+

WO2003045369A2 - Utilisation des isomeres l de derives aminoacides de l'hydroxyguanidine pour la protection localisee de no - Google Patents

Utilisation des isomeres l de derives aminoacides de l'hydroxyguanidine pour la protection localisee de no Download PDF

Info

Publication number
WO2003045369A2
WO2003045369A2 PCT/FR2002/004117 FR0204117W WO03045369A2 WO 2003045369 A2 WO2003045369 A2 WO 2003045369A2 FR 0204117 W FR0204117 W FR 0204117W WO 03045369 A2 WO03045369 A2 WO 03045369A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
compound
isomer
arginine
nitric oxide
formula
Prior art date
Application number
PCT/FR2002/004117
Other languages
English (en)
Other versions
WO2003045369A3 (fr
WO2003045369A9 (fr
Inventor
Petra Beranova
Andrei Klechtchev
Bernard Muller
Christa Schott
Jean-Claude Stoclet
Sylvie Dijols
Jean-Luc Boucher
Daniel Mansuy
Original Assignee
Universte Louis Pasteur (Etablissement Public À Caractère Scientifique, Culturel Et Professionnel)
Centre National De La Recherche Scientifique (Etablissement Public À Cractère Scientifique Et Technologique)
Universite Rene Descartes (Paris V)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Universte Louis Pasteur (Etablissement Public À Caractère Scientifique, Culturel Et Professionnel), Centre National De La Recherche Scientifique (Etablissement Public À Cractère Scientifique Et Technologique), Universite Rene Descartes (Paris V) filed Critical Universte Louis Pasteur (Etablissement Public À Caractère Scientifique, Culturel Et Professionnel)
Priority to AU2002364804A priority Critical patent/AU2002364804A1/en
Publication of WO2003045369A2 publication Critical patent/WO2003045369A2/fr
Publication of WO2003045369A3 publication Critical patent/WO2003045369A3/fr
Publication of WO2003045369A9 publication Critical patent/WO2003045369A9/fr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/195—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group
    • A61K31/197—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group the amino and the carboxyl groups being attached to the same acyclic carbon chain, e.g. gamma-aminobutyric acid [GABA], beta-alanine, epsilon-aminocaproic acid or pantothenic acid
    • A61K31/198—Alpha-amino acids, e.g. alanine or edetic acid [EDTA]

