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WO2003048194A2 - Peptid oder protein enthaltend ein c'-d loop der cd28 rezeptorfamilie - Google Patents

Peptid oder protein enthaltend ein c'-d loop der cd28 rezeptorfamilie Download PDF

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WO2003048194A2
WO2003048194A2 PCT/DE2002/004064 DE0204064W WO03048194A2 WO 2003048194 A2 WO2003048194 A2 WO 2003048194A2 DE 0204064 W DE0204064 W DE 0204064W WO 03048194 A2 WO03048194 A2 WO 03048194A2
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mab
protein
loop
seq
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PCT/DE2002/004064
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WO2003048194A3 (de
Inventor
Thomas HÜNIG
Fred LÜHDER
Thomas Hanke
Original Assignee
Tegenero Ag
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Priority to EP02804143A priority patent/EP1451224B1/de
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Publication of WO2003048194A3 publication Critical patent/WO2003048194A3/de

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70521—CD28, CD152
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants

Definitions

  • the invention relates to a protein or peptide containing a partial sequence of a member of the CD28 family, a nucleic acid coding for such a peptide, a plasmid containing such a nucleic acid, hybridoma cells which form monoclonal antibodies (mAb) which bind to such a peptide, mAb available from such hybridoma cells and uses of the peptide and mAb.
  • mAb monoclonal antibodies
  • Monoclonal antibodies are antibodies that are produced by hybrid cell lines (so-called hybridomas), which are typically produced by fusing an antibody-producing B cell of animal or human origin with a suitable myeloma tumor cell.
  • the amino acid sequence of Human CD28 is under accession no. NM_006139 known.
  • the amino acid sequence of Human CTLA-4 is under accession no. L15006 known.
  • the amino acid sequence of Human ICOS is under accession no. AJ277832 known.
  • the amino acid sequence of Human PD-1 is under accession no. U64863 known.
  • the C'-D loop of CD28 comprises amino acids 52 to 66 of the above CD28 sequence (numbering according to FIG. 7, see also Ostrov, D.A., et al.; Science (2000), 290: 816-819).
  • the term “C'-D loop” should also be understood to mean any partial sequences from this.
  • a loop or a binding site arranged therein is freely accessible if there is no steric hindrance due to sequences or molecules connected to the loop for a defined binding partner for the binding site in the loop.
  • T-lymphocytes Activation of T-lymphocytes indicates the increase in metabolic activity, enlargement of the cell volume, synthesis of immunologically important molecules and entry into the cell division (proliferation) of T-lymphocytes due to an external stimulus. Inhibition is the opposite process. For example, such processes are caused by special occupation of the CD28 molecule on T cells
  • T-lymphocytes with the described side effects is part of the physiological immune reaction, but can get out of control in pathological situations (lymphoproliferative diseases) or be inadequate (immunodeficiency).
  • Modulation of the proliferation of T cells means either the intensification of the activation (in the case of pathologically inadequate activation) or the weakening or inhibition of the activation (in the case of pathologically lymphoproliferative diseases).
  • T cells mean at least the subgroups CD4 and CD8 T cells.
  • An analog peptide is a peptide whose amino acid sequence differs from that of the peptide to which it is analog, but binds a defined binding partner with at least the same affinity. Deviations in the sequence can be deletions, substitutions, insertions and elongations.
  • An analog peptide will usually have a tertiary (partial) structure and / or exposure in the context of a (cell surface) protein very similar to the peptide and otherwise only needs a binding site for the defined one in the region analogous to the direct binding region of the peptide To show or form attachment partners.
  • a mimicriver compound of a mAb is a natural or synthetic chemical structure that behaves in a binding assay like a defined mAb that the mimicriver compound mimicizes.
  • a mimicro connection of a C ' -D loop is a natural or synthetic chemical structure to which superagonistic mAb specific for a member of the CD28 family specifically bind.
  • the term mAb also includes structures which consist exclusively of the Fab fragment. It is also possible to use only the variable region, the heavy chain fragment being connected to the light chain fragment in a suitable manner, for example also by means of synthetic bridging molecules, in such a way that the binding regions of the chains form the antibody binding site.
  • the term antibody also includes (complete) chimeric and humanized antibodies.
  • Superagonistic modulation of T cell proliferation means that no costi ulation, i.e. no further binding event besides binding a mAb or a facial expression link to a member of the CD28 family is required to stimulate or inhibit proliferation.
  • a screening method comprises the use of a target, for example a partial sequence from CD28, one or more known or unknown substances being contacted with the target and a binding event being ascertained or not being ascertained. If a binding event is determined, the substance is selected. If a mixture of substances is used, a selection of the mixture is typically followed by a deconvolution in order to determine binding components in the selected mixture.
  • the CD28 family is a group of T cell surface receptors that have immunoregulatory activity. This can either be stimulating, as in Case of the CD28 or inhibitory as in the case of the CTLA-4.
  • the CD28 family includes CD28, CTLA-4, PD-1 and ICOS.
  • a substrate can be soluble, insoluble and / or immobilized.
  • a substrate can be formed from any natural or synthetic molecule, including from amino acid chains.
  • a protein or peptide in the terminology of this text need not necessarily be a protein or peptide in the usual definition.
  • a protein or peptide according to the terminology used here is also a protein or peptide in the terminology used in the art.
  • the activation of resting T cells for proliferation and functional differentiation first requires the occupation of two surface structures, so-called receptors: 1. the antigen receptor, which has a different specificity from cell to cell and for the detection of antigens, e.g. B. viral fission products is necessary; as well as the CD28 molecule expressed equally on all resting T cells with the exception of a subset of the CD8 T cells of humans, which naturally binds to ligands on the surface of other cells of the immune system.
  • mAbs which can initiate T cell proliferation alone.
  • T-lymphocytes by CD28-specific mAb were observed in the following systems: Brinkmann et al., J. Immunology, 1996, 156: 4100-4106, showed that a very small proportion (5%) of human T-lymphocytes that is for dormant
  • T-lymphocytes carry the typical surface marker CD45 RO, which is activated by the CD28-specific mAb 9.3 which normally requires costimulation when the growth factor interleukin-2 (IL-2) is added without the antigen receptor being occupied.
  • IL-2 growth factor interleukin-2
  • CD28-specific mAb produced in cell culture can activate a subset of human T cells for proliferation without occupying the antigen receptor if CD28 is occupied by this mAb and the cell-bound mAb are additionally crosslinked by further antibodies ,
  • the antibodies known in this respect have in common that only a small proportion of the T cells can be activated.
  • Antigen receptor can activate T lymphocytes of all classes in vitro and in the experimental animal for proliferation. Both mAb known in this respect result from an immunization with cells on which rat CD28 is expressed and are obtainable by different selections directed towards their respective described properties. Finally, another superagonistic mAb is known from literature reference WO 98/54225, namely CMY-2.
  • the superagonistic mAbs known in this respect do not yet meet the requirements with regard to the strength of the activating effect or the width of the activated subpopulations of T-lymphocytes in their stimulatory effect or do not have the required human specificity.
  • the invention is therefore based on the technical problem of specifying means with which superagonistic substances which bind specifically to one or more members of the CD28 family and have an improved stimulatory or inhibitory effect can be found, and specifying such substances.
  • the invention is based on the investigation of the binding regions of superagonistic mAb to CD28 and the interaction of the C'-D loop of CD28 with superagonistic mAb found in the course of these investigations.
  • the invention is based on the further finding that a corresponding binding region for superagonistic mAb can be found in the other members of the CD28 family, namely the C'-D loops there too.
  • Various aspects for technical teachings of the invention can be derived from this basic knowledge.
  • the invention teaches a protein or peptide containing the C'-D loop of a member of the CD28 family or containing an analogous peptide or containing a facial expression compound, but not a member of the CD28 family.
  • the essential element of a protein or peptide according to the invention is the C'-D loop structure (or an analog / a mimicri to it), regardless of whether and which sequences join on both sides of the loop. It is only essential that the loop structure is sufficiently exposed to provide access for superagonistic mAb or mimicrial connections and, in the case of the specific binding possibility, not to prevent binding for steric reasons.
  • a peptide in particular an oligopeptide (4-9 amino acids) or polypeptide (10-100 amino acids) or a facial expression compound therefor
  • the ends thereof are each bound to a binding site of a substrate, the binding sites of the substrate being spatially are arranged to one another in accordance with the binding sites for the C ' -D loop, the C'-D loop or the analogous peptide or the facial expression connection being fixed to it in a three-dimensional configuration according to the C ' -D loop, the bound C'- D Loop or the analog peptide or the mimicriver compound therefor are freely accessible for antibodies or mimicriver compounds therefor, and the substrate is not a member of the CD28 family without a C'-D loop. This creates a three-dimensional structure that enables binding with superagonistic substances.
