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WO2003045998A2 - Polynucléotide et protéine impliqués dans la synaptogenèse, variants de ceux-ci, et leurs applications thérapeutiques et diagnostiques. - Google Patents

Polynucléotide et protéine impliqués dans la synaptogenèse, variants de ceux-ci, et leurs applications thérapeutiques et diagnostiques. Download PDF

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WO2003045998A2
WO2003045998A2 PCT/FR2002/004134 FR0204134W WO03045998A2 WO 2003045998 A2 WO2003045998 A2 WO 2003045998A2 FR 0204134 W FR0204134 W FR 0204134W WO 03045998 A2 WO03045998 A2 WO 03045998A2
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WO
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protein
seq
polypeptide
polynucleotide
mutation
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Application number
PCT/FR2002/004134
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WO2003045998A3 (fr
Inventor
Thomas Bourgeron
Stéphane JAMAIN
Hélène QUACH
Catalina Betancur
Marion Leboyer
Christopher Gillberg
Original Assignee
Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm)
Institut Pasteur
Assistance Publique-Hopitaux De Paris
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Publication date
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Priority to EP02801090A priority patent/EP1453861A2/fr
Priority to US10/496,011 priority patent/US7384740B2/en
Publication of WO2003045998A2 publication Critical patent/WO2003045998A2/fr
Publication of WO2003045998A3 publication Critical patent/WO2003045998A3/fr
Priority to US11/932,220 priority patent/US20090117554A1/en
Priority to US11/931,784 priority patent/US7906640B2/en

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system

Definitions

  • the present invention relates to the identification of a human gene coding for a protein involved in synaptogenesis and of its murine ortholog, and whose mutation is associated in humans with the development of neurological diseases and / or with a predisposition to the development of mental disorders or psychiatric illnesses such as autism and Asperger's Syndrome.
  • the invention also relates to diagnostic and therapeutic applications related to the identification of the gene and its mutations.
  • the invention also relates to diagnostic and therapeutic applications linked to the identification of the involvement of a defect in a protein of the neuroligin family in the development of mental disorders or psychiatric diseases such as autism and the Syndrome of Asperger. b) Brief description of the prior art
  • Autism is a disease which affects approximately one child in 1000 and mainly boys (from 4 to 23 boys for a girl depending on the clinical criteria chosen). The clinical symptoms of autism are described in the book DSM-IV-TR TM (Diagnostic and statistical manual of mental disorders, 2000, pages 70-75).
  • Neuroligins are cell adhesion proteins which alone can trigger synaptogenesis, i.e. the formation of synapses. (Scheiffele et a /., Cell, 2000, 101: 657-669). Neuroligins NL1, NL2 and NL3 were originally cloned in rats (Ichtchenko et al., Cell., 1995, 81 (3): 435-43; Ichtchenko et al., J. Biol. Chem., 1996, 271 ( 5): 2676-82). The neuroligins HNL1 and HNL2 are located on autosomes (3q26 and 17p13).
  • HNL4X Human Neuroligline-4
  • Bollinger et al. Biochem. J., 2001, 356: 581-588
  • the LOCUSLINK TM database http://www.ncbi.nim.nih.gov) dated September 13, 2001 provides under the accession numbers KIAA1260 and KIAA0951 incomplete sequences of a neuroligin gene the function of which is also unknown.
  • All neuroligins have an extracellular domain homologous to Acetylcholine esterase (ACHE).
  • ACHE Acetylcholine esterase
  • the neuroligins interact with the ⁇ -neurexins (Ichtchenko et al., Cell., 1995, 81 (3): 435-43). This interaction can be modulated by the ACHE itself (Grifman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, 95 (23): 13935-40).
  • ACHE Acetylcholine esterase
  • the present invention relates to the identification of human genes and their murine ortholog coding for a protein involved in synaptogenesis and whose mutation is associated in humans with the development of neurological diseases and / or with a predisposition to the development of mental disorders or psychiatric illnesses such as autism and Asperger's Syndrome.
  • the present invention relates to an isolated or purified polynucleotide coding for a polypeptide involved, in its wild form, in synaptogenesis.
  • the polynucleotide of the present invention is characterized in that at least one mutation in the nucleic acid sequence of said polynucleotide is associated with the development of neurological diseases and / or with a predisposition to the development of mental disorders or psychiatric diseases.
  • the present invention relates to a polynucleotide encoding a protein belonging to the family of human Neuroligins (HNLs) and more particularly the protein HNL4X (previously called HNL4) and its functional counterpart HNL4Y (previously called HNL5) coded by a chromosome gene.
  • HNLs human Neuroligins
  • HNL4X previously called HNL4X
  • HNL4Y previously called HNL5
  • the present invention also relates to a polynucleotide encoding the mouse protein MNL4 orthologue of the proteins HNL4X and HNL4Y.
  • the present invention relates to an isolated or purified polypeptide, characterized in that it is coded by a polynucleotide as defined above. More particularly, the polypeptide according to the present invention is characterized in that it is involved in synaptogenesis, and in that the presence of at least one mutation in the amino acid sequence of said polypeptide is associated with a predisposition to the development of mental disorders or psychiatric illnesses.
  • the present invention provides a method for detecting biochemical disorders altering the formation of synapses, and / or a predisposition to the development of psychiatric pathologies and / or a mental illness, comprising at least one of the following steps:
  • kits for the detection of biochemical disorders altering the formation of synapses, and / or a predisposition to the development of psychiatric pathologies and / or a mental illness, and / or for the diagnosis of a mental illness comprising at least one of the elements chosen from the group consisting of: a probe, an antibody, a reagent and a solid support allowing: i) the detection of a mutation in the sequence of a polynucleotide as defined above, in the sequence of a fragment of said polynucleotide or in the sequence of a messenger RNA of said polynucleotide; and / or ii) measuring the biological activity of a polypeptide as defined above or the interaction thereof with one of its protein partners.
  • the invention also relates to the use of a non-mutated polynucleotide encoding a protein involved in its wild form in synaptogenesis for the treatment or prevention of biochemical pathologies or mental diseases.
  • the invention also relates to the use of an unmutated polypeptide involved in its wild form in synaptogenesis for the treatment or prevention of biochemical pathologies or mental diseases.
  • the present invention also provides a method for sorting molecules making it possible to modulate the biological activity of the polypeptide encoded by the polynucleotide defined above or the biological activity of the polypeptide defined above, comprising: a) bringing said polypeptide or a recombinant cell containing it with a molecule capable of modulating its biological activity; b) measuring the biological activity of said polypeptide or its interaction with one of its protein partners; and c) evaluating the activity measured in step b) relative to a measurement of the biological activity of said polypeptide in the absence of said molecule.
  • Another object of the present invention is a method of treating a mental or neurological disease comprising the insertion into at least a portion of the cells of a patient of a patient of a polynucleotide encoding a polypeptide as defined above.
  • the present invention also provides a method of transforming stem cells of a patient with a mutation of a gene coding for a protein involved in synaptogenesis, characterized by a) the use of stem cells of said patient; b) the insertion into the genome of said stem cells of a polynucleotide as defined above; and c) reimplantation in the patient of cells transformed according to step b).
  • the invention further relates to a cloning or expression vector comprising one of the polynucleotides of the invention or a fragment thereof; a host cell containing a polynucleotide and / or a vector according to the invention; or purified monoclonal or polyclonal antibodies specifically recognizing at least one of the polynucleotides of the invention and / or at least one of the polypeptides of the invention.
  • the invention also relates to a composition containing at least one element chosen from the group consisting of a) a polypeptide, b) a polynucleotide, c) a vector, d) a host cell or e) an antibody, and a pharmaceutically acceptable vehicle.
  • Figure 1 shows the region of chromosome Xp22.3 containing the HNL4X gene.
  • Figure 2 shows a protein alignment of human Neuroligins.
  • Figure 3 is a diagram showing the protein architecture of a synapse with the location and known partners of Neuroligins.
  • Figures 4A and 4B represent a diagram which shows the chromosomal location and the evolution of the HNL4X and HNL4Y genes.
  • Figure 5 is a diagram showing the genomic structure of human Neuroligins genes.
  • Figures 6A and 6B show the result of the analysis by SSCP (Single Strand
  • Conformational Polymorphism of a mutation in the gene coding for the protein HNL4X as well as the sequence of this mutation.
  • Figure 7 is a diagram showing the location of the HNL4X protein and the effects of the mutation on HNL4X.
  • Figure 8A shows the genomic sequence (SEQ ID NO: 1) of the human gene
  • Figure 8B shows the nucleic acid sequence (SEQ ID NO: 16) of the exon
  • Figure 9 shows the complementary DNA sequence (SEQ ID NO: 2) of the human HNL4X wild type gene (not mutated).
  • Figure 10 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 3) of the human protein HNL4X wild (not mutated).
  • Figure 11A shows the genomic sequence (SEQ ID NO: 4) of the human gene
  • Figure 11B shows the nucleic acid sequence (SEQ ID NO: 17) of exon 1 of Figure 11A.
  • Figure 12 shows the complementary DNA sequence (cDNA) (SEQ ID NO: 5) of the wild-type human HNL4 Y gene.
  • Figure 13 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 6) of the human protein H NL4Y wild.
  • Figure 14 shows the complementary DNA sequence (cDNA) (SEQ ID NO: 7) of an alternative transcript of the wild-type human HNL4 Y gene.
  • Figure 15 represents the amino acid sequence (SEQ ID NO: 8) corresponding to the alternative sequence of Figure 14.
  • Figure 16 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 9) of the mutated human protein HNL4X.
  • Figure 17 shows the chromosomal location of the HNL3, HNL4X and
  • HNL4Y and pedigree of a family with a mutation in HNL4X in an autistic boy and a boy with Asperger's syndrome are known in the art.
  • Figure 18 is a diagram showing the conservation of HNL3 mutations.
  • Figure 19A shows the nucleic acid sequence of MNL4 cDNA (SEQ ID NO: 1
  • Figure 19B shows the amino acid sequence of the MNL4 protein (SEQ ID NO: 1
  • Figure 20 is a diagram showing the genomic structure of the HNL1, HNL2 and HNL3 genes, as well as the location of the mutations observed in HNL3.
  • Figure 21 is a diagram showing the genomic structure of HNL4X and HNL4Y.
  • Figure 22 shows a portion of the amino acid sequence (SEQ ID NO: 10) of the HNL3 protein mutated at position 451.
  • Figure 23 shows another portion of the amino acid sequence (SEQ ID NO: 11) of the HNL3 protein mutated at position 796.
  • Figure 24 shows the complementary DNA sequence (cDNA) (SEQ ID NO: 12) of the wild-type HNL3 transcript.
  • Figure 25 shows the complementary DNA sequence (cDNA) (SEQ ID NO: 13) of the mutated HNL3 transcript.
  • Figure 26 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 14) of the human protein HNL3 wild.
  • Figure 27 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 15) of the mutated human protein HNL3.
  • the originality of the present invention relates to the identification of the genomic sequence of the HNL4X gene located in Xp22.3 and of a functional homolog HNL4Y placed on the Y chromosome located in Yq11.22 as well as their murine ortholog MLN4.
  • the invention also relates to the identification of the involvement of synaptogenesis proteins, in particular HNL3 and HNL4 in the development of mental disorders or psychiatric diseases such as autism.
  • the present invention relates to an isolated or purified polypeptide, which, in its wild form (ie non-mutated), is involved in synaptogenesis, of which at least one mutation in the amino acid sequence is associated with the development of neurological diseases and / or a predisposition to the development of mental disorders or psychiatric diseases.
  • “Mental disorders or psychiatric illnesses” means illnesses such as autism, Asperger's syndrome, schizophrenia and ADHD (Attention Deficit Hyperactivity Disorder) syndrome.