Definitions

  • the present invention relates to the field of synthetic organic chemistry applied to the pharmaceutical field and relates to the use of amino acid derivatives of hydroxyguanidine, pharmaceutically acceptable salts or esters thereof for localized and selective production of monoxide nitrogen (NO) in its different forms (NO "free radical, NO " nitroxyl ion or NO + nitrosonium ion) biologically active in one or other of the different vascular tunics as well as the different applications resulting therefrom, in particular in prevention and / or the treatment of cardiovascular diseases and the prevention of rejection of transplants.
  • NO monoxide nitrogen
  • NO nitrogen monoxide
  • This role is particularly important in the cardiovascular system, where NO regulates hemodynamics and tissue irrigation (through its effects on vascular and cardiac muscles), hemostasis (through its effects on blood platelets) and l short-term and long-term adaptation of the cardiovascular system to variations in the environment (such as adaptation to exertion) and to various pathological states (such as ischemia or hypoxia), in particular by regulating phenomena of proliferation and migration of vascular and cardiac cells.
  • NO deficiency relating either to its production in the tissues or to its biological effects, is implicated in the pathophysiology of major cardiovascular diseases such as atherosclerosis, various types of arterial hypertension, pulmonary hypertension, vascular spasms (especially coronary), vascular disorders of smokers, vasculopathies consecutive to diabetes or rejection of transplant, in particular.
  • a replacement therapy aimed at compensating for the lack of NO in these pathologies therefore represents a major therapeutic objective in the cardiovascular field.
  • NO is produced by enzymes called NO synthases which are specifically localized in certain cells and whose activity is locally modulated by endogenous chemical or mechanical signals. This results in a very precise localization in space of the production and action sites of NO in response to these signals.
  • NO synthases enzymes which are specifically localized in certain cells and whose activity is locally modulated by endogenous chemical or mechanical signals.
  • endothelium which is a single-cell layer lining the entire cardiovascular cavity, is released into the tissue where it acts on other cells by a mechanism. paracrine and in traffic where it can be transported remotely in different forms.
  • NO is still produced by certain nerve endings called “nitrergic", for example those of the cavernous body, and by the endothelial cells of the small vessels which nourish the large vessels ("vasa vasorum").
  • nitrergic nerve endings and vasa vasorum are located in the outer lining of the vessels or adventitia, which is a connective tissue that has long been considered to have only a structural role which confers rigidity on the vessel.
  • the middle coat of the vessels which contains the smooth muscle cells responsible for vascular contraction and therefore for regulating their size, normally produces little NO, but the functioning of smooth muscle cells is regulated by the NO released from the endothelium. or adventitious.
  • NO is produced not only by the endothelium which lines the cavities, but also by the endothelium of the coronary vessels which irrigate the heart and by the cardiomyocytes themselves.
  • NO of neuronal or extra-neuronal origin acts not only on synaptic transmission but also on blood supply.
  • the localization of NO synthases in the vessels, in the heart and in the central nervous system allows precise spatial regulation of the concentration of NO in the different parts of the tissue.
  • This regulation can be disrupted or even be completely disabled during tissue aggression by inflammatory signals. These can indeed induce the expression in practically all cells of an inducible NO synthase capable of producing significant quantities of NO which flood the tissues and are often associated with the production of superoxide ions and other species. harmful radicals.
  • this phenomenon can constitute an adaptation reaction making it possible to fight against aggression (intense vasodilation, inhibition of the migration of phagocytic cells, cytotoxic effects on agents pathogens). Rapidly, it can nevertheless become deleterious in tissues such as the heart or the central nervous system of which it is the seat, as a result of cytotoxic phenomena.
  • inducible NO synthase One of the characteristics of the induction of inducible NO synthase and the deleterious phenomena which follow from it is that they are often associated with a deficiency of endothelial production of NO, for example in atherosclerosis, pulmonary hypertensions , cardiac ischemia, certain neuro-inflammatory or neuro-degenerative diseases such as Alzheimer's disease, etc.
  • Expression of inducible NO synthase can be inhibited by the administration of an NO donor.
  • One of the objects of the present invention is therefore the obtaining of medicaments making it possible to deliver NO (in one or the other of its forms) or a related compound selectively in one or the other of the different vascular tunics, so as to obtain the protective effects of NO on the cardiovascular system and on the tissues which it irrigates, such as the central nervous system, or to compensate for a deficiency of endogenous NO while avoiding the undesirable or deleterious effects which could arise from general flooding of the tissues with said NO or its neighboring forms.
  • a NO donor or NO gas by inhalation
  • a NO donor is a known therapeutic method, in particular to strengthen the protective role of NO in the cardiovascular system or the lungs, particularly in the event of deficiency in NO production endogenous by the endothelium.
  • Beneficial effects can be particularly expected in atherosclerosis, vascular complications of diabetes, insufficient male erectile function, vascular disorders in smokers, coronary restenosis after angioplasty (to limit neointimal proliferation), for protection of the heart or central nervous system against disorders related to ischemia, hypoxia and Alzheimer's disease, to inhibit tumor angiogenesis, to improve the functioning of the graft, and to prevent atherosclerosis after transplantation heart.
  • NO donors still have a relatively limited use in therapy.
  • Currently known donors are trinitrine and other organic nitro esters, nitroprusside, sydnonimines and inhaled NO gas.
  • Trinitrine and its analogues are used in the treatment of angina (angina). For reasons still unknown, their effects exercise mainly on the cardiovascular system, particularly in the veins. However, the margin is relatively narrow between the dose of trinitrine effective in angina attack and the dose capable of producing a sudden drop in blood pressure and a vascular collapse. In addition, a tolerance is quickly established. Chronic administration of organic nitro esters is recommended to prevent the occurrence of certain types of angina attack, but their therapeutic efficacy has not been demonstrated under these conditions.
  • Nitroprusside is a powerful vasodilator that has sometimes been used to treat certain very high arterial hypertensions in emergency situations. It produces NO (or the nitrosonium ion NO) in tissues by several mechanisms which are still poorly understood and which lead to the formation of ferrocyanide, which is not devoid of biological effect, or even to the formation of cyanide. The possibility of cyanide production under certain conditions seriously limits the use of nitroprusside.
  • the sydnonimines, molsidomine and linsidomine are spontaneously broken down in the body, thus releasing NO and a superoxide ion 0 2 ⁇ capable of causing a toxic effect in certain pathological situations.
  • NO gas administered by inhalation produces a local vasodilator effect in the lung. It is quickly captured by the blood.
  • One part is oxidized to nitrate, but another part seems to be transported at a distance in an undetermined form for the moment. NO transported in this way can be responsible for long-term or prolonged effects in various tissues, in particular diuretic and anti-platelet aggregation effects. These remote effects are still poorly understood.
  • NO by inhalation requires special facilities, so that it cannot be considered, in most of its therapeutic indications, outside the hospital environment.
  • Other NO donors which are not currently used in therapy, are currently being studied. Mention may be made of S-nitrosothiols, which can either liberate the free radical NO or S-nitrosyler of cysteine residues on proteins.
  • S-nitrosothiols which vary according to the physicochemical properties of the media, make their pharmacological properties unpredictable.
  • various molecules of therapeutic interest are known to which NO donor donor functional groups (either nitro esters or S-nitrosothiols) have been connected in order to take advantage of the complementary properties of these molecules and of NO.
  • derivatives of aspirin which do not produce gastric bleeding or a derivative of captopril (inhibitor of the angiotensin converting enzyme) donor of NO.
  • these compounds do not only deliver NO in the body, but also and above all the other associated active compound whose undesirable effects are supposed to be reduced by the presence of NO.
  • the pharmacological properties of such combinations and their therapeutic usefulness are therefore largely based on the effects of the latter compound and not on those of NO alone.
  • the present invention aims to overcome these drawbacks. To this end, it relates to the use of the L isomer of a compound of general formula (I):
  • nitric oxide precursor or a derivative resulting from the interaction of said nitric oxide with its targets organic.
  • nitric oxide precursor any chemical or physical form of nitric oxide capable of leading to the formation of biologically active NO.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition for use as a medicament, characterized in that it comprises, as active principle, the L isomer of at least one compound of formula (I) according to the invention, combined, where appropriate, in said composition with at least one pharmaceutically acceptable excipient or vehicle.
  • FIG. 3 represents a diagram illustrating the effects of NOHA on the cyclic GMP content of the rat thoracic aorta
  • figure 4 groups together two diagrams illustrating the influence of a NO sensor on the relaxing effect of N ⁇ -hydroxy-L-arginine (NOHA) in FIG. 4a and of N ⁇ -hydroxy-nor-L-arginine (nor- NOHA) in FIG. 4b, on the rat aorta deprived of endothelium, FIG.
  • NOHA N ⁇ -hydroxy-L-arginine
  • nor- NOHA N ⁇ -hydroxy-nor-L-arginine
  • FIG. 5 represents a diagram illustrating the influence of an inhibitor of the activation of guanylyl cyclase (ODQ) and of an inhibitor of NO-synthase (L-NAME) on the relaxing effect of N ⁇ -hydroxy- L-arginine (NOHA)
  • Figure 6 combines two diagrams illustrating the influence of an inhibitor of the activation of guanylyl cyclase (ODQ - Figure 6a) and an inhibitor of NO-synthase (L-NAME - Figure 6b ) on the relaxing effect of N ⁇ - hydroxy-nor-L-arginine (nor-NOHA), FIG.
  • FIG. 7 brings together two diagrams illustrating the interaction of N ⁇ - hydroxy-L-arginine (NOHA), on the Figure 7a, and N ⁇ -hydroxy- nor-L-arginine (nor-NOHA), in Figure 7b, with L-arginine (L-Arg),
  • Figure 8 combines three diagrams illustrating the influence of l weed on the cyclic GMP content of the media in preparations exposed to N ⁇ - hydroxy-L-arginine (NOHA) (media alone - Figure 8a), in the presence of the weed removed by dissection before dosing ( Figure 8b ) and by that of adventitious re-associated with the media during the incubation with NOHA, and FIG.
  • FIG. 9 represents a diagram illustrating the influence of an inhibitor of NO-synthase on the inhibition by the endothelium of the relaxing effect N ⁇ - hydroxy-nor-L-arginine (nor-NOHA) on the isolated rat aorta.
  • m is an integer between 0 and 4 (limits included) for the localized production, in situ and in vivo in the coats of blood vessels in humans or animals, of nitrogen monoxide (NO) under the form of NO + (nitrosonium ion), NO " (nitroxyl ion) or NO * (radical NO), a nitric oxide precursor or a derivative resulting from the interaction of said nitric oxide with its targets organic.
  • NO nitrogen monoxide
  • Therapeutic indications follow either from the effects on the weed (atherosclerosis, neointimal proliferation after vascular injury, certain forms of angina, transplant rejection) or the substitution of endothelial insufficiency (arterial hypertension, pulmonary hypertension). , diabetic vasculopathies, alterations in male erection, neurodegenerative state (in particular Alzheimer's disease), various vascular spasms, certain forms of angina, transplant rejection, neointimal proliferation consecutive to an endothelial lesion).
  • N-hydroxyguanidines according to the invention are obtained by following the usual synthetic routes from o ⁇ co-diamined acids, protected with N ⁇ -Z derivatives (benzyloxycarbonyl). These starting compounds are commercial or prepared according to usual protocols in N ⁇ -Z derivatives.
  • the first stages (a, b) of the syntheses consist in protecting the acid and ⁇ -amine functions in the form of N ⁇ -Boc (tert-butyloxycarbonyl) derivatives and of tert-butyl esters.
  • the terminal amino functions are then selectively deprotected by catalytic hydrogenation and then transformed into cyanamides by the action of cyanogen bromide (steps c, d).
  • the addition of hydroxylamine hydrochloride on the cyanamides in anhydrous ethanol leads to the desired N-hydroxyguanidines in protected form as well as to the corresponding ureas which are separated by chromatography on silica (step e).
  • a last step (f) the N-hydroxyguanidines are deprotected by the action of HCl gas dissolved in anhydrous dioxane.
  • the hydrochlorides of N-hydroxyguanidines are filtered, washed with dry dioxane then with ether and dried under vacuum.
  • a (Boc) 2 ⁇ , dioxane / water, NaHC03, 3 days, room temperature; b: tert-Bu-Br, K2CO3, TEBAC, DMAC, 3-6h, 55 ° C; c: H2, Pd / C, MeOH, 3-6h, room temperature; d: BrCN, AcONa, MeOH, 2-6h, 0 ° C; e: NH2OH-HCI, anhydrous EtOH, 1-6h, reflux; f: HC1 4M in anhydrous dioxane, 3-12h, room temperature.
  • the L isomer of compound (I) is present in the form of a pharmaceutically acceptable ester, preferably in the form of a lower C1 to C 4 alkyl ester such as the methyl, ethyl ester. , propyl or butyl or in the form of the benzyl ester.
  • salts can be obtained in a conventional manner by reaction of the compound (I) with an acid and / or at least a suitable base.
  • the L isomer of compound (I) is present in the form of a pharmaceutically acceptable salt, preferably a hydrochloride, acetate, oxalate or a sulfate.
  • the invention is based in particular on the fact, not predictable from known data, that the length of the chain (m) which separates the amino acid function and the hydroxy-guanidine function not only modulates the power and the effectiveness of the effect on the vessel, but still directs it towards a vascular coat or another and modifies its characters which makes it possible to remedy the defects of known NO donors producing an untargeted release of NO.
  • rat thoracic aorta preparations (aorta rings) were pre-contracted with norepinephrine (NA) at 80% of its maximum effect, i.e. 0.1 ⁇ M for the aorta without functional endothelium and 0.3 ⁇ M for rings with endothelium.
  • NA norepinephrine
  • norepinephrine, arginine derivatives have been applied cumulatively at increasing successive concentrations.
  • N ⁇ - hydroxy-nor-L-arginine (nor-NOHA) and N ⁇ -hydroxy-dinor-L- arginine (dinor-NOHA) on the other hand have more powerful and more marked relaxing effects than that of N ⁇ -hydroxy-L-arginine (NOHA), the effect of the latter being appreciably unchanged from that previously demonstrated in the presence of endothelium.
  • the use according to the invention is characterized in that the production, from NOHA, of nitrogen monoxide (NO) in the form of NO + (nitrosonium ion), NO " (ion nitroxyle) or NO * (radical NO), of a nitric oxide precursor or a derivative resulting from the interaction of said nitric oxide with its biological targets takes place in the outer coats (weed) of blood vessels .
  • NO nitrogen monoxide
  • NO nitrogen monoxide
  • NO + nitrogen monoxide
  • NO * radical NO
  • NO nitrogen monoxide
  • NO + nitrogen ion
  • NO " nitrogenyl ion
  • NO ' radical NO
  • a nitric oxide precursor or a derivative resulting from the interaction of said nitric oxide with its biological targets then takes place in the median coat (media) of blood vessels.
  • N ⁇ -hydroxy-L-arginine and its higher homolog are substrates of NO-synthases (but the homo derivative is inactive on the aorta and the nor derivative, which is not substrate of NO- synthases is the most active).
  • two other arginase inhibitors produce only a very weak relaxing effect on the aorta deprived of endothelium, as shown in FIG.
  • the shortening of the chain shows a direct effect on the contraction of the smooth muscle cells of the media; this effect has the important characteristic of being largely, or even entirely, suppressed by the presence of a functional endothelium.
  • the therapeutic indications for these compounds will relate to the pathologies associated with insufficiency or endothelial damage (see below).
  • the biological activity of the NO produced in the vessels can be estimated indirectly by studying the increase in cyclic GMP content and the relaxing effect.
  • results presented in FIG. 3 show the effect on the cyclic GMP content of the rat thoracic aorta without functional endothelium of N ⁇ - hydroxy-L-arginine, which produces an increase in cyclic GMP content comparable to that produced by the presence of the endothelium (not shown).
  • N ffl- hydroxy-L-arginine and its nor derivative are inhibited by a NO sensor (PTIO, Figure 4) and by an inhibitor of l activation of soluble guanylyl cyclase (ODQ, FIGS. 5 and 6) but not by an inhibitor of NO-synthase (N ⁇ -nitro-L-arginine methyl ester, FIGS. 5 and 6).
  • rat aorta rings without endothelium were incubated with 300 ⁇ M of PTIO (2-phenyl-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-l-oxyl 3 -oxide ) during 30 minutes. After incubation, the vessels were contracted with 0.1 ⁇ M phenylephrine and an effect-concentration curve of NOHA or nor-NOHA was built. The results are the mean ⁇ the standard deviation from the mean of 6 or 7 experiments (*** p ⁇ 0.001 by comparison with the controls (analysis of variance)).
  • rat aorta rings without endothelium were precontracted with 0.1 ⁇ M of noradrenaline. Then 100 ⁇ M of NOHA were added, then the ability of the inhibitors to reverse relaxation was tested. The results are the mean ⁇ standard deviation from the mean of 6 to 20 experiments (*** p ⁇ 0.001 by comparison with the level of relaxation caused by NOHA - Student's t test for unpaired values).
  • the inhibitors used are an inhibitor of guanylyl cyclase activation, namely lH- [1,2,4] oxadiazole [4,3a] -quinoxaline-l-one (ODQ, 1 ⁇ M) and an inhibitor of NO- synthase, N ⁇ -nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME, 1 mM).
  • rat aorta rings without endothelium were incubated, either with ODQ (1 ⁇ M) for 30 minutes, or with L-NAME (300 ⁇ M) for 15 minutes. After the pre-incubation, the vessels were contracted with 0.1 ⁇ M noradrenaline and an effect-concentration curve of nor-NOHA was constructed.
  • the inhibitors used are, for FIG. 6a, the inhibitor of the activation of guanylyl cyclase, 1H- [1,2,4] oxadiazole [4,3a] -quinoxaline-1-one (ODQ, 1 ⁇ M) mentioned above and , for FIG.
  • the expected beneficial effect of the administration of these compounds will result from their ability to selectively deliver NO into one or other of the vascular coats, either as a replacement therapy in the event of endogenous NO insufficiency (particularly in endothelial damage), either to strengthen the protective power of NO on the cardiovascular system and irrigated tissue.
  • the indications will include those resulting either from targeting NO in the adventitia, or from substitution for insufficient endothelial production (see below).
  • FIG. 7 illustrates the inhibition by L-arginine but not by D-arginine of the relaxing effect of N ⁇ -hydroxy-L-arginine.
  • Endothelium-deprived rat aorta rings were pre-contracted with 0.1 ⁇ M noradrenaline (NA), and then exposed to increasing concentrations of NOHA alone, either in the absence or in the presence of L-Arg (1 mM) or D-Arg (1 mM).
  • N ⁇ -hydroxy-L-arginine is oxidized to NO in the weed and that NO can diffuse cells from the weed to the media.
  • NO formed in the vessel from N ⁇ -hydroxy-L-arginine will therefore act mainly on the cells of the two coats, adventitious and media.
  • N ⁇ -hydroxy-L-arginine arise from its ability to deliver NO in the weed with the consequences of a reduction in contraction and vascular spasms, a modulation of the activity of the sympathetic terminations making it possible to maintain a a certain degree of vasoconstriction in sepsis and acute hyperdynamic inflammatory states, an improvement in the blood supply to the large vessels by the vasa vasorum and the maintenance of the balance between apoptosis and migration and proliferation of adventitious cells.
  • Such effects can oppose the development of atherosclerosis following an alteration of the adventitia and the rupture of the atherosclerotic plaque.
  • neo-intima formation that is observed in the vessels transplanted or after endothelial injury. This phenomenon is a sign of vascular damage. It can reduce the lumen of the vessel, for example in restenosis after angioplasty.
  • the NO produced in the weed is capable of opposing the development of inflammation in various tissues, such as nervous tissue in particular. Therefore, the therapeutic indications of N ⁇ -hydroxy-L-arginine, due to its NO donor effect (or related compound) in the weed, include the prevention and treatment of vascular spasms and angina, hyperdynamic cardiovascular shock , atherosclerosis, restenosis after angioplasty, transplant rejection and neuro-inflammations.
  • rat aorta rings with (+ endo) or without (-endo) functional endothelium were incubated with 300 ⁇ M of L-NAME for 15 minutes. Then, they were pre-contracted by norepinephrine to 80% of its maximum effect (i.e. 0.1 ⁇ M for the aorta without endothelium and 0.3 ⁇ M for the rings with endothelium) and then nor-NOHA was added cumulatively.
  • the results indicated are the mean ⁇ standard deviation from the mean of the number n of experiments (n between 4 and 23; ** p ⁇ 0.01 by comparison with the controls (analysis of variance)).
  • the therapeutic indications which result therefrom are essentially the pathological states in which there is an insufficient production of NO by the endothelium or a reduction in its biological effects: atherosclerosis, vasculopathies secondary to diabetes, alterations in erectile function in men associated with endothelium dysfunction, pulmonary hypertension, vascular disorders of smokers, arterial hypertension, vascular spasms (particularly coronary), Alzheimer's disease.
  • NO deficiency endothelial is likely to cause a toxic reaction to the tissue which justifies replacement therapy.
  • the administration of N ⁇ -hydroxy-nor-L-arginine or its lower counterpart (dinor) represents a unique means of carrying out this replacement therapy in the only tissues where it is necessary.
  • NOHA may be expected to produce a relaxing effect independent of NO synthase in the blood vessels.
  • the present invention also provides for the use of the L isomer of a compound of formula (I) or of a derivative (salt, ester, etc.) for obtaining a medicament intended to treat or prevent pathologies resulting from an abnormal endogenous production of nitric oxide (NO) in the form of NO + (nitrosonium ion), NO " (nitroxyl ion) or NO * (radical NO), of a nitric oxide precursor or a derivative resulting from the interaction of said nitric oxide with its biological targets.
  • NO nitric oxide
  • the preceding use is characterized in that the production of nitrogen monoxide (NO) in the form of NO + (nitrosonium ion), NO " (nitroxyl ion) or NO" (radical NO), of a precursor of nitrogen monoxide or a derivative resulting from the interaction of said nitric oxide with its biological targets is insufficient.
  • NO nitrogen monoxide
  • the use of the L isomer of a compound of formula (I) or of a derivative (salt, ester, etc.) according to the invention can be used to obtain a medicament intended for preventing or to treat vascular diseases comprising an inflammatory component, in particular oxidative stress, systemic inflammations, particularly hyperdynamic cardiovascular shock states, neuro-inflammations and neurodegenerative diseases such as particularly Alzheimer's disease.
  • vascular diseases comprising an inflammatory component, in particular oxidative stress, systemic inflammations, particularly hyperdynamic cardiovascular shock states, neuro-inflammations and neurodegenerative diseases such as particularly Alzheimer's disease.
  • the use of the L isomer of a compound of formula (I)) or of a derivative (salt, ester, etc.) according to the invention can also serve to obtain a medicament intended to prevent or to treat vascular diseases having a proliferative component, to obtain a medicament intended to prevent or to treat cardiovascular diseases such as in particular atherosclerosis, angina, vascular complications of diabetes, vascular disorders of smokers, alteration of male erection, certain arterial hypertension and pulmonary hypertension. As explained above, it can also be used to obtain a medicament intended to prevent or treat transplant rejection.
  • the L isomer of a compound of formula (I) or a derivative (salt, ester, etc.) of such a compound according to the invention is used for obtaining a medicament intended for inhibit tumor angiogenesis and prevent or treat the correlative development of tumors
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition for use as a medicament, characterized in that it comprises, as active principle, the L-isomer of at least one compound of formula (I) or of a derivative (salt , ester ...) of such a compound according to the invention, combined, where appropriate, in said composition with at least one pharmaceutically acceptable excipient or vehicle.
  • the rings are then mounted in an insulated organ tank containing 10 ml of Krebs solution (composition in mmol / 1: NaCl 119; KCl 4,7; NaHCO s 25; MgS0 4 7; H 2 0 1,2; CaCl 2 1.25; KH 2 P0 4 1.2; glucose 11).
  • the physiological liquid is thermostatically controlled at 37 ° C. and oxygenated by a gaseous mixture containing 95% DO 2 and 5% CO 2 .
  • the aorta ring is subjected to an initial tension of 2 g for one hour, period of stabilization of the organ.
  • the contractile response of the aorta fragments is measured by an isometric force sensor, connected to a preamp with an 8-way interface system.
  • the preparations are then contracted by norepinephrine at a concentration of 1 ⁇ M. To ensure the presence of the endothelium, we checked their ability to relax after addition of acetylcholine (1 ⁇ M). Then several rinses are carried out.
  • the content of cyclic GMP in the tissues was determined by radioimmunoassay (Immunotech protocol, Marseille, France).
  • the L isomers of the compounds (I) of the present invention it also becomes possible to propose a method for the treatment or prevention of a disease in a mammal, in particular diseases requiring localized production, in situ and in vivo, of nitrogen monoxide (NO) in the form of NO + (nitrosonium ion), NO " (nitroxyl ion) or NO * (radical NO), of derivatives resulting from the interaction of nitrogen monoxide with its biological targets (particularly heme or non-heme iron and thiols) or of a nitric oxide precursor in the coats of blood vessels in man or in animals, in particular in the outer coats (weed) of blood vessels, in the middle tunics (media) of blood vessels.
  • NO nitrogen monoxide
  • its biological targets particularly heme or non-heme iron and thiols
  • a nitric oxide precursor in the coats of blood vessels in man or in animals, in particular in the outer coats (weed) of blood vessels, in the middle tunics
  • NO nitrogen monoxide
  • NO + nitrogen monoxide
  • NO * radical NO
  • vascular diseases in which the production of nitrogen monoxide (NO) in the form of NO + (nitrosonium ion), NO " (nitroxyl ion) or NO * (radical NO), of a nitric oxide precursor or of a derivative resulting from the interaction of said nitric oxide with its biological targets is abnormal (in particular insufficient), in particular the vascular diseases with an inflammatory component, in particular oxidative stress, systemic inflammations, particularly hyperdynamic cardiovascular shock states and / or neuro-inflammations, vascular diseases comprising a proliferative component, cardiovascular diseases, such as in particular atherosclerosis, angina, vascular complications of diabetes, certain arterial hypertension and pulmonary hypertension, transplant rejection, complications vascular disease of diabetes, insufficiency of erectile function in men (in particular that linked to dysfunction of the endothelium), Alzheimer's disease, vascular disorders of smokers, coronary spasms, diseases involving training neo-intima, especially in the case of restenosis after

