WO2002026965A1

WO2002026965A1 - Acide nucleique d'un nouveau gene humain associe a la kinesine, proteine codees par cet acide nucleique, fragment de peptide de cet acide nucleique et agents anticancereux comprenant cet acide nucleique et similaire

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Publication number: WO2002026965A1
Application number: PCT/JP2001/008635
Authority: WO
Inventors: Akira Nakagawara
Original assignee: Hisamitsu Pharmaceutical Co., Inc.; Chiba-Prefecture
Priority date: 2000-09-29
Filing date: 2001-10-01
Publication date: 2002-04-04
Also published as: JPWO2002026965A1; DE60133023D1; US7214782B2; EP1329504A1; US20040072778A1; EP1329504B1; JP3913171B2; EP1329504A4; AU2001292326A1; DE60133023T2

Description

明細書

新規ヒトキネシン関連遺伝子の核酸、該核酸によってコードされるタンパク質、その部分ペプチド、および該核酸等からなる抗癌剤技術分野

本発明は、新規ヒトキネシン関連遺伝子と、該遺伝子がコードするタンパク質に関する情報、並びにそれらを癌の治療または予後の診断に応用することに関する。背景技術

ニューロンにおける物質輸送

ニューロンの軸索内では種々の物質が、一定の秩序に従って輸送されており、その速度によって「速い輸送」と「遅い輸送」の 2つに分けられる。「速い輸送」には、細胞体から軸索末端へ向かう順行性の輸送と、その反対方向の逆行性輸送とがある。「速い輸送」は、一般の細胞内でも見られる定方向性の運動で、微小管の上を細胞内小器官についた分子モー夕一（モータータンパク質）が移動することによって生じる。

軸索輸送におけるキネシンの役割

キネシンは細胞内小器官を微小管のプラス端に運び、神経軸索内では速い順行性輸送を行う。キネシン分子は、 120 kD aの重鎖 2個と、 64kDaの軽鎖 2個とのペプチドからなるヘテロ 4量体である。前記重鎖の N末端側は、球状の頭部となって、 ATPおよび微小管と結合するモー夕一ドメインを構成し、さらにロッド状の体部と、扇状の尾部とからなり、全長は約 80 nmである（Hir ok aw a N. ら： Ce l l 56 : 867— 878 , ( 1989 ))。前記軽鎖はスプライシングの違いによって、 3つの分子種を生じ（Cyr JL. ら： P ro c Nat l Acad Sc i USA 88: 10114-10118, (1991))、臓器により差異がある。軽鎖は重鎖尾部につき、重鎖尾部と軽鎖で膜性小器官につく。

キネシン関連遺伝子

最近いくつかのキネシン関連遺伝子が発見され、タンパク質の構造解析が行われた。これらのキネシン関連遺伝子は、モー夕一部の構造が良く保存されている (E y e r J. ら： Nature 391 : 584— 587, (1998))。現在までにマウスで 30種以上のキネシン関連タンパク質が発見されているが、全てモ一夕一部の構造を有し（Gibbons IR. ら： Ce l l Mot 11 Cyt oske l 32 : 136— 144，（1995 ))、これらはキネシンス一パーファミリーと呼ばれている。最近、キネシンスーパーファミリ一の系統樹が発表され（Hirokawa N. ら： Sc ience 279 : 519-52 6, ( 1998))、これらのいくつかが軸索輸送に関与することが分かった。上記のキネシンスーパーファミリーの研究は、マウスで精力的に進められ、これらは K I Fと呼ばれているが（A i z awa H. ら： J Ce l l Bio 1 119 : 1287— 1296，（ 1992 ))、モータードメインの位置により、 N末端側にあるもの、中央にあるもの、 C末端側にあるものと 3つに大別されている。

N末端側型のキネシンスーパーフアミリー

N末端側型のキネシンスーパーフアミリーは、さらに、 KH C；、 Un c 104、 RP85/95、 BimC；、 MKLP 1、クロモキネシンのサブファミリ一に分類される。このうち B imCファミリ一は、哺乳動物では同定されていない。

KHCフアミリーは、マウスで 3種（KIF5B、 KI F5A、 KIF5C)ヽヒトで 2種（HsuKHC；、 HsnKHC) 同定され、無脊椎動物では 1種のみが同定されている。このファミリ一は、遍在するもの（KIF5B、 HsuKH C) と、神経系特異的なもの（KIF5A、 KIF5 C、 HsnKHC) に分けることができる。 Hs nKHCは神経細胞体に、 H s uKHCは軸索内にも分布する（Ni c las J. ら： Neuron 12 : 1059-1072, (19

Un c 104ファミリ一は、ヒトでは同定されていないが、マウスでは K IF 1 Aと K I F 1 Bとが知られている。 K I F 1 Aは 1695個のアミノ酸、 20 0 kD aと大きく単頭で働き、 in v i t r oでは 1. 2— 1. 5〃mZsで微小管のプラス端側に向かい、シナプス小胞前駆体を運ぶ（Ok ad a Y. ら： Ce l l 81 : 769— 780，（1995))。また、遺伝子夕一ゲッティングでマウスは重篤な運動感覚障害を示し、生後間もなく死亡する。

K I F 1Bは 1150個のアミノ酸からなり、やはり単頭で働き 0. 5 zmZ sで微小管のプラス端側に向かい、ミトコンドリアを運ぶ（Nangaku M. ら： Ce l l 79 : 1209— 1220, ( 1994))。

RP85/95フアミリ一であるマウス K IF3Aとマウス KI F3Bは、双頭であるがヘテロダイマ一で存在し、 KAP 3を随伴しヘテロトリマーとなる。これらのキネシン関連タンパク質は、 0. 3〃m/sで微小管のプラス端側に向かい、神経非特異的で、シナプス小胞より大きい膜小胞を運ぶ（Yamazak i H. ら： Proc Nat l Acad Sc i USA 93 : 8443 一 8448，（1996 ))。