  • the polypeptide consists of a cell adhesion protein, more preferably a protein belonging to the family of human neuroligins and even more preferably, the polypeptide consists of the protein HNL3, HNL4X or the protein HNL4Y.
  • the polypeptide when it is HNL3, it comprises an amino acid sequence according to SEQ ID NO: 14 and the sequences of at least 20, at least 50 and at least 100 consecutive or more derived amino acids of SEQ ID NO: 14.
  • polypeptide of the invention comprises a sequence chosen from the group consisting of: SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, and the sequences at least 20, at least 50 and at least 100 consecutive or more amino acids derived from SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 8.
  • the invention also relates to the "mutated" polypeptides and the polypeptides "derived” from the wild-type protein, preferably a neuroligin such as HNL3, HNL4X or HNL4Y.
  • polypeptide derived from a wild protein or “variant” of a wild protein is meant all peptides which have a peptide sequence substantially identical, at least in part, to the peptide sequence of the wild protein. They may, for example, be chemically modified polypeptides having a peptide sequence 100% identical to a portion of the wild-type protein. They may also be hybrid polypeptides having a first portion 100% identical to a first portion of the wild protein and a second portion in no way / partially identical to a second portion of the wild protein. They may also be polypeptides having total / partial homology with a portion of the wild-type protein.
  • mutant polypeptides derived from a wild protein all the peptides which have been obtained following a modification of said wild protein, whether it is a modification by addition, deletion or substitution of one or more of the amino acids of the wild protein. It can also be a modification brought about by the addition of carbon chains attached to at least one of the amino acids of the wild protein or to at least one of the amino acids of peptides for which there is a substitution or a modification of one of the amino acids compared to wild protein. More particularly, the present invention covers peptides which are derived from the human protein HNL3, HNL4X or HNL4Y. According to a preferred embodiment, and in the case where the polypeptide is a
  • HNL3 mutated according to the present invention, it has SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 15, and a sequence of at least 20, at least 50 and at least 100 consecutive or more amino acids derived from SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 15.
  • the polypeptide is a mutated HNL4X or a mutated HNL4Y according to the present invention, it has the SEQ ID NO: 9 or a sequence of at least 20, at least 50 and at least 100 consecutive amino acids or more derived from SEQ ID NO: 9.
  • polypeptide is defined as being any peptide or protein comprising at least two amino acids linked by a modified or unmodified peptide link.
  • polypeptide refers to molecules of short chains such as peptides, oligopeptides or oligomers or to long chains such as proteins.
  • a polypeptide according to the present invention can comprise modified amino acids.
  • the polypeptide of the present invention can also be modified by a natural method such as post-transcriptional modifications or by a chemical method.
  • any modification of the polypeptide which does not have the effect of eliminating the biochemical characteristics of the original polypeptide, i.e. the ability to form functional synapses, is covered within the scope of the present invention.
  • the invention relates to an isolated or purified polynucleotide coding for a polypeptide as defined above and more particularly to an isolated or purified polynucleotide coding for a polypeptide involved in synaptogenesis in which at least one mutation of this polynucleotide is associated with development of neurological diseases and / or a predisposition to the development of mental illnesses or psychiatric illnesses.
  • isolated or purified is meant the molecules which have been altered by humans from their native state, that is to say, if such a molecule exists in nature, it has been changed and / or removed from its initial environment.
  • a polynucleotide or polypeptide naturally present in a living organism is not “isolated”.
  • the same polynucleotide or polypeptide when separated from its normal environment and / or obtained by cloning, amplification and / or by chemical synthesis is considered according to the present invention as being “isolated”.
  • a polynucleotide or polynucleotide which is introduced into an organism by transformation, genetic manipulation or by any other method of recombination is “isolated” even if it is present in said organism.
  • polynucleotide is meant any DNA or RNA sequence or molecule having two or more nucleotides, including the nucleic sequences encoding an entire gene.
  • polynucleotide encompasses all nucleic acid molecules that are found in a natural or artificial state. This includes DNA molecules, RNA molecules, cDNAs, expressed sequences (ESTs), artificial sequences and all fragments thereof. It goes without saying that the definitions "derivative”, “variant” and “mutated” also apply to the polynucleotides according to the present invention. Any polynucleotide which has been chemically, enzymatically or metabolically modified but which has retained the biochemical properties of the original polypeptide, that is to say which has retained its power to form functional synapses, is included within the scope of the present invention. .
  • the polynucleotide according to the invention when it codes for an HNL3 protein or a fragment of this protein, the latter advantageously comprises SEQ ID NO: 14.
  • the polynucleotide comprises a sequence chosen from the group consisting of: SEQ ID NO: 12, and the sequences of at least 20, at least 50 and at least 100 consecutive or more nucleotides derived from SEQ ID NO: 12.
  • the polynucleotide according to the invention when it codes for an HNL4X or HNL4Y protein or a fragment of this protein, the latter advantageously comprises SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8.
  • the polynucleotide comprises a sequence chosen from the group consisting of: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, and the sequences of at least 20, at least 50 and at least 100 consecutive nucleotides or more derived from these sequences.
  • the polynucleotide codes for a non-functional mutated protein.
  • the polynucleotide codes for a mutated HNL3 or mutated HNL4X protein.
  • the polynucleotide is mutated so that the mutation causes early termination of the protein.
  • the polynucleotide of the invention comprises SEQ ID NO: 1 and the mutation is an insertion of a thymine at position 1186 from position 465 of Figure 9 (ORF). This mutation causes the production of a defective protein devoid of its transmembrane part since this mutation causes early termination of the protein (D396stop).
  • the mutation causes a modification of the sequence protein such as an amino acid substitution at position 451 and / or 796 in Figure 18 or 21. More specifically, the mutation produced at position 451 consists in the substitution of an arginine by a cysteine, while the mutation produced at position 796 consists of the substitution of an asparagine by a serine.
  • This amino acid, arginine R451 is located in the acetylcholine esterase domain of neuroligins and is extremely conserved in all neuroligins sequenced to date and in the acetylcholine esterases of fish, birds and reptiles ( Figures 6A and 6B).
  • polypeptides and polynucleotides according to the present invention can be prepared by any suitable method. They can in particular be obtained by chemical synthesis, but it is also possible to obtain them by biological means, in particular by using different vectors in appropriate cell cultures as will be described below.
  • the peptides according to the present invention can be in deglycosylated, or glycosylated form, if necessary. A person skilled in the field of the invention will be able to obtain different polynucleotides / polypeptides and he will also be able to determine which of the polynucleotides / polypeptides obtained have those which have adequate biological activity.
  • the invention relates to any vector (cloning and / or expression) and any cellular host (prokaryotic or eukaryotic) transformed by such a vector, and comprising the regulatory elements allowing expression of the nucleotide sequence coding for a peptide according to the invention.
  • the subject of the invention is a process for the preparation of a peptide of the invention, by transformation of a cellular host using an expression vector (plasmid, cosmid, virus, etc. .) comprising the DNA sequences coding for the peptides of the invention, followed by culturing the cell host thus transformed, and recovering the peptide from the culture medium.
  • an expression vector plasmid, cosmid, virus, etc. .
  • the use of vectors for the expression of proteins and peptides in the cells of a host, in particular the human, is well known and will not be described in more detail.
  • polypeptides and polynucleotides of the present invention can also be used to prepare polyclonal or monoclonal antibodies capable of binding (preferably specifically) to at least one polypeptide / polynucleotide object of the invention.
  • the present invention therefore also relates to such purified antibodies which can be obtained by very well known techniques such as example the technique described by Kolher and Milstein (Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity, Nature, 1975, 262: 495-497).
  • the antibodies are of the “humanized” type. A person skilled in the art through his general knowledge will know how to prepare these types of antibodies.
  • vector refers to a polynucleotide construct designed to be transfected into different cell types.
  • these vectors target the expression vectors designed for the expression of a nucleotide sequence in a host cell; cloning vectors designed for the isolation, propagation and replication of inserted nucleotides; viral vectors designed for the production of recombinant virus or viral-like particle; or shuttle vectors that include attributes from more than one vector.
  • the invention relates to the treatment or prevention of biochemical pathologies or mental illnesses such as autism or Asperger's Syndrome. More particularly, the invention relates to the use of a non-mutated polynucleotide encoding a protein involved in synaptogenesis.
  • the protein consists of a cell adhesion protein, more preferably a protein belonging to the family of human neuroligins and even more preferably the polypeptide consists of the protein HNL3, HNL4X or the protein HNL4Y. Examples of non-mutated polynucleotides are given above.
  • the invention also relates to a treatment method comprising the insertion into at least a portion of the cells of a sick patient, of a polynucleotide encoding a polypeptide involved in synaptogenesis such as the protein HNL3 or HNL4X.
  • a polynucleotide encoding a polypeptide involved in synaptogenesis such as the protein HNL3 or HNL4X.
  • the cells into which the polynucleotide is inserted are stem cells. Examples of satisfactory polynucleotides are given above.
  • the invention relates to a method of transforming stem cells of a patient having a mutation of a gene coding for a protein involved in synaptogenesis, the method comprising: a) the use of stem cells of the patient ; b) insertion into the stem cell genome of a polynucleotide encoding a functional polypeptide involved in synaptogenesis such as the protein HNL3 or HNL4X; and c) reimplantation in the patient of cells transformed according to step b).
  • a person skilled in the art will be able to adapt the above-mentioned methods of treatment and determine, depending on several factors, the polynucleotides to be used, the means of inserting them into cells and the mode and quantity of polynucleotides or cells. to be administered.
  • factors that can influence his choices are: the nature of the treatment, the exact sequence of the polynucleotides; the stage of the disease; the patient's condition, age and weight, etc.
  • the invention also relates to a method for detecting biochemical disorders altering the formation, stabilization and / or recognition of synapses, a predisposition to the development of psychiatric pathologies and / or a mental illness such as autism. or Asperger's Syndrome.
  • the method comprises at least one of the following steps: the detection of a mutation in the sequence of a gene coding for a protein involved in synaptogenesis, in the sequence of a fragment of this gene or in the sequence of a messenger RNA of this gene; - detecting the presence of a protein involved in synaptogenesis; detecting a mutation in a protein involved in synaptogenesis; measuring the biological activity of a protein involved in synaptogenesis or its interaction with one of its protein partners.
  • a method for measuring such an interaction is for example described in Ichtchenko et al. (J. Biol. Chem., 1996, 271 (5): 2676-82) or Grifman et al. (Proc. Natl. Acad. Sci.
  • the method comprises: a) amplification of a gene coding for a protein involved in synaptogenesis, amplification of a fragment of said gene or amplification of a messenger RNA of said gene; and b) detecting a mutation in the sequence of said gene, in the sequence of said fragment or in the sequence of said messenger RNA.
  • kit for the detection of biochemical disorders altering the formation of synapses, of a predisposition to the development of psychiatric pathologies and / or of a mental illness, and / or for the diagnosis of mental illness.
  • the kit comprises at least one of the elements chosen from the group consisting of: a probe, an antibody, a reagent and a solid support, these elements allowing: i) the detection of a mutation in the sequence a gene coding for a protein involved in synaptogenesis, in the sequence of a fragment of this gene or in the sequence of a messenger RNA of this gene; and / or ii) measuring the biological activity of a protein involved in synaptogenesis or its interaction with one of its protein partners.
  • the elements chosen from the group consisting of: a probe, an antibody, a reagent and a solid support, these elements allowing: i) the detection of a mutation in the sequence a gene coding for a protein involved in synaptogenesis, in the sequence of a fragment of this gene or in the sequence of a messenger RNA of this gene; and / or ii) measuring the biological activity of a protein involved in synaptogenesis or its interaction with one of its protein partners.