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

Utilisation des isomères L de dérivés aminoacides de l'hydroxyguanidine pour la production de NO, compositions pharmaceutiques les contenant et utilisations pharmaceutiques La présente invention concerne le domaine de la chimie organique de synthèse appliquée au domaine pharmaceutique et a pour objet l'utilisation de l'isomère L d'un composé de formule générale (I) où m est un entier compris entre 0 et 4 (bornes incluses) pour la production localisée, in situ et in vivo dans les tuniques des vaisseaux sanguins chez l'homme ou chez l'animal, de monoxyde d'azote (NO) sous la forme de NO+ (ion nitrosonium), NO- (ion nitroxyle) ou NO* (NO radicalaire), d'un précurseur de monoxyde d'azote ou d'un dérivé résultant de l'interaction dudit monoxyde d'azote avec ses cibles biologiques. L'invention est particulièrement applicable pour l'obtention de nouveaux médicaments, notamment pour l'obtention d'un médicament destiné à prévenir ou à traiter une déficience, lésion ou absence de l'endothélium vasculaire.

Description

Utilisation des isomères L de dérivés aminoacides de l'hydroxyguanidine pour la production de NO, compositions pharmaceutiques les contenant et utilisations pharmaceutiques
La présente invention concerne le domaine de la chimie organique de synthèse appliquée au domaine pharmaceutique et a pour objet l'utilisation de dérivés aminoacides de l'hydroxyguanidine, de sels ou esters pharmaceutiquement acceptables de ces derniers pour une production localisée et sélective de monoxyde d'azote (NO) sous ses différentes formes (NO" radical libre, NO" ion nitroxyle ou NO+ ion nitrosonium) biologiquement actif dans l'une ou l'autre des différentes tuniques vasculaires ainsi que les différentes applications en résultant, notamment dans la prévention et/ou le traitement de maladies cardio-vasculaires et la prévention du rejet des greffes.
Il est bien établi que le monoxyde d'azote (NO) sous l'une ou l'autre de ses différentes formes précitées joue dans l'organisme un rôle de messager ubiquitaire. Ce rôle est particulièrement important dans le système cardio-vasculaire, où NO régule l'hémodynamique et l'irrigation des tissus (par ses effets sur les muscles vasculaires et cardiaques), l'hémostase (par ses effets sur les plaquettes sanguines) et l'adaptation à court et à long terme du système cardio-vasculaire aux variations de l'environnement (comme l'adaptation à l'effort) et dans différents états pathologiques (comme par exemple l'ischémie ou l'hypoxie) en régulant notamment les phénomènes de prolifération et de migration des cellules vasculaires et cardiaques.
Une déficience en NO, portant soit sur sa production dans les tissus, soit sur ses effets biologiques est impliquée dans la physio- pathologie d'affections cardio-vasculaires majeures comme l'athérosclérose, divers types d'hypertensions artérielles, les hypertensions pulmonaires, les spasmes vasculaires (notamment coronariens), les troubles vasculaires des fumeurs, les vasculopathies consécutives au diabète ou le rejet de greffe, notamment. Une thérapeutique substitutive visant à compenser le défaut de NO dans ces pathologies représente donc un objectif thérapeutique majeur dans le domaine cardio-vasculaire.
Dans l'organisme, le NO est produit par des enzymes appelées NO-synthases qui sont spécifiquement localisées dans certaines cellules et dont l'activité est modulée localement par des signaux endogènes chimiques ou mécaniques. Il en résulte une localisation très précise dans l'espace des sites de production et d'action de NO en réponse à ces signaux. Ainsi dans les vaisseaux et dans le cœur, le NO physiologiquement produit par l'endothélium, qui est une couche monocellulaire tapissant l'ensemble de la cavité cardio-vasculaire, est libéré dans le tissu où il agit sur d'autres cellules par un mécanisme paracrine et dans la circulation où il peut être transporté à distance sous différentes formes.
Dans les vaisseaux, le NO est encore produit par certaines terminaisons nerveuses dites "nitrergiques", par exemple celles du corps caverneux, et par les cellules endothéliales des petits vaisseaux qui nourrissent les gros vaisseaux ("vasa vasorum"). Les terminaisons nerveuses nitrergiques et les vasa vasorum sont situés dans la tunique externe des vaisseaux ou adventice, qui est un tissu conjonctif longtemps considéré comme n'ayant qu'un rôle de structure conférant une certaine rigidité au vaisseau. La tunique médiane des vaisseaux, qui contient les cellules musculaires lisses responsables de la contraction vasculaire et donc de la régulation de leur calibre, produit normalement peu de NO, mais le fonctionnement des cellules musculaires lisses y est régulé par le NO libéré de l'endothélium ou de l'adventice. Dans le cœur, le NO est produit non seulement par l'endothélium qui tapisse les cavités, mais encore par l'endothélium des vaisseaux coronaires qui irriguent le cœur et par les cardiomyocytes eux-mêmes. Dans le système nerveux central, le NO d'origine neuronale ou extra-neuronale agit non seulement sur la transmission synaptique mais aussi sur l'irrigation sanguine. La localisation des NO-synthases dans les vaisseaux, dans le cœur et dans le système nerveux central permet une régulation spatiale précise de la concentration de NO dans les différentes parties du tissu.
Cette régulation peut être perturbée voire être mise totalement hors service lors d'agressions des tissus par des signaux inflammatoires. Ceux-ci peuvent en effet induire l'expression dans pratiquement toutes les cellules d'une NO-synthase inductible capable de produire des quantités importantes de NO qui inondent les tissus et sont souvent associées à la production d'ions superoxydes et d'autres espèces radicalaires néfastes. A son début, ce phénomène peut constituer une réaction d'adaptation permettant de lutter contre l'agression (vasodilatation intense, inhibition de la migration de cellules phagocytaires, effets cytotoxiques sur des agents pathogènes). Rapidement, il peut néanmoins devenir délétère dans les tissus comme le cœur ou le système nerveux central dont il est le siège, par suite de phénomènes cytotoxiques.
L'un des caractères de l'induction de la NO-synthase inductible et des phénomènes délétères qui s'en suivent est qu'ils sont souvent associés à une déficience de production endothéliale de NO, par exemple dans l'athérosclérose, les hypertensions pulmonaires, les ischémies cardiaques, certaines maladies neuro-inflammatoires ou neuro-dégénératives comme la maladie d'Alzheimer, etc. L'expression de la NO-synthase inductible peut être inhibée par l'administration d'un donneur d'NO.
Un des objets de la présente invention est donc l'obtention de médicaments permettant de délivrer le NO (sous l'une ou l'autre de ses formes) ou un composé apparenté sélectivement dans l'une ou l'autre des différentes tuniques vasculaires, de façon à obtenir les effets protecteurs du NO sur le système cardio-vasculaire et sur les tissus qu'il irrigue, comme le système nerveux central, ou à compenser une déficience du NO endogène tout en évitant les effets indésirables ou délétères qui pourraient découler d'une inondation générale des tissus par ledit NO ou ses formes voisines.
L'administration d'un donneur de NO (ou de NO gaz par inhalation) est une méthode thérapeutique connue, notamment pour renforcer le rôle protecteur de NO dans le système cardio-vasculaire ou les poumons, particulièrement en cas de déficience de production de NO endogène par l'endothélium. Des effets bénéfiques peuvent particulièrement espérés dans l'athérosclérose, les complications vasculaires du diabète, l'insuffisance de la fonction érectile masculine, les troubles vasculaires des fumeurs, la resténose coronarienne après angioplastie (pour limiter la prolifération néo-intimale), pour la protection du cœur ou du système nerveux central contre les troubles liés à l'ischémie, à l'hypoxie et dans la maladie d'Alzheimer, pour inhiber l'angiogénèse tumorale, pour améliorer le fonctionnement du greffon, et pour prévenir l'athérosclérose après transplantation cardiaque.
Pour l'instant, les donneurs de NO ont cependant encore une utilisation relativement limitée en thérapeutique. Les donneurs actuellement connus sont la trinitrine et d'autres esters nitrés organiques, le nitroprussiate, les sydnonimines et le NO gazeux inhalé.
La trinitrine et ses analogues sont utilisés dans le traitement de l'angor (angine de poitrine). Pour des raisons encore inconnues, leurs effets s'exercent principalement sur le système cardio-vasculaire, particulièrement au niveau des veines. Cependant la marge est relativement étroite entre la dose de trinitrine efficace dans la crise d'angor et la dose susceptible de produire une chute brutale de pression artérielle et un collapsus vasculaire. De plus, une tolérance s'établit rapidement. L'administration chronique d'esters nitrés organiques est préconisée pour prévenir la survenue de certains types de crise d'angor, mais leur efficacité thérapeutique n'est pas démontrée dans ces conditions.
Le nitroprussiate est un puissant vasodilatateur qui a parfois été utilisé pour traiter certaines très fortes hypertensions artérielles, en situation d'urgence. Il produit NO (ou l'ion nitrosonium NO ) dans les tissus par plusieurs mécanismes encore mal connus qui aboutissent à la formation de ferrocyanure, lequel n'est pas dépourvu d'effet biologique, voire à la fomation de cyanure. La possibilité de production de cyanure dans certaines conditions limite sérieusement l'utilisation du nitroprussiate.
Les sydnonimines, molsidomine et linsidomine sont spontanément décomposées dans l'organisme en libérant ainsi NO et un ion superoxyde 02 Λ susceptible de provoquer un effet toxique dans certaines situations pathologiques. Le NO gazeux administré par inhalation produit un effet vasodilateur local dans le poumon. Il est rapidement capté par le sang. Une partie est oxydée en nitrate, mais une autre partie semble transportée à distance sous forme indéterminée pour l'instant. Le NO ainsi transporté peut être responsable d'effets à distance ou prolongés dans divers tissus, notamment des effets diurétique et anti-agrégant plaquettaire. Ces effets à distance sont encore mal connus. De plus, l'administration de NO par inhalation nécessite des installations particulières, de sorte qu'elle ne peut être envisagée, dans la plupart de ses indications thérapeutiques, en dehors du milieu hospitalier. D'autres donneurs de NO, qui ne sont pas présentement utilisés en thérapeutique, sont actuellement à l'étude. On peut citer des S- nitrosothiols, qui peuvent soit libérer le radical libre NO, soit S-nitrosyler des résidus de cystéine sur les protéines. Cependant, les mécanismes complexes de la décomposition des S-nitrosothiols, variables suivant les propriétés physico- chimiques des milieux, rendent imprévisibles leurs propriétés pharmacologiques. Par ailleurs, on connaît différentes molécules d'intérêt thérapeutique sur lesquelles on a branché des groupements fonctionnels donneurs de NO (soit esters nitrés, soit S-nitrosothiols) afin de mettre à profit les propriétés complémentaires de ces molécules et de NO. On peut citer, par exemple, des dérivés de l'aspirine ne produisant pas de saignement gastrique ou un dérivé du captopril (inhibiteur de l'enzyme de conversion de l'angiotensine) donneur de NO. Toutefois, ces composés ne délivrent pas seulement NO dans l'organisme, mais encore et surtout l'autre composé actif associé dont les effets indésirables sont supposés être réduits par la présence du NO. Les propriétés pharmacologiques de telles associations et leur utilité thérapeutique reposent donc en très grande partie sur les effets de ce dernier composé et non sur ceux du NO seul.
Enfin des composés qui délivrent spontanément NO par voie non-enzymatique, tels que des adduits de NO avec des agents nucléophiles, sont couramment utilisés en expérimentation animale. Leurs effets dépendent de la rapidité de la libération de NO, mais ces composés ne présentent pas de sélectivité tissulaire.
Il ressort de ce qui est exposé plus haut qu'aucun des donneurs de NO actuellement disponibles n'est capable de libérer le NO (ou un composé apparenté) sélectivement pour obtenir des effets protecteurs vasculaires ou pour rétablir à un niveau physiologique la production de NO lorsqu'elle est déficiente dans les vaisseaux, sans entraîner les effets indésirables ou toxiques liés à une libération non ciblée de NO.
La présente invention a pour but de pallier ces inconvénients. A cet effet, elle a pour objet l'utilisation de l'isomère L d'un composé de formule générale (I) :
Figure imgf000007_0001
