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WO2002036165A1 - Agent à base d'antagoniste d'il-6, faisant baisser le niveau des mmp-3 dans le sang - Google Patents

Agent à base d'antagoniste d'il-6, faisant baisser le niveau des mmp-3 dans le sang Download PDF

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WO2002036165A1
WO2002036165A1 PCT/JP2000/007604 JP0007604W WO0236165A1 WO 2002036165 A1 WO2002036165 A1 WO 2002036165A1 JP 0007604 W JP0007604 W JP 0007604W WO 0236165 A1 WO0236165 A1 WO 0236165A1
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WO
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receptor
antibody
antibody against
mmp
agent
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Application number
PCT/JP2000/007604
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English (en)
French (fr)
Inventor
Kazuyuki Yoshizaki
Norihiro Nishimoto
Yasunori Okada
Ken-Ichi Obata
Original Assignee
Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
Daiichi Fine Chemical Co., Ltd.
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • C07K16/248—IL-6
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
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    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies

Definitions

  • the present invention relates to an agent for lowering blood band P-3 concentration, an agent for inhibiting cartilage destruction, etc., containing interleukin-6 (IL-6) antagonist as an active ingredient.
  • IL-6 interleukin-6
  • IL-6 is a site-powered enzyme also called B-cell stimulating factor 2 (BSF2) or interferon 32.
  • BSF2 B-cell stimulating factor 2
  • IL-6 was discovered as a differentiation factor involved in the activation of B lymphocyte cells (Hirano, T. et al., Nature (1986) 324, 73-76), and subsequently It has been revealed that it is a multifunctional site that affects cell function (Akira, S. et al., Adv. In Immunology (1993) 54, 1-78). IL-6 has been reported to induce maturation of T lymphocyte cells (Lotz, M. et al., J. Exp. Med. (1988) 167, 1253-1258).
  • IL-6 transmits its biological activity on cells via two proteins.
  • One is the IL-6 receptor, a ligand-binding protein with a molecular weight of about 80 kD to which IL-6 binds (Taga, T. et al., J. Exp. Med. (1987) 166, 967-). 981, Yamasaki, K. et al., Science (1987) 241, 825-82 8).
  • the IL-6 receptor exists not only as a membrane-bound type expressed through the cell membrane but also as a soluble IL-6 receptor mainly composed of its extracellular region.
  • the other is the molecular weight involved in non-ligand binding signaling. It is gpl30, a 130 kD membrane protein.
  • IL- 6 and I Medical 6 receptor form the IL- 6 / IL-6 receptor complex, followed by binding to the g P 130, IL - 6 biological activity is transferred into cells (Taga, T. et al., Cell (198 9) 58, 573-581) 0
  • IL-6 antagonist is a substance that inhibits the transmission of biological activity of IL-6.
  • antibodies to IL-6 anti-IL-6 antibody
  • antibody against IL-6 receptor anti-IL- 6 receptor antibody
  • antibody against g PL30 anti g P 130 antibodies
  • IL- 6 modified Body IL-6 or IL-6 receptor partial peptide and the like are known.
  • MMP is an important ECM-degrading enzyme together with neutrophil elastase and cathepsin G, and about 20 molecular species have been reported to date as MMP gene families. These MMPs include collagenases (MMP-1, MMP-8, MMP-13), gelatinases (MMP-2, MMP-9), Thin group (MMP-3, MMP-10), membrane type MMP group (MMP-14, ⁇ -15, ⁇ -16, ⁇ -17), other ⁇ ( ⁇ -7, ⁇ -11, ⁇ -12, 19-19, ⁇ -20, etc.).
  • the stromlysin group (MMP-3, ⁇ -10) degrades theophylline theodalican, ⁇ type, type IV, type K collagen, laminin, fibronectin, etc., and has the broadest substrate specificity among ⁇ .
  • MMP-3 is thought to play an important role in cartilage destruction in OA. MMP-3 is also considered to play an important role in rheumatoid arthritis, adult still disease, etc., and the suppression of the action of MMP-3 improves the symptoms of these diseases. It is considered to be.
  • MMP-3 itself degrades cartilage proteodalican (addarican), and MMP-3 has the strongest activity of degrading aggrecan core protein among MMPs.
  • additivecan cartilage proteodalican
  • MMP-3 has the strongest activity of degrading aggrecan core protein among MMPs.
  • MMP exists as a latent MMP and is converted to an active MMP by cleavage of a propeptide
  • active MMP-3 is a latent MMP- It also attracts attention because it has the function of activating 1, 7, 8, and 9 to a complete level.
  • MMP-3 is expressed in RA and OA joint tissues, but its production is higher in RA than in ⁇ A, and In RA, it is known that an increase in blood levels of MMP-3 is useful for differentiating from OA. That is, serum MMP-3 level is an indicator of RA synovitis.
  • MMP-3 is induced by IL-1, TNF-H, EGF, bFGF, etc., and is suppressed by retinoic acid, dalcocorticoid, TGF-j8, etc. No association was reported. It has been reported that IL-6 antagonists such as anti-IL-6 receptor antibody improve rheumatic symptoms by suppressing abnormal growth of synovial cells (W096 / 11020) It was not known that IL-6 antagonists, especially anti-IL-6 receptor antibodies, reduced blood levels of MMP-3, a major enzyme of cartilage destruction, in rheumatic patients. Disclosure of the invention
  • the present invention provides a blood MMP-3 concentration lowering agent and a cartilage destruction inhibitor, a method for detecting, evaluating, and judging the effect of the lowering agent and Z or the inhibitor, and a reagent used therefor. Trying to do so.
  • the present inventor has reported that IL-6 antagonists such as anti-IL-6 receptor antibody are used for MMP-3, MMP_1, and Tis sue Inhibitor of Metalloprote inases-l (l ⁇ Pl), particularly MMP-3.
  • the present inventors have found that the blood concentration is reduced, and completed the present invention.
  • the present invention provides (1) a blood band P-3 concentration-lowering agent and a cartilage destruction inhibitor containing IL-6 antagonist as an active ingredient.
  • the present invention also provides (2) IL-6 Provided are a blood band P-3 concentration lowering agent and a cartilage destruction inhibitor containing an antibody against a receptor as an active ingredient.
  • the present invention also relates to (3) a blood band P-3 concentration-lowering agent and a cartilage destruction inhibitor containing a monoclonal antibody against IL-6 receptor as an active ingredient. Provide the agent.
  • the present invention also provides (4) a blood band P-3 concentration-lowering agent and a cartilage destruction inhibitor comprising a monoclonal antibody against human IL-6 receptor as an active ingredient.
  • Monoclonal antibodies to human IL-6 receptor are preferably PM-1 antibodies.
  • the present invention also provides (5) an agent for lowering a blood band P-3 concentration and an agent for inhibiting cartilage destruction, comprising a monoclonal antibody against mouse IL-6 receptor as an active ingredient.
  • the monoclonal antibody against mouse IL-6 receptor is preferably MR16-1 antibody.
  • the present invention also provides (6) a blood band P-3 concentration-lowering agent and a cartilage destruction inhibitor, which contain a recombinant antibody against IL-6 receptor as an active ingredient.
  • Recombinant antibodies to the IL-6 receptor preferably have a human antibody constant region (C region).
  • the present invention also provides (7) a blood band P-3 concentration lowering agent and a cartilage destruction inhibitor comprising a chimeric antibody or humanized antibody against IL-6 receptor as an active ingredient.
  • the present invention also provides (8) an agent for lowering blood MMP-3 concentration and an agent for suppressing cartilage destruction, comprising a humanized PM-1 antibody as an active ingredient.
  • the present invention also provides a therapeutic agent for osteoarthritis containing interleukin-6 (IL-6) antagonist as an active ingredient.
  • IL-6 interleukin-6
  • the present invention also provides IL-6, which is selected from the group consisting of MMP-3, MMP-1 and TIMP-1, by using, in particular, the in vivo concentration of maraudal P-3, for example, blood concentration.
  • Drugs containing antagonist as an active ingredient such as cartilage destruction inhibitor or osteoarthritis drug using IL-6 antagonist as an active ingredient (for example, therapeutic effect) Provided is a method for performing any of them, and a reagent used for the method.
  • FIG. 1 is a graph showing the time course of blood MMP-1 in 8 rheumatic patients after administration of a humanized IL-6 receptor antibody.
  • FIG. 2 is a graph showing the time course of blood MMP-3 after administration of a humanized IL-6 receptor antibody in eight rheumatic patients.
  • FIG. 3 is a graph showing the time course of blood TIMP-1 in 8. rheumatic patients after administration of humanized IL-6 receptor antibody.
  • FIG. 4 is a graph showing the time course of blood MMP-1 in five CD patients after administration of a humanized IL-6 receptor antibody.
  • FIG. 5 is a graph showing the time course of blood MMP-3 in 5 CD patients after administration of a humanized IL-6 receptor antibody.
  • FIG. 6 is a graph showing the time course of blood TIMP-1 in 5 CD patients after administration of a humanized IL-6 receptor antibody.
  • the IL-6 antagonist used in the present invention may be of any type and shape as long as it exhibits a blood MMP-3 concentration lowering effect and a Z or cartilage destruction inhibitory effect.
  • IL-6 antagonist is a substance that blocks signal transduction by IL-6 and inhibits the biological activity of IL-6.
  • IL-6 antagonist is a substance that preferably has an inhibitory action on the binding of I-6, I-6 receptor and gpl30.
  • examples of the IL-6 antagonist include an anti-IL-6 antibody, an anti-IL-6 receptor antibody, an anti-gpl30 antibody, a modified IL-6, a modified soluble IL-6 receptor, or a modified IL-6 receptor. Partial peptides of 6 or IL-6 receptor and low molecular weight substances having similar activities to these are mentioned.
  • the anti-IL-6 antibody used in the present invention can be obtained as a polyclonal or monoclonal antibody using known means.
  • a monoclonal antibody derived from a mammal is particularly preferable.
  • Monoclonal antibodies derived from mammals include those produced by Neubridomas and those produced by a host transformed with an expression vector containing the antibody gene by genetic engineering techniques. By binding to IL-6, this antibody inhibits the binding of IL-6 to the I6 receptor and blocks the transmission of the biological activity of IL-6 into cells.
  • Such antibodies include MH166 (Matsuda, T. et al., Eur. J. Immunol. (1988) 18, 951-956) and SK2 antibody (Sato, K. et al., 21st Japan). General Meeting of the Society of Immunology, Scientific Records (1991) 21, 166).
  • An anti-IL-6 antibody-producing hybridoma can be basically produced using a known technique as follows. That is, IL-6 is used as a sensitizing antigen, and immunized with the same according to a usual immunization method, and the obtained immunized cells are fused with a known parent cell by a usual cell fusion method, and a conventional screening method is used. Thus, it can be prepared by screening monoclonal antibody-producing cells.
  • an anti-IL-6 antibody may be prepared as follows.
  • human IL-6 used as a sensitizing antigen for obtaining antibodies can be obtained from Eur. J. Biochem (1987) 168, 543-550, J. Immunol. (1988) 140, 153 4-1541, or Agr. Obtained by using the IL-6 gene / amino acid sequence disclosed in Biol. Chem. (1990) 54, 2685-2688.
  • a desired IL-6 protein is obtained from the host cell or the culture supernatant by a known method.
  • the purified IL-6 protein may be used as a sensitizing antigen.
  • fusion of IL-6 protein with other proteins A protein may be used as the sensitizing antigen.
  • the anti-IL-6 receptor antibody used in the present invention can be obtained as a polyclonal or monoclonal antibody using known means.
  • a mammalian monoclonal antibody is particularly preferable.
  • mammal-derived monoclonal antibodies include those produced in hybridomas and those produced in hosts transformed with expression vectors containing antibody genes by genetic engineering techniques. By binding to the I6 receptor, this antibody inhibits the binding of IL-6 to the IL-6 receptor and blocks the transmission of IL-6 biological activity into cells.
  • Such antibodies include MR16-1 antibody (Tamura, T. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90, 11924-11928) and PM_1 antibody (Hirata, Y. et al., J. Immunol. (1989) 143, 2900-2906), AUK12-20 antibody, AUK64-7 antibody or AUK146-15 antibody (International Patent Application Publication No. WO92-19759).
  • a particularly preferred antibody is the PM-1 antibody.
  • the PM-1 antibody-producing hybridoma cell line was designated as PM-1 by the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (1-1-3 Higashi, Tsukuba, Ibaraki Prefecture) on July 10, 1990. Deposited internationally under the Budapest Treaty as FERM BP-2998.
  • the MR16-1 antibody-producing hybridoma cell line was designated as Rat-mous e hybridoma MR16-1 by the Institute of Biotechnology and Industrial Technology, Institute of Industrial Science and Technology (1-1-3 Higashi, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture). On March 13, 1997, it was deposited internationally under the Budapest Treaty as FERM BP-5875.
  • An anti-IL-6 receptor monoclonal antibody-producing hybridoma can be basically produced using a known technique as follows. That is, the IL-6 receptor was used as a sensitizing antigen, and this was used as a normal immunization method. By immunization, the resulting immune cells are fused with a known parent cell by a normal cell fusion method, and the monoclonal antibody-producing cells are screened by a normal screening method. Can be manufactured.
  • an anti-IL-6 receptor antibody may be prepared as follows.
  • a human IL-6 receptor used as a sensitizing antigen for obtaining an antibody is disclosed in European Patent Application Publication No. EP 325474
  • a mouse IL-6 receptor is disclosed in Japanese Patent Application Publication No. 3-155579. It can be obtained by using the IL-6 receptor gene / amino acid sequence obtained.
  • IL-6 receptor protein is expressed on and detached from cell membrane (soluble IL-6 receptor) (Yasukawa, K. et al., J. Biochem. (1990) 108 , 673-676).
  • Soluble IL-6 receptor antibody consists essentially of the extracellular region of the IL-6 receptor bound to the cell membrane, and lacks the transmembrane region or the transmembrane region and the intracellular region. Is different from the membrane-bound IL-6 receptor.
  • the IL-6 receptor protein any IL-6 receptor may be used as long as it can be used as a sensitizing antigen for producing the anti-IL-6 receptor antibody used in the present invention.
  • the target IL-6 receptor protein is isolated from the host cell or the culture supernatant. Purification may be performed by a known method, and the purified IL-6 receptor protein may be used as a sensitizing antigen. Alternatively, cells expressing the IL-6 receptor or a fusion protein of the IL-6 receptor protein and another protein may be used as the sensitizing antigen.
  • Escherichia coli (E. coli) containing the plasmid pIBIBSF2R containing cDNA coding for the human IL-6 receptor was released on January 9, 1989 Received HB101-P IB IBSF2R at the Technical Research Institute Deposited internationally under the Budapest Treaty under the deposit number FERM BP-2232.
  • the anti-gpl30 antibody used in the present invention can be obtained as a polyclonal or monoclonal antibody using known means.
  • a mammalian-derived monoclonal antibody is particularly preferable.
  • mammal-derived monoclonal antibodies include those produced by hybridomas and those produced by a host transformed with an expression vector containing an antibody gene by genetic engineering techniques. This antibody transfer to intracellular of g P 130 and Ri by the a coupling child, IL-6 / IL-6 by inhibiting the binding of gpl30 receptor complex IL- 6 biological activity Cut off.
  • Such antibodies include the AM64 antibody (JP-A-3-219894), the 4B11 antibody and the 2H4 antibody (US Pat. No. 5,715,513), the B-S12 antibody and the B-P8 antibody (JP-A-8-291199). '
  • An anti-gpl30 monoclonal antibody-producing hybridoma can be basically produced as follows using a known technique. That is, gpl30 is used as a sensitizing antigen, and is immunized according to a usual immunization method. The obtained immune cells are fused with a known parent cell by a usual cell fusion method, and a normal script is used. It can be produced by screening monoclonal antibody-producing cells by the screening method. 'Specifically, a monoclonal antibody can be prepared as follows. For example, gpl30, which is used as a sensitizing antigen for antibody acquisition is obtained by using a g PL30 gene amino acid sequence disclosed in European Patent Application Publication No. EP four hundred eleven thousand nine hundred and forty-six.
  • the desired gP130 protein is purified from the host cell or culture supernatant by a known method.
  • the purified gpl30 receptor The protein may be used as the sensitizing antigen.
  • cells expressing gpl30 or a fusion protein of gpl30 protein with another protein may be used as the sensitizing antigen.
  • the mammal to be immunized with the sensitizing antigen is not particularly limited, but is preferably selected in consideration of compatibility with the parent cell used for cell fusion.
  • Rodent animals for example, mice, rats, hamsters and the like are used.
  • Immunization of an animal with a sensitizing antigen is performed according to a known method.
  • the sensitizing antigen is injected intraperitoneally or subcutaneously into a mammal.
  • the sensitizing antigen is diluted to an appropriate amount with PBS (Phosphate-Buffered Saline), physiological saline, or the like, and the suspension is mixed with an ordinary adjuvant, for example, an appropriate amount of Freund's complete adjuvant, if desired.
  • PBS Phosphate-Buffered Saline
  • physiological saline or the like
  • an ordinary adjuvant for example, an appropriate amount of Freund's complete adjuvant, if desired.
  • a suitable carrier can be used during immunization of the sensitizing antigen.
  • immune cells are removed from the mammal and subjected to cell fusion.
  • Preferred immune cells to be subjected to cell fusion particularly include spleen cells.
  • Mammalian myeloma cells as the other parent cells fused with the immune cells are already known in various cell lines, for example, P3X63Ag8.653 (Kearney, JF et al. J. Immnol. (1979) 123, 1548-1550), P3X63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and Immunolog y (1978) 81, 1-7), NS-l (Kohler.G. And Milstein, C. Eur. J. Immunol. 1976) 6, 511-519), MPC-11 (Margulies. DH et al., Cell (1976) 8, 405-415), SP2 / 0 (Shulman, M.
  • the cell fusion is performed, for example, in a normal nutrient culture in the presence of a cell fusion promoter.
  • a cell fusion promoter for example, polyethylene glycol (PEG), Sendai virus (HVJ) and the like are used, and if necessary, an adjuvant such as dimethyl sulfoxide can be added to increase the fusion efficiency.
  • PEG polyethylene glycol
  • HVJ Sendai virus
  • an adjuvant such as dimethyl sulfoxide
  • the ratio of the use of the immune cells to the myeloma cells is preferably, for example, 1 to 10 times that of the myeloma cells.
  • the culture medium used for the cell fusion for example, RPMI1640 culture medium, MEM culture medium, and other ordinary culture medium used for cell culture of this type, which are suitable for the growth of the myeloma cell line, can be used.
  • a serum replacement solution such as fetal calf serum (FCS) can be used in combination.
  • a predetermined amount of the immune cells and myeloma cells are mixed well in the culture medium, and a PEG solution previously heated to about 37 ° C., for example, a PEG solution having an average molecular weight of about 1000 to 6000 is prepared.
  • a PEG solution previously heated to about 37 ° C.
  • a PEG solution having an average molecular weight of about 1000 to 6000 is prepared.
  • the desired fused cells are formed by adding and mixing at a concentration of 30-60% (w / v). Subsequently, by repeatedly adding an appropriate culture solution and centrifuging to remove the supernatant, a cell fusion agent or the like that is unfavorable for hybridoma growth can be removed.
  • the hybridoma can be prepared by using a conventional selective culture medium, for example, a HAT culture medium (a culture medium containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine). Selected by culturing. Culture in the HAT culture medium is continued for a period of time sufficient to kill cells other than the target hybridoma (non-fused cells), usually several days to several weeks. Next, a conventional limiting dilution method is performed to perform screening and closing of hybridomas producing the desired antibody.