  • the gene to which reference is made in the method and the kit codes, in its wild form, for a cell adhesion protein, more preferably for a protein belonging to the family of human neuroligins and even more preferably for the protein HNL3. , HNL4X or the HNL4Y protein.
  • the gene codes, in its wild form, for a protein comprising SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 14. More preferably, the gene comprises SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 12.
  • the invention relates to a method for sorting molecules which can make it possible to modulate the biological activity of a polypeptide encoded by the polynucleotide as defined above, or the biological activity of the polypeptide as defined above.
  • the sorting process comprises: a) bringing said polypeptide into contact with a molecule capable of modulating its biological activity; b) measuring the biological activity of said polypeptide; and c) evaluating the activity measured in step b) relative to a measurement of the biological activity of said polypeptide in the absence of said molecule.
  • the present invention also relates to the use of these polypeptides and polynucleotides encoding them for the preparation of therapeutic compositions. useful in the treatment of a mental or neurological disease, such as autism, Asperger's syndrome, schizophrenia or ADHD syndrome.
  • the composition of the present invention further contains a pharmaceutically acceptable vehicle, and an element selected from the group consisting of: a polynucleotide according to the present invention; - a polypeptide according to the present invention; an antibody according to the present invention; a vector according to the present invention; and - a host cell according to the present invention.
  • compositions according to the present invention can be in any solid or liquid form customary for pharmaceutical administration, that is to say for example forms of liquid administration, in gel, or any other support allowing for example the controlled release.
  • compositions which can be used mention may in particular be made of injectable compositions more particularly intended for injections into the blood circulation in humans.
  • a person skilled in the art will know how to prepare pharmaceutically acceptable compositions and to determine, according to several factors, the preferred mode of administration and the quantity to be administered. Among the factors that can influence his choices are: the nature of the treatment, the exact nature of the ingredients, active or not, used in the composition; the stage of the disease; the patient's condition, age and weight, etc.
  • HNL4X human neuroligin 4 gene
  • HNL1 HNL1
  • HNL2 chromosomes 3q26
  • HNL3 HNL3
  • HNL4X Xp22.3
  • HNL4Y Yq11.2
  • This table groups together the synonymous (KS) and non-synonymous (KA) 5 substitution rates of all known genes on the X chromosome having a homolog on the Y chromosome.
  • the KS / KA ratio is an indication of gene conservation.
  • KS is the synonymous substitution rate per synonymous site which represents the modifications which do not change the sequence of the protein.
  • the isolation of the HNL4X and HNL4Y genes was carried out by computer analysis of the sequences of the Xp22.3 and Yq11.22 region and by amplification of the complete transcripts from brain mRNAs.
  • Computer analysis A systematic study of the genes of the Xp22.3 region, close to the DXS996 microsatellite, was carried out using data from the sequencing of the human genome (http://genome.usc.edu and http // www. Ensembl.org / genomecentral).
  • the DXS996 microsatellite is the genetic marker that shows the most significant link with autism in the analysis by Philippe et al. (1999, supra).
  • the complete cDNAs of the HNL4X and HNL4Y mRNAs were back-transcribed, amplified and directly sequenced.
  • the oligonucleotides used for amplification and sequencing are indicated in Tables 2 and 3.
  • Table 3 Names and sequences of the primers used to sequence the HNL4X and HNL4Y genes
  • HNLXYE1R CACGGGAAAGGGGTGCATGGA 29
  • HNLXYE1R CACGGGAAAGGGGTGCATGGA 31
  • Table 4 Names and sequences of the primers used for the amplification of the MNL4 cDNA (mouse 57BL6)
  • Table 5 Names and sequences of the primers used for the amplification of MNL4 in three PCRs of approximately 1 kb
  • HNL4X / 4Y influences the synaptogenesis and mutation of HNL4X / 4Y constitutes a factor. predisposition to mental illness, including autism and Asperger's syndrome.
  • This Stop mutation in a specific gene for primates, carried by the X chromosome in two autistic subjects and involved in synaptogenesis is one of the first functional mutations identified in a psychiatric illness. This mutation is also the first mutation described associated with autism without any other clinical sign (fragile X, tuberculous sclerosis, etc.).
  • Example 2 Characterization of the HNL3 gene and its implication in psychiatric syndromes.

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Abstract

La présente invention concerne l'identification de gènes humains codant pour une protéine impliquée dans la synaptogenèse et dont la mutation est associée chez l'homme au développement de maladies neurologiques et/ou à une prédisposition au développement de désordres mentaux ou maladies psychiatriques tels que l'autisme et le syndrome d'Asperge. Plus particulièrement, l'invention vise une protéine appartenant à la famille des neuroligines humaines (HNLs) et plus particulièrement la protéine HNL4X et son homologue fonctionnel HNL4Y codé par un gène du chromosome Y. L'invention vise également les polynucléotides codant pour les protéines HNL4X et HNL4Y mutées ou non et HNL3 mutées, les vecteurs d'expression cellulaire comprenant les séquences d'acides nucléiques exprimant HNL3, HNL4X, HNL4Y mutées ou non, et les anticorps polyclonaux ou monoclonaux capables de se fixer sur un de ces peptides et/ou polynucléotides mentionnés précédemment. La présente invention concerne également l'utilisation de polypeptides, de polynucléotides, un vecteur, une cellule hôte, et/ou un anticorps tel que définis précédemment pour la préparation d'une composition utile dans le traitement d'une maladie mentale ou neurologique telle l'autisme, le syndrome d'Asperge, la schizophrénie ou le syndrome ADHB.

Description

POLYNUCLEOTIDE ET PROTÉINE IMPLIQUES DANS LA SYNAPTOGENESE, VARIANTS DE CEUX-CI, ET LEURS APPLICATIONS THÉRAPEUTIQUES ET
DIAGNOSTIQUES
CONTEXTE DE L'INVENTION a) Domaine de l'invention
La présente invention concerne l'identification d'un gène humain codant pour une protéine impliquée dans la synaptogenèse et de son orthologue murin, et dont la mutation est associée chez l'homme au développement de maladies neurologiques et/ou à une prédisposition au développement de désordres mentaux ou maladies psychiatriques tels que l'autisme et le Syndrome d'Asperger.
L'invention concerne également les applications diagnostiques et thérapeutiques liées à l'identification du gène et de ses mutations.
L'invention concerne aussi les applications diagnostiques et thérapeutiques liées à l'identification de l'implication d'un défaut d'une protéine de la famille des neuroligines dans le développement de désordres mentaux ou maladies psychiatriques tels que l'autisme et le Syndrome d'Asperger. b) Brève description de l'art antérieur
L'autisme est une maladie qui touche environ un enfant sur 1000 et principalement les garçons (de 4 à 23 garçons pour une fille selon les critères cliniques choisis). Les symptômes cliniques de l'autisme sont décrits dans l'ouvrage DSM-IV- TR™ (Diagnostic and statistical manual of mental disorders, 2000, pages 70-75).
Les bases moléculaires de l'autisme sont actuellement inconnues. Des études ont déjà suggéré l'existence d'une composante génétique dans l'autisme. À partir de résultats d'analyse de liaison, Philippe et al. (Human Molecular Genetics, 1999, 8:805- 812) décrit 11 régions chromosomiques susceptibles d'être impliquées dans le développement de l'autisme parmi lesquelles une région du chromosome Xp. D'autre part, Thomas et al. (Hum. Genêt., 1999, 104:43-48) décrit des délétions du bras court du chromosome X chez des patients atteints d'autisme et Milunsky et al. (Clin. Genêt., 1999, 55:455-460) décrit des délétions en Xp22 chez des patients atteints de schizophrénie et suggère plus précisément l'implication d'une délétion en Xp22.3 dans le développement de cette maladie psychiatrique. Toutefois, ni le gène impliqué dans la maladie, ni la nature de la mutation ne sont mentionnés.
Les neuroligines (HNLs) sont des protéines d'adhésion cellulaire qui peuvent déclencher à elles seules la synaptogenèse c'est-à-dire la formation de synapses (Scheiffele et a/., Cell, 2000, 101 :657-669). Les neuroligines NL1 , NL2 et NL3 ont été clonées originalement chez le rat (Ichtchenko et al., Cell., 1995, 81(3):435-43; Ichtchenko et al., J. Biol. Chem., 1996, 271(5):2676-82). Les neuroligines HNL1 et HNL2 sont localisées sur des autosomes (3q26 et 17p13). Ces gènes sont des cibles pour la susceptibilité aux maladies psychiatriques et plusieurs variations protéiques de HNL2 ont été mises en évidence par les inventeurs chez des patients autistes (R734H, G754R, A755V). Une protéine HNL4X (Human Neuroligline-4) a été décrite par Bollinger et al. (Biochem. J., 2001, 356:581-588) sans description génomique ni fonction biologique associée. D'autre part, la base de données LOCUSLINK™ (http://www.ncbi.nim.nih.gov) du 13 septembre 2001 fournit sous les numéros d'accession KIAA1260 et KIAA0951 des séquences incomplètes d'un gène de la neuroligine dont la fonction est en outre inconnue. Toutes les neuroligines possèdent un domaine extracellulaire homologue à l'Acétylcholine estérase (ACHE). Au niveau de cette partie extracellulaire, les neuroligines interagissent avec les β-neurexines (Ichtchenko et al., Cell., 1995, 81 (3):435-43). Cette interaction peut être modulée par l'ACHE elle-même (Grifman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, 95(23): 13935-40). Au niveau cytoplasmique, les neuroligines interagissent avec plusieurs protéines contenant des domaines PDZ (Irie et al., Sciences, 1997, 277(5331): 1511-5; Hirao et al., J. Biol. Chem.1998, 273(33), 21105-10; Kurschner et al., Mol. Cell Neurosci., 1999, 11 (3): 161 -72; Bolliger et al., Biochem J., 2001 , 356:581-8; Toyooka et al., J Neurochem., 2002, 83(4):797-806). Parmi ces protéines, on trouve les protéines de la famille DLG1-5 (3q29, 11q13, Xq13.1, 17p13.1 et 10q22.3), la protéine S-SCAM (7q21.11), les protéines de la famille CIPP (MPDZ, 9p23 et INADL, 1p31), la protéine CASK (Xp11). Au vu de ce qui précède, il est clair que la connaissance des bases moléculaires de l'autisme et tout particulièrement du gène impliqué dans la maladie est fortement souhaitée afin de permettre de développer de nouvelles approches thérapeutiques, de nouveaux médicaments et des tests diagnostiques.
Il existe également un besoin concernant l'identification de la fonction biologique des neuroligines ainsi que l'identification de la séquence nucléique et protéique des neuroligines, notamment celle de la HNL3 et HNL4X.
La présente invention répond à ces besoins et à d'autres besoins comme cela sera apparent à une personne versée dans le domaine à la lecture de la présente description de l'invention. RÉSUMÉ DE L'INVENTION
La présente invention concerne l'identification de gènes humains et de leur orthologue murin codant pour une protéine impliquée dans la synaptogenèse et dont la mutation est associée chez l'homme au développement de maladies neurologiques et/ou à une prédisposition au développement de désordres mentaux ou maladies psychiatriques tels que l'autisme et le Syndrome d'Asperger.
Plus particulièrement, la présente invention a pour objet un polynucléotide isolé ou purifié codant pour un polypeptide impliqué, dans sa forme sauvage, dans la synaptogenèse. Le polynucléotide de la présente invention est caractérisé en ce qu'au moins une mutation dans la séquence en acide nucléique dudit polynucléotide est associée au développement de maladies neurologiques et/ou à une prédisposition au développement de désordres mentaux ou de maladies psychiatriques.
