+

WO2003048370A1 - Methodes de criblage de molecules modulatrices de l'expression de genes, lignees cellulaires, preparation et utilisations - Google Patents

Methodes de criblage de molecules modulatrices de l'expression de genes, lignees cellulaires, preparation et utilisations Download PDF

Info

Publication number
WO2003048370A1
WO2003048370A1 PCT/FR2002/004124 FR0204124W WO03048370A1 WO 2003048370 A1 WO2003048370 A1 WO 2003048370A1 FR 0204124 W FR0204124 W FR 0204124W WO 03048370 A1 WO03048370 A1 WO 03048370A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
selection
genes
vector
ires
translation
Prior art date
Application number
PCT/FR2002/004124
Other languages
English (en)
Inventor
Clarence Deffaud
Original Assignee
Clarence Deffaud
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Clarence Deffaud filed Critical Clarence Deffaud
Priority to AU2002365698A priority Critical patent/AU2002365698A1/en
Publication of WO2003048370A1 publication Critical patent/WO2003048370A1/fr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1086—Preparation or screening of expression libraries, e.g. reporter assays
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/20—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron
    • C12N2840/203—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron having an IRES
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/20—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron
    • C12N2840/203—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron having an IRES
    • C12N2840/206—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron having an IRES having multiple IRES