  • a conventional selective culture medium for example, a HAT culture medium (a culture medium containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine). Selected by culturing. Culture in the HAT culture medium is continued for a period of time sufficient to kill cells other than the target hybridoma (non-fused cells), usually several days to several weeks.
  • a conventional limiting dilution method is performed to perform screening and closing of hybridomas producing the desired antibody.
  • sensitizing B lymphocyte is obtained by sensitizing human lymphocyte in vitro with a desired antigen protein or an antigen-expressing cell.
  • a desired antigen protein or an antigen-expressing cell can be fused with a human myeloma cell, for example, U266, to obtain a desired human antibody having a binding activity to a desired antigen or an antigen-expressing cell (see Japanese Patent Publication No. 1-59878).
  • an antigen or an antigen-expressing cell may be administered to a transgenic animal having a human antibody gene repertoire to obtain a desired human antibody according to the method described above (International Patent Application Publication No. 93). / 12227, W092 / 03918, W094 / 02602, W094 / 25585, W096 / 34096, W096 / 33735).
  • the hybridoma producing the monoclonal antibody thus produced can be subcultured in a normal culture solution, and can be stored for a long time in liquid nitrogen.
  • a method of culturing the hybridoma according to an ordinary method and obtaining the culture supernatant, or transferring the hybridoma to a mammal compatible therewith A method of administering the substance, growing it, and obtaining it as ascites is employed.
  • the former method is suitable for obtaining high-purity antibodies, while the latter method is suitable for mass production of antibodies.
  • the production of a hybridoma producing an anti-IL-6 receptor antibody can be performed by the method disclosed in JP-A-3-139293.
  • the Institute of Life Science and Industrial Technology, the Institute of Industrial Science and Technology (1-1-3 Higashi, Tsukuba, Ibaraki Prefecture) On July 10, 2002, a PM-1 antibody-producing hybridoma, which was internationally deposited under FERM BP-2998 under the Swine Treaty, was injected into the abdominal cavity of BALB / c mice to obtain ascites.
  • a method for purifying the PM-1 antibody from the ascites fluid and a method for purifying this hybridoma in an appropriate medium, for example, RPMI1640 medium containing 10% fetal calf serum and 5% B M-Condimed HI (Boehringer Mannheim), hybridoma Culture can be performed in an SFM medium (GIBC0-BRL), PFHM-II medium (GIBC0-BRL), etc., and the PM-1 antibody can be purified from the culture supernatant.
  • an appropriate medium for example, RPMI1640 medium containing 10% fetal calf serum and 5% B M-Condimed HI (Boehringer Mannheim)
  • hybridoma Culture can be performed in an SFM medium (GIBC0-BRL), PFHM-II medium (GIBC0-BRL), etc., and the PM-1 antibody can be purified from the culture supernatant.
  • a recombinant antibody produced as a monoclonal antibody by cloning an antibody gene from a hybridoma, incorporating the antibody gene into an appropriate vector, introducing this into a host, and using gene recombination technology is described.
  • a recombinant antibody produced as a monoclonal antibody by cloning an antibody gene from a hybridoma, incorporating the antibody gene into an appropriate vector, introducing this into a host, and using gene recombination technology is described.
  • mRNA encoding the variable (V) region of the antibody is isolated from cells producing the antibody of interest, such as a hybridoma. Isolation of mRNA can be performed by known methods, for example, guanidine ultracentrifugation (Chirgwin, JM et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299), AGPC method (Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159), etc., and prepare mRNA using mRNA Purification Kit (Pharmacia). Also, mRNA can be directly prepared by using the QuickPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia).
  • cDNA for the antibody V region is synthesized using reverse transcriptase.
  • cDNA can be synthesized using AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit or the like.
  • To perform cDNA synthesis and amplification use the 5, -Ampli FINDER RACE Kit (Clontech) Acad. Sci. USA (1988) 85, 8998-9002; Belyavsky, A. et al., Nucleic Ac (Frohman, MA et al., Proc. Natl. Acad. (1989) 17, 2919-2932) can be used. Purify the target DNA fragment from the obtained PCR product and ligate it to vector DNA.
  • a recombinant vector is prepared from this, and introduced into E. coli or the like, and a colony is selected to prepare a desired recombinant vector.
  • the nucleotide sequence of the target DNA is confirmed by a known method, for example, the Doxy method.
  • DNA encoding the V region of the desired antibody is obtained, it is ligated to the DNA encoding the desired antibody constant region (C region) and inserted into an expression vector.
  • DNA encoding the V region of the antibody may be incorporated into an expression vector containing the DNA of the C region of the antibody.
  • the antibody gene is incorporated into an expression vector so as to be expressed under the control of an expression control region, for example, an enhancer or a promoter, as described later.
  • a host cell can be transformed with this expression vector to express an antibody.
  • a gene set artificially modified for the purpose of, for example, reducing the antigenicity to humans is reduced.
  • Recombinant antibodies for example, chimeric antibodies and humanized antibodies can be used. These modified antibodies can be produced using known methods.
  • Chimeric antibodies are produced by linking DNA encoding the antibody V region obtained as described above to DNA encoding the human antibody C region, incorporating the DNA into an expression vector, and introducing the resulting DNA into a host.
  • a chimeric antibody useful in the present invention can be obtained.
  • plasmids containing DNA encoding the V regions of the L chain and H chain of the chimeric PM-1 antibody are named pPM-k3 and pPM-hi, respectively.
  • Industrial and Marine Bacteria Limited [This, February 11, 1991, has been deposited internationally under the Budapest Treaty as NC 1MB 40366 and NCIMB 40362, respectively.
  • the humanized antibody is also called a reshaped human antibody, and is obtained by transplanting the complementarity-determining regions (CDRs) of a non-human mammal, for example, a mouse antibody, into the complementarity-determining regions of the human antibody.
  • CDRs complementarity-determining regions
  • the general method of gene recombination is also known (see European Patent Application Publication No. EP 125023, International Patent Application Publication No. WO 92-19759).
  • a DNA sequence designed to link the CDR of a mouse antibody and the framework region (FR) of a human antibody was prepared by forming several DNA fragments having an overlapping portion at the end. Synthesized from the oligonucleotide by PCR. The obtained DNA is ligated to DNA encoding the human antibody C region, then inserted into an expression vector, and introduced into a host to produce it (European Patent Application Publication No. EP 239400; (See Application Publication No. W0 92-19759).
  • the FRs of the human antibody linked via the CDR are selected so that the complementarity-determining region forms a favorable antigen-binding site. If necessary, amino acids in the framework region of the variable region of the antibody may be substituted so that the complementarity determining region of the reshaped human antibody forms an appropriate antigen-binding site (Sato, K. et al. , Cancer Res. (1993) 53, 851-856).
  • the human antibody C region is used for chimeric antibodies and humanized antibodies. Is a human antibody C region, C y can be mentioned, for example, may be used C y l, Cy 2, Cy 3 or C Y 4. In addition, antibodies or antibodies The human antibody C region may be modified in order to improve the stability of the production of the antibody.
  • a chimeric antibody is composed of the variable region of an antibody derived from a mammal other than human and a C region derived from a human antibody.
  • a humanized antibody is derived from the complementarity determining region of an antibody derived from a mammal other than human and a human antibody It is composed of a framework region and a C region, and has reduced antigenicity in a human body, and thus is useful as an antibody used in the present invention.
  • Preferred specific examples of the humanized antibody used in the present invention include a humanized PM-1 antibody (see International Patent Application Publication No. WO92-19759).
  • the antibody gene constructed as described above can be expressed and obtained by a known method.
  • expression should be carried out using a useful useful promoter commonly used, an antibody gene to be expressed, a DNA having a polyA signal operably linked to its 3 'downstream, or a vector containing the same.
  • the promoter Z enhancer includes a human cytomegalovirus immediate early promoter / enhancer.
  • virus promoters such as retrovirus, poliovirus, adenovirus, and simian virus 40 (SV40).
  • SV40 simian virus 40
  • HEF1a human cell-derived motor enhancers
  • the method of Mulligan et al. (Mulligan, R. et al., Ature (1979) 277, 108-114), and the method using the HEFla promoter / enhancer, may be used.
  • it can be easily carried out according to the method of Mizushima et al. (Mizushima, S. and Nagata, S. Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322).
  • expression can be performed by operably linking a useful promoter commonly used, a signal sequence for antibody secretion, and an antibody gene to be expressed.
  • the promoter include a lacZ promoter and an araB promoter.
  • the lacZ promoter the method of Ward et al. (Ward, ES et al., Nature (1989) 341, 544-546; Ward, ES et al. FASEB J. (1992) 6, 242 2-2427),
  • the araB promoter the method of Better et al. (Better, M. et al. Science (1988) 240, 1041-1043) may be used.
  • the pelB signal sequence (Lei, SP et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379-4383) may be used when E. coli is produced in the periplasm. After isolating the antibody produced in the periplasm, the antibody structure is appropriately refolded and used (see, for example, W096 / 30394).
  • the expression vectors are selected as selectable markers: aminoglycoside phosphotransferase (APH) gene, thymidine kinase (TK) gene, Escherichia coli xanthinguanine phosphoribosinoletransferase (Ecogpt) gene, dihydrofolate reductase (dhfr) It can contain genes and the like.
  • APH aminoglycoside phosphotransferase
  • TK thymidine kinase
  • dhfr dihydrofolate reductase
  • any production system can be used.
  • Production systems for antibody production are in vitro and in V There is an ivo production system.
  • Examples of the in vitro production system include a production system using eukaryotic cells and a production system using prokaryotic cells.
  • animal cells When eukaryotic cells are used, there are production systems using animal cells, plant cells, or fungal cells.
  • animal cells include (1) mammalian cells, such as CH0, COS, myeloma, BHK (baby hamster kidney), HeLa, Vero, etc., (2) amphibian cells, such as African omega oocytes, or (3) ) Insect cells such as sf9, sf21, and Tn5 are known.
  • Known plant cells are those derived from Nicotiana tabacum (Nicotiana ta bacum), which can be callus cultured.
  • Fungal cells include yeast, for example, the genus Saccharomyces, for example, Saccharomyces cerevisiae, filamentous fungi, for example, the genus Aspergillus, for example, Aspergillus niger ).
  • E. coli Escherichia coli
  • Bacillus subtilis Bacillus subtilis
  • An antibody can be obtained by introducing a desired antibody gene into these cells by transformation and culturing the transformed cells in vitro. Culture is performed according to a known method. For example, DMEM, MEM, RPMI1640, IMDM can be used as a culture solution, and a serum supplement such as fetal calf serum (FCS) can be used in combination.
  • FCS fetal calf serum
  • antibodies may be produced in vivo by transferring cells into which the antibody gene has been introduced into the peritoneal cavity of animals.
  • examples of in vivo production systems include production systems using animals and production systems using plants. When using animals, there are production systems using mammals and insects.
  • Silkworms can be used as insects.
  • tobacco can be used.
  • An antibody gene is introduced into such an animal or plant, and the antibody is produced and recovered in the animal or plant.
  • an antibody gene is inserted into a gene encoding a protein that is uniquely produced in milk, such as goat jS casein, to prepare a fusion gene.
  • a DNA fragment containing the fusion gene into which the antibody gene has been inserted is injected into a goat embryo, and the embryo is introduced into a female goat.
  • the desired antibody is obtained from milk produced by the transgenic goat born from the goat that has received the embryo or its progeny.
  • hormones may be used in the transgenic goat to increase the amount of milk containing the desired antibody produced from the transgenic goat.
  • the silkworm is infected with a paculovirus into which the antibody gene of interest has been introduced, and a desired antibody is obtained from the body fluid of the silkworm (Maeda, S. et al., Nature (1985) 315, 592). -594).
  • the desired antibody gene is inserted into a plant expression vector, for example, pMON530, and this vector is introduced into a pacteria such as Agrobacterium tumefa ciens.
  • the bacterium is infected with tobacco, for example, Nicotiana tabacum, to obtain the desired antibody from the leaves of the tobacco (Julian, K.-C..Ma et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24, 24). 131-138).
  • DNA encoding the antibody heavy chain (H chain) or light chain (L chain) is separately incorporated into an expression vector, and the host is used simultaneously. May be transformed, Alternatively, the host may be transformed by incorporating DNAs encoding the H chain and the L chain into a single expression vector (see International Patent Application Publication No. WO94-11523). .
  • the antibody used in the present invention may be an antibody fragment or a modified product thereof as long as it can be suitably used in the present invention.
  • antibody fragments include Fab, F (ab ') 2, Fv, or a single chain Fv (scFv) in which Fvs of an H chain and an L chain are linked by an appropriate linker.
  • an antibody is treated with an enzyme, for example, papine or pepsin, to generate an antibody fragment, or a gene encoding these antibody fragment is constructed, and after introducing the gene into an expression vector, (See, eg, Co, MS et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976, Better, M. & Horwitz, AH Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496, Plueckthun, A. & Skerra, A. Methods in Enzymolog 989) 178, 476-496, Lamoyi, E., Methods in Enzymology (1989) 121, 652-663, Rousseaux, J. et al., Metho ds in Enzymology (1989) 121, 663-669, Bird, RE et al., TI BTECH (1991) 9, 132-137) 0
  • scFv can be obtained by linking the H chain V region and L chain V region of the antibody.
  • the H chain V region and the L chain V region are linked via a linker, preferably a peptide linker (Huston, J.S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 5879-5883).
  • the H chain V region and the L chain V region in the scFv may be derived from any of the antibodies described above.
  • the peptide linker that connects the V regions for example, an arbitrary single-chain peptide consisting of amino acid residues 12 to 19 is used.
  • the DNA encoding scFv includes DNA encoding the H chain or H chain V region, and DNA encoding the L chain or L chain V region of the antibody.
  • the DNA portion encoding the desired amino acid sequence of those sequences is amplified by PCR using primer pairs defining both ends thereof, and then a portion of the peptide linker is further amplified. It can be obtained by combining and amplifying a pair of primers that define the DNA to be ligated and both ends thereof to be linked to H and L chains, respectively.
  • DNAs encoding-and scFv are prepared, an expression vector containing them and a host transformed by the expression vector can be obtained according to a conventional method.
  • the scFv can be obtained by a conventional method using a host.
  • antibody fragments can be obtained and expressed in the same manner as described above, and can be produced by a host.
  • the “antibody” in the claims of the present application also includes fragments of these antibodies.
  • an antibody conjugated with various molecules such as polyethylene glycol (PEG) can also be used.
  • PEG polyethylene glycol
  • the “antibody” referred to in the claims of the present application also includes these modified antibodies.
  • Such a modified antibody can be obtained by subjecting the obtained antibody to chemical modification. These methods are already established in this field.
  • the antibody produced and expressed as described above can be separated from the host inside and outside the cell and from the host and purified to homogeneity. Separation and purification of the antibody used in the present invention can be performed by affinity chromatography. Columns used for abundance chromatography include, for example, a protein A column and a protein G column. Examples of the carrier used for the protein A column include Hyper D, P0R0S, Separose F.F., and the like. In addition, separation and purification methods used for ordinary proteins may be used, and there is no limitation. For example, the antibodies used in the present invention can be separated and purified by appropriately selecting and combining chromatography other than affinity chromatography, filters, ultrafiltration, salting out, dialysis, and the like. Wear.
  • chromatography examples include ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, and gel filtration. These chromatographs are applied and protected by High Performance Liquid Chromatography (HPLC). Alternatively, reverse liner HPL (rever se phas e HP LC) may be used.
  • HPLC High Performance Liquid Chromatography
  • the determination of the antibody obtained above can be performed by measuring the absorbance or ELISA. That is, in the case of measuring the absorbance, after appropriately diluting with PBS (-), measure the absorbance at 280 nm, and calculate 1 mg / ml as 1.350D.
  • measurement can be performed as follows. That is, 100 ⁇ l of goat anti-human IgG (manufactured by TAG0) diluted to 1 ⁇ g / ml with 0.1 M bicarbonate buffer ( ⁇ 9.6) was added to a 96-well plate (manufactured by Nunc), and 4 ° Incubate with C to solidify the antibody. After blocking, add appropriately diluted samples containing the antibody or antibody used in the present invention, or human IgG (manufactured by CAPPEL) 100 / xl as a standard, and incubate at room temperature for 1 hour. On.
  • the modified IL-6 used in the present invention is a substance that has an activity of binding to an IL-6 receptor and does not transmit a biological activity of IL-6. That is, the IL-6 variant competitively binds IL-6 to the IL-6 receptor, but does not transmit the biological activity of IL-6, and thus blocks signal transduction by IL-6.
  • the IL-6 variant is produced by introducing a mutation by substituting an amino acid residue in the amino acid sequence of IL-6.
  • IL-6, which is the source of the modified IL-6 may be of any origin, but preferably human IL-6 in consideration of antigenicity and the like.
  • the amino acid sequence of IL-6 can be obtained by using a known molecular modeling program, for example, WHATIF (Vriend et al., J. MoI. Graphics (1990) 8, 52-56). This is done by predicting its secondary structure and assessing its effect on the overall substituted amino acid residue. After determining an appropriate substituted amino acid residue, the amino acid is replaced by a conventional PCR method using a setter containing a nucleotide sequence encoding the human IL-6 gene as a type II. By introducing such a mutation, a gene encoding a modified IL-6 can be obtained. This can be incorporated into an appropriate expression vector as needed, and an IL-6 variant can be obtained according to the above-mentioned recombinant antibody expression, production and purification methods.
  • a known molecular modeling program for example, WHATIF (Vriend et al., J. MoI. Graphics (1990) 8, 52-56). This is done by predicting its secondary structure and assessing its effect on the overall
  • IL-6 variants include Brakenhoff et al., J. Biol. Chem. (1994) 269, 86-93, and Savino et al., EMBO J. (1994) 13, 1357-1367. WO 96-18648, W096- 17869.
  • the IL-6 partial peptide or IL-6 receptor partial peptide used in the present invention has an activity of binding to an IL-6 receptor or IL-6, respectively, and has a biological activity of IL-6.
  • a substance that does not transmit activity That is, the IL-6 partial peptide or IL-6 receptor partial peptide binds to IL-6 receptor or IL-6, and captures these to bind IL-6 to I6 receptor. Specifically inhibits As a result, it does not transmit the biological activity of IL-6 and thus blocks signal transduction by I-6.
  • IL-6 partial peptide or IL-6 receptor partial peptide is a part of the region involved in binding between IL-6 and IL-6 receptor in the amino acid sequence of IL-6 or IL-6 receptor. Alternatively, it is a peptide consisting of the entire amino acid sequence. This Such peptides usually consist of 10 to 80, preferably 20 to 50, more preferably 20 to 40 amino acid residues.
  • the IL-6 partial peptide or IL-6 receptor partial peptide defines a region related to the binding between IL-6 and IL-6 receptor in the amino acid sequence of IL-6 or IL-6 receptor. Speci? Cally, a part or all of the amino acid sequence can be prepared by a generally knoWn method, for example, a genetic engineering method or a peptide synthesis method.
  • an IL-6 partial peptide or an IL-6 receptor partial peptide by a genetic engineering method, a DNA sequence encoding a desired peptide is incorporated into an expression vector, and the recombinant antibody is prepared. It can be obtained according to expression, production and purification methods.
  • a method usually used in peptide synthesis for example, a solid phase synthesis method or a liquid phase synthesis method Method can be used.
  • an amino acid corresponding to the C-terminus of the peptide to be synthesized is bound to a support that is insoluble in an organic solvent, and the amino acid and the side chain functional group are appropriately synthesized.
  • Reaction of amino acids protected by various protecting groups one by one in the order from the C-terminus to the N-terminus and the protecting group of the amino group of amino acids or peptides bound on the resin.
