu de culture.
Test d'activité à 20°C
* Solμtion réactionnelle de 100g contenant :
- 50g de tampon phosphate lOOmM
- 49g de solution aqueuse de nitrile respectivement : . x grammes de nitrile correspondant à la quantité nécessaire à l'obtention de la concentration finale recherchée . 49 - x g d'eau déionisée
* La réaction est déclenchée en rajoutant 1 g de suspension cellulaire (contenant une quantité prédéterminée de cellules centrifugées 10 min à 10000 g).
* Prélèvement de 4 mL après différents temps d'incubation et arrêt de la réaction avec 30 μL d'acide sulfurique concentré.
* Dosage par chromatographie phase liquide de l'amide formé.
3/ EXEMPLES
A/ EXEMPLE 1
Test activité effectué dans des conditions standards optimales utilisées pour Rhodococcus rhodochrous Jl [Optimum culture conditions for the production of cobalt-containing nitrile hydratase by Rhodococcus rhodochrous Jl, Appl. Microbiol. Biotechnol. (1991) 34 : 783-788].
Conditions de culture : CoCl -6H2O : lOmg/1 ; urée : 7,5 g/1 ; glucose : 10 g/L ; substrat : acrylonitrile 50 mM
: Activité spécifique relative (%) * : sur la base des résultats du brevet EP 362829 (AS = 497 ; ex 2, tab 1)
On constate que, dans des conditions standards décrites comme optimales pour Jl, MW3 présente une activité nitrile hydratasique modérée.
B/ EXEMPLE 2 : Variation des conditions de culture de MW3 en fonction des concentrations et/ou des temps d'ajout du cobalt.
Conditions dé culture : CoCl2-6H20 : variable ; urée : 7,5 g/1 ; glucose : 10 g/L ; substrat : acrylonitrile 50 mM
C/ EXEMPLE 3 : Variation des conditions de culture de MW3 en fonction des concentrations et/ou des temps d'ajout de l'inducteur (l'urée).
Conditions de culture : CoCl2-6H2O : 10 mg/1 ; urée : variable ; glucose : 10 g/L ; substrat : acrylonitrile 50 mM
1 : Activité spécifique relative (%) De façon surprenante, lorsque l'ajout d'urée n'intervient qu'après le début de culture de MW3 (au moins 12 heures) et que la quantité utilisée est augmentée, l'activité nitrile hydratasique de la bactérie est surmultipliée.
D/ EXEMPLE 4 : Variation des conditions de culture de MW3 en fonction des concentrations et/ou des temps d'ajout de la source de carbone (le glucose).
Conditions de culture : CoCl2-6H2O : 10mg/l ; urée : 7,5 g/1 ; glucose : variable ; substrat : acrylonitrile 50 mM
: Activité totale relative (%)
De façon surprenante, lorsque la quantité en source de carbone est augmentée et que son ajout est fractionné après le début de culture de MW3, l'activité nitrile hydratasique de la bactérie est amplifiée.
E/ EXEMPLE 5 : Variation du substrat (nitrile) utilisé lors du test d'activité. Conditions de culture : CoCl2-6H20 : 10mg/l ; urée : 7,5 g/1 ; glucose : 10 g/L ; substrat : variable
MW3 présente une activité nitrile hydratasique sur une grande variété de substrats aussi bien aliphatiques, aromatiques ou insaturés.
F/ EXEMPLE 6 : Mesures d'activité spécifique (substrat : acrylonitrile 377 mM).
Test l Test 2 Test 3
CoCl2-6H20 20 mg/L 20 mg/L 20 mg/L
Temps d'ajout T = 0 T = 0 et 24h T = 0
Urée 2 x 7,5 g/L 2 x 7,5 g/L 2 x 7,5 g/L
Temps d'ajout T = 0 et 24h T = 24 et 48h T = 0 et 24h
Glucose 2 x 10 g/L 16 g/L 2 x 10 g/L
Temps d'ajout T = 0 et 24h T = 0 T = 0 et 24h
Durée de culture 168h 168h 120h
Concentration de 9 g/L 8,1 g/L 6,2 g/L cellules
Formation d'amide
Activité Spécifique 340 220 250
Activité Totale 3060 1760 1550
Remarque :
Lorsque l'ajout d'urée est effectué en totalité à T = 0, l'activité totale obtenue était nettement plus faible que celles constatées pour les tests présentés dans le tableau ci-dessus (inférieure à 1000).
G/ EXEMPLE 7 : immobilisation
140 g d'une suspension cellulaire de MW-3 (contenant 15% p/p de cellules sèches dans du tampon phosphate 50 mM pH 7,0) obtenue par fermentation sur milieu nutritif tel que décrit par l'exemple 6 (test 1), est immobilisée dans un gel de polyacrylamide selon un procédé bien connu de l'homme de l'art. Le gel ainsi obtenu est broyé dans un moulin afin d'obtenir après tamisage des particules de taille homogène comprise entre 500 et 1500 μm. Ces particules sont lavées dans le tampon phosphate pH 7,0 puis stockés dans ce même tampon.