Definitions

  • the present invention relates to screening compositions and methods for identifying molecules capable of modulating gene expression. It also relates to tools, kits, compositions, vectors, cell lines and genetic constructions, for the implementation of such methods and their uses in the field of human or animal health, in particular for preventing or treating pathologies causing deregulation of gene expression such as cancer, or in experimental research for example.
  • the methods of the invention are based more particularly on the use of a double selection system, conferring better sensitivity and selectivity.
  • They advantageously comprise (i) bringing a test compound into contact with at least two selection units each comprising at least one distinct selection gene placed under the control of a promoter and of elements for initiating translation, under conditions allowing the expression of said selection genes, and (ii) determining the capacity of the test compound to modulate the expression of selection genes.
  • the possibility of identifying compounds acting on the expression of proteins offers numerous applications, in the therapeutic, agricultural, research fields, etc.
  • most of the strategies developed for this purpose aim to identify compounds modulating the biological activity of a protein or its expression in general.
  • these strategies do not always have sufficient specificity and reliability to allow the selection of compounds of interest.
  • the present invention is more particularly concerned with precise mechanisms involved in the overall process of gene expression, which give the technologies and compositions developed better reliability and predictability.
  • the invention describes tools and methods suitable for the identification of compounds modulating transcription and / or the initiation of translation.
  • gene expression and “gene expression” refer more particularly here to the following mechanisms: (i) transcription, (ii) maturation of pre-messenger RNAs, (iii) export of mRNAs to the cytoplasm and ( iv) translation of mRNAs.
  • RNA polymerases RNA polymerases that RNA polymerases.
  • the transcription initiation signal is contained in the proximal promoter of the gene. In this region is located the TATA box, present in almost all genes, as well as the CCAAT and GC boxes in a lesser frequency.
  • the initiation of transcription requires the recruitment of a multiprotein complex in the promoter region. This complex is, in particular, formed of transcriptional factors (TF), among which only TFIID is fixed on the TATA box.
  • TF transcriptional factors
  • TFIIA stabilizes the complex while TFUD-DNA, TFIIB and TFIIE link with TARN polymerase.
  • TFIIF has a helicase activity making it possible to denature the double helix of DNA at the site level transcription initiation.
  • distal sequences regulate transcription. These cis-regulatory elements, more or less distant (upstream or even downstream) from the site of initiation of transcription, fix "trans-regulatory” factors.
  • enhancers or activators as well as “silencers” or “extinguishing sequences”.
  • Mature eukaryotic mRNA is distinguished from prokaryotic mRNAs and certain viral mRNAs by specific post-transcriptional modifications at its 5 'and 3' ends.
  • the mRNA is "capped" at its 5 'end and has a polyadenylated sequence at its 3' end.
  • the cap is necessary for the splicing of pre-messenger RNAs, facilitates the nucleocytoplasmic export of mature mRNAs, increases their stability and, finally, improves the efficiency of translation by interacting specifically with certain initiation factors.
  • the poly A sequence is involved in the nucleocytoplamsic export of mature mRNAs and in the control of the stability of mRNAs in the cytoplasm. In addition, it would also be essential for the efficient translation of mRNAs.
  • splicing Another step in the maturation of mRNAs consists in the constitutive or alternative elimination of intervening sequences (or introns) and in "splicing" the exons. This complex operation, called splicing, requires the participation of many cellular factors.
  • eukaryotic mRNAs only comprise a single reading phase (cistron or ORF for “Open Reading Frame”) delimited in 5 'by a codon for initiating translation (generally AUG) and in 3' by a codon translation stop or stop codon (UAG, UGA or UAA).
  • ORF Open Reading Frame
  • AUG codon for initiating translation
  • UAG codon translation stop or stop codon
  • UAA codon translation stop or stop codon
  • ribosomes The translation of mRNAs requires the participation of specialized organizations: ribosomes. It takes place in three successive phases: (1) the initiation of translation, phase during which a ribosome competent for translation is formed on an mRNA, (2) the elongation which constitutes the protein synthesis phase and ( 3) the termination which marks the end of protein synthesis with the dissociation of the ribosome.
  • the aim of translational initiation is to correctly position a ribosome on an mRNA so that the triggering of protein synthesis takes place on the correct initiation codon.
  • the “scanning” of the ribosomes the mechanism of direct entry of the ribosomes (IRES-dependent mechanism), the mechanism of “shunt”, also called “transfer of the ribosome”, as well than hybrid mechanisms involving at least two of the previously mentioned mechanisms.
  • the ribosome scanning initiation model requires the participation of many initiation factors called elFs (eukaryotic Initiation Factor) and includes four steps: (1) the association of the initiating tRNA (Met-tRNA) and of the initiation factors elFlA, eIF3, eIF5 and eIF2 with the small ribosomal subunit 40S to form the 43S pre-initiation complex; (2) the formation of the 43 S pre-initiation complex; (3) the binding of the 43 S complex to mRNA; (4) scanning the pre-initiation complex and fixing the large ribosomal subunit. This mechanism postulates that the ribosomes must unwind the secondary structures of the mRNA to allow their migration.
  • elFs eukaryotic Initiation Factor
  • Ribosomes “jump” along the mRNA sequence.
  • the term “shunt donor and acceptor sites” should be understood to mean the minimum regions of the mRNA capable of directing the initial and final stages of the “shunt” mechanism.
  • the “direct entry” mechanism of ribosomes is an alternative mechanism which requires the presence of a particular structural element of the mRNA (an “IRES”: “Internai Ribosomal Entry Segment”). This mechanism does not involve the recognition of the cap by the factor eIF4F and nevertheless allows the initiation of translation.
  • the IRES element is made up of highly structured domains of RNA which, in association with cellular proteins, direct ribosomes to a specific initiation codon. This mechanism governs the synthesis of a certain number of cellular proteins, in particular during cell division and under certain conditions of cellular stress (modifications of the environment of the cell such as changes in temperature, variations in the levels of O and CO 2 , depletion of nutrients and growth factors, the presence of toxic molecules).
  • US Patent 6,171,821 B1 describes a method for screening molecules capable of modulating the alternative mechanism of initiation of translation via the IRES sequence of the XI AP gene and provides a method for normalizing the results.
  • Patent application WO 99/61613 describes a method for screening for compounds capable of modulating the interaction between an IRES-dependent translation initiation factor and a ligand, without however seeking to target the general translation mechanism IRES-dependent. There is therefore a real need for tools and methods making it possible to identify in a simple and reliable manner compounds making it possible to modulate in a targeted manner gene expression, and in particular the mechanisms of translation initiation, which are usable in the context of the preparation of medicaments intended for the treatment of pathologies, in particular pathologies linked to translational deregulation, such as cancers.
  • the present invention now describes a new approach for the identification, selection, characterization or optimization of compounds capable of modulating targeted expression of genes.
  • the present invention describes in particular new methods for the identification, selection, characterization or optimization ex vivo or in vitro, of compounds capable of modulating in a targeted manner, ie stimulating or inhibiting, the initiation of translation or the transcription.
  • the present invention further describes novel cell lines and compositions for screening for such compounds.
  • the methods according to the invention are based on the establishment of a particularly advantageous double selection which makes it possible to increase the specificity of said compounds.
  • the screening methods according to the invention more particularly allow the identification of compounds capable of modulating, in a targeted manner, the efficiency or the execution of one or more translation initiation mechanisms such as the "scanning" of ribosomes, the direct ribosome entry mechanism (IRES-dependent mechanism), the “shunt” mechanism (also called “ribosome transfer”) or a hybrid mechanism involving at least two of the previously mentioned mechanisms.
  • translation initiation mechanisms such as the "scanning" of ribosomes, the direct ribosome entry mechanism (IRES-dependent mechanism), the “shunt” mechanism (also called “ribosome transfer”) or a hybrid mechanism involving at least two of the previously mentioned mechanisms.
  • Another particular object of the invention resides in a method of screening for molecules which act in a targeted manner on the transcriptional activity of a promoter.
  • the "targeted" action of the compounds screened by the methods of the invention indicates that these compounds have a main action on a determined stage or mechanism of the expression process, which guarantees their greater specificity.
  • the methods of the invention allow a screening of molecules acting in a targeted manner (specific or main) on the translation initiation mechanisms, and not acting (or not directly or mainly) on other mechanisms, such as transcription, splicing, export of mRNAs, etc.
  • the methods of the invention adapted to the screening of compounds acting in a targeted manner on the transcription mechanisms provide compounds having no direct or main activity on other stages of the expression process.
  • a first object of the invention lies more particularly in screening methods allowing the identification of compounds modulating in a targeted manner the expression of genes comprising (i) bringing a test compound into contact with at least two selection units each comprising at least one distinct selection gene placed under the control of a promoter and of translation initiation elements, under conditions allowing the expression of said selection genes, and (ii) the determination of the capacity of the test compound for modulating the expression of said selection genes.
  • Another object of the invention lies in a screening method allowing the identification of compounds modulating in a targeted manner the mechanism of initiation of translation, characterized in that it comprises: (i) bringing into contact a test compound with at least two selection units each comprising at least one distinct selection gene placed under the control of a promoter (preferably distinct) and of elements of initiation of translation, under conditions allowing the expression of said selection genes, and (ii) the determination of the capacity of the test compound to modulate the expression of said selection genes.
  • Another object of the invention resides in a screening method allowing the identification of compounds modulating in a targeted manner the transcription of genes, characterized in that it comprises: (i) bringing a test compound into contact with at at least two selection units each comprising at least one distinct selection gene placed under the control of a promoter and of translation initiation elements (preferably distinct), under conditions allowing the expression of said selection genes, and (ii) determining the ability of the test compound to modulate the expression of said selection genes.
  • IRES sequences are chosen from the IRES sequences of the ODC, c-myc, c-sis, FGF-2, PDGF-2, IGF-2 genes, VEGF, apaf-1, XIAP, eIF4G, EMCV, HCV or any functional IRES in the system used.
  • IRES sequences of viral origins HCV, EMCV .
  • Another subject of the invention relates to a cell comprising at least two selection units each comprising at least one distinct selection gene placed under the control of a promoter and of translation initiation elements, as well as a population cell characterized in that at least a part of the cells which constitute it comprises at least two selection units as defined above.
  • the cells are typically recombinant cells modified by simultaneous or sequential insertion of the selection units.
  • kits for the implementation of screening methods characterized in that it comprises a population (e.g., a line) of cells as defined above.
  • the invention also relates to the use of a compound obtained thanks to a screening method according to the invention for the preparation of a medicament intended for the treatment of a pathology involving the abnormal expression of a protein, and in particular cancer.
  • the invention can be implemented in different systems (cellular or acellular), with different types of constructs, selection genes and regulatory elements in order to target the main activity of screened compounds.
  • the invention can be used in research, industrial screening, therapy, molecular modeling, etc. Selection / screening systems
  • the invention is based in particular on the use of a double selection system, making it possible to improve the efficiency of the processes.
  • the method generally calls for the use of two selection units each comprising at least: a separate selection gene, that is to say different from one unit to another, placed under the control of a promoter and elements of initiation of the translation.
  • the selection units are therefore nucleic acid molecules comprising a set of functional regions, leading under conditions suitable for the expression of the selection gene.
  • the selection units are typically DNA or RNA, preferably double-stranded DNA.
  • selection gene within the meaning of the invention thus designates any region of nucleic acid coding for a protein product which can be detected.
  • selection gene designates only the coding region.
  • Each selection unit comprises at least one selection gene placed under the control of a promoter and of elements for initiating translation.
  • the elements for initiating translation are included in an untranslated nucleic region, typically located 5 ′ of the selection gene.
  • the latter may contain one or more IRES and / or elements involved in the shunt mechanisms.
  • other regions of the mRNA may contain elements involved in controlling the initiation of translation.
  • the translation initiation elements preferably comprise an untranslated region (5'UTR) preferably comprising one or more IRES elements and / or elements involved in the transfer mechanism of the ribosome, for example donor sites and shunt acceptor.
  • the elements for initiating the translation of each of the selection units are preferably identical, and correspond for example to the 5 'untranslated region of said mRNA.
  • the elements of initiation of translation of each of the selection units can also be different, according to another preferred mode, more particularly suitable for screening for compounds modulating the general mechanism of one or more modes of initiation of translation or the mechanism of transcription.
  • the IRES sequences are preferably chosen from the IRES sequences of the ODC genes (Pyronnet, S., L. Pradayrol, and N. Sonnenberg N. A cell cycle-dependent internai ribosome entry site. Molecular cell; 2000; (5) 607-616 ), c-myc (Stoneley M, Paulin FE, Le Quesne JP, Chappell SA, Willis AE .; c-myc 5 'untranslated region contains an internai ribosome entry segment; Oncogene; 1998, Jan 22; 16 (3): 423 -8), c-sis (Bernstein J, Sella O, Le SY, Elroy-Stein O.
  • PDGF2 / c-sis mRNA leader contains a differentiation-linked internai ribosomal entry site (D-IRES. J Biol. Chem. 1997, Apr 4; 272 (14): 9356-62), FGF-2 (Vagner, S., MC Gensac, A. Maret, F. Bayard, F. Amalric, H. Prats, and AC Prats. Alternative translation of human fibroblast growth factor 2 mRNA occurs by internai entry of ribosomes. Mol. Cell. Biol. 1995, (15): 35-44), PDGF-2 (Bernstein J.
  • PDGF2 / c-sis mRNA leader contains a differentiation-linked internai ribosomal entry site (D- IRES. J Biol. Chem. 1997, Apr 4; 272 (14): 9356-62), IGF-2 (Henk Teerink, Harry O. Voorma, Adri AM Thomas.
  • the human insulin-like growth factor II leader 1 contains an internai ribosomal entry site. Biochimica and Biophysica Acta. 1995, 403-408), VEGF (Akiri G, Nahari D, Finkelstein Y, Le SY, Elroy-Stein O, Levi BZ.
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • Any other element for initiating translation can be chosen and incorporated into a selection unit according to the invention by techniques known to those skilled in the art. These elements can correspond to the 5 'untranslated region of any mRNA for which it is desired to produce specific modulators of the mechanism of initiation of translation.
  • the promoters of the selection units controlling the expression of the selection genes can be identical or different from one unit to another. When two different promoters are used, this promotes the screening of compounds acting in a targeted manner on the translation initiation mechanisms, in particular when these elements are identical within the two units. When two identical promoters are used, this promotes the screening of compounds acting in a targeted manner on the transcription mechanisms, in particular when the elements of initiation of translation are different from one unit to another.
  • promoters can be strong or weak promoters, ubiquitous or specific for tissues, constitutive or regulated. Mention may be made of viral and cellular promoters (for example of domestic genes), bacteria, etc., generally any transcriptional promoter functional in the cell or acellular system used. Mention may be made, as specific examples of viral promoters, of CMV, SV40, LTR, TK, etc. promoters, as examples of promoters of domestic genes, promoters of the ⁇ -actin, PGK, apolipoprotein, albumin and Ubiquitin C genes, and as an example of bacterial promoters the promoters pLac, pTrp, etc.
  • Each selection unit used in the context of a screening method according to the invention preferably comprises at least one selection gene, the selection genes preferably being different from one selection unit to the other. other.
  • the selection gene can be, in general, any gene whose expression can be detected, observed or measured, by any known technique (auxotrophy, fluorescence, luminescence, resistance, etc.). Any gene known to a person skilled in the art whose activity or presence in biological extracts is (easily) measurable can, in general, be used as a selection gene for the implementation of the screening method according to the invention. 'invention.
  • the selection gene is a negative selection gene.
  • the genes coding for a thymidine kinase in particular thymidine kinase of the human herpes virus (HSV-TK)
  • the cytosine deaminase are preferred.
  • gpt hypoxanthine phosphoribosyl transferase
  • NTR nitroreductase from E. coli
  • the selection gene is a positive selection gene.
  • positive selection genes mention may be made, as preferred examples, of the genes hygro (for resistance to hygromycin), neo (for resistance to neomycin), phleo (for resistance to phleomycin), puro (for resistance puromycin) and bla (resistance to blasticidin).
  • the selection gene is a reporter gene. It may be, for example, the gene coding for luciferase (more particularly for firefly luciferase or for that of Renilla), for secreted alkaline phosphatase, for galactosidase, for lactamase, for Chloramphenicol acetyl transferase (CAT), for human growth hormone (hGH), for ⁇ -glucuronidase (Gluc) or for Green fluorescent protein (GFP) and its variants or derivatives ( ⁇ GFP, ⁇ CFP, ⁇ BFP), etc.
  • luciferase more particularly for firefly luciferase or for that of Renilla
  • secreted alkaline phosphatase for galactosidase, for lactamase, for Chloramphenicol acetyl transferase (CAT), for human growth hormone (hGH), for ⁇ -glucuronidase (Gluc) or for Green fluorescent protein (GFP) and
  • a preferred subject of the invention relates to a method according to the invention in which the selection genes are negative selection genes, preferably chosen from the thymidine kinase gene of the human herpes virus (HSV-TK), the cytosine deaminase gene of. coli (CodA), the hypoxanthine phosphoribosyl transferase (HPRT) gene, the xanthine-guanine phosphoribosyl transferase (gpt) gene and the E nitroreductase gene.
  • the selection genes are negative selection genes, preferably chosen from the thymidine kinase gene of the human herpes virus (HSV-TK), the cytosine deaminase gene of. coli (CodA), the hypoxanthine phosphoribosyl transferase (HPRT) gene, the xanthine-guanine phosphoribosyl transferase (gpt) gene and the E nitrore
  • NTR coli
  • TK or CodA telomere sequence
  • reporter genes preferably chosen from GFP, ⁇ GFP, ⁇ CFP and ⁇ BFP
  • positive selection genes preferably chosen from the hygro, neo, phleo genes , puro and blah.
  • one, several or each of the selection units comprises several selection genes, preferably several selection genes belonging to a different category as defined above, typically a negative selection gene and a positive selection gene.
  • Another preferred subject of the invention relates to a method in which each selection unit comprises a positive selection gene and a negative selection gene.
  • the second selection gene (or at least one of the two) is advantageously a positive selection gene, preferably chosen from hygro, neo, phleo, puro and bla.
  • the two selection genes present in each unit are different from each other.
  • the selection genes present on one unit are distinct (i.e., different) from the selection genes present on another unit used concomitantly.
  • the positive selection gene allowing the establishment of a stable line can be “fused” with the selection gene (s) (negative, reporter and / or positive) present within each selection unit.
  • mergers include the combinations or mergers TK-bla, TK-hygro, TK-neo, TK-puro, CodA-hygro, CodA-neo, CodA-puro, CodA-bla, neo- HPRT, hygro-NTR, puro-gtp, or any other functional combination, in particular the bla-TK, hygro-TK, neo-TK fusion genes, etc.
  • the positive selection gene allowing the establishment of a stable line can also be present on another reading frame (distinct from that of negative, reporter and / or positive selection genes) and function by reinitiation, or even be carried by another transcriptional unit.
  • the promoter (P), the elements for initiating translation (5'UTR) with or without IRES and / or donor and shunt acceptor sites, the selection gene (s) (S) possibly fused or linked by reinitiation, are functionally arranged in the selection unit, that is to say so that the promoter controls the expression of said genes and that their expression can be modulated by a test compound.
  • the selection units according to the invention preferably further comprise a poly A transcription termination sequence preceded by a 3'-UTR region. Generally, these regions are therefore arranged in the following order, in the 5 '->3' orientation: (P) - (5'UTR) - (S) - (3'UTR) - (polyA).
  • the unit contains several selection genes, for example a negative selection gene (S-), a positive selection gene (S +) or a gene having several selection properties both positive and negative (S - / +), these regions are advantageously arranged in the following order, in the 5 * -> 3 'orientation: (P) - (5'UTR) - (S -) - (S +) - (3'UTR) - (polyA). It is understood that any other functional arrangement can be envisaged by a person skilled in the art without departing from the present invention.
  • each selection unit is included in an eigenvector (that is to say that each unit is included in a distinct or different vector). It can be any vector adapted to the system used, such as a plasmid, virus, phage, episome, artificial chromosome, etc.
  • plasmid vectors such as the bacterial plasmids pQE70, pDIO, phagescript, ⁇ siX174, p.BluescriptSK, ⁇ NH46A; pKK233-3, ⁇ RIT5; pSV2CAT, pSG; pSVK3, pBPV, pMSG and pSVL, commercially available, the bacteriophage PI (Sternberg NL (1992; 1994)), a human adenovirus type 2 or 5 or of animal origin (WO94 / 28152, WO97 / 00326, WO95 / 00655 ), and retroviruses (MLV, FLV, etc.).
  • the vector is preferably a plasmid (i.e. typically a circular molecule, preferably based on double-stranded DNA), which can be linearized.
  • the selection units can be introduced into the cell by viral transfection or transduction, and can replicate in autonomous form or integrate into the genome of the host cell, for example by homologous recombination.
  • the selection unit selection genes are carried by a single vector, preferably a plasmid, and, while being placed under the control of IRES elements and / or donor sites and identical or different shunt acceptors, are functionally linked by these.
  • a particular object of the invention relates to the use, within the framework of a screening method allowing the identification of compounds modulating the mechanism of initiation of translation, of at least two selection units each comprising elements of initiation of identical translation and at least one selection gene, the selection gene or genes of each selection unit being placed under the control of the same promoter.
  • a preferred object of the invention thus relates to a screening method in which each selection unit or vector comprises a different promoter, a different selection gene, a 5 ′ UTR region located between said promoter and said selection gene within the 'selection unit and said region 5'UTR being identical or different from one vector or from one unit to another.
  • each selection unit is included in a separate vector.
  • each selection unit or vector comprises a different promoter controlling the expression of a bicistronic unit composed of a positive selection gene, an element of IRES type and / or shunt and a negative selection gene, said IRES element being identical or different from one vector or from one unit to another.
  • each selection unit is included in a separate vector.
  • a preferred subject of the invention relates to a screening method in which the selection units, located within the same vector, comprise different selection genes and are placed under the control of a common promoter and of IRES elements identical or different.
  • the selection units as described above are moreover contained in a cell allowing the expression of the selection genes.
  • the test compound or a precursor thereof can then be brought into contact with the cell.
  • the invention also relates to a cell comprising at least two selection units each comprising at least one distinct selection gene placed under the control of a promoter and of elements for initiating translation.
  • the invention also relates to a cell comprising at least one vector as defined above.
  • the invention also relates to a population of cells in which the cells (or a part of them) comprise at least two selection units or at least one vector as defined above.
  • the translation initiation elements may include an untranslated region (5'UTR) preferably comprising one or more IRES elements and / or elements involved in the ribosome transfer mechanism.
  • the elements for initiating the translation of the selection units are identical.
  • the promoters of the selection units are different.
  • the selection genes used are preferably negative selection genes, preferably chosen from Tk, HPRT, NTR, gpt and CodA and / or reporter genes, preferably chosen from EGFP, ECFP, EBFP, and / or selection genes positive, preferably chosen from the hygro, neo, phleo, puro and bla genes.
  • the IRES sequences are preferably chosen from the IRES sequences of the ODC, c-myc, c-sis, FGF-2, PDGF-2, IGF-2, VEGF, apaf-1, XIAP, eIF4G, EMCV genes, HCV or any functional IRES in the cellular or acellular system used.
  • Each selection unit can be included in a vector, preferably in a plasmid.
  • the cell populations according to the invention are preferably composed of eukaryotic cells, in particular human cells, preferably immortalized. They can be prepared by any technique known to those skilled in the art, in particular by electroporation, infection, precipitation with calcium phosphate, use of agents which facilitate transfection (e.g., liposomes, cationic lipids, peptides, polymers, etc.).
  • agents which facilitate transfection e.g., liposomes, cationic lipids, peptides, polymers, etc.
  • the selection units are brought into contact with the test compound, in an acellular system, in the presence of enzymes and reagents allowing transcription and / or translation in vitro.
  • enzymes and reagents allowing transcription and / or translation in vitro.
  • Such systems are marketed by suppliers such as Promega (reticulocyte lysate (RRL) or TNT system). It is understood that in the particular case of the introduction into an acellular system of selection units in the form of RNA, the presence of enzymes and reagents allowing transcription in vitro is not required.