  • a method of extending a peptide chain by alternately repeating the elimination reaction is used.
  • Solid phase peptide synthesis methods are broadly classified into the Boc method and the Fmoc method according to the type of protecting group used. .
  • a deprotection reaction and a cleavage reaction of the peptide chain from the support are performed.
  • hydrogen fluoride or trifluoromethanesulfone is used in the Boc method.
  • Acid and TFA can be usually used in the Fmoc method.
  • the Boc method for example, the above-mentioned protective peptide resin is treated in hydrogen fluoride in the presence of anisol.
  • the protecting group is removed and the peptide is cleaved from the support to recover the peptide. By freeze-drying this, a crude peptide can be obtained.
  • a deprotection reaction and a cleavage reaction of a peptide chain from a support can be carried out by, for example, the same operation as described above in TFA.
  • the obtained crude peptide can be separated and purified by applying to HPLC.
  • the elution may be performed under optimal conditions using a water-acetonitrile solvent commonly used for protein purification.
  • the fraction corresponding to the peak of the obtained chromatographic profile is collected and lyophilized.
  • the peptide fraction purified in this way is identified by mass spectrometry molecular weight analysis, amino acid composition analysis, amino acid sequence analysis, or the like.
  • partial IL-6 peptide and the partial IL-6 receptor peptide are disclosed in JP-A-2-188600, JP-A-7-324097, JP-A-8-311098, and US Pat.
  • the IL-6 signaling inhibitory activity of the IL-6 antagonist used in the present invention can be evaluated by a commonly used method. Specifically, an IL-6-dependent human myeloma cell line (S6B45, KPMM2), a human T-lymphoma T lymphoma cell line KT3, or an IL-6-dependent cell line MH60. 6 was added, may be measured 3 H- thymidine incorporation IL- 6 dependent cell in the coexistence of the same time IL- 6 antagonists bets.
  • the treatment target in the present invention is a mammal.
  • the mammal to be treated is preferably human.
  • the agent for lowering blood face P-3 concentration and the agent for suppressing cartilage destruction of the present invention can be administered orally or parenterally systemically or locally.
  • intravenous injection such as infusion, intramuscular injection, intraperitoneal injection, subcutaneous injection, suppository, enema, oral enteric solution, etc. can be selected, and the appropriate administration method is selected according to the patient's age and symptoms be able to.
  • the effective dose is selected from a range of 0.01 mg / kg body weight / 100 mg / dose.
  • a dose of 1 to: L000 mg, preferably 5 to 50 mg per patient can be chosen.
  • a preferable dose and administration method is, for example, in the case of an anti-IL-6 receptor antibody, the effective dose is such that free antibodies are present in the blood.
  • 0.5 mg force 40 mg, preferably lmg to 20 mg per kg (4 weeks) per month divided into 1 to several times, for example, 2 times Z week, 1 time Z week, 1 time / 2 weeks, 1 time Z Intravenous injection such as infusion, subcutaneous injection, etc., in a dosing schedule such as 4 weeks.
  • the agent for lowering the blood band P-3 concentration and the agent for suppressing cartilage destruction of the present invention may contain a pharmaceutically acceptable carrier or additive depending on the administration route.
  • a pharmaceutically acceptable carrier or additive include water, pharmaceutically acceptable organic solvents, collagen, polyvinyl alcohol, polyvinyl alcohol, and the like.
  • Norepyrrolidone, force / repoxybininole polymer sodium carboxymethinoresenolerose sodium, sodium sodium polyacrylate, sodium alginate, water-soluble dextran, carboxymethyl starch sodium , Pectin, methinoresenorelose, etinoresenorelose, xanthan gum, gum arabic, casein, gelatin, agar, diglycerin, propylene glycol cornole, polyethylene glycol cornole, vaseline, paraffin, stearyl alcohol, stearyl Acid, human serum albumin
  • HSA HSA
  • mannitol mannitol
  • sorbitol sorbitol
  • ratatose surfactants acceptable as pharmaceutical additives.
  • surfactants acceptable as pharmaceutical additives.
  • the additives to be used are appropriately or in combination selected from the above depending on the dosage form, but are not limited thereto.
  • an IL-6 antagonist such as an anti-IL-6 receptor antibody causes the concentration in the body of a substance selected from the group consisting of MMP-3, MMP-1 and TIMP-1 to be increased, for example, blood concentration.
  • a drug containing IL-6 antagonist as an active ingredient for example, IL-6 antagonism
  • a cartilage destruction inhibitor or a therapeutic agent for osteoarthritis using the active ingredient as an active ingredient; It will be appreciated that the reagents used in the procedure are useful.
  • Methods for measuring MMP-3, MMP-1 and TIMP-1 in vivo or in vitro or reagents for the measurement are widely known in the art, and the known methods and reagents are known. And can be used for the purpose of the present invention.
  • the measurement of MMP-3, MMP-1 or TIMP-1 in a sample is performed using an anti-MMP antibody, an MMP inhibitor, or a compound having inhibitory activity against MMP family (including synthetic compounds).
  • a monoclonal antibody against Dragon P-3 is used.
  • antibody may be used in a broad sense, and may include a single monoclonal antibody to a desired substance or an antibody composition having specificity for various epitopes And also includes monovalent or multivalent antibodies as well as polyclonal and monoclonal antibodies, as well as native (intact) molecules and their fragments and derivatives.
  • Triome Triome
  • bispecific recombinant antibodies interspecies hybrid antibodies, anti-idiotypic antibodies, and chemically modified or Those which are considered to be derivatives of these by processing, etc., antibodies obtained by applying known cell fusion or hybridoma technology or antibody engineering, or using synthetic or semi-synthetic technology, and known from the viewpoint of antibody production.
  • Antibodies or binding properties that apply certain prior art techniques or that are prepared using DNA recombination techniques, have a neutralizing property with respect to the target antigenic substance or target epitope as defined and defined herein.
  • immunoassay using an antibody such as a monoclonal antibody against MMP-1 or an antibody such as a monoclonal antibody against TIMP-1 or the like be able to.
  • various methods including biochemical techniques such as measuring enzyme activity or inhibitory activity may be used.
  • any of competitive or non-competitive binding assays, direct and indirect sandwich assays, and immunoprecipitation assays may be used, as well as enzyme immunoassays, radioimmunoassays, fluorescent immunoassays, and biotin.
  • Labels known in the art such as metal particles such as avidin and gold colloid, coloring substances, and magnetic substances It may be based on any of the used assays.
  • a labeled antibody reagent such as a monoclonal antibody in which a substance to be measured is labeled with an enzyme or the like and an antibody bound to a carrier are sequentially reacted or simultaneously reacted. You can also do it.
  • the order in which the reagents are added depends on the type of carrier system chosen. If sensitized plastic beads or beads are used, a labeled antibody reagent such as a monoclonal antibody labeled with an enzyme is first placed in a suitable test tube together with a sample containing the substance to be measured. Put together, then add the sensitized plastic or other beads or place in the wells for measurement.
  • any form of solution, colloid solution, non-fluid sample, etc. can be used, but preferably a biological sample such as thymus, testis, Intestine, kidney, brain, breast cancer, ovarian cancer, colorectal cancer, blood, serum, plasma, synovial fluid, cerebrospinal fluid, saliva, amniotic fluid, urine, other body fluids, cell culture fluid, tissue culture fluid, tissue homogenate , Biopsy samples, tissues, cells and the like.
  • a biological sample such as thymus, testis, Intestine, kidney, brain, breast cancer, ovarian cancer, colorectal cancer, blood, serum, plasma, synovial fluid, cerebrospinal fluid, saliva, amniotic fluid, urine, other body fluids, cell culture fluid, tissue culture fluid, tissue homogenate , Biopsy samples, tissues, cells and the like.
  • MMP-3 measurement is described in, for example, Matrix, (1990) 10, 285-291, or JP-A-4-237499.
  • a technique suitable for measuring MMP-3 in a sample for example, a technique described in JP-A-4-237499 is exemplified.
  • MMP-1 measurement is described, for example, in Clin. Chim. Acta (1993) 219, 1-14, or Res. Com band. Mol. Pathol. Pharmacol. (1997) 95, 115-128. I have.
  • techniques suitable for measuring MMP-1 in a sample include, for example, those described in Clin. Chim. Acta (1993) 219, 1-14.
  • TIMP-1 measurement is described in, for example, J. Immunol. Methods (1990) 127,103-108, Matrix (1989) 9,1-6, or JP-A-63-210665.
  • examples of a technique suitable for measuring TIMP-1 in a sample include those described in JP-A-63-210665.
  • protease activity or inhibitor activity can be performed according to a usual measurement method, for example, by referring to the method described in Biochemistry (1993) 32, 4330-4337. .
  • various labels, buffer systems, and other appropriate reagents can also be used.
  • MMPs or the like can be treated with an activator such as mercury aminophenyl acetate, or their precursors or latent forms can be converted into active forms in advance.
  • an appropriate measurement system should be constructed by adding ordinary technical considerations of those skilled in the art to the usual conditions and operation methods in each method.
  • Humanized anti-I6 receptor antibody Humanized PM-1 antibody; consisting of L-chain version a and H-chain version f described in W092Z19759
  • Patients with rheumatoid arthritis for more than 2 months and 5 patients with Multicentric Castleman's Disease (CD) treated with MMP-1, -2, -3, Changes in blood levels of -7, -8 and -13 and TIMP-1 and -2 were examined.
  • anti-IL-6 receptor antibody lowers blood P-3 concentration and may be a cartilage destruction inhibitor and a therapeutic agent for osteoarthritis.
  • PCR was performed using the plasmid pBSF2R.236 containing the cDNA encoding the IL-6 receptor obtained according to the method of Yamasaki et al. (Yamasaki, K. et al., Science (1988) 241, 825-828). Thus, a soluble IL-6 receptor was prepared.
  • the plasmid pBSF2R.236 was digested with the restriction enzyme SphI to obtain an IL-6 receptor cDNA, which was introduced into mpl8 (Amersham).
  • the in vitro mitogeneesis system was used to perform IL-6 PCR. Mutations were introduced into the receptor cDNA. This procedure introduced a stop codon at amino acid 345, resulting in a cDNA encoding a soluble IL-6 receptor.
  • plasmid Ligation with pSV yielded plasmid pSVL344.
  • the soluble IL-6 receptor cDNA cut with HindIII-SalI was inserted into a plasmid pECEdhfr containing dhfr cDNA to obtain a CH0 cell expression plasmid pECEdhfr344.
  • the selected CH0 cells were screened by limiting dilution to obtain a single CH0 cell clone.
  • This CH0 cell clone was amplified with methotrexate at a concentration of 20 to 200 nM to obtain a human soluble IL-6 receptor-producing CH0 cell line 5E27.
  • the CH0 cell line 5E27 was cultured in Iscope modified Dulbecco's medium (IMDM, Gibco) containing 5% FBS. The culture supernatant was collected, and the concentration of soluble IL-6 receptor in the culture supernatant was measured by ELISA. As a result, it was confirmed that soluble IL-6 receptor was present in the culture supernatant.
  • IMDM Iscope modified Dulbecco's medium
  • mice were immunized with 10 ⁇ g of recombinant IL-6 (Hirano, T. et al., Immunol. Lett. (198 8) 17, 41) together with complete Freund's adjuvant, and anti-IL- This was continued weekly until 6 antibodies could be detected.
  • Immune cells were excised from the local lymph node and fused with myeloma cell line P3U1 using polyethylene glycol 1500. Using hybridomas in HAT culture medium, the method of Oi et al. (Selective Methods in Cellular Immunology, W.H. Freeman and Co., San Francisco, 351; 1980) to establish a hybridoma producing an anti-human IL-6 antibody.
  • the hybridoma producing anti-human IL-6 antibody was subjected to IL-6 binding assay as follows. That is, a 96-micron flexible mouth plate (Dynatech Laboratories, Inc., Alexandria, VA) made of a flexible poly-bubble was mixed with 100 ⁇ l of 0.1 M carbonate-hydrogen carbonate buffer solution (H 9.6). With goat anti-mouse Ig (10 ⁇ 1 / ml, Malvern, PA, manufactured by Cooper Biomedical, Inc.) at 4 ° C. The plate was then treated with 100 ⁇ l of PBS containing 1% serum albumin (BSA) at room temperature for 2 hours at room temperature.
  • BSA serum albumin
  • the anti-IL-6 antibody MH166 produced by the hybridoma has an IgGl ⁇ subtype.
  • MH60.BSF2 cells dispensed by Uni content becomes 1 X 10 4/200 ⁇ 1 / well, to which was added a sample containing MH166 antibody were cultured for 48 hours, 0.5 mu Ci / well of 3 H-thymidine (New England Nuclear, Boston, Mass.), And the culture was continued for another 6 hours.
  • the cells were treated with a glass filter paper (Kooki, Auto / Pubester (Labo Mash Science Co., Tokyo, Japan).) Using a heron anti-IL-6 antibody as a control was.
  • the MH166 antibody inhibited 3H-thymidine uptake of MH60.
  • Sepharose 4B Anti-IL-6 receptor antibody MT18 prepared by CNir activated by the method of Hirata et al. (Hirata, Y. et al. J. Immunol. (1989) 143, 2900-2906)). Pharmacia Fine Chemicals, Piscat away, NJ), and the IL-6 receptor (Yamasaki, K. et al., Science (1988) 241, 825-828) was purified.
  • the human myeloma cell line U266 was purified from lmM p-paraaminophenol methanesorephoninolephnochloride containing 1% digitonin (Wako Chemicals), 10 mM triethanolamine (pH 7.8) and 0.15 M NaCl.
  • BALB / c mice were immunized four times every 10 days with the above partially purified IL-6 receptor obtained from 3 ⁇ 10 9 U266 cells, and then a hybridoma was prepared by a conventional method.
  • the binding activity to the IL-6 receptor of the hybridoma culture supernatant from the growth positive hole was examined by the following method. 5 ⁇ 10 7 U266 cells were labeled with 35 S-methionine (2.5 mCi) and solubilized with the above digitonin buffer.
  • the solubilized U266 cells were mixed with a 0.04 ml volume of MT18 antibody conjugated to Sephose 4B beads, then washed six times with digitonin buffer, and 0.25 ml digitonin buffer (pH 3.
  • Antibodies produced from hybridoma PM-1 have an IgGl ⁇ subtype.
  • the activity of the antibody produced by hybridoma PM-1 to inhibit the binding of IL-6 to human IL-6 receptor was examined using a human myeloma cell line U266.
  • Human recombinant IL-6 was prepared from Escherichia coli (Hirano, T. et al., Immunol. Lett. (1988) 17, 41-45), and a Volton-Hunter reagent (New Engl and Nuclear, Boston, USA). were labeled with 125 I MA) (Taga, T. et al , J. Exp Med (1987%) 166, 967 - 981).
  • Hypridoma PM-1 inhibits the binding of IL-6 to the IL-6 receptor.
  • a monoclonal antibody against the mouse IL-6 receptor was prepared by the method described in Saito, T. et al., J. Immunol. (1991) 147, 168-173.
  • CH0 cells producing mouse soluble IL-6 receptor were cultured in IMDM medium containing 10% FCS, and the anti-mouse IL-6 receptor antibody RS12 (see Saito, T. et al above) was isolated from the culture supernatant. Fixed on Affigel 10 gel (Biorad) The mouse soluble IL-6 receptor was purified using the prepared ab-tee column.
  • mice soluble IL-6 receptor 50 was mixed with Freund's complete adjuvant and injected into the abdomen of Wistarrat. Two weeks later, they were boosted with Freund's incomplete adjuvant. On day 45, rat spleen cells were collected, and 2 ⁇ 10 8 cells were fused with 1 ⁇ 10 7 mouse myeloma cells P3U1 and 50% PEG1500 (manufactured by Boehringer Mannheim) in a conventional manner. The hybridoma was screened in the medium.
  • Hybridoma culture supernatant was added to a plate coated with a heron anti-rat IgG antibody (manufactured by Cappel), and reacted with mouse soluble IL-6 receptor.
  • hybridomas producing antibodies to the mouse soluble IL-6 receptor were screened by ELISA using a rabbit ego anti-mouse IL-6 receptor antibody and an alkaline phosphatase-labeled hidge anti-panther IgG.
  • Hybridoma clones for which antibody production was confirmed were screened twice to obtain a single hybridoma clone. This clone was named MR16-1.
  • MH60.BSF2 cells The neutralizing activity of the antibody produced by this hybridoma in the signaling of mouse IL-6 was determined using MH60.BSF2 cells (Matsuda, T. et al., J. Immunol. (1988) 18, 951-956). 3 H-thymidine incorporation was examined.
  • MH60.BSF2 cells were prepared in a 96-well plate at 1 ⁇ 10 4 cells / 200 ⁇ l / well.
  • the plates with mouse IL-6 of 10pg / ml MR1 6 - 1 antibody or RS12 antibody added 12.3 ⁇ 1000ng / ml and 37 ° C, in 5% C02 after incubation for 44 hours, 3 H thymidine l Ci / Ueru was added. Four hours later, 3 H thymidine incorporation was measured.
  • the MR16-1 antibody suppressed 3 H-thymidine uptake in MH60 .BSF2 cells.
  • hybridoma MR16-1 (FERM BP-5875) produces The antibody was shown to inhibit the binding of IL-6 to the IL-6 receptor.
  • IL-6 antagonists such as anti-I-6 receptor antibody have a blood MMP-3 concentration lowering effect. Therefore, it was revealed that I-antagonist is useful as an agent for lowering blood MMP-3 concentration, as a cartilage destruction inhibitor and as a therapeutic agent for Z or osteoarthritis.