H/ EXEMPLE 8 : essai de bioconversion n°l
On prend 120 g de gel égoutté obtenu selon l'exemple 7 et ayant une activité totale de 15000 U sont ajoutés à 2,895 kg d'eau déionisée contenant 148 ppm d'acrylate de sodium, pH 8,0. Le mélange est maintenu, sous une agitation de 200 rpm, à 12°C les 12 premières heures puis à 20°C les 12 heures suivantes. 2624 ml d' acrylonitrile sont ajoutés à un débit constant de 164 ml/h pendant 16 h, le pH étant régulé par addition de soude 50 mM. Après une durée totale de 24 h de bioconversion, on obtient une solution finale présentant une concentration de 56,4% en acrylamide et avec un résidu d' acrylonitrile <50 ppm (vérification effectuée par Chromatographie Liquide Haute Pression). Le produit est séparé du catalyseur par fîltration sur 0.2 μm.
1/ EXEMPLE 9 : essai de bioconversion n°2
20 g de MW-3 immobilisé et égoutté comme décrit dans l'exemple 7 sont ajoutés à 811 g d'eau déionisée contenant 148 ppm d'acrylate de sodium, pH 8.0. La température du mélange étant maintenue à 20°C sous une agitation de 200
rpm. 189 ml de méthacrylonitrile sont ajoutés à un débit constant pendant 24 h. Après une durée totale de 30 h de bioconversion, 19,1% de methacrylamide contenant moins de 100 ppm de méthacrylonitrile sont obtenus. Le produit est séparé du catalyseur par filtration sur 0.2 μm, puis cristallisé avec un rendement de 46%.
J/ EXEMPLE 10 : essai de bioconversion n°3
3 g d'une suspension de cellules libres de MW-3 (310 mg de cellules sèches dans 0.85% NaCl) sont ajoutés à 687 g d'eau déionisée contenant 148 ppm d'acrylate de sodium, pH 8,0. Ce mélange étant maintenu à 20°C sous une agitation de 200 rpm, 389 ml d'acrylonitrile sont ajoutés à un débit constant durant 16 h. Après une durée totale de bioconversion de 24 h, une solution de 42% d'acrylamide contenant moins de 50 ppm d'acrylonitrile résiduel est obtenue. Les cellules sont séparées du produit final par filtration sur 0.2 μm.
4/ Absence d'activité nitrile hydratase de PBD9
Dans cette exemple, on compare l'activité nitrile hydratase de la souche PBD9 décrite par Yoon, avec MW3, dans les conditions standard suivantes à 20°C :
Solution réactionnelle de 100g contenant :
- 50g de tampon phosphate 100 mM
- 49g de solution aqueuse nitrile respectivement :
- x grammes de nitrile correspondant à la quantité nécessaire à l'obtention de la concentration finale recherchée
- 49-x grammes d'eau désionisée
La réaction est déclenchée en ajoutant 1 g de suspension cellulaire (contenant une quantité prédéterminée de cellules centrifugées 10 min à 10000g)
Prélèvement de 4 mL après 3 min d'incubation et arrêt de la réaction avec 30 μL d'acide sulfurique concentré.
On dose par chromatographie phase liquide, l' amide formé.
Les résultats apparaissent sur les figures 1 et 2. Comme le montrent clairement ces 2 figures, il n'y a pas de formation d'acrylamide en utilisant PBD9 (fig 2) contrairement à M 3 (fig 1).
Claims
REVENDICATIONS
1/ Procédé de fabrication d'amides consistant à hydrater un nitrile en une amide correspondante, en présence d'une nitrile-hydratase d'origine microbiologique, caractérisé en ce que ladite nitrile hydratase est produite par une bactérie appartenant à l'espèce Rhodococcus pyridinovorans.
2/ Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les bactéries sont cultivées en présence d'ions cobalt.
3/ Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que les concentrations finales en cobalt (base CoCl2-6H2θ) sont comprises entre 10 et 40 mg/L, préférentiellement entre 15 et 30 mg/L.
4/ Procédé selon la revendication précédente, caractérisé en ce que les bactéries sont cultivées en présence d'urée ou de ses dérivés.
5/ Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que les concentrations finales en urée ou ses dérivées sont comprises entre 5 et 50 g/L, préférentiellement supérieures à 10 g/L.
61 Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que des bactéries sont cultivées en présence d'une source de carbone dont les concentrations nominales varient entre 5 et 50 g/L, de préférence entre 12 et 30 g/L.
Il Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la bactérie utilisée est la souche MW3 déposée le 24 janvier 2002 à la CNCM sous le numéro CNCM 1-2772 et les mutants de cette souche.
8/ Procédé de culture de bactéries appartenant à l'espèce Rhodococcus pyridinovorans, caractérisé en ce que le milieu contient des ions cobalt dans des concentrations comprises entre 10 et 40 mg/L (base C0CI2.6H2O), préférentiellement entre 15 et 30 mg/L.
9/ Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que le milieu contient de l'urée ou ses dérivés dans des concentrations finales comprises entre 5 et 50 g/L, préférentiellement supérieures à 10 g/L.
10/ Procédé selon l'une des revendications 8 ou 9, caractérisé en ce que le milieu contient une source de carbone dont les concentrations nominales varient entre 5 et 50 g/L, de préférence entre 12 et 30 g/L.
11/ Souche MW3 appartenant à Rhodococcus pyridinovorans déposée le 24 janvier 2002 à la CNCM sous le numéro CNCM 1-2772 et les mutants de cette souche.
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