  • a peptide or protein according to the invention can have an amino acid sequence SEQ ID 41 (Human CD28 Loop), but not Human CD28, SEQ ID 42 (Human CTLA-4 Loop), but not Human CTLA-4, SEQ ID 43 (Human ICOS Loop), but not Human ICOS, or SEQ ID 44 (Human PD-1 Loop), but not Human PD-1.
  • SEQ ID 41 Human CD28 Loop
  • SEQ ID 42 Human CTLA-4 Loop
  • SEQ ID 43 Human ICOS Loop
  • SEQ ID 44 Human PD-1 Loop
  • One or two amino acids according to FIG. 7 can be appended to this at the 3 ' end and / or at the 5' end.
  • Partial sequences thereof can be contained in peptides according to the invention, for example according to the sequences SEQ ID 1 to 4, respectively.
  • SEQ ID 5 to 10 indicate variants of the Human CD28 loop.
  • SEQ ID 12 to 17 indicate variants of the Human CTLA-4 loop.
  • SEQ ID 26 to 31 indicate variants of the Human PD-1 loop.
  • One or more amino acids of sequence 11 according to FIG. 7a can be connected to one of the sequences 1, 7 or 9.
  • One or more amino acids of sequence 18 according to FIG. 7a can be connected to one of the sequences 2, 14 or 16.
  • One or more amino acids of sequence 25 according to FIG. 7a can be connected to one of the sequences 3, 21 or 23.
  • One or more amino acids of sequence 32 according to FIG. 7a can be connected to one of the sequences 4, 28 or 30.
  • the sequences mentioned are areas according to the invention to which superagonistic mAb bind specifically. When comparing the sequences, one can see in particular that the primary structure of the loop for the respective
  • Family members is specific. By selecting the C'-D loop of a particular member and thus by using substances with specificity for this selected loop, an activation or inhibition of the proliferation can be brought about alternatively.
  • a (CD28-specific) protein, peptide or a facial expression compound according to the invention can be identified by subjecting one or more prospective proteins, peptides or facial expression compounds to a binding test with one of the mAb 9D7 or 5.11A and selecting binding peptides.
  • the mAb mentioned are new superagonistic CD28 specific mAb, which are described in detail in the experimental section.
  • proteins, peptides or Mimikri compounds according to the invention can be identified for the other members.
  • the invention further relates to a nucleic acid coding for a peptide according to the invention or for a protein containing such a peptide, but not coding for a member of the CD28 family, and to a plasmid containing such a nucleic acid.
  • a peptide, protein or a mimicro compound according to the invention for this purpose can be used in a method for producing mAb which superagonistically modulate the proliferation of T cells from several to all subgroups, a non-human mammal immunizing with the peptide, protein or the mimic compound for this purpose whereby cells are taken from the non-human mammal and hybridoma cells are produced from the cells, and the hybridoma cells thus obtained are selected with the proviso that their culture supernatant contains mAb which bind to the C ' -D loop of the peptide or protein, or bind to the facial expression connection for this purpose, such hybridoma cells and mAb obtainable with such hybridoma cells.
  • human mAb according to the invention can alternatively also be produced by selecting B lymphocytes which bind to the loop and cloning their expressed immunoglobulin genes.
  • human mAb according to the invention can be isolated from phage libraries. The average subject With his knowledge, man is readily able to carry out such processes, so that a detailed description can be dispensed with here.
  • the invention can also be used to identify new superagonistic CD28 family-specific mAb and / or facial expression compounds.
  • the invention therefore also relates to the use of a peptide, protein or a facial expression compound according to the invention in a screening process for the identification of substances which superagonistically modulate the proliferation of T cells from several to all subgroups, a prospective substance or a mixture of prospective substances are subjected to a binding assay with the peptide or protein, and substances which bind to the peptide or protein are selected.
  • all customary binding assays can be used.
  • the search for facial expression compounds can be of particular importance here, since these are typically so-called small molecules which have pharmacological advantages over macromolecules.
  • a substance library can be screened with high throughput.
  • Both a peptide, protein or mimicri compound according to the invention and the mAb or mimicrial compounds according to the invention for this purpose are of therapeutic importance since lymphoproliferative diseases by inhibiting proliferation as well
  • Immunodeficiency disorders can be treated by activating proliferation. Also the induction of effector functions, eg secretion of Effective substances is possible. This is done by selecting or designing the mAb or the facial expression compound in accordance with a specificity and high affinity for a specific member of the CD28 family. If a further increased specificity / affinity is desirable, for example to control surprising side effects, it can be done by looking for a second ligand in addition to the mAb or the facial expression compound with specificity for the specific family member, and the second ligand after analyzing the relative spatial positions the two ligands are linked to one another via a bridge connection with the mAb or the mimicriver connection, and so both ligands are stiffened against one another in the binding position.
  • the spatial position of two ligands relative to one another after binding to a target can be determined, for example, using X-ray structure analysis or multidimensional NMR correlation spectroscopy, for example 15 N / 1 H NMR.
  • a second ligand can be determined using conventional screening methods, with the special CD28 family member being used as the target. It is understood that the second ligand does not bind to the C'-D loop, but is spatially spaced from it.
  • a peptide, protein or a facial expression according to the invention which has no other physiological effect, competitively binds natural ligands of the members of the CD28 family and thus achieves a reverse effect by preventing pathologically induced natural activation or inhibition ,
  • the invention also relates to the use of a peptide, protein or Facial expression compound for this purpose for the production of a pharmaceutical composition for modulating the physiological T-cell proliferation.
  • the invention therefore relates to the use of a mAb according to the invention or a facial expression compound according to the invention for this purpose for the production of a pharmaceutical composition for the treatment of diseases with pathologically reduced CD4-T cell numbers, in particular AIDS, for the production of a pharmaceutical composition for the treatment after stem cell transplants in the course of chemotherapy. or radiation therapy for leukemic diseases, for the manufacture of a pharmaceutical composition for potentiating and / or influencing the quality of
  • the invention also relates to healing methods in which a pharmaceutical composition according to the invention is administered to a person suffering from a proliferative or immunodeficient disease.
  • Fig. 4 Binding of different human CD28-specific mAbs to CD28 (a) as well as costimulatory (b) and superagonistic, i.e. directly stimulatory (c) activity of the mAb from FIG. 4a,
  • Fig. 7 Sequence alignment with emphasis on the C'-D loop or analog structures, for different
  • the methodology corresponds to that as described in literature reference W098 / 54225, to which full reference is made here and below and their
  • the content of the disclosure is hereby incorporated into the present text.
  • the costimulation is shown in FIG. 1 a, ie T-cell receptor (TCR) -specific mAbs were bound to the plastic surface in all wells. In the absence of costimulation, the negative control (top row) shows no installation. Costimulation is then given in soluble form by the addition of CD28-specific mAb. The entire range of CD28-specific mAb shown was used. This series of different CD28-specific mAbs originates from an approach of immunization and production of hybridoma cell lines already described in WO98 / 54225.
  • CD28-specific mAbs bind to different areas of the CD28 molecule.
  • the mAb were determined by Immunization of mice made with rat CD28; therefore, as expected, they all do not react with mouse CD28 (not shown). Since the mAb can only recognize those regions of the rat CD28 molecule that differ from that of the mouse, a
  • Rat CD28-specific mAb was JJ319, for a superagonistic mAb JJ316 was used (see W098 / 54225).
  • FIG. 3 The mapping of the binding is shown in FIG.
  • Expression plasmids were constructed in which part of the extracellular domain of CD28 originates from the mouse and another part from the rat. This is represented symbolically by bars and dashes; to the right is shown the binding of mAb JJ316 and JJ319 to mouse fibroblasts (L929 cells) that had been transfected with these expression plasmids.
  • Fig. 3 m / r and r / m 1-37
  • the binding of both antibodies to the "right" half of the sequence is mapped: both bind if this originates from the rat; No binding takes place in the reverse construct (rm CD28 1-37, left rat, right mouse).
  • the third line (m / r CD28 1-66) shows that JJ316 no longer binds, while the part of the rat sequence ("right") that is still available is still sufficient for recognition by JJ319. Accordingly, the two mAb recognize different epitopes on the CD28 molecule and the binding of the superagonist JJ316 must therefore be sought in the region that is in the first line construct, but not the third line construct was from the rat. The clear candidate for this is the area encased in FIG. 2.
  • mice were immunized with human CD28-transfected A20 / J mouse B lymphoma cells (see WO98 / 54225) and additionally boosted before fusion with commercially available human CD28-Fc fusion protein (purchased from R and D Systems).
  • human CD28-transfected A20 / J mouse B lymphoma cells see WO98 / 54225
  • commercially available human CD28-Fc fusion protein purchased from R and D Systems.
  • 24 were identified from several thousand cell lines that produce human CD28-specific mAb (binding to mouse L929 cells, expressing human CD28, but not on untransfected L929 cells), analogous to the screen in literature reference W098 / 54225.