  • the screening methods according to the invention provide an ex vivo or in vitro step of bringing the test compound into contact with at least two selection units according to the invention, under specific conditions which make it possible to determine the expression of said selection genes and thereby obtain information regarding the effect of the test compound. Conventionally, the effect of the test compound is compared with the level of expression of the selection genes, determined in the absence of said compound, or in a reference situation.
  • the test compound can be brought into contact with host cells into which selection units according to the invention have been introduced, via plasmid vectors, for example.
  • These cells in a preferred embodiment of the invention, can be eukaryotic cells, for example yeasts, mammalian cells and in particular human cells (hepatocytes, fibroblasts, endothelial cells, muscles, etc.). Even more preferably, these cells can be immortalized human cells. It can also be populations, primary cultures or established lines (Hela cells for example).
  • the invention therefore relates to a screening method in which the test compounds are preferably brought into contact with a cell from a population or a line of eukaryotic cells, in particular human cells, preferably immortalized, comprising the selection units.
  • Another object of the present invention relates to a population or a cell line whose constituent cells comprise at least two selection units each comprising at least one distinct selection gene placed under the control of a promoter and of initiation elements of the translation.
  • the latter preferably comprise an untranslated region (5'UTR) which may comprise one or more IRES elements and / or elements involved in the transfer mechanism of the ribosome, for example shunt donor and acceptor sites, and are preferably identical.
  • the selection gene (s) of each selection unit are preferably different and are placed under the control of preferably different promoters as well.
  • the compounds can be brought into contact with the selection units or the cells containing them at different times, according to their effect (s), their concentration, the nature of the cells and the technical assessment.
  • the contact can be made on any suitable support and in particular on a plate, in a tube or a flange.
  • the contacting is carried out in a multiwell plate which makes it possible to conduct, in parallel, numerous and varied tests.
  • microtitration plates and more particularly 96 or 384 well plates (or more) easy to handle and on which the revelation can be obtained thanks to a classic stimulation.
  • variable amounts of cells can be used when implementing the methods described.
  • 10 3 to 10 6 cells are brought into contact with a type of test compound, in an appropriate culture medium, and preferably between 10 and 10 5 cells.
  • a type of test compound in an appropriate culture medium, and preferably between 10 and 10 5 cells.
  • 10 4 to 10 5 cells can be incubated in each well with a desired amount of a test compound.
  • less than 10 5 cells and typically between 10 3 and 5 ⁇ 10 4 cells are generally incubated in each well with the test compound.
  • the amount (or concentration) of test compound can be adjusted by the user according to the type of compound (its toxicity, its cell penetration capacity, etc.), the number of cells, the length of the incubation period, etc.
  • cells are exposed to amounts of test compounds which vary from 1nM to ImM. It is of course possible to test other concentrations without deviating from the present invention.
  • Each compound can, moreover, be tested, in parallel, at different concentrations.
  • Another object of the invention thus relates to a screening method which comprises contacting, in parallel, several test compounds with the selection units.
  • Contact is maintained for about a week, generally between 5 and 72 hours, or even between 12 and 48 hours.
  • the cells and the various reagents should preferably remain in contact long enough to allow de novo synthesis of the expression product of the selection genes.
  • the incubation lasts about 36 hours.
  • the method of selecting, identifying and characterizing compounds capable of modulating a gene expression mechanism provides for a step of determining the expression of the selection genes. This determination can be obtained using various techniques, the nature of which depends on the type of gene used.
  • the measurement can, for example, correspond to an optical density or to a fluorescent emission in the case of use as a selection gene of the reporter gene coding for ⁇ -galactosidase or luciferase. It may be a revelation of the expression of said genes using a suitable substrate.
  • the presence of the reporter gene product (or of the substrate hydrolysis product) can be determined by conventional methods known to those skilled in the art (fluorescence, DO, luminescence, FRET (see WO 0037077), SPA, biochips, methods immunological, etc.).
  • Measuring hydrolysis essentially involves measuring (or determining the relative amount) of the hydrolysis product contained in each reaction sample. This measurement can be carried out using various techniques known to those skilled in the art, including the detection of fluorescence, radioactivity, color, enzymatic activity, immune complex antigen-antibody, etc.
  • the hydrolysis product is detected and quantified using a fluorescence detection technique.
  • fluorescence detection technique Various fluorochromes can thus be used and checked on cell samples.
  • the activity of a test compound in a cell is determined and this effect is compared to the level activity in the absence of test compound or at a determined average value in the absence of any test compound.
  • these methods allow rapid and parallel screening of numerous test compounds on one or more cell populations (eukaryotic cells, mammalian cells, human cells, etc.). These methods are predictive, automatable and suitable for the selection, identification and characterization of said compounds.
  • test compound can be any product which is in an isolated form or in admixture with other products.
  • the compound may be defined in terms of structure and / or composition or may not be defined.
  • the compound can, for example, be an isolated and structurally defined product, an isolated product of indefinite structure, a mixture of known and characterized products or an indefinite composition comprising one or more products.
  • Such indefinite compositions can be compounds of varied nature, structure and origin, in particular biological compounds, chemical, synthetic compounds, etc., capable of modulating translation. These can be, for example, tissue samples, biological fluids, cell supernatants, plant preparations, etc.
  • the test compounds can be inorganic or organic products, a chemical or biological compound and in particular a polypeptide (or a protein or a peptide), a nucleic acid, a lipid, a polysaccharide, a cofactor or any mixture or derivative of the latter.
  • the compound can be of natural or synthetic origin and include a combinatorial library, a chemical library, a clone or a library of cDNA or of fragments thereof, a library of proteins or of random or constrained peptides, etc.
  • the test compound is preferably chosen from a peptide, a polypeptide, a carbohydrate, a lipid, a nucleic acid, a chemical or synthetic molecule, a plant extract or a combinatorial library.
  • the present invention is particularly suitable for the selection, identification or characterization of a large number of compounds. This simple and effective screening can be accomplished in a very short period of time.
  • the methods described can, in particular, be partially automated, thus allowing efficient and simultaneous screening of various and numerous compounds, either in the form of a mixture or in separate form. The selected compounds are then studied to confirm their biological properties.
  • the compounds identified according to the invention have advantageous properties for therapeutic use, in particular in the field of pathologies causing expression abnormal protein such as translational deregulation, for example cancer.
  • One possible application of the invention is to allow the identification of a therapeutic substance capable of modulating the mechanism of initiation of translation within, for example, cancer cells.
  • the selection of compounds exhibiting for example a modulating activity of the IRES-dependent mechanism can be used to design new types of molecules which can be used in the treatment of certain cancers. Indeed many proto-oncogenes have a translation directed by an IRES. Certain mutations in the 5 'untranslated region of these proto-oncogenes appear to be directly linked to translational deregulation and to the cancerization phenotype. It also seems that IRES is more active in cancer cells or in division than in differentiated cells.
  • the invention thus includes the use of any compound (or derivatives of said compounds) selected, identified or characterized according to one of the methods described above, in the context of the present invention, as a target for experimental research or for the preparation of a drug intended for the treatment of a pathology involving the abnormal expression of a protein (in particular a translational deregulation), and in particular of cancer, but also of neurodegenerative, autoimmune, cardiovascular, stenosis, etc. diseases.
  • a protein in particular a translational deregulation
  • the invention also relates to any kit which can be used for the implementation of screening methods as described above, comprising for example vectors, cell line (s), compositions according to the invention, assay plates and / or reagents for the detection of gene expression.
  • kit which can be used for the implementation of screening methods as described above, comprising for example vectors, cell line (s), compositions according to the invention, assay plates and / or reagents for the detection of gene expression.
  • Figure 1 Selection units to target a particular mode of initiation of translation
  • the promoter (P), the negative (S-) and / or positive (S +) selection gene (s), fused or linked by reinitiation, the elements translation initiation (5'UTR, IRES, donor sites (D) and acceptor (A) of shunt, 3'UTR, possibly coding region) are arranged in a functional manner in the selection unit, i.e. say so that the promoter controls the expression of said genes and that their expression is modulated by the test compound.
  • Figure 2 Possible variations of selection units to target "IRES” mode
  • Figure 3 Possible variations of selection units to target “SHUNT” mode
  • Figure 4 Selection units to target translation directed by a 5'UTR region particular (5'UTR1)
  • Figure 5 Possible variations of selection units to target translation directed by
  • Figure 6 Cell sorting conditions of Hela, Hela-24C / 54A and Hela-54A cells
  • Protocol C corresponds to sorting according to window M2 and protocol D corresponds to sorting according to window Ml (see example 5).
  • Example 1 Method for screening compounds modulating the initiation mechanism of IRES-dependent translation, derived from a library of random peptides, using negative selection genes.
  • the cell line containing the two negative selection genes must be carried out.
  • the Hela line or other preferably immortalized human cells can be used.
  • the IRES sequences are chosen from ODC, c-myc, c-sis, FGF-2, PDGF-2, IGF-2, VEGF, apaf-1, XIAP, eIF4G, EMCV, HCV or any functional IRES in the cellular system used.
  • the negative selection genes the TK and CodA genes are preferred. For these two enzymes, there are a multitude of mutants having different substrates which can be used for their particular properties.
  • the two suicide genes are encoded by two plasmids which also contain all the elements necessary for their expression in eukaryotic cells, namely a promoter (CMV, SV40, ⁇ -actin, PGK, promoter derived from a domestic gene, etc. .), a polyadenylation signal, etc.
  • a promoter CMV, SV40, ⁇ -actin, PGK, promoter derived from a domestic gene, etc. .
  • PGK promoter derived from a domestic gene, etc. .
  • polyadenylation signal etc.
  • the plasmids coding for the peptides originating from a bank of random peptides are introduced into the cell line described above.
  • BPA plasmids Different molecular biology techniques can be used for the introduction of these plasmids into eukaryotic cells (transfection, transduction, etc.).
  • This step is ideally carried out by viral transduction (use of retro-viral or adeno-viral vectors).
  • the gene concerned can code for a protein originating from different origins (prokaryote or eukaryote cDNA library).
  • the BPA plasmid codes for a free random peptide (from 5 to 30 aa) or included within a presenting protein (constrained peptide; from 5 to 20 aa) such as an inactive version of the staphylococcus nuclease, the loop of the active site of E. coli thioredoxin, scorpion toxins or the alpha-amylase inhibitor (Tendamistat).
  • the BPA plasmid preferably has a positive selection gene to allow long-term stable expression and thus facilitate its subcloning.
  • the presenting protein may itself be fused to a positive selection marker (neo, hygro, puro, blasticidine, etc.).
  • the cell line is subjected to double negative selection by activation of the two suicide programs (typically by adding Gancyclovir, Acyclovir, 5Fluoro-cytosine, etc. to the cell culture medium).
  • These cells are then cultured and the random peptides characterized. This method is based on the double selection system of the invention which makes it possible to increase the specificity of the selected peptides.
  • the resistant clones obtained are amplified and subjected to various analyzes (study of the “cell cycle” profile by FACS to determine the proportion of cells in each phase of the cycle).
  • the region of the plasmid coding for the random peptide is then cloned after amplification by PCR. Finally, the isolated peptides are studied to confirm their biological properties.
  • This example describes the composition and construction of cloning vectors allowing, depending on the objectives of the screening envisaged, the transfer into a given cell type of unique selection units.
  • Each of the selection units is determined by a unique combination of the following genetic elements: (i) a promoter, (ii) a 5 'untranslated region (5'UTR), (iii) a sequence coding for a bi-functional protein ( fusion protein), (iv) a 3 'untranslated region (3'UTR) and (V) a polyadenylation sequence (polyA).
  • these selection units are easily modular. Indeed, they contain unique enzyme restriction sites facilitating the substitution of their genetic elements.
  • the promoters were chosen from the promoter sequences of the genes for human phosphoglycerate kinase (PGK), for human ubiquitin C (Ubc), for the promoter of the heavy chain of the ferritin (Iron) gene and for the SV40 virus. (SV40).
  • the 5 ′ UTR regions were chosen from those of the cMYC P2 mRNA (IRES cMYC) and of the ApaF1 mRNA (IRES ApaFl). It can also be a synthetic sequence (arbitrarily called SX).
  • the sequences encoding the bi-functional proteins were chosen from those of the puromycin-thymidine kinase fusion proteins of the human herpes virus (PAC-TK), hygromycin-cytosine deaminase with E. Coli (Hygro-CODA) and hygromycin -GFP (Hygro- GFP). In addition, some of these proteins have a short C-terminal sequence (3X-Flag) (Stratagen). The 3 'UTR regions were chosen from two synthetic fragments arbitrarily called SY and SW. The polyadenylation sequences were chosen from those of the bovine growth hormone (BGH) gene and the simian 40 virus (SV40).
  • the Selection units can be represented schematically in the 5 '->3' direction as follows:
  • the vector pi was generated by enzymatic digestion of the vector pUB6 / V5His A (Invitrogen) with PvuII then, circularization of the fragment of 3662 bp.
  • This vector contains in the 5 '-> 3' direction: the Ubc promoter, a 5 'UTR region containing an intron, a multiple cloning site, the 3' UTR SY region, the polyadenylation sequence of the hormone of bovine growth (BGH), the origin of bacterial replication pMBl ori and the ampicillin resistance gene.
  • the vector p2 was generated by the insertion of the PAC-TK fusion sequence between the Not I and Xho I restriction sites of the pi vector.
  • the PAC-TK fusion sequence was purified after digestion of the vector pCMV-PAC-TK (Karreman C. A new set of positive / negative selectable markers for mammalian cells. Gene. 1998. Sep 18; 218 (1-2): 57 -61) by the restriction enzymes Not I and Xho I.
  • the vector p3 was generated by the insertion of the Hygro-CODA fusion sequence between the Not I and Xho I restriction sites of vector i.
  • the Hygro-CODA coding sequence was purified after digestion of the vector pCMV-Hygro-CODA TK (Karreman C. A new set of positive / negative selectable markers for mammalian cells. Gene. 1998. Sep 18; 218 (1-2): 57-61) by the restriction enzymes Not I and Xho I.
  • the vector p8 was generated by the insertion of the CODA-3Xflag fusion sequence between the NgoM I and Xho I restriction sites of the vector p3.
  • the CODA-3Xflag fusion sequence was generated by the PCR fusion technique using the vectors pCMV-Hygro-CODA and p3XFLAG-CMV10 (Sigma) as template.
  • the vector plO was generated by insertion of the TK-3Xflag fusion sequence between the PshA I and Xho I restriction sites of the vector p2.
  • TK-3Xflag fusion sequence generated by the PCR fusion technique using the vectors pCMV-PAC-TK and p3XFLAG-CMV10 (Sigma) as template.
  • the vector pl4 was generated by insertion of the promoter Ubc between the restriction sites Bgl II and Hind III of the vector p8.
  • the Ubc promoter was obtained by the PCR technique using the vector pUB6 / V5-HIS A (invitrogen) as a template.
  • the vector pl5 was generated by insertion of the promoter Ubc between the restriction sites Bgl II and Hind III of the vector plO.
  • the vector pl7 was generated by insertion of the PGK promoter between the Bgl II and Hind III restriction sites of the vector p8.
  • the PGK promoter was obtained by the PCR technique using human cell genomic DNA Hela as a template.
  • the vector pl8 was generated by insertion of the PGK promoter between the Bgl II and Hind III restriction sites of the vector plO.
  • the p19 vector was generated by insertion of the SV40 promoter between the Bgl II and Hind III restriction sites of the p8 vector.
  • the SV40 promoter was purified after digestion of the vector pGFR-p (R) (Packard) with the restriction enzymes Hind III and Bgl IL
  • the vector p20 was generated by insertion of the promoter SV40 between the restriction sites Bgl II and Hind III of the vector plO.
  • the vector p24 was generated by insertion between the Hind III and pShA I restriction sites of the vector pl7 of a fusion sequence between TIRES cMYC and of the first 38 nucleotides of the coding sequence of hygromycin (Hygro).
  • the cMYC-Hygro fragment was generated by the PCR fusion technique using the vectors pCMV-Hygro-CODA and pIRESYS 1 lbis (constructed by C. Deffaud) as template.
  • the vector p25 was generated by the introduction between the Hind III and BstE II restriction sites of the vector pl5 of a fusion sequence between TIRES cMYC and of the first 138 nucleotides of the coding sequence of puromycin (PAC).
  • the cMYC-PAC fragment was generated by the PCR fusion technique using the vectors pCMV-PAC-TK and pIRESYS 1 Ibis (constructed by C. Deffaud) as template.
  • the vector p26 was generated by insertion between the Hind III and BstE II restriction sites of the vector p20 of the cMyc-PAC fusion sequence generated and described for the plasmid p24.
  • the vector p28 was generated by insertion of the GFP coding sequence between the BstE II and Xba I restriction sites of the vector p24.
  • the GFP cDNA fragment was obtained by the PCR technique using the vector pEGCF-Cl (Clonetech) as a template.
  • the vector p54 was generated by insertion of the ferritin (Fer) promoter between the Bgl II and Hind III restriction sites of the vector p28.
  • the Ferritin promoter was generated by PCR using the vector pORF 1 (Cayla) as a template.
  • the vector p51 was generated by insertion between the Hind III and pShA I restriction sites of the vector pl8 of a fusion sequence between TIRES Apaf-1 and of the first 38 nucleotides of the coding sequence of puromycin (PAC).
  • the Apaf-1-PAC fragment was generated by the PCR fusion technique using the vectors (pRAF) and pCMV-PAC-TK as template.
  • the vector p56 was generated by insertion between the Hind III and pShA I restriction sites of the vector p54 of a fusion sequence between TIRES Apaf-1 and of the first 138 nucleotides of the coding sequence of hygromycin (Hygro).
  • the Apaf-1 -Hygro fragment was generated by the PCR fusion technique using vectors (pRAF) and pCMV-Hygro-CODA as template.
  • the vector p82 was generated by insertion between the Xho I and Sph I restriction sites of the vector p26 of a fragment containing the 3 'synthetic UTR SW sequence and the polyadenylation sequence of the SV40 virus. This DNA fragment was obtained by the PCR technique using the pGFR-p (R) (Packard) vectors for template.
  • pl9 SV40 SX Hygro-CODA SY BGH p82: SV40 cMyc PAC-TK SW SV40
  • Hela cells were transfected with the vectors pl9 and p82 then, maintained in culture for 15 days in the presence of hygromycin (200 ⁇ g / ml) and puromycin (2 ⁇ g / ml).
  • hygromycin 200 ⁇ g / ml
  • puromycin 2 ⁇ g / ml
  • the Hela-19/82 cells will be contacted with a plurality of test compounds, and incubated in the presence of GCV and 5FC. Only molecules capable of inhibiting the transcriptional activity of the SV40 promoter will jointly decrease the expression of the two suicide genes and thus provide Hela-19/82 cells with increased viability.
  • the Hela-19/82 cells will be brought into contact with a plurality of test compounds, and preferably incubated in the presence of puromycin and hygromycin at toxic concentrations. Only the molecules capable of increasing the transcriptional activity of the SV40 promoter will jointly stimulate the expression of the two resistance genes and will thus make it possible to increase the viability of the cells.
  • Example 4 Cellular system for the screening of modulating compounds of the direct entry mechanism of ribosomes directed by TIRES cMYC.
  • the cMyc protein is a transcription factor involved in many extremely varied cellular processes such as proliferation, differentiation, Tapoptosis or transformation.
  • the expression of cMYC is regulated at different levels and in particular at the translational level by a direct ribosome entry site (IRES).
  • IRS direct ribosome entry site
  • Some forms of cancer involve translational deregulations of c-myc mRNA. Consequently, LIRES cMYC constitutes a potential target for the treatment of these pathologies.
  • a selection system has been developed using the human cell line Hela and the vectors p25 and p54.
  • Hela cells were transfected with the vector p24 and then maintained in culture for 2 weeks in the presence of puromycin (2 ⁇ g / ml).
  • puromycin (2 ⁇ g / ml).
  • Several cell clones from this selection were selected based on the functionality of the TK gene (cell suicide in the presence of GCV, typically from 1 to 20 ⁇ g / ml for one week).
  • the genomic DNA of these clones was analyzed by PCR to verify the integrity of the promoter region and of TIRES of the integrated p24 vector.
  • the overall efficiency of a screening depends on several parameters, including mainly (i) the nature of the library of molecules used, (ii) the size of the library and ( ⁇ i) the intrinsic efficiency of the system. Selection.
  • the intrinsic efficiency of the detection system is the result of two parameters: (i) system leakage and ( ii) system selectivity.
  • leakage from the system is meant the percentage of cells which will react positively during screening, despite the intervention of any effector molecule. It can be either (i) variation of expression and / or mutation and / or deletion of the selection genes (in the broad sense of the word gene: regulatory elements and / or coding part) and / or (ii) an experimental artifact inherent in the cell line used. In all cases, this will result in a loss of selectivity of the system, which will inevitably lead to the emergence of "false positives”. In order to alleviate this problem, the solution disclosed in this present invention consists in using cell lines containing several crossed selection systems (or filters).
  • the Hela-24C and Hela-24C / 54A cells were described in the previous example.
  • the Hela-54A cells are derived from a cell clone Hela-24C / 54A resistant to suicide by GCV, the analysis of genomic DNA of which by PCR revealed a deletion of the selection system 1.
  • Simple screening on selection unit # 24 20,000 cells are trypsinized, seeded in a box 10 cm in diameter, then after adhesion to the support, incubated in the presence of 1 ⁇ g / ml of GCV (protocol A) or 0.25 ⁇ g / ml of GCV (protocol B) for 48 hours. The cells are then maintained in culture in medium without GCV and the resistant clones counted after 6 days.
  • Simple screening on selection unit # 54 20,000 cells are trypsinized, then sorted using FACS according to two protocols (protocols C and D; see FIG. 6) to select the cells whose fluorescence is reduced. The cells are then seeded in a box 10 cm in diameter. The cells are maintained in culture and the resistant clones counted after 6 days. Double screening on selection units # 24 and # 25: 20,000 cells are trypsinized, then sorted with FACS to select the cells whose fluorescence is reduced. The cells are then seeded in a 10 cm diameter dish and, after adhesion to the support, incubated in the presence of 1 ⁇ g / ml of GCV or 0.25 ⁇ g / ml of GCV for 48 hours. The cells are then maintained in culture in medium without GCV and the resistant clones counted after 6 days.
  • Table 1 summarizes the results obtained in "percentage of leakage" (Number of clones obtained / Number of starting cells x 100)
  • the use of the Hela-24C / 54A line makes it possible to carry out a screening based on a double filtering system. Given the almost independent functioning (see system leak) of the two selection units of the Hela-24C / 54A cell line, the screening process is rationally very targeted on TIRES cMYC. By comparison, a system which would have only one single filter (p54 for example), could not eliminate molecules whose action would be to lower the transcriptional activity of the Ubc promoter or to inhibit the fluorescence of the protein Hygro GFP. Thus, such a system would have less good selectivity than the system consisting of the Hela-24C / 54A line.
  • the Hela-24C / 54A line has, due to a limited system leakage and better selectivity, advantageous characteristics which none of the cell systems containing only one of the two selection units of the Hela-24C line have. / 54A.
  • Example 6 Cellular system for the screening of modulating compounds of the mechanism of direct entry of the ribosomes governed by TIRES Apaf-1.
  • the protein Apaf-1 is a factor involved in the process of cell death by apoptosis.
  • the expression of Apaf-1 is translationally regulated by a direct ribosome entry site (IRES).
  • IRES Apaf-1 thus constitutes a potential target for modifying the sensitivity of cells to Tapoptosis.
  • a selection system has been developed from the human cell line Hela and the vectors p51 and p56.
  • Hela cells were transfected with the vectors p51 and p56 and then maintained in culture in the presence of hygromycin (200 ⁇ g / ml) and puromycin (2 ⁇ g / ml) for 15 days.
  • the cell clones resulting from this selection (Hela-51/56 clones) have the characteristics required for carrying out a cell screening of TIRES apaf-1 modulating molecules.
  • cell screening is meant that a plurality of test compounds can be placed in the presence of a plurality of Hela-51/56 cells, which have the capacity to designate, by virtue of their viability and the intensity of their fluorescence, the presence of effector molecules having a TIRES-modulating activity Apaf-1 .
  • Example 7 Cellular system for the screening of IRES modulating compounds cMyc and Apaf-1.
  • This example describes a cell screening system oriented towards the selection of modulating molecules of both TIRES cMyc and TIRES Apaf-1.
  • the potential targets of this screening correspond to any cellular element required for the functioning of these two IRES.
  • a cellular system containing 2 selection units has been developed.
  • the first selection unit consists of the vector p82.
  • the second unit consists of the vector p56.
  • the Hela cells were transfected with the vectors p82 and p56 and then maintained in culture in the presence of hygromycin (200 ⁇ g / ml) and puromycin (2 ⁇ g / ml) for 18 days.
  • the cell clones resulting from this selection (Hela-82/56 clones) have the desired characteristics for carrying out a cell screening of TIRES modulating molecules cMyc and Apaf-1.
  • cell screening is meant that a plurality of test compounds can be placed in the presence of a plurality of Hela-82/56 cells, which have the capacity to designate, by virtue of their viability and the intensity of their fluorescence, the presence of effector molecules having an activity modulating IRES cMYC and Apaf-1.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