MKLPフアミリーは、ヒトでは 1種（ヒト MKLP) が知られている。ヒト MKLP 1は、後期 Bにおける紡錘体の伸長、収縮環の形成、細胞質分裂の完了等の機能をもっている。

クロモキネシンフアミリーであるマウス K I F 4は、 1231個のアミノ酸からなり、 116 nmと長く双頭である。速度は 0. 2〃m/ sであり、成長円錐への膜小胞輸送を行う。成体では免疫系臓器に多い（Shingyo j i C. ら： Nature 393 : 711— 714, ( 1998))。

中央型のキネシンス一パーフアミリー

中央型のキネシンスーパ一ファミリ一は、ヒトでは同定されていない。マウスの K I F 2は 81 kDaで双頭になり、 0. 4 m/sで微小管のプラス端側に向かう。このキネシン関連タンパク質は、神経非特異的であるが、幼若神経系に発現し、成長円錐への膜小胞輸送を行う（Noda Y. ら： J Ce l l B i o l 129 : 157— 167, (1995 ))。

C末端側型のキネシンスーパーフアミリ一

C末端側型のキネシンスーパーフアミリ一もヒトでは同定されていない。マウスでは 3種（KI FC1、 KIFC2、 KIF C 3 )のキネシンが知られている。 K I FC 2は末梢神経にはなく、樹状突起に多く存在し、主に樹状突起の末端に向かい多胞小体を運ぶ（Sai t o N. ら： Neuron 18 : 425 -4 38 ( 1997))。

新規ヒトキネシン関連遺伝子断片のクローニング

KIAA0591の cDNA (GenBank受理番号： ABO 1 1 163) は、分子量分画したヒト脳の cDNAライブラリ一よりクローニングされた（N agas e T. ら： DNA Res. 5 : 31— 39 (1998))。

この cDNAは 5368個の塩基より構成され、 1338個のアミノ酸からなるヒト神経軸索におけるシナブス小胞のトランスポー夕一の遺伝子と非常に高いホモロジ一を有する新規遺伝子の部分断片であった。 KIAA 0591の cDN Aの 5' 末端には転写開始コドンが存在せず、対応する約 9. 5kbの転写物に比べて短いため、より長い完全長 c DNAの存在が予想されていた。

そこで、本発明者は、 K I AA0591を含む完全長の cDNAを得るためにヒト脳黒質の cDNAライブラリーのスクリーニングを行ったが、その完全長の cDNAを明らかするまでには至っておらず、従ってその機能も当然ながら不明であった。

一方、本発明者らは K I AA 0591の完全長 cDNAを明らかにする過程で、キネシンスーパ一フアミリーに共通して見られるモー夕一ドメインに該当する部分を有さないキネシン関連遺伝子を見出した。この遺伝子の翻訳領域の塩基配列を配列表の配列番号 3に、また該領域から翻訳されるタンパク質を配列番号 1にそれそれ示す。

さらに、この遺伝子が、神経芽細胞腫等において頻繁に欠失が認められるヒト 1番染色体短腕 3 6. 2 - 36. 3に存在していること、 8種類の神経芽細胞腫と 1 5種類の神経芽細胞腫由来細胞株で遺伝子をコードする領域内に変異は認められないこと、成人の幅広い組織で発現しており、特に脳、腎臓、骨格筋、膝臓で強発現していること、ヒト胎児では脳で強発現していること等を見出した（N akagawar a A .ら： I n t e r n a t i o n a 1 J ourna l o f Onc o l o gy 1 6 : 907— 9 1 6 ( 2000))。

しかしながら、上記モータードメインを有さないキネシン関連遺伝子およびそのタンパク質については、その機能が不明のままであった。

足場非依存的増殖と癌

ところで、正常な接着細胞は増殖のために足場にしっかりと接着する必要がある。接着できない物質の表面で培養すると、細胞は長期間生きてはいるが、増殖はしない。例えば、正常細胞をァガロースゲルのような足場のない半固形培地に懸濁すると、生命の維持に必要な代謝等は行うが増殖は抑制される。一方、癌細胞のように悪性形質転換した細胞は、一般に接着に対する要求を失っており、足場のない半固形培地に懸濁しても、コロニーを形成し増殖することができる。この特徴は、悪性形質転換した細胞が腫瘍を形成する能力と非常に関連深い。すなわち、足場非依存的に増殖する細胞を、動物に接種すると効率良く腫瘍を形成する。 Darne 11ら： MOLE CULAR CELL B I OLOGY S e c ond Ed i t i on 24 : 963— 9 67 ( 1 993 ) を参照。

細胞接着と癌の浸潤，転移

癌が悪性腫瘍たる所以は浸潤、転移にある。現在までその機序の解明を目指して精力的な研究がなされてきたが、浸潤、転移は癌細胞と宿主細胞との相克の結果として生じる複雑な現象で、その全貌は未だ不明である。血行性転移は、原発巣からの癌細胞の浸潤、血管内侵入、運搬、定着、血管外脱出、初期増殖を経て成立する。リンパ行性転移、播種性転移、管内性転移も類似した過程を経るものと考えられる。これらの過程の随所で癌細胞と癌細胞、癌細胞と正常細胞、癌細胞と細胞外基質との接着と解離が起こる。

癌細胞間の接着の低下は多くの癌に見られ浸潤、転移能との関連が注目されている。また癌細胞は転移成立過程で多種多様な正常細胞と接するが、内皮細胞との接着は、癌細胞が内皮細胞に被包されるもの、内皮細胞頂面に接着するもの、内皮細胞基底面に覆われるものがあり、癌細胞の血管内侵入や、血管外脱出と深く関連している。癌細胞と細胞外基質との接着も同様に、随所で観察される。また癌細胞が正常細胞に接着後、細胞融合を起こし、正常細胞を死滅させると考えられる所見も観察されている（鶴尾隆ら：癌転移の分子機構メジカルビユー社（ 1993))。