  • the two superagonistic mAbs are described in particular below.
  • the newly generated mAb 7.3B6 is used as an example of a conventional human CD28-specific mAb.
  • FIG. 4a shows that the preparations used for the three new mAbs bind to human T lymphocytes comparatively well and also with a comparable titer.
  • An experiment is shown in which freshly isolated mononuclear cells from human blood (so-called PBMC) were first treated with various dilution levels of the mAb used on ice; then it was washed and the bound mAb visualized by a fluorescent dye-labeled secondary antibody that specifically recognizes the bound mouse mAb.
  • PBMC mononuclear cells from human blood
  • the binding of the titrated mAb could be determined selectively for CD4 T lymphocytes by electronic gating.
  • MFI is the average
  • Fluorescence intensity which is a measure of the amount of bound CD28-specific mAb.
  • concentrations represent 3-fold dilutions of a standardized starting preparation. It is quite normal for this test to give the highest concentration a weaker signal than the following titration steps; this has to do with avidity (bivalent Binding) of mAb and plays no role in the contexts discussed here.
  • Figures 4b and c compare the ability of these three new CD28-specific mAb to stimulate freshly isolated human T cells to grow in the presence and absence of a TCR signal.
  • a 3H-thymidine incorporation is again shown, as described above for the rat.
  • the wells were coated with a mAb that reacts with the human TCR / CD3 complex. So costimulation was measured. It can be seen that there is no proliferation without costimulation with one of the mAbs (negative control), but all three antibodies are able to stimulate cell division.
  • Figure 4c was worked in the absence of a TCR / CD3 specific mAb. Only antibodies 9D7 and 5.11A were able to stimulate superagonistically.
  • FIG. 2 A three-dimensional model of the CD28 molecule is shown in FIG. The newly identified binding region is highlighted. It corresponds to the encased sequence in FIG. 2.
  • the extracellular domain of CD28 belongs structurally to the so-called immunoglobulin superfamily, which is characterized by two superimposed ⁇ -sheets as the basic structure. These tapes are labeled according to a pattern given in the literature. It is important for the representation shown here that the region identified as an epitope for superagonistic CD28-specific mAbs in rats and mice is referred to as "C'-D loop".
  • mAb with specificity for the C'-D loop of the CD28 molecule had superagonistic activity possess, that is, can be used for the activation of T-lymphocytes in the sense of the literature reference W098 / 54225.
  • the superagonistic activity of the C'-D loop of specific mAbs in rats and humans shows that it is not the sequence of the epitope that matters, but its location or shape.
  • CD28 belongs to a family of cell surface receptors with immunoregulatory activity. This is either stimulating (CD28, ICOS) or inhibiting (CTLA-4, PD-1).
  • FIG. 7 shows the sequences of the known members of the CD28 family in the sense of an "alignment”. The C'-D Loop for CD28 is highlighted. Analog loops of the other molecules (encapsulated) are a correspondingly good target structure for the development of superagonistic ligands. Regarding FIG. 7, it should be noted that "-" represents a gap in the alignment, i.e. the subsequent amino acids are directly linked.
  • mouse T tumor cells, BW were either transfected with the construct of FIG. 3, line 5, (rat C'-D loop transmission) or with the construct of FIG. 5, line 3, (human C'-D loop) , The activation of these cells is not measured by cell division (they proliferate anyway), but by the production of the cytokine IL-2.
  • Figure 8 first shows that without stimulation, no IL-2 production done (negative control).
  • FIG. 8a shows the results when using the rat superagonistic mAb JJ316
  • FIG. 8b shows results for the mAb 5.11A specific for human C'-D loop. In both cases the respective cell lines are stimulated for IL-2 production. As expected, however, the stimulation does not take place by means of "conventional" CD28-specific mAb, since these not only do not bind to the C-D loop, but cannot recognize the construct at all, because they are specific for rat- or human-specific sequences that are specific to the construct are not included.
  • FIG. 9a shows the nuclear acid sequence of the variable region of the light chain of an mAb 9D7 according to the invention (SEQ-ID 33).
  • FIG. 9b shows the peptide encoded in this way (SEQ-ID 34).
  • FIG. 9c shows the nuclear acid sequence of the variable region of the heavy chain of this mAb (SEQ-ID 35).
  • Figure 9d is the peptide encoded thereby (SEQ ID 36).
  • FIG. 9e shows the nuclear acid sequence of the variable region of the heavy chain of a mAb 5.
  • ILA according to the invention SEQ-ID 37
  • FIG. 9f shows the peptide encoded in this way
  • FIG. 9g shows the nuclear acid sequence of the variable region of the light chain of this mAb (SEQ-ID 39).
  • Figure 9h is the peptide encoded thereby (SEQ-ID 40).
  • Figure 10 shows the humanized variable domain of mAb 5.11A. 10a shows the light chain and FIG. 10b shows the heavy chain. Table I:

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Protein oder Peptid enthaltend das C'-D Loop eines Mitgliedes der CD28 Familie sowie dessen Verwendungen und damit erhältliche mAb.

Description

Peptid oder Protein enthaltend ein C'-D Loop der CD2i
Rezeptorfamilie
Gebiet der Erfindung.
Die Erfindung betrifft ein Protein oder Peptid enthaltend eine Teilsequenz eines Mitgliedes der CD28 Familie, eine Nukleinsäure codierend für ein solches Pep- tid, ein Plasmid enthaltend eine solche Nukleinsäure, Hybridomzellen, welche monoklonale Antikörper (mAb) bilden, die an ein solches Peptid binden, aus solchen Hybridomzellen erhältliche mAb sowie Verwendungen des Peptids und der mAb.
Definitionen.
Als monoklonale Antikörper sind Antikörper bezeichnet, die von Hybrid-Zellinien (sog. Hybridomen) produziert werden, die typischerweise durch Fusion einer Antikörper produzierenden B-Zelle tierischer oder menschlicher Herkunft mit einer geeigneten Myelom Tumorzelle entstanden sind.
Die Aminosäuresequenz von Human CD28 ist unter der Accession No. NM_006139 bekannt.
Die Aminosäuresequenz von Human CTLA-4 ist unter der Accession No. L15006 bekannt.
Die Aminosäuresequenz von Human ICOS ist unter der Accession No. AJ277832 bekannt. Die Aminosäuresequenz von Human PD-1 ist unter der Accession No. U64863 bekannt.
Das C'-D Loop von CD28 umfaßt die Aminosäuren 52 bis 66 der vorstehenden CD28 Sequenz (Numerierung gemäß Fig. 7, siehe auch Ostrov, D.A. , et al . ; Science (2000), 290:816-819). Unter dem Begriff des C'-D Loops sollen im Folgenden auch beliebige Teilsequenzen hier- aus verstanden sein.
Ein Loop bzw. eine darin angeordnete Bindungsstelle ist frei zugänglich, wenn für einen definierten Bindungspartner für die Bindungsstelle im Loop keine ste- rische Hinderung durch an das Loop anschließende Sequenzen oder Moleküle vorliegt.
Mit Aktivierung von T-Lymphozyten ist die Vermehrung der Stoffwechselaktivität, Vergrößerung des Zellvolu- mens, Synthese immunologisch wichtiger Moleküle und Eintritt in die Zellteilung (Proliferation) von T-Lymphozyten auf einen äußeren Reiz hin bezeichnet. Inhibierung ist der hierzu entgegengesetzte Prozeß. Beispielsweise werden solche Vorgänge durch Besetzung des CD28-Moleküls auf T-Zellen durch besondere
CD28-spezifische monoklonale Antikörper ausgelöst. Die Aktivierung von T-Lymphozyten mit den beschriebenen Begleiterscheinungen ist Teil der physiologischen Immunreaktion, kann dort aber in pathologischen Situa- tionen außer Kontrolle geraten (lymphoproliferative Erkrankungen) , oder unzureichend sein ( Immundefizienz) . Modulation der Proliferation von T-Zellen meint entweder die Verstärkung der Aktivierung (bei pathologisch unzureichender Aktivierung) oder Abschwächung bzw. Inhibierung der Aktivierung (bei pathologisch lympho- proliferativen Erkrankungen) .
Mehrere Untergruppen der T-Zellen meint zumindest die Untergruppen CD4 und CD8 T-Zellen.
Ein analoges Peptid ist ein Peptid, dessen Aminosäuresequenz von jener des Peptids, zu welchem es analog ist, abweicht, jedoch einen definierten Bindungspartner mit zumindest gleicher Affinität bindet. Abweichungen in der Sequenz können Deletionen, Substitutio- nen, Insertionen und Elongationen sein. Ein analoges Peptid wird in der Regel eine dem Peptid sehr ähnliche Tertiär (teil) Struktur und/oder Exposition im Rahmen eines (Zelloberflächen-) Proteins aufweisen und braucht ansonsten nur im dem dem unmittelbaren Bin- dungsbereich des Peptids analogen Bereich eine Bindungsstelle für den definierten Bindungspartner aufzuweisen bzw. diese bilden.