où m est un entier compris entre 0 et 4 (bornes incluses) pour la production localisée, in situ et in vivo dans les tuniques des vaisseaux sanguins chez l'homme ou chez l'animal, de monoxyde d'azote (NO) sous la forme de NO+ (ion nitrosonium), NO" (ion nitroxyle) ou NO* (NO radicalaire), d'un précurseur de monoxyde d'azote ou d'un dérivé résultant de l'interaction dudit monoxyde d'azote avec ses cibles biologiques. Les dérivés résultant de l'interaction du monoxyde d'azote
(sous l'une quelconque de ses formes précitées) avec ses cibles biologiques incluent notamment les dérivés formés avec les thiols (dérivés S-nitrosylés), et les dérivés formés avec les métaux de transition, en particulier avec le fer héminique ou non-héminique.
Par précurseur de monoxyde d'azote on entend toute forme chimique ou physique de monoxyde d'azote susceptible de conduire à la formation de NO biologiquement actif.
La présente invention a également pour objet une composition pharmaceutique pour utilisation comme médicament, caractérisée en ce qu'elle comprend à titre de principe actif, l'isomère L d'au moins un composé de formule (I) selon l'invention, associé, le cas échéant, dans ladite composition avec au moins un excipient ou véhicule pharmaceutiquement acceptable. Enfin, elle a encore pour objet un composé chimique en tant que tel, caractérisé en ce qu'il s'agit de l'isomère L du composé de formule (I) dans laquelle m=0.
L'invention sera mieux comprise, grâce à la description ci- après, qui se rapporte à un mode de réalisation préféré, donné à titre d'exemple non limitatif, et expliqué avec référence aux dessins schématiques annexés, dans lesquels : la figure 1 regroupe trois diagrammes illustrant les effets relaxants de la Nω-hydroxy-L-arginine (NOHA, m=3), de ses homologues inférieurs (nor- et dinor-) et supérieur (homo-) sur l'aorte entière de rat avec endothélium (figure la), sur l'aorte de rat sans endothélium fonctionnel (figure lb) et sur une aorte de rat sans adventice et sans endothélium fonctionnel (figure le), la figure 2 représente un diagramme illustrant les effets de deux inhibiteurs de l'arginase sur la contraction d'anneaux d'aorte de rat privés d' endothélium fonctionnel comparés à celui de la nor-NOHA (m=2), la figure 3 représente un diagramme illustrant les effets de la NOHA sur la teneur en GMP cyclique de l'aorte thoracique de rat, la figure 4 regroupe deux diagrammes illustrant l'influence d'un capteur de NO sur l'effet relaxant de la Nω-hydroxy-L-arginine (NOHA) à la figure 4a et de la Nω-hydroxy-nor-L-arginine (nor-NOHA) à la figure 4b, sur l'aorte de rat privée d' endothélium, la figure 5 représente un diagramme illustrant l'influence d'un inhibiteur de l'activation de guanylyl cyclase (ODQ) et d'un inhibiteur de NO-synthase (L-NAME) sur l'effet relaxant de la Nω-hydroxy-L-arginine (NOHA), la figure 6 regroupe deux diagrammes illustrant l'influence d'un inhibiteur de l'activation de guanylyl cyclase (ODQ - figure 6a) et d'un inhibiteur de NO-synthase (L-NAME - figure 6b) sur l'effet relaxant de la Nω-hydroxy-nor-L-arginine (nor-NOHA), la figure 7 regroupe deux diagrammes illustrant l'interaction de la Nω-hydroxy-L-arginine (NOHA), sur la figure 7a, et de la Nω-hydroxy- nor-L-arginine (nor-NOHA), sur la figure 7b, avec la L-arginine (L-Arg), la figure 8 regroupe trois diagrammes illustrant l'influence de l'adventice sur la teneur en GMP cyclique de la média dans les préparations exposées à la Nω-hydroxy-L-arginine (NOHA) (média seule - figure 8a), en présence d'adventice éliminée par dissection avant le dosage (figure 8b) et en présence d'adventice re-associée à la média pendant l'incubation avec la NOHA, et la figure 9 représente un diagramme illustrant l'influence d'un inhibiteur de NO-synthase sur l'inhibition par l'endothélium de l'effet relaxant de la Nω-hydroxy-nor-L-arginine (nor-NOHA) sur l'aorte isolée de rat.
Ainsi, la présente invention a donc pour objet l'utilisation de l'isomère L d'un composé de formule générale (I) :
Figure imgf000009_0001
où m est un entier compris entre 0 et 4 (bornes incluses) pour la production localisée, in situ et in vivo dans les tuniques des vaisseaux sanguins chez l'homme ou chez l'animal, de monoxyde d'azote (NO) sous la forme de NO+ (ion nitrosonium), NO" (ion nitroxyle) ou NO* (NO radicalaire), d'un précurseur de monoxyde d'azote ou d'un dérivé résultant de l'interaction dudit monoxyde d'azote avec ses cibles biologiques. Pour remédier aux inconvénients des donneurs de NO actuellement disponibles, la présente invention propose donc d'utiliser des aminoacides porteurs d'une fonction hydroxyguanidine.
L'invention porte ainsi sur l'utilisation d'acides aminés porteurs d'un reste -NH-C(NH2)=NOH, qui sont des homologues Nω-hydroxylés de la L-arginine pour le traitement des maladies cardio-vasculaires du fait de leur propriété de délivrer NO en quantité modérée et de façon sélective soit dans la tunique adventice, soit dans la tunique média des vaisseaux, dans ce dernier cas de manière inversement liée à la production de NO par l'endothélium, et de moduler ainsi leur fonctionnement.
En effet, il a été trouvé de manière surprenante et inattendue, que suivant la longueur de la chaîne (CH2)m certains de ces composés agissent spécifiquement pour délivrer NO (sous l'une ou l'autre de ses formes ou celle d'un composé apparenté) soit par l'intermédiaire de l'adventice soit directement dans la média, mais dans ce dernier cas uniquement lorsque la production endothéliale de NO est inhibée ou absente.
Il en découle des indications thérapeutiques consécutives soit aux effets sur l'adventice (athérosclérose, proliférations néo-intimales après lésion vasculaire, certaines formes d'angor, rejets de greffe) soit à la substitution de l'insuffisance endothéliale (hypertensions artérielles, hypertensions pulmonaires, vasculopathies diabétiques, altérations de l'érection masculine, état neuro-dégénératifs (notamment la maladie d'Alzheimer), spasmes vasculaires divers, certaines formes d'angor, rejets de greffe, proliférations néo-intimales consécutives à une lésion endothéliale).
Les N-hydroxyguanidines selon l'invention sont obtenues en suivant des voies de synthèse usuelles à partir d'acides oζco-diaminés, protégés en dérivés Nω-Z (benzyloxycarbonyle). Ces composés de départ sont commerciaux ou préparés selon des protocoles usuels en dérivés Nω-Z.
Les premières étapes (a, b) des synthèses consistent à protéger les fonctions acide et α-amine sous forme de dérivés Nα-Boc (tert- butyloxycarbonyle) et d'esters de tert-butyle. Les fonctions aminés terminales sont ensuite déprotégées sélectivement par hydrogénation catalytique puis transformées en cyanamides par action du bromure de cyanogène (étapes c, d). L'addition du chlorhydrate d'hydroxylamine sur les cyanamides dans l'éthanol anhydre conduit aux N-hydroxyguanidines recherchées sous forme protégées ainsi qu'aux urées correspondantes qui sont séparées par chromatographie sur silice (étape e). Dans une dernière étape (f), les N-hydroxyguanidines sont déprotégées par l'action d'HCl gazeux dissous dans le dioxane anhydre. Les chlorhydrates des N-hydroxyguanidines sont filtrés, lavés au dioxane sec puis à l'ether et séchés sous vide.
Les étapes de synthèse précitées peuvent s'écrire comme suit :
Figure imgf000011_0001
Figure imgf000011_0002
m = 1, 2, 3, 4
a: (Boc)2θ, dioxane/eau, NaHC03, 3 jours, température ambiante ; b: tert-Bu-Br, K2CO3, TEBAC, DMAC, 3-6h, 55°C; c: H2, Pd/C, MeOH, 3-6h, température ambiante ; d: BrCN, AcONa, MeOH, 2-6h, 0°C; e: NH2OH-HCI, EtOH anhydre, l-6h, reflux; f: HC1 4M dans dioxane anhydre, 3-12h, température ambiante.
Selon une première caractéristique l'isomère L du composé (I) est présent sous la forme d'un ester pharmaceutiquement acceptable, préférentiellement sous la forme d'un ester d'alkyle inférieur en Ci à C4 tel que l'ester méthylique, éthylique, propylique ou butylique ou sous la forme de F ester benzylique.
Compte tenu de la présence simultanée, sur la molécule de formule (I), d'une fonction carboxylique et de deux fonctions aminé, des sels peuvent être obtenus de manière classique par réaction du composé (I) avec un acide et/ou au moins une base adaptés. De manière avantageuse, l'isomère L du composé (I) est présent sous la forme d'un sel pharmaceutiquement acceptable, préférentiellement un chlorhydrate, acétate, oxalate ou un sulfate. La Nω-hydroxy-L-arginine (NOHA, m = 3) elle-même est un composé endogène. Dans l'organisme, elle est produite par les NO- synthases (comme intermédiaire dans la réaction conduisant à la formation de NO à partir de L-arginine) et est capable de relâcher les vaisseaux. Sa concentration circulante est basse chez les patients à risque cardio- vasculaire, ce qui peut être interprété comme un signe de dysfonctionnement endothélial.
Par ailleurs, la Nω-hydroxy-L-arginine (NOHA, m = 3) entre en compétition de façon stéréo-spécifique avec la L-arginine (le précurseur de NO endogène) au niveau de son transporteur membranaire et de divers systèmes enzymatiques impliqués dans la production de NO (NO- synthases) ou la disponibilité de l'arginine pour cette synthèse (arginase).
Parmi ses homologues supérieurs ou inférieurs, l'homologue homo (m=4) est également substrat de la NO-synthase, tandis que le composé résultant du racourcissement de la chaîne (homologue nor, m=2) n'est pratiquement pas substrat de la NO-synthase, mais est un très puissant inhibiteur d'arginase.
L'invention repose notamment sur le fait, non prédictible à partir des données connues, que la longueur de la chaîne (m) qui sépare la fonction aminoacide et la fonction hydroxy-guanidine module non seulement la puissance et l'efficacité de l'effet sur le vaisseau, mais oriente encore celui-ci vers une tunique vasculaire ou une autre et modifie ses caractères ce qui permet de remédier aux défauts des donneurs de NO connus produisant une libération non ciblée de NO. Selon une autre caractéristique, l'isomère L du composé (I) est préférentiellement la Nω-hydroxy-L-arginine ou NOHA ^=3).
L'étude de l'effet relaxant de la Nω-hydroxy-L-arginine (NOHA, m = 3) ef de ses homologues sur les vaisseaux a en outre révélé le rôle inattendu des différentes tuniques vasculaires. Dans les expériences illustrées à la Figure 1, il a été étudié les effets relaxants de la Nω-hydroxy- L-arginine (NOHA, m=3), de ses homologues inférieurs (nor- et dinor-) et supérieur (homo-) sur l'aorte entière de rat avec endothélium (figure la), sur l'aorte de rat sans endothélium fonctionnel (figure lb) et sur une aorte de rat sans adventice et sans endothélium fonctionnel (figure le). A cette fin, des préparations d'aorte thoracique de rat (anneaux d'aorte) ont été pré-contractées par de la noradrénaline (NA) à 80 % de son effet maximal, soit 0,1 μM pour l'aorte sans endothélium fonctionnel et 0,3 μM pour les anneaux avec endothélium. Suite à l'ajout de cet agoniste endogène, la noradrénaline, des dérivés de l'arginine ont été appliqués de façon cumulative à des concentrations successives croissantes.
Les résultats indiqués sont la moyenne ± l'écart-type à la moyenne du nombre n d'expériences compris, ici, entre 2 et 23.
On observe d'après la figure la que lorsque l'anneau contient les trois tuniques vasculaires (endothélium, média et adventice), seule la Nω-hydroxy-L-arginine (NOHA) produit un effet relaxant significatif, la Nω-hydroxy-nor-L-arginine (nor-NOHA) et la Nω-hydroxy-homo-L- arginine (homo-NOHA) étant relativement peu actives dans ces conditions. Comme on peut le constater d'après les courbes de la figure lb, si l'endothélium est enlevé (il reste alors la média et l'adventice), la Nω-hydroxy-nor-L-arginine (nor-NOHA) et la Nω-hydroxy-dinor-L- arginine (dinor-NOHA) ont par contre des effets relaxants plus puissants et plus marqués que celui de Nω-hydroxy-L-arginine (NOHA), l'effet de ce dernier étant sensiblement inchangé par rapport à celui qui a été précédemment mis en évidence en présence d'endothélium.
Enfin, si on enlève encore l'adventice (il ne reste alors que la média), l'effet de la Nω-hydroxy-L-arginine (NOHA) disparaît presque complètement, tandis que celui de la Nω-hydroxy-nor-L-arginine reste quasi inchangé (cf. figure le).
Ainsi, de manière avantageuse, l'utilisation selon l'invention est caractérisée en ce que la production, à partir de la NOHA, de monoxyde d'azote (NO) sous la forme de NO+ (ion nitrosonium), NO" (ion nitroxyle) ou NO* (NO radicalaire), d'un précurseur de monoxyde d'azote ou d'un dérivé résultant de l'interaction dμdit monoxyde d'azote avec ses cibles biologiques a lieu dans les tuniques externes (adventice) des vaisseaux sanguins.