La présente invention se rapporte à une nouvelle Méthode de criblage permettant l'identification de composés modulant de manière ciblée l'expression de gènes, caractérisée en ce qu'elle comprend (i) la mise en contact d'un composé test avec au moins deux unités de sélection comprenant chacune au moins un gène de sélection distinct placé sous le contrôle d'un promoteur et d'éléments d'initiation de la traduction, dans des conditions permettant l'expression desdits gènes de sélection, et (ii) la détermination de la capacité du composé test à moduler l'expression desdits gènes de sélection. Elle concerne également des lignées cellulaires dont les cellules comprennent au moins deux unités de sélection telles que définies ci-dessus, leur préparation et leurs utilisations. Elle concerne également l'utilisation des composés identifiés pour prévenir ou traiter les pathologies entraînant une dérégulation traductionnelle telles que les cancers.

Description

METHODES DE CRIBLAGE DE MOLECULES MODULATRICES DE L'EXPRESSION DE GENES, LIGNEES CELLULAIRES, PREPARATION ET UTILISATIONS.
La présente invention concerne des compositions et méthodes de criblage, permettant l'identification de molécules capables de moduler l'expression de gènes. Elle concerne également des outils, kits, compositions, vecteurs, lignées cellulaires et constructions génétiques, pour la mise en œuvre de telles méthodes et leurs utilisations dans le domaine de la santé humaine ou animale, notamment pour prévenir ou traiter les pathologies entraînant une dérégulation de l'expression génétique telles que les cancers, ou en recherche expérimentale par exemple. Les méthodes de l'invention reposent plus particulièrement sur l'utilisation d'un double système de sélection, conférant une meilleure sensibilité et sélectivité. Elles comprennent avantageusement (i) la mise en contact d'un composé test avec au moins deux unités de sélection comprenant chacune au moins un gène de sélection distinct placé sous le contrôle d'un promoteur et d'éléments d'initiation de la traduction, dans des conditions permettant l'expression desdits gènes de sélection, et (ii) la détermination de la capacité du composé test à moduler l'expression des gènes de sélection.
La possibilité d'identifier des composés agissant sur l'expression des protéines offre de nombreuses applications, dans les domaines thérapeutiques, agricoles, de recherche, etc.. Actuellement, la plupart des stratégies développées dans ce but visent à identifier des composés modulant l'activité biologique d'une protéine ou son expression en général. Toutefois, ces stratégies ne présentent pas toujours une spécificité et une fiabilité suffisantes pour permettre la sélection de composés d'intérêt. La présente invention s'intéresse plus particulièrement à des mécanismes précis impliqués dans le processus global d'expression de gènes, qui confèrent aux technologies et compositions développées une meilleure fiabilité et prédictibilité. En particulier, l'invention décrit des outils et méthodes adaptés à l'identification de composés modulant la transcription et/ou l'initiation de la traduction.
Les termes "expression des gènes" et "expression génique" renvoient plus particulièrement ici aux mécanismes suivants : (i) la transcription, (ii) la maturation des ARN pré-messagers, (iii) l'export des ARNm vers le cytoplasme et (iv) la traduction des ARNm.
La transcription permet à la séquence nucléotidique d'un gène d'être copiée sous forme d'un brin d'ARN (ARN pré-messager). Chez les eucaryotes, cette étape est effectuée dans le noyau par les ARN polymérases. Le signal d'initiation de la transcription est contenu dans le promoteur proximal du gène. Dans cette région est localisée la boîte TATA, présente dans presque tous les gènes, ainsi que les boîtes CCAAT et GC dans un moins grande fréquence. L'initiation de la transcription nécessite le recrutement d'un complexe multiprotéique dans la région promotrice. Ce complexe est, notamment, formé de facteurs transcriptionnels (TF), parmi lesquels seul TFIID se fixe sur la boîte TATA. TFIIA stabilise le complexe alors que TFUD-ADN, TFIIB et TFIIE assurent la liaison avec TARN polymérase. Enfin TFIIF possède une activité hélicase permettant de dénaturer la double hélice de l'ADN au niveau du site d'initiation de la transcription. Outre le promoteur proximal, des séquences distales régulent la transcription. Ces éléments cis-régulateurs, plus ou moins éloignés (en amont ou même en aval) du site d'initiation de la transcription, fixent des facteurs "trans-régulateurs". Parmi ces séquences régulatrices, on distingue les "enhancers" ou "activateurs" ainsi que les "silencers" ou "séquences extinctrices".
L'ARNm eucaryote mature se distingue des ARNm procary otes et de certains ARNm viraux par des modifications post-transcriptionnelles particulières à ses extrémités 5' et 3'. L'ARNm est «coiffé» à son extrémité 5' et présente une séquence polyadénylée à son extrémité 3'. La coiffe est nécessaire à l'épissage des ARN pré-messagers, facilite l'export nucléocytoplasmique des ARNm matures, augmente leur stabilité et, enfin, améliore l'efficacité de la traduction en interagissant spécifiquement avec certains facteurs d'initiation. La séquence poly A est impliquée dans l'export nucléocytoplamsique des ARNm matures et dans le contrôle de la stabilité des ARNm dans le cytoplasme. En outre, elle serait également indispensable à la traduction efficace des ARNm.
Une autre étape de la maturation des ARNm consiste en l'élimination constitutif ou alternatif des séquences intervenantes (ou introns) et à "rabouter" les exons. Cette opération complexe, appelée épissage, requiert la participation de nombreux facteurs cellulaires.
En général, les ARNm eucaryotes ne comportent qu'une seule phase de lecture (cistron ou ORF pour «Open Reading Frame») délimitée en 5' par un codon d'initiation de la traduction (généralement AUG) et en 3' par un codon d'arrêt de la traduction ou codon stop (UAG, UGA ou UAA). Ils peuvent cependant parfois contenir plusieurs phases de lecture (uORF pour «upstream ORF»). La région située entre la coiffe et la phase de lecture principale est appelée région 5' non traduite (5'UTR pour «5'-Untranslated Région»). Dans la majorité des cas, le site d'initiation de la traduction est le codon AUG le plus proche de l'extrémité 5' de l'ARNm.
La traduction des ARNm requiert la participation d'organites spécialisés : les ribosomes. Elle se déroule en trois phases successives : (1) l'initiation de la traduction, phase durant laquelle un ribosome compétent pour la traduction se constitue sur un ARNm, (2) l'élongation qui constitue la phase de synthèse de la protéine et (3) la terminaison qui marque la fin de la synthèse protéique avec la dissociation du ribosome.
L'initiation de la traduction a pour but de positionner correctement un ribosome sur un ARNm de façon à ce que le déclenchement de la synthèse protéique s'opère sur le bon codon d'initiation. On distingue plusieurs mécanismes d'initiation de la traduction parmi lesquels le «balayage» des ribosomes, le mécanisme d'entrée directe des ribosomes (mécanisme IRES- dépendant), le mécanisme de «shunt», encore appelé «transfert du ribosome», ainsi que les mécanismes hybrides impliquant au moins deux des mécanismes précédemment cités.
Le modèle d'initiation par balayage des ribosomes requiert la participation de nombreux facteurs d'initiation appelés elFs (eukaryotic Initiation Factor) et comprend quatre étapes : (1) l'association de l'ARNt initiateur (Met-tRNA) et des facteurs d'initiations elFlA, eIF3, eIF5 et eIF2 avec la petite sous-unité ribosomale 40S pour former le complexe de pré-initiation 43S ; (2) la formation du complexe de pré-initiation 43 S ; (3) la fixation du complexe 43 S à PARNm ; (4) le balayage du complexe de pré-initiation et la fixation de la grande sous-unité ribosomale. Ce mécanisme postule que les ribosomes doivent dérouler les structures secondaires de l'ARNm pour permettre leur migration.
Le mécanisme de transfert du ribosome permet le déplacement de ce dernier en aval d'une structure secondaire sans que cette dernière n'ait apparemment été déroulée. Les ribosomes effectuent un «saut» le long de la séquence de l'ARNm. Il faut entendre par «sites donneurs et accepteurs de shunt», les régions minimales de l'ARNm capables de diriger les étapes initiales et finales du mécanisme du «shunt».
Le mécanisme «d'entrée directe» des ribosomes est un mécanisme alternatif qui requiert la présence d'un élément structural particulier de l'ARNm (un «IRES» : «Internai Ribosomal Entry Segment»). Ce mécanisme ne fait pas intervenir la reconnaissance de la coiffe par le facteur eIF4F et permet néanmoins l'initiation de la traduction. L'élément IRES est formé de domaines très structurés de l'ARN qui, en association avec des protéines cellulaires, dirigent les ribosomes sur un codon d'initiation spécifique. Ce mécanisme gouverne la synthèse d'un certain nombre de protéines cellulaires, en particulier pendant la division cellulaire et dans certaines conditions de stress cellulaire (modifications de l'environnement de la cellule tels que des changements de température, des variations des taux de O et CO2, l'appauvrissement en nutriments et en facteurs de croissance, la présence de molécules toxiques).
Le brevet US 6,171,821 Bl décrit une méthode de criblage de molécules capables de moduler le mécanisme alternatif d'initiation de la traduction via la séquence IRES du gène XI AP et prévoit une méthode de normalisation des résultats. La demande de brevet WO 99/61613 décrit quant à elle une méthode de criblage de composés capables de moduler l'interaction entre un facteur d'initiation de la traduction IRES-dépendant et un ligand, sans toutefois chercher à cibler le mécanisme général de traduction IRES-dépendant. Il existe donc un réel besoin de disposer d'outils et de méthodes permettant d'identifier de manière simple et fiable des composés permettant de moduler de manière ciblée l'expression de gènes, et notamment les mécanismes d'initiation de la traduction, qui soient utilisables dans le cadre de la préparation de médicaments destinés au traitement de pathologies, notamment de pathologies liées à une dérégulation traductionnelle, telles que les cancers.
La présente invention décrit à présent une nouvelle approche pour l'identification, la sélection, la caractérisation ou l'optimisation de composés capables de moduler de manière ciblée l'expression de gènes. La présente invention décrit en particulier de nouvelles méthodes pour l'identification, la sélection, la caractérisation ou l'optimisation ex vivo ou in vitro, de composés capables de moduler de manière ciblée, i.e. stimuler ou inhiber, l'initiation de la traduction ou la transcription. La présente invention décrit en outre de nouvelles lignées cellulaires et compositions pour le criblage de tels composés. Les méthodes selon l'invention sont basées sur la mise en place d'une double sélection particulièrement avantageuse qui permet d'accroître la spécificité desdits composés.
Les méthodes de criblage selon l'invention permettent plus particulièrement l'identification de composés capables de moduler, de manière ciblée, l'efficacité ou l'exécution d'un ou plusieurs mécanismes d'initiation de la traduction tels que le «balayage» des ribosomes, le mécanisme d'entrée directe des ribosomes (mécanisme IRES-dépendant), le mécanisme de «shunt» (encore appelé «transfert du ribosome») ou un mécanisme hybride impliquant au moins deux des mécanismes précédemment cités. Un autre objet particulier de l'invention réside dans une méthode de criblage de molécules agissant de manière ciblée sur l'activité transcriptionnelle d'un promoteur.
L'action «de manière ciblée» des composés criblés par les méthodes de l'invention indique que ces composés ont une action principale sur une étape ou un mécanisme déterminé du processus d'expression, qui garantit leur plus grande spécificité. Ainsi, les méthodes de l'invention permettent un criblage de molécules agissant de manière ciblée (spécifique ou principale) sur les mécanismes d'initiation de la traduction, et n'agissant pas (ou pas directement ou principalement) sur d'autres mécanismes, tels que la transcription, l'épissage, l'export des ARNm, etc. De la même manière, les méthodes de l'invention adaptées au criblage de composés agissant de manière ciblée sur les mécanismes de transcription fournissent des composés n'ayant pas d'activité directe ou principale sur d'autres étapes du processus d'expression.
Ainsi, il est possible, en adaptant les éléments mis en œuvre, de cibler certains mécanismes de l'expression des gènes et de fournir des molécules ayant un profil biologique mieux défini et plus adapté à une utilisation thérapeutique. La haute sélectivité du système de criblage de l'invention permet en outre de tester un grand nombre de composés et d'éviter l'analyse fastidieuse d'un grand nombre de «faux positifs». Les lignées cellulaires et méthodes selon l'invention offrent à présent aux biologistes et aux industriels de nouvelles solutions pour l'identification de tels composés, fondées sur des méthodes rapides, sensibles et automatisables.
Un premier objet de l'invention réside plus particulièrement dans des méthodes de criblage permettant l'identification de composés modulant de manière ciblée l'expression de gènes comprenant (i) la mise en contact d'un composé test avec au moins deux unités de sélection comprenant chacune au moins un gène de sélection distinct placé sous le contrôle d'un promoteur et d'éléments d'initiation de la traduction, dans des conditions permettant l'expression desdits gènes de sélection, et (ii) la détermination de la capacité du composé test à moduler l'expression desdits gènes de sélection.
Un autre objet de l'invention réside dans une méthode de criblage permettant l'identification de composés modulant de manière ciblée le mécanisme d'initiation de la traduction, caractérisée en ce qu'elle comprend : (i) la mise en contact d'un composé test avec au moins deux unités de sélection comprenant chacune au moins un gène de sélection distinct placé sous le contrôle d'un promoteur (de préférence distinct) et d'éléments d'initiation de la traduction, dans des conditions permettant l'expression desdits gènes de sélection, et (ii) la détermination de la capacité du composé test à moduler l'expression desdits gènes de sélection.
Un autre objet de l'invention réside dans une méthode de criblage permettant l'identification de composés modulant de manière ciblée la transcription de gènes, caractérisée en ce qu'elle comprend : (i) la mise en contact d'un composé test avec au moins deux unités de sélection comprenant chacune au moins un gène de sélection distinct placé sous le contrôle d'un promoteur et d'éléments d'initiation de la traduction (de préférence distincts), dans des conditions permettant l'expression desdits gènes de sélection, et (ii) la détermination de la capacité du composé test à moduler l'expression desdits gènes de sélection.
Un autre objet de l'invention réside dans une méthode selon l'invention dans laquelle les séquences IRES sont choisies parmi les séquences IRES des gènes ODC, c-myc, c-sis, FGF-2, PDGF-2, IGF-2, VEGF, apaf-1, XIAP, eIF4G, EMCV, HCV ou encore toute IRES fonctionnelle dans le système utilisé. L'utilisation de séquences IRES d'origines virales (HCV, EMCV...) permettra l'identification de composés modulateurs de ces éléments viraux et sera par conséquent particulièrement utile pour la mise au point d'agents antiviraux
Un autre objet de l'invention concerne une cellule comprenant au moins deux unités de sélection comprenant chacune au moins un gène de sélection distinct placé sous le contrôle d'un promoteur et d'éléments d'initiation de la traduction, ainsi qu'une population cellulaire caractérisée en ce que une partie au moins des cellules qui la constituent comprenne au moins deux unités de sélection telles que définies ci-dessus. Les cellules sont typiquement des cellules recombinantes modifiées par insertion simultanée ou séquentielle des unités de sélection.
Un autre objet de l'invention réside dans un kit pour la mise en œuvre de méthodes de criblage caractérisé en ce qu'il comprend une population (e.g., une lignée) cellulaire telle que définie ci-dessus.
L'invention concerne également l'utilisation d'un composé obtenu grâce à une méthode de criblage selon l'invention pour la préparation d'un médicament destiné au traitement d'une pathologie entraînant l'expression anormale d'une protéine, et en particulier du cancer.
Comme il sera décrit plus en détails dans la suite du texte, l'invention peut être mise en œuvre dans différents systèmes (cellulaires ou acellulaires), avec différents types de constructions, gènes de sélection et éléments régulateurs afin de cibler l'activité principale des composés criblés. L'invention est utilisable en recherche, criblage industriel, thérapie, modélisation moléculaire, etc. Systèmes de sélection/criblage
Comme indiqué, l'invention repose notamment sur l'utilisation d'un double système de sélection, permettant d'améliorer l'efficacité des procédés. Le procédé fait appel, de manière générale, à l'utilisation de deux unités de sélection comprenant chacune au moins : un gène de sélection distinct, c'est-à-dire différent d'une unité à l'autre, placé sous le contrôle d'un promoteur et d'éléments d'initiation de la traduction.
Les unités de sélection sont donc des molécules d'acides nucléiques comprenant un ensemble de régions fonctionnelles, conduisant dans des conditions adaptées à l'expression du gène de sélection. Les unités de sélection sont typiquement de l'ADN ou de l'ARN, préférentiellement de l'ADN double-brin.
Le terme «gène de sélection» au sens de l'invention désigne ainsi toute région d'acide nucléique codant un produit protéique qui peut être mis en évidence. Dans ce contexte, le terme «gène de sélection» désigne uniquement la région codante.
Chaque unité de sélection comprend au moins un gène de sélection placé sous le contrôle d'un promoteur et d'éléments d'initiation de la traduction.