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Description

明 細 書
I L— 6アンタゴニス トを有効成分と して含有する血中匪 P- 3濃度 低下剤 発明の分野
本発明はィンターロイキン- 6 (IL-6) アンタゴニス トを有効成分 として含有する血中匪 P- 3濃度低下剤および軟骨破壌抑制剤等に関 する。 背景技術
IL- 6は B 細胞刺激因子 2 (BSF2)あるいはィ ンターフェロン 32 と も呼称されたサイ ト力イ ンである。 IL- 6は、 B リ ンパ球系細胞の活 性化に関与する分化因子と して発見され （Hirano, T. et al. , Nat ure (1986) 324, 73-76 ) 、 その後、 種々の細胞の機能に影響を及 ぼす多機能サイ ト力イ ンであることが明らかになった （Akira, S. et al. , Adv. in Immunology (1993) 54, 1-78) 。 IL- 6は、 T リ ン パ球系細胞の成熟化を誘導することが報告されている （Lotz, M. e t al. , J. Exp. Med. (1988) 167, 1253-1258) 。
IL - 6は、 細胞上で二種の蛋白質を介してその生物学的活性を伝達 する。 一つは、 IL- 6が結合する分子量約 80kDのリガンド結合性蛋白 質の IL-6受容体である （Taga， T. et al. , J. Exp. Med. (1987) 1 66, 967-981, Yamasaki, K. et al. , Science (1987) 241, 825-82 8)。 IL- 6受容体は、 細胞膜を貫通して細胞膜上に発現する膜結合型 の他に、 主にその細胞外領域からなる可溶性 IL- 6受容体としても存 在する。
も う一つは、 非リガンド結合性のシグナル伝達に係わる分子量約 130kD の膜蛋白質 gpl30 である。 IL- 6と Iい 6受容体は IL- 6/IL-6受 容体複合体を形成し、 次いで gP130 と結合することにより、 IL - 6の 生物学的活性が細胞内に伝達される （Taga, T. et al.， Cell (198 9) 58, 573-581) 0
IL-6ァンタゴニス トは、 IL-6の生物学的活性の伝達を阻害する物 質である。 これまでに、 IL-6に対する抗体 （抗 IL-6抗体） 、 IL-6受 容体に対する抗体 （抗 IL- 6受容体抗体） 、 gpl30 に対する抗体 （抗 gP130 抗体） 、 IL- 6改変体、 IL-6又は IL-6受容体部分ペプチド等が 知られている。
抗 IL-6受容体抗体に関しては、 いくつかの報告がある （Novick, D. et al.， Hybridoma (1991) 10, 137-146 、 Huang, Y. W. et al -， Hybridoma (1993) 12, 621-630 、 国際特許出願公開番号 WO 95 - 09873 、 フランス特許出願公開番号 FR 2694767、 米国特許番号 US 5 21628 ) 。 その一つであるマウス抗体 PM- 1 (Hirata, Y. et al. , J . Immunol. (1989) 143, 2900-2906) の相捕性決定領域 （CDR; com plementar ity determining region ) をヒ ト 几体へ移植することに よ り得られたヒ ト型化 PM- 1抗体が知られている （国際特許出願公開 番号 W0 92-19759 ) 。
慢性関節リ ウマチ （RA) や変形性関節症 （OA) による関節軟 骨破壌は、 種々の因子の複合作用により、 1 ) 軟骨細胞死、 2 ) 軟 骨細胞外マト リ ックス （Extracellular Matrix, ECM) 分解亢進、 3 ) 軟骨 ECM産生低下、 が生じることによ り進行する。 近年、 ECMの 分解亢進を行う蛋白分解酵素の中で MMPが特に注目されている。
MMPは好中球エラスターゼ、 カテブシン Gとともに重要な ECM分解 酵素であり、 MMP遺伝子フアミ リーと しては現在までに約 2 0種類 の分子種が報告されている。 これらの MMPはコラゲナーゼ群 （MMP - 1 ，MMP-8，MMP-13) 、 ゼラチナーゼ群 （MMP- 2，MMP- 9) 、 ス ト ロムライ シン群 ( MMP-3 , MMP-10) 、 膜型 MMP群 ( MMP-14 , ΜΜΡ-15 , ΜΜΡ-16 , ΜΜΡ- 17) 、 その他の ΜΜΡ ( ΜΜΡ-7，ΜΜΡ-11，ΜΜΡ- 12，ΜΜΡ- 19 , ΜΜΡ- 20など） な どに分類される。 ここでス ト ロムライシン群 （MMP- 3，ΜΜΡ-10) はプ 口テオダリ カン、 ΠΙ型、 IV型、 K型コラーゲン、 ラ ミニン、 フイブ ロネクチンなどを分解し、 ΜΜΡの中でも最も広い基質特異性を持つ
R Α患者の関節液中には、 高値の！！！^-；！^ ^ ^が存在し、 また R A関節滑膜細胞や、 非パンヌス部の関節軟骨組織では画 P- 1，2，3， 9 , MT1- MMPの発現が認められている。 これらのデータから特に R A における関節軟骨破壌には MMPによる ECM分解が重要な役割を果たし ていると考えられる。 しかし、 これとは対照的に R A滑膜は MMPの 標的組織とはならないことも知られている。
また、 ほとんどの O A関節軟骨は MMP-3陽性を示すこ と、 O A関 節軟骨組織を培養し分泌された匪 P- 3活性は正常軟骨群よ り有意に 高値であるこ となどの事実よ り O Aにおける軟骨破壊にも MMP- 3が 重要な役割をしているものと考えられている。 また、 MMP - 3は若年 性関節リ ゥマチ、 成人型スチル病などでも重要な役割を果たしてい る と考えられており、 MMP- 3の作用の抑制によ り これらの疾患の症 状が改善されるものと考えられる。
MMP-3はそれ自身が軟骨プロテオダリ カン （ァダリ カン） を分解 するこ とは多く の報告によ り広く知られており、 ァグリ カンコア蛋 白の分解活性は MMPの中でも MMP- 3が最も強いと されている。 さ らに 、 MMPは潜在型 MMPと して存在し、 プロペプチ ドの切断によ り活性型 MMPに変換されるこ とが知られているが、 活性型 MMP - 3は潜在型の MM P- 1，7，8 , 9を完全なレベルにまで活性化するという働きを有するこ とからも注目 されている。 MMP-3は R Aと O A関節組織で発現され るが、 その産生量は R Aの方が〇 Aよ り高値であり 、 多関節発症の R Aでは血中レベルの MMP-3値の上昇は O Aとの鑑別に有用である ことが知られている。 すなわち血清中 MMP - 3のレベルは R A滑膜炎 の指標となる。
MMP-3の発現は、 IL- 1、 TNF-ひ、 EGF、 b FGFなどで誘導され、 レ チノイン酸、 ダルココルチコイ ド、 TGF- j8などで抑制されることが 知られているが IL- 6との関連については何ら報告されていない。 抗 IL- 6受容体抗体などの IL-6アンタゴ-ス トは滑膜細胞の異常な 増殖を抑制することによ り リ ウマチの症状を改善することが報告さ れている （W096/11020) カ 、 IL-6アンタゴニス ト特に抗 IL-6受容体 抗体がリ ゥマチ患者において軟骨破壌の主要な酵素である MMP- 3の 血中濃度を低下させることは知られていなかった。 発明の開示
本発明は、 血中 MMP-3濃度低下剤および軟骨破壊抑制剤、 さらに は、 該低下剤および Zまたは、 該抑制剤の効果の検出 · 評価 ·判定 方法およびそれに使用される試薬を提供しよ う とするものである。 発明者は、 抗 IL- 6受容体抗体などの IL-6ァンタゴニス トが MMP - 3 、 MMP_1、 および Ti s sue Inhibi tor of Metal l oprot e inases-l (l ιΜ P-l )、 特に MMP- 3の血中濃度を低下させることを見出し本発明を完 成した。
すなわち、 本発明は、 （ 1 ) IL-6アンタゴニス トを有効成分と し て含有する血中匪 P- 3濃度低下剤および軟骨破壊抑制剤を提供する 本発明はまた、 （ 2 ) IL-6受容体に対する抗体を有効成分として 含有する血中匪 P-3濃度低下剤および軟骨破壌抑制剤を提供する。 本発明はまた、 （ 3 ) IL-6受容体に対するモノ ク ローナル抗体を 有効成分と して含有する血中匪 P-3濃度低下剤および軟骨破壌抑制 剤を提供する。
本発明はまた、 （ 4 ) ヒ ト IL-6受容体に対するモノ ク ローナル抗 体を有効成分として含有する血中匪 P- 3濃度低下剤および軟骨破壊 抑制剤を提供する。 ヒ ト IL- 6受容体に対するモノク口ーナル抗体は 、 好ましくは PM-1抗体である。
本発明はまた、 （ 5 ) マウス IL- 6受容体に対するモノ ク ローナル 抗体を有効成分と して含有する血中匪 P-3濃度低下剤および軟骨破 壊抑制剤を提供する。 マウス IL- 6受容体に対するモノクローナル抗 体は、 好ましくは MR16- 1抗体である。
本発明はまた、 （ 6 ) IL-6受容体に対する組換え型抗体を有効成 分として含有する血中匪 P- 3濃度低下剤および軟骨破壊抑制剤を提 供する。 IL-6受容体に対する組換え型抗体は、 好ましく はヒ ト抗体 定常領域 （C 領域） を有する。
本発明はまた、 （ 7 ) IL- 6受容体に対するキメラ抗体又はヒ ト型 化抗体を有効成分として含有する血中匪 P- 3濃度低下剤および軟骨 破壊抑制剤を提供する。
本発明はまた、 （ 8 ) ヒ ト型化 PM - 1抗体を有効成分と して含有す る血中 MMP- 3濃度低下剤および軟骨破壊抑制剤を提供する。
本発明はまた、 ィンターロイキン- 6 ( IL-6) アンタゴニス トを有 効成分と して含有する変形性関節症治療剤を提供する。
本発明はまた、 MMP - 3 、 MMP-1 及び TIMP-1から成る群から選ばれ たものの、 特に匪 P- 3の体内濃度、 例えば血中濃度などを指標とす ることにより、 IL-6アンタゴニス トを有効成分と した薬剤、 例えば IL - 6アンタゴニス トを有効成分とした軟骨破壊抑制剤あるいは変形 性関節症治療剤などの効果 （例えば治療効果など） にっき、 その検 出 · 評価 ' 判定のいずれかを行う方法、 及びそれに使用される試薬 を提供する。 図面の簡単な説明
図 1は、 8名のリ ウマチ患者における、 ヒ ト型化 IL- 6受容体抗体 を投与した後の、 血中 MMP-1の経時変化を示すダラフである。
図 2は、 8名のリ ウマチ患者における、 ヒ ト型化 IL-6受容体抗体 を投与した後の、 血中 MMP- 3の経時変化を示すダラフである。
図 3は、 8 .名のリ ウマチ患者における、 ヒ ト型化 IL- 6受容体抗体 を投与した後の、 血中 TIMP- 1の経時変化を示すダラフである。
図 4は、 5名の CD患者における、 ヒ ト型化 IL- 6受容体抗体を投与 した後の、 血中 MMP-1の経時変化を示すダラフである。
図 5は、 5名の CD患者における、 ヒ ト型化 IL-6受容体抗体を投与 した後の、 血中 MMP- 3の経時変化を示すグラフである。
図 6は、 5名の CD患者における、 ヒ ト型化 IL- 6受容体抗体を投与 した後の、 血中 TIMP- 1の経時変化を示すグラフである。 発明の実施の形態
本発明で使用される IL- 6アンタゴニス トは、 血中 MMP-3濃度低下 効果および Zまたは軟骨破壌抑制効果を示すものであれば、 その由 来、 種類および形状を問わない。
IL- 6アンタゴニス トは、 IL - 6によるシグナル伝達を遮断し、 IL - 6 の生物学的活性を阻害する物質である。 IL-6アンタゴニス トは、 好 ましく は Iい 6、 Iい 6受容体及び gpl30 のいずれかの結合に対する阻 害作用を有する物質である。 IL- 6アンタゴ-ス ト と しては、 例えば 抗 IL- 6抗体、 抗 IL- 6受容体抗体、 抗 gpl30 抗体、 IL-6改変体、 对溶 性 IL-6受容体改変体あるいは IL- 6又は IL- 6受容体の部分べプチドぉ よび、 これらと同様の活性を示す低分子物質が挙げられる。
本発明で使用される抗 IL- 6抗体は、 公知の手段を用いてポリ クロ ーナル又はモノク口一ナル抗体として得ることができる。 本発明で 使用される抗 IL-6抗体として、 特に哺乳動物由来のモノ ク ローナル 抗体が好ましい。 哺乳動物由来のモノ ク ローナル抗体としては、 ノヽ イブリ ドーマに産生されるもの、 および遺伝子工学的手法により抗 体遺伝子を含む発現べクターで形質転換した宿主に産生されるもの がある。 この抗体は IL- 6と結合することによ り、 IL-6の Iい 6受容体 への結合を阻害して IL-6の生物学的活性の細胞内への伝達を遮断す る。
このような抗体と しては、 MH166 (Matsuda, T. et al. , Eur. J. Immunol. (1988) 18， 951-956) や SK2 抗体 (Sato, K. et al.， 第 21回 日本免疫学会総会、 学術記録（1991) 21, 166) 等が挙げら れる。
抗 IL- 6抗体産生ハイプリ ドーマは、 基本的には公知技術を使用し 、 以下のよ うにして作製できる。 すなわち、 IL- 6を感作抗原として 使用して、 これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、 得られる免 疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、 通常 のスク リーニング法により 、 モノク ローナルな抗体産生細胞をスク リーニングすることによって作製できる。
具体的には、 抗 IL-6抗体を作製するには次のようにすればよい。 例えば、 抗体取得の感作抗原として使用されるヒ ト IL-6は、 Eur. J . Biochem (1987) 168， 543-550 、 J. Immunol. (1988) 140, 153 4-1541 、 あるいは Agr. Biol. Chem. (1990) 54, 2685-2688 に開 示された IL - 6遺伝子/アミノ酸配列を用いることによって得られる
IL - 6の遺伝子配列を公知の発現べクター系に挿入して適当な宿主 細胞を形質転換させた後、 その宿主細胞中又は、 培養上清中から目 的の IL- 6蛋白質を公知の方法で精製し、 この精製 IL- 6蛋白質を感作 抗原と して用いればよい。 また、 IL - 6蛋白質と他の蛋白質との融合 蛋白質を感作抗原として用いてもよい。
本発明で使用される抗 IL-6受容体抗体は、 公知の手段を用いてポ リ ク口ーナル又はモノクローナル抗体と して得ることができる。 本 発明で使用される抗 IL- 6受容体抗体として、 特に哺乳動物由来のモ ノクローナル抗体が好ましい。 哺乳動物由来のモノクローナル抗体 としては、 ハイプリ ド一マに産生されるもの、 および遺伝子工学的 手法により抗体遺伝子を含む発現べクターで形質転換した宿主に産 生されるものがある。 この抗体は Iい 6受容体と結合することにより 、 IL- 6の IL- 6受容体への結合を阻害して IL- 6の生物学的活性の細胞 内への伝達を遮断する。
このよ うな抗体と しては、 MR16- 1抗体 ( Tamura , T. et al. Proc . Nat l . Acad. Sc i . USA ( 1993 ) 90， 11924-11928 )、 PM_1抗体 (Hi rata , Y. et al. , J. Immunol. ( 1989) 143 , 2900-2906) 、 AUK12- 20抗体、 AUK64- 7 抗体あるいは AUK146- 15 抗体 （国際特許出願公開 番号 W0 92-19759 )などが挙げられる。 これらのうちで、 特に好まし い抗体として PM-1抗体が挙げられる。
なお、 PM-1抗体産生ハイプリ ドーマ細胞株は、 PM-1として、 工業 技術院生命工学工業技術研究所 （茨城県つくば市東 1 丁目 1 番 3 号 ) に、 平成 2 年 7 月 10日に、 FERM BP-2998と してブダペス ト条約に 基づき国際寄託されている。 また、 MR16- 1 抗体産生ハイプリ ドー マ細胞株は、 Rat- mous e hybr idoma MR16-1と して、 工業技術院生命 工学工業技術研究所 （茨城県つくば市東 1 丁目 1 番 3 号） に、 平成 9 年 3 月 13日に、 FERM BP-5875としてブダぺス ト条約に基づき国際 寄託されている。
抗 IL- 6受容体モノ ク ローナル抗体産生ハイプリ ドーマは、 基本的 には公知技術を使用し、 以下のようにして作製できる。 すなわち、 IL - 6受容体を感作抗原と して使用して、 これを通常の免疫方法にし たがって免疫し、 得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公 知の親細胞と融合させ、 通常のスク リーニング法によ り、 モノクロ 一ナルな抗体産生細胞をスク リ一ユングすることによつて作製でき る。
具体的には、 抗 IL- 6受容体抗体を作製するには次のようにすれば よい。 例えば、 抗体取得の感作抗原として使用される ヒ ト IL - 6受容 体は、 欧州特許出願公開番号 EP 325474 に、 マウス IL- 6受容体は日 本特許出願公開番号特開平 3- 155795に開示された IL- 6受容体遺伝子 /アミ ノ酸配列を用いることによって得られる。
IL - 6受容体蛋白質は、 細胞膜上に発現しているものと細胞膜より 離脱しているもの （可溶性 IL- 6受容体） （Yasukawa , K. et al .， J . Bi ochem. ( 1990 ) 108， 673-676) との二種類がある。 可溶性 IL- 6 受容体抗体は細胞膜に結合している IL- 6受容体の実質的に細胞外領 域から構成されており、 細胞膜貫通領域あるいは細胞膜貫通領域と 細胞内領域が欠損している点で膜結合型 IL- 6受容体と異なっている 。 IL - 6受容体蛋白質は、 本発明で用いられる抗 IL- 6受容体抗体の作 製の感作抗原と して使用されうる限り、 いずれの IL- 6受容体を使用 してもよい。
IL - 6受容体の遺伝子配列を公知の発現べクター系に挿入して適当 な宿主細胞を形質転換させた後、 その宿主細胞中又は、 培養上清中 から目的の IL-6受容体蛋白質を公知の方法で精製し、 この精製 IL - 6 受容体蛋白質を感作抗原と して用いればよい。 また、 IL- 6受容体を 発現している細胞や IL- 6受容体蛋白質と他の蛋白質との融合蛋白質 を感作抗原として用いてもよい。
ヒ ト IL- 6受容体をコ一ドする cDNAを含むプラスミ ド p IBIBSF2R を 含有する大腸菌 （E. col i) は、 平成元年 （1989年） 1 月 9 日付でェ 業技術院生命工学工業技術研究所に、 HB101-P IB IBSF2R として、 受 託番号 FERM BP- 2232と してブダぺス ト条約に基づき国際寄託されて いる。
本発明で使用される抗 gpl30 抗体は、 公知の手段を用いてポリ ク ローナル又はモノクローナル抗体と して得ることができる。 本発明 で使用される抗 gpl30 抗体と して、 特に哺乳動物由来のモノ ク ロ一 ナル抗体が好ましい。 哺乳動物由来のモノ ク ローナル抗体と しては 、 ハイプリ ドーマに産生されるもの、 および遺伝子工学的手法によ り抗体遺伝子を含む発現べクターで形質転換した宿主に産生される ものがある。 この抗体は gP130 と結合するこ とによ り、 IL-6/ IL-6 受容体複合体の gpl30 への結合を阻害して IL- 6の生物学的活性の細 胞内への伝達を遮断する。
このよ うな抗体としては、 AM64抗体 （特開平 3- 219894) 、 4B11抗 体および 2H4 抗体 （US 5571513) B-S12 抗体および B-P8抗体 （特開 平 8 - 291199) などが挙げられる。 '
抗 gpl30 モノ ク ローナル抗体産生ハイブリ ドーマは、 基本的には 公知技術を使用し、 以下のようにして作製できる。 すなわち、 gpl3 0 を感作抗原として使用して、 これを通常の免疫方法にしたがって 免疫し、 得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によつて公知の親細 胞と融合させ、 通常のスク リ ーニング法によ り、 モノ ク ローナル抗 体産生細胞をスク リーニングするこ とによつて作製できる。 ' 具体的には、 モノクローナル抗体を作製するには次のようにすれ ばよい。 例えば、 抗体取得の感作抗原として使用される gpl30 は、 欧州特許出願公開番号 EP 411946 に開示された gpl30 遺伝子 アミ ノ酸配列を用いることによって得られる。
gpl30 の遺伝子配列を公知の発現べクター系に挿入して適当な宿 主細胞を形質転換させた後、 その宿主細胞中又は、 培養上清中から 目的の gP130 蛋白質を公知の方法で精製し、 この精製 gpl30 受容体 蛋白質を感作抗原と して用いればよい。 また、 gpl30 を発現してい る細胞や gpl30 蛋白質と他の蛋白質との融合蛋白質を感作抗原と し て用いてもよレヽ。
感作抗原で免疫される哺乳動物と しては、 特に限定されるもので はないが、 細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択す るのが好ましく、 一般的にはげつ歯類の動物、 例えば、 マウス、 ラ ッ ト、 ハムスター等が使用される。
感作抗原を動物に免疫するには、 公知の方法にしたがって行われ る。 例えば、 一般的方法として、 感作抗原を哺乳動物の腹腔内又は 、 皮下に注射することによ り行われる。 具体的には、 感作抗原を PB S (Phosphate-Buffered Saline ) や生理食塩水等で適当量に希釈 、 懸濁したものを所望により通常のアジュパント、 例えば、 フロイ ン ト完全アジュパン トを適量混合し、 乳化後、 哺乳動物に 4- 21日毎 に数回投与するのが好ましい。 また、 感作抗原免疫時に適当な担体 を使用することができる。 '