Préférentiellement, la présente invention concerne un polynucléotide codant pour une protéine appartenant à la famille des Neuroligines humaines (HNLs) et plus particulièrement la protéine HNL4X (précédemment appelée HNL4) et son homologue fonctionnel HNL4Y (précédemment appelée HNL5) codé par un gène du chromosome
Y.
La présente invention concerne également un polynucléotide codant pour la protéine de souris MNL4 orthologue des protéines HNL4X et HNL4Y. Selon un autre objet, la présente invention vise un polypeptide isolé ou purifié, caractérisé en ce qu'il est codé par un polynucléotide tel que défini précédemment. Plus particulièrement, le polypeptide selon la présente invention est caractérisé en ce qu'il est impliqué dans la synaptogenèse, et en ce que la présence d'au moins une mutation dans la séquence en acide aminé dudit polypeptide est associée à une prédisposition au développement de désordres mentaux ou de maladies psychiatriques.
Selon un autre objet, la présente invention propose un procédé pour détecter des désordres biochimiques altérant la formation des synapses, et/ou une prédisposition au développement de pathologies psychiatriques et/ou une maladie mentale, comprenant au moins une des étapes suivantes:
- la détection d'une mutation dans la séquence d'un polynucléotide tel que défini précédemment, dans la séquence d'un fragment dudit polynucléotide ou dans la séquence d'un ARN messager dudit polynucléotide;
- la détection de la présence d'un polypeptide tel que défini précédemment; - la détection d'une mutation dans un polypeptide tel que défini précédemment;
- la mesure de l'activité d'un polypeptide tel que défini précédemment ou de l'interaction de celui-ci avec l'un de ses partenaires protéiques. Un autre objet de l'invention est de fournir un kit pour la détection des désordres biochimiques altérant la formation des synapses, et/ou d'une prédisposition au développement de pathologies psychiatriques et/ou d'une maladie mentale, et/ou pour le diagnostic d'une maladie mentale, le kit comprenant au moins un des éléments choisi dans le groupe constitué par: une sonde, un anticorps, un réactif et un support solide permettant: i) la détection d'une mutation dans la séquence d'un polynucléotide tel que défini précédemment, dans la séquence d'un fragment dudit polynucléotide ou dans la séquence d'un ARN messager dudit polynucléotide; et/ou ii) la mesure de l'activité biologique d'un polypeptide tel que défini précédemment ou de l'interaction de celui-ci avec l'un de ses partenaires protéiques.
L'invention porte également sur l'utilisation d'un polynucléotide non muté codant pour une protéine impliquée dans sa forme sauvage dans la synaptogenèse pour le traitement ou la prévention des pathologies biochimiques ou des maladies mentales.
L'invention porte également sur l'utilisation d'un polypeptide non muté impliqué dans sa forme sauvage dans la synaptogenèse pour le traitement ou la prévention des pathologies biochimiques ou des maladies mentales.
La présente invention propose également un procédé de tri de molécules permettant de moduler l'activité biologique du polypeptide codé par le polynucléotide défini précédemment ou l'activité biologique du polypeptide défini précédemment, comprenant: a) la mise en contact dudit polypeptide ou d'une cellule recombinante le contenant avec une molécule susceptible de moduler son activité biologique; b) la mesure de l'activité biologique dudit polypeptide ou de son interaction avec l'un de ses partenaires protéiques; et c) l'évaluation de l'activité mesurée à l'étape b) par rapport à une mesure de l'activité biologique dudit polypeptide en absence de ladite molécule.
Un autre objet de la présente invention vise une méthode de traitement d'une maladie mentale ou neurologique comprenant l'insertion dans au moins une portion des cellules d'un patient malade d'un polynucléotide codant pour un polypeptide tel que défini précédemment. La présente invention propose également un procédé de transformation de cellules souches d'un patient présentant une mutation d'un gène codant pour une protéine impliquée dans la synaptogenèse, caractérisé par a) l'utilisation de cellules souches dudit patient; b) l'insertion dans le génome desdites cellules souches d'un polynucléotide tel que défini précédemment; et c) la réimplantation chez le patient de cellules transformées selon l'étape b). L'invention concerne en outre un vecteur de clonage ou d'expression comprenant un des polynucleotides de l'invention ou un fragment de celui-ci; une cellule hôte contenant un polynucléotide et/ou un vecteur selon l'invention; ou des anticorps monoclonaux ou polyclonaux purifiés reconnaissant spécifiquement au moins un des polynucleotides de l'invention et/ou au moins un des polypeptides de l'invention.
L'invention vise également une composition contenant au moins un élément choisi dans le groupe constitué par a) un polypeptide, b) un polynucléotide, c) un vecteur, d) une cellule hôte ou e) un anticorps, et un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
BRÈVE DESCRIPTION DES DESSINS La Figure 1 montre la région du chromosome Xp22.3 contenant le gène HNL4X.
La Figure 2 montre un alignement protéique des Neuroligines humaines.
La Figure 3 est un schéma qui montre l'architecture protéique d'une synapse avec la localisation et les partenaires connus des Neuroligines.
Les Figures 4A et 4B représentent un schéma qui montre la localisation chromosomique et l'évolution des gènes HNL4X et HNL4Y.
La Figure 5 est un schéma qui montre la structure génomique des gènes Neuroligines humaines.
Les Figures 6A et 6B montrent le résultat de l'analyse par SSCP (Single Strand
Conformational Polymorphism) d'une mutation du gène codant pour la protéine HNL4X ainsi que la séquence de cette mutation.
La Figure 7 est un schéma qui montre la localisation de la protéine HNL4X et les effets de la mutation sur HNL4X.
La Figure 8A représente la séquence génomique (SEQ ID NO: 1) du gène humain
HNL4X sauvage (non muté). La Figure 8B représente la séquence en acides nucléiques (SEQ ID NO: 16) de l'exon
1 de la figure 8A.
La Figure 9 représente la séquence d'ADN complémentaire (SEQ ID NO: 2) du gène humain HNL4X sauvage (non muté). La Figure 10 représente la séquence en acides aminés (SEQ ID NO: 3) de la protéine humaine HNL4X sauvage (non muté).
La Figure 11A représente la séquence génomique (SEQ ID NO: 4) du gène humain
HNL4Y.
La Figure 11 B représente la séquence en acides nucléiques (SEQ ID NO: 17) de l'exon 1 de la figure 11 A.
La Figure 12 représente la séquence d'ADN complémentaire (ADNc) (SEQ ID NO: 5) du gène humain HNL4 Y sauvage.
La Figure 13 représente la séquence en acides aminés (SEQ ID NO: 6) de la protéine humaine H NL4Y sauvage. La Figure 14 représente la séquence d'ADN complémentaire (ADNc) (SEQ ID NO: 7) d'un transcrit alternatif du gène humain HNL4 Y sauvage.
La Figure 15 représente la séquence en acides aminés (SEQ ID NO: 8) correspondant à la séquence alternative de la Figure 14.
La Figure 16 représente la séquence en acides aminés (SEQ ID NO: 9) de la protéine humaine HNL4X mutée.
La Figure 17 montre la localisation chromosomique des gènes HNL3, HNL4X et
HNL4Y et pedigree d'une famille présentant une mutation dans HNL4X chez un garçon autiste et un garçon atteint d'un syndrome d'Asperger.
La Figure 18 est un schéma qui montre la conservation des mutations HNL3. La Figure 19A montre la séquence en acides nucléiques de l'ADNc de MNL4 (SEQ ID
NO : 62) (orthologue de HNL4X et HNL4Y).
La Figure 19B représente la séquence en acides aminés de la protéine MNL4 (SEQ ID
NO : 63).
La Figure 20 est un schéma qui montre la structure génomique des gènes HNL1 , HNL2 et HNL3, ainsi que la localisation des mutations observées chez HNL3.
La Figure 21 est un schéma qui montre la structure génomique de HNL4X et HNL4Y.
La Figure 22 montre une portion de la séquence en acides aminés (SEQ ID NO: 10) de la protéine HNL3 mutée en position 451.
La Figure 23 montre une autre portion de la séquence en acides aminés (SEQ ID NO: 11) de la protéine HNL3 mutée en position 796. La Figure 24 représente la séquence d'ADN complémentaire (ADNc) (SEQ ID NO: 12) du transcrit HNL3 sauvage.
La Figure 25 représente la séquence d'ADN complémentaire (ADNc) (SEQ ID NO: 13) du transcrit HNL3 muté. La Figure 26 représente la séquence en acide aminés (SEQ ID NO: 14) de la protéine humaine HNL3 sauvage.
La Figure 27 représente la séquence en acide aminés (SEQ ID NO: 15) de la protéine humaine HNL3 mutée.
DESCRIPTION DÉTAILLÉE DE L'INVENTION
L'originalité de la présente invention porte sur l'identification de la séquence génomique du gène HNL4X localisé en Xp22.3 et d'un homologue fonctionnel HNL4Y placé sur le chromosome Y localisé en Yq11.22 ainsi que leur orthologue murin MLN4.
L'invention concerne aussi l'identification de l'implication des protéines de la synaptogenèse, en particulier HNL3 et HNL4 dans le développement de désordres mentaux ou maladies psychiatriques telle que l'autisme.
1. Polypeptide et polynucléotide
Selon un premier aspect, la présente invention vise un polypeptide isolé ou purifié, qui, dans sa forme sauvage (i.e. non-muté), est impliqué dans la synaptogenèse, dont au moins une mutation dans la séquence en acides aminés est associée au développement de maladies neurologiques et/ou à une prédisposition au développement de désordres mentaux ou maladies psychiatriques.
Par « désordres mentaux ou maladies psychiatriques », on entend des maladies telles l'autisme, le syndrome d'Asperger, la schizophrénie et le syndrome de ADHD (Attention Déficit Hyperactivity Disorder).
Préférablement, le polypeptide consiste en une protéine d'adhésion cellulaire, plus préférablement en une protéine appartenant à la famille des neuroligines humaines et encore plus préférablement, le polypeptide consiste en la protéine HNL3, la HNL4X ou la protéine HNL4Y. Avantageusement, lorsque le polypeptide est le HNL3, il comprend une séquence d'acides aminés selon la SEQ ID NO: 14 et les séquences d'au moins 20, d'au moins 50 et d'au moins 100 acides aminés consécutifs ou plus dérivées de la SEQ ID NO: 14. Lorsque le polypeptide de l'invention est la HNL4X ou la protéine HNL4Y, il comprend une séquence choisie dans le groupe constitué par: la SEQ ID NO: 3, la SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 8, et les séquences d'au moins 20, d'au moins 50 et d'au moins 100 acides aminés consécutifs ou plus dérivées de la SEQ ID NO: 3, la SEQ ID NO: 6 ou de la SEQ ID NO: 8.
L'invention concerne également les polypeptides "mutés" et les polypeptides "dérivés" de la protéine sauvage, de préférence une neuroligine telle que HNL3, HNL4X ou HNL4Y.
Par "polypeptide dérivé" d'une protéine sauvage ou "variant" d'une protéine sauvage, on entend tous les peptides qui possèdent une séquence peptidique substantiellement identique, au moins en partie, à la séquence peptidique de la protéine sauvage. Il peut s'agir par exemple de polypeptides modifiés chimiquement ayant une séquence peptidique 100 % identique à une portion de la protéine sauvage. Il peut s'agir aussi de polypeptides hybrides ayant une première portion 100 % identique à une première portion de la protéine sauvage et une seconde portion aucunement/partiellement identique à une seconde portion de la protéine sauvage. Il peut s'agir encore de polypeptides ayant une homologie totale/partielle avec une portion de la protéine sauvage.