L'utilisation pour la production localisée, in situ et in vivo dans les tuniques des vaisseaux sanguins chez l'homme ou chez l'animal, de monoxyde d'azote (NO) sous la forme de NO+ (ion nitrosonium), NO" (ion nitroxyle) ou NO* (NO radicalaire), d'un précurseur de monoxyde d'azote ou d'un dérivé résultant de l'interaction dudit monoxyde d'azote avec ses cibles biologiques est caractérisée en ce que l'isomère L du composé (I) est préférentiellement la Nω-hydroxy-nor-L-arginine (nor-NOHA, m=2) ou la Nω-hydroxy-dinor-L-arginine (dinor-NOHA, m=l). Conformément à l'invention et comme cela va être décrit plus en détail plus loin, la production de monoxyde d'azote (NO) sous la forme de NO+ (ion nitrosonium), NO" (ion nitroxyle) ou NO' (NO radicalaire), d'un précurseur de monoxyde d'azote ou d'un dérivé résultant de l'interaction dudit monoxyde d'azote avec ses cibles biologiques a alors lieu dans les tuniques médianes (média) des vaisseaux sanguins.
L'utilisation est encore caractérisée en ce que l'isomère L du composé (I) est la Nω-hydroxy-nor-L-arginine (nor-NOHA, m=2) pour une production de monoxyde d'azote (NO) sous la forme de NO+ (ion nitrosonium), NO" (ion nitroxyle) ou NO* (NO radicalaire), d'un précurseur de monoxyde d'azote ou d'un dérivé résultant de l'interaction dudit monoxyde d'azote avec ses cibles biologiques dans les tuniques médianes (média) des vaisseaux sanguins lors d'une lésion, d'une absence ou d'un dysfonctionnement de l'endothélium vasculaire. Aucun des donneurs de NO actuellement connus ne possède les propriétés des amino-acides dérivés de l'hydroxyguanidine décrites ci- dessus. L'hydroxyguanidine elle-même est dépourvue d'effet relaxant.
Il résulte de ce qui précède que la longueur de la chaîne oriente l'action du composé vers un type de cellule plutôt qu'un autre. Aucune relation n'est observée entre les propriétés connues des homologues Nω-hydroxylés de la L-arginine comme substrats des NO- synthases ou inhibiteurs d'arginase et les effets observés.
En effet, la Nω-hydroxy-L-arginine et son homologue supérieur (homo) sont substrats des NO-synthases (mais le dérivé homo est inactif sur l'aorte et le dérivé nor, qui n'est pas substrat des NO-synthases est le plus actif). De plus, deux autres inhibiteurs d'arginase ne produisent qu'un effet relaxant très faible sur l'aorte privée d'endothélium, ainsi que cela est montré à la figure 2 où les effets sur la contraction d'anneaux d'aorte de rat privés d'endothélium fonctionnel de deux inhibiteurs de l'arginase, à savoir la L-valine et l'acide 2(S)-amino-6-boronohexanoïque (ABH) sont comparés à celui de la nor-NOHA (moyenne de n expériences ± l'écart-type à la moyenne).
Par conséquent, l'allongement ou le raccourcissement de la chaîne carbonée de l'acide aminé Nω-hydroxylé a une influence considérable, totalement imprévisible au vu des connaissances actuelles dans ce domaine, sur l'effet sur le vaisseau. Les propriétés nouvelles mises en évidence sont notamment les suivantes : - l'effet de la Nω-hydroxy-L-arginine dépend de la présence de l'adventice, le composé n'ayant que peu ou pas d'effet direct sur les cellules musculaires lisses de la média (siège de la contraction) ; ses indications thérapeutiques porteront sur les pathologies où l'adventice est impliquée (voir ci-dessous),
- l'allongement de la chaîne (dérivé homo, m=4) supprime tout effet relaxant,
- le raccourcissement de la chaîne (dérivés nor, m=2 et dinor, m=l) fait apparaître un effet direct sur la contraction des cellules musculaires lisses de la média ; cet effet possède la caractéristique importante d'être en grande partie, voire entièrement, supprimé par la présence d'un endothélium fonctionnel. Les indications thérapeutiques de ces composés porteront sur les pathologies associées à une insuffisance ou une lésion endothéliale (voir ci-dessous). L'activité biologique du NO produit dans les vaisseaux peut être estimée indirectement en étudiant l'augmentation de teneur en GMP cyclique et l'effet relaxant.
Les résultats présentés à la figure 3 montrent l'effet sur la teneur en GMP cyclique de l'aorte thoracique de rat sans endothélium fonctionnel de la Nω-hydroxy-L-arginine, qui produit une augmentation de teneur en GMP cyclique comparable à celle que produit la présence de l'endothélium (non montrée).
Pour cette expérience, des anneaux d'aorte sans endothélium ont été exposés à la NOHA (100 μM) puis rapidement congelés jusqu'au dosage. Les résultats sont la moyenne ± F écart-type à la moyenne de
10 expériences (** p<0,01 par comparaison avec les contrôles (test t de
Student pour valeurs non appariées).
Ainsi que le montrent les figures 4, 5 et 6, les effets relaxants de la Nffl-hydroxy-L-arginine et de son dérivé nor sont inhibés par un capteur de NO (le PTIO, figure 4) et par un inhibiteur de l'activation de la guanylyl-cyclase soluble (ODQ, figures 5 et 6) mais non par un inhibiteur de NO-synthase (Nω-nitro-L-arginine méthyl ester, figures 5 et 6).
En ce qui concerne l'expérience de la figure 4, des anneaux d'aorte de rat sans endothélium ont été incubés avec 300 μM de PTIO (2- phényl-4,4,5,5-tétraméthylimidazoline-l-oxyl 3 -oxyde) pendant 30 minutes. Après l'incubation, les vaisseaux ont été contractés avec 0,1 μM de phényléphrine et une courbe effet-concentration de la NOHA ou de la nor-NOHA a été construite. Les résultats sont la moyenne ± l'écart-type à la moyenne de 6 ou 7 expériences (*** p<0,001 par comparaison avec les contrôles (analyse de variance)).
Pour l'expérience de la figure 5, des anneaux d'aorte de rat sans endothélium ont été précontractés par 0,1 μM de noradrénaline. Ensuite 100 μM de NOHA ont été ajoutés, puis la capacité des inhibiteurs à inverser la relaxation a été testée. Les résultats sont la moyenne ± Fécart-type à la moyenne de 6 à 20 expériences (*** p<0,001 par comparaison avec le niveau de relaxation provoqué par la NOHA - test t de Student pour valeurs non appariées). Les inhibiteurs utilisés sont un inhibiteur de l'activation de guanylyl cyclase, à savoir le lH-[l,2,4]oxadiazole[4,3a]-quinoxaline-l-one (ODQ, 1 μM) et un inhibiteur de NO-synthase, le Nω-nitro-L-arginine méthyl ester (L-NAME, 1 mM).
Pour ce qui est des expériences de la figure 6, des anneaux d'aorte de rat sans endothélium ont été incubés, soit avec ODQ (1 μM) pendant 30 minutes, soit avec L-NAME (300 μM) pendant 15 minutes. Après la pré-incubation, les vaisseaux ont été contractés avec 0,1 μM de noradrénaline et une courbe effet-concentration de la nor-NOHA a été construite. Les inhibiteurs utilisés sont, pour la figure 6a, l'inhibiteur de l'activation de guanylyl cyclase, lH-[l,2,4]oxadiazole[4,3a]-quinoxaline-l- one (ODQ, 1 μM) précité et, pour la figure 6b, l'inhibiteur de NO-synthase, le Nω-nitro-L-arginine méthyl ester (L-NAME, 300 μM) également déjà évoqué. Les résultats sont la moyenne ± Fécart-type à la moyenne de 4 à 23 expériences (*** p<0,001 par comparaison avec l'effet de la NOHA seule - analyse de variance).
L'ensemble de ces expériences démontre que les effets relaxants sur l'aorte de rat de la Nω-hydroxy-L-arginine et de son homologue la Nω-hydroxy-nor-L-arginine impliquent l'activation de la guanylyl cyclase par le NO, entraînant une augmentation de la teneur en GMP cyclique et le relâchement des cellules musculaires lisses vasculaires. Elles montrent, en outre, que les deux composés sont des donneurs de NO agissant par un mécanisme indépendant de la NO-synthase.
Par conséquent, l'effet bénéfique attendu de l'administration de ces composés découlera de leur aptitude à délivrer sélectivement NO dans l'une ou l'autre des tuniques vasculaires, soit comme thérapeutique substitutive en cas d'insuffisance de NO endogène (particulièrement en cas d'altération endothéliale), soit pour renforcer le pouvoir protecteur de NO sur le système cardio-vasculaire et les tissus irrigés. En plus des indications thérapeutiques classiques des donneurs de NO ou de NO dans l'angor et dans les hypertensions pulmonaires, les indications comprendront celles qui découlent soit du ciblage de NO dans l'adventice, soit de la substitution à une production endothéliale insuffisante (voir ci-dessous).
La figure 7 illustre l'inhibition par la L-arginine mais non par la D-arginine de l'effet relaxant de la Nω-hydroxy-L-arginine. Des anneaux d'aorte de rat privés d'endothélium ont été précontractés avec 0,1 μM de noradrénaline (NA), puis ils ont été exposés à des concentrations croissantes de la NOHA seule, soit en l'absence, soit en la présence de la L- Arg (1 mM) ou de la D-Arg (1 mM). Les résultats sont la moyenne ± Fécart-type à la moyenne de 7 expériences. (* p<0,05 analyse de variance ; NS = non significatif).
Ces observations démontrent la stéréospécificité de l'effet inhibiteur de la L-arginine sur la relaxation provoquée par la Nω-hydroxy- L-arginine. Dans ces expériences, une concentration de L-arginine (1 mM) dix fois supérieure aux concentrations physiologiques (de l'ordre de 100 μM) a été utilisée pour inhiber l'effet de la Nω-hydroxy-L-arginine, mais l'effet relaxant de cette dernière a pu être partiellement restauré en augmentant sa concentration jusqu'à 100 μM. Malgré l'effet antagoniste de la L-arginine à très forte concentration, l'effet de la Nω-hydroxy-L-arginine n'est pas inhibé en présence d'une concentration physiologique de L- arginine (non montré), ce qui lui permettra d'exercer ses effets dans l'organisme. A la différence de ce qui a été observé avec la Nω-hydroxy-L- arginine (figure 7a), l'effet de la Nffl -hydroxy-nor-L-arginine n'est pas du tout inhibé en présence de L-arginine, même à concentration élevée (1 mM, figure 7b). Il s'agit d'une différence importante entre les deux composés à mettre en relation avec le fait qu'ils n'agissent pas sur les mêmes cellules et le fait que les voies qui conduisent à la formation de NO ne sont pas identiques. Cette différence due au raccourcissement de la chaîne carbonée de l'acide aminé dans le cas du dérivé nor était totalement imprévisible dans l'état actuel des connaissances. La conséquence est que l'effet de la Nω-hydroxy-nor-L-argihine sera indépendant des variations physiologiques ou pathologiques de la concentration en L-arginine.
Ainsi qu'il a été montré plus haut (figure 1), la présence de l'adventice est indispensable ou quasi indispensable à l'effet sur l'aorte de la Nω-hydroxy-L-arginine, mais non à celui de ses homologues inférieurs. Les résultats contenus dans la figure 8 montrent que la présence de l'adventice est également nécessaire à l'augmentation de la teneur en GMP cyclique dans la média. Dans l'expérience de la figure 8, la média a été exposée à la
NOHA (100 μM), soit seule (figure 8a), soit en présence d'adventice éliminée par dissection avant le dosage (figure 8b), soit en présence d'adventice séparée avant l'expérience puis re-associée à la média pendant l'incubation avec la NOHA (figure 8c). Les résultats sont la moyenne ± l'écart-type à la moyenne de 6 expériences (* p<0,05 par comparaison avec les contrôles, test t de Student pour valeurs non appariées).
Ces résultats et ceux qui ont été exposés plus haut conduisent à conclure que la Nω-hydroxy-L-arginine est oxydée en NO dans l'adventice et que NO peut diffuser des cellules de l'adventice à la média. NO formé dans le vaisseau à partir de Nω-hydroxy-L-arginine agira donc principalement sur les cellules des deux tuniques, adventice et média.
Les effets bénéfiques de la Nω-hydroxy-L-arginine découlent de son aptitude à délivrer NO dans l'adventice avec pour conséquences une réduction de la contraction et des spasmes vasculaires, une modulation de l'activité des terminaisons sympathique permettant de maintenir un certain degré de vasoconstriction dans le sepsis et les états inflammatoires hyperdynamiques aigus, une amélioration de l'irrigation sanguine des gros vaisseaux par les vasa vasorum et le maintien de l'équilibre entre apoptose et migration et prolifération des cellules adventitielles. De tels effets peuvent s'opposer au développement de l'athérosclérose consécutive à une altération de l'adventice et à la rupture de la plaque d'athérosclérose. Ils peuvent en outre empêcher la migration des cellules de l'adventice à travers la média, jusqu'à l'espace sous-endothélial où elles prolifèrent sous forme de myofibroblastes, phénomène dit de formation de neo-intima qu'on observe dans les vaisseaux greffés ou après lésion endothéliale. Ce phénomène est le signe d'une altération vasculaire. Il peut réduire la lumière du vaisseau, par exemple dans la resténose après angioplastie.