Les éléments d'initiation de la traduction sont compris dans une région nucléique non traduite, typiquement localisée en 5' du gène de sélection. Cette dernière peut contenir un ou plusieurs IRES et/ou des éléments impliqués dans les mécanismes de shunt. Néanmoins, d'autres régions de l'ARNm (la région 3' non traduite et la région codante par exemple) peuvent contenir des éléments impliqués dans le contrôle de l'initiation de la traduction. Les éléments d'initiation de la traduction comprennent de préférence une région non traduite (5'UTR) comprenant, de préférence, un ou plusieurs éléments IRES et/ou des éléments impliqués dans le mécanisme de transfert du ribosome, par exemple des sites donneur et accepteur de shunt. Pour le criblage de composés agissant de manière ciblée (ou spécifiquement) sur l'initiation de la traduction d'un ARNm particulier ou sur un même mode d'initiation de la traduction (mécanisme d'entrée directe, shunt ou balayage par exemple), les éléments d'initiation de la traduction de chacune des unités de sélection sont de préférence identiques, et correspondent par exemple à la région 5' non traduite dudit ARNm. Les éléments d'initiation de la traduction de chacune des unités de sélection peuvent également être différents, selon un autre mode préféré, adapté plus particulièrement au criblage de composés modulant le mécanisme général d'un ou de plusieurs modes d'initiation de la traduction ou le mécanisme de la transcription.
Les séquences IRES sont choisies préférentiellement parmi les séquences IRES des gènes ODC (Pyronnet, S., L. Pradayrol, et N. Sonnenberg N. A cell cycle-dependent internai ribosome entry site. Molecular cell; 2000; (5) 607-616), c-myc (Stoneley M, Paulin FE, Le Quesne JP, Chappell SA, Willis AE.; c-myc 5' untranslated région contains an internai ribosome entry segment; Oncogene; 1998, Jan 22; 16(3):423-8), c-sis (Bernstein J, Sella O, Le SY, Elroy-Stein O. PDGF2/c-sis mRNA leader contains a differentiation-linked internai ribosomal entry site (D-IRES. J Biol. Chem. 1997, Apr 4; 272(14):9356-62), FGF-2 (Vagner, S., M.C. Gensac, A. Maret, F. Bayard, F. Amalric, H. Prats, et A.C. Prats. Alternative translation of human fibroblast growth factor 2 mRNA occurs by internai entry of ribosomes. Mol. Cell. Biol. 1995, (15):35-44), PDGF-2 (Bernstein J., Sella O., Le SY, Elroy-Stein O.; PDGF2/c-sis mRNA leader contains a differentiation-linked internai ribosomal entry site (D- IRES. J Biol. Chem. 1997, Apr 4; 272(14):9356-62), IGF-2 (Henk Teerink, Harry O. Voorma, Adri A. M. Thomas. The human insulin-like growth factor II leader 1 contains an internai ribosomal entry site. Biochimica et Biophysica Acta. 1995, 403-408), VEGF (Akiri G, Nahari D, Finkelstein Y, Le S Y, Elroy-Stein O, Levi BZ. Régulation of vascular endothelial growth factor (VEGF) expression is mediated by internai initiation of translation and alternative initiation of transcription. Oncogene. 1998 Jul 16;17(2):227-36), apaf-1 (Coldwell MJ, Mitchell SA, Stoneley M, MacFarlane M, Willis. Initiation of Apaf-1 translation by internai ribosome entry. Oncogene. 2000 Feb 17;19(7):899-905), XIAP (Holcik M, Korneluk RG. Functionnal characterization of the X-linked inhibitor of apoptosis (XIAP) internai ribosome entry site élément: rôle of La autoantigen in XIAP translation. Mol. Cell. Biol. 2000 Jul;20(13):4648-57), eIF4G (Gan W, LaCelle M, Rhoads RE. Functionnal characterization of the internai ribosome entry site of eIF4G mRNA. J Biol Chem. 1998 Feb 27 ;273(9) :5006- 12), EMCV (Jang SK, Krausslich HG, Nicklin MJ, Duke GM, Palmenberg AC, Wimmer E. A segment of the 5' nontranslated région of encephalomyocarditis virus RNA directs internai entry of ribosomes during in vitro translation. J. Virol.. 1988 Aug ;62(8) :2636-43), HCV (Pelletiet J. et Sonnenberg N. Internai initiation of translation of eukaryotic mRNA directed by a séquence derived from poliovirus RNA. Nature. 1988. (334) :320-43) mais aussi PV, HRV, FMDV, HAV, TEV, BVDV, CSFV, MLV, HaMSV, HTLV, RevA, SIV, TGEV, RhPV, Bip, AMLl, NRF ou encore toute IRES fonctionnelle dans le système cellulaire utilisé, si un système cellulaire est utilisé.
Tout autre élément d'initiation de la traduction (du type «shunt» ou balayage, par exemple) peut être choisi et incorporé à une unité de sélection selon l'invention par des techniques connues de l'homme du métier. Ces éléments peuvent correspondre à la région 5' non traduite de n'importe quel ARNm pour lequel on veut produire des modulateurs spécifiques du mécanisme d'initiation de la traduction.
Les promoteurs des unités de sélection contrôlant l'expression des gènes de sélection peuvent être identiques ou différents d'une unité à l'autre. Lorsque deux promoteurs différents sont utilisés, cela favorise le criblage de composés agissant de manière ciblée sur les mécanismes d'initiation de la traduction, en particulier lorsque ces éléments sont identiques au sein des deux unités. Lorsque deux promoteurs identiques sont utilisés, cela favorise le criblage de composés agissant de manière ciblée sur les mécanismes de transcription, en particulier lorsque les éléments d'initiation de la traduction sont différents d'une unité à l'autre.
Différents types de promoteurs peuvent être utilisés pour la mise en œuvre de l'invention. Il peut s'agir de promoteurs forts ou faibles, ubiquitaires ou spécifiques de tissus, constitutifs ou régulés. On peut citer les promoteurs viraux, cellulaires (par exemple de gènes domestiques), bactériens, etc., de manière générale tout promoteur transcriptionnel fonctionnel dans le système cellulaire ou acellulaire utilisé. On peut citer à titre d'exemples spécifiques de promoteurs viraux les promoteurs CMV, SV40, LTR, TK, etc., comme exemple de promoteurs de gènes domestiques, les promoteurs des gènes β-actine, PGK, apolipoprotéine, albumine et Ubiquitine C, et comme exemple de promoteurs bactériens les promoteurs pLac, pTrp, etc.
Chaque unité de sélection utilisée dans le cadre d'une méthode de criblage selon l'invention, comprend, de préférence, au moins un gène de sélection, les gènes de sélection étant, de préférence, différents d'une unité de sélection à l'autre.
Le gène de sélection peut être, de manière générale, tout gène dont l'expression peut être détectée, observée ou mesurée, par toute technique connue (auxotrophie, fluorescence, luminescence, résistance, etc.). Tout gène connu de l'homme du métier dont l'activité ou la présence dans des extraits biologiques est (facilement) mesurable peut, d'une manière générale, être utilisé comme gène de sélection pour la mise en œuvre du procédé de criblage selon l'invention.
Selon un premier mode particulier de réalisation de l'invention, le gène de sélection est un gène de sélection négative. Parmi les gènes de sélection négative sont préférés les gènes codant pour une thymidine kinase (notamment la thymidine kinase du virus de l'herpès humaine (HSV-TK)), la cytosine déaminase d'E. coli (CodA), l'hypoxanthine phosphoribosyl transférase (gpt), la nitroréductase d'E. coli (NTR), etc.. Il existe pour ces enzymes une multitude de mutants ayant des substrats différents susceptibles d'être utilisés pour leurs propriétés particulières.
Selon un autre mode particulier de réalisation de l'invention, le gène de sélection est un gène de sélection positive. Parmi les gènes de sélection positive, on peut citer à titre d'exemples préférés les gènes hygro (de résistance à l'hygromycine), néo (de résistance à la néomycine), phleo (de résistance à la phléomycine), puro (de résistance à la puromycine) et bla (de résistance à la blasticidine).
Selon un troisième mode particulier de réalisation de l'invention, le gène de sélection est un gène rapporteur. Il peut s'agir, par exemple, du gène codant pour la luciférase (plus particulièrement pour la luciférase de luciole ou pour celle de Renilla), pour la phosphatase alcaline sécrétée, pour la galactosidase, pour la lactamase, pour la Chloramphenicol acetyl transférase (CAT), pour l'hormone de croissance humaine (hGH), pour la β-glucuronidase (Gluc) ou pour la Green fluorescent protein (GFP) et ses variants ou dérivés (ΕGFP, ΕCFP, ΕBFP), etc.
Un objet préféré de l'invention concerne une méthode selon l'invention dans laquelle les gènes de sélection sont des gènes de sélection négative, choisis de préférence parmi le gène de la thymidine kinase du virus de l'herpès humain (HSV-TK), le gène de la cytosine déaminase d'E. coli (CodA), le gène de l'hypoxanthine phosphoribosyl transférase (HPRT), le gène de la xanthine-guanine phosphoribosyl transférase (gpt) et le gène de la nitroréductase d'E. coli (NTR), de préférence TK ou CodA, et/ou des gènes rapporteurs, choisis de préférence parmi GFP, ΕGFP, ΕCFP et ΕBFP, et/ou des gènes de sélection positive, choisis de préférence parmi les gènes hygro, néo, phleo, puro et bla.
Par ailleurs, dans un mode de réalisation particulier, une, plusieurs ou chacune des unités de sélection comporte plusieurs gènes de sélection, de préférence plusieurs gènes de sélection appartenant à une catégorie différente telle que définie ci-dessus, typiquement un gène de sélection négative et un gène de sélection positive. Un autre objet préféré de l'invention concerne une méthode dans laquelle chaque unité de sélection comporte un gène de sélection positive et un gène de sélection négative.
L'utilisation de telles unités de sélection permet d'une part d'améliorer l'efficacité de la méthode et d'autre part de faciliter l'établissement (et notamment la sélection) in vitro ou ex vivo de cellules (e.g. d'une lignée stable) contenant les unités). Pour ce faire, le second gène de sélection (ou l'un au moins des deux) est avantageusement un gène de sélection positive, choisi de préférence parmi hygro, néo, phleo, puro et bla. Les deux gènes de sélection présents dans chaque unité sont différents l'un de l'autre. En outre, préférentiellement, les gènes de sélection présents sur une unité sont distincts (i.e., différents) des gènes de sélection présents sur une autre unité utilisée de manière concomitante. Dans un autre mode de réalisation, il est possible d'utiliser un gène de sélection ayant à la fois des propriétés de gène de sélection positive et négative.
Le gène de sélection positive permettant l'établissement d'une lignée stable peut être «fusionné» avec le ou les gènes de sélection (négatif, rapporteur et/ou positif) présents au sein de chaque unité de sélection. A titre d'exemples de telles fusions on peut citer notamment les combinaisons ou fusions TK-bla, TK-hygro, TK-neo, TK-puro, CodA-hygro, CodA-neo, CodA-puro, CodA-bla, neo-HPRT, hygro-NTR, puro-gtp, ou tout autre combinaison fonctionnelle, notamment les gènes de fusion bla-TK, hygro-TK, neo-TK, etc.. Le gène de sélection positive permettant l'établissement d'une lignée stable peut également être présent sur un autre cadre de lecture (distinct de celui des gènes de sélection négatif, rapporteur et/ou positif) et fonctionner par réinitiation, ou encore être porté par une autre unité transcriptionnelle .
Le promoteur (P), les éléments d'initiation de la traduction (5'UTR) avec ou sans IRES et/ou sites donneur et accepteur de shunt, le ou les gènes de sélection (S) éventuellement fusionnés ou reliés par réinitiation, sont agencés de manière fonctionnelle dans l'unité de sélection, c'est- à-dire de sorte que le promoteur contrôle l'expression desdits gènes et que leur expression puisse être modulée par un composé test. Les unités de sélection selon l'invention comprennent en outre, de préférence, une séquence poly A de terminaison de la transcription précédée d'une région 3'-UTR. Généralement, ces régions sont donc disposées dans l'ordre suivant, dans l'orientation 5'->3' : (P)-(5'UTR)-(S)-(3'UTR)-(polyA). Lorsque l'unité comporte plusieurs gènes de sélection, par exemple un gène de sélection négative (S-), un gène de sélection positive (S+) ou un gène ayant plusieurs propriétés de sélection à la fois positive et négative (S-/+), ces régions sont avantageusement disposées dans l'ordre suivant, dans l'orientation 5*->3' : (P)-(5'UTR)-(S-)-(S+)-(3'UTR)-(polyA). Il est entendu que tout autre agencement fonctionnel peut être envisagé par l'homme du métier sans départir de la présente invention.
Typiquement, chaque unité de sélection est comprise dans un vecteur propre (c'est-à-dire que chaque unité est comprise dans une vecteur distinct ou différent). Il peut s'agir de tout vecteur adapté au système utilisé, tel qu'un plasmide, virus, phage, episome, chromosome artificiel, etc. On peut citer à titre d'exemple des vecteurs plasmidiques, tels que les plasmides bactériens pQE70, pDIO, phagescript, ρsiX174, p.BluescriptSK, ρNH46A; pKK233-3, ρRIT5; pSV2CAT, pSG; pSVK3, pBPV, pMSG et pSVL, disponibles dans le commerce, le bactériophage PI (Sternberg N.L. (1992;1994)), un adénovirus humain de type2 ou 5 ou d'origine animale (WO94/28152, WO97/00326, WO95/00655), et des rétrovirus (MLV, FLV, etc.). Le vecteur est de préférence un plasmide (c'est-à-dire typiquement une molécule circulaire, de préférence à base d'ADN double-brin), qui peut être linéarisé. Les unités de sélection peuvent être introduites dans la cellule par transfection ou transduction virale, et se répliquer sous forme autonome ou s'intégrer dans le génome de la cellule hôte, par exemple par recombinaison homologue.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, les gènes de sélection des unités de sélection sont portés par un vecteur unique, de préférence un plasmide, et, tout en étant placés sous le contrôle d'éléments IRES et/ou sites donneur et accepteur de shunt identiques ou différents, sont liés fonctionnellement par ces derniers.
Un objet particulier de l'invention concerne l'utilisation, dans le cadre d'une méthode de criblage permettant l'identification de composés modulant le mécanisme d'initiation de la traduction, d'au moins deux unités de sélection comprenant chacune des éléments d'initiation de la traduction identiques et au moins un gène de sélection, le ou les gènes de sélection de chaque unité de sélection étant placés sous le contrôle du même promoteur.
Un objet préféré de l'invention concerne ainsi une méthode de criblage dans laquelle chaque unité de sélection ou vecteur comprend un promoteur différent, un gène de sélection différent, une région 5' UTR située entre ledit promoteur et ledit gène de sélection au sein de l'unité de sélection et ladite région 5'UTR étant identique ou différente d'un vecteur ou d'une unité à l'autre. Préférentiellement, chaque unité de sélection est comprise dans un vecteur distinct.
Un autre objet préféré concerne une méthode de criblage dans laquelle chaque unité de sélection ou vecteur comprend un promoteur différent contrôlant l'expression d'une unité bicistronique composée d'un gène de sélection positive, d'un élément de type IRES et/ou shunt et d'un gène de sélection négative, ledit élément IRES étant identique ou différent d'un vecteur ou d'une unité à l'autre. Préférentiellement, chaque unité de sélection est comprise dans un vecteur distinct. Un objet préféré de l'invention concerne une méthode de criblage dans laquelle les unités de sélection, situées au sein d'un même vecteur, comprennent des gènes de sélection différents et sont placées sous le contrôle d'un promoteur commun et d'éléments IRES identiques ou différents.
Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, les unités de sélection telles que décrites précédemment (ou le ou les vecteurs les contenant), sont par ailleurs contenues dans une cellule permettant l'expression des gènes de sélection. Le composé test ou un précurseur de celui-ci peut alors être mis en contact avec la cellule.
A cet égard, l'invention est également relative à une cellule comprenant au moins deux unités de sélection comprenant chacune au moins un gène de sélection distinct placé sous le contrôle d'un promoteur et d'éléments d'initiation de la traduction. L'invention est également relative à une cellule comprenant au moins un vecteur tel que défini ci-avant. L'invention est également relative à une population de cellules dont les cellules (ou une partie d'entre-elles) comprennent au moins deux unités de sélection ou au moins un vecteur tels que définis ci-avant. Les éléments d'initiation de la traduction peuvent comprendre une région non traduite (5'UTR) comprenant de préférence un ou plusieurs éléments IRES et/ou des éléments impliqués dans le mécanisme de transfert du ribosome. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, les éléments d'initiation de la traduction des unités de sélection sont identiques. Selon un autre mode préféré, les promoteurs des unités de sélection sont différents. Les gènes de sélection utilisés sont de préférence des gènes de sélection négative, choisis préférentiellement parmi Tk, HPRT, NTR, gpt et CodA et/ou des gènes rapporteurs, choisis de préférence parmi EGFP, ECFP, EBFP, et/ou des gènes de sélection positive, choisis de préférence parmi les gènes hygro, néo, phleo, puro et bla. Les séquences IRES sont quant à elles choisies de préférence parmi les séquences IRES des gènes ODC, c-myc, c-sis, FGF-2, PDGF-2, IGF-2, VEGF, apaf- 1, XIAP, eIF4G, EMCV, HCV ou encore toute IRES fonctionnelle dans le système cellulaire ou acellulaire utilisé. Chaque unité de sélection peut être comprise dans un vecteur, de préférence, dans un plasmide.
Les populations cellulaires selon l'invention sont préférentiellement composées de cellules eucaryotes, notamment humaines, de préférence immortalisées. Elles peuvent être préparées par toute technique connue de l'homme du métier, notamment par électroporation, infection, précipitation au phosphate de calcium, utilisation d'agents facilitant la transfection (e.g., liposomes, lipides cationiques, peptides, polymères, etc.).
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, les unités de sélection sont mises en contact avec le composé test, dans un système acellulaire, en présence des enzymes et réactifs permettant la transcription et/ou la traduction in vitro. De tels systèmes sont commercialisés par des fournisseurs tel que Promega (lysat de réticulocytes (RRL) ou système TNT ). Il est entendu que dans le cas particulier de l'introduction dans un système acellulaire d'unités de sélection sous forme d'ARN, la présence des enzymes et réactifs permettant la transcription in vitro n'est pas requise. Mise en contact des composés avec au moins deux unités de sélection selon l'invention
Les méthodes de criblage selon l'invention prévoient une étape ex vivo ou in vitro de mise en contact du composé test avec au moins deux unités de sélection selon l'invention, dans des conditions particulières qui permettent de déterminer l'expression desdits gènes de sélection et d'obtenir ainsi une information concernant l'effet du composé test. Classiquement, l'effet du composé test est comparé au niveau d'expression des gènes de sélection, déterminé en l'absence dudit composé, ou dans une situation de référence.