Eine Mimikriverbindung eines mAb ist eine natürliche oder synthetische chemische Struktur, die sich in einem Bindungsassay wie ein definierter mAb verhält, welchen die Mimikriverbindung mimikriert.
Eine Mimikriverbindung eines C'-D Loops ist eine na- türliche oder synthetische chemische Struktur, an welche superagonistische und für ein Mitglied der CD28 Familie spezifische mAb spezifisch binden. Der Begriff der mAb umfaßt neben Strukturen des üblichen Fab/Fc Aufbaus auch Strukturen, die ausschließlich aus dem Fab-Fragment bestehen. Es ist auch möglich, lediglich die variable Region zu Nutzen, wobei das Fragment der schweren Ketten mit dem Fragment der leichten Kette auf geeignete Weise, beispielsweise auch mittels synthetischer Brückenmoleküle, so verbunden ist, daß die Bindungsregionen der Ketten die Antikörperbindungsstelle bilden. Der Begriff der Antikör- per umfaßt auch (vollständige) chimäre sowie humanisierte Antikörper.
Superagonistische Modulation der Proliferation von T-Zellen meint, daß keine Costi ulation, i.e. kein weiteres Bindungsereignis neben einer Bindung eines mAb oder einer Mimikriverbindung an ein Mitglied der CD28 Familie zur Stimulation oder Inhibierung der Proliferation erforderlich ist.
Ein Screening Verfahren umfaßt dem Einsatz eines Targets, beispielsweise einer Teilsequenz aus CD28, wobei eine oder mehrere bekannte oder unbekannte Substanzen mit dem Target kontaktiert wird und ein Bindungsereignis festgestellt oder nicht festgestellt wird. Im Falle der Feststellung eines Bindungsereignisses wird die Substanz selektiert. Im Falle des Einsatzes einer Mischung von Substanzen schließt sich typischerweise einer Selektion der Mischung eine Dekonvolution an zwecks Ermittelung bindender Komponenten in der selektierten Mischung.
Als CD28 Familie ist eine Gruppe von T-Zelloberflächen- rezeptoren bezeichnet, die immunregulatorische Aktivität aufweisen. Dies kann entweder stimulierend sein, wie im Falle des CD28 oder inhibierend, wie im Falle des CTLA-4. Zur CD28 Familie gehören CD28, CTLA-4, PD-1 und ICOS.
Ein Substrat kann löslich, unlöslich und/oder immobilisiert sein. Ein Substrat kann aus beliebigen natürlichen oder synthetischen Molekülen gebildet sein, u.a. aus Aminosäurenketten. Insofern muß ein Protein oder Peptid in der Terminologie dieses Textes nicht notwendigerweise ein Protein oder Peptid in üblicher Definition sein. In der Regel ist ein Protein oder Peptid nach der hier verwendeten Terminologie allerdings auch ein Protein oder Peptid in fachüblicher Terminologie.
Hintergrund der Erfindung und Stand der Technik.
Zum Verständnis der Erfindung ist zunächst folgender technologischer Hintergrund wichtig. Die Aktivierung ruhender T-Zellen zur Proliferation und funktionellen Differenzierung erfordert zunächst die Besetzung zweier Oberflächenstrukturen, sogenannter Rezeptoren: 1. des Antigenrezeptors, der von Zelle zu Zelle eine unterschiedliche Spezifität besitzt und für die Erkennung von Antigenen, z. B. viralen Spaltprodukten, notwendig ist; sowie des auf allen ruhenden T-Zellen mit Ausnahme einer Untergruppe der CD8 T-Zellen des Menschen gleichermaßen exprimierten CD28 Moleküls, welches natürlicherweise an Liganden auf der Oberfläche anderer Zellen des Immunsystems bindet. Man spricht von der Costimulation der antigenspezifischen Immunreaktion durch CD28. In Zellkultur können diese Vorgänge nachgestellt werden durch Besetzung des Antigenrezeptors sowie des CD28-Moleküls mit geeigneten mAbs . Im klassischen System der Costimulation führt weder die Besetzung des Antigenrezeptors noch die des CD28-Moleküls allein zur T-Zellproliferation, die Besetzung beider Rezeptoren ist jedoch effektiv. Diese Beobachtung wurde an T-Zellen des Menschen, der Maus und der Ratte gemacht.
Dagegen sind auch mAbs bekannt, die allein die T-Zellproliferation einleiten können. Eine solche superagonistische, d. h. von der Besetzung des Anti- genrezeptors unabhängige Aktivierung ruhender
T-Lymphozyten durch CD28-spezifische mAb, wurde in folgenden Systemen beobachtet: in der Literaturstelle Brinkmann et al., J. Immunology, 1996, 156: 4100-4106 wurde gezeigt, daß ein sehr kleiner Anteil (5 %) menschlicher T-Lymphozyten, die den für ruhende
T-Lymphozyten typischen Oberflächenmarker CD45 RO tragen, durch den normalerweise Costimulation erfordernden CD28-spezifischen mAb 9.3 bei Zusatz des Wachstumsfaktors Interleukin-2 (IL-2) ohne Besetzung des Antigenrezeptors aktiviert wird. In der Arbeit von Siefken et al., Cellular Immunology, 1997, 176: 59-65, wurde gezeigt, daß ein auf konventionellem Wege, d.h. durch Immunisierung von Mäusen mit menschlichen T-Zellen, hergestellter CD28-spezifischer mAb in Zellkultur eine Untergruppe menschlicher T-Zellen ohne Besetzung des Antigenrezeptors zur Proliferation aktivieren kann, wenn CD28 durch diesen mAb besetzt wird und die zellgebundenen mAb zusätzlich durch weitere Antikörper miteinander vernetzt werden. Den insofern bekannten Antikörpern ist gemeinsam, daß nur ein kleiner Anteil der T-Zellen aktivierbar ist.
In der Arbeit von Tacke et al., Eur. J. Immunol., 1997, 27:239-247 wurden zwei Arten von CD28-spezifischen mono- klonalen Antikörpern mit unterschiedlichen funktioneilen Eigenschaften beschrieben: costimulatorische mAb, die die Aktivierung ruhender T-Zellen nur bei gleichzeitiger Besetzung des Antigenrezeptors costimulieren; und superagonistische mAb, die ohne Besetzung des
Antigenrezeptors T-Lymphozyten aller Klassen in vitro und im Versuchstier zur Proliferation aktivieren können. Beide insofern bekannte mAb rühren aus einer Immunisierung mit Zellen, auf denen Ratten-CD28 exprimiert ist und sind durch auf ihre jeweiligen beschriebenen Eigenschaften gerichtete unterschiedlichen Selektionen erhältlich. Schließlich ist aus der Literaturstelle WO 98/54225 ein weiterer superagonistischer mAb bekannt, nämlich CMY-2.
Die insofern bekannten superagonistischen mAb genügen in ihrer stimulatorischen Wirkung jedoch noch nicht den Anforderungen hinsichtlich der Stärke des aktivierenden Effektes oder der Breite der aktivierten Subpopulationen von T-Lymphozyten oder weisen nicht die erforderliche Humanspezifität auf.
Technisches Problem der Erfindung.
Der Erfindung liegt daher das technische Problem zu Grunde Mittel anzugeben, mit welchen sich superagonistische Substanzen, die an eines oder mehrere Mitglieder der CD28 Familie spezifisch binden und eine verbesserte stimulatorische oder inhibierende Wirkung aufweisen, finden lassen, sowie solche Substanzen anzugeben. Die der Erfindung zu Grunde liegende Erkenntnis.
Der Erfindung liegt die Untersuchung der Bindungsbereiche von superagonistischen mAb an CD28 zu Grunde sowie die im Zuge dieser Untersuchungen gefundene Wechselwirkung des C'-D Loop von CD28 mit superagonistischen mAb. Der Erfindung liegt die weitere Erkenntnis zu Grunde, daß ein entsprechender Bindungsbereich für superagonistische mAb in den anderen Mitgliedern der CD28 Familie zu finden ist, nämlich auch dort die C'-D Loops . Aus dieser grundsätzlichen Erkenntnis leiten sich verschiedene Aspekte für technische Lehren der Erfindung her.
Grundzüge der Erfindung und bevorzugte Ausführungsformen.