Par polypeptides "mutés" dérivés d'une protéine sauvage, on entend tous les peptides qui ont été obtenus suite à une modification de ladite protéine sauvage, que ce soit une modification par addition, délétion ou substitution de un ou plusieurs des acides aminés de la protéine sauvage. Il peut également s'agir d'une modification apportée par l'addition de chaînes carbonées fixées sur au moins un des acides aminés de la protéine sauvage ou sur au moins un des acides aminés des peptides pour lesquels il existe une substitution ou une modification de l'un des acides aminés par rapport à la protéine sauvage. Plus particulièrement, la présente invention couvre les peptides qui dérivent de la protéine humaine HNL3, HNL4X ou HNL4Y. Selon un mode de réalisation privilégié, et dans le cas où le polypeptide est un
HNL3 muté selon la présente invention, il possède la SEQ ID NO: 10, la SEQ ID NO: 11 ou la SEQ ID NO: 15, et une séquence d'au moins 20, d'au moins 50 et d'au moins 100 acides aminés consécutifs ou plus dérivée de la SEQ ID NO: 10, la SEQ ID NO: 11 ou la SEQ ID NO: 15. Dans le cas où le polypeptide est un HNL4X muté ou un HNL4Y muté selon la présente invention, il possède la SEQ ID NO: 9 ou une séquence d'au moins 20, d'au moins 50 et d'au moins 100 acides aminés consécutifs ou plus dérivée de la SEQ ID NO:9.
L'invention vise aussi les polypeptides (et les fragments de ceux-ci) qui sont codés par les séquences nucléotidiques mentionnées ci-après. Dans le contexte de la présente invention, le terme "polypeptide" est défini comme étant tout peptide ou protéine comprenant au moins deux acides aminés liés par un lien peptidique modifié ou non. Le terme polypeptide se réfère à des molécules de courtes chaînes telles que des peptides, oligopeptides ou oligomères ou à des longues chaînes telles des protéines. Un polypeptide selon la présente invention peut comprendre des acides aminés modifiés. Ainsi, le polypeptide de la présente invention peut également être modifié par un procédé naturel tel que les modifications post- transcriptionelles ou par un procédé chimique. Quelques exemples de ces modifications sont : acétylation, acylation, ADP-ribosylation, amidation, liaison covalente avec la flavine, liaison covalente avec un hème, liaison covalente avec un nucléotide ou un dérivé nucléotidique, liaison avec un lipide ou un dérivé lipidique, liaison covalente avec un phosphotidylinositol, réticulation, cyclisation, formation de lien disulfure, déméthylation, formation de molécule cystéine, formation de pyroglutamate, formylation, gamma-carboxylation, hydroxylation, iodination, méthylation, oxidation, phosphorylation, racémisation, hydroxylation, etc.. Ainsi, toute modification du polypeptide qui n'a pas pour effet d'éliminer les caractéristiques biochimiques du polypeptide d'origine, c'est-à-dire la capacité de former des synapses fonctionnelles, est couverte dans la portée de la présente invention.
Selon un aspect connexe, l'invention vise un polynucléotide isolé ou purifié codant pour un polypeptide tel que défini précédemment et plus particulièrement un polynucléotide isolé ou purifié codant pour un polypeptide impliqué dans la synaptogenèse dans lequel une mutation au moins de ce polynucléotide est associée au développement de maladies neurologiques et/ou à une prédisposition au développement de maladies mentales ou de maladies psychiatriques. Par "isolé ou purifié", on entend les molécules qui ont été altérées par l'homme de leur état natif, c'est-à-dire, si une telle molécule existe dans la nature, elle a été changée et/ou retirée de son environnement initial. Par exemple, un polynucléotide ou un polypeptide naturellement présent dans un organisme vivant n'est pas "isolé". Toutefois, le même polynucléotide ou polypeptide lorsque séparé de son environnement normal et/ou obtenu par clonage, amplification et/ou par synthèse chimique est considéré selon la présente invention comme étant "isolé". D'ailleurs, un polynucléotide ou polynucléotide qui est introduit dans un organisme par transformation, manipulation génétique ou par n'importe quelle autre méthode de recombinaison est "isolé" même si il est présent dans ledit organisme. Par "polynucléotide" on entend toute séquence ou molécule d'ADN, d'ARN possédant deux nucléotides et plus, incluant les séquences nucléiques codant pour un gène entier. Le terme polynucléotide englobe toutes les molécules d'acides nucléiques qui se retrouvent à l'état naturel ou artificiel. Ceci inclut les molécules d'ADN, les molécules d'ARN, les ADNc, les séquences exprimées (ESTs), les séquences artificielles et tous les fragments de ceux-ci. Il va de soi que les définitions "dérivé", "variant" et "muté" s'appliquent également aux polynucleotides selon la présente invention. Tout polynucléotide qui a été modifié chimiquement, enzymatiquement ou métaboliquement mais qui a conservé les propriétés biochimiques du polypeptide d'origine c'est-à-dire qui a conservé son pouvoir de former des synapses fonctionnelles, est inclus dans la portée de la présente invention.
Selon un mode de réalisation préférentiel, le polynucléotide selon l'invention lorsqu'il code pour une protéine HNL3 ou un fragment de cette protéine, cette dernière comprend avantageusement la SEQ ID NO: 14. Préférablement, le polynucléotide comprend une séquence choisie dans le groupe constitué par: la SEQ ID NO: 12, et les séquences d'au moins 20, d'au moins 50 et d'au moins 100 nucléotides consécutifs ou plus dérivées de la SEQ ID NO: 12.
Selon un mode de réalisation préférentiel, le polynucléotide selon l'invention lorsqu'il code pour une protéine HNL4X ou HNL4Y ou un fragment de cette protéine, cette dernière comprend avantageusement la SEQ ID NO: 3, la SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 8. Préférablement, le polynucléotide comprend une séquence choisie dans le groupe constitué par: la SEQ ID NO: 1 , la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 4, la SEQ ID NO: 5, la SEQ ID NO: 7, la SEQ ID NO: 16, la SEQ ID NO: 17, et les séquences d'au moins 20, d'au moins 50 et d'au moins 100 nucléotides consécutifs ou plus dérivées de ces séquences.
Selon un autre mode de réalisation, le polynucléotide code pour une protéine mutée non fonctionnelle. Préférablement, le polynucléotide code pour une protéine HNL3 mutée ou HNL4X mutée. Dans le cas où la protéine est la HNL4X, le polynucléotide est muté de telle sorte que la mutation provoque une terminaison précoce de la protéine. Plus préférablement, le polynucléotide de l'invention comprend la SEQ ID NO: 1 et la mutation est une insertion d'une thymine en position 1186 à partir de la position 465 de la Figure 9 (ORF). Cette mutation occasionne la production d'une protéine défectueuse dépourvue de sa partie transmembranaire puisque cette mutation provoque une terminaison précoce de la protéine (D396stop). Dans le cas où la protéine mutée est la HNL3, la mutation provoque une modification de la séquence protéique telle qu'une substitution d'acide aminé à la position 451 et/ou 796 de la Figure 18 ou 21. Plus particulièrement, la mutation produite à la position 451 consiste en la substitution d'une arginine par une cystéine, tandis que la mutation produite à la position 796 consiste en la substitution d'une asparagine par une serine. Cet acide aminé, arginine R451 , est localisé dans le domaine acétylcholine estérase des neuroligines et est extrêmement conservé dans toutes les neuroligines séquencées à ce jour et dans les acétylcholine estérases de poissons, d'oiseaux et de reptiles (Figures 6A et 6B).
Les polypeptides et polynucleotides selon la présente invention peuvent être préparés par tout procédé approprié. Ils peuvent notamment être obtenus par synthèse chimique mais il est également possible de les obtenir par voie biologique en utilisant notamment différents vecteurs dans les cultures cellulaires appropriées tel que cela sera décrit ci-après. Les peptides selon la présente invention peuvent se présenter sous forme déglycosylée, ou glycosylée, si cela est nécessaire. Une personne versée dans le domaine de l'invention saura obtenir différents polynucléotides/polypeptides et elle saura également déterminer quels sont, parmi les polynucléotides/polypeptides obtenus, ceux qui ont une activité biologique adéquate.
2. Vecteur, Anticorps et Cellule Selon un autre aspect, l'invention concerne tout vecteur (de clonage et/ou d'expression) et tout hôte cellulaire (procaryote ou eucaryote) transformé par un tel vecteur, et comprenant les éléments de régulation permettant l'expression de la séquence de nucléotides codant pour un peptide selon l'invention.
Selon un autre aspect, l'invention a pour objet un procédé de préparation d'un peptide de l'invention, par transformation d'un hôte cellulaire à l'aide d'un vecteur d'expression (plasmide, cosmide, virus, etc.) comprenant les séquences d'ADN codant pour les peptides de l'invention, suivie de la mise en culture de l'hôte cellulaire ainsi transformé, et de la récupération du peptide dans le milieu de culture. L'utilisation de vecteurs pour l'expression de protéines et de peptides dans les cellules d'un hôte, notamment l'humain, est bien connue et ne sera pas décrite plus en détail.
Les polypeptides et polynucleotides de la présente invention peuvent aussi être utilisés pour préparer des anticorps polyclonaux ou monoclonaux capables de se fixer (préférablement de manière spécifique) sur au moins un polypeptide/polynucléotide objet de l'invention. La présente invention vise donc également de tels anticorps purifiés qui peuvent être obtenus par des techniques très bien connues comme par exemple la technique décrite par Kolher et Milstein (Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity, Nature, 1975, 262:495-497). Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, les anticorps sont de type « humanisés ». Une personne versée dans le domaine de par ses connaissances générales saura comment préparer ces types d'anticorps.
Dans le contexte de la présente invention, le terme "vecteur" se réfère à une construction polynucléotidique conçue pour être transfectée dans différents types cellulaires. De ce fait ces vecteurs visent les vecteurs d'expression conçus pour l'expression d'une séquence nucléotidique dans une cellule hôte ; les vecteurs de clonage conçus pour l'isolation, propagation et la réplication de nucléotides insérés; les vecteurs viraux conçus pour la production de virus recombinant ou de particule virale (viral-like particle); ou des vecteurs navettes qui comprennent des attributs de plus d'un vecteur.
3. Méthodes et Procédé d'utilisation
Selon un autre aspect, l'invention concerne le traitement ou la prévention des pathologies biochimiques ou des maladies mentales telles que l'autisme ou le Syndrome d'Asperger. Plus particulièrement, l'invention vise l'utilisation d'un polynucléotide non muté codant pour une protéine impliquée dans la synaptogenèse. Préférablement, la protéine consiste en une protéine d'adhésion cellulaire, plus préférablement en une protéine appartenant à la famille des neuroligines humaines et encore plus préférablement le polypeptide consiste en la protéine HNL3, HNL4X ou la protéine HNL4Y. Des exemples de polynucleotides non mutés sont donnés précédemment. L'invention vise aussi une méthode de traitement comprenant l'insertion dans au moins une portion des cellules d'un patient malade, d'un polynucléotide codant pour un polypeptide impliqué dans la synaptogenèse tel que la protéine HNL3 ou HNL4X. Préférablement, les cellules dans lesquelles le polynucléotide est inséré sont des cellules souches. Des exemples de polynucleotides satisfaisants sont donnés précédemment.
Selon un aspect connexe, l'invention vise un procédé de transformation de cellules souches d'un patient présentant une mutation d'un gène codant pour une protéine impliquée dans la synaptogenèse, le procédé comprenant: a) l'utilisation de cellules souches du patient; b) l'insertion, dans le génome des cellules souches, d'un polynucléotide codant pour un polypeptide fonctionnel impliqué dans la synaptogenèse telle que la protéine HNL3 ou HNL4X; et c) la réimplantation chez le patient de cellules transformées selon l'étape b). Une personne versée dans le domaine saura adapter les méthodes de traitement ci-dessus mentionnées et déterminer, en fonction de plusieurs facteurs, les polynucleotides devant être utilisés, le moyen pour les insérer dans les cellules et le mode et la quantité de polynucleotides ou de cellules devant être administrés. Parmi les facteurs pouvant influencer ses choix l'on retrouve: la nature du traitement, la séquence exacte des polynucleotides; le stade de la maladie; la condition, l'âge et le poids du patient, etc..