De manière préférée, le composé test peut être mis en contact avec des cellules hôtes dans lesquelles des unités de sélection selon l'invention ont été introduites, via des vecteurs plasmidiques, par exemple. Ces cellules, dans un mode préféré de l'invention, peuvent être des cellules eucaryotes, par exemple des levures, des cellules de mammifères et notamment des cellules humaines (hépatocytes, fibroblastes, cellules endothéliales, musculaires, etc.). De manière encore plus préférée, ces cellules peuvent être des cellules humaines immortalisées. Il peut également s'agir de populations, de cultures primaires ou de lignées établies (cellules Hela par exemple).
L'invention concerne donc une méthode de criblage dans laquelle les composés tests sont préférentiellement mis en contact avec une cellule issue d'une population ou d'une lignée de cellules eucaryotes, notamment humaines, de préférence immortalisées, comprenant les unités de sélection.
Un autre objet de la présente invention concerne une population ou une lignée cellulaire dont les cellules constitutives comprennent au moins deux unités de sélection comprenant chacune au moins un gène de sélection distinct placé sous le contrôle d'un promoteur et d'éléments d'initiation de la traduction. Ces derniers comprennent de préférence une région non traduite (5'UTR) pouvant comprendre un ou plusieurs éléments IRES et/ou des éléments impliqués dans le mécanisme de transfert du ribosome, par exemple des sites donneur et accepteur de shunt, et sont de préférence identiques. Le ou les gènes de sélection de chaque unité de sélection sont de préférence différents et sont placés sous le contrôle de promoteurs de préférence différents également.
Les composés peuvent être mis au contact des unités de sélection ou des cellules les contenant à différents moments, selon leur(s) effet(s), leur concentration, la nature des cellules et l'appréciation technique. Le contact peut être effectué sur tout support approprié et notamment sur une plaque, dans un tube ou une flasque. Généralement, la mise en contact est réalisée dans une plaque multipuits ce qui permet de conduire, en parallèle, des essais nombreux et variés. Parmi les supports typiques on trouve des plaques de microtitration et plus particulièrement des plaques 96 ou 384 puits (ou plus), faciles à manipuler et sur lesquels la révélation peut être obtenue grâce à une stimulation classique. Selon le support et la nature du composé test, des quantités variables de cellules peuvent être utilisées lors de la mise en œuvre des méthodes décrites. De manière classique, 103 à 106 cellules sont mises en contact avec un type de composé test, dans un milieu de culture approprié, et de manière préférentielle entre 10 et 105 cellules. A titre d'exemples, dans une plaque de 96 puits, 104 à 105 cellules peuvent être incubées dans chaque puit avec une quantité voulue d'un composé test. Dans une plaque à 384 puits, moins de 105 cellules et typiquement entre 103 et 5xl 04 cellules sont généralement incubées dans chaque puit avec le composé test. La quantité (ou la concentration) de composé test peut être ajustée par l'utilisateur selon le type de composé (sa toxicité, sa capacité de pénétration cellulaire, etc.), le nombre de cellules, la longueur de la période d'incubation, etc. Généralement, les cellules sont exposées à des quantités de composés test qui varient de lnM à ImM. Il est bien sûr possible de tester d'autres concentrations sans dévier de la présente invention. Chaque composé peut, de plus, être testé, en parallèle, à différentes concentrations.
Un autre objet de l'invention concerne ainsi une méthode de criblage qui comprend la mise en contact, en parallèle, de plusieurs composés tests avec les unités de sélection.
Différents adjuvants et/ou vecteurs et/ou produits facilitant la pénétration des composés dans les cellules tels que des liposomes, des lipides cationiques ou des polymères peuvent, en outre, être utilisés, si nécessaire.
Le contact est maintenu environ une semaine, généralement entre 5 et 72 heures, voire entre 12 et 48 heures. En effet, les cellules et les divers réactifs doivent, de préférence, rester en contact suffisamment longtemps pour permettre la synthèse de novo du produit d'expression des gènes de sélection. De manière préférée, l'incubation dure environ 36 heures.
Détermination de l'expression des gènes de sélection
La méthode de sélection, d'identification et de caractérisation de composés capables de moduler un mécanisme d'expression de gènes prévoit une étape de détermination de l'expression des gènes de sélection. Cette détermination peut être obtenue à l'aide de techniques variées dont la nature dépend du type de gène utilisé. La mesure peut, par exemple, correspondre à une densité optique ou à une émission fluorescente dans le cas d'une utilisation comme gène de sélection du gène rapporteur codant pour la β-galactosidase ou la luciférase. Il peut s'agir d'une révélation de l'expression desdits gènes à l'aide d'un substrat adapté. La présence du produit du gène rapporteur (ou du produit d'hydrolyse du substrat) peut être déterminée par des méthodes classiques connues de l'homme du métier (fluorescence, D.O., luminescence, FRET (voir WO 0037077), SPA, biopuces, méthodes immunologiques, etc.). La mesure de l'hydrolyse implique essentiellement une mesure (ou la détermination de la quantité relative) du produit d'hydrolyse contenu dans chaque échantillon réactionnel. Cette mesure peut être réalisée grâce à différentes techniques connues de l'homme du métier, incluant la détection d'une fluorescence, d'une radioactivité, d'une couleur, d'une activité enzymatique, d'un immun complexe antigène-anticorps, etc. De manière préférée, le produit d'hydrolyse est détecté et quantifié grâce à une technique de détection de fluorescence. Des fluorochromes variés peuvent ainsi être utilisés et contrôlés sur des échantillons de cellules. Généralement, on détermine l'activité d'un composé test dans une cellule et cet effet est comparé au niveau d'activité en l'absence de composé test ou à une valeur moyenne déterminée en l'absence de tout composé test.
Comme indiqué précédemment, ces méthodes permettent le criblage, rapide et en parallèle, de nombreux composés test sur une ou plusieurs populations cellulaires (cellules eucaryotes, cellules de mammifère, cellules humaines, etc.). Ces méthodes sont prédictives, automatisables et adaptées à la sélection, l'identification et la caractérisation desdits composés.
Composés test
La présente invention peut être appliquée à tout type de composé test. Ainsi, le composé test peut être tout produit qui se présente sous une forme isolée ou en mélange avec d'autres produits. Le composé peut être défini en termes de structure et/ou de composition ou ne pas être défini. Le composé peut, par exemple, être un produit isolé et structurellement défini, un produit isolé de structure indéfinie, un mélange de produits connus et caractérisés ou une composition indéfinie comprenant un ou plusieurs produits.
De telles compositions indéfinies peuvent être des composés de nature, structure et origine variées, notamment des composés biologiques, des composés chimiques, synthétiques, etc., capables de moduler la traduction. Il peut s'agir par exemple, d'échantillons de tissus, de fluides biologiques, de surnageants cellulaires, de préparations végétales, etc. Les composés test peuvent être des produits inorganiques ou organiques, un composé chimique ou biologique et notamment un polypeptide (ou une protéine ou un peptide), un acide nucléique, un lipide, un polysaccharide, un cofacteur ou tout mélange ou dérivé de ces derniers. Le composé peut être d'origine naturelle ou synthétique et inclure une banque combinatoire, une chimiothèque, un clone ou une banque d' ADNc ou de fragments de ces derniers, une banque de protéines ou de peptides aléatoires contraints ou libres, etc.
Pour réaliser une méthode de criblage selon l'invention, le composé test est choisi préférentiellement parmi un peptide, un polypeptide, un glucide, un lipide, un acide nucléique, une molécule chimique ou synthétique, un extrait végétal ou une banque combinatoire.
La présente invention est particulièrement adaptée à la sélection, l'identification ou la caractérisation d'un nombre important de composés. Ce criblage simple et efficace peut être accompli en un laps de temps très court. Les méthodes décrites peuvent, en particulier, être partiellement automatisées, autorisant ainsi le criblage efficace et simultané de composés divers et nombreux, soit sous forme de mélange soit sous forme séparée. Les composés sélectionnés sont ensuite étudiés pour confirmer leurs propriétés biologiques.
Utilisation des composés sélectionnés
Les composés identifiés selon l'invention présentent des propriétés avantageuses pour une utilisation thérapeutique, notamment dans le domaine des pathologies entraînant l'expression anormale d'une protéine telle qu'une dérégulation traductionnelle, par exemple le cancer. Une application possible de l'invention est de permettre l'identification d'une substance thérapeutique susceptible de moduler le mécanisme d'initiation de la traduction au sein, par exemple, des cellules cancéreuses.
La sélection de composés présentant par exemple une activité modulatrice du mécanisme IRES-dépendant peut être utilisée pour concevoir de nouveaux types de molécules utilisables dans le cadre du traitement de certains cancers. En effet de nombreux proto-oncogènes ont une traduction dirigée par un IRES. Certaines mutations dans la région 5' non traduite de ces proto-oncogènes s'avèrent être directement liées à une dérégulation traductionnelle et au phénotype de cancérisation. Il semble par ailleurs que les IRES soient plus actifs dans les cellules cancéreuses ou en division que dans les cellules différenciées.
L'invention inclut ainsi l'utilisation de tout composé (ou dérivés desdits composés) sélectionné, identifié ou caractérisé selon l'une des méthodes précédemment décrites, dans le cadre de la présente invention, comme cible de recherches expérimentales ou pour la préparation d'un médicament destiné au traitement d'une pathologie entraînant l'expression anormale d'une protéine (notamment une dérégulation traductionnelle), et en particulier du cancer, mais également des maladies neurodégénératives, auto-immunes, cardiovasculaires, de la sténose, etc.
Kit
L'invention concerne également tout kit utilisable pour la mise en œuvre de méthodes de criblage telles que décrites ci-avant comprenant par exemple des vecteurs, lignée(s) cellulaire(s), compositions selon l'invention, plaques de dosages et/ou réactifs pour la détection de l'expression des gènes.
La faisabilité, la réalisation et d'autres avantages de l'invention sont illustrés plus en détails dans les exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.
LEGENDE DES FIGURES
Figure 1 : Unités de sélection pour cibler un mode d'initiation de la traduction particulier Le promoteur (P), le ou les gènes de sélection négatives (S-) et/ou positive (S+), fusionnés ou reliés par réinitiation, les éléments d'initiation de la traduction (5'UTR, IRES, sites donneurs (D) et accepteurs (A) de shunt, 3'UTR, éventuellement région codante) sont agencés de manière fonctionnelle dans l'unité de sélection, c'est à dire de sorte que le promoteur contrôle l'expression desdits gènes et que leur expression soit modulée par le composé test. Figure 2: Variations possibles des unités de sélection pour de cibler le mode "IRES" Figure 3 : Variation possibles des unités de sélection pour cibler le mode "SHUNT" Figure 4 : Unités de sélection pour cibler la traduction dirigée par une région 5'UTR particulière (5'UTR1) Figure 5 : Variations possibles des unités de sélection pour de cibler la traduction dirigées par
IRES particulière (IRES 1)
Figure 6 : Conditions de tri cellulaire des cellules Hela, Hela-24C/54A et Hela-54A
Le protocole C correspond au tri suivant la fenêtre M2 et le protocole D correspond au tri suivant la fenêtre Ml (voir example 5).
EXEMPLES
Exemple 1 : Méthode de criblage de composés modulant le mécanisme d'initiation de la traduction IRES-dépendant, issus d'une banque de peptides aléatoires, à l'aide de gènes de sélection négative.
Dans un premier temps, la lignée cellulaire contenant les deux gènes de sélection négative doit être réalisée. La lignée Hela ou d'autres cellules humaines de préférence immortalisées peuvent être utilisées. Les séquences IRES sont choisies parmi ODC, c-myc, c-sis, FGF-2, PDGF-2, IGF-2, VEGF, apaf-1, XIAP, eIF4G, EMCV, HCV ou encore tout IRES fonctionnel dans le système cellulaire utilisé. Parmi les gènes de sélection négative sont préférés les gènes TK et CodA. Il existe pour ces deux enzymes une multitude de mutants ayant des substrats différents susceptibles d'être utilisés pour leurs propriétés particulières. Typiquement, les deux gènes suicides sont codés par deux plasmides qui contiennent par ailleurs tous les éléments nécessaires pour leur expression dans les cellules eucaryotes à savoir un promoteur (CMV, SV40, β-actine, PGK, promoteur issu d'un gène domestique, etc.), un signal de polyadénylation, etc.
Dans un second temps, les plasmides codant pour les peptides issus d'une banque de peptides aléatoires (plasmides BPA) sont introduits dans la lignée cellulaire décrite précédemment. Différentes techniques de biologie moléculaire peuvent être utilisées pour l'introduction de ces plasmides dans les cellules eucaryotes (transfection, transduction, etc.). Cette étape est idéalement réalisée par transduction virale (utilisation de vecteurs rétro viraux ou adéno viraux). Le gène concerné peut coder pour une protéine provenant de différentes origines (banque d'ADNc procary ote ou eucaryote). Typiquement, le plasmide BPA code pour un peptide aléatoire libre (de 5 à 30 aa) ou inclus au sein d'une protéine présentatrice (peptide contraint ; de 5 à 20 aa) telle qu'une version inactive de la nucléase du staphylocoque, la boucle du site actif de la thioredoxine d'E.co/ , les toxines de scorpion ou encore l'inhibiteur de l'alpha- amylase (Tendamistat). Le plasmide BPA dispose de préférence d'un gène de sélection positive pour permettre une expression stable à terme et ainsi faciliter son sous-clonage. La protéine présentatrice peut-être elle-même fusionnée à un marqueur de sélection positive (neo, hygro, puro, blasticidine, etc.).
Enfin, la lignée cellulaire est soumise à la double sélection négative par activation des deux programmes suicides (typiquement par apport dans le milieu de culture cellulaire de «pro- drug» de type Gancyclovir, Acyclovir, 5Fluoro-cytosine, etc.). Les cellules exprimant un peptide capable d'inhiber le mécanisme d'initiation de la traduction IRES-dépendant, et par conséquent capable de diminuer conjointement l'expression des deux programmes de suicide (gène de sélection négative), survivent. Ces cellules sont ensuite cultivées et les peptides aléatoires caractérisés. Cette méthode est basée sur le système de sélection double de l'invention qui permet d'accroître la spécificité des peptides sélectionnés. En effet, ne seront pas sélectionnés les peptides aléatoires pouvant interférer avec des étapes non ciblées de l'expression de l'un des deux gènes de sélection (la transcription, l'épissage, l'export des ARNm, etc.). De façon similaire ne seront pas sélectionnés les peptides pouvant interférer avec l'un des deux processus biochimiques impliqués dans le programme de suicide cellulaire. Ainsi, la haute sélectivité de ce système de criblage permet, en utilisant un grand nombre de cellules, de pouvoir tester un grand nombre de peptides aléatoires et d'éviter l'analyse fastidieuse d'un grand nombre de «faux positifs».
A l'issue de la sélection négative, les clones résistants obtenus sont amplifiés et soumis à différentes analyses (étude du profil «cycle cellulaire» par FACS pour déterminer la proportion de cellules dans chaque phase du cycle). La région du plasmide codant pour le peptide aléatoire est ensuite clonée après amplification par PCR. Finalement, les peptides isolés sont étudiés pour confirmer leurs propriétés biologiques.
Exemple 2 : Construction d'unités de sélection modulables
Cet exemple décrit la composition et la construction de vecteurs de clonage permettant, selon les objectifs du criblage envisagé, le transfert dans un type cellulaire donné d'unités de sélection uniques. Chacune des unités de sélection est déterminée par une combinaison unique des éléments génétiques suivants : (i) un promoteur, (ii) une région 5' non traduite (5'UTR), (iii) une séquence codant pour une protéine bi-fonctionnelle (protéine de fusion), (iv) une région 3' non traduite (3'UTR) et (V) une séquence de polyadénylation (polyA). Par ailleurs, ces unités de sélection sont aisément modulables. En effet, elles contiennent des sites de restriction enzymatique uniques facilitant la substitution de leurs éléments génétiques.
Choix des éléments génétiques :
Les promoteurs ont été choisis parmi les séquences promotrices des gènes de la phospho- glycérate kinase humaine (PGK), de l'ubiquitine C humaine (Ubc), du promoteur de la chaine lourde du gène de la ferritine (Fer) et du virus SV40 (SV40). Les régions 5' UTR ont été choisies parmi celles de l'ARNm cMYC P2 (IRES cMYC) et de l'ARNm ApaFl (IRES ApaFl). Il peut aussi s'agir d'une séquence synthétique (arbitrairement appelée SX). Les séquences codant pour les protéines bi-fonctionnelles ont été choisies parmi celles des protéines fusions puromycine-thymidine kinase du virus de l'herpès humain (PAC-TK), hygromycine-cytosine déaminase à'E.Coli (Hygro-CODA) et hygromycine-GFP (Hygro- GFP). En outre, certaines de ces protéines disposent d'une courte séquence C-terminale (3X- Flag) (Stratagen). Les régions 3' UTR ont été choisies parmi deux fragments synthétiques arbitrairement appelés SY et SW. Les séquences de polyadénylation ont été choisies parmi celles du gène de l'hormone de croissance bovine (BGH) et du virus simian 40 (SV40). Les unités de sélection peuvent être représentées schématiquement dans le sens 5'->3' de la manière suivante :