以上のように、本発明者らが先に、発見したモータードメインを有さない新規キネシン関連遺伝子およびそれがコードするタンパク質の機能は、不明のままであった。また、 K I AA 059 1を含む完全長の cDNAは、その存在が予想されていたにもかかわらず、未だ確認、同定されていなかった。発明の開示

本発明は、かかる事情に鑑みてなされたものであり、モー夕一ドメインを有する新規ヒトキネシン関連遺伝子に関する塩基配列情報を提供することを目的とする。さらに、本発明は、前記モータードメインを有する新規ヒトキネシン関連遺伝子、およびモータードメインを有さないキネシン関連遺伝子がコ一ドするタンパク質の機能に関する情報を提供することを目的とする。

本発明者は、鋭意研究した結果、モー夕一ドメインを有さないキネシン関連遺伝子（配列番号 3) よりも 5' 末端がさらに長い、新規遺伝子を Rap i d A mp l i f i c at i on o f cDNA End s (RACE) 法によりクローニングし、このモータードメインを有するキネシン関連遺伝子の完全長 cD NAのシークェンシングに成功した。ここで便宜上、このモ一夕一ドメインを有する新規キネシン関連遺伝子を K I F 1 b— ?と名付け、その cDNA配列（塩基配列）を配列表の配列番号 4に示す。

さらに、本発明者らは、 K I F 1 b— ?遺伝子が神経芽細胞腫の予後良好な臨床組織でのみ発現が増強していることを見出した。

また、さらに K I F 1 b— ?遺伝子、およびモータ一ドメインを有さないキネシン関連遺伝子の発現をアンチセンス RN Aで抑制すると、本来足場依存的にのみ増殖する正常細胞が足場非依存的に増殖すること、すなわちこれら遺伝子が正常細胞の癌化を制御する機能を有することを見出した。

さらに本発明者は、 KI F lb— ?遺伝子、およびモー夕一ドメインを有さない新規キネシン関連遺伝子の発現をアンチセンス RN Aで抑制すると、正常細胞が腫瘍形成することも見出した。従って、これらの遺伝子が欠失すると、正常細胞が腫瘍化し易くなる。

すなわち、本発明は、以下の 1〜12記載の核酸、およびタンパク質またはその薬学的に許容できる塩を提供する。さらに、本発明は、以下の 13〜17に記載の核酸、およびタンパク質またはその薬学的に許容できる塩の治療上または診断用上の用途を提供する。

1. 配列表の配列番号 4に記載の塩基配列を有する核酸。

2. 配列表の配列番号 2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列を有する核酸。

3. 上記 1または 2に記載の核酸の断片である核酸。

4. 上記 1〜3のいずれか 1つに記載の核酸にハイブリダィズしうる核酸。

5. 配列表の配列番号 7に記載の塩基配列を有する核酸。

6. 上記 1または 2に記載の核酸に対するアンチセンス核酸。

7. 正常細胞に導入することにより、正常細胞を足場非依存的に増殖させることを特徴とする、配列表の配列番号 7に記載の塩基配列を有するアンチセンス核酸。 8 . 配列表の配列番号 2に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、またはその薬学的に許容できる塩。

9 . 配列表の配列番号 2に記載のァミノ酸配列に実質的に同一のァミノ酸配列を有し、且つその欠失が正常細胞の腫瘍化を誘起する活性を有するタンパク質、またはその薬学的に許容できる塩。

1 0 . 前記配列表の配列番号 2に記載のアミノ酸配列に実質的に同一のァミノ酸配列が、配列番号 2に記載のアミノ酸配列における一若しくは複数のアミノ酸を置換、欠失、または付加してなるアミノ酸配列であることを特徴とする、上記 9 に記載のタンパク質、またはその薬学的に許容できる塩。

1 1 . 配列番号 1に記載のアミノ酸配列における一若しくは複数のアミノ酸を置換、欠失、または付加してなるアミノ酸配列を有し、且つその欠失が正常細胞の腫瘍化を誘起する活性を有するタンパク質、またはその薬学的に許容できる塩。

1 2 . 配列表の配列番号 2に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の機能的に有効な断片である部分ペプチド、またはその薬学的に許容できる塩。

1 3 . 配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、またはその薬学的に許容できる塩を含む抗癌剤。

1 4 . 配列表の配列番号 2に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、またはその薬学的に許容できる塩を含む抗癌剤。

1 5 . 配列表の配列番号 3に記載の塩基配列を有する核酸を含む抗癌剤。

1 6 . 配列表の配列番号 4に記載の塩基配列を有する核酸を含む抗癌剤。

1 7 . 上記 1に記載の核酸またはその断片をヒト神経芽細胞腫の臨床組織サンプルから検出することを特徴とする、ヒト神経芽細胞腫の予後の診断方法。

1 8 . 以下の（a)または (b)の核酸を含む核酸プローブ：

(a)配列表の配列番号 4に示す塩基配列の一部、またはそれと相補的な塩基配列を有する核酸； (b)配列表の配列番号 4に示す塩基配列からなる核酸とストリンジェン卜な条件下でハイブリダィズする核酸。

19. 以下の（a)または（b)の DN Aを含むプライマー：

(a)配列表の配列番号 4に示す塩基配列の一部、またはそれと相補的な塩基配列を有する DNA；

(b)配列表の配列番号 4に示す塩基配列からなる DN Aとストリンジヱントな条件下でハイブリダイズする DNA。

20. 上記 18に記載のプローブまたは上記 19に記載のプライマーを有効成分とする神経芽細胞腫の予後診断用キット。図面の簡単な説明

図 1 A、図 1 Bともに、予後良好 ·不良ヒト神経芽細胞腫における K I F 1 b 遺伝子発現量を半定量的 R T— P C Rで調べた結果を示す電気泳動写真に相当する図である。図中、レ一ン 1〜 16は、予後良好なヒト神経芽細胞腫の臨床組織サンプルを表わす。一方、レーン 17〜32は、予後不良なヒト神経芽細胞腫の臨床組織サンプルを表わす。