Zur Lösung dieses technischen Problems lehrt die Erfindung ein Protein oder Peptid enthaltend das C'-D Loop eines Mitgliedes der CD28 Familie oder enthaltend ein hierzu analoges Peptid oder enthaltend eine Mimikriverbindung hierzu, nicht jedoch ein Mitglied der CD28 Familie. Mit anderen Worten ausgedrückt, ist das wesentliche Element eines erfindungsgemäßen Proteins oder Peptids die C'-D Loop Struktur (oder eines Analogen/einer Mimikri hierzu) , und zwar unabhängig davon, ob und welche Sequenzen sich beidseitig des Loops anschließen. Wesentlich ist lediglich, daß die Loop Struktur hinreichend exponiert ist, um Zugang für superagonistische mAb oder Mimikriverbindungen zu bieten und im Falle der spezifischen Bindungsmöglichkeit eine Bindung nicht aus sterischen Gründen zu verhindern. Im Rahmen der Erfindung ist es dabei überraschend, daß alle gefundenen superagonistischen CD28 spezifischen mAb an den C'-D Loop binden, während nicht-superagonistische CD28 spezifische mAb nicht dorthin binden. Mit einer einzigen Gruppe von Zielstrukturen hinsichtlich ihrer räumlichen Anordnung auf Mitgliedern der CD28 Familie werden somit prospektive Wirkstoffe gegen die unterschiedlichsten Erkrankungen zugänglich.
In der Ausführungsform eines Peptids, insbesondere eines Oligopeptids (4 - 9 Aminosäuren) oder Polypeptids (10 - 100 Aminosäuren) oder einer Mimikriverbindung hierzu, ist es bevorzugt, wenn dessen Enden an jeweils eine Bindungsstelle eines Substrats gebunden sind, wobei die Bindungsstellen des Subtrats räumlich zueinander gemäß den Bindungsstellen für das C'-D Loop angeordnet sind, wobei das C'-D Loop oder das hierzu analoge Peptid oder die Mimikriverbindung hierzu in einer dreidimensionalen Konfiguration gemäß dem C'-D Loop fixiert ist, wobei das gebundene C'-D Loop oder das hierzu analoge Peptid oder die Mimikriverbindung hierzu für Antikörper oder Mimikriverbindungen hierzu frei zugänglich sind, und wobei das Substrat nicht ein Mitglied der CD28 Familie ohne C'-D Loop ist. Hierdurch wird eine eine Bindung mit superagonistischen Substanzen ermöglichende dreidimensionale Struktur eingerichtet.
Im Einzelnen kann ein erfindungsgemäßes Peptid oder Protein eine Aminosäurensequenz Seq.-ID 41 (Human CD28 Loop), nicht jedoch Human CD28, Seq.-ID 42 (Human CTLA-4 Loop), nicht jedoch Human CTLA-4, Seq.-ID 43 (Human ICOS Loop), nicht jedoch Human ICOS, oder Seq.-ID 44 (Human PD-1 Loop), nicht jedoch Human PD-1, enthalten. Hieran können am 3 ' -Ende und/oder am 5 '-Ende ein oder zwei Aminosäuren gemäß Fig. 7 angehängt sein. Aber auch Teilsequenzen daraus können in erfindungsgemäßen Peptiden enthalten sein, beispielsweise gemäß der Sequenzen Seq.-ID 1 bis 4, respektive. Die Seq.-ID 5 bis 10 geben Varianten des Human CD28 Loops an. Die Seq.-ID 12 bis 17 geben Varianten des Human CTLA-4 Loops an. Die Seq.-ID 19 bis 24 bis geben Varianten des Human ICOS Loops an. Die Seq.-ID 26 bis 31 geben Varianten des Human PD-1 Loops an. An eine der Sequenzen 1, 7 oder 9 kann eine oder mehrere Aminosäuren der Sequenz 11 gemäß der Fig. 7a angeschlossen sein. An eine der Sequenzen 2, 14 oder 16 kann eine oder mehrere Aminosäuren der Sequenz 18 gemäß der Fig. 7a angeschlossen sein. An eine der Sequenzen 3, 21 oder 23 kann eine oder mehrere Aminosäuren der Sequenz 25 gemäß der Fig. 7a angeschlossen sein. An eine der Sequenzen 4, 28 oder 30 kann eine oder mehrere Aminosäuren der Sequenz 32 gemäß der Fig. 7a angeschlossen sein. Bei den genannten Sequenzen handelt es sich um erfindungsgemäße Bereiche, an welche superagonistische mAb spezifisch binden. Man erkennt bei Vergleich der Sequenzen insbesondere, daß die Primärstruktur des Loops für die jeweiligen
Familienmitglieder spezifisch ist. Durch Auswahl des C'-D Loops eines bestimmten Mitgliedes und somit durch Einsatz von Substanzen mit Spezifität für dieses ausgewählte Loop kann somit gezielt alternativ eine Aktivierung oder Inhibierung der Proliferation bewirkt werden.
Ein (CD28 spezifisches) erfindungsgemäßes Protein, Peptid oder eine Mimikriverbindung hierzu läßt sich dadurch identifizieren, daß ein oder mehrere prospektive Proteine, Peptide oder Mimikriverbindungen einem Bindungstest mit einem der mAb 9D7 oder 5.11A unterworfen und bindende Peptide selektiert werden. Bei den genannten mAb handelt es sich um neue superagonistische CD28 spezifische mAb, die im experimentellen Teil im Detail beschrieben werden. Mittels entsprechender mAb mit Spezifität gegenüber einem C'-D Loop eines anderen CD28 Familienmitgliedes lassen sich für die anderen Mitglieder spezifische erfindungsgemäße Proteine, Peptide oder Mimikri Verbindungen identifizieren.
Die Erfindung betrifft weiterhin eine Nukleinsäure codierend für ein erfindungsgemäßes Peptid oder für ein ein solches Peptid enthaltendes Protein, nicht jedoch codierend für ein Mitglied der CD28 Familie, sowie ein Plasmid enthaltend eine solche Nukleinsäure.
Ein erfindungsgemäßes Peptid, Protein oder eine erfindungsgemäße Mimikriverbindung hierzu kann in einem Verfahren zur Herstellung von mAb eingesetzt werden, die superagonistisch die Proliferation von T-Zellen mehrerer bis aller Untergruppen modulieren, wobei ein nichtmenschliches Säugetier mit dem Peptid, Protein, oder der Mimkriverbindung hierzu immunisiert wird, wobei aus dem nichtmenschlichen Säugetier Zellen entnommen und aus den Zellen Hybridomzellen hergestellt werden, und wobei die so erhaltenen Hybridomzellen mit der Maßgabe selektiert werden, daß in deren Kulturüberstand mAb enthalten sind, die an das C'-D Loop des Peptids oder Proteins, oder an die Mimikriverbindung hierzu binden, solche Hybridomzellen sowie mAb erhältlich mit solchen Hybridomzellen. Erfindungsgemäße mAb aus dem Menschen lassen sich alternativ aber auch dadurch herstellen, daß B-Lymphozyten selektiert werden, welche an das Loop binden, und deren exprimierte Immunglobulingene kloniert werden. Weiterhin lassen erfindungsgemäße menschliche mAb aus Phagenbibliotheken isolieren. Der Durchschnittsfach- mann ist mit seinen Kenntnissen ohne weiteres in der Lage, solche Verfahren auszuführen, so daß von einer detaillierten Beschreibung hier abgesehen werden kann.
Mit der Erfindung lassen sich aber auch neue superagonistische CD28 Familien-spezifische mAb und/oder Mimikriverbindungen identifizieren. Daher betrifft die Erfindung auch die Verwendung eines erfindungsgemäßen Peptids, Proteins, oder einer erfindungsgemäßen Mimikriverbindung hierzu in einem Screeningverfahren zur Identifizierung von Substanzen, die superagonistisch die Proliferation von T-Zellen mehrerer bis aller Untergruppen modulieren, wobei eine prospektive Substanz oder eine Mischung von prospektiven Substanzen einem Bindungsassay mit dem Peptid oder Protein unterworfen werden, und wobei an das Peptid oder Protein bindende Substanzen selektiert werden. Eingesetzt werden können grundsätzlich alle fachüblichen Bindungsassays . Von besondere Bedeutung kann hierbei die Suche nach Mimikriverbindungen sein, da diese typischerweise sogenannte small molecules sind, die gegenüber Makromolekülen pharmakologische Vorteile aufweisen. In einem solchen Screening Verfahren nach Mimikri Verbindungen kann mit hohem Durchsatz eine Stoffbibliothek gescreent werden.