Vecteur Promoteur 5' UTR protéine fusion 3'UTR polyA pl4 Ubc SX Hygro-CODA-3X Flag SY BGH pl5 Ubc SX PAC-TK-3X Flag SY BGH pl7 PGK SX Hygro-CODA-3X Flag SY BGH pl8 PGK SX PAC-TK-3X Flag SY BGH pl9 SV40 SX Hygro-CODA-3X Flag SY BGH p20 SV40 SX PAC-TK-3X Flag SY BGH p24 PGK IRES cMyc Hygro-CODA-3X Flag SY BGH p25 Ubc IRES cMyc PAC-TK-3X Flag SY BGH p26 SV40 IRES cMyc PAC-TK-3X Flag SY BGH p24 PGK IRES cMyc Hygro-GFP SY BGH p51 PGK IRES ApaFl PAC-TK-3X Flag SY BGH p54 Fer IRES cMyc Hygro-GFP SY BGH p56 Fer IRES ApaFl Hygro-GFP SY BGH p82 SV40 IRES cMyc PAC-TK-3X Flag SX SV40
Déta ils de la construction des vecteurs :
Le vecteur pi a été généré par digestion enzymatique du vecteur pUB6/V5His A (Invitrogen) par PvuII puis, circularisation du fragment de 3662 pb. Ce vecteur contient dans le sens 5'->3' : le promoteur Ubc, une région 5' UTR contenant un intron, un site de clonage multiple, la région 3 'UTR S Y, la séquence de polyadénylation du gène de l'hormone de croissance bovine (BGH), l'origine de réplication bactérienne pMBl ori et le gène de résistance à l'ampicilline.
Le vecteur p2 a été généré par l'insertion de la séquence fusion PAC-TK entre les sites de restriction Not I et Xho I du vecteur pi. La séquence fusion PAC-TK a été purifiée après digestion du vecteur pCMV-PAC-TK (Karreman C. A new set of positive/négative selectable markers for mammalian cells. Gène. 1998. Sep 18; 218(1-2): 57-61) par les enzymes de restriction Not I et Xho I.
Le vecteur p3 a été généré par l'insertion de la séquence fusion Hygro-CODA entre les sites de restriction Not I et Xho I du vecteur i. La séquence codante Hygro-CODA a été purifiée après digestion du vecteur pCMV-Hygro-CODA TK (Karreman C. A new set of positive/négative selectable markers for mammalian cells. Gène. 1998. Sep 18; 218(1-2): 57- 61) par les enzymes de restriction Not I et Xho I.
Le vecteur p8 a été généré par l'insertion de la séquence fusion CODA-3Xflag entre les sites de restriction NgoM I et Xho I du vecteur p3. La séquence fusion CODA-3Xflag a été générée par la technique de PCR fusion en utilisant les vecteurs pCMV-Hygro-CODA et p3XFLAG-CMV10 (Sigma) comme matrice.
Le vecteur plO a été généré par insertion de la séquence fusion TK-3Xflag entre les sites de restriction PshA I et Xho I du vecteur p2. La séquence fusion TK-3Xflag a été générée par la technique de PCR fusion en utilisant les vecteurs pCMV-PAC-TK et p3XFLAG- CMV10 (Sigma) comme matrice.
Le vecteur pl4 a été généré par insertion du promoteur Ubc entre les sites de restriction Bgl II et Hind III du vecteur p8. Le promoteur Ubc a été obtenu par la technique de PCR en utilisant le vecteur pUB6/V5-HIS A (invitrogen) comme matrice.
Le vecteur pl5 a été généré par insertion du promoteur Ubc entre les sites de restriction Bgl II et Hind III du vecteur plO.
Le vecteur pl7 a été généré par insertion du promoteur PGK entre les sites de restriction Bgl II et Hind III du vecteur p8. Le promoteur PGK a été obtenu par la technique de PCR en utilisant de l'ADN génomique de cellule humaine Hela comme matrice.
Le vecteur pl8 a été généré par insertion du promoteur PGK entre les sites de restriction Bgl II et Hind III du vecteur plO.
Le vecteur pl9 a été généré par insertion du promoteur SV40 entre les sites de restriction Bgl II et Hind III du vecteur p8. Le promoteur SV40 a été purifié après digestion du vecteur pGFR-p(R) (Packard) par les enzymes de restriction Hind III et Bgl IL
Le vecteur p20 a été généré par insertion du promoteur SV40 entre les sites de restriction Bgl II et Hind III du vecteur plO.
Le vecteur p24 a été généré par insertion entre les sites de restriction Hind III et pShA I du vecteur pl7 d'une séquence fusion entre TIRES cMYC et des 38 premiers nucléotides de la séquence codante de l'hygromycine (Hygro). Le fragment cMYC-Hygro a été généré par la technique de PCR fusion en utilisant les vecteurs pCMV-Hygro-CODA et pIRESYS l lbis (construit par C. Deffaud) comme matrice.
Le vecteur p25 a été généré par l'introduction entre les sites de restriction Hind III et BstE II du vecteur pl5 d'une séquence fusion entre TIRES cMYC et des 138 premiers nucléotides de la séquence codante de la puromycine (PAC). Le fragment cMYC-PAC a été généré par la technique de PCR fusion en utilisant les vecteurs pCMV-PAC-TK et pIRESYS 1 Ibis (construit par C. Deffaud) comme matrice.
Le vecteur p26 a été généré par insertion entre les sites de restriction Hind III et BstE II du vecteur p20 de la séquence fusion cMyc-PAC générée et décrite pour le plasmide p24.
Le vecteur p28 a été généré par insertion de la séquence codante de la GFP entre les sites de restriction BstE II et Xba I du vecteur p24. Le fragment d'ADNc de la GFP a été obtenu par la technique de PCR en utilisant le vecteur pEGCF-Cl (Clonetech) comme matrice.
Le vecteur p54 a été généré par insertion du promoteur Ferritine (Fer) entre les sites de restriction Bgl II et Hind III du vecteur p28. Le promoteur Ferritine a été généré par PCR en utilisant le vecteur pORF 1 (Cayla) comme matrice.
Le vecteur p51 a été généré par insertion entre les sites de restriction Hind III et pShA I du vecteur pl8 d'une séquence fusion entre TIRES Apaf-1 et des 38 premiers nucléotides de la séquence codante de la puromycine (PAC). Le fragment Apaf-1-PAC a été généré par la technique de PCR fusion en utilisant les vecteurs (pRAF) et pCMV-PAC-TK comme matrice.
Le vecteur p56 a été généré par insertion entre les sites de restriction Hind III et pShA I du vecteur p54 d'une séquence fusion entre TIRES Apaf-1 et des 138 premiers nucléotides de la séquence codante de l'hygromycine (Hygro). Le fragment Apaf-1 -Hygro a été généré par la technique de PCR fusion en utilisant les vecteurs (pRAF) et pCMV-Hygro-CODA comme matrice.
Le vecteur p82 a été généré par insertion entre les sites de restriction Xho I et Sph I du vecteur p26 d'un fragment contenant la séquence 3 'UTR synthétique SW et la séquence de polyadénylation du virus SV40. Ce fragment d'ADN a été obtenu par la technique de PCR en utilisant les vecteurs pGFR-p(R) (Packard) pour matrice.
Exemple 3 : Système cellulaire pour le criblage de composés modulateurs du promoteur viral SV40
Pour sélectionner de façon ciblée des molécules modulatrices (activatrices ou inhibitrices) de l'activité transcriptionnelle du promoteur SV40, un système de sélection à été développé à partir de la lignée cellulaire humaine Hela et des vecteurs pl9 et p82.
pl9 : SV40 SX Hygro-CODA SY BGH p82 : SV40 cMyc PAC-TK SW SV40
Les cellules Hela ont été transfectées avec les vecteurs pl9 et p82 puis, maintenues en culture pendant 15 jours en présence d'hygromycine (200μg/ml) et de puromycine (2 μg/ml). Plusieurs clones cellulaires issus de cette sélection (clones Hela- 19/82) présentent les caractéristiques requises à la réalisation d'un criblage cellulaire de molécules modulatrices du promoteur SV40.
Dans le cas particulier d'un criblage de molécules inhibitrices du promoteur SV40, les cellules Hela-19/82 seront mises en contact avec une pluralité de composés test, et incubées en présence de GCV et de 5FC. Seules les molécules capables d'inhiber l'activité transcriptionnelle du promoteur SV40 diminueront conjointement l'expression des deux gènes de suicide et procureront ainsi aux cellules Hela-19/82 une viabilité accrue.
Dans le cas du criblage de molécules activatrices du promoteur SV40, les cellules Hela-19/82 seront mis en contact avec une pluralité de composés test, et préférentiellement incubées en présence de puromycine et hygromycine à des concentrations toxiques. Seules les molécules capables d'augmenter l'activité transcriptionnelle du promoteur SV40 stimuleront conjointement l'expression des deux gènes de résistance et permettront ainsi d'accroître la viabilité des cellules.
Exemple 4 ; Système cellulaire pour le criblage de composés modulateurs du mécanisme d'entrée directe des ribosomes dirigé par TIRES cMYC.
La protéine cMyc est un facteur de transcription impliqué dans de nombreux processus cellulaires extrêmement variés tels que la prolifération, la différentiation, Tapoptose ou la transformation. L'expression de cMYC est régulée à différents niveaux et notamment au niveau traductionnel par un site d'entrée direct des ribosomes (IRES). Certaines formes de cancer impliquent des dérégulations traductionnelles de l'ARNm c-myc. Par conséquent, LIRES cMYC constitue une cible potentielle pour le traitement de ces pathologies. Afin de sélectionner de façon ciblée des molécules modulatrices (activatrices ou inhibitrices) de TIRES cMYC, un système de sélection à été développé à partir de la lignée cellulaire humaine Hela et des vecteurs p25 et p54.
: Ubc cMyc PAC-TK SX BGH
: Fer cMyc Hygro-GFP SX BGH
Dans un premier temps, des cellules Hela ont été transfectées par le vecteur p24 puis maintenues en culture pendant 2 semaines en présence de puromycine (2μg/ml). Plusieurs clones cellulaires issus de cette sélection ont été sélectionnés sur la base de la fonctionnalité du gène TK (suicide cellulaire en présence de GCV, typiquement de 1 à 20 μg/ml pendant une semaine). Enfin, l'ADN génomique de ces clones a été analysé par PCR pour vérifier l'intégrité de la région promotrice et de TIRES du vecteur p24 intégré.
Dans un second temps, des cellules de l'un des clones stables précédemment obtenus (clone Hela-24C) ont été transfectées par le vecteur p54, puis maintenues en culture pendant 3 semaines en présence d'hygromycine (200 μg/ml). Les clones cellulaires issus de cette deuxième sélection ont ensuite été sélectionnés sur la base de la fonctionnalité du gène GFP (analyse par FACS). Enfin, TADN génomique de ces clones a été analysé par PCR pour vérifier l'intégrité de la région promotrice et de TIRES du vecteur p54 intégré. Les clones cellulaires ainsi obtenus possèdent les caractéristiques requises à la réalisation d'un criblage de molécules inliibitrices de TIRES cMYC. Un de ces clones, le clone Hela-24C/54A a été analysé de façon plus approfondie, les résultats obtenus étant présentés dans l'exemple 5.
Exemple 5 : Caractéristiques avantageuses de la lignée Hela-24C/54A
Le criblage cellulaire de molécules aléatoires est un outil extrêmement puissant pour valider de nouvelles cibles cellulaires et identifier des molécules d'intérêt thérapeutique. Néanmoins, les différents éléments impliqués dans de tels criblages doivent avoir les caractéristiques nécessaires et optimales pour offrir les meilleures chances de succès.
Dans le cadre de la mise en place d'un criblage cellulaire de molécules inhibitrices de TIRES cMYC, les caractéristiques avantageuses de la lignée Hela-24C/54A (voir exemple 3), ont été évaluées plus en détails.
De façon plus général, l'efficacité globale d'un criblage dépend de plusieurs paramètres, dont principalement (i) la nature de la banque de molécules utilisées, (ii) la taille de la banque et (ϋi) l'efficacité intrinsèque du système de sélection. Dans le cas de la lignée Hela-24C/54A, comme pour toute autre lignée cellulaire destinée au un criblage de banques moléculaires, l'efficacité intrinsèque du système de détection est la résultante de deux paramètres : (i) la fuite du système et (ii) la sélectivité du système.
1- La "fuite" du système
Par fuite du système, on entend le pourcentage de cellules qui vont réagir positivement au cours du criblage et ce malgré l'intervention d'une quelconque molécule effectrice. Il peut s'agir soit (i) de variation d'expression et/ou mutation et/ou délétion des gènes de sélection (au sens large du mot gène : éléments régulateurs et/ou partie codante) et/ou (ii) d'un artefact expérimental inhérent à la lignée cellulaire utilisée. Dans tous les cas, il en résultera une perte de sélectivité du système, qui conduira inévitablement à l'émergence de "faux positifs". Afin de pallier à ce problème, la solution divulguée dans cette présente invention consiste à utiliser des lignées cellulaires contenant plusieurs systèmes de sélection (ou filtres) croisés.
Pour vérifier la validité de cette approche, la fuite du système de la lignée Hela-24C/54A a été comparée à des systèmes contenant un filtre unique. Les 3 lignées cellulaires utilisées pour cette étude sont les suivantes :
Les cellules Hela-24C contenant uniquement un seul système de sélection issu du vecteur p24
(filtre 1)
Les cellules Hela-24C/54A contenant deux systèmes de sélection croisés et issus des vecteurs p54 et p24 (filtre 1 et 2).
Les cellules Hela-54A contenant uniquement un seul système de sélection issu vecteur p54
(filtre 2).
Les cellules Hela-24C et Hela-24C/54A ont été décrites dans l'exemple précédent. Les cellules Hela-54A dérivent d'un clone cellulaire Hela-24C/54A résistant au suicide par le GCV, dont T analyse de TADN génomique par PCR a révélé une délétion du système de sélection 1.
3 protocoles de criblage ont été appliqués sur ces 3 lignées cellulaires :
Criblage simple sur l'unité de sélection #24 : 20 000 cellules sont trypsinées, ensemencées dans une boite de 10cm de diamètres, puis après adhésion au support, incubées en présence de 1 μg/ml de GCV (protocole A) ou 0,25 μg/ml de GCV (protocole B) pendant 48 heures. Les cellules sont ensuite maintenues en culture dans du milieu sans GCV et les clones résistants dénombrés au bout de 6 jours.
Criblage simple sur l'unité de sélection #54: 20 000 cellules sont trypsinées, puis triées au FACS selon deux protocoles (protocoles C et D ; voir figure 6) pour sélectionner les cellules dont la fluorescence est diminuée. Les cellules sont alors ensemencées dans une boite de 10cm de diamètres. Les cellules sont maintenues en culture et les clones résistants dénombrés au bout de 6 jours. Criblage double sur les unités de sélection #24 et #25 : 20 000 cellules sont trypsinées, puis triées au FACS pour sélectionner les cellules dont la fluorescence est diminuée. Les cellules sont alors ensemencées dans une boite de 10cm de diamètres et, après adhésion au support, incubées en présence de 1 μg/ml de GCV ou 0,25 μg/ml de GCV pendant 48 heures. Les cellules sont ensuite maintenues en culture dans du milieu sans GCV et les clones résistants dénombrés au bout de 6 jours.
Le tableau 1 résume les résultats obtenus en "pourcentage de fuite" (Nombre de clones obtenus /Nombre de cellules de départ x 100)
TABLEAU 1 : "Fuite du système" utilisant les lignées Hela-24C, Hela 54A et Hela-24C/54A
Figure imgf000024_0001
Les résultats obtenus montrent clairement que la fuite du système est minimale dans le cas de l'utilisation de la lignée cellulaire Hela-24C/54A à laquelle est appliquée une double sélection.
Par ailleurs, il est important de noter que l'introduction ou l'élimination d'une seconde unité de sélection n'affecte pas la fuite du système d'une première unité de sélection. Ceci montre que les deux unités de sélection de la lignée cellulaire Hela-24C/54A ont un mode de fonctionnement quasi indépendant.
2- La sélectivité du système
L'utilisation de la lignée Hela-24C/54A permet d'effectuer un criblage basé sur un système de double filtrage. Compte tenu du fonctionnement quasi indépendant (cf fuite du système) des deux unités de sélection de la lignée cellulaire Hela-24C/54A, le processus de criblage est rationnellement très ciblé sur TIRES cMYC. Par comparaison, un système qui ne posséderait qu'un seul et unique filtre (p54 par exemple), ne pourrait éliminer des molécules dont l'action serait de baisser l'activité transcriptionnelle du promoteur Ubc ou d'inhiber la fluorescence de la protéine Hygro-GFP. Ainsi, un tel système disposerait d'une moins bonne sélectivité que le système constitué de la lignée Hela-24C/54A.
Conclusion : La lignée Hela-24C/54A présente, de par une fuite du système limitée et une meilleure sélectivité, des caractéristiques avantageuses dont ne disposent aucun des systèmes cellulaires ne contenant qu'une seule des deux unités de sélection de la lignée Hela-24C/54A. Exemple 6 : Système cellulaire pour le criblage de composés modulateurs du mécanisme d'entrée directe des ribosomes gouverné par TIRES Apaf-1.
La protéine Apaf-1 est un facteur impliqué dans le processus de mort cellulaire par apoptose. L'expression d'Apaf-1 est traductionnellement régulée par un site d'entrée direct des ribosomes (IRES). L'IRES Apaf-1 constitue ainsi une cible potentielle pour modifier la sensibilité des cellules à Tapoptose. Pour sélectionner de façon ciblée des molécules modulatrices (activatrices ou inhibitrices) de TIRES Apaf-1, un système de sélection à été développé à partir de la lignée cellulaire humaine Hela et des vecteurs p51 et p56.
p51 : PGK IRES ApaFl PAC-TK-3X Flag S Y BGH p56 : Fer IRES ApaFl Hygro-GFP S Y BGH
Les cellules Hela ont été transfectées avec les vecteurs p51 et p56 puis maintenues en culture en présence d'hygromycine (200μg/ml) et de puromycine (2 μg/ml) pendant 15 jours. Les clones cellulaires issus de cette sélection (clones Hela-51/56) disposent des caractéristiques exigées pour la réalisation d'un criblage cellulaire de molécules modulatrices de TIRES Apaf- 1. Par criblage cellulaire on entend qu'une pluralité de composés test peuvent être mis en présence d'une pluralité de cellules Hela-51/56, lesquelles disposent de la capacité de désigner, de part leur viabilité et l'intensité de leur fluorescence, de la présence de molécules effectrices possédant une activité modulatrice de TIRES Apaf-1.
Exemple 7 : Système cellulaire pour le criblage de composés modulateurs des IRES cMyc et Apaf-1.
Cette exemple décrit un système de criblage cellulaire orienté vers la sélection de molécules modulatrices à la fois de TIRES cMyc et de TIRES Apaf-1. Ainsi, les cibles potentielles de ce criblage correspondent à tout élément cellulaire requis pour le fonctionnement de ces deux IRES. Un système cellulaire contenant 2 unités de sélection a été développé. La première unité de sélection est constituée du vecteur p82. La seconde unité est constituée du vecteur p56.
p82 : Ubc cMyc PAC-TK SW SV40 p56 : Fer Apaf-1 Hygro-GFP SX BGH
Les cellules Hela ont été transfectées avec les vecteurs p82 et p56 puis maintenues en culture en présence d'hygromycine (200μg/ml) et de puromycine (2 μg/ml) pendant 18 jours. Les clones cellulaires issus de cette sélection (clones Hela-82/56) disposent des caractéristiques désirées pour la réalisation d'un criblage cellulaire de molécules modulatrices de TIRES cMyc et Apaf-1. Par criblage cellulaire on entend qu'une pluralité de composés test peuvent être mis en présence d'une pluralité de cellules Hela-82/56, lesquelles disposent de la capacité de désigner, de part leur viabilité et l'intensité de leur fluorescence, de la présence de molécules effectrices possédant une activité modulatrice des IRES cMYC et Apaf-1.