図 2は、実施例で使用した GSE法の概略を示す概念図である。

図 3 Aは、レトロウイルスベクターを用いて、 KIF lb— 5遺伝子、およびモ—夕—ドメインを有さないキネシン関連遺伝子のアンチセンス（K I FAS) を導入したマウス乳腺細胞の足場非依存的増殖の結果、増殖が認められたソフトァガロースゲルの写真に相当する図である。

図 3Bは、レトロウイルスベクターを用いて、陰性対照であるネオマイシン耐性遺伝子を導入したマウス乳腺細胞の足場非依存的増殖の結果を示すソフトァガロースゲルの写真に相当する図である。

図 4は、アデノウイルスベクターを用いて、 K I F 1 b— 遺伝子を導入した NMuMGがん細胞の増殖曲線を表す図である。図 5は、アデノウイルスベクタ一を用いて、 K I F 1 b— 3遺伝子を導入した N B - C 2 0 1細胞の増殖曲線を表す図である。

図 6 Aは、レトロウイルスベクターを用いて、 K I F A Sを導入したマウス乳腺細胞をヌードマウス大腿部の皮下に移植した結果、腫瘍形成が認められた写真に相当する図である。

図 6 Bは、陰性対照である、ネオマイシン耐性遺伝子を導入したマウス乳腺細胞をヌードマウス大腿部の皮下に移植した結果を示す写真に相当する図である。図 7は、図 6 Aで示したマウスの腫瘍形成について、腫瘍の大きさ（腫瘍体積）を時間に対してプロッ卜した図である。発明を実施するための最良の形態

以下、本発明の構成および好ましい実施の形態について、詳しく説明する。本明細書で用いる、「配列番号 1に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質」とは、配列番号 3に記載の核酸がコードするタンパク質のみならず、それと実質的に同等の活性を有するタンパク質をも意味する場合がある。前記実質的に同等の活性を有するタンパク質は、配列番号 1に記載のァミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するものである。後者のアミノ酸配列は、例えば配列番号 1に記載のアミノ酸配列において一若しくは複数のアミノ酸を置換、欠失、または付加してなるアミノ酸配列である。「配列番号 2に記載のァミノ酸配列を有する夕ンパク質」も、全く同様の定義を有し、配列番号 4に記載の塩基配列を有する核酸がコードするタンパク質のみならず、それと実質的に同等の活性を有するタンパク質をも意味する場合がある。

また、本明細書で用いる、「配列番号 3に記載の塩基配列を有する核酸」とは、配列番号 3に記載の核酸がコードするタンパク質と実質的に同等の活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を有する核酸をも意味する場合がある。「配列番号 4に記載の塩基配列を有する核酸」も、全く同様の定義を有し、配列番号 4 に記載の核酸がコードするタンパク質と実質的に同等の活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を有する核酸をも意味する場合がある。これら核酸およびタンパク質の変異体は、部位特異的突然変異等の当業者に公知の手法で、前記核酸の塩基配列情報に基づき、調製することができる。

本明細書で用いる「核酸」とは、上記で定義したタンパク質または該夕ンパク質の機能的に有効な断片である部分べプチドをコードするか、或いはそのようなタンパク質または部分べプチドをコ一ドする核酸に相補的であるか、さらにそのような核酸に「ストリンジェント」な条件下、ハイブリダィズする D N Aまたは R N Aを意味する。

本発明の核酸は、予後良好および予後不良な神経芽細胞腫の発現量の比較において、予後良好な神経芽細胞腫に多く発現されている。また、該核酸に対するァンチセンス（核酸）（後述）を正常細胞に導入することにより、その正常細胞は足場非依存性成長（anchorage independent growth) し、また腫瘍形成性の増加をもたらす。これらの理由から、本発明の核酸は、少なくとも、生体の正常性を維持する（例えば、細胞の癌化を抑制して）機能を有するものと考えられる。従って、本発明の核酸（その断片を含む）、該核酸がコードするタンパク質またはその部分ペプチド（あわせて、本発明のタンパク質という場合もある）、および該核酸に対するアンチセンスは、以下に示すように様々な疾患（特に悪性腫瘍）の診断、治療、予防において用いられることが可能である。

( 1 ) 診断上の有用性

本発明の核酸、タンパク質、部分ペプチド、並びに前記タンパク質および部分ペプチドに対する抗体は、診断上の有用性を備える。

すなわち、これらの分子は、種々の検定法により本発明のタンパク質、または部分べプチドの発現量の増減が影響を与えるような疾患 (例えば、神経芽細胞腫)、障害を検出したり、その予後を予測、診断、監視したりする際に使用することが可能である。本発明のタンパク質、または部分べプチドに対する抗体を用いる免疫検定法としては、特に限定はされないが、ウエスタンプロット、ラジオィムノアツセィ、

E L I S A、「サンドウイツチ」免疫検定法、免疫沈降検定法、沈降素反応、ゲル拡散沈降素反応、免疫拡散検定法、凝集検定法、補体結合検定法、免疫放射線検定法、蛍光免疫検定法、プロテイン A免疫検定法をはじめとする種々の技法を使用した競合的、非競合的な検定法が挙げられる。

また、本発明の核酸を診断に用いる場合は、ハイブリダィゼーシヨンのプロ一ブ、または P C Rのプライマ一として使用し、試料細胞中の遺伝子発現の増強の有無を調べることにより、予後同定が可能である。遺伝子発現の増強の有無を調ベるには、例えば、本発明により開示された塩基配列の任意の配列とハイブリダィズし得る塩基配列をプローブとして使用する全て方法が考慮される。好ましくは、放射性同位元素等で標識されたプローブをサザン、またはノーザンブロッテイングに用い、検定する。試料細胞中でプローブとハイブリダィズする核酸の量が増強する場合、予後が良好であると診断することが可能である。また P C Rのプライマーとして使用する場合は、例えば、検定したい試料（細胞）から R NA を抽出し、 R T— P C R法により遺伝子発現を半定量的に測定することが可能である。