Sowohl ein erfindungsgemäßes Peptid, Protein oder Mimikri Verbindung hierzu als auch die erfindungsgemäßen mAb oder Mimikriverbindungen hierzu haben therapeutische Bedeutung, da damit lymphoproliferative Erkrankungen durch Inhibierung der Proliferation ebenso wie
Immundefizienz-Erkrankungen durch Aktivierung der Proliferation behandelt werden können. Auch die Induktion von Effektorfunktionen, z.B. Sekretion von Effektorsubstanzen, ist möglich. Dies erfolgt durch Selektion oder Design des mAb oder der Mimikriverbindung nach Maßgabe einer Spezifität und hohen Affinität für ein bestimmtes Mitglied der CD28 Familie. Ist eine weiter erhöhte Spezifität/Affinität wünschenwert, beispielsweise zur Beherrschung überraschender Nebenwirkungen, so kann so vorgegangen werden, daß ein zweiter Ligand neben dem mAb oder der Mimikriverbindung mit Spezifität für das spezielle Familienmitglied gesucht wird, und der zweite Ligand nach Analyse der relativen räumlichen Positionen der beiden Liganden zueinander über eine Brückenverbindung mit dem mAb bzw. der Mimikriverbindung verknüpft wird und so beide Liganden gleichsam gegeneinander in Bindungsstellung ausgesteift werden. Die Bestimmung der räumlichen Position zweier Liganden zueinander nach Bindung an ein Target kann beispielsweise mit Röntgenstrukturanalyse oder mehrdimensionaler NMR Korrelationsspektroskopie, beispielsweise 15N/1H NMR, erfolgen. Ein zweiter Ligand läßt sich mittels üblicher Screening Methoden ermitteln, wobei das spezielle CD28 Familienmitglied als Target eingesetzt wird. Es versteht sich, daß der zweite Ligand nicht am C'-D Loop bindet, sondern räumlich hiervon beabstandet. Auf der anderen Seite ist es möglich, daß ein erfindungsgemäßes Peptid, Protein oder eine Mimikriverbindung hierzu, welches keine sonstige physiologische Wirkung aufweist, natürliche Liganden der Mitglieder der CD28 Familie kompetitiv bindet und so durch Verhinderung einer pathologisch bedingten natürlichen Aktivierung oder Inhibierung einen reversen Effekt erzielt.
Daher betrifft die Erfindung einerseits auch die Verwendung eines erfindungsgemäßen Peptids, Proteins oder Mimikriverbindung hierzu zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Modulation der physiologischen T-Zeil-Proliferation.
Andererseits betrifft daher die Erfindung die Verwendung eines erfindungsgemäßen mAb oder einer erfindungsgemäßen Mimikriverbindung hierzu zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Erkrankungen mit pathologisch erniedrigten CD4-T-Zellzahlen, insbesondere AIDS, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung nach Stammzelltransplantationen in Verfolg von Chemo- oder Strahlentherapie bei leukämischen Erkrankungen, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Potenzierung und/oder qualitativen Beeinflussung von
Immunreaktionen bei Schutzimpfungen, und zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von autoimmun-inflammatorischen Erkrankungen .
Die Erfindung betrifft schließlich auch Heilverfahren, bei welchen einer an einer proliferativen oder immundefizienten Erkrankung leidenden Person eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung verabreicht wird.
Im Folgenden wird die Erfindung anhand von lediglich Ausführungsformen darstellenden Beispielen näher erläutert. Es zeigen:
Fig. 1: Stimulation von T-Lymphozyten der Ratte mit verschiedenen CD28 spezifischen mAb (a: Costimulation, b: superagonistische, i.e. direkte, Stimulation) , Fig. 2: einen Sequenzvergleich zwischen Maus, Ratte und Human CD28 im Bereich des C'-D Loops (eingekastelt) ,
Fig. 3: experimentelle Ergebnisse zur Lokalisierung der Bmdungsstelle superagonistischer mAb am CD28 Moleküle der Ratte,
Fig. 4: Bindung von verschiedenen human CD28 spezifischen mAb an CD28 (a) sowie costimulatorische (b) und superagonistische, i.e. direkt stimulatorische (c) Aktivität der mAb aus Figur 4a,
Fig. 5: Bindungsversuche, die belegen, daß human CD28 spezifische superagonistische mAb spezifisch an das C'-D Loop binden,
Fig. 6: eine dreidimensionale Darstellung von CD28 mit Markierung des C -D Loop,
Fig. 7: Sequenzalignment unter Hervorhebung des C'-D Loop bzw. analoger Strukturen, für verschiedene
Mitglieder der CD28 Familie, und
Fig. 8: Experimente zur Aktivierung von Zellen mittels erfmdungsgemaßer human CD28 spezifischer mAb und mutierter Maus CD28 Moleküle.
Fig. 9: Darstellung der Sequenzen SEQ-ID 33 - 40 (a - h)
Fig. 10: Humanisierte variable Domäne des mAb 5.11A (leichte Kette: VLC5.11=a; schwere Kette: VHC5.11=b) Fig. 1 zeigt die Stimulation frisch isolierter T-Lymphozyten der Ratte in Form eines 3H-Thymidin-Einbaus . Die Methodik entspricht jener, wie in der Literaturstelle W098/54225 beschrieben, auf welche hier und folgend vollumfänglich Bezug genommen wird und deren
Offenbarungsinhalt hiermit in den vorliegenden Text inkorporiert wird. In der Fig. la ist die Costimulation gezeigt, d. h. in allen Näpfen waren T-Zellrezeptor (TCR) -spezifische mAb an die Plastikoberfläche gebunden. Mangels Costimulation zeigt die Negativkontrolle (oberste Reihe) keinen Einbau. Costimulation wird sodann durch die Zugabe CD28-spezifischer mAb in löslicher Form gegeben. Zum Einsatz kam die gesamte gezeigte Palette CD28-spezifischer mAb. Diese Serie von verschiedenen CD28-spezifischen mAb stammt aus einem in W098/54225 bereits beschriebenen Ansatz der Immunisierung und Herstellung von Hybridom-Zelllinien. Es handelt sich um Kulturüberstände, die genug CD28-spezifische mAb für eine sättigende Bindung an die pro kultivierten 2xlOΛ5 T-Zellen enthielten. Der Figur la ist entnehmbar, daß sämtliche dieser mAb in der Lage sind, costimulierend zu aktivieren, d.h. in Anwesenheit der anti-TCR mAb den Thymidin-Einbau anzuregen. In Fig. lb ist die Stimulation in Abwesenheit TCR-spezifischer mAb gezeigt. Auch dieses Experiment wurde so durchgeführt, wie in der Literaturstelle W098/54225 beschrieben. Man erkennt, daß nur zwei mAb in der Lage sind, in Abwesenheit eines TCR-Signals die T-Lymphozyten zu stimulieren. Diese mAb besitzen also superagonistische Aktivität.
Im Weiteren wurde untersucht, ob costimulatorische und superagonistische CD28-spezifische mAb an unterschiedliche Bereiche des CD28-Moleküls binden. Die mAb wurden durch Immunisierung von Mäusen mit CD28 der Ratte hergestellt; erwartungsgemäß reagieren sie deshalb alle nicht mit Maus CD28 (nicht gezeigt) . Da die mAb also nur solche Bereiche des Ratten CD28-Moleküls erkennen können, die sich von dem der Maus unterscheiden, wurde zunächst ein
Sequenzvergleich zwischen CD28 der Maus und der Ratte vorgenommen (siehe Fig. 2, oberer Teil). Die Unterschiede zwischen beiden Spezies sind hervorgehoben. Zur Benennung der Aminosäuren wurde der Ein-Buchstaben-Code verwendet. Als Prototypen für einen konventionellen
Ratten-CD28-spezifischen mAb wurde JJ319, für einen superagonistischen mAb wurde JJ316 verwendet (siehe W098/54225) .
In Figur 3 ist die Kartierung der Bindung gezeigt. Es wurden Expressionsplasmide konstruiert, in denen ein Teil der extrazellulären Domäne von CD28 aus der Maus, ein anderer aus der Ratte stammt. Dies ist jeweils symbolisch durch Balken bzw. Striche dargestellt; rechts daneben ist die Bindung der mAb JJ316 und JJ319 an Maus-Fibroblasten (L929-Zellen) gezeigt, die mit diesen Expressionsplasmiden transfiziert worden waren. In den ersten beiden Zeilen der Abb. 3 (m/r und r/m 1-37) wird die Bindung beider Antikörper zur "rechten" Hälfte der Sequenz kartiert: Beide binden, wenn diese aus der Ratte stammt; Im umgekehrten Konstrukt (rm CD28 1-37, links Ratte, rechts Maus) findet keine Bindung statt. In der dritten Zeile (m/r CD28 1-66) wird gezeigt, dass JJ316 nicht mehr bindet, während der noch vorhandene Teil der Rattensequenz ("rechts") für die Erkennung durch JJ319 noch ausreicht. Demnach erkennen die beiden mAb unterschiedliche Epitope auf dem CD28-Molekül, und die Bindung des Superagonisten JJ316 muss folglich in dem Bereich zu suchen sein, der in dem Konstrukt der ersten Zeile, nicht aber in dem Konstrukt der dritten Zeile aus der Ratte stammte. Klarer Kandidat dafür ist der in Figur 2 eingekastelte Bereich.