Claims

REVENDICATIONS
1. Méthode de criblage permettant l'identification de composés modulant de manière ciblée l'expression de gènes, caractérisée en ce qu'elle comprend :
(i) la mise en contact d'un composé test avec au moins deux unités de sélection comprenant chacune au moins un gène de sélection distinct placé sous le contrôle d'un promoteur et d'éléments d'initiation de la traduction, dans des conditions permettant l'expression desdits gènes de sélection, et
(ii) la détermination de la capacité du composé test à moduler l'expression desdits gènes de sélection.
2. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que les éléments d'initiation de la traduction comprennent une région 5' non traduite (5 'UTR) comprenant, de préférence, un ou plusieurs éléments IRES et/ou des éléments impliqués dans le mécanisme de transfert du ribosome.
3. Méthode selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que les éléments d'initiation de la traduction de chacune des unités de sélection sont identiques.
4. Méthode selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que les éléments d'initiation de la traduction de chacune des unités de sélection sont différents.
5. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que les promoteurs des unités de sélection sont différents.
6. Méthode selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que les promoteurs des unités de sélection sont identiques.
7. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que chaque unité de sélection est comprise dans un vecteur, de préférence dans un plasmide.
8. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que les unités de sélection sont contenues dans une cellule permettant l'expression des gènes de sélection, et en ce que le composé test ou un précurseur de celui-ci est mis en contact avec la cellule.
9. Méthode selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que les unités de sélection sont mises en contact avec le composé test dans un système acellulaire, en présence des enzymes et réactifs permettant la transcription et/ou la traduction in vitro.
10. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle comprend la mise en contact, en parallèle, de plusieurs composés tests avec les unités de sélection.
11. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que les gènes de sélection sont des gènes de sélection négative, choisis de préférence parmi Tk, HPRT, NTR, gpt et CodA et/ou des gènes rapporteurs, choisis de préférence parmi EGFP, ECFP, EBFP, et/ou des gènes de sélection positive, choisis de préférence parmi les gènes hygro, néo, phleo, puro et blasticidine.
12. Méthode selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que chaque unité de sélection comporte un gène de sélection positive et un gène de sélection négative.
13. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que les promoteurs sont choisis parmi les promoteurs viraux et les promoteurs de gènes domestiques, notamment parmi les promoteurs CMV, SV40, β-actine, PGK et Ubiquitine C.
14. Méthode selon l'une des revendications 1-8 et 10-13, caractérisée en ce que la cellule est issue d'une population ou d'une lignée de cellules eucaryotes, notamment humaines, de préférence immortalisées.
15. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le composé test est choisi parmi un peptide, un polypeptide, un glucide, un lipide, un acide nucléique, une molécule synthétique, un extrait végétal ou animal ou une banque combinatoire.
16. Méthode selon l'une des revendications 1 à 14, caractérisée en ce que chaque unité ou vecteur comprend un promoteur différent, un gène de sélection différent, une région 5' UTR située entre ledit promoteur et ledit gène de sélection au sein de l'unité de sélection et en ce que ladite région 5 'UTR est identique d'un vecteur ou d'une unité à l'autre.
17. Méthode selon l'une des revendications 1 à 14, caractérisée en ce que chaque unité ou vecteur comprend un promoteur différent, un gène de sélection différent, une région 5' UTR située entre ledit promoteur et ledit gène de sélection au sein de l'unité de sélection et en ce que ladite région 5'UTR est différente d'un vecteur ou d'une unité à l'autre.
18. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, caractérisée en ce que chaque unité ou vecteur comprend un promoteur différent contrôlant l'expression d'une unité bicistronique composé d'un gène de sélection positive, d'un élément de type IRES et/ou shunt et d'un gène de sélection négative, et en ce que ledit élément IRES est identique ou différent d'un vecteur ou d'une unité à l'autre.
19. Méthode selon l'une quelconque des revendications 7 à 15, caractérisée en ce que les unités de sélection, situées au sein d'un même vecteur, comprennent des gènes de sélection différents et sont placées sous le contrôle d'un promoteur commun et d'éléments IRES identiques ou différents.
20. Méthode selon l'une des revendications 1 à 15, 17 à 19, caractérisée en ce que les séquences IRES sont choisies parmi les séquences IRES des gènes ODC, c-myc, c-sis, FGF-2, PDGF-2, IGF-2, VEGF, apaf-1, XIAP, eIF4G, EMCV, HCV ou encore toute IRES fonctionnelle dans le système cellulaire ou acellulaire utilisé.
21. Population cellulaire caractérisée en ce que les cellules qui la constituent ou une partie d'entre-elles comprennent au moins deux unités de sélection comprenant chacune au moins un gène de sélection distinct placé sous le contrôle d'un promoteur et d'éléments d'initiation de la traduction.
22. Population cellulaire selon la revendication 21, caractérisée en ce que les éléments d'initiation de la traduction comprennent une région non traduite (5 'UTR) comprenant de préférence un ou plusieurs éléments IRES et/ou des éléments impliqués dans le mécanisme de transfert du ribosome.
23. Population cellulaire selon l'une des revendications 21 ou 22, caractérisée en ce que les éléments d'initiation de la traduction des unités de sélection sont identiques.
24. Population cellulaire selon l'une des revendications 21 à 23, caractérisée en ce que les promoteurs des unités de sélection sont différents.
25. Population cellulaire selon l'une des revendications 21 à 24, caractérisée en ce que chaque unité de sélection est comprise dans un vecteur, de préférence, dans un plasmide.
26. Population cellulaire selon l'une des revendications 21 à 25, caractérisée en ce que les cellules sont des cellules eucaryotes, notamment humaines, de préférence immortalisées.
27. Population selon l'une des revendications 21 à 26, caractérisée en ce que les gènes de sélection sont des gènes de sélection négative, choisis de préférence parmi Tk et CodA et/ou des gènes rapporteurs, choisis de préférence parmi EGFP, ECFP, EBFP, et/ou des gènes de sélection positive, choisis de préférence parmi les gènes hygro, néo, phleo, puro et blasticidine.
28. Population selon l'une des revendications 21 à 27, caractérisée en ce que les séquences IRES sont choisies parmi les séquences IRES des gènes ODC, c-myc, c-sis, FGF-2, PDGF-2, IGF-2, VEGF, apaf-1, XIAP, eIF4G, EMCV, HCV ou encore toute IRES fonctionnelle dans le système cellulaire utilisé.
29. Kit pour la mise en œuvre de méthodes de criblage caractérisé en ce qu'il comprend une lignée cellulaire selon l'une des revendications 21 à 28.
30. Utilisation d'un composé obtenu grâce à une méthode de criblage selon l'une des revendications 1 à 20 pour la préparation d'un médicament destiné au traitement d'une pathologie entraînant l'expression anormale d'une protéine, et en particulier du cancer.
PCT/FR2002/004124 2001-12-03 2002-12-02 Methodes de criblage de molecules modulatrices de l'expression de genes, lignees cellulaires, preparation et utilisations WO2003048370A1 (fr)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AU2002365698A AU2002365698A1 (en) 2001-12-03 2002-12-02 Method for screening molecules modulating gene expression, cell lines, preparation and uses

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR0115581A FR2833017B1 (fr) 2001-12-03 2001-12-03 Methodes de criblage de molecules modulatrices de l'expression de genes, lignees cellulaires, preparation et utilisations
FR01/15581 2001-12-03

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2003048370A1 true WO2003048370A1 (fr) 2003-06-12

Family

ID=8870031

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/FR2002/004124 WO2003048370A1 (fr) 2001-12-03 2002-12-02 Methodes de criblage de molecules modulatrices de l'expression de genes, lignees cellulaires, preparation et utilisations

Country Status (3)

Country Link
AU (1) AU2002365698A1 (fr)
FR (1) FR2833017B1 (fr)
WO (1) WO2003048370A1 (fr)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996040721A1 (fr) * 1995-06-07 1996-12-19 Emory University Systeme de selection genetique base sur la cytotoxicite (toxsel)
WO1999067375A2 (fr) * 1998-06-22 1999-12-29 Universität Zürich Systeme de criblage
WO2000005366A2 (fr) * 1998-07-24 2000-02-03 University Of Ottawa Sequence ires du gene xiap et ses utilisations

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996040721A1 (fr) * 1995-06-07 1996-12-19 Emory University Systeme de selection genetique base sur la cytotoxicite (toxsel)
WO1999067375A2 (fr) * 1998-06-22 1999-12-29 Universität Zürich Systeme de criblage
WO2000005366A2 (fr) * 1998-07-24 2000-02-03 University Of Ottawa Sequence ires du gene xiap et ses utilisations

Also Published As

Publication number Publication date
FR2833017B1 (fr) 2005-02-04
FR2833017A1 (fr) 2003-06-06
AU2002365698A1 (en) 2003-06-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Matreyek et al. An improved platform for functional assessment of large protein libraries in mammalian cells
ES2324495T3 (es) Expresion recombinante de complejo de multiproteinas utilizando poligenes.
US7468275B2 (en) Synthetic internal ribosome entry sites and methods of identifying same
JP2020537646A (ja) トランスジェニック選択方法および組成物
US9249408B2 (en) Directed evolution using proteins comprising unnatural amino acids
EP2348119A2 (fr) Vecteur de lentivirus multicistronique
KR102476276B1 (ko) 증강된 슬리핑 뷰티 트랜스포존, 키트 및 전위 방법
Bouabe et al. Improvement of reporter activity by IRES-mediated polycistronic reporter system
JP2002514054A (ja) ウイルスベクターおよびそれらの使用
McEvoy et al. Constitutive turnover of cyclin E by Cul3 maintains quiescence
US20190151475A1 (en) Methods And Compositions For Regulating Gene Expression
Giry-Laterriere et al. Polyswitch lentivectors:“all-in-one” lentiviral vectors for drug-inducible gene expression, live selection, and recombination cloning
CN113260700B (zh) 基于可检测标签与靶蛋白的CRISPR/Cas控制的整合而选择细胞的方法
JP7002454B2 (ja) 遺伝子修飾アッセイ
WO2005054463A1 (fr) Mise au point d'une technique de modification du genome d'un mammifere a l'aide d'un retrotransposon
US20200017883A1 (en) Compositions and methods for studying the tat gene
US9738907B2 (en) Viral vector
WO2003048370A1 (fr) Methodes de criblage de molecules modulatrices de l'expression de genes, lignees cellulaires, preparation et utilisations
US20090133136A1 (en) Inducible SIRNA expression cassette and method of use
Parikh et al. Targeted control of gene expression using CRISPR-associated endoribonucleases
WO2024208989A1 (fr) Cellules hôtes modifiées pour la production de lentivirus
EP1451295A2 (fr) Procedes de mutation de genes dans des cellules et des animaux au moyen d'agents mutagenes par insertion
Kumar et al. Extensive in vitro and in vivo protein translation via in situ circularized RNAs
US20240002457A1 (en) Vibrio toxin binding proteins in shrimp and uses thereof
WO2001094598A2 (fr) Construction d'acide nucleique utile pour l'expression de transgenes notamment dans les cellules souches embryonnaires

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NO NZ OM PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): GH GM KE LS MW MZ SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
122 Ep: pct application non-entry in european phase
NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: JP

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Country of ref document: JP

点击 这是indexloc提供的php浏览器服务，不要输入任何密码和下载