( 2 ) 治療上の有用性

本発明の核酸、タンパク質、および部分ペプチドは、これらのうちのいずれかが関与している疾患、障害に対して治療剤と.しての有用性を備える。

本発明の一つの実施の形態では、本発明のタンパク質または部分べプチドの発現量が減少している疾患（特に悪性腫瘍）、障害に対して該タンパク質または部分ペプチドを含む医薬組成物を投与する。または、本発明の核酸の一部又は全部を含む医薬組成物を投与してもよい。

別の実施の形態では、本発明のタンパク質または部分べプチドの発現量が増加している疾患、障害に対して、アンチセンス、中和抗体、または前記タンパク質またはべプチドに対する競合的阻害剤等を含む医薬組成物を投与し、タンパク質またはべプチドの発現量の抑制、或いは機能阻害を行うことが可能となる。特に、前記の目的で本発明の核酸を遺伝子治療に用いる場合は、該核酸を遺伝子運搬に使用されるベクターに導入して、任意の発現プロモー夕一により導入遺伝子を患者の体内で発現させ、例えば癌の治療を行うことができる。

前記核酸が導入されうるべクタ一は、好ましくは、 DNAまたは RNAウィルスをもとに作製できる。このようなウィルスベクターの種類は特に限定されないが、 Mo ML Vベクタ一、ヘルべスウィルスベクター、アデノウィルスベクター、 AAVベクタ一、 HI Vベクター、 S IVベクター、センダイウィルスベクター等が用いられる。

また、ウィルスベクターの構成タンパク質群のうち 1つ以上を、異種ウィルスの構成タンパク質で置換する、或いは遺伝子情報を構成する核酸配列のうち一部を異種ウィルスの核酸配列で置換する、シユードタイプ型のウィルスベクターも使用できる。例えば、 H I Vの外皮タンパク質である E nvタンパク質を、小水痘性口内炎ウィルス（Ve s i c u 1 a r s t omat i t i s V i r u s ： VS V) の外皮タンパク質である VSV—Gタンパク質に置換したシユードタイプウィルスベクタ一が挙げられる（Na l d in i Lら： S c i enc e 272 263— 267 ( 1996 ))。

さらに、治療効果を持つウィルスであれば、ヒト以外の宿主域を持つウィルスもウィルスベクタ一として使用可能である。ウィルス由来でないベクターとしては、リン酸カルシウムと核酸の複合体、リボソーム、カチオン脂質複合体、センダイウィルスリポソ一ム、ポリカチオンを主鎖とする高分子キヤリア一等が使用可能である。さらに、遺伝子導入系としてはエレクト口ポレーシヨン、遺伝子銃等も使用可能である。

前記のようなベクターに本発明の核酸を導入して、遺伝子発現させるのに、発現プロモー夕一を備えた発現カセットを用いるのが好ましい。発現カセットは、標的細胞内で遺伝子を発現させることができるものであれば、特に制限されることなく、いかなるものでも用いることができる。当業者はそのような発現カセットを容易に選択することができるが、好ましくは、動物由来の細胞内で遺伝子発現が可能な発現カセットであり、より好ましくは、哺乳類由来の細胞内で遺伝子発現が可能な発現カセットであり、特に好ましくは、ヒト由来の細胞内で遺伝子発現が可能な発現カセットが選択される。

前記発現カセットには、本発明の核酸の他、遺伝子を転写するためのプロモー夕一ゃェンハンサー、ポリ Aシグナル、遺伝子が導入された細胞の標識および/ または選別のためのマーカー遺伝子、細胞のゲノム D N A配列内に効率よく該遺伝子を挿入するためのウィルス由来の遺伝子配列、遺伝子発現により産生される薬物として作用する物質を細胞外に分泌および Z細胞内の局所に滞留させるためのシグナル配列等、いかなる配列でも用いることが可能である。

発現カセットに用いられるプロモーターとしては、例えばアデノウイルス、サイトメガロウィルス、ヒト免疫不全ウィルス、シミアンウィルス 4 0、ラウス肉腫ウィルス、単純へルぺスウィルス、マウス白血病ウィルス、シンビスウィルス、 A型肝炎ウィルス、 B型肝炎ウィルス、 C型肝炎ウィルス、パピローマウィルス、ヒト T細胞白血病ウィルス、インフルエンザウイルス、日本脳炎ウィルス、 J C ウィルス、パルボウイルス B 1 9、ポリオウイルス等のウィルス由来のプロモー夕一、アルブミン、 S Rひ、熱ショック蛋白、ェロンゲーシヨン因子等の哺乳類由来のプロモーター、 C A Gプロモータ一等のキメラ型プロモーター、テトラサイクリン、ステロイド等によって発現が誘導されるプロモーター等が挙げられる。 ( 3 ) 医薬組成物

本発明の核酸、タンパク質、および部分ペプチドは、適当な医薬組成物として治療に供される。このため、該核酸等を下記の調剤方法に従い、製剤化し、好ましい投与経路を設定して、望ましい治療効果を達成するように投与量を決定する。

(調剤法）本発明の核酸、タンパク質、またはペプチドを含む医薬組成物は、特に限定はされないが、リボソーム、微粒子、マイクロカプセル内への被包、組換え細胞による発現、レセプ夕一媒介飲食法、レトロウイルスまたは他のベクターの部分としての医薬品への構築が可能である。