In den Zeilen 4 und 5 der Figur 3 wurden deshalb zunächst zwei und dann drei Aminosäuren in diesem Bereich des Maus CD28-Moleküls so verändert, dass sie nun die Rattensequenz darstellen. Durch diese "Transplantation" von nur drei Aminosäuren konnte die Bindungsfähigkeit für mAb JJ316, nicht aber (wie erwartet) die von JJ319 übertragen werden. In Tab. 1 sind die Bindungsdaten für die ganze Palette CD28-spezifischer mAb zusammengefasst . Es ergibt sich eine eindeutige Korrelation: eine signifikante Bindung an den C'-D Loop der Ratte, der durch Übertragung der Aminosäurenpositionen 62, 64 und 65 auf das CD28 Molekül der Maus geschaffen wurde, zeigte sich nur für die beiden superagonistischen mAb JJ316 und 5S38.17, für die konventionellen (nur costimulatorischen) mAb dagegen nicht. Ein costimulatorischer mAb (5S35) erkennt das eingekastelte Epitop sehr schwach und bindet sehr stark an das "konventionelle" Epitop.
Die nächsten Figuren beschäftigen sich mit superagonistischen human-spezifischen mAb. Auch diese wurden in Mäusen hergestellt, reagieren also nicht mit dem CD28-Molekül der Maus. Die Mäuse wurden mit human-CD28-transfizierten A20/J Maus B-Lymphomzellen immunisiert (siehe W098/54225) und zusätzlich vor der Fusion mit käuflich erhältlichem human CD28-Fc Fusionsprotein geboostert (von R und D Systems gekauft) . In einer Serie von Fusionsexperimenten wurden aus mehreren Tausend Zelllinien 24 identifiziert, die human-CD28 spezifische mAb produzieren (Bindung an Maus L929 Zellen, die human-CD28 exprimieren, aber nicht an untransfizierte L929 Zellen) , analog zum Screen in der Literaturstelle W098/54225. Von diesen zeigten zwei die gesuchte superagonistische Aktivität (9D7 und 5.11A), während alle neuen mAb konventionelle costimulatorische Aktivität besitzen. Im Weiteren werden insbesondere die beiden superagonistischen mAb beschrieben. Als Beispiel für einen konventionellen human-CD28-spezifischen mAb wird der ebenfalls neu generierte mAb 7.3B6 verwendet.
Figur 4a zeigt, dass die verwendeten Präparate der drei neuen mAb vergleichbar gut und auch mit vergleichbarem Titer an menschliche T-Lymphozyten binden. Gezeigt ist ein Experiment, in dem frisch isolierte mononukleäre Zellen aus dem menschlichen Blut (sog. PBMC) zunächst mit verschiedenen Verdünnungsstufen der eingesetzten mAb auf Eis behandelt wurden; dann wurde gewaschen und der gebundene mAb durch einen Fluoreszenz-Farbstoff markierten Sekundärantikörper sichtbar gemacht, der spezifisch die gebundenen Maus mAb erkennt. Durch Verwendung eines weiteren mAb, der menschliche CD4 T-Zellen detektiert und an den ein zweiter Fluoreszenz-Farbstoff gebunden war, konnte die Bindung der titrierten mAb durch elektronisches gating selektiv für CD4 T-Lymphozyten bestimmt werden. Angegeben ist mit "MFI" die durchschnittliche
Fluoreszenzintensität, die ein Maß für die Menge des gebundenen CD28-spezifischen mAb darstellt. Die Konzentrationen stellen 3-fach Verdünnungen eines standardisierten Ausgangspräparats dar. Es ist durchaus normal, dass bei diesem Test die höchste Konzentration ein schwächeres Signal gibt als die folgenden Titrationsschritte; dies hat mit der Avidität (bivalente Bindung) von mAb zu tun und spielt in den hier diskutierten Zusammenhängen keinerlei Rolle.
In Figur 4b und c ist die Fähigkeit dieser drei neuen CD28-spezifischen mAb verglichen, - in An- und Abwesenheit eines TCR-Signals - frisch isolierte menschliche T-Zellen zum Wachstum zu stimulieren. Gezeigt ist wiederum ein 3H-Thymidin Einbau, wie vorstehend für die Ratte beschrieben. Für Figur 4b waren die Näpfe mit einem mAb beschichtet, der mit dem menschlichen TCR/CD3-Komplex reagiert. Es wurde also Costimulation gemessen. Man erkennt, daß die Proliferation ohne Costimulation mit einem der mAb ausbleibt (Negativkontrolle) , alle drei Antikörper sind jedoch in der Lage, die Zellteilung zu stimulieren. Für Figur 4c wurde in Abwesenheit eines TCR/CD3-spezifischen mAb gearbeitet. Nur die Antikörper 9D7 und 5.11A konnten superagonistisch stimulieren.
Nachdem das Epitop für superagonistische mAb bei der Ratte definiert ist und zwei neue superagonistische mAb mit Spezifität für menschliches CD28 isoliert worden waren, wurde überprüft, ob diese mAb an die entsprechende Stelle des menschlichen CD28-Moleküls binden. Wie aus Figur 2 ersichtlich, unterscheiden sich die CD28-Moleküle der Maus und des Menschen in zahlreichen Positionen. Aufbauend auf der Kartierung des superagonistischen Epitops bei der Ratte wurde deshalb direkt geprüft, ob sich die Bindungsstelle für das superagonistische Epitop auf menschlichem CD28 auf das CD28-Molekül der Maus durch "Transplantation" der fünf Aminosäuren dieses homologen Bereiches erreichen lässt. Die Ergebnisse sind in der Figur 5 gezeigt. Vor dem Hintergrund der homogen dargestellten Maus-Sequenz für die extrazelluläre Domäne des CD28 Moleküls (Mitte) sind als Striche die ausgetauschten (Maus zu human) Aminosäurepositionen dargestellt (unten) . Die Zahlen an der Seite geben zusätzlich noch die einzelnen Positionen und Mutationen an (F60V bedeutet z.B., dass an Position 60 das Phenylalanin der Maus durch ein Valin der menschlichen Sequenz ersetzt wurde) . Daneben ist die Bindung der drei untersuchten mAb dargestellt. Wie die Abbildung zeigt, erkennen zwar alle drei mAb menschliches CD28, nur die beiden mAb 9D7 und 5.11A reagieren jedoch mit dem Maus CD28-Molekül, dem die fünf Aminosäuren des menschlichen CD28 an der entscheidenden Stelle transplantiert worden waren. Angesichts der Vielfalt von Unterschieden ist diese gezielte Herstellung der Reaktivität überraschend und bestätigt in vollem Maße die aus den Experimenten mit
Ratten CD28 abgeleitete Erkenntnis, dass superagonistische mAb an eine bestimmte, nämlich diese Stelle des Moleküls binden müssen.
In Figur 6 ist ein dreidimensionales Modell des CD28-Moleküls gezeigt. Die neu identifizierte Bindungsregion ist hervorgehoben. Sie entspricht der eingekastelten Sequenz in Figur 2. Die extrazelluläre Domäne von CD28 gehört strukturell zur sog. Immunglobulin-Superfamilie, die sich durch zwei übereinanderliegende ß-Faltblätter als Grundstruktur auszeichnet. Die Beschriftung dieser Bänder erfolgt nach einem in der Literatur vorgegebenen Muster. Wichtig für die hier gezeigte Darstellung ist, dass die als Epitop für superagonistische CD28-spezifische mAb in Ratte und Maus identifizierte Region als "C'-D loop" bezeichnet wird. Es wurde also gezeigt, dass mAb mit Spezifität für den C'-D Loop des CD28-Moleküls superagonistische Aktivität besitzen, also im Sinne der Literaturstelle W098/54225 zur Aktivierung von T-Lymphozyten eingesetzt werden können. Die superagonistische Aktivität C'-D Loop spezifischer mAb in Ratte und Mensch zeigt, dass es dabei nicht auf die Sequenz des Epitops, sondern auf seine Lage bzw. Form ankommt .
CD28 gehört zu einer Familie von Zeiloberflächenrezeptoren mit immunregulatorischer Aktivität. Diese ist entweder stimulierend (CD28, ICOS), oder eine inhibierend (CTLA-4, PD-1). In Figur 7 sind die Sequenzen der bekannten Mitglieder der CD28-Familie im Sinne eines "alignment" zusammengestellt. Der C'-D Loop für CD28 ist hervorgehoben. Analoge Loops der anderen Moleküle (eingekastelt) sind eine entsprechend gute Zielstruktur für die Entwicklung superagonistischer Liganden. Zur Figur 7 ist anzumerken, daß "-" eine Lücke im Alignment darstellt, i.e. die daran anschließenden Aminosäuren unmittelbar miteinander verbunden sind.