De plus, en diminuant l'expression de protéines inflammatoires et en suscitant au contraire l'expression de protéines protectrices comme des enzymes anti-oxydantes, le NO produit dans l'adventice est capable de s'opposer au développement de l'inflammation dans divers tissus, comme notamment le tissu nerveux. Par conséquent, les indications thérapeutiques de la Nω-hydroxy-L-arginine, du fait de son effet de donneur de NO (ou composé apparenté) dans l'adventice, comprennent la prévention et le traitement des spasmes vasculaires et l'angor, les états de choc cardiovasculaire hyperdynamique, l'athérosclérose, la resténose après angioplastie, les rejets de greffes et les neuro-inflammations.
La présence d'un endothélium fonctionnel (vérifié par l'effet relaxant de l'acétylcholine, absent si l'endothélium est éliminé) inhibe sensiblement, voire complètement, l'effet de la Nω -hydroxy-nor-L-arginine (figures 1 et 9). Il n'en est plus de même si, l'endothélium étant présent, l'expérience est réalisée en présence d'un inhibiteur de NO-synthase (Nω- nitro-L-arginine méthyl ester, figure 9).
Dans l'expérience de la figure 9, des anneaux d'aorte de rat avec (+endo) ou sans (-endo) endothélium fonctionnel ont été incubés avec 300 μM de L-NAME pendant 15 minutes. Ensuite, ils ont été pré-contractés par la noradrénaline à 80 % de son effet maximal (soit 0,1 μM pour l'aorte sans endothélium et 0,3 μM pour les anneaux avec endothélium) et puis la nor-NOHA a été ajoutée de façon cumulative. Les résultats indiqués sont la moyenne ± Fécart-type à la moyenne du nombre n d'expériences (n compris entre 4 et 23 ; ** p<0,01 par comparaison avec les contrôles (analyse de variance)).
Il peut être conclu de cette expérience, d'une part, que l'endothélium n'exerce pas un obstacle physique à la diffusion de Nω- hydroxy-nor-L-arginine et, d'autre part, que la NO-synthase endothéliale inhibe l'effet de la Nω -hydroxy-nor-L-arginine sur le vaisseau. Cette dernière observation, très importante, montre en effet que la Nω -hydroxy- nor-L-arginine n'agit préférentiellement qu'en cas de production insuffisante de NO par l'endothélium. Son administration sera indiquée en cas de lésion endothéliale, mais entraînera peu d'effet si l'endothélium fonctionne normalement. Les indications thérapeutiques qui en découlent sont essentiellement les états pathologiques dans lesquels intervient une production insuffisante de NO par l'endothélium ou une diminution de ses effets biologiques : athérosclérose, vasculopathies secondaires au diabète, altérations de la fonction érectile chez l'homme associées à un dysfonctionnement de l'endothélium, hypertensions pulmonaires, troubles vasculaires des fumeurs, hypertensions artérielles, spasmes vasculaires (particulièrement coronariens), maladie d'Alzheimer. La déficience en NO endothélial est susceptible d'entraîner une réaction toxique pour le tissu qui justifie une thérapeutique substitutive. L'administration de Nω-hydroxy-nor- L-arginine ou de son homologue inférieur (dinor) représente un moyen unique de réaliser cette thérapeutique substitutive dans les seuls tissus où elle est nécessaire.
Conformément à la présente invention l'utilisation de l'isomère
L d'un composé de formule (I) ou d'un dérivé (sel, ester...), de préférence les isomères L des composés pour lesquels m=l (dinor-NOHA) ou m=2
(nor-NOHA) peut être prévue pour la production d'un effet relaxant indépendant de la NO-synthase au niveau des vaisseaux sanguins.
La présente invention prévoit également l'utilisation de l'isomère L d'un composé de formule (I) ou d'un dérivé (sel, ester...) pour l'obtention d'un médicament destiné à traiter ou à prévenir les pathologies résultant d'une production endogène anormale de monoxyde d'azote (NO) sous la forme de NO+ (ion nitrosonium), NO" (ion nitroxyle) ou NO* (NO radicalaire), d'un précurseur de monoxyde d'azote ou d'un dérivé résultant de l'interaction dudit monoxyde d'azote avec ses cibles biologiques.
Plus spécifiquement, l'utilisation précédente est caractérisée en ce que la production de monoxyde d'azote (NO) sous la forme de NO+ (ion nitrosonium), NO" (ion nitroxyle) ou NO" (NO radicalaire), d'un précurseur de monoxyde d'azote ou d'un dérivé résultant de l'interaction dudit monoxyde d'azote avec ses cibles biologiques est insuffisante.
Dans une variante, l'utilisation selon l'invention est caractérisée en ce que l'isomère L du composé (I) est préférentiellement la Nω-hydroxy-L-arginine (NOHA, m=3), la Nω -hydroxy-nor-L-arginine (nor- NOHA, m=2) ou la Nω-hydroxy-dinor-L-arginine (dinor-NOHA, m=l), utilisé en vue de l'obtention d'un médicament destiné à prévenir ou à traiter une déficience, lésion ou absence de l'endothélium vasculaire.
Par ailleurs, l'utilisation de l'isomère L d'un composé de formule (I) ou d'un dérivé (sel, ester...) selon l'invention peut servir à l'obtention d'un médicament destiné à prévenir ou à traiter les maladies vasculaires comportant une composante inflammatoire, en particulier un stress oxydatif, les inflammations systémiques, particulièrement les états de choc cardio-vasculaire hyperdynamique, les neuro-inflammations et les maladies neuro-dégénératives comme particulièrement la maladie d'Alzheimer. L 'utilisation de l'isomère L d'un composé de formule (I) ) ou d'un dérivé (sel, ester...) selon l'invention peut également servir à l'obtention d'un médicament destiné à prévenir ou à traiter les maladies vasculaires comportant une composante proliférative, à obtenir un médicament destiné à prévenir ou à traiter les maladies cardio-vasculaires telles que notamment l'athérosclérose, l'angor, les complications vasculaires du diabète, les troubles vasculaires des fumeurs, l'altération de l'érection masculine, certaines hypertensions artérielles et les hypertensions pulmonaires. Comme expliqué plus haut, elle peut encore servir à l'obtention d'un médicament destiné à prévenir ou à traiter un rejet de greffe.
Selon un autre aspect, l'isomère L d'un composé de formule (I) ou un dérivé (sel, ester...) d'un tel composé selon l'invention est utilisé pour l'obtention d'un médicament destiné à inhiber l'angiogénèse tumorale et prévenir ou traiter le développement corrélatif des tumeurs
De préférence, on utilise l'isomère L d'un composé de formule (I) dans laquelle m=3 ou un dérivé (sel, ester...) d'un tel composé selon l'invention pour l'obtention d'un médicament destiné à prévenir ou à traiter l'athérosclérose et l'angor. L'utilisation de l'isomère L d'un composé de formule (I) selon l'invention dans laquelle m=3 ou d'un dérivé (sel, ester...) d'un tel composé peut encore servir à l'obtention d'un médicament destiné à prévenir ou à traiter la formation de neo-intima, en particulier dans le cas d'une resténose après angioplastie. On prévoit en outre l'utilisation de l'isomère L d'un composé de formule (I) selon l'invention dans laquelle m=l ou m=2 ou d'un dérivé (sel, ester...) d'un tel composé pour l'obtention d'un médicament destiné à prévenir ou à traiter les affections résultant d'une insuffisance de monoxyde d'azote endothélial, notamment dans les complications vasculaires du diabète, les altérations de la fonction érectile chez l'homme en particulier celles liées à un dysfonctionnement de l'endothélium, les troubles vasculaires des fumeurs, les spasmes coronariens, les hypertensions artérielles, la maladie d'Alzheimer et les rejets de greffes.
La présente invention a encore pour objet une composition pharmaceutique pour utilisation comme médicament, caractérisée en ce qu'elle comprend à titre de principe actif, l'isomère L d'au moins un composé de formule (I) ou d'un dérivé (sel, ester...) d'un tel composé selon l'invention, associé, le cas échéant, dans ladite composition avec au moins un excipient ou véhicule pharmaceutiquement acceptable.
Enfin, elle a encore pour objet un composé chimique en tant que tel, caractérisé en ce qu'il s'agit de l'isomère L du composé de formule (I) dans laquelle m=0 ou d'un dérivé (sel, ester...) de ce composé.
Les méthodes suivantes ont été utilisées dans le cadre de la présente invention :
1. Dissection et étude de la contraction de l'aorte isolée de Rat avec et sans endothélium fonctionnel
Immédiatement après décapitation du rat, l'aorte thoracique est dégagée, prélevée et découpée en fragments annulaires d'environ 3 - 4 mm de long. L'étude s'est ensuite déroulée de deux façons différentes :
- dans les expériences sur les aortes entières, il a été essayé de conserver l'endothélium le plus intact possible,
- dans les autres expériences, l'endothélium a été lésé par un léger abrasage de la surface interne.
Les anneaux sont ensuite montés dans une cuve à organe isolé contenant 10 ml de solution de Krebs (composition en mmol/1 : NaCl 119 ; KCl 4,7 ; NaHCOs 25 ; MgS04 7 ; H20 1,2 ; CaCl2 1,25 ; KH2P04 1,2 ; glucose 11). Le liquide physiologique est thermostaté à 37°C et oxygéné par un mélange gazeux contenant 95 % dO2 et 5 % de C02. L'anneau d'aorte est soumis à une tension initiale de 2 g pendant une heure, période de stabilisation de l'organe. La réponse contractile des fragments d'aorte est mesurée par un capteur isométrique de force, relié à un préampli avec système interface 8 voies.
Les préparations sont alors contractées par la noradrénaline à la concentration de 1 μM. Pour s'assurer de la présence de l'endothélium, nous avons vérifié leur capacité à relâcher après addition d'acétylcholine (1 μM). Ensuite plusieurs rinçages sont effectués.
Les composés chimiques ont été ajoutés comme indiqué dans les descriptions détaillées des différentes figures.
2. Dissection et étude de la média et de l'adventice Dans quelques expériences, l'aorte est délicatement débarassée de son adventice avec des ciseaux et des pinces très fines. 3. Dosage du GMP cyclique
La teneur en GMP cyclique dans les tissus a été déterminée par essai radioimmunologique (protocole Immunotech, Marseille, France).
Grâce aux isomères L des composés (I) de la présente invention, il devient également possible de proposer un procédé de traitement ou de prévention d'une maladie chez un mammifère, en particulier des maladies nécessitant une production localisée, in situ et in vivo, de monoxyde d'azote (NO) sous la forme de NO+ (ion nitrosonium), NO" (ion nitroxyle) ou NO* (NO radicalaire), de dérivés résultant de l'interaction du monoxyde d'azote avec ses cibles biologiques (particulièrement le fer héminique ou non héminique et les thiols) ou d'un précurseur de monoxyde d'azote dans les tuniques des vaisseaux sanguins chez l'homme ou chez l'animal, en particulier dans les tuniques externes (adventice) des vaisseaux sanguins, dans les tuniques médianes (média) des vaisseaux sanguins.
Ceci est spécialement le cas lors d'une lésion, d'une absence ou d'un dysfonctionnement de l'endothélium vasculaire, dans les traitements de maladies nécessitant la production d'un effet relaxant au niveau des vaisseaux sanguins et dans les maladies résultant d'une production endogène anormale de monoxyde d'azote (NO) sous la forme de NO+ (ion nitrosonium), NO" (ion nitroxyle) ou NO* (NO radicalaire), d'un précurseur de monoxyde d'azote ou d'un dérivé résultant de l'interaction dudit monoxyde d'azote avec ses cibles biologiques. En particulier, sont également concernées les maladies dans lesquelles la production de monoxyde d'azote (NO) sous la forme de NO+ (ion nitrosonium), NO" (ion nitroxyle) ou NO* (NO radicalaire), d'un précurseur de monoxyde d'azote ou d'un dérivé résultant de l'interaction dudit monoxyde d'azote avec ses cibles biologiques est anormale (en particulier insuffisante), notamment les maladies vasculaires comportant une composante inflammatoire, en particulier un stress oxydatif, les inflammations systémiques, particulièrement les états de choc cardio- vasculaire hyperdynamique et/ou les neuro-inflammations, les maladies vasculaires comportant une composante proliférative, les maladies cardio- vasculaires, telles que notamment l'athérosclérose, l'angor, les complications vasculaires du diabète, certaines hypertensions artérielles et les hypertensions pulmonaires, les rejets de greffes, les complications vasculaires du diabète, l'insuffisance de la fonction érectile chez l'homme (en particulier celle liée à un dysfonctionnement de l'endothélium), la maladie d'Alzheimer, les troubles vasculaires des fumeurs, les spasmes coronariens, les maladies impliquant la formation de neo-intima, en particulier dans le cas d'une resténose après angioplastie.
Ledit procédé de traitement ou de prévention comprend l'administration audit mammifère d'une quantité efficace sur le plan thérapeutique de l'isomère L d'au moins un composé de formule générale
(I) ou d'un dérivé pharmaceutiquement acceptable (sel, ester...) dudit composé selon la présente invention.
Bien entendu, l'invention n'est pas limitée au mode de réalisation décrit et représenté aux dessins annexés. Des modifications restent possibles, notamment du point de vue de la constitution des divers éléments ou par substitution d'équivalents techniques, sans sortir pour autant du domaine de protection de l'invention.

Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation de l'isomère L d'un composé de formule générale (I) :
Figure imgf000025_0001
où m est un entier compris entre 0 et 4 (bornes incluses) pour la production localisée, in situ et in vivo dans les tuniques des vaisseaux sanguins chez l'homme ou chez l'animal, de monoxyde d'azote (NO) sous la forme de NO+ (ion nitrosonium), NO" (ion nitroxyle) ou NO* (NO radicalaire), d'un précurseur de monoxyde d'azote ou d'un dérivé résultant de l'interaction dudit monoxyde d'azote avec ses cibles biologiques.
2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'isomère L du composé (I) est présent sous la forme d'un ester pharmaceutiquement acceptable, préférentiellement sous la forme d'un ester d'alkyle inférieur en Ci à C4 tel que l'ester méthylique, éthylique, propylique ou butylique ou sous la forme de l'ester benzylique.
3. Utilisation selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que l'isomère L du composé (I) est présent sous la forme d'un sel pharmaceutiquement acceptable, préférentiellement un chlorhydrate, acétate, oxalate ou un sulfate.
4. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que l'isomère L du composé (I) est préférentiellement la Nω-hydroxy-L-arginine ou NOHA (m=3).
5. Utilisation selon la revendication 4, caractérisée en ce que la production de monoxyde d'azote (NO) sous la forme de NO+ (ion nitrosonium), NO" (ion nitroxyle) ou NO* (NO radicalaire), d'un précurseur de monoxyde d'azote ou d'un dérivé résultant de l'interaction dudit monoxyde d'azote avec ses cibles biologiques a lieu dans les tuniques externes (adventice) des vaisseaux sanguins.
6. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que l'isomère L du composé (I) est préférentiellement la Nω-hydroxy-nor-L-arginine (nor- NOHA, m=2) ou la Nω-hydroxy- dinor-L-arginine (dinor-NOHA, m=l).
7. Utilisation selon la revendication 6, caractérisée en ce que la production de monoxyde d'azote (NO) sous la forme de NO+ (ion nitrosonium), NO" (ion nitroxyle) ou NO" (NO radicalaire), d'un précurseur de monoxyde d'azote ou d'un dérivé résultant de l'interaction dudit monoxyde d'azote avec ses cibles biologiques a lieu dans les tuniques médianes (média) des vaisseaux sanguins.
8. Utilisation selon les revendications 6 et 7, caractérisée en ce que l'isomère L du composé (I) est la Nω -hydroxy-nor-L-arginine (nor- NOHA, m=2) pour une production de monoxyde d'azote (NO) sous la forme de NO+ (ion nitrosonium), NO" (ion nitroxyle) ou NO* (NO radicalaire), d'un précurseur de monoxyde d'azote ou d'un dérivé résultant de l'interaction dudit monoxyde d'azote avec ses cibles biologiques dans les tuniques médianes (média) des vaisseaux sanguins lors d'une lésion, d'une absence ou d'un dysfonctionnement de l'endothélium vasculaire.
9. Utilisation de l'isomère L d'un composé de formule (I) selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, pour la production d'un effet relaxant indépendant de la NO-synthase au niveau des vaisseaux sanguins.
10. Utilisation de l'isomère L d'un composé de formule (I) selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 pour l'obtention d'un médicament destiné à traiter ou à prévenir les pathologies résultant d'une production endogène anormale de monoxyde d'azote (NO) sous la forme de NO+ (ion nitrosonium), NO" (ion nitroxyle) ou NO* (NO radicalaire), d'un précurseur de monoxyde d'azote ou d'un dérivé résultant de l'interaction dudit monoxyde d'azote avec ses cibles biologiques.
11. Utilisation selon la revendication 10, caractérisée en ce que la production de monoxyde d'azote (NO) sous la forme de NO+ (ion nitrosonium), NO" (ion nitroxyle) ou NO* (NO radicalaire), d'un précurseur de monoxyde d'azote ou d'un dérivé résultant de l'interaction dudit monoxyde d'azote avec ses cibles biologiques est insuffisante.
12. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que l'isomère L du composé (I) est préférentiellement la Nω-hydroxy-L-arginine (NOHA, m=3), la Nffl-hydroxy-nor-L-arginine (nor- NOHA, m=2) ou la Nω -hydroxy-dinor-L-arginine (dinor-NOHA, m=l) en vue de l'obtention d'un médicament destiné à prévenir ou à traiter une déficience, lésion ou absence de l'endothélium vasculaire.
13. Utilisation de l'isomère L d'un composé de formule (I) selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 pour l'obtention d'un médicament destiné à prévenir ou à traiter les maladies vasculaires comportant une composante inflammatoire, en particulier un stress oxydatif, les inflammations systémiques, particulièrement les états de choc cardio-vasculaire hyperdynamique, les neuro-inflammations et les maladies neuro-dégénératives comme particulièrement la maladie d'Alzheimer.
14. Utilisation de l'isomère L d'un composé de formule (I) selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 pour l'obtention d'un médicament destiné à prévenir ou à traiter les maladies vasculaires comportant une composante proliférative.
15. Utilisation de l'isomère L d'un composé de formule (I) selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 pour l'obtention d'un médicament destiné à prévenir ou à traiter les maladies cardio-vasculaires telles que notamment l'athérosclérose, l'angor, les complications vasculaires du diabète, les troubles vasculaires des fumeurs, l'altération de l'érection masculine, certaines hypertensions artérielles et les hypertensions pulmonaires.
16. Utilisation de l'isomère L d'un composé de formule (I) selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 pour l'obtention d'un médicament destiné à prévenir ou à traiter un rejet de greffe.
17. Utilisation de l'isomère L d'un composé de formule (I) selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, pour l'obtention d'un médicament destiné à inhiber l'angiogénèse tumorale et prévenir ou traiter le développement corrélatif des tumeurs.
18. Utilisation de l'isomère L d'un composé de formule (I) selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 dans laquelle m=3, pour l'obtention d'un médicament destiné à prévenir ou à traiter l'athérosclérose et l'angor.
19. Utilisation de l'isomère L d'un composé de formule (I) selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 dans laquelle m=3, pour l'obtention d'un médicament destiné à prévenir ou à traiter la formation de neo-intima, en particulier dans le cas d'une resténose après angioplastie.
20. Utilisation de l'isomère L d'un composé de formule (I) selon la revendication 6 dans laquelle m=l ou m=2 pour l'obtention d'un médicament destiné à prévenir ou à traiter les affections résultant d'une insuffisance de monoxyde d'azote endothélial, notamment dans les complications vasculaires du diabète, les altérations de la fonction érectile chez l'homme en particulier celles liées à un dysfonctionnement de l'endothélium, les troubles vasculaires des fumeurs, les spasmes coronariens, les hypertensions artérielles, la maladie d'Alzheimer et les rejets de greffes.
21. Composition pharmaceutique pour utilisation comme médicament, caractérisée en ce qu'elle comprend à titre de principe actif, l'isomère L d'au moins un composé de formule (I) selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, associé, le cas échéant, dans ladite composition avec au moins un excipient ou véhicule pharmaceutiquement acceptable.
22. Composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il s'agit de l'isomère L du composé de formule (I) dans laquelle m=0.
PCT/FR2002/004117 2001-11-29 2002-11-29 Utilisation des isomeres l de derives aminoacides de l'hydroxyguanidine pour la protection localisee de no WO2003045369A2 (fr)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AU2002364804A AU2002364804A1 (en) 2001-11-29 2002-11-29 Use of l isomers of amino acid derivatives of hydroxyguanidine for producing no, pharmaceutical compositions containing same and pharmaceutical uses