より具体的には、本発明の核酸を含む組換えウィルスベクターを、水、生理食塩水、等張化した緩衝液等の適当な溶媒に溶解することで本発明の核酸を含む組成物を調製できる。また、本発明のタンパク質または部分ペプチドを水、生理食塩水、等張化した緩衝液等の適当な溶媒に溶解することで本発明のタンパク質または部分べプチドを含む組成物を調製できる。その際、ポリエチレングリコール、グルコース、各種アミノ酸、コラーゲン、アルブミン等を保護材として添加して、調製してもよい。

本発明に係る医薬組成物は、中和形態または薬学的に許容できる塩として塩形態で製剤化されてもよい。薬学的に許容される塩には、塩酸、リン酸、酢酸、シユウ酸、酒石酸等から誘導されるもののようにタンパク質、またはへプチドの遊離のアミノ基と形成されるもの、およびナトリウム、カリウム、アンモニゥム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリェチルァミン、 2—ェチルアミノエ夕ノール、ヒスチジン、プロ力イン等から誘導されるもののように夕ンパク質、またはへプチドの遊離のカルボキシル基と形成されるものが含まれる。

(投与法、投与量）

本発明に係る医薬組成物を生体へ投与するとき、その投与方法については、特に制限はない。例えば、皮膚内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内へ注射投与することにより好ましく実施できる。本発明の医薬組成物の投与量は、投与経路、投与を受ける'患者の状態、年齢、体重、性別、その他により異なるが、処置する医者は、該患者に最適な投与量を決定することが可能である。例えば、注射投与する場合には、 1日量約 0 . l / g/k g〜： L 0 0 O m g/ k gを投与するのが好ましく、より好ましくは、 1日量約 1〃g/ k g〜： L 0 O m gZk gである。

( 4 ) 対象疾患、障害

本発明の核酸、タンパク質、および部分ペプチドが医薬品として治療に使用可能な対象疾患、障害としては、該核酸等の機能が直接、間接的に関与しているものであれば特に限定されない。前述のように、本発明の核酸に対するアンチセンスを正常細胞に導入することにより、その正常細胞は足場非依存性成長 (anchorage Independent growth) をし、また腫瘍形成性の増加がみられる。従つて、本発明の核酸、タンパク質、および部分ペプチドが、正常細胞の癌化を抑制するのは明らかであり、これらは特に悪性腫瘍に対して有用である。

本発明の核酸等によって治療の対象とされる悪性腫瘍としては、特に限定されないが、急性白血病、慢性白血病、リンパ腫、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、肝細胞癌、絨毛癌、精上皮腫、胎生期癌、ビルムス腫瘍、胆管癌、精巣癌、子宮頸癌、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、膠腫、髄芽細胞腫、上皮細胞腫、血管芽細胞腫、黒色腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、軟骨肉腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、結腸癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、偏平上皮癌、腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、腎細胞癌等が挙げられる。また、本発明の核酸等を悪性腫瘍の治療に用いる場合は、それらが有する機能のために悪性腫瘍の転移を抑制する医薬品としても使用可能である。

( 5 ) アンチセンス（核酸）

本発明の別の実施の形態に従えば、本発明により開示される遺伝子（本発明の核酸を含む）の発現を抑制するアンチセンス核酸を使用して、治療上および予防上の効果が達成される。ここで、「アンチセンス核酸」とは、配列のある程度の相補性により、本発明に係る遺伝子の R N A (好ましくは mR N A) の一部とハイプリダイズしうる核酸をいう。

アンチセンス核酸は、二本鎖、一本鎖、 R N A、あるいは D N A (該 R N Aをコードする）であるオリゴヌクレオチドか、またはそれらのキメラ混合物かいずれの形態でも使用可能である。また、アンチセンス核酸は、特に限定はされないが、好ましくは 5〜 5 0 0、さらに好ましくは 2 0 0〜 5 0 0塩基の範囲のォリゴヌクレオチドからなる。このようなオリゴヌクレオチドは、その塩基部分、糖部分、リン酸骨格のいずれの部分が修飾されていてもよい。

また、具体的な一形態として、アンチセンス核酸は触媒 R N A、リボザィム、あるいはキメラ R NA— D N A類似体としても使用可能である。

アンチセンス核酸は、当業者に公知の方法で、例えば、自動 D N A合成装置を使用することにより合成することが可能である。

アンチセンス核酸を治療または、予防目的で使用するとき、前述のように他の核酸と同様に、医薬組成物として、患者に投与できるが、特に好ましくは、特定の細胞（例えば、癌細胞）に直接投与することもできる。さらに、アンチセンス核酸である R N Aをコ一ドする D N Aを含むベクターで細胞を形質転換、またはトランスフエクシヨンして、転写により該アンチセンス核酸を細胞内で生成させることもできる。

( 6 ) 抗体

本発明のさらに別の実施の形態に従えば、本発明のタンパク質または部分ぺプチドに対する抗体、或いはその結合ドメインを有する断片を治療薬または診断薬として用いることも可能である。すなわち、前者（治療薬）の用途では、抗体が本発明のタンパク質の特定の領域に結合することによって、アン夕ゴニストまたはァゴニストとして作用することが可能である。後者（診断薬）の用途では、前述のように、抗体が本発明のタンパク質等を検出、測定する様々な免疫検定法に使用可能である。

前記抗体は、当業者に公知の手法に従い、本発明の夕ンパク質、部分べプチド、それらの断片、類似体または誘導体を免疫原として作製することができる。このような抗体としては、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、一本鎖、 F a b断片、または F a b発現ラィブラリ一由来の抗体が挙げられる。 ( 7) ノヅクァゥト動物

本発明のさらに別の実施の形態に従えば、本発明に係る遺伝子の発現をノックァゥ卜する核酸配列、および該配列をトランスジーンとして導入したノックァゥト動物が提供される。さらに、これらの情報に基づいて、例えば癌のモデル動物作製が可能である。

以下、実施例を挙げて、本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって制限されるものではない。

実施例

(実施例 1) 完全長 cDNAのクローニング .