In den Experimenten der Fig. 8 wurde untersucht, ob erfindungsgemäße mAb mit Spezifität für den C'-D Loop der Ratte bzw. des Menschen nicht nur an die Maus CD28 mit "transplantiertem" C'-D Loop der Ratte bzw. des Menschen binden (siehe Figuren 3 und 5), sondern ob auch tatsächlich eine Aktivierung erfolgt. Hierfür wurden T-Tumorzellen der Maus, BW, entweder mit dem Konstrukt der Figur 3, Zeile 5, (Ratten C'-D Loop Übertragung) oder mit dem Konstrukt der Figur 5, Zeile 3, (human C'-D Loop) transfiziert . Die Aktivierung dieser Zellen wird nicht durch Zellteilung gemessen (sie proliferieren ohnehin) , sondern durch die Produktion des Zytokins IL-2. Figur 8 zeigt zunächst, daß ohne Stimulation keine IL-2 Produktion erfolgt (Negativkontrolle) . Stimulation mit einem T-Zellrezeptor-spezifischen mAb induziert IL-2 Produktion (Positivkontrolle) . Figur 8a zeigt zeigt die Ergebnisse bei Einsatz des superagonistischen mAb JJ316 der Ratte, wahrend Figur 8b Ergebnisse f r den human C'-D Loop spezifischen mAb 5.11A zeigt. In beiden Fallen werden die jeweiligen Zelllmien zur IL-2 Produktion stimuliert. Erwartungsgemäß erfolgt die Stimulierung jedoch nicht mittels "konventioneller" CD28 spezifischer mAb, da diese nicht nur nicht an das C -D Loop bindet, sondern das Kontrukt überhaupt nicht erkennen können, weil sie für ratten- bzw. humanspezifische Sequenzen spezifisch sind, die dem Konstrukt nicht enthalten sind.
In der Figur 9a ist die Nuklemsauresequenz der variablen Region der light chain eines erfmdungsgemaßen mAb 9D7 wiedergegeben (SEQ-ID 33) . Figur 9b zeigt das hierdurch codierte Peptid (SEQ-ID 34) . Figur 9c zeigt die Nuklemsauresequenz der variable Region der heavy chain dieses mAb (SEQ-ID 35) . Figur 9d ist das hierdurch codierte Peptid (SEQ-ID 36) .
In der Figur 9e ist die Nuklemsauresequenz der variablen Region der heavy chain eines erfmdungsgemaßen mAb 5. ILA wiedergegeben (SEQ-ID 37) . Figur 9f zeigt das hierdurch codierte Peptid (SEQ-ID 38) . Figur 9g zeigt die Nuklemsauresequenz der variable Region der light chain dieses mAb (SEQ-ID 39) . Figur 9h ist das hierdurch codierte Peptid (SEQ-ID 40) . Figur 10 zeigt die humanisierte variable Domäne des mAb 5.11A. m Fig. 10a ist die leichte Kette und in Fig. 10b die schwere Kete dargestellt. Tabelle I:
Bindung von anti-Ratten CD28 mAb an Maus- und Ratten CD2i und verschiedene CD28 Mutanten.
mAb Maus CD28 Ratten CD28 mCD28, S62P m/rCD28
A64V, E65G Mval269I
Kontr. - - - -
JJ316 - +++ +++ JJ319 - +++ - +++
5S28 - ++ - ++
5S38.17 - +++ +++
5S247 - +++ - +++
5G40/3 - +++ - +++ 5G87 - ++ - ++
5G111 - ++ - ++
5S35 - +++ + +++

Claims

Patentansprüche :
1. Protein oder Peptid enthaltend das C'-D Loop eines Mit- gliedes der CD28 Familie oder enthaltend ein hierzu analoges Peptid oder enthaltend eine Mimikriverbindung hierzu, nicht jedoch ein Mitglied der CD28 Familie.
2. Peptid nach Anspruch 1, wobei dessen Enden an jeweils eine Bindungsstelle eines Substrats gebunden sind, wobei die Bindungsstellen des Subtrats räumlich zueinander gemäß den Bindungsstellen für das C'-D Loop in CD28 angeordnet sind, wobei das C'-D Loop oder das hierzu analoge Peptid in einer dreidimensionalen Konfiguration gemäß dem C'-D Loop in CD28 fixiert ist, wobei das gebundene C'-D Loop oder das hierzu analoge Peptid für Antikörper frei zugänglich ist, und wobei das Substrat nicht ein Mitglied der CD28 Familie ohne C'-D Loop oder hierzu analoges natürliches Peptid des betreffenden CD28 Familienmitgliedes ist.
3. Peptid oder Protein nach Anspruch 1 oder 2 enthaltend eine Aminosäurensequenz Seq.-ID 41, Seq.-ID 1, oder 5 - 10, nicht jedoch Human CD28, Seq.-ID 42, Seq.-ID 2, oder 12 - 17, nicht jedoch Human CTLA-4, Seq.-ID 43, Seq.-ID 3, oder 19 - 24, nicht jedoch Human ICOS, oder Seq.-ID 44, Seq.-ID 4, oder 26 - 31, nicht jedoch Human PD-1. Peptid oder Protein oder Mimiktiverbindung hierzu nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch erhältlich, daß ein oder mehrere prospektive Peptide oder Proteine einem Bindungstest mit einem der monoklonalen Antikörper (mAb) 9D7 oder 5.11A unterworfen werden und bindende Peptide oder Proteine selektiert werden.
5. Nukleinsäure codierend für ein Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder für ein dieses Peptid enthaltendes Protein, nicht jedoch codierend für ein Mitglied der CD28 Familie.
6. Plasmid enthaltend eine Nukleinsäure nach Anspruch 5
7. Verwendung eines Peptids oder Proteines oder einer Mimikriverbindung hierzu nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Modulation der T-Zell-Proliferation.
8. Verwendung eines Peptids nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder eines dieses Peptid enthaltenden Proteins oder einer Mimikriverbindung hierzu in einem Verfahren zur Herstellung von mAb, die superagonistisch die Proliferation von T-Zellen mehrerer bis aller Untergruppen modulieren,
wobei ein nichtmenschliches Säugetier mit dem Peptid oder dem Protein oder der Mimikriverbindung immunisiert wird, wobei aus dem nichtmenschlichen Säugetier Zellen entnommen und aus den Zellen Hybridomzellen hergestellt werden, und
wobei die so erhaltenen Hybridomzellen mit der Maßgabe selektiert werden, daß in deren Kulturüberstand mAb enthalten sind, die an das C'-D Loop des Peptids oder Proteins oder an die Mimikriverbindung hierzu binden.
9. Verwendung eines Peptids nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder eines dieses Peptid enthaltenden Proteins oder einer Mimikriverbindung hierzu in einem Screeningver- fahren zur Identifizierung von Substanzen, die superagonistisch die Proliferation von T-Zellen mehrerer bis aller Untergruppen modulieren,
wobei eine prospektive Substanz oder eine Mischung von prospektiven Substanzen einem Bindungsassay mit dem
Peptid oder Protein oder Mimikriverbindung hierzu unterworfen werden,
und wobei an das Peptid oder Protein oder an die Mimi- kriverbindung hierzu bindende Substanzen, insbesondere mAb und/oder Mimikriverbindungen, selektiert werden.
10. Hybridomzellen, welche an ein Peptid oder Protein ge- maß einer der Ansprüche 1 bis 4 bindende mAb produzieren, insbesondere wie hinterlegt unter den DSM Nummern DSM ACC2531 (9D7 bzw. 9D7G3H11) oder DSM ACC2530 (5.11A bzw. 5.11A1C2H3) .
11. mAb erhältlich aus Hybridomzellen nach Anspruch 10 oder mAb welche zumindest teilweise codiert werden durch eine oder mehrere der Sequenzen Seq.-ID 33, 35, 37 und/oder 39, oder mAb enthaltend oder bestehend aus eine oder mehrere Sequenzen Seq.-ID 34, 36, 38 und/oder 40 oder hierzu homologe Sequenzen.
12. Verwendung eines mAb nach Anspruch 11 oder einer Mimikriverbindung hierzu oder einer Substanz, erhältlich aus einem Screening Verfahren nach Anspruch 9 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Erkrankungen mit pathologisch erniedrigten CD4-T-Zellzahlen, insbesondere AIDS.
13. Verwendung eines mAb nach Anspruch 11 oder einer Mimi- kriverbindung hierzu oder einer Substanz erhältlich aus einem Screening Verfahren nach Anspruch 9 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung nach Stammzelltransplantationen in Verfolg von Chemo- oder Strahlentherapie bei leukämischen Erkrankungen.
14. Verwendung eines mAb nach Anspruch 11 oder einer Mimikriverbindung hierzu oder einer Substanz erhältlich aus einem Screening Verfahren nach Anspruch 9 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Potenzierung und/oder qualitativen Beeinflussung von Immunreaktionen bei Schutzimpfungen.
5. Verwendung eines mAb nach Anspruch 11 oder einer Mimikriverbindung hierzu oder einer Substanz erhältlich aus einem Screening Verfahren nach Anspruch 9 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von autoimmun-inflammatorischen Erkrankungen .
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