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR0115457A FR2832634A1 (fr) 2001-11-29 2001-11-29 Utilisation des isomeres l de derives aminoacides de l'hydroxyguanidine pour la production de no, compositions pharmaceutiques les contenant et utilisations pharmaceutiques
FR0115457 2001-11-29

Publications (3)

Publication Number Publication Date
WO2003045369A2 true WO2003045369A2 (fr) 2003-06-05
WO2003045369A3 WO2003045369A3 (fr) 2004-06-03
WO2003045369A9 WO2003045369A9 (fr) 2004-07-01

Family

ID=8869931

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/FR2002/004117 WO2003045369A2 (fr) 2001-11-29 2002-11-29 Utilisation des isomeres l de derives aminoacides de l'hydroxyguanidine pour la protection localisee de no

Country Status (3)

Country Link
AU (1) AU2002364804A1 (fr)
FR (1) FR2832634A1 (fr)
WO (1) WO2003045369A2 (fr)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010078865A1 (fr) 2009-01-09 2010-07-15 Christian-Albrechts-Universität Zu Kiel DÉRIVÉS DE N ω-HYDROXY-L-ARGININE POUR LE TRAITEMENT DE MALADIES
JP2013511556A (ja) * 2009-11-23 2013-04-04 カルディオキル ファーマシューティカルズ，インク． 肺高血圧症の処置のためのニトロキシル供与体
US9018411B2 (en) 2009-12-07 2015-04-28 Cardioxyl Pharmaceuticals, Inc. Bis-acylated hydroxylamine derivatives

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998058633A2 (fr) * 1997-06-23 1998-12-30 Queen's University At Kingston Traitement par administration de microdoses
US6436997B1 (en) * 1998-06-01 2002-08-20 Nitromed, Inc. Endogenous nitric oxide synthesis under conditions of low oxygen tension
JP2003514020A (ja) * 1999-10-29 2003-04-15 ニトロメド インコーポレーテッド 酸化窒素不足により特徴付けられる血管疾患の治療法
WO2002034303A1 (fr) * 2000-10-27 2002-05-02 Nitromed, Inc. Methodes de traitement de maladies vasculaires caracterisees par une insuffisance en monoxyde d'azote
EP1351674A4 (fr) * 2000-04-12 2004-12-22 Cornell Res Foundation Inc Pharmacotherapie pour dysfonction vasculaire associee a la bioactivite deficiente de l'oxyde nitrique
AU2001264729A1 (en) * 2000-05-22 2001-12-03 Nitromed, Inc. Thromboxane inhibitors, compositions and methods of use related applications

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010078865A1 (fr) 2009-01-09 2010-07-15 Christian-Albrechts-Universität Zu Kiel DÉRIVÉS DE N ω-HYDROXY-L-ARGININE POUR LE TRAITEMENT DE MALADIES
US9387185B2 (en) 2009-01-09 2016-07-12 Christian-Albrechts-Universität Zu Kiel N-ω-hydroxy-L-arginine derivatives for the treatment of diseases
JP2013511556A (ja) * 2009-11-23 2013-04-04 カルディオキル ファーマシューティカルズ，インク． 肺高血圧症の処置のためのニトロキシル供与体
JP2016128481A (ja) * 2009-11-23 2016-07-14 カルディオキシル ファーマシューティカルズ，インク． 肺高血圧症の処置のためのニトロキシル供与体
US9018411B2 (en) 2009-12-07 2015-04-28 Cardioxyl Pharmaceuticals, Inc. Bis-acylated hydroxylamine derivatives
US9458127B2 (en) 2009-12-07 2016-10-04 Cardioxyl Pharmaceuticals, Inc. Bis-acylated hydroxylamine derivatives

Also Published As

Publication number Publication date
WO2003045369A3 (fr) 2004-06-03
AU2002364804A8 (en) 2003-06-10
AU2002364804A1 (en) 2003-06-10
WO2003045369A9 (fr) 2004-07-01
FR2832634A1 (fr) 2003-05-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA2754283A1 (fr) Derives indoliques pour le traitement de maladies neurodegeneratives
EP1206257A1 (fr) Utilisation d&#39;acides amines pour la fabrication de medicaments destines au traitement des insulino-resistances
WO2003045369A2 (fr) Utilisation des isomeres l de derives aminoacides de l&#39;hydroxyguanidine pour la protection localisee de no
WO2011006983A1 (fr) Derives amines de dihydro-1,3,5-triazine pour le traitement du stress oxydatif
EP2297095B9 (fr) Nouveaux dérivés d&#39;amino-acides, leur procédé de préparation et leur utilisation thérapeutique
EP3624822B1 (fr) Principe actif constitue par un melange de composes poly-lysine et utilisation dans la prevention des avc et le traitement de la phase inflammatoire post-avc
WO2000071118A1 (fr) Composes inhibiteurs specifiques de la phospholipase a¿2?
WO2013004436A1 (fr) Compositions pour le traitement ou la prévention du cancer de la prostate à base d&#39;extrait de graines de brocoli
EP2453898B1 (fr) Derives amines de dihydro-1,3,5-triazine pour leur utilisation dans le traitement des maladies associees a une ischemie et/ou une reperfusion
CA2365500A1 (fr) Association d&#39;inhibiteur(s) de no synthase et d&#39;antioxydant(s) metabolique(s)
EP1311273A2 (fr) Association d&#39;une purine et d&#39;un ains pour le traitement des dysfonctions sexuelles
FR2948028A1 (fr) Association d&#39;un inhibiteur de l&#39;echangeur sodium-proton et d&#39;un derive amine de dihydro-1,3,5-triazine
EP1505985A1 (fr) Therapie de combinaison destinee a traiter des maladies a mediation par cyclooxygenase-2 chez des malades presentant un risque d&#39;accident cardiovasculaire thrombotique
Červenka et al. Role of nNOS in regulation of renal function in hypertensive Ren-2 transgenic rats
Haefely et al. Pre-clinical pharmacology of moclobemide: a review of published studies
CA3166781A1 (fr) Combinaison de l&#39;anethole trithione ou son derive la 4-oh-anethole trithione avec la doxycycline ou la minocycline pour son utilisation dans le traitement de la maladie de parkinson
EP0174888B1 (fr) Dérivés de 1-(aminophényl)-2-amino-éthanone, procédé de préparation et utilisation en thérapeutique
FR2937550A1 (fr) Utilisation de la citrulline pour le traitement et la prevention du syndrome d&#39;ischemie-reperfusion
CH679554A5 (fr)
BE1025645B1 (fr) Compose pour le traitement de la neurotoxicite due a l&#39;hyperexcitabilite des recepteurs glutamatergiques ionotropes
WO2010063910A1 (fr) Utilisation d&#39;inhibiteurs de gerany-geranyl transferase dans le traitement des lesions de la moelle epiniere
EP2738167B1 (fr) Nouveau produit antithrombotique anti-athérosclérotique et procédé de sa fabrication (et variantes)
Gabriel et al. 2-Hydroxyacetophenone Isatin Derivatives on Cardiac and Vascular Smooth Muscles in Rats
EP0233459A1 (fr) Médicament contenant un complexe acétylsalicylate de magnésium-urée et procédé pour la fabrication de ce complexe
US20050215611A1 (en) Combination therapy for treating cyclooxygenase-2 mediated diseases in patients at risk of thrombotic cardiovascular events

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NO NZ OM PH PL PT RO RU SC SD SE SG SI SK SL TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): GH GM KE LS MW MZ SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
COP Corrected version of pamphlet

Free format text: PUBLISHED INTERNATIONAL SEARCH REPORT IN ENGLISH (8 PAGES) REPLACED BY CORRECT INTERNATIONAL SEARCHREPORT (14 PAGES)

122 Ep: pct application non-entry in european phase
NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: JP

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Country of ref document: JP

点击 这是indexloc提供的php浏览器服务，不要输入任何密码和下载