このように免疫し、 血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確 認した後に、 哺乳動物から免疫細胞が取り出され、 細胞融合に付さ れる。 細胞融合に付される好ましい免疫細胞としては、 特に脾細胞 が挙げられる。
前記免疫細胞と融合される他方の親細胞と しての哺乳動物のミエ ローマ細胞は、 すでに、 公知の種々の細胞株、 例えば、 P3X63Ag8.6 53 (Kearney, J. F. et al. J. Immnol. (1979) 123, 1548 - 1550) 、 P3X63Ag8U.1 ( Current Topics in Microbiology and Immunolog y (1978) 81, 1-7) 、 NS-l (Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J . Immunol. (1976) 6, 511-519 ) 、 MPC - 11 (Margulies. D. H. et al.， Cell (1976) 8, 405-415 ) 、 SP2/0 (Shulman, M. et al.， Nature (1978) 276, 269-270 ) 、 F0 (de St. Groth, S. F. et a 1. , J. Immunol. Methods (1980) 35， 1-21 ) 、 S194 (Trowbridge ， I. S. J. Exp. Med. (1978) 148， 313-323) 、 R210 (Galfre, G. et al. , Nature (1979) 277, 131-133 ) 等が適宜使用される。 前記免疫細胞と ミエローマ細胞の細胞融合は基本的には公知の方 法、 たとえば、 ミルスティンらの方法 （Kohler. G. and Milstein,
C. 、 Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46) 等に準じて行う ことが できる。
より具体的には、 前記細胞融合は例えば、 細胞融合促進剤の存在 下に通常の栄養培養液中で実施される。 融合促進剤と しては例えば 、 ポリ エチレングリ コール (PEG ) 、 センダイゥィルス (HVJ ) 等 が使用され、 更に所望によ り融合効率を高めるためにジメチルスル ホキシド等の補助剤を添加使用することもできる。
免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は、 例えば、 ミエローマ 細胞に対して免疫細胞を 1-10倍とするのが好ましい。 前記細胞融合 に用いる培養液と しては、 例えば、 前記ミエローマ細胞株の増殖に 好適な RPMI1640培養液、 MEM 培養液、 その他、 この種の細胞培養に 用いられる通常の培養液が使用可能であり、 さ らに、 牛胎児血清 （ FCS ) 等の血清補液を併用することもできる。
細胞融合は、 前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培 養液中でよく混合し、 予め、 37°C程度に加温した PEG 溶液、 例えば 、 平均分子量 1000- 6000 程度の PEG 溶液を通常、 30-60 % (w/v ) の濃度で添加し、 混合することによって目的とする融合細胞 （ハイ プリ ドーマ） が形成される。 続いて、 適当な培養液を逐次添加し、 遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによ りハイブリ ドーマ の生育に好ましく ない細胞融合剤等を除去できる。
当該ハイプリ ドーマは、 通常の選択培養液、 例えば、 HAT 培養液 (ヒポキサンチン、 アミ ノプテリ ンおよびチミジンを含む培養液） で培養することにより選択される。 当該 HAT 培養液での培養は、 目 的とするハイプリ ドーマ以外の細胞 （非融合細胞） が死滅するのに 十分な時間、 通常数日〜数週間継続する。 ついで、 通常の限界希釈 法を実施し、 目的とする抗体を産生するハイプリ ドーマのス ク リー ニングおよびクローユングが行われる。
また、 ヒ ト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイプリ ドーマを得 る他に、 ヒ ト リ ンパ球を in vitroで所望の抗原蛋白質又は抗原発現 細胞で感作し、 感作 B リ ンパ球をヒ ト ミエローマ細胞、 例えば U266 と融合させ、 所望の抗原又は抗原発現細胞への結合活性を有する所 望のヒ ト抗体を得ることもできる （特公平 1-59878 参照） 。 さらに 、 ヒ ト抗体遺伝子のレパー ト リ一を有する ト ランスジヱニッ ク動物 に抗原又は抗原発現細胞を投与し、 前述の方法に従い所望のヒ ト抗 体を取得してもよい （国際特許出願公開番号 93/12227 、 W0 92/ 03918 、 W0 94/02602 、 W0 94/25585 、 W0 96/34096 、 W0 96/3373 5 参照） 。
このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイブ リ ドーマは、 通常の培養液中で継代培養することが可能であり、 ま た、 液体窒素中で長期保存することが可能である。
当該ハイプリ ドーマからモノ ク ローナル抗体を取得するには、 当 該ハイプリ ドーマを通常の方法にしたがい培養し、 その培養上清と して得る方法、 あるいはハイプリ ドーマをこれと適合性がある哺乳 動物に投与して増殖させ、 その腹水と して得る方法などが採用され る。 前者の方法は、 高純度の抗体を得るのに適しており、 一方、 後 者の方法は、 抗体の大量生産に適している。
例えば、 抗 IL- 6受容体抗体産生ハイプリ ドーマの作製は、 特開平 3 - 139293に開示された方法によ り行う ことができる。 工業技術院生 命工学工業技術研究所 （茨城県つくば市東 1 丁目 1 番 3 号） に、 平 成 2 年 7 月 10日に、 FERM BP- 2998と してブタぺス ト条約に基づき国 際寄託された PM- 1抗体産生ハイブリ ドーマを BALB/cマゥスの腹腔内 に注入して腹水を得、 この腹水から PM-1抗体を精製する方法や、 本 ハイプリ ドーマを適当な培地、 例えば、 10%ゥシ胎児血清、 5 %B M-Condimed HI (Boehringer Mannheim 製） 含有 RPMI1640培地、 ハ イブリ ドーマ SFM 培地 （GIBC0- BRL 製） 、 PFHM-II 培地 （GIBC0-BR L 製） 等で培養し、 その培養上清から PM - 1抗体を精製する方法で行 う こ とができる。
本発明には、 モノク ローナル抗体と して、 抗体遺伝子をハイプリ ドーマからクローユングし、 適当なベクターに組み込んで、 これを 宿主に導入し、 遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型抗体 を用いることができる （例えば、 Borrebaeck C. A. K. and Larric k J. W. THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990参照） 。
具体的には、 目的とする抗体を産生する細胞、 例えばハイプリ ド 一マから、 抗体の可変 （V ) 領域をコードする mRNAを単離する。 mR NAの単離は、 公知の方法、 例えば、 グァニジン超遠心法 (Chirgwin ， J. M. et al.， Biochemistry (1979) 18, 5294-5299 ) 、 AGPC法 (Chomczynski , P. et al. , Anal. Biochem. (1987)162, 156-159) 等により全 RNA を調製し、 mRNA Purification Kit (Pharmacia製） 等を使用して mRNAを調製する。 また、 QuickPrep mRNA Purificati on Kit (Pharmacia 製） を用いることによ り mRNAを直接調製するこ とができる。
得られた mRNAから逆転写酵素を用いて抗体 V 領域の cDNAを合成す る。 cDNAの合成は、 AMV Reverse Transcriptase First-strand cDN A Synthesis Kit 等を用いて行う こ とができる。 また、 cDNAの合成 および増幅を行うには 5，-Ampli FINDER RACE Kit (Clontech製） および PCR を用いた 5 RACE 法 ( Frohman , M. A. et al . , Proc. N at l . Acad. Sc i . USA ( 1988) 85， 8998-9002 ； Belyavsky , A. et a 1. ， Nuc le ic Ac ids Res . ( 1989 ) 17， 2919-2932 ) を使用すること ができる。 得られた PCR 産物から目的とする DNA 断片を精製し、 ベ クタ一 DNA と連結する。 さ らに、 これより組換えベクターを作成し 、 大腸菌等に導入してコロ ニーを選択して所望の組換えべクターを 調製する。 目的とする DNA の塩基配列を公知の方法、 例えば、 デォ キシ法により確認する。
目的とする抗体の V 領域をコードする DNA が得られれば、 これを 所望の抗体定常領域 （C 領域） をコードする DNA と連結し、 これを 発現ベクターへ組み込む。 又は、 抗体の V 領域をコー ドする DNA を 、 抗体 C 領域の DNA を含む発現ベクターへ組み込んでもよい。
本発明で使用される抗体を製造するには、 後述のよ うに抗体遺伝 子を発現制御領域、 例えば、 ェンハンサー、 プロモーターの制御の もとで発現するよう発現ベクターに組み込む。 次に、 この発現べク ターにより宿主細胞を形質転換し、 抗体を発現させることができる 本発明では、 ヒ トに対する異種抗原性を低下させること等を目的 と して人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、 例えば、 キメラ （Ch imer i c) 抗体、 ヒ ト型化 （Humanized ) 抗体を使用できる。 これら の改変抗体は、 既知の方法を用いて製造することができる。
キメラ抗体は、 前記のようにして得た抗体 V 領域をコードする DN A をヒ ト抗体 C 領域をコードする DNA と連結し、 これを発現べクタ 一に組み込んで宿主に導入し産生させることによ り得られる （欧州 特許出願公開番号 EP 125023 、 国際特許出願公開番号 W0 92-19759 参照） 。 この既知の方法を用いて、 本発明に有用なキメラ抗体を得 ることができる。 例えば、 キメラ PM-1抗体の L 鎖および H 鎖の V 領域をコードする DNA を含むプラスミ ドは、 各々 pPM- k3および pPM- hiと命名され、 こ のプラスミ ドを有する大腸菌は、 National Collections of Indust rial and Marine Bacteria Limited【こ、 1991年 2 月 11曰 ίこ、 各々 NC 1MB 40366 及び NCIMB40362としてブダぺス ト条約に基づき国際寄託 されている。
ヒ ト型化抗体は、 再構成 （reshaped) ヒ ト抗体とも称され、 ヒ ト 以外の哺乳動物、 例えばマウス抗体の相補性決定領域 （CDR ) をヒ ト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、 その一般的な遺伝 子組換え手法も知られている （欧州特許出願公開番号 EP 125023 、 国際特許出願公開番号 W0 92-19759 参照） 。
具体的には、 マウス抗体の CDR とヒ ト抗体のフレームワーク領域 (FR; framework region) を連結するように設計した DNA 配列を、 末端部にォーパーラップする部分を有するよ うに作製した数個のォ リ ゴヌク レオチドから PCR 法によ り合成する。 得られた DNA をヒ ト 抗体 C 領域をコー ドする DNA と連結し、 次いで発現ベクターに組み 込んで、 これを宿主に導入し産生させることにより得られる （欧州 特許出願公開番号 EP 239400 、 国際特許出願公開番号 W0 92-19759 参照） 。
CDR を介して連結されるヒ ト抗体の FRは、 相補性決定領域が良好 な抗原結合部位を形成するものが選択される。 必要に応じ、 再構成 ヒ ト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するよ うに 抗体の可変領域のフレームワーク領域のアミ ノ酸を置換してもよい (Sato, K. et al. , Cancer Res. (1993) 53, 851-856) 。
キメ ラ抗体、 ヒ ト型化抗体には、 ヒ ト抗体 C 領域が使用される。 ヒ ト抗体 C 領域と しては、 Cyが挙げられ、 例えば、 Cyl 、 Cy 2 、 Cy 3 又は CY4 を使用することができる。 また、 抗体又はそ の産生の安定性を改善するために、 ヒ ト抗体 C 領域を修飾してもよ い。
キメラ抗体はヒ ト以外の哺乳動物由来抗体の可変領域とヒ ト抗体 由来の C 領域からなり、 ヒ ト型化抗体はヒ ト以外の哺乳動物由来抗 体の相補性決定領域とヒ ト抗体由来のフレームワーク領域および C 領域からなり、 ヒ ト体内における抗原性が低下しているため、 本発 明に使用される抗体として有用である。
本発明に使用されるヒ ト型化抗体の好ましい具体例と しては、 ヒ ト型化 PM-1抗体が挙げられる （国際特許出願公開番号 W0 92-19759 参照） 。
前記のよ うに構築した抗体遺伝子は、 公知の方法によ り発現させ 、 取得することができる。 哺乳類細胞の場合、 常用される有用なプ 口モーター、 発現される抗体遺伝子、 その 3'側下流にポリ A シグナ ルを機能的に結合させた DNA あるいはそれを含むベクターによ り発 現させることができる。 例えばプロモーター Zェンハンサ一と して は、 ヒ トサイ トメガロウィルス前期プロモータ一 Zェンハンサー （ human cytomegalovirus immediate early promoter/ enhancer ) を 挙げることができる。
また、 その他に本発明で使用される抗体発現に使用できるプロモ 一ター zェンハンサ一と して、 レ ト ロ ウイルス、 ポリオ一マウイノレ ス、 アデノ ウイルス、 シミアンウィルス 40 (SV 40)等のウィルスプ ロモ—ター Zェンハンサーゃヒ トエロンゲーショ ンファクター 1 a
(HEF1 a ) などの哺乳類細胞由来のプ口モーター エンハンサーを 用いればよレ、。
例えば、 SV 40 プロモーター ェンハンサーを使用する場合、 Mu lliganらの方法 （Mulligan, R. に et al. , ature (1979) 277， 1 08-114) 、 また、 HEFl aプロモーター/ェンハンサーを使用する場 合、 Mizushima らの方法 (Mizushima , S. and Nagata , S. Nucleic Acids Res. (1990) 18， 5322 ) に従えば容易に実施することがで きる。
大腸菌の場合、 常用される有用なプロモーター、 抗体分泌のため のシグナル配列、 発現させる抗体遺伝子を機能的に結合させて発現 させることができる。 例えばプロモーターと しては、 lacZプ口モー ター、 araBプロモーターを挙げることができる。 lacZプロモーター を使用する場合、 Wardらの方法 （Ward, E. S. et al. , Nature (19 89) 341， 544-546 ； Ward, E. S. et al. FASEB J. (1992) 6, 242 2-2427 ) 、 araBプロモーターを使用する場合、 Betterらの方法 （B etter, M. et al. Science (1988) 240, 1041-1043 ) に従えばよ レ、。
抗体分泌のためのシグナル配列と しては、 大腸菌のペリブラズム に産生させる場合、 pelBシグナル配列 （Lei， S. P. et al J. Bact eriol. (1987) 169, 4379-4383) を使用すればよい。 ペリプラズム に産生された抗体を分離した後、 抗体の構造を適切にリ フォールド (refold) して使用する （例えば、 W096/30394を参照） 。
複製起源と しては、 SV 40 、 ポリォーマウィルス、 アデノウィル ス、 ゥシパピローマウィルス （BPV ) 等の由来のものを用いること ができ、 さらに、 宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、 発現べ クタ一は選択マーカーと して、 アミ ノグリ コシドホスホ トランスフ エラーゼ （APH ) 遺伝子、 チミジンキナーゼ （TK) 遺伝子、 大腸菌 キサンチングァニンホスホリ ボシノレトランスフェラーゼ （Ecogpt) 遺伝子、 ジヒ ドロ葉酸還元酵素 （dhfr) 遺伝子等を含むことができ る。
本発明で使用される抗体の製造のために、 任意の産生系を使用す ることができる。 抗体製造のための産生系は、 in vitroおよび in V ivo の産生系がある。 in vitroの産生系としては、 真核細胞を使用 する産生系や原核細胞を使用する産生系が挙げられる。
真核細胞を使用する場合、 動物細胞、 植物細胞、 又は真菌細胞を 用いる産生系がある。 動物細胞としては、 （1) 哺乳類細胞、 例えば 、 CH0 、 COS 、 ミエローマ、 BHK (baby hamster kidney) 、 HeLa、 Veroなど、 （2) 両生類細胞、 例えば、 アフリカッメガエル卵母細胞 、 あるいは（3) 昆虫細胞、 例えば、 sf9 、 sf21、 Tn5 などが知られ ている。 植物細胞と しては、 ニコチアナ ' タパクム （Nicotiana ta bacum)由来の細胞が知られており、 これをカルス培養すればよい。 真菌細胞としては、 酵母、 例えば、 サッカロ ミセス （Saccharomyce s ) 属、 例えばサッカロミセス · セ レビシェ (Saccharomyces cere visiae) 、 糸状菌、 例えばァスペルギルス属 （Aspergillus ) 属、 例えばァスぺノレギメレス · 二ガー (Aspergillus niger ) などカ 知ら れている。
原核細胞を使用する場合、 細菌細胞を用いる産生系がある。 細菌 細胞としては、 大腸菌 （E. coli ) 、 枯草菌が知られている。
これらの細胞に、 目的とする抗体遺伝子を形質転換により導入し 、 形質転換された細胞を in vitroで培養することによ り抗体が得ら れる。 培養は、 公知の方法に従い行う。 例えば、 培養液として、 DM EM、 MEM 、 RPMI1640, IMDMを使用することができ、 牛胎児血清 （FC S ) 等の血清補液を併用することもできる。 また、 抗体遺伝子を導 入した細胞を動物の腹腔等へ移すことによ り、 in vivo にて抗体を 産生してもよい。
一方、 in vivo の産生系と しては、 動物を使用する産生系や植物 を使用する産生系が挙げられる。 動物を使用する場合、 哺乳類動物 、 昆虫を用いる産生系などがある。
哺乳類動物と しては、 ャギ、 ブタ、 ヒッジ、 マウス、 ゥシなどを 用いることができる （Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology App lications, 1993 ) 。 また、 昆虫と しては、 カイコを用いることが できる。 植物を使用する場合、 例えばタバコを用いることができる これらの動物又は植物に抗体遺伝子を導入し、 動物又は植物の体 内で抗体を産生させ、 回収する。 例えば、 抗体遺伝子をャギ jSカゼ イ ンのよ うな乳汁中に固有に産生される蛋白質をコー ドする遺伝子 の途中に挿入して融合遺伝子として調製する。 抗体遺伝子が挿入さ れた融合遺伝子を含む DNA 断片をャギの胚へ注入し、 この胚を雌の ャギへ導入する。 胚を受容したャギから生まれる トランスジェニッ クャギ又はその子孫が産生する乳汁から所望の抗体を得る。 トラン スジエニックャギから産生される所望の抗体を含む乳汁量を増加さ せるために、 適宜ホルモンを トランスジエニックャギに使用しても よい。 （Ebert， K. M. et al. , Bio/Technology (1994) 12, 699 70 2 ) 。
また、 カイコを用いる場合、 目的の抗体遺伝子を揷入したパキュ ロウィルスをカイコに感染させ、 このカイコの体液よ り所望の抗体 を得る （Maeda， S. et al.， Nature (1985) 315， 592-594) 。 さら に、 タバコを用いる場合、 目的の抗体遺伝子を植物発現用ベクター 、 例えば pMON 530に挿入し、 このベクターを Agrobacterium tumefa ciens のよ うなパクテリアに導入する。 このパクテリ アをタバコ、 例えば Nicotiana tabacum に感染させ、 本タバコの葉より所望の抗 体を得る (Julian, K. - C.. Ma et al. , Eur. J. Immunol. (1994) 2 4, 131-138) 。
上述のように in vitro又は in vivo の産生系にて抗体を産生する 場合、 抗体重鎖 （H 鎖） 又は軽鎖 （L 鎖） をコードする DNA を別々 に発現べクターに組み込んで宿主を同時形質転換させてもよいし、 あるいは H 鎖および L 鎖をコードする DNA を単一の発現ベクターに 組み込んで、 宿主を形質転換させてもよい （国際特許出願公開番号 W0 94-11523 参照） 。 .