モータードメインを有さないキネシン関連タンパク質のアミノ酸配列（配列番号 1 ) をもとに 5 ' 末端を SMART RACE cDNA Am 1 i f i c at ion Ki t ( C L◦ N T E C H社製）を用いて、ヒト胎児脳のライブラリー（CLONTECH社製）によりクローニングした。一般的手法（Sang e r F. ら： Pro c. Nat l. Acad. Sc i. USA 74 : 546 3 - 5467 ( 1977)) を用いて、クローニングした D N A断片の塩基配列を決定した。塩基配列は全て両鎖とも解析した。

解析した結果、従来知られていたモー夕一ドメインを有さないキネシン関連夕ンパク質の 5，末端からさらに 1390塩基対を有する DNA断片が得られたことが分かった。この断片の翻訳領域の検索を行ったところ、 85塩基対の 5，側非翻訳領域、 5472塩基対の翻訳領域、 1353塩基対の 3 ' 側非翻訳領域が判明した。翻訳されるタンパク質は 1824アミノ酸であり、その分子量は 20 5, 065ダルトンであった。翻訳されるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号 2に、翻訳領域の塩基配列を配列番号 4にそれそれ示す。この新規キネシン関連タンパク質を K I F 1 b— と名付けた。なお、配列番号 4に記載の塩基配列を DDBJ、GenBank、 E MB Lに登録した（受理番号： A B 017133)。 (実施例 2 ) 半定量的 PCRによる予後良好 ·不良ヒト神経芽細胞腫での遺伝子発現量の測定

K I F 1 b—/?遺伝子の一部から、 P CRプライマーを合成し、ヒト神経芽細胞腫の予後良好 ·不良の臨床組織サンプルで発現量を比較定量した。合成した P CRプライマーの配列を、配列番号 5 (順方向プライマー）および配列番号 6 (逆方向プライマー）に、それそれ示す。ヒト神経芽細胞腫の臨床組織サンプルより mRNAを抽出し、 rTaq (宝酒造社製）を用いて P C R反応を行った。すなわち、 5 1の滅菌蒸留水、 2 tzlのmRNA、 1 / 1の 10 x r T a qバッファ一、の 2mM dNTPs、各々 0. 5 / 1の合成プライマーセット、 0. 5 1の rT a qを混合した。この混合液を 95 °Cで 2分間変性させた後、 9 5°C, 1 5秒間 · 63 °C、 1 5秒間 · 72 °C、 20秒間を 1サイクルとして 3 5サイクル繰り返し、さらに 72°Cで 6分間放置し PCR反応を行った。この反応液を 2. 5 %のァガロースゲルで電気泳動した。結果を図 1 Aおよび図 1 Bに示す。

図 1の結果から、 K I F 1 b— ?遺伝子は予後良好ヒト神経芽細胞腫でのみ発現量が増強することが確認された。

(実施例 3 ) Genet i c Suppre s sor E l ement (G S E) 法による K I F 1 b— ^遺伝子、およびモー夕一ドメインを有さないキネシン関連遺伝子が腫瘍増殖へ与える影響の検討（その 1)

「GSE」とは、ドミナントに作用するペプチド、または阻害性アンチセンス

RNAをコードする短い生物活性遺伝子断片を指す。この GS Eを分子腫瘍学のツールに用いる方法を GSE法と呼ぶが、その概念、戦略等は、例えば、 Ron i n s o n IBら、 Cancer Res. 55 : 4023-4028 ( 19 95) の総説に解説されている。すなわち、 GSE法は任意の遺伝子の腫瘍増殖に関する機能解析を行うのに応用できる。手法としては、レトロウイルスベクタ —およびパッケージング細胞によって受容細胞に遺伝子導入し、腫瘍形成の有無を判定する。この手法の一連の流れを概略的に示したものが図 2である。さらに詳しくは、解析したい遺伝子に対するアンチセンスを受容細胞に導入すると、該細胞中ではその遺伝子の機能が抑制される。その結果、アンチセンスを導入した細胞が、足場非依存的増殖などの腫瘍形成能を獲得した場合は、その遺伝子の本来の機能は腫瘍形成を負に制御していると判断できるのである。

そこで、 Garkavt s e vらの方法（Garkavt s ev I . らヽ N a t ur e Gene t . 4 , 415— 420 ( 1996 )) に準じて、 K I F 1 b— ?遺伝子（K I F 1 b— ）、およびモー夕一ドメインを有さないキネシン関連遺伝子のアンチセンス（K I FASとも呼ぶ）を発現するレトロウイルスべクタ一を作製し、マウス乳腺細胞にトランスフエクトした。使用したアンチセンスの配列を配列番号 7に示す。このアンチセンスを合成アダプタ一と連結し、該アダプタ一のセンス鎖を P CRプライマ一として、 PCRによって増幅した。 P CR増幅した DNAをレトロウィルスベクタ一 pLXSNにクローニングし、得られたプラスミドライブラリーを BOSC23ウィルス ·パッケージング細胞株にトランスフエクトした。このレトロウイルス含有培養上澄み液でマウス乳腺細胞（非腫瘍化、不死化マウス乳腺細胞： NMuMG) を感染させた。感染されたマウス乳腺細胞を軟寒天培地（ソフトァガロースゲル）上で培養し、足場非依存性増殖の有無を観察した。また、対照（陰性）として、同様にネオマイシン耐性遺伝子を導入したマウス乳腺細胞を用いた。使用した軟寒天培地は、下層（DM EM、 10%FCS、 0. 6 %寒天）と上層（DMEM、 10%FCS、 0. 3 % 寒天）からなり、 5x 10⁴個の細胞を軟寒天培地（ 10 cmプレート）に植菌し、 37°Cで 6〜7週間放置した。観察結果を図 3A (K I FAS導入細胞）および図 3B (陰性対照）に示す。