Selon un autre aspect, l'invention porte aussi sur un procédé pour détecter des désordres biochimiques altérant la formation, la stabilisation et/ou la reconnaissance des synapses, une prédisposition au développement de pathologies psychiatriques et/ou une maladie mentale tels que l'autisme ou le Syndrome d'Asperger. Ainsi, le procédé comprend au moins une des étapes suivantes: la détection d'une mutation dans la séquence d'un gène codant pour une protéine impliquée dans la synaptogenèse, dans la séquence d'un fragment de ce gène ou dans la séquence d'un ARN messager de ce gène; - la détection de la présence d'une protéine impliquée dans la synaptogenèse; la détection d'une mutation dans une protéine impliquée dans la synaptogenèse; la mesure de l'activité biologique d'une protéine impliquée dans la synaptogenèse ou de son interaction avec l'un de ses partenaires protéiques. Un procédé pour mesurer une telle interaction est par exemple décrit dans Ichtchenko et al. (J. Biol. Chem., 1996, 271(5):2676-82) ou Grifman et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, 95(23): 13935-40). Selon un mode de réalisation privilégié, le procédé comprend: a) l'amplification d'un gène codant pour une protéine impliquée dans la synaptogenèse, l'amplification d'un fragment dudit gène ou l'amplification d'un ARN messager dudit gène; et b) la détection d'une mutation dans la séquence dudit gène, dans la séquence dudit fragment ou dans la séquence dudit ARN messager. Un aspect connexe du procédé de l'invention concerne un kit (trousse) pour la détection des désordres biochimiques altérant la formation des synapses, d'une prédisposition au développement de pathologies psychiatriques et/ou d'une maladie mentale, et/ou pour le diagnostic d'une maladie mentale. Selon un mode de réalisation préféré, le kit comprend au moins un des éléments choisis dans le groupe constitué par: une sonde, un anticorps, un réactif et un support solide, ces éléments permettant: i) la détection d'une mutation dans la séquence d'un gène codant pour une protéine impliquée dans la synaptogenèse, dans la séquence d'un fragment de ce gène ou dans la séquence d'un ARN messager de ce gène; et/ou ii) la mesure de l'activité biologique d'une protéine impliquée dans la synaptogenèse ou de son interaction avec l'un de ses partenaires protéiques.
Préférablement, le gène auquel il est fait référence dans le procédé et le kit code, dans sa forme sauvage, pour une protéine d'adhésion cellulaire, plus préférablement pour une protéine appartenant à la famille des neuroligines humaines et encore plus préférablement pour la protéine HNL3, HNL4X ou la protéine HNL4Y.
Avantageusement, le gène code, dans sa forme sauvage, pour une protéine comprenant la SEQ ID NO: 3, la SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 8 ou la SEQ ID NO: 14. Plus préférablement, le gène comprend la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 4 ou la SEQ ID NO: 12. La connaissance du gène impliqué dans une prédisposition au développement de l'autisme ou du Syndrome d'Asperger ouvre la porte à la découverte de nouvelles molécules permettant de prévenir, contrôler ou traiter la maladie. Ainsi, selon un autre aspect, l'invention vise un procédé de tri de molécules pouvant permettre de moduler l'activité biologique d'un polypeptide codé par le polynucléotide tel que défini précédemment, ou l'activité biologique du polypeptide tel que défini précédemment. Selon un mode de réalisation privilégié, le procédé de tri comprend: a) la mise en contact dudit polypeptide avec une molécule susceptible de moduler son activité biologique; b) la mesure de l'activité biologique dudit polypeptide; et c) l'évaluation de l'activité mesurée à l'étape b) par rapport à une mesure de l'activité biologique dudit polypeptide en absence de ladite molécule.
4. Compositions
La présente invention porte également sur l'utilisation de ces polypeptides et des polynucleotides les codant pour la préparation de compositions thérapeutiques utiles dans le traitement d'une maladie mentale ou neurologique, tel l'autisme, le syndrome d'Asperger, la schizophrénie ou le syndrome ADHD.
Dans un mode de réalisation préféré, la composition de la présente invention contient, en outre un véhicule pharmaceutiquement acceptable, et un élément choisi dans le groupe constitué par : un polynucléotide selon la présente invention; - un polypeptide selon la présente invention; un anticorps selon la présente invention; un vecteur selon la présente invention; et - une cellule hôte selon la présente invention.
Les compositions selon la présente invention peuvent se présenter sous une forme solide ou liquide quelconque habituelle pour l'administration pharmaceutique, c'est-à-dire par exemple des formes d'administration liquide, en gel, ou tout autre support permettant par exemple la libération contrôlée. Parmi les compositions utilisables, on peut citer notamment les compositions injectables plus particulièrement destinées aux injections dans la circulation sanguine chez l'humain.
Une personne versée dans le domaine saura préparer des compositions pharmaceutiquement acceptables et déterminer, en fonction de plusieurs facteurs, le mode d'administration privilégié et la quantité devant être administrée. Parmi les facteurs pouvant influencer ses choix l'on retrouve: la nature du traitement, la nature exacte des ingrédients, actifs ou non, entrant dans la composition; le stade de la maladie; la condition, l'âge et le poids du patient, etc..
Les exemples ci-après permettront de mettre en évidence d'autres caractéristiques et avantages de la présente invention.
EXEMPLES
Les exemples qui suivent servent à illustrer l'étendue de l'utilisation de la présente invention et non à limiter sa portée. Des modifications et variations peuvent y être effectuées sans que l'on échappe à l'esprit et à la portée de l'invention. Bien que l'on puisse utiliser d'autres méthodes ou produits équivalents à ceux que l'on retrouve ci-dessous pour tester ou réaliser la présente invention, le matériel et les méthodes préférés sont décrits. Introduction
Un locus de prédisposition à l'autisme a été suggéré en Xp22.3 par l'observation de plusieurs délétions chromosomiques indépendantes et de novo dans cette région. La taille de la région critique supprimée chez ces patients était approximativement de 10 Mb, délimitée par DXYS232X (6 cM) et DXS7103 (16 cM). À l'appui de ces résultats, l'analyse globale du génome effectuée par l'étude PARIS (Philippe et al., 1999) indique que le LOD maximal pour le chromosome X est localisé dans cette région (11 cM).
Dans cet intervalle, nous avons identifié le gène humain de la neuroligine 4 (HNL4X), codant un nouveau membre de la famille des neuroligines (Scheiffele et al., 2000; Song et al., 1999). Ces molécules d'adhésion cellulaire possèdent une homologie avec les acétylcholines estérases et sont spécifiquement localisées dans la membrane postsynaptique des synapses excitatrices (Song et al., 1999). Elles sont des facteurs cruciaux pour la formation des synapses fonctionnelles car l'expression des neuroligines dans des cellules HeLa ou de reins peut déclencher le développement de structures présynaptiques dans les neurones en contact (Scheiffele et al., 2000). Nous avons identifié cinq gènes HNL dans le génome humain, localisés sur les chromosomes 3q26 (HNL1), 17p13 (HNL2), Xq13 (HNL3), Xp22.3 (HNL4X) et Yq11.2 (HNL4Y). La phylogénie des neuroligines suggère que HNL3 est l'ancêtre commun de HNL4X et HNL4Y. Le profil d'expression des HNLs a été déterminé par RT-PCR spécifiques dans différents tissus de cerveaux adultes (mâles et femelles). L'expression des gènes HNL1-3 et de leurs transcrits alternatifs est retrouvée dans toutes les régions de cerveau. HNL4X et HNL4Y sont exprimés à des niveaux semblables dans le cerveau mâle sans différences significatives entre les différents tissus. Comme attendu, HNL4Y n'est pas exprimé dans le cerveau femelle, tandis que HNL4X l'est.
Exemple 1 : Caractérisation des gènes HNL4X et HNL4Y et leur implication dans les syndromes psychiatriques L'étude phylogénétique montre que les gènes HNL4X localisés sur le chromosome X et HNL4Y localisé sur le chromosome Y ont commencé à diverger, il y a environ 40 millions d'années, pendant l'évolution des primates. Alors que tous les gènes du chromosome Y qui ont divergé à cette date sont devenus des pseudo gènes (gènes inactifs), HNL4 Y est fortement conservé (Tableau 1). Tableau 1 : Conservation des gènes HNL4X et HNL4Y au cours de l'évolution
Divergence Divergence Séquence
Paire de gène Ks KA Ks/KA ADN Protéine comparée
(%) (nucléotides)
Group 4
GYG2/GYG2P* 0.11 0.06 1.8 7 12 525
ARSD/ARSDP* 0.09 0.07 1.3 7 13 846
ARSE/ARSEP* 0.05 0.04 1.2 4 9 615
PRKX Y 0.07 0.03 2.3 5 8 1020
HNL4X/4Y 0.079 0.012 6.456 3 2 2451
STS/STSP* 0.12 0.10 1.2 11 18 852
KAL1/KALP* 0.07 0.06 1.2 6 12 1302
AMELX/Y 0.07 0.07 1.0 7 12 576
Group 3
TB4X/Y 0.29 0.04 7.3 7 7 135
EIF1AX/Y 0.32 0.01 32 9 2 432
ZFX/Y 0.23 0.04 5.8 7 7 2394
DFFRX/Y 0.33 0.05 6.6 11 9 7671
DBX/Y 0.36 0.04 9.0 12 9 1932
CASK/CASKP* 0.24 0.22 1.1 15 32 156
UTX/Y 0.26 0.08 3.3 12 15 4068
Group 2
UBE1X/Y 0.58 0.07 8.3 16 13 693
SMCX/Y 0.52 0.08 6.5 17 15 4623
Group 1
RPS4X/Y 0.97 0.05 19 18 18 792
RBMX Y 0.94 0.25 3.8 29 38 1188
SOX3/SRY 1.25 0.19 6.6 28 29 264
PCDHX/Y 0.006 0.008 0.809 1 2 2850
Ce tableau regroupe les taux de substitutions synonymes (KS) et non synonymes (KA) 5 de tous les gènes connus du chromosome X possédant un homologue sur le chromosome Y. Le rapport KS/KA est une indication de la conservation des gènes. KS est le taux de substitution synonyme par site synonyme qui représente les modifications qui ne changent pas la séquence de la protéine. KA est le taux de substitution non synonyme par site non synonyme qui représente les modifications qui 0 changent la séquence de la protéine. Si le rapport KS/KA = 1 alors le gène n'est pas conservé car il y a autant de modifications synonymes et non-synonymes. C'est le cas pour les couples X/Y possédant un pseudogène non fonctionnel sur le chromosome Y (par ex. KAL1/KALP*). Si KS/KA >1 , alors le gène varie au cours de l'évolution mais la protéine est bien conservée. C'est le cas pour le couple HNL4/5 indiquant que la 5 variation génétique entre ces gènes est soumise à une pression de sélection qui conserve les séquences protéiques de HNL4X et HNL4Y. Pour la détection de mutations sur le gène HNL4X, les étapes suivantes ont été utilisées:
Matériels et Méthodes Identification de la séquence des gènes HNL4X, HNL4Y et MNL4
L'isolement des gènes HNL4X et HNL4Y a été effectué par l'analyse informatique des séquences de la région Xp22.3 et Yq11.22 et par l'amplification des transcrits complets à partir d'ARNm de cerveaux. Analyse informatique Une étude systématique des gènes de la région Xp22.3, proche du microsatellite DXS996, a été effectuée à partir des données du séquençage du génome humain (http://genome.usc.edu et http//www. ensembl.org/ genomecentral). Le microsatellite DXS996 est le marqueur génétique qui montre la liaison la plus significative avec l'autisme dans l'analyse de Philippe et al. (1999, précité). Nous avons identifié, que ce marqueur génétique était localisé dans un gène putatif KIAA1260 et qu'il y existait un homologue putatif KIAA0951 localisé sur le chromosome Y. La séquence partielle des ADNc des gènes codant pour KIAA1260 et KIAA0951 a été déduite à partir de la séquence génomique. Une analyse par alignement de séquence (BLAST) et un arbre phylogénétique regroupant les autres neuroligines humaines a été effectué pour définir que KIAA1260 et KIAA0951 sont des nouveaux membres de la famille des neuroligines que nous appelons dorénavant HNL4Xet HNL4Y. Analyse des transcrits HNL4X et HNL4Y
Des ARN totaux de cerveaux humains provenant de différents hommes (n=5) et femmes (n=5) ont été isolés à partir de biopsies de cortex frontaux. Les ADNc complets des ARNm HNL4X et HNL4Y ont été rétrotranscrits, amplifiés et directement séquences. Les oligonucléotides utilisés pour l'amplification et le séquençage sont indiqués dans les Tableaux 2 et 3.