本発明で使用される抗体は、 本発明に好適に使用され得るかぎり 、 抗体の断片やその修飾物であってよい。 例えば、 抗体の断片と し ては、 Fab 、 F(ab' )2 、 Fv又は H 鎖と L 鎖の Fvを適当なリ ンカーで 連結させたシングルチェイン Fv (scFv) が挙げられる。
具体的には、 抗体を酵素、.例えば、 パパイ ン、 ペプシンで処理し 抗体断片を生成させるか、 又は、 これら抗体断片をコードする遺伝 子を構築し、 これを発現ベクターに導入した後、 適当な宿主細胞で 発現させる （例えば、 Co， M.S. et al. , J. Immunol. (1994) 152, 2968 - 2976、 Better, M. & Horwitz, A. H. Methods in Enzymolog y (1989) 178, 476-496 、 Plueckthun, A. & Skerra, A. Methods in Enzymolog 989) 178， 476-496 、 Lamoyi , E.， Methods in E nzymology (1989) 121 , 652 - 663 、 Rousseaux, J. et al. , Metho ds in Enzymology (1989) 121, 663-669、 Bird, R. E. et al. , TI BTECH (1991) 9， 132-137 参照） 0
scFvは、 抗体の H 鎖 V 領域と L 鎖 V 領域を連結することにより得 られる。 この scFvにおいて、 H 鎖 V 領域と L 鎖 V 領域はリ ンカ一、 好ましくは、 ペプチ ドリ ンカ一を介して連結される （Huston, J. S . et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. U. S.A. (1988) 85， 5879-5883 ) 。 scFvにおける H 鎖 V 領域おょぴ L 鎖 V 領域は、 上記抗体と して 記載されたもののいずれの由来であってもよい。 V 領域を連結する ペプチドリ ンカ一としては、 例えばァミ ノ酸 12-19 残基からなる任 意の一本鎖ぺプチドが用いられる。
scFvをコー ドする DNA は、 前記抗体の H 鎖又は、 H 鎖 V 領域をコ 一ドする DNA 、 および L 鎖又は、 L 鎖 V 領域をコードする DNA を铸 型とし、 それらの配列のうちの所望のァミノ酸配列をコードする DN A 部分を、 その両端を規定するプライマー対を用いて PCR 法によ り 増幅し、 次いで、 さ らにペプチドリ ンカ一部分をコー ドする DNA お よびその両端を各々 H 鎖、 L 鎖と連結されるよ うに規定するプライ マー対を組み合せて増幅することによ り得られる。
また、 ー且 s cFvをコードする DNA が作製されれば、 それらを含有 する発現ベクター、 および該発現べクタ一によ り形質転換された宿 主を常法に従って得ることができ、 また、 その宿主を用いて常法に 従って、 s cFvを得ることができる。
これら抗体の断片は、 前記と同様にしてその遺伝子を取得し発現 させ、 宿主により産生させることができる。 本願特許請求の範囲で いう 「抗体」 にはこれらの抗体の断片も包含される。
抗体の修飾物と して、 ポリエチレングリ コール （PEG ) 等の各種 分子と結合した抗体を使用することもできる。 本願特許請求の範囲 でいう 「抗体」 にはこれらの抗体修飾物も包含される。 このような 抗体修飾物を得るには、 得られた抗体に化学的な修飾を施すことに よって得ることができる。 これらの方法はこの分野においてすでに 確立されている。
前記のよ うに産生、 発現された抗体は、 細胞内外、 宿主から分離 し均一にまで精製することができる。 本発明で使用される抗体の分 離、 精製はァフィ二ティークロマトグラフィーによ り行うことがで きる。 アブイ二ティークロマトグラフィ一に用いるカラムとしては 、 例えば、 プロテイ ン A カラム、 プロテイン G カラムが挙げられる 。 プロテイン A カラムに用いる担体と して、 例えば、 Hyp e r D 、 P0 R0S 、 S ephar o s e F . F.等が挙げられる。 その他、 通常のタンパク質 で使用されている分離、 精製方法を使用すればよく、 何ら限定され るものではない。 例えば、 上記ァフィ二ティークロマ トグラフィー以外のクロマ ト グラフィー、 フィルター、 限外濾過、 塩析、 透析等を適宜選択、 組 み合わせれば、 本発明で使用される抗体を分離、 精製することがで きる。 クロマ トグラフィーと しては、 例えば、 イオン交換クロマ ト グラフィー、 疎水クロマ トグラフィー、 ゲルろ過等が挙げられる。 これらのクロマ トグラフィーは HPLC (High performanc e l iquid ch romatography) ίこ適用し守る。 ま 7こ、 逆ネ目 HPLし ( rever se phas e HP LC) を用いてもよい。
上記で得られた抗体の濃虔測定は吸光度の測定又は ELI SA 等によ り行う ことができる。 すなわち、 吸光度の測定による場合には、 PB S (-）で適当に希釈した後、 280 nmの吸光度を測定し、 1 mg/ml を 1. 35 0D と して算出する。 また、 ELI SA による場合は以下のように測 定することができる。 すなわち、 0. 1M重炭酸緩衝液 （ρΗ9· 6 ) で 1 μ g/mlに希釈したャギ抗ヒ ト IgG ( TAG0製） 100 μ 1 を 96穴プレー ト （Nunc製） に加え、 4 °Cでー晚イ ンキュベーショ ンし、 抗体を固 相化する。 ブロッキングの後、 適宜希釈した本発明で使用される抗 体又は抗体を含むサンプル、 あるいは標品と してヒ ト I gG ( CAPPEL 製） 100 /x l を添加し、 室温にて 1時間イ ンキュベーシ ョ ンする。
洗浄後、 5000倍希釈したアル力リ フォスフ ァターゼ標識抗ヒ ト I g G (BI O SOURCE製） 100 1 を加え、 室温にて 1時間インキュベー トする。 洗浄後、 基質溶液を加えイ ンキュベーショ ンの後、 MI CR0P LATE READER Model 3550 ( B io - Rad 製） を用いて 405mn での吸光度 を測定し、 目的の抗体の濃度を算出する。
本発明で使用される IL-6改変体は、 IL-6受容体との結合活性を有 し、 且つ IL- 6の生物学的活性を伝達しない物質である。 即ち、 IL - 6 改変体は IL- 6受容体に対し IL- 6と競合的に結合するが、 IL- 6の生物 学的活性を伝達しないため、 IL-6によるシグナル伝達を遮断する。 IL - 6改変体は、 IL - 6のァミノ酸配列のァミノ酸残基を置換するこ とにより変異を導入して作製される。 IL-6改変体のもと となる IL - 6 はその由来を問わないが、 抗原性等を考慮すれば、 好ましく はヒ ト IL-6である。
具体的には、 IL- 6のァミノ酸配列を公知の分子モデリ ングプログ ラム、 たとえば、 WHATIF ( Vr i end et al.， J. Mo l . Graphi cs ( 199 0 ) 8， 52-56 ) を用いてその二次構造を予測し、 さ らに置換される ァミノ酸残基の全体に及ぼす影響を評価することによ り行われる。 適切な置換ァミ ノ酸残基を決定した後、 ヒ ト IL - 6遺伝子をコ ドす る塩基配列を含むベタターを鏺型と して、 通常行われる PCR 法によ りァミノ酸が置換されるように変異を導入することにより、 IL-6改 変体をコードする遺伝子が得られる。 これを必要に応じて適当な発 現ベクターに組み込み、 前記組換え型抗体の発現、 産生及び精製方 法に準じて IL - 6改変体を得ることができる。
IL - 6改変体の具体例としては、 Brakenhoff et al .， J. Bi o l . Ch em. ( 1994) 269， 86 - 93 、 及び Savino et al . , EMBO J. (1994 ) 13 , 1357-1367 、 WO 96-18648 、 W096— 17869 ίこ開示されてレヽる。
本発明で使用される IL- 6部分べプチド又は IL- 6受容体部分べプチ ドは、 各々 IL- 6受容体あるいは IL- 6との結合活性を有し、 且つ IL- 6 の生物学的活性を伝達しない物質である。 即ち、 IL- 6部分ペプチ ド 又は IL- 6受容体部分ぺプチドは IL- 6受容体又は IL- 6に結合し、 これ らを捕捉することにより IL - 6の Iい 6受容体への結合を特異的に阻害 する。 その結果、 IL- 6の生物学的活性を伝達しないため、 Iい 6によ るシグナル伝達を遮断する。
IL - 6部分べプチ ド又は IL- 6受容体部分べプチドは、 IL- 6又は IL - 6 受容体のァミノ酸配列において IL- 6と IL - 6受容体との結合に係わる 領域の一部又は全部のアミ ノ酸配列からなるペプチドである。 この ようなペプチドは、 通常 1 0 〜 8 0、 好ましく は 2 0 〜 5 0、 よ り 好ましくは 2 0 〜 4 0個のアミノ酸残基からなる。
IL - 6部分ぺプチ ド又は IL- 6受容体部分べプチドは、 IL- 6又は IL-6 受容体のアミノ酸配列において、 IL-6と IL - 6受容体との結合に係わ る領域を特定し、 その一部又は全部のァミノ酸配列を通常知られる 方法、 例えば遺伝子工学的手法又はぺプチド合成法によ り作製する ことができる。
IL - 6部分べプチド又は IL- 6受容体部分べプチドを遺伝子工学的手 法によ り作製するには、 所望のペプチドをコードする DNA 配列を発 現ベクターに組み込み、 前記組換え型抗体の発現、 産生及び精製方 法に準じて得ることができる。
IL - 6部分べプチ ド又は IL-6受容体部分べプチドをぺプチド合成法 によ り作製するには、 ぺプチド合成において通常用いられている方 法、 例えば固相合成法又は液相合成法を用いることができる。
具体的には、 続医薬品の開発第 1 4卷ペプチド合成 監修矢島治 明廣川書店 1991年に記載の方法に準じて行えばよい。 固相合成法と しては、 例えば有機溶媒に不溶性である支持体に合成しよう とする ペプチドの C 末端に対応するアミ ノ酸を結合させ、 ひ - アミ ノ基及 び側鎖官能基を適切な保護基で保護したアミ ノ酸を C 末端から N 末 端方向の順番に 1アミ ノ酸ずつ縮合させる反応と樹脂上に結合した アミ ノ酸又はペプチドのひ - アミ ノ基の該保護基を脱離させる反応 を交互に繰り返すことによ り、 ぺプチド鎖を伸長させる方法が用い られる。 固相ペプチド合成法は、 用いられる保護基の種類により Bo c 法と Fmoc法に大別される。 .
このようにして目的とするペプチ ドを合成した後、 脱保護反応及 びペプチド鎖の支持体からの切断反応をする。 ペプチド鎖との切断 反応には、 Boc 法ではフッ化水素又は ト リ フルォロメ タンスルホン 酸を、 又 Fmo c法では TFA を通常用いることができる。 B o c 法では、 例えばフッ化水素中で上記保護べプチド樹脂をァニソール存在下で 処理する。 次いで、 保護基の脱離と支持体からの切断をしペプチド を回収する。 これを凍結乾燥することによ り、 粗ペプチドが得られ る。 一方、 Fmo c法では、 例えば TFA 中で上記と同様の操作で脱保護 反応及びべプチド鎖の支持体からの切断反応を行う ことができる。
得られた粗ペプチドは、 HPLCに適用することによ り分離、 精製す ることができる。 その溶出にあたり、 蛋白質の精製に通常用いられ る水- ァセトニト リル系溶媒を使用して最適条件下で行えばよい。 得られたクロマ トグラフィーのプロファイルのピークに該当する画 分を分取し、 これを凍結乾燥する。 このよ うにして精製したぺプチ ド画分について、 マススペク トル分析による分子量解析、 アミノ酸 組成分析、 又はアミノ酸配列解析等により同定する。
IL-6部分べプチド及び IL-6受容体部分べプチドの具体例は、 特開 平 2-188600、 特開平 7-324097、 特開平 8-311098及び米国特許公報 US 5210075に開示されている。
本発明で使用される IL- 6アンタゴニス トの IL- 6シグナル伝達阻害 活性は、 通常用いられる方法により評価することができる。 具体的 には、 IL- 6依存性ヒ ト骨髄腫株 （S6B45， KPMM2) 、 ヒ トレンネル ト T リ ンパ腫細胞株 KT3 、 あるいは IL- 6依存性細胞 MH60. BSF2 を培養 し、 これに IL-6を添加し、 同時に IL- 6アンタゴニス トを共存させる ことにより IL- 6依存性細胞の 3 H-チミジン取込みを測定すればよい 。 また、 IL- 6受容体発現細胞である U266を培養し、 1 2 5 1 標識 IL - 6 を添加し、 同時に IL-6アンタゴニス トを加えることにより、 IL-6受 容体発現細胞に結合した 1 2 5 1 標識 IL- 6を測定する。 上記アツセィ 系において、 IL-6アンタゴニス トを存在させる群に加え IL- 6アンタ ゴニス トを含まない陰性コ ン ト ロール群をおき、 両者で得られた結 果を比較すれば IL- 6アンタゴニス トの IL- 6阻害活性を評価すること ができる。
後述の実施例に示されるように、 抗 IL-6受容体抗体の投与により 、 リ ウマチ患者において、 MMP- 3の血中濃度の低下が認められたこ とから、 抗 IL-6受容体抗体等の IL-6アンタゴニス トは血中 MMP-3濃 度低下効果を有し、 これによ り軟骨破壊抑制作用を有するこ とが示 唆された。
本発明における治療対象は哺乳動物である。 治療対象の哺乳動物 は、 好ましくはヒ トである。
本発明の血中顏 P-3濃度低下剤および軟骨破壊抑制剤は、 経口的 にまたは非経口的に全身あるいは局所的に投与することができる。 例えば、 点滴などの静脈内注射、 筋肉内注射、 腹腔内注射、 皮下注 射、 坐薬、 注腸、 経口性腸溶剤などを選択することができ、 患者の 年齢、 症状により適宜投与方法を選択するこ とができる。 有効投与 量は、 一回につき体重 1 kgあたり 0. 01 mg 力、ら 100 mgの範囲で選ば れる。 あるいは、 患者あたり 1〜： L000 mg 、 好ましくは 5〜50 mg の投与量も選ぶこ とができる。 好ましい投与量、 投与方法は、 たと えば抗 IL- 6レセプター抗体の場合には、 血中にフリ一の抗体が存在 する程度の量が有効投与量であり、 具体的な例としては、 体重 l kg あたり 1 ヶ月 （4週間） に 0. 5mg力 ら 40mg、 好ましくは lmgから 20mg を 1 回から数回に分けて、 例えば 2回 Z週、 1回 Z週、 1回 / 2週 、 1 回 Z 4週などの投与スケジュールで点滴などの静脈内注射、 皮 下注射などの方法で、 投与する方法などである。
本発明の血中匪 P- 3濃度低下剤および軟骨破壌抑制剤は、 投与経 路次第で医薬的に許容される担体や添加物を共に含むものであって もよい。 このような担体および添加物の例と して、 水、 医薬的に許 容される有機溶媒、 コラーゲン、 ポリ ビュルアルコール、 ポリ ビニ ノレピロ リ ドン、 力/レポキシビニノレポリ マー、 カルボキシメチノレセノレ ロースナ ト リ ウム、 ポリ アク リル酸ナ ト リ ウム、 アルギン酸ナ ト リ ゥム、 水溶性デキス トラン、 カルボキシメチルスターチナ ト リ ウム 、 ぺクチン、 メチノレセノレロース、 ェチノレセノレロース、 キサンタンガ ム、 アラビアゴム、 カゼイン、 ゼラチン、 寒天、 ジグリセリ ン、 プ ロ ピレングリ コーノレ、 ポリエチレングリ コーノレ、 ワセリ ン、 パラフ イ ン、 ステアリルアルコール、 ステアリ ン酸、 ヒ ト血清アルブミ ン
( HSA ) 、 マンニ トール、 ソルビ トール、 ラタ トース、 医薬添加物 と して許容される界面活性剤などが挙げられる。 使用される添加物 は、 剤型に応じて上記の中から適宜あるいは組合せて選択されるが 、 これらに限定されるものではない。
本発明では、 抗 IL-6受容体抗体などの IL- 6アンタゴニス ト の作用 により、 MMP- 3 、 MMP-1 及び TIMP- 1から成る群から選ばれたものの 体内濃度、 例えば血中濃度などが低下することが観察されているこ とから、 こ う した MMP - 3 などの血中濃度を指標とすることによ り、 IL-6ァンタゴニス トを有効成分とした薬剤、 例えば IL-6アンタゴニ ス トを有効成分と した軟骨破壊抑制剤あるいは変形性関節症治療剤 などの効果 （例えば治療効果など） について、 それを検出したり、 評価したり、 及びノ又は判定したりする方法や、 該方法に使用され る試薬が、 有用なものであることが理解されよう。 MMP - 3 、 MMP-1 及び TIMP-1について、 それらを in v ivo 又は in vi t ro で測定する 方法あるいはその測定用の試薬は、 当該分野で広く知られており、 該公知の方法及び試薬の中から適宜選択して、 本発明の目的に使用 することができる。 検体中の MMP- 3 、 MMP-1 あるいは T IMP- 1測定は 、 抗 MMP 抗体、 MMP 阻害剤、 MMP フ ァ ミ リ一に対するィンヒ ビター 活性を有する化合物 （合成化合物を含む） を使用して行うことがで きるが、 好ましく は、 例えば龍 P- 3 に対するモノ ク ローナル抗体な どの抗体 〔ここで、 「抗体」 との用語は、 広義の意味で使用される ものであってよく、 所望の物質に対するモノク ローナル抗体の単一 のものや各種ェピトープに対する特異性を持つ抗体組成物であって よく、 また 1価抗体または多価抗体並びにポリ クローナル抗体及び モノク ローナル抗体を含むものであり、 さ らに天然型（intac t )分子 並びにそれらのフラグメント及び誘導体も表すものであり、 F ( ab ' ) 2 , Fab， 及び Fab といったフラグメ ントを包含し、 さらに少なく と も二つの抗原又はェピトープ （ep i t ope )結合部位を有するキメラ抗 体若しくは雑種抗体、 又は、 例えば、 クヮ ドローム（quadrome ) , ト リオーム（t r i ome )などの二重特異性組換え抗体、 種間雑種抗体、 抗 ィディオタィプ抗体、 さ らには化学的に修飾あるいは加工などされ てこれらの誘導体と考えられるもの、 公知の細胞融合又はハイブリ ドーマ技術や抗体工学を適用したり、 合成あるいは半合成技術を使 用して得られた抗体、 抗体生成の観点から公知である従来技術を適 用したり、 DNA 組換え技術を用いて調製される抗体、 本明細書で記 载し且つ定義する標的抗原物質あるいは標的ェピトープに関して中 和特性を有したりする抗体又は結合特性を有する抗体を包含してい てよい、 以下同様〕 、 MMP- 1 に対するモノ ク ローナル抗体などの抗 体あるいは TIMP - 1に対するモノク口ーナル抗体などの抗体を使用し た免疫学的測定法などにより行うことができる。 その他、 酵素活性 あるいは阻害活性を測定するなどの生化学的な手法を含んだ各種の 方法を使用してもよい。
免疫学的測定法では、 競合型あるいは非競合型結合アツセィ、 直 接及び間接サンドイ ッチアツセィ、 及び免疫沈降アツセィのいずれ によってもよく、 さらに酵素免疫アツセィ、 放射免疫アツセィ、 蛍 光免疫アツセィ、 その他、 ビォチン一アビジン系、 金コロイ ドなど の金属粒子、 発色物質、 磁気物質など、 当該分野で知られた標識を 使用したいずれのァッセィによってもよい。
本発明の測定法によれば、 例えば、 測定すべき物質を酵素などで 標識したモノクローナル抗体などの標識抗体試薬と、 担体に結合さ れた抗体とを順次反応させたり、 同時に反応させたり して行う こと もできる。 試薬を加える順序は選ばれた担体系の型により異なる。 また、 感作されたプラスチックなどのビーズあるいはゥエルを用い た場合には、 酵素などで標識したモノクローナル抗体などの標識抗 体試薬を測定すべき物質を含む検体試料と共に最初に適当な試験管 中に一緒に入れ、 その後該感作されたプラスチックなどのビーズを 加えるあるいは該ゥエルに入れることにより測定を行うことができ る。
本発明の測定方法で測定される試科と しては、 あらゆる形態の溶 液やコロイ ド溶液、 非流体試料などが使用しうるが、 好ましくは生 物由来の試科、 例えば胸腺、 睾丸、 腸、 腎臓、 脳、 乳癌、 卵巣癌、 結腸 · 直腸癌、 血液、 血清、 血漿、 関節液、 脳脊髄液、 唾液、 羊水 、 尿、 その他の体液、 細胞培養液、 組織培養液、 組織ホモジュネー ト、 生検試料、 組織、 細胞などが挙げられる。
これら個々の免疫学的測定法を含めた各種の分析 · 定量法を本発 明の測定方法に適用するにあたっては、 特別の条件、 操作等の設定 は必要とされない。 それぞれの方法における通常の条件、 操作法に 当業者の通常の技術的配慮を加えて、 本発明の当該対象物質あるい はそれと実質的に同等な活性を有する物質に関連した測定系を構築 すればよい。
MMP - 3 測定は、 例えば、 Matr ix , ( 1990 ) 10 , 285-291 、 あるい は特開平 4- 237499号公報などに記載されている。 特に、 検体中の MM P-3 を測定するのに適した技術としては、 例えば、 特開平 4-237499 号公報などに記載のものが挙げられる。 MMP-1 測定は、 例えば、 Clin. Chim. Acta(1993)219, 1-14、 あるい は Res. Com匪. Mol. Pathol. Pharmacol. (1997) 95， 115 - 128などに記 载されている。 特に、 検体中の MMP - 1を測定するのに適した技術と しては、 例えば、 Clin. Chim. Acta(1993)219，l-14などに記載のもの が挙げられる。
TIMP- 1測定は、 例えば、 J. Immunol. Methods (1990) 127,103-108 、 Matrix (1989) 9,1-6, あるいは特開昭 63- 210665号公報などに記 载されている。 特に、 検体中の TIMP-1を測定するのに適した技術と しては、 例えば、 特開昭 63- 210665号公報などに記載のものが挙げ られる。
プロテアーゼ活性あるいはインヒ ビター活性の測定は、 通常の測 定法に準じて実施することができ、 例えば Biochemistry (1993) 3 2,4330-4337 に示されている方法などを参考にして行う ことができ る。 また、 各種標識、 緩衝液系その他適当な試薬等を使用したりす ることもできる。 方法を行うにあたっては、 MMPs等をァミノフエ二 ル酢酸水銀などの活性化剤で処理したり、 その前駆体あるいは潜在 型のものを活性型のものに予め変換しておく こともできる。 個々の 測定にあたっては、 それぞれの方法における通常の条件、 操作法に 当業者の通常の技術的配慮を加えて、 適切な測定系を構築すればよ レゝ 実施例
以下、 実施例、 参考例および実験例により本発明を具体的に説明 するが、 本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例
ヒ ト型化抗 Iい 6受容体抗体 （ヒ ト型化 PM- 1抗体 ； W092Z19759に 記載されている、 L鎖パージョ ン a と H鎖パージョ ン f から成る） による 2ヶ月以上の治療を行ったリ ゥマチ患者 8例、 並びに Multic entric Castleman' s Disease (CD) の患者 5例の患者こつレヽて、 、冶 療に伴う MMP-1, -2， -3， -7, - 8および- 13並びに TIMP-1および- 2の 血中濃度の変化について検討した。 抗体は生理食塩水 100mlに溶解 し 1 mg、 10mg 50mgと安全を確認しながら増量し、 50mg/body週 2 回あるいは 100mg/body週 1 回の割合で点滴静注にて使用した。
前値、 治療開始後 2ヶ月、 および 6ヶ月間治療を継続したリ ウマ チ患者 4例および CD患者 2例については 6ヶ月 目の値も検討した。 MMP-1, -2， -3, -7, -8および- 13並びに TIMP-1および- 2の血中濃度 の測定には ELISA kit (富士薬品工業） を用いた。 その結果、 ヒ ト 型化抗 IL- 6受容体抗体はリ ゥマチ患者およびキャスルマン病患者に おいて MMP- 1， MMP-3および TIMP- 1の血中濃度を低下させることを示 している （図 1力 ら図 6 ) 。
以上よ り、 抗 IL-6受容体抗体は、 血中匪 P- 3濃度を低下させ、 軟 骨破壊抑制剤、 変形性関節症治療剤となる可能性が示された。
参考例 1. ヒ ト可溶性 IL - 6受容体の調製