図 3A、 3 Bの結果から、 K I FASを形質導入したマウス乳腺細胞では、陰性対照に比べ足場非依存性増殖が顕著に観察された。

上記と同様に、 K I F 1 b— 遺伝子の全長 cDNA (配列番号 4) をアデノウィルスベクタ一に導入し、 NMuMG乳がん細胞に感染させた。細胞を培地中で増殖し、その増殖曲線を求めた。これを図 4に示す。対照として、 LacZのみを含むベクターで感染させた NMuMG乳がん細胞を用いた。図中、「M〇I」は、細胞 1個あたりに感染するウィルス数を表す。

さらに、 K I F 1 b— ?遺伝子の全長 cDNAをアデノウイルスベクターに導入し、 NB— C 201細胞（ホモ接合部欠失、すなわち K I F 1 b— ?遺伝子欠損神経芽腫細胞株）に感染させた。細胞を培地中で増殖し、その増殖曲線を求めた。これを図 5に示す。

図 4および図 5共に、 K I F 1 b_ 5遺伝子の導入によって、がん細胞の増殖が抑制されることを示している。

(実施例 4) GSE法による KI F 1 b— 遺伝子、およびモータードメインを有さないキネシン関連遺伝子が腫瘍増殖へ与える影響の検討（その 2)

実施例 3に記載した手法と同様な手法を用いて、 K I FASを発現するレトロウィルスベクターで感染させたマウス乳腺細胞をヌードマウスの大腿部の皮下に移植し、腫瘍形成の有無を確認した。対照（陰性）として、実施例 3と同様に、ネオマイシン耐性遺伝子を導入したマウス乳腺細胞を用い、これをヌードマウスの皮下に移植した。結果を図 6 A (KIF AS導入）および図 6 B (陰性対照）に示す。

図 6 Aおよび図 6 Bの結果から、 K I FASを導入したマウス乳腺細胞は、ヌ —ドマウスの大腿部の皮下に移植すると、陰性対照群に比べ腫瘍形成が顕著に観察された。

さらに、処置群と対照群それそれ 5匹づつのヌードマウスに K I FASを形質導入したマウス乳腺細胞およびネオマイシン耐性遺伝子を導入したマウス乳腺細胞を移植し、形成された腫瘍の大きさの経時変化を調べた。その結果を図 7に示す。図から、明らかに処置群では、移植後 5週間で腫瘍の増大が観察された。産業上の利用可能性

本発明の核酸は、モー夕一ドメインを有する新規キネシン関連遺伝子の D N A または R N Aであり、キネシン関連遺伝子の塩基配列情報を明らかにする。本発明の核酸またはその断片は、プローブ或いはプライマ一として、各種ハイブリダィゼーシヨンまたは P C R法に使用でき、キネシン関連遺伝子の組織、細胞での発現の検出やその構造および機能の解析が可能となる。また、該遺伝子がコードするキネシンタンパク質の遺伝子工学的製造を可能とする。

さらに、本発明の核酸は、神経芽細胞腫の予後良好な臨床組織でのみ発現が増強しており、従って、その発現のレベルから神経芽細胞腫の予後の診断が可能となる。

また、本発明のアンチセンス核酸で K I F 1 b—^遺伝子、およびモータードメインを有さないキネシン関連遺伝子の発現を抑制すると、本来足場依存的にのみ増殖する正常細胞が足場非依存的に増殖することが確認された。すなわち、前記遺伝子が正常細胞の癌化を制御する機能を有することが分かった。また、 K I F 1 b— ?遺伝子を癌細胞に導入すると、癌細胞の増殖が抑制されることも見出された。これらの知見に基づき、本発明の核酸、タンパク質等を細胞の癌化を制御する目的で、抗癌剤として、悪性腫瘍の治療に用いることが可能となる。

Claims

請求の範囲

1 . 配列表の配列番号 4に記載の塩基配列を有する核酸。

2 . 配列表の配列番号 2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列を有する核酸。

3 . 請求項 1または 2に記載の核酸の断片である核酸。

4 . 請求項 1または 2に記載の核酸にハイブリダイズしうる核酸。

5 . 配列表の配列番号 7に記載の塩基配列を有する核酸。

6 . 請求項 1または 2に記載の核酸に対するアンチセンス核酸。

7 . 正常細胞に導入することにより、正常細胞を足場非依存的に増殖させることを特徴とする、配列表の配列番号 7に記載の塩基配列を有するアンチセンス核酸。

8 . 配列表の配列番号 2に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、またはその薬学的に許容できる塩。

9 . 配列表の配列番号 2に記載のアミノ酸配列に実質的に同一のアミノ酸配列を有し、且つその欠失が正常細胞の腫瘍化を誘起する活性を有するタンパク質、またはその薬学的に許容できる塩。

1 0 . 前記配列表の配列番号 2に記載のアミノ酸配列に実質的に同一のァミノ酸配列が、配列番号 2に記載のアミノ酸配列における一若しくは複数のアミノ酸を置換、欠失、または付加してなるアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項 9に記載のタンパク質、またはその薬学的に許容できる塩。

1 7 . 請求項 1に記載の核酸またはその断片をヒト神経芽細胞腫の臨床組織サンプルから検出することを特徴とする、ヒト神経芽細胞腫の予後の診断方法。

1 8 . 以下の（a)または (b)の核酸を含む核酸プローブ：

(a)配列表の配列番号 4に示す塩基配列の一部、またはそれと相補的な塩基配列を有する核酸；

(b)配列表の配列番号 4に示す塩基配列からなる核酸とストリンジヱン卜な条件下でハイブリダィズする核酸。

1 9 . 以下の（a)または（b)の D N Aを含むプライマー：

(a)配列表の配列番号 4に示す塩基配列の一部、またはそれと相補的な塩基配列を有する D N A；

(b)配列表の配列番号 4に示す塩基配列からなる D N Aとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする D N A。

2 0 . 請求項 1 8に記載のプローブまたは請求項 1 9に記載のプライマ一を有効成分とする神経芽細胞腫の予後診断用キット。