Séquençage des gènes HNL4X et HNL4Y chez les sujets autistes et Asperger Chaque exon des gènes HNL4X et HNL4Y a été amplifié et séquence à partir de l'ADN génomique. Le nom et la séquence de chaque amorce sont indiqués dans le Tableau 3. Tableau 2 : Noms et séquences des amorces utilisés pour amplifier et séquencer les ADNc de HNL4X et HNL4Y
Exons 1-6 HNLXY1 ACCCCGCGTGAAGATGAAATG SEQ ID NO: 18
HNLXYE6dR GAGGGATAGGARGGGAAATAG SEQ ID NO: 19
Exons 2-5 HNLXYE2F GGATGTGGATGCAGATTTGAA SEQ ID NO: 20
HNLXY4 GCTCTGAATGATGGCCTTCTG SEQ ID NO: 21
Exons 4-6 HNLXY10 TCCTGGATCAGATTCAAGCAC SEQ ID NO: 22
HNLXYE6dR GAGGGATAGGARGGGAAATAG SEQ ID NO: 23
Exons 2-6 HNLXYE2F GGATGTGGATGCAGATTTGAA SEQ ID NO: 24
HNLXYE6dR GAGGGATAGGARGGGAAATAG SEQ ID NO: 25
Pour les amorces dégénérées, utilisation du code universel : M(AC), R(AG), W(AT), S(CG), Y(CT), K(GT), V(ACG), H(ACT), D(AGT), B(CGT), N(ACGT)
Tableau 3 : Noms et séquences des amorces utilisés pour séquencer les gènes HNL4X et HNL4Y
Exons Amorces Séquences SEQ ID NO
Exon 1a HNL4X HNLXYElaF GAAACAACGAATTTCCTCCAAA 26
HNLXYElaR AGIGAGG I I ICCAICCI I IGC 27
Exon1bHNL4X HNLXE1F ATTCTTTAAGAAAACTGTCAGC 28
HNLXYE1R CACGGGAAAGGGGTGCATGGA 29
Exon 1 HNL4Y HNLYE1F GGGG I GC I I C I I I I GGGAGG I 30
HNLXYE1R CACGGGAAAGGGGTGCATGGA 31
Exon 2 HNLX/Y HNLXYE2F GGAIUIGGAIGCAGAI I IGAA 32
HNLXE2Rbis GTATTGTTTTCTGTTCCAGTG 33
Exon 3 HNL4X/Y HNLXYE3F IGIGIIICCGIACI IGGCI I I 34
HNLXYE3R GCTTAGTCATTCACATGATGAA 35
Exon 4 HNL4x HNLXYE4F ACCAAAAATCTCTTGTGTTCT 36
HNLXYE4R I ICI IGGI ICAGGGIAI I IGC 37
Exon 4 HNL4Y HNLYE4F AACAAAAATGTCCTGTGTTCT 38
HNLXYE4R I ICI IGGI ICAGGGIAI I IGC 39
Exon 5 HNL4X/Y HNLXYEδdF I G I CCRCAA I I I I GCAC I GC 40
HNLXYEδdR AGGAYAGTGATACCCCAACA 41
Exon 6 HNL4X/Y HNLXYE6Fbis AGAGCAGATTGTAACTTCCTG 42
HNLXYE6dR GAGGGATAGGARGGGAAATAG 43
Pour les amorces dégénérées, utilisation du code universel : M(AC), R(AG), W(AT), S(CG), Y(CT), K(GT), V(ACG), H(ACT), D(AGT), B(CGT), N(ACGT).
Tableau 4 : Noms et séquences des amorces utilisés pour l'amplification de l'ADNc MNL4 (souris 57BL6)
Figure imgf000022_0001
Tableau 5 : Noms et séquences des amorces utilisés pour l'amplification de MNL4 en trois PCR d'environ 1 kb
Figure imgf000023_0001
Tableau 6 : Noms et séquences des amorces utilisés pour l'amplification de HNL3
Figure imgf000023_0002
Afin de tester ce gène chez des sujets autistes, la structure génomique des différentes HNLs a été définie et les parties codantes (Exon 2-Exon 6) ont été amplifiées.
Ainsi, 140 garçons et 18 filles autistes ont été testés pour la majorité de la partie codante HNL4X/4Y.
Dans une famille suédoise avec deux frères atteints, l'un avec un autisme et l'autre présentant un syndrome d'Asperger, une thymidine supplémentaire a été identifiée au nucléotide 1186 du gène HNL4X, créant un codon stop (Figure 17). Cette mutation (D396stop) est localisée dans le domaine estérase, produisant un arrêt prématuré de la protéine et supprimant le domaine transmembranaire. Ce changement est hérité de la mère, mais est absent chez la grand-mère maternelle, chez les deux tantes maternelles et chez l'enfant non atteint, indiquant le statut de novo de cette mutation chez la mère des garçons atteints. En outre, cette mutation n'a pas été trouvée dans 350 contrôles (250 femmes et 100 hommes).
D'autre part, le ratio garçon/fille, lequel est de quatre pour l'autisme et de neuf pour de syndrome d'Asperger corrobore cette observation selon laquelle HNL4X/4Y influe sur la synaptogenèse et la mutation de HNL4X/4Y constitue un facteur de prédisposition aux maladies mentales, notamment l'autisme et le syndrome d'Asperger.
L'identification de cette mutation Stop dans un gène spécifique des primates, porté par le chromosome X chez deux sujets autistes et impliqué dans la synaptogenèse est une des premières mutations fonctionnelles identifiées dans une maladie psychiatrique. Cette mutation est en outre la première mutation décrire associée à l'autisme sans autre signe clinique (X fragile, sclérose tuberculeuse, etc.).
Exemple 2 : Caractérisation du gène HNL3 et son implication dans les syndromes psychiatriques.
Lors de la recherche de mutations dans HNL3, le gène ancestral de HNL4X/Y localisé dans la région Xq13, chez deux familles indépendantes, deux changements d'acides aminés situés dans des régions fortement conservées de la protéine ont été identifiés. Une des deux familles est très semblable à la première famille mutée dans HNL4X. Les deux frères atteints, le premier d'autisme et le second du syndrome d'Asperger, reçoivent la mutation de leur mère. De façon intéressante, la mère a aussi un frère avec syndrome d'Asperger et d'autres parents avec des désordres psychiatriques. La mutation (R451C) est située dans le domaine estérase de la protéine et concerne un acide aminé conservé au cours de l'évolution car il est présent dans toutes les neuroligines (y compris chez D. melanogasteή et dans toutes les acétylcholine estérases de mammifères, de poissons, de reptiles et d'oiseaux séquencées à ce jour (voir Figure 6). La mutation est absente chez 200 contrôles (100 femmes et 100 hommes). Ces résultats soutiennent le rôle des neuroligines dans l'étiologie de désordres mentaux ou maladies psychiatriques tels que l'autisme et du syndrome d'Asperger. MNL4, l'orthologue de HNL4X chez la souris a aussi été identifié. Ce nouveau gène devrait permettre la compréhension du déficit induit par une mutation telle que la mutation HNL4X dans l'autisme (voir Figure 19). Le dernier tour du génome effectué sur des familles d'autistes Finlandais (Auranen, et al., 2002) a identifié 2 pics de liaison très significatifs en 3q26 (exactement où est situé HNL1) et en Xq13-21 (exactement où est situé HNL3). La région Xp22.3, contenant HNL4X, est aussi délétée chez deux patients schizophrènes. II est donc possible que les neuroligines soient aussi responsables de la susceptibilité à ce syndrome (la schizophrénie affecte 1% de la population).

Claims

REVENDICATIONS
1. Polynucléotide isolé ou purifié codant pour un polypeptide impliqué, dans sa forme sauvage, dans la synaptogenèse, caractérisé en ce qu'au moins une mutation dans la séquence en acide nucléique dudit polynucléotide est associée au développement de maladies neurologiques et/ou à une prédisposition au développement de désordres mentaux ou de maladies psychiatriques.
2. ' Polynucléotide selon la revendication 1 , caractérisé en ce que ladite protéine est une protéine d'adhésion cellulaire.
3. Polynucléotide selon la revendication 2, caractérisé en ce que ladite protéine appartient à la famille des neuroligines humaines.
4. Polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il est muté de manière à coder pour une protéine mutée non fonctionnelle.
5. Polynucléotide selon la revendication 4, caractérisé en ce que ladite protéine est la HNL3.
6. Polynucléotide selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il code pour une protéine comprenant une séquence choisie dans le groupe constitué par: la SEQ ID NO: 10, la SEQ ID NO: 11 , et les fragments de cette protéine.
7. Polynucléotide selon la revendication 5 ou 6, caractérisé en ce qu'il comprend la SEQ ID NO: 13, et les séquences d'au moins 20 nucléotides consécutifs dérivés de ladite séquence.
8. Polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que ladite protéine est la HNL4X ou la HNL4Y.
9. Polynucléotide selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il code pour une protéine comprenant une séquence choisie dans le groupe constitué par: la SEQ ID
NO: 3, la SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 8 et les fragments de cette protéine.
10. Polynucléotide selon la revendication 8 ou 9, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence choisie dans le groupe constitué par: la SEQ ID NO:1 , la SEQ ID NO.2, la SEQ ID NO:4, la SEQ ID NO:5, la SEQ ID NO:7, la SEQ ID NO: 16, la SEQ ID NO: 17 et les séquences d'au moins 20 nucléotides consécutifs dérivés desdites séquences.
11. Polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 8 à 10, caractérisé en ce que la protéine est la HNL4X et en ce que ledit polynucléotide est muté de telle sorte que ladite mutation provoque une terminaison précoce de la protéine.
12. Polynucléotide selon la revendication 11 , caractérisé en ce qu'il comprend la SEQ ID NO: 1 et en ce que ladite mutation est une insertion d'une thymine en position 1186 à partir de la position 465 de la Figure 9.
13. Polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 8 à 12, caractérisé en ce que ladite mutation occasionne la production d'une protéine défectueuse dépourvue de sa partie transmembranaire.
14. Polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, caractérisé en ce que ladite mutation est associée à une prédisposition du développement de l'autisme, du syndrome d'Asperger, de la schizophrénie ou du syndrome ADHD.
15. Polypeptide isolé ou purifié, caractérisé en ce qu'il est codé par un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 14.