Yamasakiらの方法 (Yamasaki, K. et al.， Science (1988) 241, 825-828) に従い得られた IL- 6受容体をコードする cDNAを含むプラ スミ ド pBSF2R.236を用いて、 PCR 法によ り可溶性 IL- 6受容体を作成 した。 プラスミ ド pBSF2R.236を制限酵素 Sph I で消化して、 IL- 6受 容体 cDNAを得、 これを mpl8 (Amersham製） に揷入した。 IL- 6受容体 cDNAにス トップコ ドンを導入するよ うにデザィンした合成ォリ ゴプ ライマーを用いて、 イ ンビ ト ロ ミ ュータジエネシスシステム （Amer sham製） により、 PCR 法で IL-6受容体 cDNAに変異を導入した。 この 操作によ りス ト ップコ ドンがアミノ酸 345 の位置に導入され、 可溶 性 IL- 6受容体をコ一ドする cDNAが得られた。
可溶性 IL- 6受容体 cDNAを CH0 細胞で発現するために、 プラスミ ド pSV (Pharmacia製） と連結させ、 プラスミ ド pSVL344 を得た。 dhfr の cDNAを含むプラスミ ド pECEdhfrに Hind III- Sal Iで切断した可溶 性 IL- 6受容体 cDNAを挿入し、 CH0 細胞発現プラスミ ド pECEdhfr344 を得た。
10 μ g のプラスミ ド PECEdhfr344 を dhfr- CH0細胞株 DXB- 11 (Urla ub， G. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, 4216-42 20) へカルシウムフォスフェイ ト沈降法 （Chen， に et al. , Mol. Cell. Biol. (1987) 7, 2745-2751 ) によ り、 トランスフエタ ト し た。 ト ランスフエク ト した CH0 細胞を ImM グルタ ミ ン、 10% 透析 FC S 、 100U/ml のペニシリ ンおよび 100 μ /ml のス ト レプ トマイシン を含むヌクレオシド不含 α MEM 選択培養液で 3 週間培養した。
選択された CH0 細胞を限界希釈法でスク リーニングし、 単一の CH 0 細胞クローンを得た。 この CH0 細胞クローンを 20nM〜 200nM の濃 度のメ ト ト レキセー トで増幅し、 ヒ ト可溶性 IL-6受容体産生 CH0 細 胞株 5E27を得た。 CH0 細胞株 5E27を 5%FBS を含むイスコープ改変ダ ルべコ培養液 （IMDM、 Gibco 製） で培養した。 培養上清を回収し、 培養上清中の可溶性 IL- 6受容体の濃度を ELISA にて測定した。 その 結果、 培養上清中には可溶性 IL - 6受容体が存在することが確認され た。
参考例 2 . 抗ヒ ト IL - 6抗体の調製
10 β g の組換型 IL - 6 (Hirano, T. et al. , Immunol. Lett. (198 8) 17, 41 ) をフロイント完全アジュバント とともに BALB/cマゥス を免疫し、 血清中に抗 IL-6抗体が検出できるまで一週間毎にこれを 続けた。 局部のリ ンパ節から免疫細胞を摘出し、 ポリ エチレングリ コール 1500を用いてミエ口一マ細胞株 P3U1と融合させた。 ハイブリ ドーマを HAT 培養液を用いる 0iらの方法 （Selective Methods in C ellular Immunology, W. h. Freeman and Co. , San Francisco , 351， 1980 ) に従って選択し、 抗ヒ ト IL-6抗体を産生するハイプリ ドー マを樹立した。
抗ヒ ト IL-6抗体を産生するハイプリ ドーマは下記のようにして I L - 6結合アツセィをおこなった。 すなわち、 柔軟なポリ ビュル製の 9 6ン マイ ク 口 プレー 卜 (Dynatech Laboratories , inc. 製， Alexand r ia , VA) を 0.1Mの carbonate - hydrogen carbonate緩衡液 ( H 9.6 ) 中で 100 μ 1 のャギ抗マウス Ig (10 β 1/ml, Cooper Biomedical, Inc製 Malvern, PA) により 4 °Cでー晚コート した。 次いで、 プレ ートを 100μ 1 の 1 %ゥシ血清アルブミン （BSA ) を含む PBS によ り室温で 2 時間処理した。
これを PBS で洗浄した後、 ΙΟΟμ Ι のハイプリ ドーマ培養上清を 各穴へ加え、 4 °Cにてー晚インキュベート した。 プレートを洗浄し て、 2000cpm/0.5ng/wellとなるように 125 I 標識組換型 Iい 6を各穴 へ添加し、 洗浄した後各穴の放射活性をガンマカウンター （Beckma n Gamma 9000 , Beckman Instruments , Fu丄丄 erton, し A) で ll定し 7こ 。 216 ノヽイブリ ドーマク ローンの うち 32のノヽイブリ ドーマク ロ ー ン が IL-6結合アツセィによ り陽性であった。 これらのクローンのなか で最終的に安定な MH166.BSF2が得られた。 該ハイプリ ドーマが産生 する抗 IL - 6抗体 MH166 は IgGl κ型のサブタイプを有する。
ついで、 IL- 6依存性マウスハイブリ ドーマクローン謹 0. BSF2 を 用いて MH166 抗体によるハイプリ ドーマの増殖に関する中和活性を 調べた。 MH60.BSF2 細胞を 1 X 104 /200 μ 1/穴となるよ うに分注し 、 これに MH166 抗体を含むサンプルを加え、 48時間培養し、 0.5 μ Ci/ 穴の 3H チミジン (New England Nuclear, Boston, MA ) をカロ えた後、 更に 6 時間培養を続けた。 細胞をグラスフィルターぺーパ 一上（こおき、 自動/ヽーベスター (Labo Mash Science Co. , Tokyo, Japan ) で処理した。 コ ン ト ロールとしてゥサギ抗 IL - 6抗体を用い た。
その結果、 MH166 抗体は IL-6によ り誘導される MH60. BSF2 細胞の 3H チミジンの取込みを容量依存的に阻害した。 このことよ り、 MH 166 抗体は IL - 6の活性を中和することが明らかとなった。
参考例 3. 抗ヒ ト IL - 6受容体抗体の調製
Hirataらの方法 (Hirata, Y. et al. J. Immunol. (1989) 143, 2900-2906 ) により作成した抗 IL- 6受容体抗体 MT18を CNBrによ り活 性化させたセファ ロース 4B (Pharmacia Fine Chemicals製， Piscat away, NJ) と添付の処方にしたがって結合させ、 IL-6受容体 （Yama saki, K. et al. , Science (1988) 241, 825 - 828) を精製した。 ヒ トミエローマ細胞株 U266を 1%ジギトニン （Wako Chemicals製） ， 10 mMト リエタノールァミ ン （pH 7.8) および 0· 15M NaClを含む lmM p- パラア ミ ノフエニルメタンスノレフォニノレフノレオラィ ドハイ ドロクロ リ ド （Wa.ko Chemicals製） （ジギトニン緩衝液） で可溶化し、 セフ ァロース 4Bビーズと結合させた MT18抗体と混合した。 その後、 ビー ズをジギトニン緩衝液で 6 回洗浄し、 免疫するための部分精製 IL - 6 受容体と した。
BALB/cマウスを 3 X109 個の U266細胞から得た上記部分精製 IL - 6 受容体で 10日おきに 4 回免疫し、 その後常法によりハイプリ ドーマ を作成した。 成長陽性穴からのハイプリ ドーマ培養上清を下記の方 法にて IL- 6受容体への結合活性を調べた。 5 X107 個の U266細胞を 35S —メチォニン （2.5mCi) で標識し、 上記ジギトニン緩衝液で可 溶化した。 可溶化した U266細胞を 0.04ml容量のセフ了口ース 4Bビー ズと結合させた MT18抗体と混合し、 その後、 ジギトニン緩衝液で 6 回洗浄し、 0.25mlのジギト二ン緩衝液 （pH3.4 ) によ り 35 S —メチ ォニン標識 IL- 6受容体を流出させ、 0.025ml の lM Tris (pH 7.4) で中和した。 0.05mlのハイブリ ドーマ培養上清を 0.01mlの Protein G セファロ ース （Phramacia 製） と混合した。 洗浄した後、 セファロースを上 記で調製した' 0.005ml の35 S 標識 IL-6受容体溶液とともにィンキュ ペート した。 免疫沈降物質を SDS-PAGEで分析し、 IL-6受容体と反応 するハイプリ ドーマ培養上清を調べた。 その結果、 反応陽性ハイブ リ ドーマクローン PM-1 (FERM BP-2998) を榭立した。 ハイブリ ドー マ PM-1から産生される抗体は、 IgGl κ型のサブタイプを有する。 ハイブリ ドーマ PM-1が産生する抗体のヒ ト IL- 6受容体に対する I L-6の結合阻害活性をヒ トミエロ一マ細胞株 U266を用いて調べた。 ヒ ト組換型 IL- 6を大腸菌よ り調製し （Hirano, T. et al. , Immunol . Lett. (1988) 17, 41-45) 、 ボル ト ン一ハンター試薬 （New Engl and Nuclear, Boston, MA ) により 125 I標識した (Taga, T. et al. , J. Exp. Med. (1987) 166， 967 - 981 ) 。
4 X105 個の U266細胞を 1 時間、 70% (v/v ) のハイプリ ドーマ PM- 1の培養上清および 14000cpmの 125 I標識 IL - 6とともに培養した 。 70μ 1 のサンプルを 400 μ ΐ のマイ ク ロフュージポリエチレンチ ユーブに 300 1 の FCS 上に重層し、 遠心の後、 細胞上の放射活性 を測定した。
その結果、 ハイプリ ドーマ PM- 1が産生する抗体は、 IL-6の IL-6受 容体に対する結合を阻害することが明らかとなった。
参考例 4. 抗マウス IL- 6受容体抗体の調製
Saito, T. et al. , J. Immunol. (1991) 147, 168-173 に記載の 方法によ り、 マウス IL- 6受容体に対するモノクローナル抗体を調製 した。
マゥス可溶性 IL- 6受容体を産生する CH0 細胞を 10%FCSを含む IMDM 培養液で培養し、 その培養上清から抗マウス IL-6受容体抗体 RS12 ( 上記 Saito, T. et al 参照） を Affigel 10ゲル （Biorad製） に固定 したアブイ -ティーカラムを用いてマウス可溶性 IL-6受容体を精製 した。
得られたマウス可溶性 IL - 6受容体 50 をフロイント完全アジュ パンドと混合し、 ウィスターラッ トの腹部に注射した。 2 週間後か らはフロイント不完全アジュパンドで追加免疫した。 45日 目にラッ ト脾臓細胞を採取し、 2 X108 個を 1 X107 個のマウスミエローマ 細胞 P3U1と 50% の PEG1500 (Boehringer Mannheim 製） をもちレヽて 常法により細胞融合させた後、 HAT 培地にてハイプリ ドーマをスク リ一二ングした。
ゥサギ抗ラッ ト IgG 抗体 （Cappel製） をコートしたプレー トにハ イブリ ドーマ培養上清を加えた後、 マウス可溶性 IL- 6受容体を反応 させた。 次いで、 ゥサギ抗マウス IL- 6受容体抗体およびアルカ リ フ ォスファターゼ標識ヒッジ抗ゥサギ IgG による ELISA 法によりマウ ス可溶性 IL- 6受容体に対する抗体を産生するハイプリ ドーマをスク リーニングした。 抗体の産生が確認されたハイブリ ドーマクローン は 2 回のサブスク リーニングを行い、 単一のハイプリ ドーマクロー ンを得た。 このク ローンを MR16 - 1と名付けた。
このハイブリ ドーマが産生する抗体のマウス IL- 6の情報伝達にお ける中和活性を MH60.BSF2 細胞 (Matsuda, T. et al. , J. Immunol . (1988) 18， 951-956) を用いた 3H チミジンの取込みで調べた。 96ゥェルプレートに MH60.BSF2 細胞を 1 X104 個/ 200 μ ΐ/ゥエルと なるように調製した。 このプレートに 10pg/ml のマウス IL-6と MR1 6 - 1抗体又は RS12抗体を 12.3〜1000ng/ml 加えて 37°C、 5%C02 で 44 時間培養した後、 l Ci/ ゥエルの 3H チミジンを加えた。 4 時間 後に 3H チミジンの取込みを測定した。 その結果 MR16- 1抗体は MH60 .BSF2 細胞の 3H チミジン取込みを抑制した。
したがって、 ハイブリ ドーマ MR16- 1 (FERM BP-5875) が産生する 抗体は、 IL-6の IL - 6受容体に対する結合を阻害することが明らかと なった。 産業上の利用可能性
本発明によ り、 抗 Iい 6受容体抗体等の IL-6アンタゴニス トが血中 MMP- 3濃度低下効果効果を有することが示された。 したがって、 Iい 6アンタ ゴニス トは血中 MMP- 3濃度低下、 軟骨破壌抑制剤および Zま たは変形性関節症治療剤として有用であることが明らかにされた。 特許協力条約第 13規則の 2の寄託された微生物への言及及び寄託 機関
寄託機関 名 称 ： 工業技術院生命工学工業技術研究所
あて名 ： 日本国茨城県つくば市東 1丁目 1 一 3 微生物（1) 名 称 ： PM- 1
寄託番号 ： FERM BP - 2998
寄託日 ： 1989年 7月 12日
(2) 名 孙 ： Rat-mouse hybr iaoma MR16- 1
寄託番号 ： FERM BP - 5875
寄託日 ： 1997年 3月 13日
(3) 名 称 ： HB- 101-pIBIBSF2R
寄託番号 ： FERM BP-2232
寄託日 ： 1989年 1月 9 日
寄 St機 ： National し ollections of Industrial , food and Mar ine Bacteria Limited
あて名 ： 23 St Macher Drive, Aberdeen AB2 IRY, UNITED KINGD
OM
(4) 名 称 ： E. coli DH5a pPM-k3
38 訂芷きれた用紙 （規則 91) 寄託番号 ： MCIMB 40366
寄託日 ： 1991年 2月 12日
(5) 名 称 ： E. coli DH5a pPM-hl
寄託番号 ： MCIMB 40362
寄託日 ： 1991年 2月 12日 '
39 訂正きれた用紙 （規則 91)

Claims

請 求 の 範 囲
1 . イ ンターロイキン- 6 ( IL-6) アンタ ゴニス トを有効成分とし て含有する血中マ ト リ ックスメタ口プロテアーゼ一 3 ( MMP-3) 濃 度低下剤。
2 , IL- 6アンタゴニス トが IL- 6受容体に対する抗体であることを 特徴とする請求項 1記載の血中匪 P- 3濃度低下剤。
3 . IL-6受容体に対する抗体が IL- 6受容体に対するモノクローナ ル抗体であることを特徴とする請求項 2に記載の血中 MMP-3濃度低 下剤。
4 . IL - 6受容体に対する抗体がヒ ト IL- 6受容体に対するモノ ク ロ ーナル抗体であることを特徴とする請求項 3に記載の血中 MMP - 3濃 度低下剤。
5 . IL- 6受容体に対する抗体がマゥス IL-6受容体に対するモノク 口ーナル抗体であるこ とを特徴とする請求項 3に記載の血中 MMP - 3 濃度低下剤。
6 . IL - 6受容体に対する抗体が組換え型抗体であることを特徴と する請求項 2〜 5のいずれか 1項に記載の血中 MMP- 3濃度低下剤。
7 . ヒ ト IL - 6受容体に対するモノク口ーナル抗体が PM - 1抗体であ ることを特徴とする請求項 4に記載の血中 MMP - 3濃度低下剤。
8 . マウス IL-6受容体に対するモノク ローナル抗体が MR16- 1抗体 であることを特徴とする請求項 5に記載の血中 MMP - 3濃度低下剤。
9 . IL-6受容体に対する抗体が IL-6受容体に対するキメラ抗体又 はヒ ト型化抗体であることを特徴とする請求項 2〜 4のいずれか 1 項に記載の血中匪 P- 3濃度低下剤。
10. IL - 6受容体に対するヒ ト型化抗体がヒ ト型化 PM - 1抗体である ことを特徴とする請求項 9に記載の血中匪 P - 3濃度低下剤。
11. イ ンターロイキン- 6 ( IL-6) アンタゴニス トを有効成分と し て含有する軟骨破壊抑制剤。
12. IL-6アンタゴニス トが IL- 6受容体に対する抗体であることを 特徴とする請求項 1 1記載の軟骨破壊抑制剤。
13. IL-6受容体に対する抗体が IL-6受容体に対するモノクローナ ル抗体であることを特徴とする請求項 1 2に記載の軟骨破壊抑制剤
14. IL-6受容体に対する抗体がヒ ト IL-6受容体に対するモノク ロ ーナル抗体であることを特徴とする請求項 1 3に記載の軟骨破壊抑 制剤。
15. IL- 6受容体に対する抗体がマゥス IL- 6受容体に対するモノク ロ ーナル抗体であることを特徴とする請求項 1 3に記載の軟骨破壊 抑制剤。
16. IL- 6受容体に対する抗体が組換え型抗体であることを特徴と する請求項 1 2 〜 1 5のいずれか 1項に記載の軟骨破壊抑制剤。
17. ヒ ト IL - 6受容体に対するモノ ク ローナル抗体が PM-1抗体であ ることを特徴とする請求項 1 4に記載の軟骨破壌抑制剤。
18. マウス IL-6受容体に対するモノク ローナル抗体が MR16- 1抗体 であることを特徴とする請求項 1 5に記載の軟骨破壊抑制剤。
19. IL- 6受容体に対する抗体が IL- 6受容体に対するキメラ抗体又 はヒ ト型化抗体であるこ とを特徴とする請求項 1 2 〜 1 4のいずれ か 1項に記載の軟骨破壊抑制剤。
20. IL-6受容体に対するヒ ト型化抗体がヒ ト型化 PM-1抗体である ことを特徴とする請求項 1 9に記載の軟骨破壊抑制剤。
21. イ ンターロイキン - 6 ( IL-6) アンタゴニス トを有効成分と し て含有する変形性関節症治療剤。
22. ( 1 ) 検体中の匪 P- 3濃度を指標と し、 かつ ( 2 ) ( a ) IL-6アンタ ゴニス トを有効成分と した薬剤、 （ b ) IL- 6アンタゴニス トを有効成分と した軟骨破壊抑制剤、 または （ c ) IL- 6アンタゴニス トを有効成分と した変形性関節症治療剤の効果 の検出 · 評価 ·判定方法。
23. ( 1 ) IL- 6アンタゴニス トを有効成分と した薬剤の軟骨破壊 抑制作用、 または （ 2 ) IL- 6アンタゴニス トを有効成分と した薬剤 の変形性関節症治療効果、 を検出 · 評価 · 判定するために使用する ことを特徴とする検体中の匪 P - 3濃度測定用試薬。
24. 抗匪 P-3抗体を含有することを特徴とする請求項 23の試薬。
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Families Citing this family (81)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8017121B2 (en) * 1994-06-30 2011-09-13 Chugai Seiyaku Kabushika Kaisha Chronic rheumatoid arthritis therapy containing IL-6 antagonist as effective component
HU225392B1 (en) * 1994-10-21 2006-11-28 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Use of an antibody againts interleukin-6-receptor for producing a pharmaceutical composition for treating anemia and cachexia caused by il-6 production
CA2284271C (en) 1997-03-21 2012-05-08 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha A preventive or therapeutic agent for sensitized t cell-mediated diseases comprising il-6 antagonist as an active ingredient
US20020187150A1 (en) * 1997-08-15 2002-12-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Preventive and/or therapeutic agent for systemic lupus erythematosus comprising anti-IL-6 receptor antibody as an active ingredient
EP1074268B1 (en) * 1998-03-17 2008-01-16 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Preventives or remedies for inflammatory intestinal diseases containing il-6 receptor antagonist antibodies
UA80091C2 (en) * 2001-04-02 2007-08-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Remedies for infant chronic arthritis-relating diseases and still's disease which contain an interleukin-6 (il-6) antagonist
PL213311B1 (pl) 2002-02-14 2013-02-28 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Preparat roztworu zawierajacego przeciwcialo
GB2401040A (en) 2003-04-28 2004-11-03 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Method for treating interleukin-6 related diseases
RU2392967C2 (ru) * 2003-10-17 2010-06-27 Тугаи Сейяку Кабусики Кайся Терапевтический агент для мезотелиомы
US8617550B2 (en) * 2003-12-19 2013-12-31 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Treatment of vasculitis with IL-6 antagonist
WO2005090405A1 (ja) 2004-03-24 2005-09-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha インターロイキン－６受容体に対するヒト型化抗体のサブタイプ
WO2006106905A1 (ja) * 2005-03-31 2006-10-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 会合制御によるポリペプチド製造方法
BRPI0617664B8 (pt) * 2005-10-21 2021-05-25 Chugai Pharmaceutical Co Ltd uso de um anticorpo que reconhece a il-6 para a produção de uma composição farmacêutica para tratar o enfarte do miocárdio ou suprimir a remodelagem ventricular esquerda depois do enfarte do miocárdio
AR057582A1 (es) * 2005-11-15 2007-12-05 Nat Hospital Organization Agentes para suprimir la induccion de linfocitos t citotoxicos
AU2007208678B2 (en) * 2006-01-27 2013-01-10 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Therapeutic agents for diseases involving choroidal neovascularization