16. Polypeptide isolé ou purifié, caractérisé en ce qu'il est impliqué dans la synaptogenèse, et en ce que la présence d'au moins une mutation dans la séquence en acide aminé dudit polypeptide est associée à une prédisposition au développement de désordres mentaux ou de maladies psychiatriques.
17. Polypeptide selon la revendication 15 ou 16, caractérisé en ce qu'il consiste en une protéine d'adhésion cellulaire.
18. Polypeptide selon l'une quelconque des revendications 15 à 17, caractérisé en ce qu'il consiste en une protéine appartenant à la famille des neuroligines humaines.
19. Polypeptide selon la revendication 18, caractérisée en ce qu'il est muté et non- fonctionnel.
20. Polypeptide selon la revendication 19, caractérisé en ce qu'il consiste en la protéine HNL3.
21. Polypeptide selon la revendication 20, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence choisie dans le groupe constitué par: la SEQ ID NO: 10, la SEQ ID NO: 11 , la SEQ ID NO: 15 et les séquences d'au moins 20 acides aminés consécutifs de la SEQ ID NO: 10, de la SEQ ID NO: 11 ou de la SEQ ID NO: 15.
22. Polypeptide selon la revendication 21 , caractérisé en ce que ladite mutation provoque une substitution d'acide aminé à la position 451 ou 796 de la Figure 18.
23. Polypeptide selon la revendication 22, caractérisé en ce que ladite mutation à la position 451 est une substitution d'une arginine par une cystéine.
24. Polypeptide selon la revendication 22, caractérisé en ce que ladite mutation à la position 796 est une substitution d'une asparagine par une serine.
25. Polypeptide selon l'une quelconque des revendications 15 à 18, caractérisé en ce qu'il consiste en la protéine HNL4X ou la protéine HNL4Y.
26. Polypeptide selon la revendication 25, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence choisie dans le groupe constitué par: la SEQ ID NO: 3, la SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 8, et les séquences d'au moins 20 acides aminés consécutifs de la SEQ ID NO: 3, la SEQ ID NO: 6 ou de la SEQ ID NO: 8.
27. Polypeptide selon la revendication 25 ou 26, caractérisé en ce que ladite mutation provoque une terminaison précoce de ladite protéine.
28. Polypeptide selon l'une quelconque des revendications 25 à 27, caractérisé en ce que ladite mutation engendre une protéine dépourvue de sa partie transmembranaire.
29. Polypeptide selon l'une quelconque des revendications 25 à 28, caractérisé en ce que ladite mutation provoque une terminaison D396stop de la protéine.
30. Polypeptide selon l'une quelconque des revendications 12 à 29, caractérisé en ce que ladite mutation est associée à une prédisposition du développement de l'autisme, du syndrome d'Asperger, de la schizophrénie ou du syndrome ADHD.
31. Procédé pour détecter des désordres biochimiques altérant la formation des synapses, et/ou une prédisposition au développement de pathologies psychiatriques et/ou une maladie mentale, comprenant au moins une des étapes suivantes:
- la détection d'une mutation dans la séquence d'un polynucléotide tel que défini à la revendication 1 , dans la séquence d'un fragment dudit polynucléotide ou dans la séquence d'un ARN messager dudit polynucléotide;
- la détection de la présence d'un polypeptide tel que défini à la revendication 16;
- la détection d'une mutation dans un polypeptide tel que défini à la revendication 16;
- la mesure de l'activité d'un polypeptide tel que défini à la revendication 16, ou de l'interaction dudit polypeptide avec l'un de ses partenaires protéiques.
32. Procédé selon la revendication 31 , comprenant:
- l'amplification d'un gène codant dans sa forme sauvage (non mutée) pour une protéine impliquée dans la synaptogenèse, l'amplification d'un fragment dudit gène ou l'amplification d'un ARN messager dudit gène;
- la détection d'une mutation dans la séquence dudit gène, dans la séquence dudit fragment ou dans la séquence dudit ARN messager.
33. Procédé selon la revendication 31 ou 32, caractérisé en ce que le gène code dans sa forme sauvage pour une protéine d'adhésion cellulaire.
34. Procédé selon l'une quelconque des revendications 31 à 33, caractérisé en ce que ladite protéine appartient à la famille des Neuroligines humaines.
35. Procédé selon l'une quelconque des revendications 31 à 34, caractérisé en ce que ladite protéine est la HNL3.
36. Procédé selon l'une quelconque des revendications 31 à 35, caractérisé en ce que ledit gène code dans sa forme sauvage pour une protéine comprenant la SEQ ID NO: 14.
37. Procédé selon l'une quelconque des revendications 30 à 35, caractérisé en ce que ledit gène comprend la SEQ ID NO: 12.
38. Procédé selon l'une quelconque des revendications 30 à 37, caractérisé en ce que ladite mutation provoque une substitution d'acide aminé à la position 451 ou 796 de la Figure 18.
39. Procédé selon la revendication 38, caractérisé en ce que ladite mutation à la position 451 est une substitution d'une arginine par une cystéine.
40. Procédé selon la revendication 38, caractérisé en ce que ladite mutation à la position 796 est une substitution d'une asparagine par une serine.
41. Procédé selon l'une quelconque des revendications 31 à 34, caractérisé en ce que ladite protéine est la HNL4X ou la HNL4Y.
42. Procédé selon la revendication 41 , caractérisé en ce que ledit gène code dans sa forme sauvage pour une protéine comprenant la SEQ ID NO: 3, la SEQ ID NO: 6 ou la SEQ IDNO: 8.
43. Procédé selon la revendication 41 ou 42, caractérisé en ce que ledit gène comprend la SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 4.
44. Procédé selon l'une quelconque des revendications 41 à 43, caractérisé en ce que ladite protéine est la HNL4X et en ce que ladite mutation provoque une terminaison précoce de la protéine.
45. Procédé selon la revendication 44, caractérisé en ce que ladite mutation occasionne la production de ladite protéine dépourvue de sa partie transmembranaire.
46. Procédé selon l'une quelconque des revendications 41 à 45, caractérisé en ce que ledit gène consiste en la SEQ ID NO: 1 et en ce que ladite mutation est une insertion d'une thymine en position 1186 à partir de la position 465 de la Figure 9.
47. Procédé selon l'une quelconque des revendications 31 à 46, caractérisé en ce que le désordre ou la maladie mentale consiste en l'autisme, le syndrome d'Asperger, la schizophrénie ou le syndrome ADHD.
48. Kit pour la détection des désordres biochimiques altérant la formation des synapses, et/ou d'une prédisposition au développement de pathologies psychiatriques et/ou d'une maladie mentale, et/ou pour le diagnostic d'une maladie mentale, le kit comprenant au moins un des éléments choisi dans le groupe constitué par: une sonde, un anticorps, un réactif et un support solide permettant: i) la détection d'une mutation dans la séquence d'un polynucléotide tel que défini à la revendication 1 , dans la séquence d'un fragment dudit polynucléotide ou dans la séquence d'un ARN messager dudit polynucléotide; et/ou ii) la mesure de l'activité biologique d'un polypeptide tel que défini à la revendication
16, ou de l'interaction dudit polypeptide avec l'un de ses partenaires protéiques.
49. Kit selon la revendication 48, caractérisé en ce que ledit gène code pour une protéine comprenant la SEQ ID NO: 3, la SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 8, ou la SEQ ID NO: 14.
50. Kit selon la revendication 48 ou 49, caractérisé en ce que ledit gène comprend la SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 4, la SEQ ID NO: 12, la SEQ ID NO: 16 ou la SEQ ID NO: 17.
51. Kit selon l'une quelconque des revendications 48 à 50, caractérisé en ce que ladite protéine comprend une séquence choisie dans le groupe constitué par: la SEQ
ID NO: 3, la SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 8, ou la SEQ ID NO: 14.
52. Utilisation d'un polynucléotide non muté codant pour une protéine impliquée dans sa forme sauvage dans la synaptogenèse pour le traitement ou la prévention des pathologies biochimiques ou des maladies mentales.
53. Utilisation d'une protéine non-mutée qui est impliquée dans sa forme sauvage dans la synaptogenèse pour le traitement ou la prévention des pathologies biochimiques ou des maladies mentales.
54. Utilisation selon la revendication 52 ou 53, caractérisée en ce que ladite protéine est une protéine d'adhésion cellulaire.
55. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 52 à 54, caractérisée en ce que ladite protéine appartient à la famille des neuroligines humaines.
56. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 52 à 55, caractérisée en ce que ladite protéine est la HNL3 ou la HNL4X.
57. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 52 à 56, caractérisée en ce que ladite maladie mentale est l'autisme, du syndrome d'Asperger, de la schizophrénie ou du syndrome ADHD.
58. Procédé de tri de molécules permettant de moduler l'activité biologique du polypeptide codé par le polynucléotide selon l'une des revendications 1 à 14 ou l'activité biologique du polypeptide selon l'une des revendications 15 à 29, comprenant: a) la mise en contact dudit polypeptide ou d'une cellule recombinante le contenant avec une molécule susceptible de moduler son activité biologique; b) la mesure de l'activité biologique dudit polypeptide ou la mesure de l'interaction dudit polypeptide avec l'un de ses partenaires protéiques; et c) l'évaluation de l'activité mesurée à l'étape b) par rapport à une mesure de l'activité biologique dudit polypeptide en absence de ladite molécule.
59. Méthode de traitement d'une maladie mentale ou neurologique comprenant l'insertion dans au moins une portion des cellules d'un patient malade d'un polynucléotide codant pour un polypeptide tel que défini à la revendication 16.
60. Méthode selon la revendication 59, caractérisée en ce que lesdites cellules sont des cellules souches.
61. Méthode selon la revendication 59 ou 60, caractérisée en ce que ladite maladie mentale est l'autisme, le syndrome d'Asperger, la schizophrénie ou le syndrome
ADHD.
62. Méthode selon l'une quelconque des revendications 59 à 61 , caractérisée en ce l'on insère un gène codant pour une protéine HNL3 fonctionnelle et/ou pour une protéine HNL4X fonctionnelle.
63. Méthode selon la revendication 62, caractérisée en ce que la protéine HNL3 possède la SEQ ID NO: 14.
64. Méthode selon la revendication 62, caractérisée en ce que la protéine HNL4X possède la SEQ ID NO: 3.
65. Procédé de transformation de cellules souches d'un patient présentant une mutation d'un gène codant pour une protéine impliquée dans la synaptogenèse, caractérisé par: a) l'utilisation de cellules souches dudit patient; b) l'insertion dans le génome desdites cellules souches d'un polynucléotide tel que défini à la revendication 1 ; et c) la réimplantation chez le patient de cellules transformées selon l'étape b).
66. Anticorps monoclonaux ou polyclonaux purifiés reconnaissant spécifiquement au moins un des polynucleotides définis aux revendications 1 à 14 et/ou au moins un des polypeptides définis aux revendications 15 à 30.
67. Anticorps selon la revendication 66, caractérisés en ce qu'ils sont humanisés.
68. Vecteur de clonage ou d'expression comprenant un des polynucleotides définis aux revendications 1 à 14 ou un fragment de celui-ci.
69. Un vecteur selon la revendication 68, caractérisé en ce que ledit vecteur est choisi parmi les plasmides, les cosmides ou les phages.
70. Cellule hôte comprenant un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 14 et/ou un vecteur selon la revendication 68 ou 69.
71. Composition caractérisée en ce qu'elle contient, en outre un véhicule pharmaceutiquement acceptable, et au moins un élément choisi dans le groupe constitué par: un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 14; un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 15 à 30; - un anticorps selon la revendication 66 ou 67; un vecteur selon la revendication 68 ou 69; et une cellule hôte selon la revendication 70.
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