ES2892925T3 (es) * 2006-03-31 2022-02-07 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Métodos para controlar la farmacocinética en sangre de anticuerpos
CN105177091A (zh) 2006-03-31 2015-12-23 中外制药株式会社 用于纯化双特异性抗体的抗体修饰方法
WO2007116962A1 (ja) * 2006-04-07 2007-10-18 Osaka University 筋再生促進剤
MY147468A (en) 2006-06-02 2012-12-14 Regeneron Pharma High affinity antibodies to human il-6 receptor
US8080248B2 (en) 2006-06-02 2011-12-20 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Method of treating rheumatoid arthritis with an IL-6R antibody
WO2008019061A2 (en) * 2006-08-03 2008-02-14 Vaccinex, Inc. Anti-il-6 monoclonal antibodies and uses thereof
US9725514B2 (en) * 2007-01-23 2017-08-08 Shinshu University Chronic rejection inhibitor
US9701747B2 (en) 2007-05-21 2017-07-11 Alderbio Holdings Llc Method of improving patient survivability and quality of life by anti-IL-6 antibody administration
US20090238825A1 (en) * 2007-05-21 2009-09-24 Kovacevich Brian R Novel rabbit antibody humanization methods and humanized rabbit antibodies
EP2164514B1 (en) 2007-05-21 2016-12-14 AlderBio Holdings LLC Antibodies to il-6 and use thereof
US7906117B2 (en) * 2007-05-21 2011-03-15 Alderbio Holdings Llc Antagonists of IL-6 to prevent or treat cachexia, weakness, fatigue, and/or fever
US8178101B2 (en) * 2007-05-21 2012-05-15 Alderbio Holdings Inc. Use of anti-IL-6 antibodies having specific binding properties to treat cachexia
US8252286B2 (en) * 2007-05-21 2012-08-28 Alderbio Holdings Llc Antagonists of IL-6 to prevent or treat thrombosis
US8062864B2 (en) 2007-05-21 2011-11-22 Alderbio Holdings Llc Nucleic acids encoding antibodies to IL-6, and recombinant production of anti-IL-6 antibodies
US8404235B2 (en) 2007-05-21 2013-03-26 Alderbio Holdings Llc Antagonists of IL-6 to raise albumin and/or lower CRP
EP2162469A4 (en) * 2007-05-21 2012-08-01 Alderbio Holdings Llc NEW METHODS OF HUMANIZING RABBIT ANTIBODIES AND HUMANIZED RABBIT ANTIBODIES
US9096651B2 (en) 2007-09-26 2015-08-04 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method of modifying isoelectric point of antibody via amino acid substitution in CDR
WO2009041613A1 (ja) * 2007-09-26 2009-04-02 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 抗体定常領域改変体
ES2585480T3 (es) * 2007-12-05 2016-10-06 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anticuerpo anti-NR10 y uso del mismo
PE20091174A1 (es) 2007-12-27 2009-08-03 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Formulacion liquida con contenido de alta concentracion de anticuerpo
CN107551270A (zh) 2008-04-11 2018-01-09 中外制药株式会社 与多个分子的抗原反复结合的抗原结合分子
CA2724279C (en) 2008-05-13 2017-03-07 Novimmune S.A. Anti-il-6/il-6r antibodies and methods of use thereof
KR101665729B1 (ko) * 2008-06-05 2016-10-12 국립연구개발법인 고쿠리츠간켄큐센터 신경침윤 억제제
TWI440469B (zh) 2008-09-26 2014-06-11 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Improved antibody molecules
US8337847B2 (en) 2008-11-25 2012-12-25 Alderbio Holdings Llc Methods of treating anemia using anti-IL-6 antibodies
US8323649B2 (en) * 2008-11-25 2012-12-04 Alderbio Holdings Llc Antibodies to IL-6 and use thereof
US8420089B2 (en) 2008-11-25 2013-04-16 Alderbio Holdings Llc Antagonists of IL-6 to raise albumin and/or lower CRP
US8992920B2 (en) 2008-11-25 2015-03-31 Alderbio Holdings Llc Anti-IL-6 antibodies for the treatment of arthritis
US9212223B2 (en) 2008-11-25 2015-12-15 Alderbio Holdings Llc Antagonists of IL-6 to prevent or treat thrombosis
US9452227B2 (en) 2008-11-25 2016-09-27 Alderbio Holdings Llc Methods of treating or diagnosing conditions associated with elevated IL-6 using anti-IL-6 antibodies or fragments
JO3672B1 (ar) 2008-12-15 2020-08-27 Regeneron Pharma أجسام مضادة بشرية عالية التفاعل الكيماوي بالنسبة لإنزيم سبتيليسين كنفرتيز بروبروتين / كيكسين نوع 9 (pcsk9).
WO2010107110A1 (ja) 2009-03-19 2010-09-23 中外製薬株式会社 抗体定常領域改変体
EP3674317B1 (en) 2009-03-19 2024-12-11 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody constant region variant
KR20120024763A (ko) 2009-05-15 2012-03-14 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 항ａｘｌ 항체
AU2010278067B2 (en) * 2009-07-31 2016-10-27 Shin Maeda Cancer metastasis inhibitor
EP2481752B1 (en) 2009-09-24 2016-11-09 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Modified antibody constant regions
KR102319842B1 (ko) 2009-10-26 2021-11-01 에프. 호프만-라 로슈 아게 글리코실화된 면역글로불린의 제조 방법
EP2504030A4 (en) 2009-11-24 2013-06-26 Alderbio Holdings Llc IL-6 ANTAGONISTS FOR INCREASING ALBUMIN AND / OR REDUCING CRP
US9775921B2 (en) 2009-11-24 2017-10-03 Alderbio Holdings Llc Subcutaneously administrable composition containing anti-IL-6 antibody
JO3417B1 (ar) 2010-01-08 2019-10-20 Regeneron Pharma الصيغ المستقرة التي تحتوي على الأجسام المضادة لمضاد مستقبل( interleukin-6 (il-6r
EP2543730B1 (en) 2010-03-04 2018-10-31 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody constant region variant
WO2011149051A1 (ja) 2010-05-28 2011-12-01 中外製薬株式会社 抗腫瘍t細胞応答増強剤
MX2013005024A (es) 2010-11-08 2013-11-21 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpo anti-il-6 receptor administrado subcutaneamente.
WO2012071561A2 (en) 2010-11-23 2012-05-31 Alder Biopharmaceuticals, Inc. Anti-il-6 antibodies for the treatment of anemia
EP4231014A3 (en) 2010-11-30 2024-08-14 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule capable of binding to plurality of antigen molecules repeatedly
KR20220136466A (ko) 2011-01-28 2022-10-07 사노피 바이오테크놀로지 특정 대상자 그룹의 치료 방법에 이용하기 위한 ｐｃｓｋ9에 대한 인간 항체
AR087305A1 (es) 2011-07-28 2014-03-12 Regeneron Pharma Formulaciones estabilizadas que contienen anticuerpos anti-pcsk9, metodo de preparacion y kit
TWI589299B (zh) 2011-10-11 2017-07-01 再生元醫藥公司 用於治療類風濕性關節炎之組成物及其使用方法
WO2014200018A1 (ja) 2013-06-11 2014-12-18 独立行政法人 国立精神・神経医療研究センター 再発寛解型多発性硬化症（ｒｒｍｓ）患者の治療予後予測方法、及び新規治療適応判断方法
CA2913687C (en) 2013-07-04 2022-12-13 F. Hoffmann-La Roche Ag Interference-suppressed immunoassay to detect anti-drug antibodies in serum samples
RU2758952C1 (ru) 2013-09-27 2021-11-03 Чугаи Сейяку Кабусики Кайся Способ получения полипептидного гетеромультимера
US9017678B1 (en) 2014-07-15 2015-04-28 Kymab Limited Method of treating rheumatoid arthritis using antibody to IL6R
BR112017014067B1 (pt) 2015-02-27 2021-01-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha usos de um anticorpo receptor de il-6 para no tratamento de doenças relacionadas a il-6
JP7082484B2 (ja) 2015-04-01 2022-06-08 中外製薬株式会社 ポリペプチド異種多量体の製造方法
JP6875683B2 (ja) 2015-05-19 2021-05-26 国立研究開発法人国立精神・神経医療研究センター 多発性硬化症（ｍｓ）患者の新規治療適用判断方法
AU2016308111A1 (en) 2015-08-18 2018-03-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-PCSK9 inhibitory antibodies for treating patients with hyperlipidemia undergoing lipoprotein apheresis
MX2018007781A (es) 2015-12-28 2018-09-05 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Metodo para promover la eficiencia de purificacion del polipeptido que contiene la region de fragmento cristalizable (fc).
WO2017147169A1 (en) 2016-02-22 2017-08-31 Ohio State Innovation Foundation Chemoprevention using controlled-release formulations of anti-interleukin 6 agents, synthetic vitamin a analogues or metabolites, and estradiol metabolites
SG10201607778XA (en) 2016-09-16 2018-04-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-Dengue Virus Antibodies, Polypeptides Containing Variant Fc Regions, And Methods Of Use
US11033496B2 (en) 2017-03-17 2021-06-15 The Regents Of The University Of Michigan Nanoparticles for delivery of chemopreventive agents
JP7185884B2 (ja) 2017-05-02 2022-12-08 国立研究開発法人国立精神・神経医療研究センター Ｉｌ－６及び好中球の関連する疾患の治療効果の予測及び判定方法
EP3698808B1 (en) 2017-10-20 2025-01-01 Hyogo College Of Medicine Anti-il-6 receptor antibody-containing medicinal composition for preventing post-surgical adhesion
CN116327926A (zh) 2018-03-15 2023-06-27 中外制药株式会社 对寨卡病毒具有交叉反应性的抗登革热病毒抗体及使用方法
WO2020160465A1 (en) 2019-01-31 2020-08-06 Sanofi Biotechnology Anti-il-6 receptor antibody for treating juvenile idiopathic arthritis
EP3947737A2 (en) 2019-04-02 2022-02-09 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods of predicting and preventing cancer in patients having premalignant lesions
MX2021014892A (es) 2019-06-04 2022-06-27 Sanofi Biotechnology Composiciones y metodos para el tratamiento del dolor en sujetos con artritis reumatoide.

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0522169A1 (en) * 1991-01-21 1993-01-13 Fuji Yakuhin Kogyo Kabushiki Kaisha Antihuman stromelysin monoclonal antibody and diagnosis of rheumatoid arthritis by enzyme immunoassay
EP0983767A1 (en) * 1997-03-21 2000-03-08 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Preventives or remedies for sensitized t cell-related diseases containing il-6 antagonists as the active ingredient

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5670373A (en) * 1988-01-22 1997-09-23 Kishimoto; Tadamitsu Antibody to human interleukin-6 receptor
DE122009000019I1 (de) * 1991-04-25 2009-07-16 Chugai Seiyaku K K 5 1 Rekombinierte humane antikörper gegen den humanen interleukin-6 rezeptor
US5888510A (en) * 1993-07-21 1999-03-30 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Chronic rheumatoid arthritis therapy containing IL-6 antagonist as effective component
US20020187150A1 (en) * 1997-08-15 2002-12-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Preventive and/or therapeutic agent for systemic lupus erythematosus comprising anti-IL-6 receptor antibody as an active ingredient
EP1074268B1 (en) * 1998-03-17 2008-01-16 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Preventives or remedies for inflammatory intestinal diseases containing il-6 receptor antagonist antibodies
UA80091C2 (en) * 2001-04-02 2007-08-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Remedies for infant chronic arthritis-relating diseases and still's disease which contain an interleukin-6 (il-6) antagonist
CA2481535C (en) * 2002-04-12 2010-08-17 Pfizer Inc. Use of ep4 receptor ligands in the treatment of il-6 involved diseases

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0522169A1 (en) * 1991-01-21 1993-01-13 Fuji Yakuhin Kogyo Kabushiki Kaisha Antihuman stromelysin monoclonal antibody and diagnosis of rheumatoid arthritis by enzyme immunoassay
EP0983767A1 (en) * 1997-03-21 2000-03-08 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Preventives or remedies for sensitized t cell-related diseases containing il-6 antagonists as the active ingredient

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BRENNEISEN, PETER ET AL.: "Ultraviolet-B induction of interstitial collagenase and stromelysin-1 occurs in human dermalfibroblasts via an autocrine interleukin-6-dependent loop", FEBS LETTERS, vol. 449, no. 1, 1999, pages 36 - 40, XP002937047 *
DATABASE CA [online] AMERICAN CHEMICAL SOCIETY (ACS) (COLUMBUS OH, USA); accession no. STN Database accession no. 121:298020 *
HOMANDBERG, GENE A. ET AL.: "Fibronectin-fragment-induced cartilage chondrolysis is associated with release of catabolic cytokines", BIOCHEMICAL JOURNAL, vol. 321, no. 3, 1997, pages 751 - 757, XP002937046 *
OKADA, YASUNORI: "Kansetsu Hakai ni okeru Matrix Metallo-protease no Yakuwari", NIPPON SEIKEI GEKA GAKKAI ZASSHI, vol. 68, no. 9, 1994, pages 808 - 817, XP002937048 *

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